DE102010025161A1

DE102010025161A1 - Verfahren zum Nachweis von Ribonukleinsäuren

Info

Publication number: DE102010025161A1
Application number: DE102010025161A
Authority: DE
Inventors: Martin Weber; Denis Flügge; Christoph Ritt; Stefan Pitsch
Original assignee: Qiagen GmbH
Current assignee: Qiagen GmbH
Priority date: 2010-06-25
Filing date: 2010-06-25
Publication date: 2011-12-29
Also published as: WO2011161239A1

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis von Ribonukleinsäuren durch Verdrängen einer Nukleinsäure aus einem Duplex bestehend aus einer an einem Zuckerrest modifizierten Nukleinsäure mit einer weiteren an einem Zuckerrest modifizierten Nukleinsäure oder Desoxyribonukleinsäure durch die nachzuweisende Ribonukleinsäure und Detektion des Verdrängungsereignisses.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis von Ribonukleinsäuren durch Verdrängen einer Nukleinsäure aus einem Duplex bestehend aus einer an einem Zuckerrest modifizierten Nukleinsäure mit einer weiteren an einem Zuckerrest modifizierten Nukleinsäure oder Desoxyribonukleinsäure durch die nachzuweisende Ribonukleinsäure und Detektion des Verdrängungsereignisses.
Zum spezifischen Nachweis von Nukleinsäuren mit bekannter Nukleotidsequenz sind aus dem Stand der Technik unterschiedliche Verfahren bekannt. So wird beispielsweise die komplementäre Basenpaarung von einzelsträngigen Nukleinsäuren ausgenutzt. Bei diesem Hybridisierung genannten Verfahren werden Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den komplementären Nukleotiden der jeweiligen einzelsträngigen Nukleinsäuren gebildet, es entsteht ein stabiler Duplex, der aus zwei Nukleinsäureeinzelsträngen aufgebaut ist. Das Prinzip der Hybridisierung ist im Stand der Technik in verschiedenen Variationen zur Detektion von spezifischen Nukleinsäuren seit Jahrzehnten bekannt.
Ein Beispiel dafür stellt der Northern-Blot dar, mit dessen Hilfe spezifische mRNAs nachgewiesen werden können. Bei diesem erfolgt nach gelelektrophoretischer Auftrennung der RNA-Moleküle eine Immobilisierung dieser auf einer Membran. Anschließend werden spezifische RNAs durch Hybridisierung mit radioaktiv oder auf andere Art markierten Nukleinsäuresonden nachgewiesen. Meistens werden zu diesem Zweck Sonden verwendet, die aus DNA aufgebaut sind. Theoretisch würden bei diesem Nachweisverfahren sowohl sequenzkomplementäre DNA als auch RNA nachgewiesen, da es bei diesem Verfahren nicht möglich ist, durch die Hybridisierung zwischen DNA-DNA und DNA-RNA Hybriden zu unterscheiden.
Um nur die gewünschten DNA-RNA Hybride, nicht aber die unerwünschten DNA-DNA Hybride zu erhalten, werden in der Praxis vor dem Hybridisierungsschritt Reinigungsschritte durchgeführt, die spezifisch mRNAs anreichern. Zusätzlich wird allgemein ein Verdau mit DNase durchgeführt, der dafür sorgt, dass sämtliche in der Probe vorhandene DNA abgebaut wird, so dass diese nicht mit dem Nachweis der RNA interferieren kann.
Ein ähnliches Verfahren zum Nachweis von RNA stellt der Dot Blot dar. Im Gegensatz zum Northern Blot werden bei diesem Verfahren die Nukleinsäuren nicht vor der Hybridisierung elektrophoretisch aufgetrennt. Vielmehr wird eine kleine Menge RNA auf eine Nukleinsäure bindende Membran aufgebracht und durch Hitzeeinwirkung immobilisiert. Mittels einer Nukleinsäuresonde, die beispielsweise radioaktiv markiert ist, kann nun festgestellt werden, ob eine bestimmte RNA-Sequenz in der auf der Membran immobilisierten Nukleinsäure vorhanden gewesen ist. Wie beim Northern Blot ist es auch mit dem Dot Blot nicht möglich, allein durch die Hybridisierungsbedingungen nur RNA spezifisch nachzuweisen. Aufreinigungsschritte vor der Immobilisierung sowie ein DNase-Verdau sind nötig, um spezifisch nur RNA nachzuweisen.
Eine Erweiterung des Dot Blots zum Hochdurchsatzverfahren stellt das Microarray dar. Hierbei wird die mRNA nach Umschreiben in cDNA durch Hybridisierung an kurze synthetische Oligonukleotide oder auch an längere DNA-Stücke nachgewiesen. Auch bei diesem Verfahren kann noch anwesende genomische DNA gleicher Sequenz die vergleichende Quantifizierung der ursprünglich vorhandenen mRNA-Menge erschweren. Zusätzlich weist die cDNA Synthese eine schwankende Effizienz auf, was eine zusätzliche mögliche Fehlerquelle für eine vergleichende Quantifizierung beim Microarray darstellt.
Die im Stand der Technik am häufigsten verwendete Methode zum Nachweis und zur Quantifizierung von RNA stellt die quantitative RT-PCR dar. Vor der Amplifikation der mRNA in der PCR muss die mRNA zunächst mittels der Reversen Transkriptase in cDNA umgeschrieben werden. Hierbei besteht die Gefahr von Artefakten durch die unterschiedliche Effizienz der Reversen Transkriptase beim Umschreiben der mRNA in cDNA. Diese Effizienz ist vor allem abhängig von der Sekundärstruktur der umzuschreibenden mRNA. Aufgrund der exponentiellen Reaktionskinetik bei der Amplifikation der cDNA ist die Fehlerfortpflanzung ebenfalls exponentiell. Je nachdem, wie die Primer für die Amplifikation der cDNA gewählt werden können, stört noch anwesende genomische DNA aus der Nukleinsäurepräparation, da diese zusammen mit der cDNA in der quantitativen PCR amplifiziert wird. Um dies zu vermeiden, muss mit Hilfe von DNase die noch verbliebene residuale genomische DNA vor der cDNA Synthese zerstört werden.
Allen hier aufgeführten Methoden aus dem Stand der Technik zum spezifischen Nachweis von RNA ist gemein, dass diese Technologien per se nicht zwischen DNA und RNA diskriminieren können. Zwar sind im Stand der Technik Aufreinigungsmethoden zur Präparation von Nukleinsäuren bekannt, die bevorzugt RNA aufreinigen, jedoch sind diese Methoden nicht absolut, d. h., auch bei einer RNA Präparation findet sich noch immer eine gewisse Menge DNA. Diese Reste kontaminierender DNA stören den Nachweis der spezifischen RNA durch die oben beschriebenen Methoden aus dem Stand der Technik. Um die Reste kontaminierender DNA, die bei der Präparation der RNA zwangsläufig auftauchen, zu eliminieren, ist es nötig, diese mit Hilfe von spezifischen Nukleasen, den so genannten DNasen, enzymatisch abzubauen. Dies bedeutet nicht nur einen zusätzlichen Arbeitsschritt, der zeitaufwendig und kostenintensiv ist, zudem besteht bei einem DNase Verdau die Gefahr, dass die DNase mit RNasen kontaminiert sein kann, so dass nicht nur die unerwünschte DNA, sondern auch die nachzuweisende RNA degradiert werden würde.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, die Nachteile des Standes der Technik zu überwinden und ein kostengünstiges und wenig zeitaufwendiges Verfahren zum spezifischen Nachweis von Ribonukleinsäuren bereitzustellen, ohne dass während der Detektion eventuell vorhandene DNA mit diesem Nachweis interferiert.
Diese Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren gemäß Anspruch 1 zum spezifischen Nachweis von Ribonukleinsäruen, umfassend die folgenden Verfahrensschritte:

a) Ausbilden eines Duplex durch Hybridisierung einer ersten Nukleinsäure (NA1) an eine mindestens teilweise komplementäre zweite Nukleinsäure (NA2), wobei NA1 mindestens ein nicht natürlich vorkommendes Nukleotid enthält, das mindestens eine Modifikation an einem Zuckerrest aufweist und wobei NA2 ebenfalls mindestens ein nicht natürlich vorkommendes Nukleotid enthält, das mindestens eine Modifikation an einem Zuckerrest aufweist oder eine nicht modifizierte Desoxyribonukleinsäure ist;
b) in Kontakt bringen des Duplex aus Schritt a) mit einer nachzuweisenden Ribonukleinsäure (NA3), die mindestens teilweise Sequenzhomologie mit NA2 aufweist;
c) Hybridisierung von NA3 an NA1, wobei NA2 von NA1 verdrängt wird und ein Duplex aus NA3 und NA1 ausgebildet wird;
d) Detektion des Verdrängungsereignisses aus Schritt c).

Das Verfahren nach Anspruch 1 eignet sich besonders zum Nachweis von spezifischen Nukleinsäuren. Dazu ist bevorzugt, dass die modifizierte Nukleinsäure NA1 in Schritt a) in Anspruch 1 mit einer weiteren Nukleinsäure NA2, die entweder DNA oder ebenfalls eine modifizierte Nukleinsäure ist, als Duplex vorliegt.
Ganz besonders bevorzugt ist es, wenn die modifizierte Nukleinsäure NA1 in Schritt a) in Anspruch 1 mit einer DNA als Duplex vorliegt.
Der Duplex zwischen NA1 und NA2 wird üblicherweise durch zwei zumindest teilweise zueinander komplementäre Nukleinsäuren ausgebildet. Durch jeweils freie einzelsträngige Bereiche an NA1 und NA2 ist es aber auch denkbar, dass der Komplex nicht nur aus zwei Nukleinsäuren, sondern aus zwei oder mehr Nukleinsäuren aufgebaut ist, die jeweils zueinander überlappende Bereiche aufweisen, so dass in der Gesamtheit ebenfalls ein Nukleinsäuredoppelstrang ausgebildet wird, wobei der jeweilige Einzelstrang aus NA1 oder NA2 dabei nicht über die volle Länge kovalent verbunden ist.
Die nachzuweisende Nukleinsäure NA3 ist in dem erfindungsgemäßen Verfahren eine Ribonukleinsäure. Bei der Ribonukleinsäure NA3 kann es sich um eine natürlich vorkommende RNA, aber auch um eine nicht natürlich vorkommende RNA handeln.
Zu den natürlich vorkommenden RNAs, die im erfindungsgemäßen Verfahren nachgewiesen werden können, gehören beispielsweise mRNAs, nicht-kodierende RNAs sowie virale RNAs.
Unter nicht-kodierenden RNAs werden RNA-Moleküle verstanden, die nicht wie die mRNA in Proteine übersetzt werden sondern nach der Transkription eine Funktion haben. Darunter fallen unter anderem rRNAs, tRNAs, miRNAs, siRNAs, piRNAs, tiRNAs, antisense RNAs, Riboswitches und Ribozyme. Weitere nicht-kodiernde RNAs sind dem Fachmann geläufig.
In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei den nachzuweisenden RNAs um natürlich vorkommende RNAs.
Nicht natürlich vorkommende RNAs können in einem den Fachmann bekannten in vitro Verfahren hergestellt werden. Zu diesen Verfahren gehören beispielsweise die in vitro Transkription und die Nukleinsäuresynthese.
Eine weitere Möglichkeit, nicht natürlich vorkommende Nukleinsäuren herzustellen, besteht darin, natürlich vorkommende Nukleinsäuren zu modifizieren. Dazu gehören beispielsweise die chemische Umwandlung durch oxidierende oder reduzierende Agenzien oder die Ankopplung von funktionellen Gruppen wie beispielsweise Methylierungen an die natürlich vorkommenden Nukleinsäuren. Weitere Verfahren zur Herstellung von nicht natürlich vorkommenden Ribonukleinsäuren sowie weitere Möglichkeiten zur Modifikation natürlich vorkommender Nukleinsäuren sind dem Fachmann geläufig.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist mindestens eine Nukleinsäure des Duplex aus Schritt a) in Anspruch 1 an eine feste Phase gekoppelt.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die NA1 des Duplex aus Schritt a) in Anspruch 1 an eine feste Phase gekoppelt.
In einer weiteren Ausführungsform sind sowohl die NA1 als auch die NA2 des Duplex aus Schritt a) in Anspruch 1 an unterschiedliche feste Phasen gekoppelt.
Als feste Phase kommen beispielsweise magnetische oder nicht magnetische Partikel, Planare oder gebogene Oberflächen, Gefäßwände oder Pipettenspitzen in Frage. Weitere geeignete feste Phasen sind dem Fachmann geläufig.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Duplex aus Schritt a) in Anspruch 1 einfach oder mehrfach detektierbar markiert. Die Markierung oder die Markierungen können sich am 5'-Ende, am 3'-Ende oder an jedem beliebigen Nukleotid einer oder beider Nukleinsäuren des Duplex befinden.
Gebräuchliche Markierungen von Nukleinsäuren umfassen beispielsweise Fluoreszenzfarbstoffe, Quencher, Radioaktivität, Chemilumineszenz, Nanopartikel von Metallen wie beispielsweise Gold oder Silber, Quantum Dots, Antikörper, Biotin, Avidin, Streptavidin, Streptactin, Digoxigenin und Enzyme. Weitere Möglichkeiten der Markierungen von Nukleinsäuren sind dem Fachmann geläufig.
Entsprechende Verfahren zur Detektion und zum Nachweis von Nukleinsäuren sind dem Fachmann ebenfalls bekannt. Zu den gebräuchlichen Verfahren gehören beispielsweise Fluoreszenzmikroskopie, Analyse mit FACS Geräten, Spectrophotometern und anderen Fluoreszenz-Lesegeräten, Autoradiographie, Szintillation, Nachweisverfahren mittels Enzym-Substratreaktion wie z. B. mittels Alkalischer Phosphatase oder Peroxidase, indirekte Nachweisverfahren z. B. mit Hilfe von Antikörpern, optische Detektionssysteme wie Surface Plasmon Resonance (SPR) und weitere Interferenz-basierte Verfahren.
Gemäß der vorliegenden Erfindung ist die Modifikation der Nukleotide so gewählt, dass die Spezifität der Basenpaarung erhalten bleibt und die Basen der modifizierten Nukleinsäure nicht modifiziert sind. Vielmehr ist der Zuckerrest der Nukleotide modifiziert. Die Modifikation am Zuckerrest ist so gewählt, dass sich die Affinität von DNA und RNA an die Nukleotide mit modifiziertem Zuckerrest unterscheidet und sich somit auch Unterschiede in der Schmelztemperatur ergeben. Die Modifikation ist so gewählt, dass die Schmelztemperatur eines Duplexes aus modifizierter Nukleinsäure und RNA signifikant höher liegt als die Schmelztemperatur eines Duplexes aus modifizierter Nukleinsäure und DNA.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist dieser Zuckerrest eine Ribose.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die mindestens eine Modifikation am Zuckerrest einer Ribose eine Modifikation durch einen Substituenten am 2'C-Atom des Zuckerrestes.
In einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform gehört die Modifikation am 2'C-Atom des Zuckerrestes einer Ribose zur Gruppe der Hydroxyalkyl-oxymethyl Substituenden, darüber hinaus ganz besonders bevorzugt handelt es sich um einen 2'-O-[((2R,3S)-2,3,4-trihydroxy-butyl)oxymethyl Substituenten, nachfolgend als (DL)-C₄ bezeichnet.
Zur näheren Erläuterung ist die Strukturformel dieses Substituenten in angegeben.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist mehr als ein Nukleotid in der modifizierten Nukleinsäure modifiziert, besonders bevorzugt sind mindestens 30% aller Nukleotide in der modifizierten Nukleinsäure modifziert, ganz besonders bevorzugt sind mindestens 50% aller Nukleotide in der modifizierten Nukleinsäure modifiziert, darüber hinaus ganz besonders bevorzugt sind mindestens 70% aller Nukleotide in der modifizierten Nukleinsäure modifiziert, darüber hinaus ganz besonders bevorzugt sind mindestens 80% aller Nukleotide in der modifizierten Nukleinsäure modifiziert, darüber hinaus ganz besonders bevorzugt sind mindestens 90% aller Nukleotide in der modifizierten Nukleinsäure modifiziert, darüber hinaus ganz besonders bevorzugt sind mindestens 95% aller Nukleotide in der modifizierten Nukleinsäure modifiziert, darüber hinaus ganz besonders bevorzugt sind alle Nukleotide in der modifizierten Nukleinsäure modifiziert.
Beim Verwenden einer Nukleinsäure NA1, aufweisend mindestens ein modifiziertes Nukleotid, ergibt sich im Vergleich zu einer nicht modifizierten Nukleinsäure gleicher Sequenz ein Unterschied in der Schmelztemperatur, wenn diese modifizierte Nukleinsäure NA1 mit einer Ribonukleinsäure (RNA) oder Desoxyribonukleinsäure (DNA) hybridisiert ist.
Während die Unterschiede in der Schmelztemperatur zwischen DNA-DNA, DNA-RNA und RNA-RNA Duplexen bei gleicher Sequenz abhängig von der spezifischen Sequenz, ihrem GC-Gehalt und der Länge der hybridisierenden Nukleinsäuren nur sehr gering sind und nur wenige Grad Celsius ausmachen, kann der Unterschied in der Schmelztemperatur deutlich erhöht sein, wenn ein oder mehrere Ribonukleotide an einem RNA- oder DNA-Strang an ihrem Zuckerrest modifiziert sind, also eine im Sinne der Erfindung modifizierte Nukleinsäure vorliegt. So unterscheiden sich Duplexe aus modifizierter Nukleinsäure mit DNA bzw. RNA deutlich in ihrer Schmelztemperatur, wobei die Duplexe aus modifizierter Nukleinsäure und RNA eine signifikant höhere Schmelztemperatur aufweisen als die Duplexe aus modifizierter Nukleinsäure mit DNA. Der genaue Unterschied in der Schmelztemperatur ist dabei abhängig von der Basenfolge und der Länge des Duplex sowie vom Anteil der modifizierten Nukleotide in der Nukleinsäure.
Während eine Nukleinsäure, die nur aus nicht-modifizierten Desoxyribo- oder Ribonukleotiden besteht, mit in etwa der gleichen Affinität sowohl DNA als auch RNA bindet, ist die Affinität einer Nukleinsäure, die mindestens eine erfindungsgemäße Modifikation besitzt, für DNA und RNA sehr unterschiedlich. Duplexe aus modifizierter Nukleinsäure und RNA besitzen eine wesentlich höhere Schmelztemperatur und damit höhere Affinität zueinander als Duplexe mit der gleichen Nukleotidabfolge aus modifzierter Nukleinsäure mit DNA oder Duplexe aus zwei modifizierten Nukleinsäuren.
Dies wird in dem erfindungsgemäßen Verfahren ausgenutzt. Würde in den Schritten a) und c) aus Anspruch 1 im erfindungsgemäßen Verfahren als NA1 eine nicht modifizierte DNA oder RNA verwendet, die an Nukleinsäuren mit komplementärer Basenfolge hybridisiert, so würde diese in etwa gleichermaßen RNA und DNA mit der komplementären Sequenz binden.
Wird hingegen in den Schritten a) und c) im erfindungsgemäßen Verfahren als NA1 eine modifizierte Nukleinsäure verwendet, so ist die Bindung einer zu dieser in der Nukleotidsequenz komplementären RNA wesentlich wahrscheinlicher als die Bindung einer zu dieser komplementären DNA, wenn diese beiden Nukleinsäurespezies als Gemisch zur Hybridisierung angeboten werden.
Die Affinität einer modifizierten Nukleinsäure zu einer komplementären weiteren modifizierten Nukleinsäure ist in etwa in derselben Größenordnung wie die Affinität einer modifizierten Nukleinsäure zu einer DNA.
Demzufolge können erfindungsgemäß als NA2 entweder eine DNA oder eine weitere modifizierte Nukleinsäure verwendet werden, um einen Duplex mit NA1 auszubilden.
Erfindungsgemäß wird demzufolge ein Duplex aus modifizierter Nukleinsäure und DNA oder aus modifizierter Nukleinsäure mit einer weiteren modifizierten Nukleinsäure in Schritt a) aus Anspruch 1 ausgebildet. Wird dieser Duplex aus NA1 und NA2 in Schritt b) aus Anspruch 1 in Kontakt gebracht mit einer Ribonukleinsäure NA3 mit einer zumindest teilweisen Sequenzhomologie zur NA2, die eine modifizierte Nukleinsäure oder DNA sein kann, so ist diese Ribonukleinsäure durch ihre höhrere Affinität zur modifizierten Nukleinsäure NA1 in der Lage, die DNA oder modifizierte Nukleinsäure (NA2) aus dem Duplex mit der NA1 zu verdrängen und selbst mit der modifizierten Nukleinsäure NA1 einen Duplex auszubilden. Das Ergebnis ist folglich ein Duplex aus modifizierter Nukleinsäure NA1 mit der nachzuweisenden Ribonukleinsäure NA3.
Die Schmelztemperatur eines Duplex aus NA1 und NA3 ist folglich höher als die Schmelztemperatur eines Duplex aus NA1 und NA2.
Durch die höhere Affinität von RNA an die modifizierte Nukleinsäure im Vergleich zu DNA ist es nicht erforderlich, für den Nachweis einer spezifischen RNA aus einem Nukleinsäuregemisch nach dem erfindungsgemäßen Verfahren zuvor DNA gleicher oder ähnlicher Sequenz aus diesem Gemisch zu entfernen, es muss also keine Aufreinigung der RNA erfolgen, bevor diese nachgewiesen wird.
Der Nachweis einer spezifischen RNA aus einem Nukleinsäuregemisch wäre nicht möglich, wenn als NA1 anstelle von modifizierter Nukleinsäure DNA oder RNA verwendet werden würde, da in diesem Fall RNA und DNA mit vergleichbarer Affinität an die NA1 in Schritt c) binden würden und sowohl RNA als auch DNA nachgewiesen werden würden.
Im Gegensatz zu den anderen im Stand der Technik bekannten Verfahren ist es mit dem erfindungsgemäßen Verfahren nicht erforderlich, einen DNase Verdau oder eine Aufreinigung durchzuführen, um eine spezifische Ribonukleinsäure nachweisen zu können. Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht also einen direkten Nachweis von spezifischer RNA, ist somit wesentlich kostengünstiger, schneller und weist keine Artefakte auf, wie sie durch ungleichmäßige Effizienz in der Aufreinigung oder der Amplifikation von unterschiedlichen Ribonukleinsäuren auftreten können.
Die Temperatur bei der Ausbildung des Duplex in Schritt a) aus Anspruch 1 ist so gewählt, dass die Temperatur unterhalb der Schmelztemperatur des Duplex zwischen der NA1 und der NA2 liegt.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Nukleinsäuren NA1 und NA2 auf eine Temperatur erhitzt, die mindestens um etwa 10°C oberhalb der Schmelztemperatur ihres Duplex liegt, und langsam bis auf Raumtemperatur abkühlen gelassen. Sobald die Reaktionstemperatur unterhalb der Schmelztemperatur des Duplex liegt, beginnt sich der Duplex zwischen NA1 und NA2 auszubilden.
Die Temperatur bei der Hybridisierung in Schritt c) aus Anspruch 1 kann im Prinzip bei jeder Temperatur durchgeführt werden, die unterhalb der Schmelztemperatur des Duplex aus NA1 und NA2 liegt. Unter diesen Temperaturbedingungen ist es möglich, dass die RNA (NA3) die NA2 aus dem Duplex mit der modifizierten Nukleinsäure (NA1) verdrängt. Läge die Reaktionstemperatur oberhalb der Schmelztemperatur des Duplex aus NA1 und NA2, so würde die NA2 auch ohne Anwesenheit einer spezifischen RNA aus dem Duplex mit NA1 dehybridisieren, da ihre Affinität zur NA1 zu gering wäre.
Der Fachmann kann die Temperatur in Schritt c) aus Anspruch 1 so wählen, dass für ihn optimale Bedingungen bezüglich der Reaktionszeit und der Spezifität des Nachweises der RNA vorliegen. Während die Reaktionskinetik bei einer Hybridisierungstemperatur, die nur wenige °C unterhalb der Schmelztemperatur des NA1–NA2 Duplexes liegt, höher ist, und somit der Nachweis der spezifischen RNA schneller vonstatten geht, ist die Spezifität des Nachweises der spezifischen RNA höher, wenn die Hybridisierungstemperatur um mehr als etwa 10°C unterhalb der Schmelztemperatur des Duplex zwischen NA1 und NA2 liegt.
Weitere Parameter, die die Schmelztemperatur von Nukleinsäuren beeinflussen sind beispielsweise die Länge und der GC-Gehalt der Nukleinsäure, die Salzkonzentration und die Art der Salze im Hybridisierungspuffer sowie das Vorhandensein weiterer Agenzien wie beispielsweise denaturierende Substanzen. Weitere Einflussfaktoren sind dem Fachmann bekannt.
Der Fachmann wird aufgrund der Kenntnis aller Einflussfaktoren entsprechend die Reaktionstemperatur für Schritt c) auswählen.
Abbildungen:
zeigt die Strukturformel eines Ribonukleotids mit 2'-O-[((2R,3S)-2,3,4-trihydroxy-butyl)oxymethyl] Substituenten.
zeigt die Schmelzkurvenanalyse eines Duplex zwischen modifizierter Nukleinsäure und RNA bzw. modifizierter Nukleinsäure und DNA. Auf der x-Achse ist die Temperatur, auf der y-Achse die Optische Dichte bei 260 nm angegeben. Details zum Versuch sind im Beispiel 3 angegeben.
zeigt die Verdrängung von DNA (helle Balken) durch RNA (dunkle Balken) aus dem Duplex mit modifizierter Nukleinsäure. Auf der x-Achse ist die relative Menge an RNA (in %) in Relation zur Duplexmenge angegeben, auf der y-Achse die relative Fluoreszenz.
zeigt die Verdrängung von Fluoreszenz markierter DNA aus dem Duplex mit modifizierter Nukleinsäure durch unmarkierte RNA in Anwesenheit von nicht sequenzhomologer RNA und DNA. Auf der x-Achse ist die relative Menge an RNA (in %) in Relation zur Duplexmenge angegeben, auf der y-Achse die relative Fluoreszenz.
zeigt die Verdrängung von Fluoreszenz markierter DNA aus dem Duplex mit modifizierter Nukleinsäure durch unmarkierte RNA in Anwesenheit eines Zell-Lysates aus menschlichen Zellkultur-Zellen. Auf der x-Achse ist die relative Menge an RNA (in %) in Relation zur Duplexmenge angegeben, auf der y-Achse die relative Fluoreszenz.
zeigt die Verdrängung von Fluoreszenz markierter DNA aus dem Duplex mit modifizierter Nukleinsäure, die mit einem Quencher markiert ist, durch unmarkierte RNA. In der Abbildung ist die Fluoreszenz der freigesetzten DNA gezeigt. Als 100% wurde die Fluoreszenzmenge der freien DNA definiert, als 0% die Fluoreszenzmenge, bei der die gesamte DNA im Duplex mit modifizierter Nukleinsäure vorlag. Auf der x-Achse ist die relative Menge an RNA (in %) in Relation zur Duplexmenge angegeben, auf der y-Achse die relative Fluoreszenz.
zeigt den Nachweis von sequenzhomologer RNA. Bei den hellen Balken wurde zusätzlich nicht sequenzhomologe RNA verwendet, bei den dunklen Balken nicht. Auf der x-Achse ist die relative Menge an RNA (in %) in Relation zur Duplexmenge angegeben, auf der y-Achse die relative Fluoreszenz.
zeigt den Nachweis von sequenzhomologer RNA. Bei den hellen Balken wurde zusätzlich Zell-Lysat von menschlichen Zellkultur-Zellen verwendet, bei den dunklen Balken nicht. Auf der x-Achse ist die relative Menge an RNA (in %) in Relation zur Duplexmenge angegeben, auf der y-Achse die relative Fluoreszenz.
zeigt den Nachweis von langer sequenzhomologer RNA. Auf der x-Achse ist die relative Menge an RNA (in %) in Relation zur Duplexmenge angegeben, auf der y-Achse die relative Fluoreszenz.
Beispiele:
Die nachfolgenden Beispiele sind dazu gedacht, die Erfindung weiter zu erläutern, ohne dass diese auf die Ausführungsbeispiele beschränkt sein soll.
Verwendete Sequenzen:
RANTES:
Beispiel 1:
Verfahren zur Herstellung des Duplexes aus modifizierter Nukleinsäure und DNA an einer festen Phase
Paramagnetische Mikropartikel mit Streptavidin-Funktionalisierung an der Oberfläche (Dynabeads Biotin Binder, Invitrogen) wurden umgepuffert in 50 μl Puffer 1 (10 mM Tris-Cl, pH 7,4; 150 mM NaCl; 0,01% BSA). Zur Kopplung an diese Mikropartikel wurden 5'-biotinylierte Oligonukleotide der Sequenz SeqB im zweifachen Überschuss relativ zu den Bindungsstellen auf den Partikeln gegeben und 25 Minuten unter Schütteln inkubiert. Nach der erfolgten Kopplung über die Biotin-Streptavidin Wechselwirkung wurden zwei Waschschritte mit jeweils 500 μl des Puffers 1 durchgeführt. Anschließend erfolgte die finale Aufnahme der Partikel in 50 μl Puffer 1. Als biotinylierte Oligonukleotide wurden am 2' Zuckerrest mit (DL)-C₄ modifizierte Ribonukleinsäuren verwendet. Zu diesen modifizierten Oligonukleotiden wurden komplementäre DNA-Oligonukleotide gegeben und hybridisiert. Diese DNA-Oligonukleotide waren am 5'-Ende mit dem Fluoreszenzfarbstoff FAM (6-FAM) markiert. Der Duplex aus modifiziertem Oligonukleotid und markierten DNA-Oligonukleotid wurde unter Lichtausschluss für 60 min bei Raumtemperatur und Schütteln ausgebildet. Anschließend wurde zweimal mit 500 μl Puffer 1 gewaschen und die Partikel bis zu ihrer Verwendung unter Lichtausschluss gelagert. In diesem Zustand können die Partikel mehrere Tage gelagert werden, bevor sie für den Nachweis von spezifischen Ribonukleinsäuren verwendet werden.
Beispiel 2:
Verfahren zur Herstellung des Duplexes aus modifizierter Nukleinsäure und DNA in flüssiger Phase
Der Duplex aus modifizierter Nukleinsäure und DNA in flüssiger Phase wurde in Puffer 1 (siehe Beispiel 1) hybridisiert. Es wurden DNA-Oligonukleotide mit der Sequenz SeqA verwendet, die am 3'-Ende den Fluoreszenzfarbstoff Alexa 532 trugen sowie (DL)-C₄ Ribonukleotide, die am 5'-Ende einen Black Hole Quencher BHQ1 (Biosearch Technologies Inc., Novato) trugen, so dass nach Ausbilden des Duplex keine Fluoreszenz detektierbar war. Der Duplex aus modifizierter Nukleinsäure und DNA wurde bis zu seiner Verwendung unter Lichtausschluss gelagert. In diesem Zustand kann der Duplex mehrere Tage gelagert werden, bevor er für den Nachweis von spezifischen Ribonukleinsäuren verwendet wird.
Beispiel 3:
Schmelzverhalten der verschiedenen Duplexe
Zwei Nukleinsäurestränge mit komplementärer Basenabfolge liegen unterhalb der Schmelztemperatur als Duplex vor. Dadurch, dass einzelsträngige Nukleinsäuren mehr UV-Licht der Wellenlänge 260 nm absorbieren als doppelsträngige Nukleinsäuren derselben Sequenz, lässt sich eine UV-Schmelzkurzve bei 260 nm aufnehmen. Für diesen Versuch wurden Duplexe gebildet, bestehend aus modifizierter Nukleinsäure der Sequenz SeqA und DNA der Sequenz SeqB, modifizierter Nukleinsäure der Sequenz SeqA und RNA der Sequenz SeqB, modifizierter Nukleinsäure der Sequenz SeqB und DNA der Sequenz SeqA sowie modifizierter Nukleinsäure der Sequenz SeqB und RNA der Sequenz SeqA. Als modifizierte Ribonukleotide wurden am 2' Zuckerrest mit (DL)-C₄ modifizierte Ribonukleotide verwendet.
Die Duplexe wurden in eine beheizbare Küvette überführt (Beckmann), und die Absorption bei 260 nm wurde gemessen. Alle 2 min wurde die Temperatur in dieser Küvette mit Hilfe einer Heizpumpe (Julabo) um 1°C hochreguliert. Der Verlauf der Absorptionskurven in zeigt, dass die Schmelztemperatur der Duplexe bei unterschiedlichen Temperaturen lag, je nachdem, ob ein Komplex aus modifizierter Nukleinsäure mit DNA oder mit RNA vorlag. Während die Schmelztemperatur eines Komplexes von modifizierter Nukleinsäure mit DNA bei 37°C lag, war die Schmelztemperatur eines Komplexes von modifizierter Nukleinsäure mit RNA deutlich höher und lag bei 54°C. Die Bindung von RNA an mit am 2' Zuckerrest mit (DL)-C₄ modifizierter RNA ist also wesentlich stärker als die Bindung von DNA.
Beispiel 4:
Verdrängung von DNA aus dem Duplex mit modifizierter Nukleinsäure durch RNA
Wie in Beispiel 1 angegeben wurde ein Duplex bestehend aus modifizierter Nukleinsäure und DNA hergestellt und an eine feste Phase gekoppelt. In diesem Fall wurde als modifizierte Nukleinsäure die Sequenz SeqB, für die DNA die Sequenz SeqA verwendet. Die DNA war an ihrem 5'-Ende mit dem Fluoreszenzfarbstoff FAM (6-FAM) markiert. Zu diesem Duplex wurde in unterschiedlichen Konzentrationen RNA der Sequenz SeqA hinzugegeben, die an ihrem 5'-Ende mit dem Fluoreszenzfarbstoff Hex (6-carboxy-2',4,4',5',7,7'-hexachlorofluorescein-succinimidyl Ester) markiert war. Nach Hybridisierung und Waschen wurden die Mikropartikel in Puffer 1 (siehe Beispiel 1) aufgenommen und die Fluoreszenz an den Partikeln in einem Stratagene 3005 p gemessen. Die detektierte FAM-Fluoreszenz stammt von DNA, die an die modifizierte Nukleinsäure an den Mikropartikeln hybridisiert war. Die detektierte Hex-Fluoreszenz stammt von RNA, die die DNA von den am 2' Zuckerrest mit (DL)-C₄ modifizierten Oligonukleotiden verdrängt hatte. Das Versuchsergebnis ist in gezeigt und zeigt eine deutliche Verdrängung der DNA durch die RNA aus dem Duplex mit modifizierter Nukleinsäure.
Beispiel 5:
Verdrängung von DNA aus dem Duplex mit modifizierter Nukleinsäure durch RNA bei gleichzeitiger Anwesenheit von weiteren Nukleinsäuren
Vorgegangen wurde wie in Beispiel 4 beschrieben. Zusätzlich zur RNA wurden zum Duplex aus modifizierter Nukleinsäure und DNA noch 500 ng Gesamt-RNA sowie 50 ng genomische DNA, die jeweils aus menschlichen Zellkultur-Zellen (Jurkat) mit Hilfe des RNeasy bzw. DNeasy Kits (QIAGEN) isoliert worden waren, zum Hybridisierungsansatz hinzugegeben. Mittels Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) wurde zuvor ausgeschlossen, dass die Sequenzen SeqA und SeqB in menschlichen Zellkultur-Zellen vorkommen. Eine konkurrierende sequenzhomologe Hybridisierung der genomischen DNA oder der Gesamt-RNA konnte also ausgeschlossen werden. In diesem Experiment wurde die Fluoreszenzabnahme der DNA der Sequenz SeqA aus dem Duplex gemessen in Abhängigkeit der Menge an RNA der Sequenz SeqA. Die Fluoreszenzabnahme wurde mit Hilfe des FacsCalibur (Becton Dickinson) bestimmt. In ist das Ergebnis dieses Experimentes wiedergegeben. Das Experiment zeigt, dass nicht sequenzhomologe Nukleinsäuren den Nachweis einer sequenzhomologen RNA nicht beeinträchtigen.
Beispiel 6:
Verdrängung von DNA aus dem Duplex mit modifizierter Nukleinsäure durch RNA bei gleichzeitiger Anwesenheit von weiteren zellulären Bestandteilen
Vorgegangen wurde wie in Beispiel 4 beschrieben. Zusätzlich wurde zum Duplex aus modifizierter Nukleinsäure und DNA noch das Lysat von etwa 500.000 menschlichen Zellkultur-Zellen (Jurkat) gegeben, das durch mechanische Lyse gewonnen wurde. Die RNA-Menge, die die DNA aus dem Duplex verdrängen sollte, wurde in unterschiedlichen Konzentrationen relativ zum Duplex aus modifizierter Nukleinsäure mit DNA hinzugegeben. Nach Waschen wurde die Fluoreszenzabnahme der DNA der Sequenz SeqA aus dem Duplex gemessen in Abhängigkeit der Menge an eingesetzter Menge RNA der Sequenz SeqA. Die Messung wurde wie in Beispiel 5 mit Hilfe des FacsCalibur (Becton Dickinson) durchgeführt. In ist das Ergebnis dieses Experimentes wiedergegeben. Dieser Versuch zeigt, dass auch beim Hinzufügen zellulärer Bestandteile die sequenzhomologe RNA in der Lage ist, die DNA gleicher Sequenz aus dem Duplex mit am 2' Zuckerrest durch (DL)-C₄ modifizerte Oligonukleotide zu verdrängen, wobei auch geringere molare Mengen an RNA relativ zur molaren Menge an Duplex hierfür ausreichend sind. Da zelluläre Bestandteile den Nachweis der RNA nicht stören, ist eine Aufreinigung der biologischen Probe vor dem Nachweis einer sequenzhomologen RNA mit Hilfe des Duplex aus modifizierter Nukleinsäure und DNA nicht erforderlich.
Beispiel 7:
Verdrängung von DNA aus dem Duplex mit modifizierter Nukleinsäure durch RNA in der Flüssigphase
Vorgegangen wurde wie in Beispiel 2 skizziert. In Puffer 1 wurde ein Duplex gebildet, bestehend aus DNA der Sequenz SeqA, die am 3'-Ende mit Alexa 532 markiert war, sowie modifizierter Nukleinsäure der Sequenz SeqB, die am 5'-Ende durch den Black Hole Quencher BHQ1 (Biosearch Technologies) markiert war. Zu diesem Duplex wurde mm nicht markierte RNA der Sequenz SeqA in unterschiedlichen Konzentrationen hinzugegeben. Anschließend wurde die freigesetzte Alexa 532 Fluoreszenz in einem Stratagene 3005 p gemessen. So lange die DNA im Duplex mit modifizierter Nukleinsäure vorliegt, ist die Alexa 532 Fluoreszenz durch den Black Hole Quencher BHQ1 gelöscht. Erst wenn die DNA aus dem Duplex mit modifizierter Nukleinsäure verdrängt wird, ist Alexa 532 nicht mehr in räumlicher Nähe zu BHQ1, und eine Fluoreszenzsteigerung lässt sich beobachten. Das Ergebnis dieses Experimentes ist in dargestellt. Bei einem 2-fachen Überschuss an RNA (80 nM) relativ zur DNA (40 nM) ist die gesamte DNA aus dem Duplex verdrängt, bei einem äquimolaren Verhältnis (jeweils 40 nM) sind etwa 80% der DNA aus dem Duplex verdrängt worden. Auch ein 5-facher Unterschuss (8 nM) an eingesetzter RNA relativ zum Duplex reicht aus, um deutlich die Anwesenheit der RNA durch eine Fluoreszenzzunahme durch die freigesetzte DNA nachzuweisen.
Beispiel 8:
Verdrängung von DNA aus dem Duplex mit modifizierter Nukleinsäure durch RNA in der Flüssigphase bei gleichzeitiger Anwesenheit von weiteren Nukleinsäuren
Vorgegangen wurde wie in Beispiel 7 beschrieben, nur dass diesmal mit den Sequenzen SeqX für RNA und DNA und SeqY für modifizierter Nukleinsäure gearbeitet wurde. In einen Teil der Reaktionsansätze wurden zusätzlich zur nachzuweisenden RNA noch 10 μl einer Gesamt-RNA Präparation aus E. coli, die mit Hilfe von RNeasy (QIAGEN) gewonnen wurde, hinzugefügt.
Das Ergebnis dieses Experiments ist in dargestellt. Es zeigte sich, dass durch die Zugabe von E. coli Gesamt-RNA die Fluoreszenzwerte generell etwas höher waren (helle Balken) als ohne diese Zugabe (dunkle Balken), der Verlauf der Fluoreszenzzunahme mit steigender Menge an RNA der SeqX jedoch identisch ist, so dass durch die Zugabe von nicht komplementärer RNA die Spezifität und die Nachweisgrenze der nachzuweisenden RNA nicht beeinträchtigt sind.
Beispiel 9:
Verdrängung von DNA aus dem Duplex mit modifizierter Nukleinsäure durch RNA in der Flüssigphase bei gleichzeitiger Anwesenheit von weiteren Zellbestandteilen
Vorgegangen wurde wie in Beispiel 8 beschrieben, nur dass diesmal anstelle von E. coli Gesamt-RNA das Zell-Lysat von etwa 500.000 menschlichen Zellkultur-Zellen (Jurkat), die durch mechanische Lyse gewonnen wurden, in den Hybridisierungsansatz eingesetzt wurde. zeigt, dass die Fluoreszenzprofile nahezu identisch sind, die Bestandteile eines Zell-Lysates wie beispielsweise Proteine, weitere Nukleinsäuren und Zucker, haben demzufolge weder einen Einfluss auf die Spezifität noch auf die Sensitivität des Testsystems.
Beispiel 10:
Nachweis von langen RNA-Molekülen
In den Beispielen 3 bis 9 wurden jeweils kurze RNA-Oligonukleotide mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens nachgewiesen. Dieses Verfahren ist jedoch nicht nur für kurze RNA-Oligonukleotide geeignet, auch RNA, die in der Länge der Länge einer typischen mRNA entspricht, kann mit Hilfe dieses Verfahrens nachgewiesen werden. Vorgegangen wurde wie im Beispiel 4 beschrieben, jedoch wurden folgende Nukleinsäuren für dieses Experiment verwendet:
DNA der Sequenz SeqX, am 3'-Ende mit Alexa 532 markiert
Modifizierte Nukleinsäure der Sequenz SeqY, am 5'-Ende mit BHQ1 markiert
RNA: in vitro transkribierte 860 Nukleotide lange artifizielle RNA, die das offene Leseraster des humanen RANTES Gens, einem Mitglied der Interleukin-8 Überfamilie der Cytokine, beinhaltete.
Das Ergebnis dieses Experimentes ist in gezeigt. Es verdeutlicht, dass sich nicht nur kurze RNA-Oligonukleotide, sondern auch RNA-Moleküle von mehreren hundert Nukleotiden Länge mit dem erfindungsgemäßen Verfahren nachweisen lassen.

Claims

Verfahren zum spezifischen Nachweis von Ribonukleinsäuren, umfassend die folgenden Verfahrensschritte: a) Ausbilden eines Duplex durch Hybridisierung einer ersten Nukleinsäure (NA1) an eine mindestens teilweise komplementäre zweite Nukleinsäure (NA2), wobei NA1 mindestens ein nicht natürlich vorkommendes Nukleotid enthält, das mindestens eine Modifikation an einem Zuckerrest aufweist und wobei NA2 ebenfalls mindestens ein nicht natürlich vorkommendes Nukleotid enthält, das mindestens eine Modifikation an einem Zuckerrest aufweist oder eine nicht modifizierte Desoxyribonukleinsäure ist; b) in Kontakt bringen des Duplex aus Schritt a) mit einer nachzuweisenden Ribonukleinsäure (NA3), die mindestens teilweise Sequenzhomologie mit NA2 aufweist; c) Hybridisierung von NA3 an NA1, wobei NA2 von NA1 verdrängt wird und ein Duplex aus NA3 und NA1 ausgebildet wird; d) Detektion des Verdrängungsereignisses aus Schritt c).
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei der Duplex aus Schritt a) oder Schritt c) detektierbar markiert ist.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 oder 2, wobei mindestens eine der Nukleinsäuren NA1, NA2 und/oder NA3 des Duplex an eine feste Phase gekoppelt ist.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Ribonukleinsäure NA3 eine natürlich vorkommende Ribonukleinsäure ist.
Verfahren gemäß Anspruch 4, wobei die natürlich vorkommende Ribonukleinsäure NA3 ausgewählt ist aus der Gruppe der mRNAs, nicht-kodierenden RNAs oder viralen RNAs.
Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass NA1 und/oder NA2 mindestens ein nicht natürlich vorkommendes Nukleotid enthalten, das mindestens eine Modifikation an einem Zuckerrest aufweist, wobei der Zuckerrest eine Ribose ist.
Verfahren gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die mindestens eine Modifikation am Zuckerrest eine Modifikation am 2'C-Atom des Zuckerrestes ist.
Verfahren gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Modifikation am 2'C-Atom des Zuckerrestes ein Hydroxyalkyl-oxymethyl Substituent ist.
Verfahren gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Modifikation am 2'C-Atom des Zuckerrestes ein 2'-O-[((2R,3S)-2,3,4-trihydroxy-butyl)oxymethyl] Substituent ist.