CN107709573A - 用于在采用ddNTP的方法中防止假阳性的方法和产品 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种当在聚合酶的存在下防止ddNTP与双链多核苷酸的不期望的结合的方法。这样的方法可以用于防止在采用ddNTP的方法中(例如在序列检测法中)出现假阳性。本发明还提供了一种避免假Tm读数或假FRET效应(例如假阳性淬灭)的方法，例如在熔解曲线分析方法中。特别地，本发明提供了一种方法，其中使用以下方法检测待测多核苷酸中的目标核苷酸序列，该方法中根据目标序列是否存在，产生可能包含或可能不包含两个标签的双链分子，其中所述两个标签的存在优选地通过进行熔解曲线分析确定。
Description
技术领域
本发明涉及一种当在聚合酶的存在下防止ddNTP与双链多核苷酸的不期望的结合的方法。这样的方法可以用于防止在采用ddNTP的方法中(例如在序列检测法中)出现假阳性。本发明还提供了一种避免假Tm读数或假FRET效应(例如假阳性淬灭)的方法，例如在熔解曲线分析方法中。特别地，本发明提供了一种方法，其中使用以下方法检测待测多核苷酸中的目标核苷酸序列，该方法中根据目标序列是否存在，产生可能包含或可能不包含两个标签的双链分子，其中所述两个标签的存在优选地通过进行熔解曲线分析确定。
背景技术
目标样品内的多核苷酸测序和特异性多核苷酸序列的鉴定已经通过多种方法进行了多年，并且允许收集关于该样品的信息，其可以用于多种方式，例如，用于诊断目的(例如，用于检测污染物的存在和/或样品类型、疾病的发病率或倾向等)。
在许多情况下，可以通过检测序列内的变异来获得相关信息，例如，在单一碱基上。这种变异可能由等位基因变异或多态性、点突变或遗传物质的任意缺失或插入引起。单核苷酸多态性(SNPs)的检测特别有意义。这些SNP反映了群体内的自然变化。SNP提供可用于研究群体动态(population dynamics)和进化的标志物，以研究复杂表型的遗传基础和法医学或诊断检测法。特别地，已经发现SNP与特定疾病相关，因此可以用于鉴定具有该疾病倾向的个体和/或根据该个体的基因型为其定制治疗。
许多测序方法，包括SNP检测，涉及双脱氧NTPs的使用。DNA测序已经通过自20世纪80年代以来使用的Sanger双脱氧法传统进行(Sanger,Nicklen and Coulson,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1977,74,5463-7)。它是基于对可被克隆的DNA的电泳过滤的多分子方法，首先用酶处理。酶法使用终止链延伸的荧光团标记的双脱氧NTPs和不终止链延伸的dNTPs的混合物通过中断聚合产生单链DNA。因此，使用这种方法获得链长度的混合物，其中每个DNA链的长度表示碱基位置，并且所连接的荧光团的颜色表示3'端碱基的标识(identity)。这些标识被读取为排列的彩色点，一行点代表一个DNA序列。
可能包括使用ddNTP的其他测序方法包括：当ddNTP可与连接到目标序列的探针一起使用时，通过逐步连接和切割进行测序。
存在多种常用的检测SNP的方法。可以使用对特定SNP特异的寡核苷酸的杂交，并且可以检测结合，例如通过使用寡核苷酸作为引物(即PCR中的扩增是SNP序列存在的证据)。寡核苷酸可以结合至SNP(这样需要使用不同的寡核苷酸以适应不同的序列)，或者可以结合SNP的上游(其中只有相关序列通过作为引物的寡核苷酸延伸)。可以使用涉及等位基因特异性连接(当两个结合的探针仅在结合至相关序列时才能连接)或等位基因特异性酶裂解的方法。
在本案中最感兴趣的是使用等位基因特异性单碱基引物延伸来检测SNP，其中鉴别发生在核苷酸掺入的水平(在延伸期间)而不是寡核苷酸(引物)结合的水平。在这种情况下，引物在多态性位点上游的一个核苷酸退火，使得待掺入新生链的第一个核苷酸与多态性位点相对。可以使用用于检测的多种不同的标签和平台。在一个选项中，可以使用一种检测方法，其中可以使用具有特异于感兴趣的SNP的ddNTP进行引物延伸以产生标记的探针(当SNP存在时)，然后通过结合至互补序列来捕获该标记的探针，并且该与互补序列连接的标记的量指示感兴趣的SNP的存在(和量)(WO99/50448)。
使用ddNTP的单核苷酸引物延伸也已经用于US2002187477中，其中基于所掺入的标记的ddNTP或延伸分子的长度来检测延伸反应(dNTP也可用于该方法)。US2009305249也使用单核苷酸引物延伸并基于产品的标签和大小检测标记的分子。WO2012/049279还讨论了单核苷酸引物延伸用来产生产物，该产物可以基于其在IP/RP HPLC中的大小和碱基组成来区分。
在上述方法中，当采用ddNTP时，其用于结合至互补碱基并终止任何延伸反应。该分子的存在可以用于鉴定样品(待测多核苷酸)中(在相关的序列背景中)互补碱基的存在或量。
然而，现在已经发现，在如下文所述的某些条件下，并且不仅在正常引物延伸反应期间，ddNTP可以与双链多核苷酸缔合或结合。这可能导致测序/SNP检测方法中的假阳性。然而，现在已经发现，可以通过如下文所述的多种方式避免该结合。因此，本发明的方法用于防止ddNTP与双链多核苷酸的错误结合(或缔合)，其使得避免序列检测法中的假阳性。此外，还发现了聚合酶还稳定了多核苷酸双链体，其影响了它们的熔解温度并且可能导致假FRET效应，例如荧光标记的假阳性淬灭。本发明的方法能够避免这些影响，特别是在熔解曲线分析方法中。
特别地，本发明方法的优点可以用于鉴定待测多核苷酸中目标核苷酸序列的方法，其中用标记探针和用第一标签标记的相关ddNTP进行特异性单碱基引物延伸，并且所得标记探针(根据待测多核苷酸序列中相应的互补碱基的存在可能被标记或不被标记)结合至携带第二标签的报告探针，所述第二标签影响了第一标签产生的信号(或反之亦然)。因此对生成的复合物进行熔解曲线分析。在复合物的变性(或解离)和/或杂交的过程中，两个标签彼此分离，使得一个标签对另一个标签的信号的影响被改变。这使得通过监测变性/杂交过程中信号的变化来鉴别标记探针上的标签的存在(因此存在目标SNP)。如下文更详细地描述的，该方法可以容易地通过使用不同标签和探针进行复用，所述不同的标签和探针产生具有不同熔融温度的复合物。
虽然不希望受到理论的限制，据信ddNTP与双链多核苷酸的结合通过多种机制发生，这取决于双链多核苷酸的性质。该多种机制可概括如下：
a)以聚合酶作为用于所述结合(例如在该方法中络合分子)的介体或接合体(adaptor)，ddNTP与双链多核苷酸的非共价结合；
b)借助于聚合酶的末端转移酶活性，ddNTP与双链多核苷酸的共价结合；
c)借助于聚合酶混杂掺入非互补的ddNTP，ddNTP与双链多核苷酸的共价结合。
如果双链多核苷酸向ddNTP提供凹陷的3'末端和相邻互补碱基，则共价结合也可以通过正常的聚合酶活性将ddNTP掺入双链多核苷酸而发生。通常可以通过适当选择双链多核苷酸的序列和/或其成分序列的长度来避免这种情况。然而，本文所述的方法也用于避免这种结合。
已经发现聚合酶的存在影响(提高)双链多核苷酸的熔解温度，从而导致假Tm。也已经发现聚合酶会产生假FRET效应，如假阳性淬灭，其即使没有ddNTP存在也可能影响结果。本文所述的方法也用于解决引起不准确结果的这一原因，在该方法中除去了聚合酶。
以前没有观察到这样的结合。虽然不希望受到理论限制，这种类型的结合是否会发生至少部分地由双链分子的类型决定。a)的非共价结合可能发生在具有平末端和3'或5'突出末端的分子上。b)的共价结合发生在具有平末端的分子上，但是出现序列敏感性；其在具有3'或5'突出末端的分子上似乎不会发生。c)的共价结合发生在具有5'突出末端的分子上。据信共价结合是通过在链延伸反应中借助于聚合酶的酶活性在5'至3'方向延伸多核苷酸掺入碱基而发生的。对Tm的聚合酶依赖性的影响和假FRET效应的产生发生在所有类型的双链分子上。
可以通过多种手段避免ddNTP的结合。可以通过有效去除聚合酶、去磷酸化或去除ddNTP和/或用其他ddNTP(例如未标记的ddNTP)竞争胜过ddNTP来除去a)的非共价结合。可以使用类似的机制来避免b)和c)中的共价结合。也可以通过改变双链多核苷酸的单链区域的长度以提供对上述结合不太敏感的分子(例如通过提供单链区域，例如3'突出区域或延长单链区域)来减少或消除不期望的非共价和/或共价结合。较长的单链区域对上述不期望的结合较不敏感和/或可用于减少ddNTP的影响(例如，如果它被标记并与双链分子中的其他位置的标签相互作用，则其影响可能会通过增加与其他标签的距离而降低)。
发明内容
因此，在本发明的第一个方面，提供了一种在聚合酶的存在下防止ddNTP与多核苷酸结合的方法，其中所述多核苷酸是双链的，但任选地可以包含长度至多10个核苷酸的单链区域，其中当所述单链区域提供5'突出序列时，其在紧邻所述双链区域不包含与所述ddNTP互补的碱基(优选地在所述单链区域中任何地方不包含与所述ddNTP互补的碱基)，其中所述方法(i)包括灭活、降解或除去所述聚合酶、去磷酸化或除去所述ddNTP和/或用另一种ddNTP竞争胜过所述ddNTP和/或(ii)使用具有单链区域的多核苷酸，其提供长度为至少1个(优选至少2个或3个)核苷酸的3'突出序列，或长度为至少2个(优选至少3个或4个)核苷酸的5'突出序列，和/或使用在多核苷酸的一个或两个末端具有单链区域的多核苷酸，所述单链区域的长度为至少1个核苷酸，所述单链区域至少部分地由所述多核苷酸中的一个或多个碱基对之间的错配导致。至少部分地由错配产生的单链区域可以在一个或两个末端提供3'或5'突出序列或两者，例如在一个末端的错配可能导致在该末端的3'和5'突出序列。
在一个方面，ddNTP携带一个标签。在特别优选的方面，ddNTP携带第一标签，并且所述多核苷酸携带第二标签，并且当所述标签彼此靠近时，所述第一或第二标签影响由另一标签产生的信号。优选地，所述第一或第二标签是荧光团，而另一标签是当在所述荧光团附近时影响所述荧光团的荧光的分子。
在另一个优选的方面，所述方法还包括通过使第一和第二多核苷酸(其充分互补以允许结合)在允许其杂交的条件下接触来产生双链多核苷酸的步骤。
如本文所使用的，对单个实体的提及包括对复数形式的实体的提及，反之亦然。提及由术语“和/或”连接的选择的列表表示可以使用或存在那些选择的任意、全部或任何组合。
如本文所用，提及在聚合酶的存在下“防止”ddNTP与多核苷酸的结合是指完全或部分阻止，即防止ddNTP与多核苷酸的任意或某些结合，其不是通过从自由3'末端的正常的聚合酶介导的延伸反应。当聚合酶通过加入与模板在5'至3'方向上互补的dNTP或ddNTP，通过引入与模板序列中的碱基互补的连续碱基，合成与DNA模板链互补的新DNA链时，发生正常的延伸反应。
ddNTP的“结合”包括共价和非共价结合二者，并且可以是多核苷酸和ddNTP之间的直接结合，或通过另外分子的中间性(intermediacy)使得ddNTP与多核苷酸结合。
“ddNTP”是2',3'双脱氧核苷酸，其是DNA聚合酶的链延伸抑制剂。ddNTP缺乏3'-羟基，因此一旦通过DNA聚合酶加入到生长的核苷酸链中，就由于不能产生磷酸二酯键而不能再加入核苷酸。ddNTP可以是ddGTP、ddATP、ddTTP(或ddUTP)和ddCTP的五选一，分别提供了对应于鸟嘌呤、腺嘌呤、胸腺嘧啶(或尿嘧啶)和胞嘧啶碱基的链终止核苷酸。还可以使用功能等价的ddNTP变体、衍生物或类似物，例如具有生物活性的非核苷酸类似物(例如AcycloTerminators(acyNTPs)；PerkinElmer Life Sciences)。与ddNTP具有相同或相似功能的功能等价的变体、类似物或衍生物，只要它们可以在链延伸期间通过DNA聚合酶掺入到生长的核苷酸链(DNA)中即可，但是一旦掺入就可防止进一步的链延伸。优选地，功能等价的变体、衍生物或类似物具有与ddNTP一样的一部分结构，例如，包括ddNTP的三磷酸基团和/或碱基。本文所述的聚合酶可与ddNTP变体、衍生物或类似物一起使用，或者可以使用对该变体/类似物/衍生物特异的聚合酶，例如，AcycloPol；PerkinElmer Life Sciences。本文中提及的“ddNTP”包括这样的ddNTP变体、类似物和衍生物。优选地，所述ddNTP如下文所述是标记的。对本文所用的“dNTP”的定义类似，但与脱氧核苷酸(三磷酸)有关，而不是双脱氧核苷酸，并且类似地包括如上所述的变体、类似物和衍生物。
本文(可交换地)使用的术语“碱基”或“核苷酸”包括腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶的天然核苷酸，特别是以2'-脱氧形式或以相同的方式起作用的非天然核苷酸，即与天然核苷酸形成互补碱基对。
提及“互补碱基”是指根据沃森-克里克配对法则与其配对碱基特定地碱基配对的碱基。配对碱基是腺嘌呤和胸腺嘧啶(或尿嘧啶)；和胞嘧啶和鸟嘌呤。互补序列是含有一系列互补碱基的序列，其允许序列通过互补碱基之间的碱基配对进行杂交。
本文所述的“多核苷酸”是含有多个核苷酸的DNA序列并包含寡核苷酸和多核苷酸。该序列是双链的，其包含第一链和第二互补链，所述第二互补链能够通过互补碱基之间的结合与第一链结合。优选地，所述双链多核苷酸(其最终形式)不是由引物延伸以形成该分子而产生的(即，不是由引物与多核苷酸结合，并且引物延伸以形成双链分子而直接得到的双链分子)。因此，虽然第一和第二链本身可以通过引物延伸反应产生，但是它们优选不一起产生以形成双链分子，其中第一链或第二链的部分用作引物。在引物延伸确实发生以形成双链多核苷酸的情况下，所述引物延伸优选小于6个核苷酸长度，例如1、2、3、4或5个核苷酸长度。双链多核苷酸序列由两个序列组成，其可以各自为任何长度，但优选各自包含至少5个核苷酸，并且优选5至200个核苷酸，例如10至100个核苷酸，例如20至50个核苷酸长度。在一个替代方案中，提供两个序列的第一链和第二链可以结合在一起，例如，可以提供在展示出自结合的单条多核苷酸链上。然而，在一个优选的方面，第一链和第二链的两个序列是分离的分子。
为了能够形成双链分子，两个序列能够通过其序列内的碱基的互补性彼此结合。互补结合涉及的碱基的数目必须足够以能产生稳定的复合物。当产生平末端双链分子时，这可能涉及所有的碱基，尽管如下文进一步所讨论的，即使在这种情况下，在某些碱基处的非互补性(错配)是可以容忍的。当产生具有突出末端的双链分子时，互补结合(杂交或双链区域)涉及的碱基可以包含构成复合物的较短序列的全部或部分，和构成复合物的较长序列的部分。在一个优选的特征中，构成双链寡核苷酸的序列中的至少5个连续碱基，优选5至200个连续碱基，例如，10至100个连续碱基，例如20至50个连续碱基彼此互补(其可以形成序列的总长度的50-100％，例如80-100％)。(“连续”碱基包括偶尔的，例如一个或两个，散布的、错配碱基的可能性。)
在一个优选的特征中，结合序列在一起以形成双链多核苷酸所涉及的序列的区域彼此具有100％互补性。然而，这并不是必需的，而且完美的碱基配对不是必要的。因此，如果两个分子具有足够的互补性以允许形成对于进行常规熔解温度分析足够稳定的复合物，则可以容忍该区域内的错配。因此，例如，彼此结合的序列的区域可以仅共享80％、90％或95％互补性(例如可能具有一个、两个、三个或更多个错配)。如本文所讨论的，错配碱基可以用于全部或部分地提供双链多核苷酸的单链区域，例如可以向所述单链区域提供一个或多个碱基。
双链多核苷酸可能含有“单链区域”。当构成双链多核苷酸的序列的全长不涉及与互补碱基结合时，存在这样的区域。特别地，单链区域可能存在于双链多核苷酸的末端，以产生3'突出或5'突出的单链区域。当存在的单链区域在构成双链分子的序列之一的5'(或3')端终止时，存在5'(或3')突出序列。单链部分可通过其碱基彼此不结合的错配碱基对而存在或延伸，并且因此直接造成单链区域或影响配对(互补)碱基对之间的结合，使得它们不再结合从而促成单链区域。
当单链区域存在并形成5'突出序列时，其在紧邻所述双链区域处不包含与在所述方法中所用的ddNTP互补的碱基。优选地，所述单链区域在紧邻所述双链区域处不包含与可用于所述方法中的任意dNTP互补的碱基。因此，例如，如果使用的ddNTP是ddGTP，则形成5'突出序列的单链区域不包含鸟嘌呤的互补碱基，即在紧邻双链区域处不包含胞嘧啶。在某些方法中，可以使用多种ddNTP，并且在这种情况下，所用的与任意ddNTP互补的碱基(或者如果ddNTP被标记，与所用的标记的任意ddNTP互补的碱基)不存在于单链区域中紧邻双链区域处，其中所述单链区域形成5'突出序列。“紧邻”双链区域是指存在于从5'到双链区域的单链区域中的第一个碱基。这可能是这样的碱基，不存在碱基与其可能形成碱基对，或者在错配碱基的情况下，存在碱基与其可能形成碱基对但不结合。优选地，当单链区域提供5'突出序列时，在所述单链区域中任意位置其都不包含与所述ddNTP(或dNTP)互补的碱基。
单链区域的长度可以短至1个核苷酸，或长达5、10、20或30个核苷酸。在聚合酶存在下防止ddNTP与多核苷酸结合的方法中，所述单链区域具有至多10个核苷酸。然而，也包括这样的方法，但是其中使用较长的单链区域。更长的单链区域可以存在于本发明的其它方法中。优选地，当本发明的方法包括灭活、降解或除去聚合酶和/或去磷酸化或除去ddNTP和/或竞争胜过ddNTP的步骤时，单链区域的长度为1至5个核苷酸，优选长度为1个、2个或3个核苷酸。
本文提及聚合酶的“存在”。存在的聚合酶是与ddNTP和双链多核苷酸两者直接接触的功能活性聚合酶。优选地，在相关的互补dNTPs和/或ddNTPs存在的情况下，在足以允许引物延伸的条件和浓度下提供聚合酶。
如本文所述，“聚合酶”是在5'至3'方向上能够引发双链多核苷酸的引物延伸的DNA聚合酶。优选地，聚合酶在用于本发明的方法中是耐热的，特别是使用温度循环步骤的那些。优选地，聚合酶来自A、B、C、D、X或Y家族中的任意一个，并且优选地具有分类EC2.7.7.7或2.7.7.49。
A家族中的聚合酶的实例包括T7DNA聚合酶、Pol I和DNA聚合酶γ。B家族聚合酶包括Pol II、Pol B、Polζ、Polα、δ和ε，而C家族聚合酶包括Pol III。D家族聚合酶在古细菌中发现。X家族聚合酶包括Polβ、Polσ、Polλ和Polμ，最后，Y家族聚合酶包括Polι(iota)、Polκ(kappa)、Pol IV和Pol V。聚合酶可以是原核的、真核的或古细菌来源源。优选地，聚合酶是A家族聚合酶、或Pol III聚合酶、或polβ聚合酶、或古细菌聚合酶、或其突变体，所述突变体就它们在促进相同酶作用的能力而言保持与其母体分子相同或基本相似的功能特性。
特别地，优选A家族聚合酶，特别是Pol I聚合酶，如T7DNA聚合酶和Taq聚合酶(如缺乏外切核酸酶活性的ThermoSequenaseTM)。在一个特别优选的实施方案中，使用thermosequenase样(thermosequenase-like)DNA聚合酶，如或HOTDNA聚合酶(Solis BioDyne)。真细菌聚合酶是特别优选的。还优选有效掺入ddNTP的聚合酶。
聚合酶可以在本发明的方法中失活、降解或除去。方法的选择可能取决于要阻止ddNTP与其结合的双链多核苷酸的性质。如上所述，尽管不希望受到理论的限制，但是认为ddNTP与双链多核苷酸的非共价结合是以聚合酶作为介体或接合体发生的，而共价结合被认为是通过所述聚合酶的酶活性发生的。因此，为了避免后者的共价结合，仅需要降低或去除聚合酶的酶活性，而为了避免非共价结合，优选降解或除去聚合酶。在方法中避免假Tm读数或假FRET效应(例如假阳性淬灭)的方法中，如在下文所述的熔解曲线分析方法中，优选降解或除去聚合酶。然而，也包含灭活聚合酶。
如本文所述，聚合酶的“灭活”是指去除聚合酶的一个或多个酶功能，例如，酶促、结合或结构性质，例如其聚合酶和/或末端转移酶活性和/或DNA结合性质。可以通过执行实施例中描述的方法来测试失活对酶功能的影响，所述实施例描述的方法示出聚合酶共价结合作用。方便地，灭活可以通过以下实现，使用合适的抑制剂，例如梓醇或其类似物，或破坏酶的相关三级结构，例如使用变性剂。在一个优选的方面，去垢剂可用于灭活聚合酶，例如，溶解蛋白质的阴离子去垢剂。在一个特别优选的方面，可以使用十二烷基硫酸钠(SDS)。方便地，可以使用0.05-1.0％，优选0.1-0.25％的浓度。
或者，聚合酶可以“降解”。这可以通过适当的化学或酶学方法来实现。在一个优选的方面，聚合酶通过使用蛋白酶而降解。在一个特别优选的方面，蛋白酶是蛋白酶K(EC3.4.21.64，例如来自Sigma-Aldrich或Promega，Uniprot P06873)，其是广谱和强烈的丝氨酸蛋白酶。去垢剂也可用于降解(以及灭活)聚合酶。
如本文所述，“去除”聚合酶是指在空间上从ddNTP和/或双链多核苷酸分离聚合酶。这可以通过收集ddNTP和/或双链多核苷酸或通过收集聚合酶来实现。因此，例如，可以对混合物进行允许不同组分的分离的纯化技术(例如柱层析或亲和分离)。举例来说，可以使用针对聚合酶的抗体，所述抗体可以连接到固体支持物(例如磁珠)上，以结合聚合酶并允许其从混合物的剩余物中分离。或者，可以使用除去的化学方法，例如在诸如氯仿的有机溶剂中萃取。
如上所述，为了有效地去除聚合酶，可以收集双链多核苷酸(也有效地除去ddNTP或分离分子)。在一个优选的方法中，这是通过亲和结合来实现的，例如通过使用结合配偶体(binding partner)(如下文所述和定义)，其中一个连接到双链多核苷酸，它们一起形成结合对。在一个优选的实施方案中，所述结合对可以是生物素:链霉亲和素。例如，双链多核苷酸可以携带生物素(例如在双链多核苷酸的一条链的5'端)，并且可以通过亲和结合链霉亲和素来收集，链霉亲和素可以负载在固体支持物上，如磁珠。因此，去除聚合酶(或ddNTP)的步骤可以包括如上所述通过亲和结合从聚合酶或ddNTP分离双链多核苷酸的一条或两条链。在下文所述的其中双链多核苷酸由标记探针和报告探针构成的方法中，标记探针或报告探针(优选为前者)可携带上述的结合配偶体。在这种情况下，去除所述聚合酶或ddNTP包括通过亲和结合从所述聚合酶或ddNTP分离所述标记探针和/或报告探针。
在替代方法中，ddNTP可以去磷酸化。当可能发生不恰当的共价结合时，优选使用该方法。合适的磷酸酶来自分类EC 3.1.3.1，包括虾碱性磷酸酶(SAP)(例如可得自Sigma-Aldrich或Affymetrix，Uniprot Q9BHT8)和牛小肠碱性磷酸酶(CIP)(例如可得自Promega或Affymetrix，Uniprot P19111)和FastAP(可得自Thermo Scientific)。
可以通过从双链多核苷酸除去ddNTP来防止ddNTP的结合，例如，通过物理分离分子，或与其他ddNTPs竞争。ddNTP可以通过任何适当的方式去除，例如可以通过如前所述收集双链多核苷酸从ddNTP中去除/分离双链多核苷酸。
提及“竞争胜出(outcompeting)”是指提供足量的其他ddNTP，使得ddNTP与双链多核苷酸的结合被减少或阻止。用于阻止或减少结合的ddNTP必须要与待阻止结合的ddNTP不同并可能对应于不同的碱基(例如ddATP替代ddGTP，优选未标记或携带不同标签)或可能对应于相同或不同的碱基，但不携带标签(例如，标记的ddNTP可能被未标记的ddNTP竞争胜出)。
如上所述，ddNTP的结合也可以通过以下来避免，使用具有长度为至少1个核苷酸(3'突出)或长度为至少2个核苷酸(5'突出)的单链区域的多核苷酸，和/或使用在多核苷酸的一个或两个末端上具有长度为至少1个核苷酸的单链区域的多核苷酸并且所述单链区域至少部分地由所述多核苷酸中的一个或多个碱基对之间的错配导致。该方案可用作聚合酶和/或ddNTPs处理的替代方案(或额外的方案)。在使用这些后续处理的方法中，单链区域的长度优选为1-5个核苷酸，优选长度为1、2或3个核苷酸。然而，当单链区域的长度用作防止ddNTP结合的唯一机制(或结合上述方法)时，单链区域的长度优选至少为2个核苷酸，优选为2-20(或2-30)个核苷酸，例如长度为3-15个或4-10个核苷酸(特别优选2、3或4个核苷酸长度)。优选地，在聚合酶存在下防止ddNTP与多核苷酸结合的方法中，单链区域具有至多10个核苷酸。这确保单链区域不易受到ddNTP的不期望的结合和/或减少ddNTP的影响(例如，如果它被标记并与双链分子中的其他位置的标签相互作用，则其影响可以通过增加与其他标签的距离而减少)。
一种用于引入单链区域(例如在其他平末端双链多核苷酸的任一末端或两个末端，或者为了增加现有的单链区域的长度)的机制是在所述双链多核苷酸的杂交区域的末端引入错配。因此，例如，替代使用平末端双链多核苷酸，可以将一个或多个错配引入到形成双链多核苷酸的多核苷酸之一中。如本文所用，“错配”是指当在双链多核苷酸中形成时，不与其配对的碱基显示互补结合的碱基。“碱基对”是位于不同多核苷酸中的一对碱基，当那些多核苷酸彼此杂交时使得这对碱基彼此靠近并且如果互补的话将彼此结合。
优选地，一个或多个错配位于双链区域的末端，例如，在所述双链区域的一个或两个末端的一个或多个碱基处。然而，也可以使用具有干扰双链区域的末端之一的互补碱基之间结合的作用的错配。优选地，改变至少1个，但优选2个(例如1、2、3或4个)或更多个碱基以提供错配碱基。特别地，这种方法可以用于下文描述的方法，其中双链多核苷酸包括标记探针和报告探针。即使当构成双链多核苷酸的单链多核苷酸具有相同的长度时，使用错配产生的单链区域导致“突出”链，即碱基对之间的结合不足导致突出链。由于碱基对之间结合不足，突出链是3'和5'二者。在一个优选的特征中，单链区域仅是由错配的使用而形成的，但也可以考虑使用错配来扩展单链区域。如本文所提及的，由错配“至少部分”地导致的单链区域定义了错配对单链区域贡献的程度。因此，错配可以在其完全地产生单链区域或仅对该区域的一部分负责，例如，至多3个，例如较长的单链区域的1、2或3个核苷酸。
如上所述，该方法可另外包括通过使第一和第二多核苷酸在允许其杂交的条件下接触来产生双链多核苷酸的步骤。第一和第二多核苷酸具有下文所述的定义。在这种情况下，在生成所述双链多核苷酸之前、期间和/或之后进行以下步骤：灭活、降解或除去所述聚合酶、去磷酸化或除去所述ddNTP、竞争胜出所述ddNTP、和/或使用具有单链区域的具有长度为至少1个核苷酸(3'突出)或2个核苷酸(5'突出)的多核苷酸、和/或使用在多核苷酸的一个或两个末端具有长度为至少1个核苷酸的单链区域的多核苷酸并且所述单链区域至少部分地由所述多核苷酸中的一个或多个碱基对之间的错配导致。如果在产生双链分子之前进行，则避免了随后不能被切断的共价键的产生。之后使用处理方案可以避免非共价的ddNTP结合和直接的聚合酶影响，而非ddNTP的共价结合。在本文中，提及在聚合酶存在下防止ddNTP与(双链)多核苷酸的结合，以及提及多核苷酸采取的形式涉及将形成的双链多核苷酸，即使在处理进行时还没形成双链多核苷酸。
在一个方面，ddNTP携带一个标签。如本文所述，“标签”是可检测的和/或直接或间接产生信号的任意分子或分子组。方便的标签包括比色、化学发光、显色、放射性和荧光标签。如上所述，在一个优选的特征中，ddNTP携带第一标签，并且多核苷酸携带第二标签。这些标签是不一样的。当这些标签彼此邻近时，第一或第二标签会影响另一个标签产生的信号。
如本文所述，标签的“信号”是可以被检测的物理信号，例如，磁性、光学活性、荧光、颜色等，取决于所用标签的性质。可以确定信号的缺失、存在或水平。
在一个优选的方面，第一或第二标签是荧光团，而另一个标签是当在该荧光团附近时影响荧光团的荧光的分子，并且在本发明的一个实施方案中本身可以是荧光团。
仅当第一和第二标签彼此之间足够“接近”时才观察到对信号(例如荧光)的上述影响。标签之间的距离指的是标签之间的空间距离。所观察到的靠近对信号(例如荧光)的影响可以根据标签的选择而不同。当标签存在于在多核苷酸中彼此结合的碱基配对中涉及的核苷酸(即互补结合的核苷酸)上或存在于多核苷酸中的相邻核苷酸上时，观察到对信号(例如荧光)的影响。此外，当标签不出现在互补结合或相邻的核苷酸上，而是出现在当考虑不含三级结构的线性分子时距离该互补或相邻核苷酸1至30个(优选1-5个，例如1、2或3个)核苷酸处的核苷酸上时，可以观察到对信号(例如荧光)的影响。因此，例如，当第一标签出现在核苷酸1上但第二标签出现在互补序列的核苷酸5’处时，其中核苷酸1与互补序列中的核苷酸1’结合，可以观察到影响。实际上，当标签被序列中的大距离分离(例如超过30个核苷酸的距离)时，(也)可以观察到对信号(例如荧光)的影响，但是考虑到发现标签所在分子的三级结构，标签变得更近(例如为上述距离)。
如本文所述，“荧光团”是在特定波长的光激发下可以重新发光的荧光化合物。所述光可以在本发明的方法期间被检测，并提供与标记分子的存在和量相关的可测量信号。
影响另一个标签产生的信号的分子(标签)在接近时提高或减少可测量信号的水平。在一个优选的方面，在靠近该荧光团时，靠近荧光团时影响该荧光团的荧光的分子提高或降低所述荧光团的荧光(即发出的光的量)。例如，可以使用淬灭剂，其降低荧光团的荧光强度。这是通过激发的荧光团通过在激活后将其能量转移给淬灭剂而不发射光回到其基态实现的，同时淬灭剂被激发到其激发态。淬灭剂本身可以是荧光团，也可以是非荧光团。在一个优选的方面，使用荧光共振能量转移(FRET)，其中荧光团将能量转移到淬灭剂(其本身是荧光团)。为了使这种情况发生，荧光团的发射光谱必须与淬灭剂的吸收光谱重叠。如果淬灭剂也是荧光团，则可以使用来自该分子(特定波长下)的光发射作为(第一荧光团的信号的)淬灭已经发生的指示。或者可以使用吸收来自荧光团的激发能量的暗淬灭剂(darkquencher)，但是其将该能量作为热而不是光消散。
在下表中提供用于本发明的合适的荧光团(这些荧光团中的任何一种可用于本发明的方法中：
表1：荧光标签
荧光团可得自各种商业来源，包括Biosearch Technologies、GE Healthcare、Life Technologies、Integrated DNA Technologies、Epoch Biosciences，Inc.和Atto-tec GmbH。
通过选择合适的荧光团，这些荧光团也可以提供一对荧光团:淬灭剂。然而，以下提供了其它合适的淬灭剂的实例，其中包括暗淬灭剂。本发明可以用本文所述的任何淬灭剂进行。
表2：淬灭剂
淬灭剂可得自各种商业来源，包括Eurogentec、Epoch Biosciences,Inc.、Integrated DNA Technologies、Biosearch Technologies、Life Technologies和Atto-tec GmbH。
用于本发明的优选标签包括TAMRA、BODIPY和FAM，所有这些都易于商业获得。在一个优选的特征中，要使用的两个标签是TAMRA和FAM，例如分别在ddNTP和双链多核苷酸(或报告探针，如下文所讨论的)上。暗淬灭剂和荧光团的其它优选组合包括：ATTO540Q/FAM、ATTO540Q/Yakima Yellow、ATTO580Q/ATTO550和ATTO580Q/ATTO565。其它优选的组合包括ATTO612Q/ATTO565、ATTO612Q/ROX、ATTO612Q/CY5、ATTO612Q/CY5.5、DYQ660/ATTO565、DYQ660/ROX、DYQ660/CY5、DYQ660/CY5.5。优选地，双链多核苷酸上的第二标签是荧光团，并且ddNTP上的第一标签是影响荧光团荧光的标签。
标签可以通过本领域熟知的技术连接到ddNTP上。可以使用本领域熟知的技术使用标记的核苷酸来制备标记的多核苷酸。这样的分子易于商购获得。多核苷酸可以在其任意核苷酸上进行标记。然而，优选地，多核苷酸在其一条链的5'末端的三个核苷酸之一处被标记。特别优选地其在组成多核苷酸的一条链的5'端(即末端5'核苷酸)处被标记。
标记可以是直接的(例如，标签通过适当的偶联化学品或通过连接体直接连接到ddNTP或多核苷酸)，或者可以通过结合配偶体连接。这些可能引起共价或非共价缔合。在这种情况下，结合对的第一结合配偶体连接到ddNTP或多核苷酸，并且结合对的第二结合配偶体携带标签。如本文所述，“结合对”是指形成特异性和稳定相互作用的一对分子。实例包括DNA:DNA、配体:受体，抗体:抗原相互作用。这样的结合实体是本领域众所周知的，例如生物素/链霉亲和素。
双链多核苷酸可以采取多种形式。特别地，除非多核苷酸由单一分子组成，否则双链分子在其末端具有多种选择。因此，双链多核苷酸的一端或两端可以是平末端。双链多核苷酸的一端或两端可具有5'突出端。双链多核苷酸的一端或两端可具有3'突出端。因此，例如，两端可以是平末端，或者一端可以是平末端，另一端可以具有5'突出端。如上所述，已经发现作为多种不同机制的结果，ddNTP将结合双链分子，并且发生的机制受双链多核苷酸上存在的末端类型影响。
如本文所述，“平”末端是指发生在双链分子的相关末端的互补碱基配对，即不留下未配对的末端碱基。“3’或5’突出端”是指导致悬垂的一个或多个未配对的末端碱基的存在。5’突出端在其末端具有5’未配对的碱基，即在5’磷酸末端。当双链分子的末端出现错配时，这可能导致分子末端有3’和5’突出端。
尽管不希望受到理论的限制，但似乎平末端可能允许ddNTP与双链多核苷酸的非共价结合，以聚合酶充当用于结合的介体或接合体，并且还允许ddNTP通过聚合酶的末端转移酶活性共价结合双链多核苷酸。因此，防止这种结合的步骤集中于去除聚合酶或其活性(例如酶或DNA结合)或ddNTP。因此，在一个优选的方面，当所述双链多核苷酸的一端或两端是平末端时，该方法包括灭活、降解或除去所述聚合酶；去磷酸化或除去所述ddNTP和/或用另一种ddNTP竞争胜过所述ddNTP。
类似地，似乎5'突出端可以允许ddNTP与双链多核苷酸的非共价结合，以聚合酶作为介体或接合体用于结合，并且还允许ddNTP与双链多核苷酸通过聚合酶的末端转移酶活性或通过聚合酶杂交掺入非互补的ddNTP共价结合。因此，防止这种结合的步骤集中于去除聚合酶或其活性或ddNTP。5'突出端也可以延长以减少非共价结合。因此，在另一个优选的方面，当所述双链多核苷酸的一端或两端具有5'突出端时，该方法包括灭活、降解或除去所述聚合酶；去磷酸化或去除所述ddNTP、用另外的ddNTP竞争胜过所述ddNTP和/或使用具有长度为至少2个核苷酸(5'突出)的单链区域的多核苷酸。或者，可以使用这样的多核苷酸，其在多核苷酸的一个或两个末端上具有长度为至少1个核苷酸以形成5'突出链的单链区域，并且所述单链区域至少部分地由所述多核苷酸中的一个或多个碱基对之间的错配导致。
最后，似乎3'突出端可能允许ddNTP与双链多核苷酸的非共价结合，以聚合酶作为介体或接合体用于结合。因此，防止这种结合的步骤集中在去除聚合酶或其活性或ddNTP或延长3'突出端以减少非共价结合。因此，在另一个优选的方面，当所述双链多核苷酸的一端或两端具有3'突出端时，该方法包括灭活、降解或除去所述聚合酶；对所述ddNTP进行去磷酸化或去除所述ddNTP、用另一种ddNTP竞争胜过所述ddNTP和/或使用具有长度为至少1个核苷酸(3'突出)的单链区域的多核苷酸。或者，可以使用在多核苷酸的一个或两个末端上具有长度为至少1个核苷酸以形成3'突出链的单链区域的多核苷酸，并且所述单链区域至少部分地由所述多核苷酸中的一个或多个碱基对之间的错配导致。
其中聚合酶被去除、变性或灭活的方法也用于去除任何直接的聚合酶依赖性效应，如假FRET效应。
如上所述，ddNTP用于多种方法中，其中ddNTP结合互补核苷酸，特别是在相关酶例如聚合酶的控制下的链延伸方法中。特别是在本发明的这种方法和其它方法中，双链分子如下所述进行解离，优选其中解离是通过加热实现的，并且对双链多核苷酸进行熔解曲线分析。因此，在一个优选的方法中，所述方法包括熔解曲线分析。通常，ddNTP被标记，例如在测序反应中。因此，可以用于防止不恰当的ddNTP结合的上述方法在防止假阳性的产生中特别有用，特别是在序列检测法中。
因此，在另一个优选的方面，本发明提供了一种避免序列检测法中的假阳性的方法，其中所述序列检测法包括以下步骤：使ddNTP、聚合酶和与彼此杂交以形成第三多核苷酸的第一和第二多核苷酸接触，所述第三多核苷酸是具有任选的单链区域的双链多核苷酸，其中当所述单链区域提供5'突出序列时，其在紧邻双链区域不包含与所述ddNTP互补的碱基，其中所述方法通过以下方法阻止ddNTP与所述第三多核苷酸的结合：(i)包括灭活、降解或除去所述聚合酶、去磷酸化或除去所述ddNTP和/或用另一种ddNTP竞争胜过所述ddNTP，和/或(ii)使用具有长度为至少1个核苷酸(3'突出)或2个核苷酸(5'突出)的单链区域的多核苷酸，和/或使用在多核苷酸的一个或两个末端上具有长度为至少1个核苷酸的单链区域的多核苷酸，并且所述单链区域至少部分地由所述多核苷酸中的一个或多个碱基对之间的错配导致。
在一个优选的方面，在所述双链多核苷酸(第三多核苷酸)产生之前、期间和/或之后进行以下步骤：灭活、降解或除去所述聚合酶、去磷酸化或除去所述ddNTP、竞争胜过所述ddNTP、和/或使用具有长度为至少1个核苷酸(3'突出)或2个核苷酸(5'突出)的单链区域的多核苷酸、和/或使用多核苷酸的一个或两个末端上具有长度为至少1个核苷酸的单链区域的多核苷酸并且所述单链区域至少部分地由所述多核苷酸中的一个或多个碱基对之间的错配导致。
如上所述，该方法包括在聚合酶存在下防止ddNTP与多核苷酸结合的方法。
上文提供的定义和优选选项同样适用于该方法。特别地，单链区域，步骤(i)和(ii)和聚合酶如上所述。“第一”和“第二”多核苷酸对应于上述第一和第二链，并且可以存在于单个多核苷酸上，但优选提供在单独的分子上。作为双链多核苷酸的第三多核苷酸对应于上述双链多核苷酸。ddNTP和双链多核苷酸可以如上所述被标记。要使用的处理和它们应用的双链分子的类型也适用于该方法。
如本文所提及的，“假阳性”是指示一种属性存在、而实际上不存在的结果，所述属性通过所设计的测试来鉴定。这也延伸到可能存在但没有达到结果指示的程度内的一种属性的虚假、明显的增加。在序列检测法的情况下，假阳性对应于当该核苷酸、碱基或序列不存在时特定核苷酸、碱基或序列的识别，例如使用该方法发现一种待测多核苷酸中含有SNP，但该SNP实际上并不出现在该待测多核苷酸中。
本文所用的“序列检测法”是指确定核苷酸序列的方法。可以确定全部或部分序列。在一些情况下，可以确定序列中的单个碱基或多个碱基(或单个或多个核苷酸)，尽管通常这是在周围序列的环境中，因此，例如，该测试证实在其周围序列中SNP存在或不存在。根据使用的方法，确定至少一个核苷酸/碱基，例如可以确定至少2、3、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、4000、6000或10000个或更多个核苷酸，特别是当使用该方法的多个循环时。
核苷酸序列的确定包括在特定位置鉴定特异性碱基(即A、T/U、G或C)，即绝对鉴定，或提供该碱基的部分鉴定，例如该方法可以识别小于4(即3或2)个碱基的一个组，其由该碱基的选择组成，例如，A或T，而非G或C，或A、T或G而非C。
在本发明的这个方面，使ddNTP、聚合酶和第一和第二多核苷酸彼此接触。第一和第二多核苷酸彼此杂交以形成第三(双链)多核苷酸。因此，在允许其杂交的适当条件(例如温度、浓度、缓冲条件)下，至少使第一和第二多核苷酸接触。也使ddNTP和聚合酶与这些分子接触(即在同一反应容器中允许与这些分子的物理接触)。可以在第一和第二多核苷酸彼此接触的同时，将ddNTP和/或聚合酶加入(或存在于)反应混合物中，或者可以在第一和第二多核苷酸中一者或两者加入到混合物之后将ddNTP和/或聚合酶加入反应混合物，即四种元素可以以任何顺序连续地或(四种元素中的两种或更多种)同时地加入到反应混合物中。可以在产生所述双链多核苷酸之前、期间和/或之后进行以下步骤：灭活、降解或除去所述聚合酶，去磷酸化或除去所述ddNTP，竞争胜过所述ddNTP和/或使用具有长度为至少1个核苷酸(3'突出)或2个核苷酸(5'突出)的单链区域的多核苷酸，和/或使用在多核苷酸的一个或两个末端上具有长度为至少1个核苷酸的单链区域的多核苷酸并且所述单链区域至少部分地由所述多核苷酸中的一个或多个碱基对之间的错配导致。因此，当要加入特定分子时，例如，磷酸酶和/或蛋白酶和/或去污剂，可以与第一批试剂一起加入或在反应的随后点加入。
该方法也可以在其它试剂的存在下进行。由于该方法可能在正常延伸反应期间或随后发生，用于该延伸反应的其它试剂(例如一种或多种dNTP)也可以存在。
优选的序列检测法基于通过聚合酶将标记的ddNTP掺入链延伸反应中，并且包括Sanger双脱氧法并通过逐步连接和切割进行测序。然而，在一个优选的方面，所述方法用于其中序列检测涉及使用单碱基引物延伸反应的方法中。
因此，在另一个优选的方面，本发明提供了一种在待测多核苷酸中鉴定目标核苷酸序列的方法，包括：
(a)将所述待测多核苷酸与ddNTP和未标记的标记探针接触，该探针在存在时与所述目标核苷酸序列杂交，在聚合酶存在下，该探针连接与所述目标核苷酸序列中与所述ddNTP互补的碱基的直接5'端，其中所述ddNTP携带第一标签，并且当所述目标序列存在于所述待测多核苷酸中时，所述未标记的标记探针与所述待测多核苷酸杂交并且通过所述聚合酶在3'方向上延伸以将所述标记的ddNTP连接到所述未标记的标记探针以形成标记的标记探针；
(b)从所述待测多核苷酸上分离所述标记探针，该探针可以是标记的或是未标记的；
(c)将所述标记探针与携带第二标签的报告探针杂交以形成双链多核苷酸(如上文所定义)，其中当标签彼此接近时，第一或第二标签影响由另一标签产生的信号(其中优选地，所述第一或第二标签是荧光团，而另一标签是在所述荧光团附近时影响所述荧光团的荧光的分子)，其中当所述标记探针未标记时，在最靠近第二标签的末端，所述双链多核苷酸是(i)平末端；(ii)具有突出的5'端或(iii)具有突出的3'端，并且在远离第二标签的末端，所述双链多核苷酸是(i)平末端；(ii)具有突出的5'端或(iii)具有突出的3'端，其中所述突出端由单链区域组成，并且当所述单链区域提供5'突出序列时，其在与双链区域直接相邻处不包含与所述ddNTP互补的碱基(优选地在所述单链区域中的任何地方均不包含与所述ddNTP互补的碱基)；
(d)灭活、降解或去除所述聚合酶，去磷酸化或除去在步骤(a)中未结合的ddNTP，用另一ddNTP竞争胜过所述ddNTP，和/或使用标记探针和报告探针，当它们结合在一起时提供长度为至少1个核苷酸(3'突出)或2个核苷酸(5'突出)的单链区域，和/或使用标记探针和报告探针，当它们结合在一起时，在所述双链多核苷酸的一个或两个末端提供长度为至少1个核苷酸的单链区域，并且所述单链区域至少部分地由所述双链多核苷酸中的一个或多个碱基对之间的错配导致，
其中步骤(d)可以在产生所述双链分子之前、期间和/或之后进行；以及
(e)通过评估与双链多核苷酸相关联的信号来确定所述标记探针是否携带第一标签，其中所述第一或第二标签信号中的变化指示所述待测多核苷酸中存在所述目标序列。
在该方法的一个优选的方面，根据生成的双链分子的形式，可以改进该方法，使得
(i)当所述多核苷酸的一个或两个末端根据步骤(c)是平末端时，在步骤(d)中，所述聚合酶失活、降解或被除去，在步骤(a)中未结合的所述ddNTP被去磷酸化或除去和/或用另一种ddNTP竞争胜过所述ddNTP；
(ii)当所述多核苷酸的一个或两个末端具有根据步骤(c)的5'突出端时，在步骤(d)中，所述聚合酶被灭活、降解或除去，在步骤(a)中未结合的所述ddNTP被去磷酸化或除去，用另一种ddNTP竞争胜过所述ddNTP和/或使用这样的标记探针和报告探针，当它们结合在一起时提供形成长度至少为2个核苷酸的所述5'突出端的单链区域(例如，可以使用错配碱基或通过延伸探针之一实现)和/或使用这样的标记探针和报告探针，当它们结合在一起时，在双链多核苷酸的一个或两个末端提供长度至少为1个核苷酸的单链区域，并且所述单链区域至少部分地由所述双链多核苷酸中的一个或多个碱基对之间的错配导致，和/或
(iii)当所述多核苷酸的一个或两个末端具有根据步骤(c)的3'突出端时，在步骤(d)中，所述聚合酶被灭活、降解或除去(优选降解或除去)，在步骤(a)中未结合的所述ddNTP脱磷酸化，用另一种ddNTP竞争胜过所述ddNTP和/或使用这样的标记探针和报告探针，当它们结合在一起时提供形成长度至少为1个核苷酸的所述3'突出端的单链区域(例如，可以使用错配碱基或通过延伸探针之一实现)和/或使用这样的标记探针和报告探针，当它们结合在一起时，在双链多核苷酸的一个或两个末端提供长度至少为1个核苷酸的单链区域，并且所述单链区域至少部分地由所述双链多核苷酸中的一个或多个碱基对之间的错配导致。
在上述方法中，优选地，所述第一或第二标签是荧光团，而另一标签是当在所述荧光团附近时影响所述荧光团的荧光的分子。在这种情况下，为了确定标记探针是否携带第一标签，评估双链多核苷酸中荧光团的荧光，其中荧光的变化指示所述待测多核苷酸中所述目标序列的存在。
识别目标核苷酸序列的方法包括在序列检测法中避免假阳性的方法，以及如上所述的防止ddNTP的方法和避免假Tm读数或假FRET效应的方法。在本发明的这个方面中使用的术语的含义如上文所述或如下文进一步描述。
如本文所述，“待测”多核苷酸是指存在于样品中的多核苷酸，其将通过所述方法检测以确定其是否包含(包含或由其组成)目标序列。“样品”是可以获得或制备的可能含有相关多核苷酸的任意样品。多核苷酸可以以其原始形式提供，例如，在来自生物体的生物样品中，但是更优选是原始天然多核苷酸的扩增产物。因此，待测多核苷酸可以通过天然RNA(例如mRNA或核糖体RNA)或DNA的扩增获得，以产生用于该方法的扩增cDNA。优选地，待测多核苷酸是DNA或cDNA。待测多核苷酸可以是双链或单链。
天然RNA(其可以首先被逆转录成cDNA)或DNA可以通过已知的扩增技术来扩增，如通过使用合适的引物(例如正向和反向)的聚合酶链式反应(PCR)、NASBA或连接酶链式反应。或者，天然DNA或cDNA(或其相关部分)可以使用载体克隆，所述载体用于转化细菌如大肠杆菌，然后可以使细菌生长以繁殖核酸分子。当DNA或cDNA的序列未知时，引物可以被引导到已经引入的核酸分子的区域。因此，例如，接合体(adapter)可以连接DNA分子和引物引导到这些部分以扩增DNA分子。或者，在真核样品的情况下，可以利用RNA的polyA尾和帽，以制备合适的引物。
原始天然多核苷酸是从生物获得的。该多核苷酸可以直接获得，例如来自被研究的人或非人类动物，例如从组织、体液或身体废物获得，或在原核生物的情况下，从生物本身获得。“体液”包括血液、唾液、脊髓液、精液、淋巴液。“身体废物”包括尿液、咳出痰物质(肺病患者)、粪便等。“组织样品”包括通过活组织检查获得的组织，通过外科手术或其他手段，例如胎盘。这些组织、体液或身体废物可以提供其中存在所述待测多核苷酸的样品，或者可以(例如，通过扩增)从其中得到所述待测多核苷酸的样品。在替代方案中，样品可能不是来自生物本身，而是含有来自该生物体的遗传物质，例如，环境样品(例如含有相关细胞或遗传物质)。
目标生物体是原核或真核生物，其可以是任何真核生物，如人、其他哺乳动物和动物、鸟、昆虫、鱼和植物，以及任何原核生物，如细菌。
优选的非人类动物包括但不限于鱼类和哺乳动物。优选的哺乳动物包括灵长类动物、家畜、牲畜和实验动物。因此，优选的哺乳动物包括小鼠、大鼠、豚鼠、猫、狗、猪、牛、山羊、绵羊和马。
“识别目标核苷酸序列”具有与上文所用的关于序列检测法相同的含义，即序列内至少一个核苷酸的绝对或部分序列。
“目标”序列是待测多核苷酸中待识别的感兴趣的序列。该方法可以用于识别特定核苷酸(例如SNP)(并且这可以被认为是被识别的序列)，但是这将在其周围序列的环境中，因此识别出目标序列的存在。目标序列的长度优选为6至30个核苷酸。
“未标记的标记探针”(对应于上述第一多核苷酸)是能够与目标核苷酸序列杂交的多核苷酸。探针具有如上所述的长度，其足够长以适当地但特异地与目标序列杂交，而不与可能存在但足够短的其它序列杂交以避免过量的化学合成。标记探针与待测分子中包含的目标序列之间的一些错配是可以容忍的。优选地，所述分子杂交在一起的区域(在标记探针的情况下，这可以是该分子的全部或部分)彼此具有100％的互补性。然而，这并不是必需的，而且完美的碱基配对不是必要的。因此，如果两个分子具有足够的互补性以使得形成能进行常规熔解温度分析的足够稳定的复合物，则可以容忍该区域内的错配。因此，例如，彼此结合的序列的区域可以仅共享80、90或95％互补性(例如可能具有一个、两个、三个或更多个错配)。在本发明的一些实施方案中，如本文所述优选使用错配。
探针是未标记的，只要它不携带如上所述的产生可检测信号的标签。
“杂交”序列是在高度严格条件下保持结合的序列，即在非严格条件下结合(例如，在室温下6×SSC/50％甲酰胺)并在高严格条件下洗涤时保持结合(2×SSC，65℃)(其中SSC＝0.15M NaCl、0.015M柠檬酸钠、pH7.2，例如用于具有70个或更多个核苷酸的寡核苷酸)、(或在50-80℃下的TMACl洗涤溶液)(其中TMACl洗涤溶液＝3.0M TMACl、50mM Tris-Cl(pH8.0)、0.2mM EDTA(pH7.6)、1mg/ml SDS，例如用于17至50个核苷酸的寡核苷酸)。
标记探针与所述目标核苷酸序列在碱基的直接5'端(即上游)结合，所述碱基与本方法中使用的ddNTP互补。因此，标记探针只与目标核苷酸序列的一部分相结合。当目标序列包含SNP时，标记探针可以结合全长目标核苷酸序列，除了SNP发生的碱基处。在这种情况下，形成双链分子，然后可以通过正常的链延伸反应结合ddNTP到其上。如本文所述，结合碱基的直接5'是指结合目标序列，使得标记探针的最终3'末端的核苷酸与目标序列中的邻近与ddNTP互补的碱基并是该碱基的5’的核苷酸结合。这允许至少在该互补碱基处发生链延伸。如下文所讨论的，也涵盖超出该第一核苷酸的链延伸。
标记探针优选长度为至少5个核苷酸，优选5至200个核苷酸，例如10-100个核苷酸，例如20-50个核苷酸。
标记探针可能不完全与目标序列互补(如上文关于双链多核苷酸中的第一和第二链之间的结合所讨论的)。涉及互补结合的碱基的数目必须足够以产生稳定的复合物。优选标记探针中至少5个连续碱基，优选5至200个连续碱基，例如10-100个连续碱基，例如20-50个连续碱基，与目标序列中的碱基互补。优选地，标记探针完全(即100％)与目标序列或其区域互补。
如本文所述，“互补性”定义两个分子(或其区域)之间的关系，并且表示分子含有互补核苷酸/碱基的程度，使得分子之间的互补结合可能发生，即互补碱基按相同的顺序提供。当序列具有100％的互补性时，它们没有错配地结合。当它们具有小于100％的互补性时，存在一个或多个错配。
ddNTP、聚合酶、第一和第二标签如上所述。第二标签结合报告探针。
当目标序列存在时，未标记的标记探针与待测多核苷酸杂交，并通过聚合酶在3'方向延伸以将标记的ddNTP结合到未标记的标记探针上，从而形成标记的标记探针。为了实现这一点，标记探针、ddNTP和聚合酶在合适的条件下(例如温度和浓度)提供，并且持续适合于允许杂交和链延伸的时间。为此目标的合适条件是本领域熟知的(参见例如Sambrook等人(1989)，Molecular Cloning:A laboratory manual，第二版，Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.)
由此形成的标记的标记探针是通过链延伸其中已经掺入标记的ddNTP的单链多核苷酸。ddNTP可以作为链延伸反应中的第一个核苷酸掺入，或者可以作为第二个或后续的核苷酸(例如当也使用dNTP时)掺入。
当目标序列不存在时，例如如果不存在特定的SNP，标记探针可能仍然与待测多核苷酸结合(在SNP的情况下，目标多核苷酸序列的大部分可能存在(即其上游周围序列)，即使特定的SNP不存在)，但没有链延伸发生，因此标记探针仍未被标记。
标记探针与待测多核苷酸的分离至少要破坏这些分子之间的碱基对结合，即杂交复合物的熔解(melting)。方便地，这可以通过将保持复合物的溶液的温度升高到该复合物的熔解温度(下文讨论的Tm)以上来实现。
虽然不是必需的，但是可以进行标记探针和待测多核苷酸的进一步物理分离。(然而，在一个优选的方面，不进行进一步物理分离使分子进入分离区域或溶液，例如不进行基于电荷或大小的分离，以分离不同的分子和未结合的ddNTP。)这可以通过例如亲和力实现，例如，其中标记探针或待测多核苷酸含有不存在于另一实体(标记探针或待测多核苷酸)上的序列或分子(例如在制备或扩增过程中引入)，并且可提供其结合配偶体(例如连接到固体支持物上)。例如，如上所述，标记探针可以携带结合配偶体，并且标记探针可以通过将该结合配偶体结合到可以在固体支持物上携带的所述结合对的另一结合配偶体来收集。
一旦与待测多核苷酸分离，(标记或未标记的)标记探针与带有第二标签的报告探针杂交。杂交和第二标签如上所述。通过该杂交形成的双链多核苷酸也如上所述。
(标记和未标记的)标记探针和报告探针对应于本文所述的第一和第二多核苷酸，其当杂交在一起时形成第三多核苷酸(上文所述的双链多核苷酸)。因此，如上所述提供给这些多核苷酸的定义是适用的。因此，例如报告探针的长度优选为5个核苷酸，优选为5至200个核苷酸，例如10-100个核苷酸，例如20-50个核苷酸，并用用第二标签进行标记，该第二标签优选为荧光团。报告探针可以在探针分子内的任何核苷酸上标记，条件是第一和第二标签的选择使得在它们邻近时可以实现所需的相互作用。优选地，报告探针在5'端标记，例如在5'端的三个核苷酸之一，例如在5'末端处标记。
在标记探针和报告探针的设计中，应避免会产生固有淬灭活性的碱基(如实施例中所示)。因此，应避免靠近其信号待测量的标签的鸟嘌呤残基。因此，如果报告分子在其5'端携带标签，则应避免具有富G3'-端的标记探针。此外，报告分子中应避免使用5'鸟嘌呤。
如此形成的双链多核苷酸在一端或两端具有有上述含义的平末端或突出链。最接近第二标签的那一末端是最接近携带标签的核苷酸的末端。在一个优选的特征中，第二标签出现在报告探针的5'端，标记探针在此(最接近)端的结合会生成平末端或突出端。在这种情况下，远离该标签的末端位于报告探针的3'端。
在一个优选的特征中，突出链的单链区域的长度为一个、两个或三个核苷酸。
根据末端类型(平或突出)，双链多核苷酸可以如上所述进行处理，即通过处理或去除聚合酶，去磷酸化或去除ddNTP，竞争胜过ddNTP或使用具有较长单链区域或错配碱基对的双链分子。如上所述，不同类型的结合是由聚合酶介导的。根据要避免的结合类型，可以适当地选择该处理的时间。可以在生成双链分子之前进行处理(以避免ddNTP的不适当的共价结合)和/或可以在生成双链分子期间和/或之后(但在信号检测之前)进行处理，其中主要关注的是假FRET效应或聚合酶的稳定作用。方便地，用于此目的的试剂可以在双链分子的产生期间存在，例如，可以在产生双链分子的同时加入蛋白酶或去垢剂。特别优选地，在使用蛋白酶时，在生成双链多核苷酸之前加入蛋白酶。优选地，当使用去垢剂时，考虑到其更快的效果，可以在双链多核苷酸生成之前或期间加入去垢剂。
在该步骤执行之后，仅如下标签应当存在：在掺入ddNTP的链延伸反应期间最初制备或引入的多核苷酸中存在的标签。为了确定目标序列是否存在，有必要确定标记探针是否携带第一标签(即ddNTP已被掺入，表明存在完整的目标序列)。
可以通过评估与双链多核苷酸相关联的信号来进行该测定。根据使用的标签并因此产生的信号，可以使用适当的确定方法。如下文更详细地所述，例如，标签之一可以是荧光团，并且可以检查其信号(荧光)的程度。
如本文所提及的，“信号变化”是指水平的改变(包括存在或不存在)或相对于参考值的信号类型的改变。改变可能是信号的增加或减少。当评估双链多核苷酸的形成是否导致改变的信号时，参考值是彼此不接近的第一或第二标签的信号。因此，例如在荧光团和淬灭剂的情况下，如果荧光团是报告探针上存在的第二标签，并且ddNTP上的第一标签是淬灭剂，则当ddNTP掺入标记探针并且该探针结合报告探针使得标签位于邻近处，来自荧光团的信号将被改变(即，荧光将会被淬灭，从而降低来自该标签的可检测的荧光)。
进行的鉴定可以是定性的(即，鉴定测试序列的存在或不存在)和/或定量的(即，鉴定测试序列的量或水平)。这可以表示为绝对值、百分比、比率或类似指标。
信号的变化可以相对于起始(例如，标签的未结合信号，例如报告探针产生的信号)来评价。然而，方便的是，通过将报告探针与标记探针(标记或未标记)分离并在该解离期间评估信号的变化来评价信号的变化。方便地，这使用熔解曲线分析来进行。
因此，在一个优选的方面，本发明提供对双链分子进行解离，其中在所述解离期间第一或第二标签的信号(优选荧光)的变化表示所述待测多核苷酸中所述目标序列的存在。优选地，所述解离通过加热实现，并且所述双链多核苷酸进行熔解曲线分析。
在一个优选的方面，评价作为荧光团的标签(其优选在报告探针上)的荧光水平。如果荧光团存在于报告探针上，则来自该分子的荧光将存在，但可能受到影响，取决于标记探针上是否存在第一标签。如果荧光团存在于标记探针上(如果标记)，则只有当标记探针存在时才会出现荧光，并且该荧光将受到报告探针上存在的第二标签的影响。
可以使用任何方便的手段来评估荧光团的荧光。例如，可以检查2-光子和3-光子时间分辨荧光光谱，荧光寿命成像或荧光共振能量转移。可以使用适当的检测器检测荧光，例如，荧光显微镜、荧光扫描仪、荧光分光光度计或流式细胞仪。使用方便的分光荧光计。作为实例，可以方便地使用诸如Applied Biosystems 7500 Fast仪器或Qiagen Rotor-Q仪器的仪器。
在多重复用方法中，如下文更详细地讨论的，可以使用多于一个的荧光标签(例如，如果使用多于一个的标记探针或报告探针)，并且在这种情况下，需要可以区分不同标签的荧光的检测器。
优选地，该方法是用于高通量筛选的自动化或半自动化的。自动化由计算机软件方便地控制。
如上所述，方便地，所述测定通过熔解曲线分析进行。熔解曲线分析是在加热过程中对双链DNA的解离特性的评估。温度的升高导致由于碱基对之间的结合被破坏，双链分子解离成单链。熔解温度(Tm)是50％的双链分子解离成单链分子的温度。熔解温度受多种因素的影响，包括结合对之间的互补程度、所涉及的分子长度和分子的GC含量，都影响双链分子的稳定性。
在目前情况下，根据目标序列是否存在，双链分子有两种不同的形式。当目标序列存在时，标记探针用第一标签标记。然后结合到具有第二标签的报告探针。其中一个标签会影响另一个标签的信号。优选地，这些标签中的一个是荧光团，另一个标签影响其荧光。当标记的标记探针和报告探针结合时，标签足够接近因而信号(例如荧光团的荧光)受到影响。因此，当这些分子杂交时，信号(例如荧光团的荧光)受到影响。然而，当这些分子解离时(例如在熔解曲线分析期间)，标签被有效地分离，使得信号(例如荧光团的荧光)不受影响。因此，在熔解曲线分析的过程中，当所述分子解离时，信号(例如来自荧光团的荧光)发生变化。这可以通过在熔解曲线分析期间评估信号(例如荧光)来监测。熔解曲线分析允许识别第一和第二标签是否一起存在，并且确定携带这些标签的两个多核苷酸解离的温度。当两个标签都存在时，这表明标记探针被标记，即ddNTP结合到目标序列。
可以使用另外的解离方法取代基于热的解离方法。因此，例如，可以使用其它变性方法，例如使用NaOH、甲酰胺或单链结合蛋白来分离标记探针和报告探针。这些变性剂可以以不同的浓度或在一个时间过程中以一个单一的浓度施用。可以施加电场以辅助变性。如上所述，通过评估解离期间的信号(例如荧光)的变化，可以适当地监测两条链变性和解离(以及因此对标记信号的影响)的进展。根据构成双链分子的链的序列，这些方法可以如本文所述进行多重复用，因为不同的复合物可以在这些方法中以不同的时间/浓度离解。
优选地，使用的标签是荧光团和淬灭剂。在这种情况下，在熔解曲线分析期间，荧光将随着双链分子解离而增加，并且将荧光团与淬灭剂分离。
在一个优选的方面，本文中提到的双链多核苷酸(例如，待经过熔解曲线分析的分子是平末端的，和/或在其一端有一个5'突出端(例如，可以在两端都是平末端、在两端具有5'突出端或在一端具有一个平末端，另一端具有一个5'突出端)。其中存在5'突出端优选具有一个、两个或三个核苷酸悬垂。当使用错配的碱基对时，5'突出端以及3'突出端可以存在于双链多核苷酸的一端。
如上所述，聚合酶的存在也提高了双链多核苷酸的熔解温度，从而导致熔解曲线分析方法中的假Tm。此外，已经发现聚合酶对荧光标签的假FRET效应(例如假阳性淬灭效应)负责，即使在没有另外的荧光供体或淬灭分子的情况下也是如此。这具有在以下方法中产生假结果的影响，所述方法中荧光标签的荧光水平(可能受淬灭和/或供体荧光影响)用于识别或量化目标实体，例如，多核苷酸与淬灭分子的结合足够靠近携带荧光团的多核苷酸以影响后者的荧光。通常可以在熔解曲线分析方法中监测这样的影响。通过灭活、变性或去除聚合酶，可以在上述方法中克服这些影响。
因此，本发明还提供了一种(优选地在或包括熔解曲线分析方法中)避免假Tm读数和/或假FRET效应(例如假阳性淬灭)的方法，其中所述方法包括以下步骤：使聚合酶、任选的dNTP和/或ddNTP，以及第一和第二多核苷酸接触，所述第一和第二多核苷酸彼此杂交以形成第三多核苷酸，所述第三多核苷酸是具有任选单链区域的双链多核苷酸，其中为了避免假FRET效应(例如假阳性淬灭)时，所述第一多核苷酸携带荧光团，其中在评估Tm和/或FRET效应之前(例如，在使用时，在所述熔解曲线分析之前)所述方法还包括灭活、降解或除去所述聚合酶，和/或当要避免假的FRET效应(例如假阳性淬灭)，并且在所述方法中使用dNTP和/或ddNTP时，去磷酸化或除去所述dNTP和/或ddNTP和/或用另一种dNTP和/或ddNTP竞争胜过所述dNTP和/或ddNTP，其中所述术语具有上述含义，除了所述双链多核苷酸，其优选地具有上述含义。
可以通过灭活、降解或去除所述聚合酶，和/或去除和/或竞争胜过所述dNTP或ddNTP来避免假FRET效应。避免假FRET效应(例如假阳性淬灭)的方法可以在熔解曲线分析或其他方法中酌情使用，例如，其中荧光标签的荧光水平的增加或减少指示目标分子或序列的存在(或量)(例如使用携带荧光供体或淬灭剂的一种或多种探针或引物的方法，其接近荧光标签指示目标分子或序列的存在(或量))。这样的方法包括例如使用Taqman探针、蝎形探针和分子信标(molecular beacon)。熔解曲线分析可以如上所述进行。
当在上述方法中使用dNTP时，它们可以用于替代ddNTP(或与ddNTP一起使用)，所述ddNTP可以另外地在该方法中使用。因此，本文提供的关于ddNTP的教导可以适用于dNTP。
如本文所述，“假Tm读数”是指当相对于计算机计算而言，实验地进行该方法时观察到的不同熔解温度，并且通过去除、灭活或降解聚合酶实验结果可以恢复到正确的Tm读数。如实施例所示，通过使用上述方案之一，可以通过实验来容易地鉴定，以避免误读，例如在有或没有蛋白酶或去垢剂的存在下，在聚合酶的存在下进行Tm分析。不希望受到理论的限制，似乎聚合酶具有稳定作用并增加双链多核苷酸的Tm。该增加可以是至少1℃，优选至少3、4或5℃，例如，从3或5-10℃。所述读数可能不会在所述方法中直接评估，即精确的Tm可能不被评估或记录，但是可以从检查熔解曲线发现假Tm是显而易见的，例如，没有可识别的峰或峰与另一个峰重叠。“评估”Tm延伸到这样的观察。
如本文所用，“假FRET效应”是指不是由淬灭或荧光供体分子的存在引起的荧光标签的荧光增加或减少。本文所用的FRET是指荧光共振能量转移。因此，聚合酶可以作为淬灭或荧光供体分子(尽管在系统中没有这样识别)。荧光的这种改变可以是在给定温度和/或波长下荧光的增加或减少。“评估”FRET效应延伸到在所述方法的所有部分期间检查荧光。
如本文所用，“假阳性淬灭”是指不是由于淬灭分子的存在而导致的荧光团的荧光的改变(降低)。因此，聚合酶可以作为淬灭分子(尽管在系统中没有确定为淬灭分子)。
避免假Tm读数的方法在双链分子中特别有效，其中两条链长度小于60个核苷酸，优选小于50、40、30或25个核苷酸，例如，长度为10-20个核苷酸。优选地，所述方法还包括通过在允许其杂交的条件下使第一和第二多核苷酸接触而产生双链多核苷酸的步骤，并且优选地，所述灭活、降解或除去所述聚合酶或去磷酸化或除去或竞争胜过所述dNTP或ddNTP的步骤是在所述双链多核苷酸生成之前、期间和/或之后进行的，根据上文描述的方法执行。方便地，用于此目的的试剂可以在双链分子的产生期间存在，例如，可以在产生双链分子的同时加入蛋白酶或去垢剂。优选地，在也使用了ddNTP的方法中，在形成双链分子之前加入去垢剂或蛋白酶，以防止错误的ddNTP掺入。特别是在蛋白酶的情况下，考虑到蛋白酶对聚合酶的缓慢作用，优选在生成双链分子之前的一段时间添加。鉴于其快速作用，去垢剂在使用时可以在稍后阶段添加，例如，在双链分子形成期间。可以在该方法中使用适合于上述目的的一种或多种试剂。
如果在该方法中使用dNTP或ddNTP，则可以如上所述标记dNTP或ddNTP和多核苷酸。然而，当不使用dNTP或ddNTP时，所述第一多核苷酸携带如上文所定义的第一标签，并且任选地所述第一或第二多核苷酸携带如上文所定义的第二标签。即使在仅存在荧光团的情况下也观察到假FRET效应(例如假阳性淬灭)，因此在所述方法中可能仅存在第一标签。特别地，如上所述，所述荧光团可以是HEX或FAM。
该方法在实施熔解曲线分析的任何方法中具有实用性。因此，例如在这样的方法中，其中基于其荧光是否淬灭(或其使荧光团的荧光淬灭)来指示其与待测分子的结合从而确定或定量携带荧光团(或淬灭剂)的目标分子的存在，上述方法避免了由可能存在的聚合酶的存在引起的假FRET结果(例如假阳性淬灭结果)。多种采用荧光检测淬灭的方法可以用于本发明的这些方法中，例如分子信标或蝎形探针(其中淬灭剂和荧光团都在测试/探针上携带)、Taqman探针，特别是上述方法，其中第一和第二多核苷酸在加热期间解离并监测荧光的变化，所述第一和第二多核苷酸的其中一个携带淬灭分子并且另一个携带荧光团。在这样的方法中，仅在该方法中完成其所需的延伸性质后才执行聚合酶去除/灭活/降解。
当Tm值对定性或定量测定重要时，该方法也是有用的。当考虑多重复用时，正确的Tm值是特别重要的，并且需要峰分离以允许识别不同的目标分子。
在设计和执行其中熔解温度对方法性能或其结果有影响的方法中也可以考虑聚合酶对Tm值的影响。因此，例如，如果在一个方法的解离和缔合步骤期间聚合酶存在，则将需要考虑其作用。例如，在PCR方法中，应相应地选择温度以考虑在该过程中形成的双链分子的可能的更高Tm。Tm的影响也应用于解释其中观察到高于预期的Tm值的结果。
本发明还允许选择合适的分子以执行该方法或用于评估聚合酶在特定方法中的影响程度。
因此，在另一方面，本发明提供了评估聚合酶对具有任选的单链区域的双链多核苷酸的熔解温度(Tm)和/或FRET(优选淬灭)的影响的方法，其中优选所述方法是熔解曲线分析方法，
其中所述方法在两个样品上进行，并且对于每个样品，所述方法包括使所述聚合酶、任选的ddNTP和/或dNTP、以及第一和第二多核苷酸接触的步骤，其中第一和第二多核苷酸彼此杂交以形成第三多核苷酸，第三多核苷酸为双链多核苷酸，其中当评估FRET效应时，所述第一多核苷酸携带荧光标签，
其中仅在一个所述样品上进行的所述方法进一步包括在评估Tm和/或FRET效应之前灭活、降解或除去所述聚合酶，和/或当评估FRET效应，并且dNTP和/或ddNTP用于以下方法时，所述方法中去磷酸化或除去所述dNTP和/或ddNTP和/或用另一种dNTP和/或ddNTP竞争胜过所述dNTP和/或ddNTP，
对两个样品进行熔解温度分析和/或FRET分析，以及
评估两个样品之间的熔解温度和/或FRET效应是否不同，以确定所述聚合酶对所述双链多核苷酸的熔解温度和/或FRET的影响，
其中优选地所述双链多核苷酸，和/或优选地所述步骤的进行如上文所定义。所述方法中使用的聚合酶、多核苷酸和其他实体的定义如本文所述。
在该方法中使用的聚合酶可以是待测聚合酶，例如是已知聚合酶的变体以评估其FRET/Tm效应。这可以相对于已知的聚合酶来评估，例如该变体来源的聚合酶，以评估变异是否导致FRET/Tm效应的任何改变。或者，双链多核苷酸可以是待测分子，以评估其FRET/Tm如何受聚合酶的作用影响。这可能有助于设计用于测序和其中FRET/Tm起作用的其他方法的分子。任选地，所述方法包括将获得的结果与用对照聚合酶或多核苷酸获得的结果进行比较。
使用的两个样品基本相同(即，该方法重复两次)，但是仅对一个样品进行用于除去假FRET/Tm读数的步骤。
通过如本文所述测量Tm或FRET效应来评估Tm/FRET效应。如果两个样品之间的Tm读数不同或荧光的存在或水平不同，则观察到差异效应。
根据本发明还提供了用于实施本文所述的方法的试剂盒。这样的试剂盒可以含有一种或多种以下组分：至少一种用第一标签标记的ddNTP(如上文和下文所述，如果使用多于一种的ddNTP，则可以使用相同的标签，或者优选使用不同的标签)、至少一种第一多核苷酸(或标记探针)、标记有第二标签的至少一种第二多核苷酸(或报告探针)(如上文和下文所述，如果使用多于一种第二多核苷酸，可以使用相同的标签，或者优选使用不同的标签)、聚合酶、灭活聚合酶的方法(例如去垢剂如SDS)、降解聚合酶的方法(例如，蛋白酶如蛋白酶K或去垢剂如SDS)、去除聚合酶的方法(例如，使用聚合酶特异性的抗体或者如果使用生物素-偶联的标记探针，则使用链霉亲和素结合的磁珠，从而将它们与聚合酶分离)、使ddNTP去磷酸化的方法(例如，磷酸酶如虾碱性磷酸酶或牛小肠碱性磷酸酶)、去除ddNTP的方法(例如用于有机提取的试剂，如果使用生物素偶联标记探针则使用链霉亲和素-偶联磁珠，从而将它们与ddNTP分离)、未标记的ddNTP用于竞争胜过标记的ddNTP、以及用于该方法的其它试剂，例如dNTP和/或未标记的ddNTP。
这些实体具有上文所述的定义和优选选项。
因此，在一个优选的方面，本发明提供了一种试剂盒，其包括：
a)如上所述的至少一个标记有第一标签的ddNTP，
b)如上所述的至少一个第一多核苷酸(或标记探针)，
c)如上所述的标记有第二标签的至少一个第二多核苷酸(或报告探针)，
d)聚合酶，和以下至少一种：
(i)灭活聚合酶的方法(例如去垢剂，如SDS)，
(ii)降解聚合酶的方法(例如蛋白酶如蛋白酶K或去垢剂如SDS)，
(iii)去除聚合酶的方法(例如，使用聚合酶特异性的抗体或者如果使用生物素-偶联的标记探针，则使用链霉亲和素结合的磁珠，从而将它们与聚合酶分离)，
(iv)使ddNTP脱磷酸化的方法(例如磷酸酶，如虾碱性磷酸酶或牛小肠碱性磷酸酶)
(v)用于去除ddNTP的方法(例如，用于有机提取的试剂，或者如果使用生物素-偶联的标记探针，则使用链霉亲和素偶联的磁珠，从而将它们与ddNTP分离)，以及
(vi)用于竞争胜过标记的ddNTP的未标记的ddNTP；其中当标签彼此靠近时，第一或第二标签影响由另一标签产生的信号。
试剂盒中使用的第一多核苷酸或标记探针能够结合目标核苷酸序列。该目标序列，以及因此标记探针可以基于试剂盒的预期效用来选择。为了本实施方案的目的，标记探针可以是目标序列可能存在的任何寡核苷酸或多核苷酸。
任选地，试剂盒还可以含有标准化材料，例如，用于比较目的的来自正常和/或患病生物的mRNA或cDNA，或参比待测多核苷酸、用于扩增的引物和/或适当的酶、缓冲液和溶液。任选地，所述试剂盒还可以包含描述应该如何执行本发明的方法的包装插页，任选地提供用于解释在执行本发明时获得的结果的标准图形、数据或软件。
如上所述，使用这样的试剂盒来确定待测多核苷酸中的目标核苷酸序列形成本发明的另一方面。
通过说明，下面更详细地描述实施本发明的方法。虽然本发明不限于这些方法，但是本文描述的优选方面是适用于本文所述的所有方法的优选方面。
对在待测多核苷酸中的目标核苷酸序列的鉴定包括鉴定在待测多核苷酸中的多个目标核苷酸序列。在单一方法中识别多个目标的能力在本文中被称为多重复用。因此，该方法允许多重复用，使得可以在单一方法中识别多于一个目标核苷酸序列(例如多于2、4、8或16个)。这可以通过使用具有可被鉴别的信号的不同标签来实现。因此，例如，如果标签的检测基于荧光信号，则可以选择不同荧光标签，其在不同波长下发荧光因而可以被鉴别。
要检测的不同目标核苷酸序列可能存在于单个待测分子和/或多个离散待测分子中。当存在于同一待测分子中时，目标核苷酸序列可能位于待测分子上相同或不同的位置。当存在于相同的位置时，该方法用于识别在该位置处存在多个可能序列中的哪一个，例如以检测SNP等位基因(在这种情况下可以使用不同的标记的ddNTP)。如果目标序列不在同一位置，则可以在单个方法中检测不同的目标序列，例如，多个SNP。
因此，在一个优选的方面中，通过使用多于一个的标签(其具有可被鉴别的信号)来多重复用该方法。这些不同的标签可能出现在ddNTP和/或标记的多核苷酸(例如报告探针)上。当使用一对标签并且当接近时一个标签的信号影响另一个时，应该选择多对标签用于多重复用，使得可以区分所得到的信号。例如，当使用荧光团和淬灭剂时，来自每对的所得淬灭和未淬灭的信号应该与由另一对标签产生的任何信号区分开。一对标签可能有一个与另一对标签相同的标签。因此，例如，如果能够淬灭两个可区分荧光团的发射并且可以鉴别所得到的淬灭信号，则可以使用普通的淬灭剂。
因此，在本发明的一个优选的方面，优选使用至少两个标记的ddNTP，其中优选地，不同ddNTP上的第一标签是不同的。进一步优选的实施方案包括使用至少两个报告探针(和/或至少两个标记探针)，其中优选地，不同报告探针的第二标签不同。特别地，可以使用多对标签，其中每对标签包括ddNTP上的第一标签和报告探针上的第二标签，其中每对标签与每隔一对标签不同，其中优选地，每对包含与任何其他标签对中所见的任意第一或第二标签不同的第一和第二标签。
检测方法可能允许其他多重复用方法。因此，所得双链分子可以不仅基于它们携带的标签，而且还基于双链分子的形式进行鉴别。这可能与双链分子的序列、长度或其他区别特征有关。可以使用不同的序列来提供不同的性质，例如结合配偶体的能力(例如以亲和力为基础的方法)，或以更高或更低的亲和力将双链分子的两条链结合在一起。例如，如果检测方法是通过熔解温度分析，则可以选择该方法中使用的双链分子，使得它们具有不同的熔解温度。在这种情况下，标记探针和报告探针构成双链分子。这些可以被适当地选择以提供特定的熔解温度(Tm)，例如，按照他们的长度或序列。例如，可以通过在序列之间选择较长的序列、更高的GC含量和/或高互补性(例如至少95、96、97、98、99或100％)来增加Tm。Tm可以通过使用较短的序列、较低的GC含量和/或低于100％的互补性(例如小于95、90或80％)来降低。
可以通过改变所使用的报告探针和/或标记探针的性质来获得不同的Tm值。因此，在一个实例中，报告探针和标记探针对可以用于检测每个待测序列，其中每对与所述方法中使用的任何其他对探针不同，并产生复合物(双链多核苷酸)，其可以与任何其他对探针形成的任何其他复合物进行区别(例如，就它们的熔解温度而言)。然而，也可以仅提供一个报告(或标记)探针，但是提供其他探针的多种形式，使得可以形成多种每一种都具有不同性质(例如熔解温度)的复合物。在这些方法中，复合物将通过其标签和杂交性质(例如，熔解温度)来区分。
因此，在一个优选的方面，使用至少两种报告探针和/或至少两种标记探针，并且当报告探针和标记探针彼此杂交时，它们产生至少两种具有不同熔解温度的双链多核苷酸。在一个优选方面，提供了多对报告探针和标记探针，其中每对探针与其他探针对不同，其中优选地，每一对中的报告探针的标签与任何其他探针对中报告探针的标签不同。
选择序列以提供可在熔解曲线分析中区分的Tm，例如，Tm差为0.1至40℃，优选至少3、4、5、6、7、8、9或10℃。
在一个优选的方面，将多重复用的方法组合。因此，例如，在熔解曲线分析的情况下，使用两对或更多不同对第一和第二标签，并使用2个或更多个不同的熔解温度。使用两对不同的第一和第二标签和2个不同解链温度可以检测4种不同的序列(即，如果在每个不同的熔解温度下使用两对标签)。9种不同序列的多重复用可以使用3种不同的标签对和3个不同的熔解温度等来容易地实现。
因此，在本发明的方法中，可以方便地，提供多于一个标记有第一标签的ddNTP(优选地每种ddNTP具有不同的第一标签)。因此，例如，可以向ddATP、ddGTP、ddTTP(或ddUTP)和ddCTP中的每一种提供不同的第一标签。然后可以向报告探针(或第二多核苷酸)提供四种不同的第二标签(如上所述，如果来自标签的信号可能仍然在不同对之间被区分，则可以使用一些常见的标签)。可以提供多个未标记的标记探针(或第一多核苷酸)指向不同的目标核苷酸序列，其可以在与报告探针(或第二多核苷酸)结合时被区分。这可以通过适当选择未标记的标记探针(或第一多核苷酸)和/或报告探针(或第二多核苷酸)的序列和/或长度来实现。
在执行序列检测法中，首先应该分离待测多核苷酸并用于测序。在使用多重复用时可能存在多种类型的待测多核苷酸。任选地，从样品获得的多核苷酸(例如基因组DNA)可以如前所述进行扩增，以提供包含适合用于该方法的目标序列的扩增子。可以适当地选择引物以提供含有目标序列的扩增子。如果要使用多个待测多核苷酸和/或多个目标序列，则可以使用多个引物。可以使用正向和反向引物。方便地，扩增子是长度为50-5000个核苷酸，例如，50-1500个，如长度为100-500个核苷酸。
PCR之后，可以加入降解单链多核苷酸而不降解双链延伸产物的核酸酶(例如外切核酸酶1)以及磷酸酶(例如上文所述)来降解已经用于反应的PCR引物和dNTP。然后在进行到下一步骤之前，需要对这些酶进行处理以使其失活，例如在85℃处理。
当目标序列存在时，在允许掺入ddNTP的条件下，使标记的ddNTP和未标记的标记探针(或第一多核苷酸)与待测多核苷酸和聚合酶接触。如上所述，这些组分可以在不同时间或以各种组合加在一起。当要执行多重复用时，多种ddNTP和/或未标记的标记探针也可以一起或依次地或以多种组合相加。当目标序列存在时，条件允许将未标记的标记探针(或第一多核苷酸)与目标序列结合，并发生聚合酶链延伸。
该方法可以在其它分子如dNTP的存在下进行。可以使用一种或多种dNTP(例如dATP和dCTP)。在这种类型的方法中，链延伸将发生，直到相关的ddNTP掺入，这将阻止进一步延伸。在这样的方法中，可以加入感兴趣的ddNTP和其他dNTP以为所有可能的核苷酸(例如ddATP、dTTP、dCTP和dGTP)提供互补碱基。也可以使用未标记的ddNTP，例如对于标记的ddNTP以外的ddNTP。这防止了标记的ddNTP错误掺入不存在互补性的位置。这也可以使用具有与目标序列错配的离散数量的标记探针来实现，使得进一步的错配不太可能被容忍。这些机制有助于该方法的特异性。
方便地，可以进行多个ddNTP标记循环以最大化所实现的标记(即提高灵敏度)。例如，在进行第一轮标记之后，可以加热所述反应以提供单链分子，然后冷却以允许杂交并重复标记步骤。方便地使用1到50个循环，例如，1到20个循环，如5到20个循环。
根据如何进行方法，一旦达到共价结合，可以洗涤复合物以去除未结合的碱基和/或其他多核苷酸，特别是如果它们携带其信号待检测的标签，将另外导致高背景读数。这可以在例如标记探针(或第一多核苷酸)携带可用于亲和结合的部分来实现，例如，一对结合对中的结合配偶体，其中另一对在固体支持物上。然而，本方法方便地允许在溶液中实现完整的方法，并且随后的方法步骤在前述步骤的试剂存在下进行。在一个优选的方面，该方法在溶液中进行，而不需要使参与的分子与固体支持物结合。
在这一步骤之后，标记探针(或第一多核苷酸)(可能由于掺入标记的ddNTP而未标记或可能不携带标签)而与待测多核苷酸分离。方便地，通过加热复合物引起解离来实现。
然后将得到的单链分子与携带第二标签的报告探针(或第二多核苷酸)在允许标记探针(第一多核苷酸)与报告探针(第二多核苷酸)杂交的条件下接触。当使用多重复用方法时，可以将不同的报告探针(或第二多核苷酸)分开地或以多种组合相加。所得的双链分子具有如上所述的选自平末端、3'突出端或5'突出端的末端。
为了避免ddNTP标记的不适当的掺入，进行如上所述的去除/灭活/降解/竞争胜过聚合酶/ddNTP/延长单链部分的处理。只要是ddNTP开始掺入的链延伸反应起始(或在该过程中)，可以进行该处理。因此，该处理可以在与掺入ddNTP的聚合酶反应的同时开始(条件是聚合酶不立即失活)，或者可以在该反应期间开始，或者直接在标记标记探针(第一多核苷酸)的步骤之后，和/或在涉及标记探针和报告探针(第一和第二多核苷酸)的杂交步骤期间和/或之后进行。优选地，在聚合酶反应掺入ddNTP之后进行该处理，以及在报告探针(或第二多核苷酸)的杂交步骤/添加之前进行该处理。
在处理/双链多核苷酸制备之后，进行分析以确定报告探针(第二多核苷酸)是否已经结合到标记的标记探针(第一多核苷酸)。在该方法期间，可以在多个点检测由标签产生的信号。在某些情况下，如果可以将该测量与信号的控制水平进行比较，则可能需要单次测量，该水平指示第一和第二多核苷酸是否已经彼此结合(例如，当定量测量完成)。可以在制备双链分子之前、期间和/或之后进行测量(以评估形成双链分子时信号的差异)。或者或另外，可以在双链分子解离之前、期间和/或之后进行测量。
方便地，如上所述，这可以通过使用熔解曲线分析。在这种情况下，在温度升高以引起双链分子熔解的方案中连续或周期性地检测信号。
在进行熔解曲线分析的方法中，如果需要，熔解曲线分析可以通过以下重复进行：通过冷却以允许杂交并重复升高温度以允许解离。优选地，在双链分子的制备之前、期间和/或之后立即，进行处理(去除聚合酶等)，在一方面，只有在第一次熔解曲线分析之后才进行处理，例如在第一次熔解曲线分析之后但在第二次熔解曲线分析之前进行。鉴定聚合酶依赖的假FRET效应(和可能的ddNTP的非共价结合)具有一些优点，所述假FRET效应可在第二次分析之前去除，其允许定性和定量鉴定该假FRET效应(和可能的非共价结合)，而不是共价的ddNTP结合。还可以通过使用或不使用上述处理(例如，使用或不使用蛋白酶)进行上述方法，和/或使用内部对照来评估(定性或定量)假ddNTP结合的程度和/或假FRET效果来进行控制反应。例如，如果进行两次熔解曲线分析(参见实施例)，并且在第一次熔解曲线期间观察到淬灭，但是在聚合酶去除/灭活/降解后进行的第二次熔解曲线中未观察到淬灭，则第一次熔解曲线中观察到的淬灭可能归因于聚合酶依赖的假FRET效应(和可能的一些ddNTP非共价结合)。
如果要在熔解曲线分析方法中进行多重复用，则随着温度的增加从任何可能复合物的最低Tm以下至少5℃的温度到高于任何可能复合物的最高Tm以上至少5℃监测信号(例如荧光)变化。如果使用荧光团：淬灭剂标签组合，并且两个标签都连接到相同的复合物上，使得淬灭剂影响荧光团的信号，则在熔解期间，随着链的熔解分离而荧光信号变化(增加)。例如，如上所述，可以监测信号(例如荧光)的这种变化。当使用多重复用时，可以监测多于一个波长处的荧光。所获得的结果可以方便地表示为荧光随温度变化的导数(即导数荧光(-dF/dT))，以将Tm鉴定为峰。
如果需要鉴定待测多核苷酸中的多于一个目标序列，通过在使用不同标记探针和报告分子的方法的进一步循环中使用待测多核苷酸可以循环进行上述方法。
该方法可以方便地用于识别待测多核苷酸中的目标序列。该方法可以用于鉴定目标序列中的一个或多个未知核苷酸。这可以例如通过使用多个标记探针(第一多核苷酸)来实现，每个标记探针针对不同的相邻序列(可以通过使用上述复用方法来区分)，例如，其末端与一个核苷酸的3'末端相互结合的标记探针。可替代地(或附加地)，可以使用针对不同可能序列特异的标记探针(但是在目标序列中的相同位点处结合)，并且它们的信号基于其特定的Tm和/或标签的信号来识别。因此，例如，可以使用一组标记探针，其中3'末端核苷酸不同，例如，XXXXA、XXXXT、XXXXC、XXXXG。然后可以将这些探针用于延伸反应中以通过ddNTP结合确定下一核苷酸的身份。如果这些标记探针可以被区分(或者通过它们所结合的报告探针上的标签)或形成的复合物的Tm，则可以在该方法期间对两个核苷酸进行测序。因此，可以在使用上文描述的多重复用方法的方法中测序/鉴定一个、两个、三个或更多个核苷酸。
在适当的情况下，可以使用标记探针组，其中如果序列变化是可能的，一个或多个核苷酸退化，但不应妨碍探针的结合。
方便地使用该方法检测SNP。因此，在一个优选的方面，目标核苷酸序列是SNP。在另一优选方面，在所述方法中检测至少两个目标核苷酸序列，优选至少两个SNP(例如至少4、6、8或16个SNP)。
在这种情况下，方便地进行多重复用以允许在单个测定中评估多个SNP和/或评估SNP的纯合性。在后一种情况下，例如，所讨论的核苷酸可以具有一个腺嘌呤或鸟嘌呤碱基。使用标记探针，在链延伸反应中使用至少两个携带不同标签的ddNTP(ddUTP和ddCTP)。然后，当双链分子产生时，基于它们的信号来评估ddUTP或ddCTP的结合。如果发现ddUTP和ddCTP均已经结合，则基因型对于A/G是杂合的，但是如果只有ddUTP或ddCTP中的一种结合，则可能鉴定为纯合的AA或GG。
本发明的方法可以用于需要检测核酸的任何方法，例如，在诊断、感染或污染生物或病原体的检测、临床监测、取证、食品和环境安全性和监测、用于区分不同细胞类型、多态性的突变检测分析，例如在组织分型和作为一般分子生物学工具。
该方法在其中快速有效地检测一个或多个SNP的方法中具有特殊应用。SNP分析具有一系列诊断应用，例如在人类、动物和植物中测试疾病的遗传倾向作为与育种参数相关的标志，以及用于生物和环境样品中微生物的检测、分型和定量。该方法可以方便地用于诊断或基因分型方法。作为实例，该方法可以用于鉴定重要的遗传标志，例如，以确定疾病的倾向或风险。例如，可以评估与鲑鱼繁殖相关的遗传标志。目前没有技术可以有效和廉价地实现育种相关的预筛选需求，其涉及到大量个体(每年超过100,000)中相对较少(<100)的SNP数。本发明的方法可以用于鉴定个体中的SNP以确定谱系和重要的育种性状的存在(例如IPN抗性)。
杂合状态也可以如上所述进行评估。该方法也可以在诊断上使用，例如，通过检查微生物标志物来诊断肠易激综合征(IBS)。可以同时评估多达60个SNP。
因此，在一个优选的方面，该方法可用于检测SNP，特别地，其可用于通过鉴定那些细菌的SNP标志来诊断多于一种细菌致病的IBS。因此，在另一个优选的方面，本方法提供了诊断肠易激综合征的方法，其包括如前所述的方法，其中优选在所述方法中检测至少两个SNP。
该方法也可用于基因分型。因此，在进一步的优选方面，本发明提供了一种对生物进行基因分型的方法，包括上述方法，其中优选在所述方法中至少检测到两个SNP。
图1提供了本发明的优选方法的概述，其中该方法用于鉴定待测多核苷酸(扩增后)中两个SNP的存在(见图1B)或识别SNP等位基因(参见图1C)。实施例中描述的方法形成本发明的进一步的优选方面。
附图说明
考虑到上述优选特征的所有组合，特别是如实施例中所述。现在将参考附图通过非限制性实施例来描述本发明，其中：
图1示出了用于SNP分型的液体阵列诊断(LAD)技术的概述。(A)LAD的主要步骤。(B)LAD用于SNP分型以鉴定/定量细菌种类。(C)在非单倍体物种中应用LAD用于SNP分型。
图2提供了非模板、聚合酶依赖性淬灭的演示。在ddCTPTAMRA和HOT TERMIPol存在下，用未标记的标记探针淬灭互补的RP 2_1_in1bFAMRevComp。
图3示出了通过氯仿提取去除ddCTPTAMRA和/或HOT TERMIPol减轻非模板依赖性假阳性淬灭现象。在氯仿提取后，图2所示的相同的“+聚合酶”样品重新解离。注意淬灭反应中的明显的Tm移位。
图4示出了蛋白酶K也可以减轻假阳性淬灭。在没有蛋白酶K的情况下，在HOTTERMIPol的存在下，在未标记的互补LP 2_1 LP的存在下，发生RP 2_1_in1bFAMRevComp的淬灭。
图5示出了结合蛋白酶K处理的LAD技术，并显示了剂量依赖的、基于模板的淬灭反应。
图6提供了HOT TERMIPol的末端转移酶样活性的指示。(A)-(C).在HOT TERMIPol、ddCTPTAMRA存在下，将三种LP-RP双链体组合在蛋白酶K存在(较浅的曲线)或不存在(较深的曲线)下。(D)-(F).来自A-C的蛋白酶K未处理的样品用蛋白酶K处理，所有样品经历第二次解离。A和D包括双链体Faecali LP/Faecali RevComp+1 FAM，在一侧形成一个平末端，另一侧形成一个突出的5'FAM-G；B和E包括双平末端双链体2_1 LP/2_1_in1bFAMRevComp；C和F包括双平末端双链体Faecali LP/Faecali RevComp FAM。
图7示出了假FRET效应仅依赖于活性聚合酶，并且不需要ddNTP-淬灭剂(ddNTP-Quencher)。将缺乏所有模板和携带所有+/-LP、+/-ddUTP-ATTO540Q的组合的模拟标记反应首先在95℃下孵育10分钟以激活Hot TERMIpol DNA聚合酶。然后将每个反应分成两个；将蛋白酶K(1X缓冲液C)加入到一组中，其终浓度为58μg/mL，另一组接受相同体积的1X缓冲液C。在产生从30℃到95℃的熔解曲线之前，将两个样品组在56℃温育30分钟。(A)不论是否存在ddNTP-Q，FAM标记的RP C313Y RP(U)FAM在含有其互补的LP C313Y LP(C_U)的样品中显示淬灭反应，但仅有那些未用蛋白酶K处理其中聚合酶仍然具有活性的那些。(B)对于HEX标记的RP nt821 RP(U)HEX和其互补的LP nt821(del11)LP(U)在不同荧光通道观察到类似的结果。
图8示出了SDS处理在减轻Tm移位时与蛋白酶K一样有效。(A)在加入RP nt821 RP(U)HEX和确定熔解曲线之前，在模板的存在下，LP nt821(del11)LP(U)首先用ddUTP-ATTO540Q标记，并且随后在蛋白酶K(58μg/mL，1X缓冲液C)、SDS(0.1％，1X缓冲液C)、BSA(58μg/mL，1X缓冲液C)的存在下或未处理(1X缓冲液C)下于56℃温育。仍然存在活性HotTERMIPol DNA聚合酶的未处理和BSA处理的样品都显示出比蛋白酶K-处理和SDS-处理的样品更高的Tm的淬灭曲线。(B)对于LP/RP双链体Q204X LP(C_U)/Q204X RP2(C)ROX，观察到类似的结果。
图9显示了在减轻假FRET效应方面SDS处理与蛋白酶K一样有效。(A)缺乏模板、但携带LP nt821(del11)LP(U)、ddUTP-ATTO540Q的模拟标记反应以50μL的体积进行。在蛋白酶K(58μg/mL，1X缓冲液C)、SDS(0.1％，1X缓冲液C)、BSA(58μg/mL，1X缓冲液C)或未处理(1X缓冲液C)的存在下，将4个10μL的等分试样依次在56℃孵育，然后加入RP nt821 RP(U)HEX并进行熔解曲线测定。虽然BSA处理的和1X缓冲液C处理的样品显示温度依赖性淬灭(FRET)效应，但是SDS处理的和蛋白酶K处理的样品都没有示出上述效应。(B)如上所述使用相同的实验装置，此时使用LP/RP双链体E291X LP(C)/E291X RP(C)CY5和ddCTP-ATTO612Q。在这里，未处理的和BSA处理的样品显示温度依赖性荧光(FRET)效应，而SDS处理的和蛋白酶K处理的样品不显示。
图10示出了hot FIREPol(一种“正常的”Taq聚合酶)也稳定了LP-RP双链体，导致Tm移位。在标准反应条件下，在37℃下60分钟用末端脱氧核苷酸转移酶(TdT；NEB)用ddNTP-Quencher标记标记探针。然后在75℃灭活酶30分钟。然后将hot FIREPol加入到每个反应中，在95℃下活化10分钟，然后在0.1％SDS(1X TdT缓冲液)或1X TdT缓冲液(未处理)中加入相应的RP至终浓度为0.1μM。在以下所有组的未处理的样品中示出了比用SDS(灭活聚合酶)处理的那些更高温度下的淬灭反应：(A,LP＝用ddUTP-ATTO540Q标记的Q204X LP(C_U)；RP＝Q204X RP2(U)FAM)、(B,LP＝用ddUTP-ATTO540Q标记的E226X LP(U)；RP＝E226X RP(U)YY)、(C,LP＝用ddCTP-ATTO612Q标记的Q204X LP(C_U)；RP＝Q204X RP3(C)ROX)、(D,LP＝用ddCTP-ATTO612Q标记的D182N LP(C_U)；RP＝D182N RP(C)CY5)。
图11示出了通过dsDNA插入荧光染料EvaGreen检测，活性DNA聚合酶也稳定未标记的LP-RP双链体。将互补寡聚双链体在40μL(1X缓冲液C、5UHot TERMIPol、1X EvaGreen)中以0.1μM的浓度组合，并将反应物分成每个10μL的三个等分试样。将蛋白酶K、BSA加入或不加任何物质到三个样品的每一组样品中的一个至58μg/mL的浓度(1X缓冲液C)，在56℃温育30分钟，然后进行熔解曲线测定。(A)示出了双链体ASP16/SP60的结果，(B)ASP20/SP60，(C)ASP30/SP60和(D)ASP60/SP60。对于所有双链体，BSA未处理的和未处理的样品表现出比通过蛋白酶K灭活聚合酶的那些显著更高的Tm的dF/dT导数曲线，但是Tm移位效应在子图(panels)(A)和(B)中具有最短的双链体。
图12显示了使用4个通道的八通道(octoplex)LAD测定，每个通道具有2个熔解温度，成功在四个牛多态性位点区分了杂合子。由具有3个SNP和1个indel多态性的杂合子序列产生代表牛MYOSTATIN基因(登录号NC_007300，2012年1月6日)的核苷酸371-480、2329-2688和4787-4976的三个多重扩增子。然后将Exo-SAP处理的扩增子用于含有ddUTP-ATTO540Q和ddCTP-ATTO612Q的复合的、基于Hot TERMIPOL的LP标记反应中。然后在0.1％SDS和1X缓冲液C中加入用四种不同荧光染料标记的相应的8个RP至浓度为0.1μM。(A)显示FAM通道中两个不同熔解温度的淬灭信号，(B)相应的在Yakima Yellow(YY)通道上的两个信号，ROX通道(C)和CY5通道(D)类似，从而提供四元杂合子的正确基因型。无模板阴性对照(无箭头)在任何图中显示没有淬灭信号。
具体实施方式
实施例
实施例1
材料和方法
用于LP标记的模板生成
含有来自大肠杆菌或栖粪杆菌属(Faecalibacterium spp.)的16S rDNA序列的质粒用于聚合酶链式反应以产生模板，用于标记探针(LP)标记。简言之，将1μL含有质粒克隆的细菌裂解物加入到以下反应组分中：1.25U HOTDNA聚合酶、1X B2缓冲液、2.5mM MgCl2(全部来自Solis Biodyne，爱沙尼亚)、0.1mM dNTPs(Thermo FisherScientific，USA)、0.2μM HU引物和0.2μM HR引物(参见表3的引物序列)，总体积为30μL。使用Applied Biosystems VeritiTM热循环仪(Life Technologies，USA)进行PCR扩增，并且包括在95℃下12分钟的初始活化步骤，然后进行如下30个循环：在95℃下变性30秒，65℃退火30秒，72℃延伸1分30秒；还包括在72℃下7分钟的最终延伸步骤。在含有1X TAE缓冲液和0.6μg/mL溴化乙锭的1％琼脂糖凝胶上各反应取5μL电泳后，在UV照射下将PCR产物显色。在每个反应剩余的25μL中，先加入3U的Exonuclease I(ExoI；BioLabs Inc.，Ipswich，MA，USA)和8U的虾碱性磷酸酶(USB Corporation，Cleveland，OH，USA)，在37℃温育90分钟，80℃15分钟，然后置于冰上。
标记引物末端标记
将4μL系列稀释(未稀释、10-1、10-2、10-3和10-4稀释)的Exo-SAP处理的PCR产物模板(或H2O，作为无模板对照)加入16μl标记反应混合物，总共反应体积为20μL[在不含DNase/RNase的水中含有5U HOTDNA聚合酶、1X反应缓冲液C、1mM MgCl2(全部来自Solis Biodyne)、0.4μMddCTPTAMRA(TAMRA标记的双脱氧胞苷三磷酸酯；Jena Bioscience，德国)和0.1μM LP(表3)]。所用的热循环条件是：初始活化步骤在95℃下进行10-12分钟，然后是在96℃下进行30秒变性、在60℃下进行1分钟的组合退火和延伸步骤的10个循环，最终保持在10℃。
熔解曲线分析
在每个LP标记反应中，在存在或不存在蛋白酶K(终浓度为25-50μg/mL)的情况下，加入5'荧光标记的报告探针(RP)至终浓度为0.05-0.1μM。将反应置于具有以下温度分布的荧光检测热循环仪(ABI 7500 Fast，Applied Biosystems)中：56℃30分钟，95℃15秒，40℃15秒，95℃15秒和60℃15秒。这些最后四个步骤包括其中检测荧光的解离阶段，并在解离曲线中表达为荧光与温度测量的导数(dF/dT)。
有机萃取消除假阳性淬灭
在一个实验中，在进行二次解离(如上所述)之前，对初始解离之后的熔解曲线反应进行氯仿萃取(1:1 v/v)以评估萃取效果。
蛋白酶K处理消除假阳性淬灭
最初，在解离分析之前，与报告探针同时加入蛋白酶K至终浓度为25-50μg/mL。然后将浓度提高至100μg/mL，并在加入报告探针之前，用酶处理在56℃进行30分钟。此外，在第二次解离之前，用酶处理未经蛋白酶K处理的熔解曲线分析的样品。
分析HOT TERMIPolDNA聚合酶的末端转移酶样活性
当在ddCTPTAMRA存在下检测LP-RP双链体与HOT TERMIPol DNA聚合酶之间的相互作用时，如上所述设置反应，加入在1X缓冲液C中的聚合酶、ddCTPTAMRA和MgCl2。首先，在加入LP之前将这些反应在95℃下进行10-12分钟以激活聚合酶，并将所述反应分成两组，一组加入蛋白酶K(终浓度50μg/mL)，然后在56℃孵育30分钟。然后加入相应的RP，所述反应进一步分为两组，一组用于如上解离，另一组用于毛细管电泳(见下文)。
毛细管电泳
为了评估潜在共价，在有或没有标记模板(ExoSAP处理的PCR产物)、互补寡核苷酸或蛋白酶K处理的情况下，用ddCTPTAMRA对寡核苷酸进行基于HOT TERMIPol的标记(LP和/或RP)，首先将熔解曲线反应用牛小肠碱性磷酸酶(CIP)处理，从未掺入的ddCTPTAMRA中除去磷酸基团，然后使用DyeSet G5在ABI 3130xl Genetic Analyzer(Applied Biosystems，USA)进行毛细管电泳，具有或不具有GSLIZ120尺寸标准，其中该染料组检测TAMRA标签作为黄色(NED)染料。
结果与讨论
图1显示了使用液体阵列诊断(LAD)SNP分型技术的方法的一个实例。简单地说，携带每个SNP的模板是从基因组DNA进行多重PCR扩增的(为简单起见，图1只显示了一个这样的模板/SNP)。在用外切核酸酶I(Exo I)和虾碱性磷酸酶(SAP)处理分别除去PCR引物和dNTP之后，PCR产物在单核苷酸延伸反应中用作模板，使用与SNP变体互补的淬灭剂标记的ddNTPs来标记标记探针(LP)，该标记探针以其3'末端紧邻SNP与模板退火。为了测定LP标记，添加了一个互补的5'荧光标记的报告探针(RP)，并进行熔解曲线分析；温度依赖性和荧光特异性的淬灭指示LP标记。该方法可用于分型种类特异性SNP以量化样品中存在的细菌种类(图1B)，或分型在非单倍体物种中的SNP等位基因(图1C)。对于几种荧光染料检测通道，利用不同长度(Tm')的LP-RP双链体增加复用度，允许每个样品分型20-30个SNP。
假阳性淬灭及其缓解
我们开发技术来量化细菌物种存在的初步实验涉及16S rDNA序列的扩增，其用作模板在与模板链上G相邻处末端标记物种特异性LP。这些实验利用含有来自大肠杆菌和栖粪杆菌属的16S rDNA序列的质粒的转化体的裂解物，并且使用质粒特异性PCR引物(HU和HR；参见表3)来避免细菌宿主序列的扩增。如图2所示，我们意外地观察到模板量与淬灭反应之间的反比关系，“无模板”对照产生最大程度的淬灭。此外，无论模板浓度如何，所有淬灭反应都需要聚合酶的存在。设计LP-RP引物双链体，使得当与其相应的RP形成双链体时，LP的标记将产生靠近报告子标签(reporter label)的3'ddCTPTAMRA突出；因此未标记的LP与RP的双链体将形成平末端(两端)，使得在熔解曲线分析期间，仍然有活性的聚合酶不会发生RP指导的假阳性引物延伸。为了测试聚合酶是否与未标记的LP-RP双链体和ddCTPTAMRA均结合，因此将淬灭剂束缚在报告子荧光染料附近，我们对来自图2的淬灭阳性样品进行了简单的氯仿提取。如图3所示，有机萃取显著降低了假阳性淬灭现象，揭示了模板剂量依赖性淬灭反应，尽管淬灭反应的Tm从约有机提取前72℃(图2)降低至之后的约66℃(图3)。由于TAMRA标签的疏水性，氯仿可能将ddCTPTAMRA分布到有机相；一些聚合酶也可能也变得类似地分配。该结果也可以由直接由聚合酶产生的假FRET效应来解释。
作为有机提取的替代方案，根据假阳性效应完全是聚合酶依赖性的观察，我们选择测试包括蛋白酶K步骤来灭活聚合酶是否可以取代氯仿提取。在ddCTPTAMRA的存在下和在HOT TERMIPol DNA聚合酶和蛋白酶K两者存在/不存在的情况下，2_1LP和2_1_in1bFAMRevComp RP(序列参见表3)结合。为了允许蛋白酶K灭活聚合酶，在聚合酶活化后但在熔解曲线生成之前，在56℃孵育30分钟。只有不含蛋白酶K而含有聚合酶的样品显示淬灭反应(图4)。在缺乏聚合酶或用蛋白酶K处理后的样品中未观察到假阳性淬灭。
使用蛋白酶K处理避免假阳性效应，然后我们对LAD方法进行了新的检验。图5显示当在LP-RP解离之前包括蛋白酶K处理时，LAD方法显示标记探针的模板剂量依赖的标记产生相应的差异淬灭反应；如预期地，缺乏模板或DNA聚合酶的对照样品显示没有淬灭。
假阳性淬灭似乎涉及末端转移酶样活性
尽管包含蛋白酶K处理灭活聚合酶减轻了假阳性效应，使我们的LAD方法能够成功地实现，但我们希望探索假阳性效应的机制来提供影响LP-RP探针双链体设计参数的信息。为了解决假阳性效应的机制是否可能涉及ddCTPTAMRA的共价添加，进行了以下实验。将两对LP-RP双链体(2_1 LP/2_1_in1bFAMRevComp RP和Faecali LP/Faecali RevComp FAM)(每对形成双平末端)和第三对放在含有活化的HOT TERMIPol DNA聚合酶、ddCTPTAMRA、缓冲液/MgCl2以及含有和不含蛋白酶K的反应混合物中，所述第三对中在RP与其互补LP(FaecaliLP/Faecali RevComp+1 FAM)形成双链体时，其中RP在其一端形成5-FAM-G悬垂。样品首先在56℃温育30分钟，然后进行熔解曲线分析。然后将未用蛋白酶K处理的样品用蛋白酶K处理，然后两组样品再次解离。前两个双末端双链体代表LAD中使用的那些，而具有5'突出G的第三个双末端双链体被认为是聚合酶引物延伸活性的阳性对照，这是因为由于酶的5'->3'聚合酶活性，ddCTPTAMRA应该以与残基相反的方向掺入。
图6和表4总结了这些实验的结果。如图6A-C(峰>70℃的较暗曲线)所示，当不用蛋白酶K处理时，所有三种双链体均表现出淬灭反应。此外，阳性对照双链体(表4中的双链体3，携带5'-G悬垂)也在蛋白酶K处理的样品中显示淬灭(图6A中的峰<70℃的较浅曲线)，而其他用蛋白酶K处理的双链体处理未显示淬灭(较浅的不显示峰的曲线，图6B和C；表4中的双链体1和2)。蛋白酶K处理以前未处理的样品后的第二次解离显示阳性对照双链体3的预期结果，即两个样品都显示淬灭反应(图6D)，尽管未用蛋白酶K处理的第一解离样品现在显示出淬灭，其Tm降低，与之前用蛋白酶K处理的来自第一次解离样品相似。2_1 LP/RP双平末端双链体1(表4)样品都不显示淬灭(图6B和6E)，而Faecali LP/RP双平末端双链体2(表4)样品在第一次解离期间(当未用蛋白酶K处理时，图6C)已经显示淬灭，其在蛋白酶K处理之后的第二次解离期间继续表现出显著的、尽管减少的淬灭，此外Tm也明显降低(图6F)。
阳性对照双链体的结果表明，在第一次解离之前的蛋白酶K处理不足以抑制用ddCTPTAMRA的聚合酶引导的LP延伸，而两种样品中通过蛋白酶K使其最终失活导致明显降低的淬灭反应的Tm。事实上，图6E中2_1双平末端双链体样品都没有显示淬灭，表明该双链体不是通过聚合酶用ddCTPTAMRA共价修饰的，另一种机制揭示了在该双链体的第一次解离中观察到的淬灭(图6B)。双平末端双链体2(Faecali LP/Faecali RevComp FAM)的结果表明，在没有进行蛋白酶K处理的情况下，聚合酶能够将ddCTPTAMRA非模板依赖性地添加到双链体的一个或两个3'末端。这些结果指向在ddCTPTAMRA存在下，Thermosequenase样HOT TERMIPolDNA聚合酶对双链体的几种影响。聚合酶可以具有末端转移酶活性，其可以将ddCTPTAMRA添加到所选择的平末端双链体，而非其他，可能指示该活性的末端序列特异性或偏好性。(已知所选择的DNA聚合酶(其中一些是热稳定的)能够进行模板无依赖性的聚合酶活性，向平末端双链体添加单个3'dAMP(Clark,1988k,Nucleic Acids Research,16:20,p9677-9686)，已经在所谓的PCR扩增子的T/A克隆中被广泛利用的事实，但是这还没有针对ddNTP观察到。)
在ddCTPTAMRA存在下，当与互补的未标记的LP形成双链体时，聚合酶也可以引导荧光标记的RP的假阳性淬灭反应。第三，无论ddCTPTAMRA结合/系链的性质如何，聚合酶对淬灭的双链体具有明显的稳定作用；聚合酶的失活降低了淬灭反应的Tm。
Clark发现平末端的寡核苷酸双链体可以通过热稳定DNA聚合酶的非模板依赖的末端脱氧核糖核苷酸转移酶(TdT)样活性用dATP有效地标记，鉴于Clark(1988，同上)的观察结果，这些结果是出人意料的；用dGTP的相似标记的效率低得多，而对于dTTP和dCTP几乎检测不到。
验证HOT TERMIPol的TdT样活性
在之前的实验中，两个平末端双链体中仅有一个被TdT样活性标记，可能表明该活性的序列周围特异性。此外，蛋白酶K与报告探针同时加入，在通过蛋白酶K完全灭活之前允许聚合酶活性。基于在熔解曲线生成期间的淬灭观察，TdT样活性的检测也是间接的。我们希望通过用毛细管电泳检测寡核苷酸的荧光标记，直接检测第三个双平末端的LP-RP双链体的潜在的基于HOT TERMIpol的标记。为了确定任何这种标记的聚合酶依赖性，我们在添加RP之前用蛋白酶K处理含有活化聚合酶的反应。这些实验的总结显示在表5中。在活性HOTTERMIPol DNA聚合酶(即在不存在蛋白酶K处理)的情况下，双链体4的两个寡核苷酸都显示用ddCTPTAMRA的模板非依赖性标记，双链体显示相应的假阳性淬灭和Tm位移反应。应当注意的是，即使用蛋白酶K处理，双链体也表现出背景淬灭反应。该双链体中的LP的3'末端包含已知的内含淬灭活性的两个末端鸟嘌呤碱基(Marras等人，2002,Nucleic AcidsResearch,e122；Seidel等人,1996,J.Phys.Chem.,100,第5541-5553页)。
可选的双链体结构来规避HOT TERMIPol的TdT样活性
我们已经证明了HOT TERMIPol DNA聚合酶的新型TdT样活性，其可以在平末端寡核苷酸双链体的末端添加单个ddCTP。此外，证据支持活性聚合酶通过未知机制将未掺入的ddCTPTAMRA连接到具有荧光标签的双链体上，从而产生温度依赖的淬灭反应，其也显示增加的Tm指示聚合酶的双链体稳定效应。这也可能由直接的聚合酶依赖的假FRET效应引起。总体上，在熔解曲线分析之前，可以通过包含聚合酶灭活步骤(通过蛋白酶K处理)来克服这些影响。
为了减少这些影响的一些或全部，我们评估了包含5'非互补突出和/或3'突出端的组合的替代双链体结构，其中一些用报告荧光染料标记，并在活性或非活性HOTTERMIPol DNA聚合酶存在下，检验其ddCTPTAMRA标记和温度依赖的淬灭行为。
如表6所示，在活性DNA聚合酶存在或不存在下，形成5'T突出(在存在或不存在FAM标签下一个或两个T)或3'C或G突出的双链体5-9的寡核苷酸都没有被ddCTPTAMRA标记。与双链体4(表5)相比，含有FAM-标记的T(双链体5)的5'突出的存在在一定程度上降低了在不存在活性聚合酶的情况下，未标记LP的固有双G淬灭作用。延伸LP的两个G碱基和双链体7中的5'FAM标签之间的距离进一步减少了此效果。在未用蛋白酶K处理的活性聚合酶存在下，双链体5和7均显示出淬灭增加，在双链体5的情况下示出双G效应和假阳性ddCTPTAMRA-结合作用和/或聚合酶依赖性假FRET效应的组合，并且在双链体7的情况下前者较少并且后者较多；两者都表现出相应的Tm移位。双链体8具有更接近两个鸟嘌呤的FAM标签，并产生相应的增加的双G淬灭效应。
令人惊讶的是，活性聚合酶的存在不会通过假阳性效应增加淬灭，也不会由于微量的Tm增加而显著稳定双链体。该结果可能表明聚合酶在具有5'凹端的双链体末端显示出结合减少。
表6的结果与如下观点一致：含有富含G的3'-末端的LP的引物双链体具有固有的淬灭特性，以及用不与ddCTPTAMRA互补的一个碱基(或两个，即T)的相应的用报告荧光团标记的RP的5'末端的延伸似乎减轻了这种G介导的淬灭效应，但似乎并没有影响在标记的ddCTP的存在下由活性聚合酶引起的假阳性淬灭效应，如同双链体8所观察到的那样。双链体的假阳性淬灭行为的差异可以通过活性聚合酶对具有5'凹端与5'突出的dsDNA末端的结合效率的潜在差异来解释，即使是与游离的双脱氧核苷三磷酸不互补的碱基。
我们希望检测含有类似5'突出或5'凹端的RP的双链体中是否包含含有非互补碱基的5'LP突出与可进一步降低假阳性效应。如表7所示，如通过毛细管电泳(CE)验证，在活性聚合酶存在下，含有5'T突出的LP的双链体的RP的3'末端意外地被ddCTPTAMRA标记。没有观察到与相应的5'RP T延伸(表7双链体10-12和表6双链体5-7)相对的LP的相似的3'延伸，这可能表明针对该活性的3'末端序列周围特异性；在考虑双链体11(表7)和6(表6)的结果时，这些5'RP上的FAM标签的存在似乎不是这种差异的原因。表7中双链体的假阳性效应的评估与如下混淆：背景双G效应、和在RP上3'TAMRA标记对在5'末端的FAM-标签使用分子内淬灭的可能性。此外，由于3'RP标记，未掺入的ddCTPTAMRA的消耗也可能会预期降低活性聚合酶的假阳性淬灭和/或去除聚合酶以避免聚合酶依赖的假FRET效应。在双链体13中，这些效应可能是最彻底的，其显示了通过CE分析的所有双链体的3'RP标记的最大程度(数据未示出)，并且其中在双重标记的RP中3'-TAMRA和5'-FAM部分之间的距离是最短的。
关于最佳LAD双链体和预解离处理的初步结论
从本文呈现的结果，特别是关于迄今未证明的Thermosequence样HOT TERMIPolDNA聚合酶的TdT样和非互补引物延伸活性除了在双链体解离期间发生的假阳性和Tm移位效应，而不考虑这些活性，我们可以总结最佳LAD双链体的重要特征。
1.在具有5'报告分子标记的RP的双链体中未标记的LP应在两端产生单碱基5'凹端。平末端具有被聚合酶的TdT样活性标记的潜力(分别是表4和表5中的双链体2和4)。应避免含有与ddNTP互补的5'突出的双链体，因为它们有可能通过聚合酶的引物延伸活性而被标记。即使与ddNTP不互补，由于本文所述聚合酶的非互补引物延伸活性(双链体10-14)，也应避免这种突出。
2.可以将LP设计为邻近SNP的任一侧，并且如果可能的话，它们应设计成在3'末端避免鸟嘌呤以限制其固有的淬灭效应。类似地，RP可以用报告荧光染料5'-标记，并且如果可能的话应该避免5'鸟嘌呤。这些不是LAD方法成功工作的绝对要求，因为可以测量其中LP由淬灭剂偶联的ddNTP扩增的双链体与其中LP保持未标记的那些双链体之间的温度依赖性淬灭的差异。
应当注意，携带5'凹端的引物双链体也可能受到活性聚合酶的假阳性和Tm移位效应的影响，而不管是否存在淬灭剂偶联的ddNTP。来自双链体8的结果表明，聚合酶可能结合5'凹端的双链DNA末端的效率低于与平末端或3'凹端结合，从而减轻假阳性和Tm移位效应。通过在RP添加和解离之前用蛋白酶K处理灭活聚合酶可以避免这些作用(如上所述)。这也可以用于具有平末端和/或3'凹端的双链体，以减轻假阳性和Tm移位效应，而且还可以避免通过聚合酶的TdT样或引物延伸活性进行的解离前双链体标记。
用于减轻假阳性效应的替代处理可以是用磷酸酶处理后LP标记的样品以灭活淬灭剂偶联的ddNTP，或者如本文所述加入未标记的ddNTP以竞争胜过淬灭剂偶联的ddNTP。为了消除假阳性和Tm移位效应，可以在加入RP和解离之前将与HOT TERMIPol交叉反应的抗DNA聚合酶抗体加入到样品中。
表3.引物名称和序列(在5'端显示的荧光FAM标记)。
实施例2
材料和方法
用于LP标记的模板生成
携带牛MYOSTATIN(MSTN)序列的质粒用于聚合酶链式反应以产生用于标记探针(LP)标记的模板。简言之，将100pg质粒DNA加入到以下反应组分中：1.25U HOTDNA聚合酶、1X B2缓冲液、1.5mM MgCl2(全部来自Solis Biodyne，Estonia)、0.1mM dNTPs(Thermo Fisher Scientific，USA)、0.1-0.2μM正义引物(SP)和0.1-0.2μM反义引物(ASP；参见表8的引物序列)，总体积为30μL。使用Applied Biosystems VeritiTM热循环仪(LifeTechnologies，USA)进行PCR扩增，并包含初始活化步骤在95℃下10分钟，随后进行在95℃下30秒变性、在50-60℃退火30秒和在72℃延伸1分30秒的30个循环；还包括在72℃下7分钟的最终延伸步骤。在含有1X TAE缓冲液和0.6μg/mL溴化乙锭的1％琼脂糖凝胶上取各反应物5μL电泳，之后在UV照射下使PCR产物显色。在每个反应剩余的25μL中，先加入3U的Exonuclease I(ExoI；BioLabs Inc.，Ipswich，MA，USA)和8U的虾碱性磷酸酶(USBCorporation，Cleveland，OH，USA)在37℃温育90分钟，80℃保温15分钟，然后置于冰上。
标记引物末端标记
将4μLExo-SAP处理的PCR产物模板(或H2O，作为无模板对照)加入到16μl标记反应主混合物中，使总反应体积为20μL[在不含DNase/RNase的水中，5U HOT聚合酶、1X反应缓冲液C、1mM MgCl2(全部来自Solis Biodyne)、0.4μM ddNTPQUENCHER(ATTO540Q标记的双脱氧尿苷三磷酸，ATTO612Q标记和DYQ660标记的双脱氧胞苷三磷酸；JenaBioscience，德国)和0.1μM LP(表8)]。所用的热循环条件是：初始活化步骤在95℃下进行10-12分钟，然后进行在96℃下30秒变性、在60℃下1分钟的退火和延伸组合步骤的10个循环，并且最终保持在10℃。
末端转移酶标记
含有0.1μM标记探针、1X TdT缓冲液、0.5mM ddNTPQUENCHER(ATTO540Q标记的双脱氧尿苷三磷酸、ATTO612Q标记和DYQ660标记的双脱氧胞苷三磷酸；Jena Bioscience，德国)、0.25mM CoCl2、0.2U/μL末端(脱氧核苷酸)转移酶(New England Biosciences)在37℃孵育1小时，然后所述酶在75℃下热灭活30分钟。
熔解曲线分析
在加入报告探针和进行熔解曲线分析之前，用以下处理样品：蛋白酶K(在H2O、1X缓冲液C或1X TdT缓冲液中最终浓度为25-58μg/mL，)、牛血清白蛋白(BSA，在H2O、1X缓冲液C或1X TdT缓冲液中终浓度为25-58μg/mL)、SDS(在H2O、1X缓冲液C或1X TdT缓冲液中最终浓度为0.1-0.25％)或简单地加入相同体积的H2O、1X缓冲液C或1X TdT缓冲液。然后将样品在56℃下温育30分钟。然后将报告探针加入至最终浓度为0.025-0.1μM。一旦确定SDS在灭活聚合酶时与蛋白酶K一样有效，从而减轻了Tm移位和假FRET效应，则将报告探针直接加入到含有SDS的溶液中(在H2O、1X缓冲液C或1X TdT缓冲液中终浓度为0.1-0.25％)。然后将反应物置于具有以下温度分布的荧光检测热循环仪(ABI 7500 Fast，Applied Biosystems)中：95℃15秒、25-30℃15秒、95℃15秒和60℃15秒。这些最后四个步骤包括其中检测荧光的解离阶段，并在解离曲线中表达为荧光与温度测量的导数(dF/dT)。将含有双链体的其中寡核苷酸不与荧光团EvaGreen(Biotium)缀合的样品加入至终浓度为1X。
结果和讨论
聚合酶依赖性假FRET效应与ddNTP-Quencher独立
为了进一步研究聚合酶依赖性假淬灭(FRET)效应的可能机制，我们进行了模拟标记反应，其中缺乏模板并且包含了+/-LP(标记探针)、+/-ddUTP-ATTO540Q的所有组合，首先在95℃下孵育10分钟以激活Hot TERMIpol DNA聚合酶，然后分成两等份等分试样。将蛋白酶K(1X缓冲液C)加入到一组中，终浓度为58μg/mL，另一组接受相同体积的1X缓冲液C。在产生从30℃到95℃的熔解曲线之前，两个样品组在56℃温育30分钟。不论淬灭剂标记的ddNTP的存在或不存在，FAM标记的RP C313Y RP(U)FAM和HEX标记的RP nt821 RP(U)HEX在含有各自相应的互补LP、C313Y LP(C_U)和nt821(del11)LP(U)的样品中示出淬灭反应，但仅有未经蛋白酶K处理的聚合酶保持活性的那些(图7，子图A和B)。这些结果还证实聚合酶依赖性假FRET效应对于其中一条寡核苷酸用荧光染料FAM标记的双链体来说不是特异的，这是因为对于含有HEX的那些也观察到(图7，子图B)。
SDS处理减轻了Tm转移和假FRET效应
为了找到在添加报告探针之前不需要单独处理和孵育步骤的聚合酶灭活的替代方法，使用了SDS。十二烷基硫酸钠(SDS)是一种去垢剂和强大的蛋白质变性剂，其浓度低于1％时不会显著影响核酸杂交。测试了在加入RP和进行熔解曲线分析之前，向含有LP的样品中加入SDS至终浓度为0.1-0.25％。
图8显示，添加SDS至0.1％与蛋白酶K一样有效地减轻了用未补充的1X缓冲液C处理的阴性对照反应中观察到的基于聚合酶的Tm偏移效应。还包括另一个对照反应以确认额外的蛋白质的加入没有导致在蛋白酶K处理的样品中看到的较低的Tm。当以相同浓度加入时，牛血清白蛋白(BSA)没有示出在用蛋白酶K处理的样品中观察到的Tm偏移，表明Tm移位是蛋白酶K的聚合酶失活活性的结果，而不是其作为蛋白质的通用性质。
在RP添加和熔解曲线生成之前加入未标记的LP时，0.1％SDS也可以像蛋白酶K一样有效地减轻用未补充的1X缓冲液C处理的阴性对照反应中所见的假FRET效应(图9)。包括另一个对照反应，以证实加入额外的蛋白质无助于在蛋白酶K处理的样品中见到的假FRET的缓解。当以相同的浓度加入时，牛血清白蛋白(BSA)显示出假FRET，因此没有显示出在用蛋白酶K处理的样品中观察到的这种缓解，表明减轻假FRET是蛋白酶K的聚合酶失活活性的结果，而不是其作为蛋白质的通用性质。还值得注意的是，对于荧光染料CY5，基于聚合酶的假FRET不表现为淬灭，而是荧光的温度依赖性增加，即定义为FRET的一种形式(图9，子图B)。
使用SDS灭活聚合酶代表了通过消除额外的试剂添加步骤和干预温育期显著改善LAD方法；报告探针可以与SDS同时添加，熔解曲线确定可以直接启动。
双链体Tm移位效应是DNA聚合酶的一般性质
非Thermosequenase样DNA聚合酶不能将荧光染料缀合的ddNTP有效地掺入DNA中，因此测试常规的、PCR可适应的DNA聚合酶(例如Hot FIREPol)的能力，以引发Hot TERMIPol中观察到的稳定双链体的Tm移位效应，使用热不稳定末端(脱氧核苷酸)转移酶用淬灭剂标记的ddNTP标记标记探针。一旦标记反应在37℃下完成，通过在75℃下孵育30分钟来去除末端转移酶活性。然后将Hot FIREPol加入到反应中，在95℃加热活化10-12分钟，然后在聚合酶灭活的SDS溶液中或在其中聚合酶仍然保持活性的样品缓冲液中加入互补的报告探针。
如图10所示，与聚合酶灭活的相同样品相比，携带活性DNA聚合酶的所有样品显示出Tm增加的淬灭曲线。对于含有四种不同荧光染料(FAM、Yakima Yellow、ROX&CY5)的RP和具有两种不同淬灭剂(ATTO540Q&ATTO612Q)的LP，观察到这种效果。除了具有较高的Tm外，淬灭曲线的宽度在活性聚合酶样品中看起来要宽得多。相比于Hot TERMIPol(例如图8)，对于HotFIREPol(图10)似乎更为显著。我们的解释是活性聚合酶样品淬灭曲线的相对宽度反映了聚合酶对双链体的相对结合亲和力。因此，Hot TERMIPol似乎对双链体DNA具有更高的结合亲和力，为Thermosequenase样聚合酶的掺入团块修饰(bulky modification)的ddNTPs的能力增强提供了可能的解释。
聚合酶依赖性双链体Tm移位效应不需要共轭荧光团
为了验证聚合酶依赖性Tm移位效应不仅仅是对双链体观察到的特性，所述双链体中两条寡核苷酸与荧光团/淬灭剂结合，我们使用双链DNA结合荧光染料EvaGreen，其仅在可逆插入双链体DNA的核苷酸之间时才发荧光。图11显示，与通过蛋白酶K处理已经灭活聚合酶的样品相比，在活性聚合酶存在下，16和20个核苷酸对长度的双链体(分别为子图A和B)分别表现出更高的Tm的荧光峰。由于SDS消除了EvaGreen的dsDNA结合能力(数据未示出)，SDS不能用于灭活聚合酶。对于长度为30个和60个核苷酸对的双链体，Tm移位不太明显(图11，子图C和D)。预期荧光强度随着双链体长度的增加而增加，因为更长的双链体具有增加数量的碱基对，其中EvaGreen可插入其间。对于较短的双链体，活性聚合酶样品中较低的相对荧光(图11，子图A和B)可能表明聚合酶对EvaGreen结合造成物理障碍，或聚合酶淬灭EvaGreen荧光。
使用LAD技术在4个荧光通道上以2Tms对8个等位基因进行基因分型
我们应用LAD技术对牛MYOSTATIN(MSTN)基因的三个扩增子区域上的四个多态性(三个SNP和一个indel)基因分型，其中突变是双肌性状中的致病因子。图12显示，LAD技术成功检测到MSTN基因的三个扩增区域中所有八个等位基因，其中所述MSTN基因在所有四个多态基因位点上表示杂合个体。在每个四个荧光检测通道中，将等位基因检测为两个不同Tm的淬灭峰(图12，子图A-D)。在任何荧光检测通道的无模板对照样品中没有观察到淬灭信号(图12，子图A-D)。通过增加每个荧光通道的可分辨Tm的范围和数量，并且通过实施其它这样的通道，预期LAD技术可用于多达60个不同等位基因的多重基因分型。
序列表
<110> 挪威生命科学大学
赫德马克应用科学大学
<120> 用于在采用ddNTP的方法中防止假阳性的方法和产品
<130> FP1V171211ZX
<160> 49
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物2_1 LP
<400> 1
caggtgtagc ggtgaaatgc gtagagat 28
<210> 2
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物2_1_in1bFAMRevComp
<400> 2
atctctacgc atttcaccgc tacacctg 28
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物Faecali LP
<400> 3
cgtagttagc cgtcacttc 19
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物Faecali RevComp +1 FAM
<400> 4
ggaagtgacg gctaactacg 20
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物Faecali RevComp FAM
<400> 5
gaagtgacgg ctaactacg 19
<210> 6
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物LAD LP GP2
<400> 6
gagctggggt agcagg 16
<210> 7
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物LAD LP GP2 -1(5')
<400> 7
agctggggta gcagg 15
<210> 8
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物LAD LP GP2 5'T
<400> 8
tgagctgggg tagcagg 17
<210> 9
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物LAD RP1 GP2atda -1 (FAM)
<400> 9
ctgctacccc agctc 15
<210> 10
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物LAD RP1 GP2atda +1T (FAM)
<400> 10
tcctgctacc ccagctc 17
<210> 11
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物LAD RP1 GP2atda +2T FAM
<400> 11
ttcctgctac cccagctc 18
<210> 12
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物LAD RP1 GP2atda 0 FAM
<400> 12
cctgctaccc cagctc 16
<210> 13
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物HR
<400> 13
gcttccggct cgtatgttgt gtgg 24
<210> 14
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物HU
<400> 14
cgccagggtt ttcccagtca cgacg 25
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物SP_MSTN gene_371-480
<400> 15
ctcctccact cctggaactg 20
<210> 16
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物ASP_MSTN gene_371-480
<400> 16
cgtcctggcg tggtagtc 18
<210> 17
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物SP_MSTN gene_2329-2688
<400> 17
ttatagctga tcttctaacg caagtg 26
<210> 18
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物ASP_MSTN gene_2329-2688
<400> 18
ctgggaaggt tacagcaaga tc 22
<210> 19
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物SP_MSTN gene_4787-4976
<400> 19
ggagagattt tgggcttgat tg 22
<210> 20
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物ASP_MSTN gene_4787-4976
<400> 20
tgcacaagat gggtatgagg atac 24
<210> 21
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物ASP60
<400> 21
ttgtgatgta gatggcggtt aggacggcag ttttatggag gtggataggt ctttactcag 60
<210> 22
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物ASP30
<400> 22
agttttatgg aggtggatag gtctttactc 30
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物ASP20
<400> 23
agttttatgg aggtggatag 20
<210> 24
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物ASP16
<400> 24
ttatggaggt ggatag 16
<210> 25
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物SP60
<400> 25
ctgagtaaag acctatccac ctccataaaa ctgccgtcct aaccgccatc tacatcacaa 60
<210> 26
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物D182N LP (C_U)
<400> 26
ttccagtata ccttgtaccg t 21
<210> 27
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物D182N RP (C)CY5
<400> 27
tttcggtaca aggtatactg gaat 24
<210> 28
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物C313Y LP (C_U)
<400> 28
ggatactttt gcaaaaatac aaattca 27
<210> 29
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物C313Y RP (U)FAM
<220>
<221> 修饰碱基
<222> (3)..(11)
<223> n为C-5丙炔基-脱氧尿苷
<220>
<221> 修饰碱基
<222> (24)..(25)
<223> n为C-5丙炔基-脱氧胞苷
<400> 29
aanttgtatt nttgcaaaag tatnnt 26
<210> 30
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物nt821 (del11) LP (U)
<400> 30
gggcttgatt gtgatgaaca c 21
<210> 31
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物nt821 RP (U) HEX
<400> 31
tttgttcatc actatcaa 18
<210> 32
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物Q204X LP (C_U)
<400> 32
ccaggcactg gtatttgg 18
<210> 33
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物Q204X RP2 (C) ROX
<400> 33
tttttcaaat actagtgcct ggg 23
<210> 34
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物E291X LP (C)
<400> 34
ccaatcccat ccaaaagctt 20
<210> 35
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物E291X RP (C) CY5
<220>
<221> 修饰碱基
<222> (6)..(6)
<223> n为C-5丙炔基脱氧胞苷
<220>
<221> 修饰碱基
<222> (8)..(8)
<223> n为C-5丙炔基脱氧尿苷
<400> 35
tttagntntt ggatgggatt gga 23
<210> 36
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物F94L LP (C)
<400> 36
ctggaactga ttgatcagtt 20
<210> 37
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物F94L RP3 (C) ROX
<400> 37
tttactgatc aatcagttcc agg 23
<210> 38
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物E226X LP (C)
<400> 38
ccattctcat ctaaagcttt gattt 25
<210> 39
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物E226X RP (C) CY5
<400> 39
aatcaaaact ttagatgaga atggc 25
<210> 40
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物E226X LP (U)
<400> 40
ctgaatccaa cttaggcatt 20
<210> 41
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物E226X RP (U)YY
<400> 41
atgcctaagc tggattcagg 20
<210> 42
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物E291X LP (U)
<400> 42
gttaccctct aactgtggat ttt 23
<210> 43
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物E291X RP (U)YY
<220>
<221> 修饰碱基
<222> (5)..(22)
<223> n为m5c
<400> 43
aaatncanag ttagagggta ang 23
<210> 44
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物F94L LP (U)
<400> 44
ggcatctctc tggacatc 18
<210> 45
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物F94L RP (U)FAM
<400> 45
atgtccagag agatgcca 18
<210> 46
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物nt419 Wt LP (U)
<400> 46
agtttattgt attgtatctt agagctaaa 29
<210> 47
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物nt419 RP (U) FAM
<400> 47
tttagctcta agatag 16
<210> 48
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物nt419 (d7i10) LP (C)
<400> 48
gaaaacccaa atgttgtttc taag 24
<210> 49
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物nt419 (d7i10) RP (C) ROX
<400> 49
ttttcttaga aacaacatta 20
Claims (39)
1.一种在聚合酶的存在下抑制ddNTP与多核苷酸的结合的方法，其中所述多核苷酸为双链，但是可以任选地包括长度为至多10个核苷酸的单链区域，其中当所述单链区域提供5’突出序列时，其在紧邻双链区域不包括与所述ddNTP互补的碱基，其中所述方法(i)包括灭活、降解或除去所述聚合酶，去磷酸化或除去所述ddNTP和/或用另一种ddNTP竞争胜过所述ddNTP，和/或(ii)使用具有一个单链区域的多核苷酸，所述单链区域提供长度为至少1个核苷酸的3'突出序列或长度为至少2个核苷酸的5'突出序列，和/或使用在多核苷酸的一个或两个末端具有长度为至少1个核苷酸的单链区域的多核苷酸，并且所述单链区域至少部分地由所述多核苷酸中的一个或多个碱基对之间的错配导致，其中优选地所述方法包括熔解曲线分析。
2.如权利要求1所述的方法，其中当所述单链区域提供5’突出序列时，其在所述单链区域中任意位置均不含与所述ddNTP互补的碱基。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述ddNTP携带第一标签，并且所述多核苷酸携带第二标签。
4.如权利要求3所述的方法，其中当所述标签彼此靠近时，所述第一或第二标签影响另一标签产生的信号。
5.如权利要求4所述的方法，其中所述第一或第二标签为荧光团，并且另一标签为在靠近所述荧光团时影响所述荧光团的荧光的分子。
6.如权利要求5所述的方法，其中所述另一标签为淬灭分子。
7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述多核苷酸上的所述第二标签为荧光团。
8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述多核苷酸上的所述第二标签位于构成所述双链多核苷酸的链之一的5’端。
9.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其中当所述双链多核苷酸的一个或两个末端为平末端时，灭活、降解或除去所述聚合酶，去磷酸化或除去所述ddNTP和/或用另一种ddNTP竞争胜过所述ddNTP。
10.如权利要求1-9中任一项所述的方法，其中当所述双链多核苷酸的一个或两个末端具有5’突出端时，灭活、降解或除去所述聚合酶，去磷酸化或除去所述ddNTP，用另一种ddNTP竞争胜过所述ddNTP，和/或使用具有长度为至少2个核苷酸的单链区域(5’突出)的多核苷酸，和/或使用在多核苷酸的一个或两个末端上具有长度为至少1个核苷酸以形成5’突出链的单链区域的多核苷酸，并且所述单链区域至少部分地由所述多核苷酸中的一个或多个碱基对之间的错配导致。
11.如权利要求1-9中任一项所述的方法，其中当所述双链多核苷酸的一个或两个末端具有3’突出端时，灭活、降解或除去所述聚合酶，去磷酸化或除去所述ddNTP，用另一种ddNTP竞争胜过所述ddNTP，和/或使用具有长度为至少1个核苷酸的单链区域(3’突出)的多核苷酸，和/或使用在多核苷酸的一个或两个末端上具有长度为至少1个核苷酸以形成3’突出链的单链区域的多核苷酸，并且所述单链区域至少部分地由所述多核苷酸中的一个或多个碱基对之间的错配导致。
12.如权利要求1-11中任一项所述的方法，其中所述方法还包括通过在允许其杂交的条件下使第一和第二多核苷酸接触来产生所述双链多核苷酸的步骤。
13.如权利要求12所述的方法，其中在所述双链多核苷酸产生之前、期间和/或之后，进行以下步骤：灭活、降解或除去所述聚合酶，去磷酸化或除去所述ddNTP，竞争胜过所述ddNTP，和/或使用具有长度为至少1个核苷酸(3’突出)或具有长度为至少2个核苷酸(5’突出)的单链区域的多核苷酸，和/或使用在多核苷酸的一个或两个末端上具有长度为至少1个核苷酸的单链区域的多核苷酸，并且所述单链区域至少部分地由所述多核苷酸中的一个或多个碱基对之间的错配导致。
14.如权利要求1-13中任一项所述的方法，其中所述聚合酶用蛋白激酶K灭活或降解。
15.如权利要求1-13中任一项所述的方法，其中所述聚合酶用去垢剂灭活或降解，优选用十二烷基硫酸钠。
16.如权利要求1-13中任一项所述的方法，其中所述ddNTP用虾碱性磷酸酶或牛小肠碱性磷酸酶去磷酸化。
17.如权利要求1-13中任一项所述的方法，其中所述多核苷酸或ddNTP的去除包括通过亲和结合，从所述多核苷酸或ddNTP中分离所述双链多核苷酸的一条或两条链，优选地，所述双链多核苷酸携带结合配对的一个结合配偶体，优选生物素。
18.一种在序列检测法中避免假阳性的方法，其中所述序列检测法包括使ddNTP、聚合酶、和彼此杂交以形成第三多核苷酸的第一和第二多核苷酸接触的步骤，所述第三多核苷酸是具有任选的单链区域的双链多核苷酸，其中所述双链多核苷酸如权利要求1或2所定义，其中所述ddNTP和/或多核苷酸任选地携带如权利要求3-8中任一项所述的标签，其中所述方法通过如权利要求1-17中任一项所述的方法抑制ddNTP与所述第三多核苷酸的结合。
19.如权利要求18所述的方法，其中在所述双链多核苷酸产生之前、期间和/或之后，进行以下步骤：灭活、降解或除去所述聚合酶，去磷酸化或除去所述ddNTP，竞争胜过所述ddNTP，和/或使用具有长度为至少1个核苷酸(3’突出)或具有长度为至少2个核苷酸(5’突出)的单链区域的多核苷酸，和/或使用在多核苷酸的一个或两个末端上具有长度为至少1个核苷酸的单链区域的多核苷酸，并且所述单链区域至少部分地由所述多核苷酸中的一个或多个碱基对之间的错配导致。
20.如权利要求18或19所述的方法，其中所述第一和/或第二多核苷酸长度为10-100个核苷酸。
21.一种避免假熔解温度(Tm)读数和/或假FRET效应(优选假阳性淬灭)的方法，其中，优选地，所述方法为在熔解曲线分析方法中，其中所述方法包括使聚合酶、任选的ddNTP和/或dNTP和彼此杂交以形成第三多核苷酸的第一和第二多核苷酸接触的步骤，所述第三多核苷酸是具有任选的单链区域的双链多核苷酸，其中当要避免假FRET效应时，所述第一多核苷酸携带荧光标签，其中所述方法进一步包括在评估Tm和/或FRET效应之前灭活、降解或除去所述聚合酶，和/或，当避免假FRET效应和在所述方法中使用dNTP和/或ddNTP时，去磷酸化或除去所述dNTP和/或ddNTP，和/或用另一种dNTP和/或ddNTP竞争胜过所述dNTP和/或ddNTP，其中优选地所述双链多核苷酸如权利要求1或2所定义，和/或优选地所述方法包括如权利要求12所定义的附加步骤，优选如权利要求13所定义，和/或优选地，所述灭活、降解或除去所述聚合酶，或所述去磷酸化或除去所述dNTP和/或ddNTP是如权利要求14-17中任一项所述进行的。
22.如权利要求21所述的方法，其中当dNTP和/或ddNTP使用所述dNTP和/或ddNTP时，并且所述多核苷酸用如权利要求3-8中任一项所述进行标记，并且当不使用dNTP和/或ddNTP时，所述第一多核苷酸携带如权利要求4-7中任一项所述的方法的第一标签，并且任选地，所述第一或第二多核苷酸携带如权利要求4-8中任一项所述的方法的第二标签。
23.一种在待测多核苷酸中鉴定目标核苷酸序列的方法，包括：
(a)使所述待测多核苷酸与ddNTP和未标记的标记探针接触，该探针在所述目标核苷酸序列存在时与其杂交，在聚合酶存在下，所述探针杂交在所述目标核苷酸序列中与所述ddNTP互补的碱基的直接5'端，其中所述ddNTP携带第一标签，并且当所述目标序列存在于所述待测多核苷酸中时，所述未标记的标记探针与所述待测多核苷酸杂交并且通过所述聚合酶在3'方向上延伸以将标记的ddNTP连接到所述未标记的标记探针上形成标记的标记探针；
(b)从所述待测多核苷酸分离可能被标记或未标记的所述标记探针；
(c)将所述标记探针与携带第二标签的报告探针杂交以形成双链多核苷酸，其中当标签彼此接近时，所述第一或第二标签影响由另一标签产生的信号(其中优选地，所述第一或第二标签是荧光团，而另一个标签是在靠近所述荧光团时影响所述荧光团的荧光的分子)，其中当所述标记探针未标记时，在紧邻第二标签的一端，双链多核苷酸是(i)平末端；(ii)具有突出的5'端或(iii)具有突出的3'端，并且在远离第二标签的一端，所述双链多核苷酸是(i)平末端；(ii)具有突出的5'端或(iii)具有突出的3'端，其中所述突出端由单链区域组成，并且当所述单链区域提供5'突出序列时，其在紧邻所述双链区域处不包含与所述ddNTP互补的碱基(优选地，在所述单链区域的任意位置不包含与所述ddNTP互补的碱基)；
(d)灭活、降解或去除所述聚合酶，去磷酸化或除去在步骤(a)中未结合的ddNTP，用另一种ddNTP竞争胜过所述ddNTP，和/或使用这样的标记探针和报告探针，其中当它们结合在一起时提供长度为至少1个核苷酸(3'突出)或2个核苷酸(5'突出)的单链区域，和/或使用这样的标记探针和报告探针，其中当它们结合在一起时，在所述双链多核苷酸的一个或两个末端提供长度至少为1个核苷酸的单链区域并且所述单链区域至少部分地由所述双链多核苷酸中的一个或多个碱基对之间的错配导致，
其中步骤(d)可以在产生所述双链分子之前、期间和/或之后进行；以及
(e)通过评估与所述双链多核苷酸相关联的信号来确定所述标记探针是否携带第一标签，其中所述第一或第二标签信号中的变化指示所述目标序列在所述待测多核苷酸中的存在。
24.如权利要求23所述的方法，其中，
(i)根据步骤(c)，当所述多核苷酸的一端或两端是平末端时，在步骤(d)中，所述聚合酶被灭活、降解或除去，在步骤(a)中未结合的所述ddNTP被去磷酸化或除去，和/或用另一种ddNTP竞争胜过所述ddNTP，
(ii)当所述多核苷酸的一端或两端具有根据步骤(c)的5'突出端时，在步骤(d)中，所述聚合酶被灭活、降解或除去，在步骤(a)中未结合的所述ddNTP被去磷酸化，用另一种ddNTP竞争胜过所述ddNTP，和/或这样的标记探针和报告探针，其中当它们结合在一起时提供形成长度为至少2个核苷酸的5’突出端的单链区域，和/或使用这样的标记探针和报告探针，其中当它们结合在一起时，在所述双链多核苷酸的一个或两个末端提供长度至少为1个核苷酸的单链区域并且所述单链区域至少部分地由所述双链多核苷酸中的一个或多个碱基对之间的错配导致，和/或
(iii)当所述多核苷酸的一端或两端具有根据步骤(c)的3'突出端时，在步骤(d)中，所述聚合酶被灭活、降解或除去，在步骤(a)中未结合的所述ddNTP被去磷酸化，用另一种ddNTP竞争胜过所述ddNTP，和/或这样的标记探针和报告探针，其中当它们结合在一起时提供形成长度为至少1个核苷酸的3’突出端的单链区域，和/或使用这样的标记探针和报告探针，其中当它们结合在一起时，在所述双链多核苷酸的一个或两个末端提供长度至少为1个核苷酸的单链区域并且所述单链区域至少部分地由所述双链多核苷酸中的一个或多个碱基对之间的错配导致。
25.如权利要求23或24所述的方法，其中所述第一和/或第二标签如权利要求5-8中任一项所定义，和/或所述标记探针和/或报告探针长度为10至100个核苷酸。
26.如权利要求23-25中任一项所述的方法，其中所述聚合酶用蛋白酶K或SDS灭活或降解，和/或所述ddNTP用虾碱性磷酸酶或牛小肠碱性磷酸酶去磷酸化。
27.如权利要求23-25中任一项所述的方法，其中所述聚合酶或ddNTP的去除包括通过亲和结合将所述标记探针和/或报告探针与所述聚合酶或ddNTP分离，优选地，其中所述标记探针或报告探针携带结合配对的一个结合配偶体，优选生物素。
28.如权利要求23-27中任一项所述的方法，其中所述目标核苷酸序列是单核苷酸多态性(SNP)。
29.如权利要求23-28中任一项所述的方法，其中在所述方法中检测至少两个目标核苷酸序列，优选至少两个SNP。
30.如权利要求23-29中任一项所述的方法，其中使用至少两个标记的ddNTP，其中优选地，位于所述不同的ddNTP上的第一标签不同。
31.如权利要求23-30中任一项所述的方法，其中使用至少两个报告探针(和/或标记探针)，其中优选地，不同的报告探针上的第二标签不同。
32.如权利要求31所述的方法，其中使用至少两个报告探针和/或至少两个标记探针，并且当所述报告探针和标记探针彼此杂交时，它们产生至少两条具有不同熔解温度的双链多核苷酸。
33.根据权利要求30-32中任一项所述的方法，其中提供多对标签，其中每对标签包括ddNTP上的第一标签和报告探针上的第二标签，其中每对标签与每隔一对标签不同，其中优选地每对包含这样的第一和第二标签，所述第一和第二标签与任意其它对标签上所见的任何第一或第二标签不同。
34.如权利要求23-33中任一项所述的方法，其中所述报告探针在其5'端的3个核苷酸之一处标记，优选在5'末端。
35.如权利要求23-34中任一项所述的方法，其中在步骤(e)中，所述双链多核苷酸经过解离，其中在所述解离期间所述第一或第二标签的信号(优选荧光)的变化指示所述待测多核苷酸中所述目标序列的存在，其中优选地，所述解离通过加热实现，并且所述双链多核苷酸经过熔解曲线分析。
36.一种诊断肠易激综合征的方法，包括根据权利要求23-35中任一项所述的方法，其中优选在所述方法中检测至少两个SNP。
37.一种生物体基因分型方法，其包含权利要求23-35中任一项所述的方法，其中优选在所述方法中检测至少两个SNP。
38.一种试剂盒，包括：
(a)至少一种用第一标签标记的ddNTP，其中优选地所述标签如权利要求5、6、25、30或33中任一项所定义，
(b)至少一种第一多核苷酸(或标记探针)，其中优选所述第一多核苷酸(或标记探针)如权利要求23、25、31或32中任一项所定义，
(c)标记有第二标签的至少一种第二多核苷酸(或报告探针)，其中优选地所述第二多核苷酸(或报告探针)如权利要求7、8、23、25、31、32、33或34中任一项所定义，
(d)聚合酶；和
(e)至少以下之一：
(i)灭活所述聚合酶的方法(优选去垢剂，优选SDS)，
(ii)降解所述聚合酶的方法(优选蛋白酶，优选蛋白酶K或去垢剂，优选SDS)，(iii)去除所述聚合酶的方法，
(iv)使所述ddNTP脱磷酸化的方法(优选磷酸酶)，
(v)去除所述ddNTP的方法，和
(vi)用于竞争胜过标记的ddNTP的未标记的ddNTP；
其中当标签彼此靠近时，所述第一或第二标签影响由另一标签产生的信号。
39.一种评估聚合酶对具有任选单链区域的双链多核苷酸的熔解温度(Tm)和/或FRET(优选猝灭)的影响的方法，其中优选地所述方法是熔解曲线分析方法，
其中所述方法在两个样品上进行，并且对于每个样品，所述方法包括使所述聚合酶、任选的ddNTP和/或dNTP以及由彼此杂交形成第三多核苷酸的第一和第二多核苷酸接触，所述第三多核苷酸为所述双链多核苷酸，其中当FRET效应被评估时，所述第一多核苷酸携带荧光标签，
其中仅在一个所述样品上进行的所述方法进一步包括：在评估Tm和/或FRET效应之前灭活、降解或除去所述聚合酶，和/或当FRET效应被评估并且在所述方法中使用dNTP和/或ddNTP时，去磷酸化或除去所述dNTP和/或ddNTP和/或用另一种dNTP和/或ddNTP竞争胜过所述dNTP和/或ddNTP，
对所述两个样品进行熔解温度分析和/或FRET分析
评估所述两个样品之间的所述熔解温度和/或FRET效应是否不同，以确定所述聚合酶对所述双链多核苷酸的熔解温度和/或FRET的影响，
其中优选地所述双链多核苷酸如权利要求1或2所定义，和/或优选地所述方法包括如权利要求12所定义的附加步骤，优选如权利要求13所定义，和/或优选地，所述灭活、降解或除去所述聚合酶或所述去磷酸化或除去所述dNTP和/或ddNTP如权利要求14至17中任一项所述进行。
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