ES2865436T3 - Método y producto para evitar los falsos positivos en métodos que utilizan ddNTP - Google Patents

Abstract

Método para evitar falsos positivos en un método de detección de secuencias en el que un ddNTP portador de un primer marcaje ha sido incorporado en una reacción de extensión de cadena por una polimerasa, en el que dicho método de detección de secuencias comprende la etapa de poner en contacto un ddNTP que porta un primer marcaje, una polimerasa y un primer y un segundo polinucleótido, en el que el primer polinucleótido puede haber sido o no marcado en la reacción de extensión de cadena y el primer y el segundo polinucleótido se hibridan entre sí para formar un tercer polinucleótido que es un polinucleótido de doble cadena con una región de cadena sencilla opcional, en el que dicha región de cadena sencilla es de hasta 10 nucleótidos de longitud y en el caso de que dicha región de cadena sencilla proporcione una secuencia 5' protuberante, no contiene una base complementaria a dicho ddNTP inmediatamente contigua a la región de doble cadena y dicho tercer polinucleótido porta un segundo marcaje, en el que dicho método evita la unión de dicho ddNTP a dicho tercer polinucleótido en presencia de una polimerasa mediante un método que comprende inactivar, degradar o eliminar dicha polimerasa en un periodo posterior a dicha reacción de extensión de cadena y antes o durante la generación de dicho tercer polinucleótido y en el que dicho método comprende el análisis de la curva de fusión de dicho tercer polinucleótido para determinar si el primer polinucleótido se encuentra marcado.

Description

DESCRIPCIÓN

Método y producto para evitar los falsos positivos en métodos que utilizan DDNTP

La presente exposición se refiere a un método que impide la unión no deseable de los ddNTP a polinucleótidos de doble cadena en presencia de una polimerasa. Dichos métodos pueden utilizarse para evitar la aparición de falsos positivos en métodos que utilizan los ddNTP, p.ej., en métodos de detección de secuencias. La presente invención proporciona además un método para evitar una falsa lectura de Tf o falsos efectos de FRET (tales como una inhibición falsa positiva), por ejemplo en un método de análisis de curva de fusión. En particular, se proporciona un método en el que una secuencia diana de nucleótidos en un polinucleótido diana se detecta utilizando un método en el que se genera una molécula de doble cadena que puede comprender o no dos marcajes, dependiendo de si se encuentra presente la secuencia diana en la que se determina la presencia de los dos marcajes, preferentemente mediante la realización de un análisis de curva de fusión.

La secuenciación de polinucleótidos y la identificación de secuencias polinucleótidas específicas dentro de una muestra diana se ha llevado a cabo mediante diversos métodos durante muchos años y permite recoger información sobre esa muestra, que puede utilizarse de una diversidad de maneras, p.ej., con fines diagnósticos (p.ej., para la presencia de un contaminante y/o el tipo de muestra, la incidencia o propensión a una enfermedad, etc.).

En muchos casos, puede obtenerse información relevante mediante la detección de la variación dentro de una secuencia, p.ej., en una sola base. Dicha variación puede aparecer a partir de variación alélica o polimorfismo, una mutación puntual o cualquier deleción o inserción de material genético. La detección de polimorfismos de nucleótido único (PNU) resultan de particular interés. Estos PNU reflejan la variación natural en una población. Los PNU proporcionan marcadores que pueden utilizarse para estudiar la dinámica poblacional y la evolución, a fin de investigar la base genética de los fenotipos complejos y en ensayos forenses o diagnósticos. En particular, se ha encontrado que los PNU están asociados a enfermedades específicas y por lo tanto pueden utilizarse para identificar individuos con propensión a esa enfermedad y/o para adaptar tratamientos para ese individuo basándose en su genotipo.

Varios métodos de secuenciación, incluyendo la detección de PNU, implican la utilización de los dideoxi-NTP. La secuenciación del ADN tradicionalmente se ha llevado a cabo mediante el método dideoxi de Sanger (Sanger, Nicklen and Coulson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463-7,1977) que ha sido utilizado desde los 1980. Es un método multimolecular basado en la filtración electroforética de ADN, que puede clonarse, que en primer lugar se trata enzimáticamente. El procedimiento enzimático produce ADN de cadena sencilla mediante polimerización interrumpida utilizando una mezcla de dideoxi NTP marcados con fluoróforo que terminan la extensión de la cadena y dNTP que no la terminan. Por lo tanto, se obtiene una mezcla de longitudes de cadena utilizando dicho procedimiento, en el que la longitud de cada cadena de ADN representa la posición de base y el color del fluoróforo conectado representa la identidad de la base en el extremo 3'. Dichas identidades se leen como puntos coloreados alineados, en donde una línea de puntos representa una secuencia de ADN.

Entre otros métodos de secuenciación que pueden incluir la utilización de ddNTP se incluyen la secuenciación mediante ligación y corte escalonados, en la que pueden utilizarse ddNTP junto con sondas que se enlazan a la secuencia diana.

Existen diversos métodos utilizados comúnmente de detección de PNU. La hibridación de un oligonucleótido específico para un PNU particular puede utilizarse, y detectarse la unión, p.ej. mediante la utilización del oligonucleótido como un cebador (es decir, la amplificación en PCR es evidencia de la existencia de la secuencia del PNU). El oligonucleótido puede unirse al PNU (de manera que necesitan utilizarse diferentes oligonucleótidos para el ajuste a diferentes secuencias) o puede unirse cadena arriba del PNU (en donde sólo se extienden secuencias relevantes por el oligonucleótido que actúa de cebador). Pueden utilizarse métodos que implican la ligación específica de alelo (en el caso de que dos sondas unidas sean capaces de ligan únicamente cuando están unidas a una secuencia relevante) o el corte enzimático específico de alelo.

Resulta del máximo interés en el presente caso la detección de PNU utilizando la extensión de cebadores de una sola base específicos de alelo en los que se produce la discriminación al nivel de la incorporación de nucleótidos (durante la extensión) y no al nivel de la unión del oligonucleótido (cebador). En este caso, los cebadores se hibridan con un nucleótido cadena arriba del sitio polimórfico, de manera que el primer nucleótido que debe incorporarse en la cadena naciente se encuentra frente al sitio polimórfico. Pueden utilizarse diversos marcajes y plataformas diferentes para la detección. En una opción, puede utilizarse un método de detección en el que la extensión del cebador con un ddNTP específico para el PNU de interés puede utilizarse para generar una sonda marcada (en el caso de que se encuentre presente el PNU) y esta sonda marcada seguidamente es capturada mediante unión a una secuencia complementaria y la cantidad de marcaje que se encuentra unida a la secuencia complementaria es indicativa de la presencia (y cantidad) del PNU de interés (documento n° WO99/50448). Se proporcionan métodos de secuenciación adicionales en los documentos n° US2014/272978 A1, n° WO0055372 A1 y n° WO2006107881 A2.

La extensión de cebadores de nucleótido único utilizando ddNTP también se ha utilizado en el documento n° US2002187477, en el que la reacción de extensión se detecta basándose en el ddNTP marcado que se incorpora o la longitud de la molécula extendida (también pueden utilizarse dNTP en el método). El documento n° US2009305249 también utiliza la extensión de cebadores de nucleótido único y detecta moléculas marcadas basándose en el mareaje y tamaño del producto. El documento n° WO2012/049279 también comenta la utilización de la extensión de cebadores de nucleótido único para generar productos que pueden distinguirse basándose en su tamaño y composición de bases en IP/RP-HPLC.

En los métodos anteriores, al utilizar ddNTP, se utiliza para unirse a una base complementaria y terminar cualquier reacción de extensión. La presencia de esta molécula puede utilizarse para identificar la presencia o la cantidad de la base complementaria (en el contexto de la secuencia relevante) en el polinucleótido de ensayo de muestra.

Sin embargo, ahora se ha encontrado que, bajo determinadas condiciones, tal como se indica posteriormente en la presente memoria, y no sólo durante las reacciones de extensión de cebador normales, los ddNTP pueden asociarse o unirse a un polinucleótido de doble cadena. Lo anterior puede conducir a falsos positivos en los métodos de secuenciación/detección de PNU. Sin embargo, ahora se ha encontrado que dicha unión puede evitarse de varias maneras, tal como se indica posteriormente en la presente memoria. De esta manera, el método de la invención sirve para evitar la unión errónea de un ddNTP (o la asociación a) un polinucleótido de doble cadena, lo que permite evitar los falsos positivos en métodos de detección de secuencias. Además, se ha encontrado que la polimerasa también estabiliza los dúplex polinucleótidos, afectando a sus temperaturas de fusión y puede causar falsos efectos FRET, tales como la inhibición falsamente positiva de marcajes fluorescentes. Los métodos de la invención permiten evitar estos efectos, particularmente en métodos de análisis de curvas de fusión.

En particular, las ventajas de los métodos de la invención pueden utilizarse en un método de identificación de una secuencia diana de nucleótidos en un polinucleótido de ensayo en el que se lleva a cabo la extensión de cebadores específicos de una sola base con una sonda de marcaje y un ddNTP relevante marcado con un primer marcaje y la sonda de marcaje resultante (que puede marcarse o no dependiendo de la presencia de la base complementaria correspondiente en la secuencia del polinucleótido de ensayo) se une a una sonda informadora que porta un segundo marcaje que afecta a la señal generada por el primer marcaje (o viceversa). Los complejos generados de esta manera se someten a análisis de curvas de fusión. Durante el procedimiento de desnaturalización (o disociación) y/o hibridación de los complejos, se separan los dos marcajes uno de otro de manera que el efecto de un marcaje sobre la señal del otro resulta alterada. Lo anterior permite la identificación de la existencia de un marcaje en la sonda de marcaje (y, por lo tanto, la presencia del p Nu diana) mediante monitorización del cambio de la señal durante el procedimiento de desnaturalización/hibridación. Dicho procedimiento puede someterse fácilmente a multiplexado mediante la utilización de diferentes marcajes y sondas que generan complejos con diferentes temperaturas de fusión, tal como se indica en mayor detalle posteriormente en la presente memoria.

Aunque sin respaldo teórico, se cree que la unión del ddNTP a un polinucleótido de doble cadena se produce por diversos mecanismos, dependiendo de la naturaleza del polinucleótido de doble cadena. Los diversos mecanismos pueden resumirse de la manera siguiente:

a) unión no covalente del ddNTP al polinucleótido de doble cadena con la polimerasa actuando como un mediador o adaptador para la unión (p.ej., acomplejando las moléculas en el método),

b) unión covalente del ddNTP al polinucleótido de doble cadena en virtud de actividad de transferasa terminal de la polimerasa,

c) unión covalente del ddNTP al polinucleótido de doble cadena en virtud de la incorporación promiscua de ddNTP no complementarios por la polimerasa.

La unión covalente también puede producirse mediante incorporación del ddNTP en el polinucleótido de doble cadena mediante actividad de polimerasa normal en el caso de que el polinucleótido de doble cadena proporcione un extremo 3' cohesivo y una base contigua complementaria al ddNTP. Lo anterior puede evitarse generalmente mediante selección apropiada de la secuencia y/o longitud de las secuencias componentes del polinucleótido de doble cadena. Sin embargo, el método descrito en la presente memoria también sirve para evitar dicha unión.

También se ha encontrado que la presencia de la polimerasa afecta (eleva) la temperatura de fusión del polinucleótido de doble cadena, conduciendo de esta manera a una Tf falsa. También se ha encontrado que la polimerasa genera falsos efectos FRET, tales como una inhibición falsamente positiva, que puede afectar a los resultados, aunque no haya ddNTP presentes. Los métodos tal como se describen en la presente memoria en los que se elimina la polimerasa también sirven para tratar dicha causa de resultados inexactos.

Dicha unión no ha sido observada anteriormente. Sin respaldo teórico, la posibilidad de que se produzca dicho tipo de unión está dictada por lo menos parcialmente por el tipo de molécula de doble cadena. La unión no covalente de a) puede producirse en moléculas con extremos romos y extremos 3' o 5' protuberantes. La unión covalente de b) se produce en moléculas con extremos romos, aunque aparentemente es sensible a la secuencia; aparentemente no se produce en moléculas con extremo 3' o 5' protuberantes. La unión covalente de c) se produce en moléculas con un extremo 5' protuberante. Se cree que la unión covalente se produce mediante incorporación de la base en una reacción de extensión de cadena en virtud de la actividad enzimática de la polimerasa que extiende el polinucleótido en la dirección 5' a 3'. Los efectos dependientes de la polimerasa sobre la Tf y la generación de falsos efectos FRET ocurren en todos los tipos de molécula de doble cadena.

La unión de ddNTP puede evitarse por diversos medios. La unión no covalente de a) puede eliminarse mediante la eliminación efectiva de la polimerasa, la desfosforilación o eliminación del ddNTP y/o la expulsión por competencia del ddNTP por otros ddNTP (p.ej., ddNTP no marcados). Pueden utilizarse mecanismos similares para evitar la unión covalente en b) y c). La unión no covalente y/o covalente no deseable también puede reducirse o eliminarse mediante alteración de la longitud de la región de cadena sencilla del polinucleótido de doble cadena para proporcionar una molécula que resulte menos susceptible a la unión anteriormente indicada (p.ej., al proporcionar una región de cadena sencilla, p.ej., una región 3' protuberante o alargar la región de cadena sencilla). Las regiones de cadena sencilla más largas son menos susceptibles a la unión no deseable indicada anteriormente y/o pueden utilizarse para reducir la influencia del ddNTP (p.ej., en el caso de que se encuentre marcado e interactúe con el marcaje en otros sitios en la molécula de doble cadena, su influencia puede reducirse mediante el incremento de su distancia respecto del otro marcaje).

De esta manera, en un primer aspecto, la presente exposición proporciona un método de prevención de la unión de un ddNTP a un polinucleótido en la presencia de una polimerasa, en el que dicho polinucleótido es de doble cadena, aunque opcionalmente puede contener una región de cadena sencilla que es de hasta 10 nucleótidos de longitud, en el que, en el caso de que dicha región de cadena sencilla proporcione una secuencia 5' protuberante, no contiene una base complementaria a dicho ddNTP inmediatamente contigua a la región de doble cadena (preferentemente no contiene una base complementaria a dicho ddNTP en ningún sitio en dicha región de cadena sencilla), en el que dicho método (i) comprende inactivar, degradar o eliminar dicha polimerasa, desfosforilando o eliminando dicho ddNTP y/o expulsando por competencia dicho ddNTP con otro ddNTP y/o (ii) utiliza un polinucleótido con una región de cadena sencilla que proporciona una secuencia 3' protuberante que es de por lo menos 1 (preferentemente por lo menos 2 o 3) nucleótidos de longitud, o una secuencia 5' protuberante que es de por lo menos 2 (preferentemente por lo menos 3 o 4) nucleótidos de longitud y/o utiliza un polinucleótido con una región de cadena sencilla en uno o o ambos extremos del polinucleótido que es de por lo menos un nucleótido de longitud y dicha región de cadena sencilla resulta, por lo menos en parte, de una no correspondencia entre uno o más pares de bases en dicho polinucleótido. La región de cadena sencilla que resulta, por lo menos en parte, de una no correspondencia puede proporcionar una secuencia 3' o 5' protuberante o ambas, en uno o ambos extremos, p.ej., una no correspondencia en un extremo puede conducir a una secuencia tanto 3' como 5' protuberante en ese extremo.

En un aspecto, el ddNTP porta un marcaje. En un aspecto particularmente preferente, el ddNTP porta un primer marcaje y dicho polinucleótido porta un segundo marcaje, y el primer o segundo marcaje afecta a la señal generada por el otro marcaje en el caso de que los marcajes se encuentren próximos entre sí. Preferentemente, el primer o segundo marcaje es un fluoróforo y el otro marcaje es una molécula que afecta a la fluorescencia de dicho fluoróforo en el caso de que se encuentre en proximidad a dicho fluoróforo.

En un aspecto preferente adicional, el método comprende además la etapa de generar el polinucleótido de doble cadena mediante la puesta en contacto de un primer y un segundo polinucleótido (que son suficientemente complementarios para permitir la unión) bajo condiciones que permiten su hibridación.

Tal como se utiliza en la presente memoria, las referencias a entidades en el singular incluyen las referencias a las entidades en plural, y viceversa. La referencia a una lista de alternativas que están conjugadas con el término "y/o" indica que puede utilizarse o se encuentra presente cualquiera, la totalidad o cualquier combinación de dichas alternativas.

Tal como se utiliza en la presente memoria, la referencia a "evitar" la unión del ddNTP al polinucleótido en presencia de la polimerasa se refiere a la prevención absoluta o parcial, es decir, a evitar cualquier unión o algo de unión del ddNTP al polinucleótido que no sea en virtud de una reacción de extensión normal mediada por polimerasa a partir de un extremo 3' libre. Una reacción de extensión normal se produce cuando una polimerasa sintetiza una nueva cadena de ADN complementaria a la cadena molde de ADN mediante la adición de dNTP o ddNTP que son complementarios al molde en dirección 5' a 3' mediante incorporación de bases consecutivas que son complementarias a las bases en la secuencia molde.

La "unión" del ddNTP comprende la unión tanto covalente como no covalente y puede ser la unión directa entre el polinucleótido y el ddNTP, o mediante la intermediación de una molécula adicional, tal como el ddNTP que está asociado al polinucleótido.

Un "ddNTP" es un 2',3'-dideoxinucleótido que es un inhibidor de alargamiento de cadena de la ADN polimerasa. Los ddNTP no presentan un grupo 3' hidroxilo, de manera que una vez añadidos a una cadena de nucleótidos en crecimiento por una ADN polimerasa, no pueden añadirse nucleótidos adicionales, ya que no puede crearse un enlace fosfodiéster. El ddNTP puede ser una de cinco opciones: ddGTP, ddATP, ddTTP (o ddUTP) y ddCTP, proporcionando, respectivamente, nucleótidos terminadores de cadena correspondientes a las bases guanina, adenina, timina (o uracilo) y citosina. También pueden utilizarse variantes, derivados o análogos de ddNTP funcionalmente equivalentes, p.ej., análogos no nucleótido biológicamente activos (p.ej., terminadores aciclo (aciNTP; Perkin Elmer Life Sciences).

Las variantes, análogos o derivados funcionalmente equivalentes presentan la misma funcionalidad o una funcionalidad similar a los ddNTP, en la medida en que pueden ser incorporados por una ADN polimerasa en una cadena de nucleótidos (ADN) en crecimiento durante la extensión de cadena, aunque una vez incorporados evitan la extensión adicional de la cadena. Preferentemente, la variante, derivado o análogo funcionalmente equivalente presenta una o más partes de su estructura en común con un ddNTP, p.ej., comprende un grupo trifosfato y/o la base del ddNTP. La polimerasa tal como se indica en la presente memoria puede utilizarse con la variante, derivado o análogo de ddNTP, o alternativamente, puede utilizarse una polimerasa específica para esa variante/análogo/derivado, p.ej., AcicloPol, Perkin Elmer Life Sciences. La referencia a "ddNTP" en la presente memoria incluye dichas variantes, análogos y derivados de ddNTP. Preferentemente, el ddNTP se marca tal como se comenta posteriormente en la presente memoria. La referencia a un "dNTP" tal como se utiliza en la presente memoria, se define de manera similar, aunque en relación a un desoxinucleótido (trifosfato) y no un dideoxinucleótido, y de manera similar incluye variantes, análogos y derivados tal como se ha indicado anteriormente.

El término "base" o "nucleótido" tal como se utiliza (intercambiablemente) en la presente memoria incluye los nucleótidos naturales de adenina, guanina, citosina, timina y uracilo, particularmente en la forma 2'-desoxi, o nucleótidos no naturales que funcionan de la misma manera, es decir, forman un par de bases complementario a un nucleótido natural.

La referencia a una "base complementaria" se refiere a una base que establece enlace específicamente con su base de pareja según apareamiento de Watson-Crick. Las bases de pareja son la adenina y la timina (o uracilo), y la citosina y la guanina. Las secuencias complementarias son secuencias que contienen una serie de bases complementarias que permiten la hibridación de las secuencias mediante apareamiento de bases entre las bases complementarias.

El "polinucleótido" indicado en la presente memoria es una secuencia de ADN que contiene múltiples nucleótidos y comprende oligonucleótidos y polinucleótidos. La secuencia es de doble cadena, comprendiendo una primera cadena y una segunda cadena complementaria que puede unirse a la primera mediante la unión entre bases complementarias. Preferentemente, dicho polinucleótido de doble cadena (en su forma final) no se genera mediante extensión de un cebador para formar esa molécula (es decir, no es una molécula de doble cadena que resulta directamente de la unión de un cebador a un polinucleótido y la extensión del cebador para formar una molécula de doble cadena). De esta manera, aunque la primera y segunda cadenas pueden generarse ellas mismas mediante reacciones de extensión de cebador, preferentemente no se generan juntas para formar esa molécula de doble cadena, en la que parte de la primera o segunda cadena ha actuado como un cebador. En el caso de que dicha extensión de cebador no se produzca para formar el polinucleótido de doble cadena, dicha extensión de cebador es preferentemente de menos de 6 nucleótidos de longitud, p.ej., de 1, 2, 3, 4 o 5 nucleótidos de longitud. La secuencia polinucleótida de doble cadena está constituida de dos secuencias, cada una de las cuales puede presentar cualquier longitud, aunque preferentemente cada una comprende por lo menos 5 nucleótidos y preferentemente 5 a 200 nucleótidos, p.ej., de 10 a 100 nucleótidos, p.ej., de 20 a 50 nucleótidos de longitud. En una alternativa, la primera y segunda cadenas que proporcionan las dos secuencias pueden unirse entre sí, p.ej., pueden proporcionarse en un único polinucleótido que muestra unión a sí mismo. Sin embargo, en un aspecto preferente, la primera y segunda cadenas con las dos secuencias son moléculas separadas.

Para poder formar una molécula de doble cadena, las dos secuencias pueden unirse entre sí mediante la complementariedad de las bases dentro de sus secuencias. El número de bases implicado en la unión complementaria debe resultar suficiente para permitir la producción de un complejo estable. En el caso de que se genere una molécula de doble cadena de extremos romos, ello puede implicar todas las bases, aunque, tal como se comenta adicionalmente después, ni siquiera en este caso puede tolerarse la no complementariedad (no correspondencia) de algunas bases. En el caso de que se genere una molécula de doble cadena con un extremo protuberante, las bases implicadas en la unión complementaria (la región hibridante o de doble cadena) puede comprender la totalidad o una parte de la secuencia más corta que constituye el complejo y una parte de la secuencia más larga que constituye el complejo. En una característica preferente, por lo menos 5 bases consecutivas, preferentemente 5 a 200 bases consecutivas, p.ej., de 10 a 100 bases consecutivas, p.ej., de 20 a 50 bases consecutivas de las secuencias que constituyen el oligonucleótido de doble cadena son complementarias entre sí (lo que puede formar 50% a 100%, p.ej., 80% a 100%, de la longitud total de las secuencias). (bases "consecutivas" comprende la posibilidad de una base no apareada ocasional, p.ej. una o dos bases intercaladas).

En una característica preferente, las regiones de las secuencias que participan en la unión de las secuencias entre sí formando el polinucleótido de doble cadena presentan una complementariedad de 100% entre sí. Sin embargo, lo anterior no resulta necesario y un apareamiento de bases perfecto no resulta necesario. De esta manera, los no apareamientos dentro de dicha región pueden tolerarse, proporcionando las dos moléculas con suficiente complementariedad para permitir la formación de un complejo que es suficientemente estable para realizar los análisis rutinarios de temperatura de fusión. De esta manera, por ejemplo, las regiones de las secuencias que se unen entre sí pueden compartir una complementariedad de sólo 80%, 90% o 95% (p.ej., pueden presentar uno, dos, tres o más desapareamientos). Tal como se comenta en la presente memoria, las bases no apareadas pueden utilizarse para proporcionar la región de cadena sencilla del polinucleótido de doble cadena, en total o en parte, p.ej. pueden proporcionar una o más bases a dicha región de cadena sencilla.

El polinucleótido de doble cadena puede contener una "región de cadena sencilla". Dicha región existe en el caso de que las longitudes totales de las secuencias que constituyen el polinucleótido de doble cadena no participen en la unión a bases complementarias. En particular, pueden encontrarse presentes regiones de cadena sencilla en los extremos terminales del polinucleótido de doble cadena para producir una región de cadena sencilla 3' protuberante o 5' protuberante. Se encuentra presente una secuencia 5' (o 3') protuberante en el caso de que la región de cadena sencilla que se encuentra presente termina en el extremo 5' (o 3') de una de las secuencias que constituyen la molécula de doble cadena. Puede existir una parte de cadena sencilla, o puede extenderse, mediante un par de bases no correspondiente cuyas bases no se unen entre sí y por lo tanto contribuyen directamente a la región de cadena sencilla o afectan a la unión entre un par de bases correspondiente (complementario), de manera que ya no se unen, contribuyendo de esta manera a la región de cadena sencilla.

La región de cadena sencilla, en caso de encontrarse presente y que forma una secuencia 5' protuberante, no contiene una base complementaria al ddNTP utilizado en el método inmediatamente contiguo a la región de doble cadena. Preferentemente, la región de cadena sencilla no contiene una base complementaria a cualquier dNTP, que podría utilizarse en el método, inmediatamente contigua a la región de doble cadena. De esta manera, por ejemplo, en el caso de que el ddNTP utilizado sea ddGTP, la región de cadena sencilla que forma una secuencia 5' protuberante no contiene la base complementaria a guanina, es decir, no contiene citosina, inmediatamente contigua a la región de doble cadena. En algunos métodos, pueden utilizarse múltiples ddNTP y en cuyo caso ninguna base complementaria a ninguno de los ddNTP que se utilizan (o en el caso de que los ddNTP estén marcados, ninguna base complementaria a ninguno de los ddNTP marcados que se utilizan) se encuentra presente en la región de cadena sencilla que forma una secuencia 5' protuberante inmediatamente contigua a la región de doble cadena. La expresión "inmediatamente contiguo" a la región de doble cadena se refiere a la primera base de la región de cadena sencilla que se encuentra situada en el lado 5' de la región de doble cadena. Lo anterior puede ser una base con la que no hay ninguna base que pueda formar un par de bases, o en el caso de bases no correspondientes, una base con la que sí hay bases que podrían formar un par de bases, pero que no se encuentra unida. Preferentemente, en el caso de que la región de cadena sencilla proporcione una secuencia 5' protuberante, no contiene una base complementaria a dicho ddNTP (o dNTP) en ningún sitio en dicha región de cadena sencilla.

La región de cadena sencilla puede ser de tan sólo 1 nucleótido de longitud o de hasta 5, 10, 20 o 30 nucleótidos de longitud. En los métodos de bloqueo de la unión de un ddNTP a un polinucleótido en presencia de una polimerasa, dicha región de cadena sencilla presenta hasta 10 nucleótidos. Dichos métodos, aunque en los que se utilizan regiones de cadena sencilla más largas, sin embargo, también se encuentran comprendidos. Puede encontrarse presente una región de cadena sencilla más larga en otros métodos de la invención. Preferentemente, en el caso de que el método de la invención comprende la etapa de inactivar, degradar o eliminar la polimerasa y/o desfosforilar o eliminar el ddNTP y/o expulsar por competición el ddNTP, la región de cadena sencilla es de 1 a 5 nucleótidos de longitud, preferentemente de 1, 2 o 3 nucleótidos de longitud.

En la presente memoria se hace referencia a la "presencia" de una polimerasa. Una polimerasa que se encuentra presente es una polimerasa funcionalmente activa que se encuentra en contacto directo tanto con el ddNTP como el polinucleótido de doble cadena. Preferentemente, la polimerasa se proporciona bajo condiciones y a una concentración suficiente para permitir la extensión del cebador en el caso de que se encuentren presentes dNTP y/o ddNTP complementarios relevantes.

Tal como se indica en la presente memoria, la "polimerasa" es una ADN polimerasa que es capaz de extensión del cebador de un polinucleótido de doble cadena en la dirección 5' a 3'. Preferentemente, la polimerasa es termoestable para la utilización en métodos de la invención, particularmente los que utilizan etapas de ciclado de la temperatura. Preferentemente, la polimerasa es de cualquiera de las familias A, B, C, D, X o Y y preferentemente presenta la clasificación EC2.7.7.7 o 2.7.7.49.

Entre los ejemplos de polimerasas en la familia A se incluyen la ADN polimerasa de T7, Pol I y la ADN polimerasa y. Entre las polimerasas de la familia B se incluyen Pol II, Pol B, Pol Z, Pol a, 8, y £, mientras que entre las polimerasas de la familia C se incluyen Pol III. Las polimerasas de la familia D se encuentran en arqueobacterias. Entre las polimerasas de la familia X se incluyen Pol p, Pol a, Pol A y Pol p y finalmente entre las polimerasas de la familia Y se Pol i (iota), Pol k (kappa), Pol IV y Pol V. La polimerasa puede ser de origen procariótico, eucariótico o arqueobacteriano. Preferentemente, la polimerasa es una polimerasa de familia A o una polimerasa Pol III o polimerasa pol p o una polimerasa arqueobacteriana, o variantes mutantes de las mismas que conservan las mismas propiedades funcionales, o sustancialmente similares, a las de las moléculas parentales en términos de su capacidad de facilitar la misma función enzimática.

En particular, las polimerasas de la familia A, particularmente las polimerasas Pol I, tales como la ADN polimerasa de T7 y la polimerasa Taq (tal como ThermoSequenase™, que no presenta actividad de exonucleasa) resultan preferentes. En una realización particularmente preferente, se utiliza una ADN polimerasa de tipo ThermoSequenase, tal como la ADN polimerasa TERMIPol® or HOT TERMIPol® (Solis BioDyne). Las polimerasas eubacterianas resultan particularmente preferentes. También resultan preferentes las polimerasas que incorporan eficazmente ddNTP.

La polimerasa puede inactivarse, degradarse o eliminarse en métodos de la invención. La elección de método puede depender de la naturaleza del polinucleótido de doble cadena con el que debe bloquearse la unión de ddNTP. Tal como se ha comentado anteriormente, aunque sin respaldo teórico, la unión no covalente del ddNTP al polinucleótido de doble cadena se cree ocurre con la polimerasa actuando como un mediador o adaptador, mientras que se cree que la unión covalente se produce mediante la actividad enzimática de la polimerasa. De esta manera, a fin de evitar la unión covalente de esta última, necesita reducirse o eliminarse únicamente la actividad enzimática de la polimerasa, mientras que, para evitar la unión no covalente, preferentemente la polimerasa se degrada o se elimina. En métodos de evitación de una falsa lectura de Tf o falsos efectos FRET (p.ej., una inhibición falsamente positiva) en métodos tales como el método de análisis de curva de fusión tal como se describe posteriormente en la presente memoria, preferentemente se degrada o se elimina la polimerasa. Sin embargo, la inactivación de la polimerasa también se encuentra contemplada.

Tal como se indica en la presente memoria, "inactivación" de la polimerasa se refiere a la eliminación de una o más de las funciones de la polimerasa, p.ej., las propiedades enzimáticas, de unión o estructurales, p.ej., su actividad de polimerasa y/o transferasa terminal y/o las propiedades de unión a ADN. El efecto de la inactivación sobre la función del enzima puede someterse a ensayo llevando a cabo los métodos descritos en los Ejemplos, que ilustran los efectos de la unión covalente de la polimerasa. Convenientemente, puede conseguirse la inactivación mediante la utilización de inhibidores apropiados, tales como Catalpol o sus análogos, o la destrucción de la estructura terciaria relevante del enzima, p.ej., utilizando agentes de desnaturalización. En un aspecto preferente, puede utilizarse un detergente para inactivar la polimerasa, p.ej., un detergente aniónico que solubiliza proteínas. En un aspecto particularmente preferente, puede utilizarse dodecilsulfato sódico (SDS, por sus siglas en inglés). Convenientemente, puede utilizarse una concentración de 0,05% a 1,0%, preferentemente de entre 0,1% y 0,25%.

Alternativamente, la polimerasa puede "degradarse". Lo anterior puede conseguirse por medios químicos o enzimáticos apropiados. En un aspecto preferente, la polimerasa se degrada mediante la utilización de una proteinasa. En un aspecto particularmente preferente, la proteinasa es proteinasa K (EC 3.4.21.64, p.ej., de Sigma-Aldrich or Promega, Uniprot P06873) que es una robusta serina proteasa de amplio espectro. También pueden utilizarse detergentes para degradar (así como inactivar) la polimerasa.

Tal como se utiliza en la presente memoria, "eliminar" la polimerasa se refiere a separar espacialmente la polimerasa respecto de los ddNTP y/o el polinucleótido de doble cadena. Lo anterior puede conseguirse mediante la recolección de los ddNTP y/o el polinucleótido de doble cadena, o alternativamente, mediante recolección de la polimerasa. De esta manera, por ejemplo, la mezcla puede someterse a técnicas de purificación que permiten la separación de los diferentes componentes (p.ej., la cromatografía de columna o la separación por afinidad). A título de ejemplo, pueden utilizarse anticuerpos de la polimerasa, que pueden unirse a un soporte sólido (p.ej., perlas magnéticas), para unirse a la polimerasa y permitir su separación respecto del resto de la mezcla. Alternativamente, pueden utilizarse métodos químicos de eliminación, p.ej., la extracción en un solvente orgánico, tal como cloroformo.

Para eliminar eficazmente la polimerasa, tal como se ha indicado anteriormente, el polinucleótido de doble cadena puede recogerse (también eliminando eficazmente los ddNTP o separando las moléculas). En un método preferente, lo anterior se consigue mediante unión por afinidad, p.ej., mediante la utilización de parejas de unión (tal como se indica y describe posteriormente en la presente memoria), una de las cuales se une al polinucleótido de doble cadena, que juntos forman una pareja de unión. En una realización preferente, la pareja de unión puede ser biotina:estreptavidina. Por ejemplo, el polinucleótido de doble cadena puede portar una biotina (p.ej., en el extremo 5' de una de las cadenas del polinucleótido de doble cadena) y puede recogerse mediante unión por afinidad a estreptavidina que puede portarse sobre un soporte sólido, tal como perlas magnéticas. La etapa de eliminación de la polimerasa (o ddNTP) puede comprender, de esta manera, separar dicha cadena, o ambas cadenas, del polinucleótido de doble cadena respecto de la polimerasa o ddNTP mediante unión por afinidad, tal como se ha indicado anteriormente. En los métodos indicados posteriormente en la presente memoria en los que el polinucleótido de doble cadena está constituido de una sonda de marcaje y una sonda informadora, la sonda de marcaje o la sonda informadora (preferentemente la primera) puede portar la pareja de unión comentada anteriormente. En este caso, la eliminación de dicha polimerasa o ddNTP comprende separar dicha sonda de marcaje y/o sonda informadora respecto de dicha polimerasa o ddNTP mediante unión por afinidad.

En un método alternativo, los ddNTP pueden desfosforilarse. Dicho método preferentemente se utiliza en el caso de que resulten probables las uniones covalentes inapropiadas. Las fosfatasas adecuadas son de la clasificación EC 3.1.31 y entre ellas se incluyen la fosfatasa alcalina de camarón (SAP) (p.ej., disponible de Sigma-Aldrich o Affymetrix, Uniprot Q9BHT8) y la fosfatasa intestinal bovina (CIP) (p.ej., disponible de Promega o Affymetrix, Uniprot P19111) y FastAP (disponible de Thermo Scientific).

La unión de ddNTP puede evitarse mediante eliminación del ddNTP respecto del polinucleótido de doble cadena, p.ej., mediante separación física de las moléculas, o mediante competición con otros ddNTP. El ddNTP puede eliminarse por cualesquiera medios apropiados, p.ej., el polinucleótido de doble cadena puede eliminarse/separarse de los ddNTP mediante recolección del polinucleótido de doble cadena tal como se ha indicado anteriormente en la presente memoria.

La referencia a la "expulsión por competición" se refiere a proporcionar suficientes cantidades de los demás ddNTP para que la unión del ddNTP al polinucleótido de doble cadena se reduzca o se elimine. Los ddNTP para la utilización en la prevención o reducción de la unión son necesariamente diferentes del ddNTP cuya unión debe evitarse y pueden corresponder a una base diferente (p.ej., ddATP en lugar de ddGTP, preferentemente no marcado o portador de un marcaje diferente) o puede corresponder a la misma base o una base diferente pero no portar un marcaje (p.ej., un ddNTP marcado puede ser expulsado por competición por ddNTP no marcados).

Tal como se ha indicado anteriormente, la unión del ddNTP también puede evitarse mediante la utilización de un polinucleótido con una región de cadena sencilla que es de por lo menos 1 nucleótido de longitud (3' protuberante) o de por lo menos 2 nucleótidos de longitud (5' protuberante) y/o utilizando un polinucleótido con una región de cadena sencilla en uno o en ambos extremos del polinucleótido que presenta una longitud de por lo menos un nucleótido y dicha región de cadena sencilla resulta, por lo menos en parte, de una no correspondencia entre uno o más pares de bases en dicho polinucleótido. Dicho protocolo puede utilizarse como alternativa (o adicionalmente) al tratamiento de la polimerasa y/o ddNTP. En métodos en los que se utilicen estos últimos tratamientos, la región de cadena sencilla es preferentemente de 1 a 5 nucleótidos de longitud, preferentemente de 1,2 o 3 nucleótidos de longitud. Sin embargo, en el caso de que la longitud de la región de cadena sencilla deba utilizarse como único mecanismo para evitar la unión de ddNTP (o junto con los métodos anteriormente indicados), la región de cadena sencilla preferentemente presenta una longitud de por lo menos 2 nucleótidos, preferentemente de 2 a 20 (o 2 a 30), p.ej., de 3 a 15 o 4 a 10 nucleótidos de longitud (especialmente preferentemente de 2, 3 o 4 nucleótidos de longitud). Preferentemente, en métodos de bloqueo de la unión de un ddNTP a un polinucleótido en presencia de una polimerasa, dicha región de cadena sencilla presenta hasta 10 nucleótidos. Lo anterior garantiza que las regiones de cadena sencilla son menos susceptibles a la unión no deseable del ddNTP y/o reducen la influencia del ddNTP (p.ej., en el caso de que se encuentre marcado e interactúe con el marcaje en otros sitios en la molécula de doble cadena, su influencia puede reducirse mediante el incremento de su distancia respecto del otro marcaje).

Un mecanismo para introducir regiones de cadena sencilla, p.ej., en cualquiera de los extremos, o en ambos extremos, de un polinucleótido de doble cadena de otro modo de extremos romos, o para incrementar la longitud de una región de cadena sencilla existente, es introducir no correspondencias en el extremo de la región hibridante del polinucleótido de doble cadena. De esta manera, por ejemplo, en lugar de utilizar un polinucleótido de doble cadena de extremos romos, puede introducirse una o más no correspondencias en uno de los polinucleótidos que forma el polinucleótido de doble cadena. Tal como se utiliza en la presente memoria, una "no correspondencia" se refiere a una base que no muestra unión complementaria a la base con la que se encuentra apareada al formarse en el polinucleótido de doble cadena. Los "pares de bases" son pares de bases en diferentes polinucleótidos que se llevan a encontrarse próximos al hibridarse dichos polinucleótidos entre sí, y en caso de ser complementarios, que se unen.

Preferentemente, la no correspondencia o no correspondencias se encuentran en el extremo de la región de doble cadena, p.ej., en una o más bases en un extremo o en ambos extremos de la región de doble cadena. Sin embargo, también pueden utilizarse las no correspondencias que presentan el efecto de interrumpir la unión entre bases complementarias en uno de los extremos de la región de doble cadena. Preferentemente, por lo menos uno, aunque preferentemente 2 (p.ej., 1, 2, 3 o 4) o más bases se alteran para proporcionar bases no correspondientes. En particular, dichos métodos pueden utilizarse en métodos indicados posteriormente en la presente memoria en los que el polinucleótido de doble cadena comprende una sonda de marcaje y una sonda informadora. Una región de cadena sencilla generada mediante la utilización de no correspondencias conduce a una cadena "protuberante", incluso en el caso de que los polinucleótidos de cadena sencilla que constituyen el polinucleótido de doble cadena sean de la misma longitud, es decir, la falta de unión entre los pares de bases conduce a una cadena protuberante. La cadena protuberante es tanto 3' como 5', en vista de la falta de unión entre los pares de bases. En una característica preferente, la región de cadena sencilla se forma únicamente mediante la utilización de no correspondencias, aunque también se encuentra contemplada la utilización de no correspondencias para extender la región de cadena sencilla. Tal como se hace referencia en la presente memoria, una región de cadena sencilla que resulta "por lo menos en parte" de una no correspondencia define el grado de la contribución de la no correspondencia a la región de cadena sencilla. De esta manera, la no correspondencia o las no correspondencias pueden generar la región de cadena sencilla en su totalmente o ser responsable de sólo parte de esa región, p.ej., hasta 3, p.ej., 1, 2 o 3 nucleótidos de una región de cadena sencilla más larga.

Tal como se ha señalado anteriormente, el método puede comprender adicionalmente la etapa de generar el polinucleótido de doble cadena mediante la puesta en contacto de un primer y un segundo polinucleótido bajo condiciones que permitan su hibridación. El primer y segundo polinucleótidos presentan las definiciones indicadas posteriormente en la presente memoria. En este caso, la etapa de inactivar, degradar o eliminar dicha polimerasa, desfosforilando o eliminando dicho ddNTP, expulsando por competición dicho ddNTP y/o utilizando un polinucleótido con una región de cadena sencilla que es de por lo menos 1 nucleótido (3' protuberante) o de por lo menos 2 nucleótidos de longitud (5' protuberante) y/o utilizando un polinucleótido con una región de cadena sencilla en uno o en ambos extremos del polinucleótido que presenta una longitud de por lo menos un nucleótido y dicha región de cadena sencilla resulta, por lo menos en parte, de una no correspondencia entre uno o más pares de bases en dicho polinucleótido, puede llevarse a cabo antes, durante y/o después de generar dicho polinucleótido de doble cadena. En el caso de que se lleve a cabo antes de la producción de la molécula de doble cadena, se evita la generación de enlaces covalentes que no puedan cortarse después. La utilización posterior del tratamiento puede evitar la unión de ddNTP no covalente y efectos de polimerasa directos, aunque no la unión covalente de ddNTP. En el presente contexto, la referencia a evitar la unión de un ddNTP a un polinucleótido (de doble cadena) en presencia de una polimerasa y la referencia a la forma que ese polinucleótido adopta se refieren al polinucleótido de doble cadena que se formará, aunque todavía no se haya formado en el tiempo en que se realiza el tratamiento.

En un aspecto, el ddNTP porta un marcaje. En la presente memoria, la referencia a un "marcaje" es cualquier molécula o grupo de moléculas que es detectable y/o genera una señal directa o indirectamente. Entre los marcajes convenientes se incluyen el marcaje colorimétrico, quimioluminiscente, cromogénico, radioactivo y fluorescente. Tal como se ha comentado anteriormente, en una característica preferente, el ddNTP porta un primer marcaje y el polinucleótido porta un segundo marcaje. Estos marcajes no son iguales. El primer marcaje o el segundo marcaje afecta a la señal generada por el otro marcaje en el caso de que los marcajes se encuentren estrechamente próximos entre sí.

En la presente memoria, la referencia a la "señal" del marcaje es una señal física que puede detectarse, p.ej., magnetismo, actividad óptica, fluorescencia, color, etc., dependiendo de la naturaleza del marcaje utilizado. Puede determinarse la ausencia, presencia o nivel de la señal.

En un aspecto preferente, el primer o segundo marcaje es un fluoróforo y el otro marcaje es una molécula que afecta a la fluorescencia del fluoróforo en el caso de que se encuentre en proximidad a ese fluoróforo y puede ser ella misma un fluoróforo en una realización de la invención.

La influencia anteriormente indicada sobre la señal (p.ej., la fluorescencia) sólo se observa en el caso de que el primer y segundo marcajes se encuentren en suficiente "proximidad" uno respecto a otro. La proximidad entre marcajes se refiere a la distancia espacial entre los marcajes. La proximidad a la que se observa una influencia sobre la señal (p.ej., la fluorescencia) puede diferir dependiendo de la elección de marcajes. La influencia sobre la señal (p.ej., la fluorescencia) se observa en el caso de que los marcajes se encuentren presentes sobre nucleótidos que participan en el apareamiento de las bases que se unen entre sí (es decir, nucleótidos de unión complementaria) o en nucleótidos contiguos en un polinucleótido. Además, la influencia sobre la señal (p.ej., la fluorescencia) puede observarse en el caso de que los marcajes no aparezcan en nucleótidos de unión complementaria o contiguos, sino que, por el contrario, aparezcan en un nucleótido situado uno a 30 (preferentemente 1 a 5, p.ej., 1, 2 o 3) nucleótidos más allá del nucleótido complementario o contiguo al considerar una molécula lineal sin estructura terciaria. De esta manera, por ejemplo, puede observarse la influencia en el caso de que el primer marcaje aparezca en el nucleótido 1 que se une al nucleótido 1' en una secuencia complementaria, aunque el segundo marcaje aparece en el nucleótido 5' en la secuencia complementaria. En la práctica, una influencia sobre la señal (p.ej., la fluorescencia) puede (también) observarse en el caso de que los marcajes se encuentren separados por una gran distancia en una secuencia (p.ej., a más de 30 nucleótidos), aunque los marcajes vienen a encontrarse en una proximidad más estrecha (p.ej., de la distancia indicada anteriormente) en vista de la estructura terciaria de la molécula en la que se encuentran los marcajes.

En la presente memoria, la referencia a un "fluoróforo" es un compuesto químico fluorescente que puede re-emitir luz tras la excitación lumínica de una longitud de onda particular. Dicha luz puede detectarse en métodos de la invención y proporciona una señal medible relacionada con la presencia y cantidad de la molécula marcada.

La molécula (marcaje) que afecta a la señal generada por el otro marcaje, en el caso de encontrarse en proximidad, incrementa o reduce el nivel de la señal medible. En un aspecto preferente, la molécula que afecta a la fluorescencia del fluoróforo en caso de encontrarse en proximidad a ese fluoróforo incrementa o reduce la fluorescencia (es decir, la cantidad de luz emitida) del fluoróforo en caso de encontrarse en proximidad a ese fluoróforo. Por ejemplo, puede utilizarse un inhibidor para reducir la intensidad de fluorescencia del fluoróforo. Lo anterior se consigue con el fluoróforo excitado volviendo a su estado basal tras la activación mediante transferencia de su energía al inhibidor, sin la emisión de luz, mientras que el inhibidor es promovido a su estado excitado. El inhibidor mismo puede ser un fluoróforo o puede ser por el contrario un no fluoróforo. En un aspecto preferente, se utiliza la energía de transferencia de energía de resonancia fluorescente (FRET, por sus siglas en inglés), en la que el fluoróforo transfiere la energía al inhibidor (que es él mismo un fluoróforo). Con el fin de que ello ocurra, el espectro de emisión del fluoróforo debe solaparse con el espectro de absorción del inhibidor. En el caso de que el inhibidor también sea un fluoróforo, puede utilizarse la emisión de luz de esa molécula (a una longitud de onda específica) como una indicación de que se ha producido la inhibición (de la señal del primer fluoróforo). Alternativamente, pueden utilizarse inhibidores oscuros, que absorben energía de excitación de un fluoróforo, aunque disipan esa energía como calor en lugar de luz.

Los fluoróforos adecuados para la utilización en la invención se proporcionan en la tabla a continuación (puede utilizarse cualquiera de dichos fluoróforos en los métodos de la invención).

Tabla 1: marcajes de fluoróforo

(continuación)

Los fluoróforos se encuentran disponibles de diversas fuentes comerciales, incluyendo Biosearch Technologies, GE Healthcare, Life Technologies, Integrated DNA Technologies, Epoch Biosciences, Inc. y Atto-tec GmbH.

Mediante la selección de fluoróforos apropiados, estos fluoróforos también pueden proporcionar una pareja de fluoróforo:inhibidor. Sin embargo, se proporcionan ejemplos de otros inhibidores adecuados a continuación, incluyendo inhibidores oscuros. La invención puede llevarse a cabo con cualquiera de los inhibidores indicados en la presente memoria.

Tabla 2: inhibidores

Los inhibidores se encuentran disponibles de diversas fuentes comerciales, incluyendo Eurogentec, Epoch Biosciences, Inc., Integrated DNA Technologies, Biosearch Technologies, Life Technologies y Atto-tec GmbH.

Entre los marcajes preferentes para la utilización en la invención se incluyen TAMRA, BODIPY y FAM, la totalidad de los cuales se encuentran fácilmente disponibles comercialmente. En una característica preferente, los dos marcajes que deben utilizarse son TAMRA y FAM, p.ej., en el ddNTP y polinucleótido de doble cadena (o sonda informadora, comentada posteriormente en la presente memoria), respectivamente. Entre otras combinaciones preferentes de inhibidor oscuro y fluoróforo se incluyen ATTO540Q/FAM, ATTO540Q/amarillo Yakima, ATTO580Q/ATTO550 y ATTO580Q/ATTO565. Entre otras combinaciones preferentes se incluyen ATTO612Q/ATTO565, ATTO612Q/ROX, ATTO612Q/CY5, ATTO612Q/CY5.5, DYQ660/ATTO565, DYQ660/ROX, DYQ660/CY5 y DYQ660/CY5.5. Preferentemente, el segundo marcaje en el polinucleótido de doble cadena es un fluoróforo y el primer marcaje en el ddNTP es el marcaje que afecta a la fluorescencia del fluoróforo.

Los mareajes pueden unirse al ddNTP mediante técnicas bien conocidas de la técnica. El polinucleótido marcado puede prepararse utilizando nucleótidos marcados mediante técnicas bien conocidas. Dichas moléculas se encuentran fácilmente disponibles comercialmente. El polinucleótido puede marcarse en cualquiera de sus nucleótidos. Sin embargo, preferentemente el polinucleótido se marca en uno de los tres nucleótidos en el extremo 5' de una de sus cadenas. Especialmente preferente se marca en el extremo 5' (es decir, el nucleótido terminal 5') de una de las cadenas que constituyen el polinucleótido.

El marcaje puede ser directo (p.ej., el marcaje se une directamente al ddNTP o polinucleótido mediante reacciones químicas de acoplamiento apropiadas o mediante un conector) o puede unirse mediante parejas de unión. Estos pueden dar lugar a una asociación covalente o no covalente. En este caso, la primera pareja de unión de una pareja de unión se une al ddNTP o al polinucleótido, y la segunda pareja de unión de la pareja de unión porta el marcaje. En la presente memoria, la referencia a "pareja de unión" se refiere a una pareja de moléculas que forman una interacción específica y estable. Entre los ejemplos se incluyen interacciones de ADN:ADN, ligando:receptor y anticuerpo:antígeno. Dichas fracciones de unión son bien conocidas de la técnica, p.ej., biotina/estreptavidina.

El polinucleótido de doble cadena puede adoptar diversas formas. En particular, a menos que el polinucleótido esté constituido de una única molécula, la molécula de doble cadena presenta diversas opciones en sus extremos. De esta manera, un extremo o ambos extremos del polinucleótido de doble cadena pueden ser romos. Un extremo o ambos extremos del polinucleótido de doble cadena puede presentar un extremo 5' protuberante. Un extremo o ambos extremos del polinucleótido de doble cadena puede presentar un extremo 3' protuberante. De esta manera, por ejemplo, ambos extremos pueden ser romos, o un extremo puede ser romo y el otro extremo puede ser un extremo 5' protuberante. Tal como se ha indicado anteriormente, se ha encontrado que ddNTP se unirá a moléculas de doble cadena como resultado de diversos mecanismos diferentes y que el mecanismo que se produce está influido por el tipo de extremos presentes en el polinucleótido de doble cadena.

En la presente memoria, la referencia a extremos "romos" se refiere a que se produce apareamiento de bases complementarias hasta el extremo relevante de la molécula de doble cadena, es decir, sin dejar ninguna base terminal sin aparear. La expresión "extremos 3' o 5' protuberantes" se refiere a la presencia de una o más bases terminales no apareadas que resultan en un extremo protuberante. Un extremo 5' protuberante presenta en su extremo una base 5' no apareada, es decir, en el extremo 5' fosforilo. En el caso de que aparezca una no correspondencia en el extremo de una molécula de doble cadena, ello puede resultar en un extremo 3' protuberante o en un extremo 5' protuberante en ese extremo de la molécula.

Aunque sin respaldo teórico, aparentemente los extremos romos pueden permitir la unión no covalente del ddNTP al polinucleótido de doble cadena sin que la polimerasa actúe como un mediador o adaptador para la unión y también permitir la unión covalente del ddNTP al polinucleótido de doble cadena en virtud de la actividad de transferasa terminal de la polimerasa. De esta manera, las etapas para evitar dicha unión están centradas en la eliminación de la polimerasa o su actividad (p.ej., unión enzimática o de ADN) o el ddNTP. De esta manera, en un aspecto preferente, en el caso de que un extremo o ambos extremos de dicho polinucleótido de doble cadena sean extremos romos, el método comprende inactivar, degradar o eliminar dicha polimerasa; desfosforilar o eliminar dicho ddNTP y/o expulsar por competición dicho ddNTP con otro ddNTP.

De manera similar, aparentemente los extremos 5' protuberantes pueden permitir la unión no covalente del ddNTP al polinucleótido de doble cadena con la polimerasa actuando como un mediador o adaptador para la unión y también permitir la unión covalente del ddNTP al polinucleótido de doble cadena en virtud de la actividad de transferasa terminal de la polimerasa o mediante la incorporación promiscua de ddNTP no complementario por la polimerasa. De esta manera, las etapas para evitar dicha unión están centradas en la eliminación de la polimerasa o su actividad o el ddNTP. El extremo 5' protuberante también puede alargarse para reducir la unión no covalente. De esta manera, en un aspecto preferente adicional, en el caso de que un extremo o ambos extremos de dicho polinucleótido de doble cadena presenten un extremo 5' protuberante, el método comprende inactivar, degradar o eliminar dicha polimerasa; desfosforilar o eliminar dicho ddNTP, expulsar por competición dicho ddNTP por otro ddNTP y/o utilizar un polinucleótido con una región de cadena sencilla que presenta una longitud de por lo menos 2 nucleótidos (5' protuberante). Alternativamente, puede utilizarse un polinucleótido que presenta una región de cadena sencilla en uno o ambos extremos del polinucleótido que presenta una longitud de por lo menos un nucleótido para formar una cadena 5' protuberante y dicha región de cadena sencilla resulta, por lo menos en parte, de una no correspondencia entre uno o más pares de bases en dicho polinucleótido.

Finalmente, aparentemente los extremos 3' protuberantes pueden permitir la unión no covalente del ddNTP al polinucleótido de doble cadena, actuando la polimerasa como un mediador o adaptador para la unión. De esta manera, las etapas para evitar dicha unión están centradas en la eliminación de la polimerasa o su actividad o el ddNTP, o en la eliminación del extremo 3' protuberante para reducir la unión no covalente. De esta manera, en un aspecto preferente todavía adicional, en el caso de que un extremo o ambos extremos de dicho polinucleótido de doble cadena presenten un extremo 3' protuberante, el método comprende inactivar, degradar o eliminar dicha polimerasa; desfosforilar o eliminar dicho ddNTP, expulsar por competición dicho ddNTP por otro ddNTP y/o utilizar un polinucleótido con una región de cadena sencilla que presenta una longitud de por lo menos 1 nucleótido (3' protuberante). Alternativamente, puede utilizarse un polinucleótido que presenta una región de cadena sencilla en uno o ambos extremos del polinucleótido que presenta una longitud de por lo menos un nucleótido para formar una cadena 3' protuberante y dicha región de cadena sencilla resulta, por lo menos en parte, de una no correspondencia entre uno o más pares de bases en dicho polinucleótido.

Los métodos en los que se elimina, desnaturaliza o inactiva la polimerasa también sirven para eliminar cualesquiera efectos dependientes de polimerasa, tales como falsos efectos FRET.

Tal como se ha indicado anteriormente en la presente memoria, se utilizan ddNTP en diversos métodos en los que el ddNTP se une a un nucleótido complementario particularmente en métodos de extensión de cadena bajo el control de un enzima relevante, tal como una polimerasa. En particular en dicho método, y en otros métodos de la invención, la molécula de doble cadena se somete a disociación, tal como se indica en la presente memoria, preferentemente en la que la disociación se consigue mediante calentamiento y el polinucleótido de doble cadena se somete a análisis de curva de análisis. De esta manera, en un método preferente, dicho método comprende el análisis de curva de fusión. Frecuentemente dicho ddNTP se marca, p.ej., en reacciones de secuenciación. El método anteriormente descrito que puede utilizarse para evitar una unión inapropiada de ddNTP, por lo tanto, resulta particularmente útil para evitar la generación de un falso positivo, en particular en un método de detección de secuencias.

De esta manera, en un aspecto preferente adicional, la presente invención proporciona un método de prevención de falsos positivos en un método de detección de secuencias, en el que dicho método de detección de secuencias comprende la etapa de poner en contacto un ddNTP, una polimerasa y un primer y segundo polinucleótidos que se hibridan entre sí para formar un tercer polinucleótido que es un polinucleótido de doble cadena con una región de cadena sencilla opcional, en el que, en el caso de que dicha región de cadena sencilla proporcione una secuencia 5' protuberante, no contiene una base complementaria a dicho ddNTP inmediatamente contiguo a la región de doble cadena, en el que dicho método evita la unión de un ddNTP a dicho tercer polinucleótido mediante un método que (i) comprende inactivar, degradar o eliminar dicha polimerasa, desfosforilar o eliminar dicho ddNTP y/o expulsar por competición dicho ddNTP por otro ddNTP y/o (ii) utiliza un polinucleótido con una región de cadena sencilla que presenta una longitud de por lo menos 1 nucleótido (3' protuberante) o 2 nucleótidos (5' protuberante) y/o utiliza un polinucleótido con una región de cadena sencilla en un extremo o ambos extremos del polinucleótido que presenta una longitud de por lo menos un nucleótido y dicha región de cadena sencilla resulta, por lo menos en parte, de una no correspondencia entre uno o más pares de bases en dicho polinucleótido.

En un aspecto preferente, la etapa de inactivar, degradar o eliminar dicha polimerasa, desfosforilar o eliminar dicho ddNTP, expulsando por competición dicho ddNTP y/o utilizando un polinucleótido con una región de cadena sencilla que es de por lo menos 1 nucleótido (3' protuberante) o de por lo menos 2 nucleótidos de longitud (5' protuberante) y/o utilizando un polinucleótido con una región de cadena sencilla en uno o en ambos extremos del polinucleótido que presenta una longitud de por lo menos un nucleótido y dicha región de cadena sencilla resulta, por lo menos en parte, de una no correspondencia entre uno o más pares de bases en dicho polinucleótido, puede llevarse a cabo antes, durante y/o después de generar dicho polinucleótido de doble cadena (tercer polinucleótido).

Dicho método comprende un método de bloqueo de la unión de un ddNTP a un polinucleótido en presencia de una polimerasa, tal como se ha indicado anteriormente en la presente memoria.

Las definiciones y opciones preferentes proporcionadas anteriormente en la presente memoria son igualmente aplicables a dicho método. En particular, la región de cadena sencilla, las etapas (i) y (ii) y la polimerasa son tal como se ha indicado anteriormente en la presente memoria. El "primer" y "segundo" polinucleótidos corresponden a la primera y segunda cadenas comentadas anteriormente y pueden encontrarse presentes en un único polinucleótido, aunque preferentemente se proporcionan en moléculas separadas. El tercer polinucleótido, que es un polinucleótido de doble cadena, corresponde al polinucleótido de doble cadena indicado anteriormente en la presente memoria. El ddNTP y polinucleótido de doble cadena pueden marcarse tal como se ha indicado anteriormente en la presente memoria. Los tratamientos que deben utilizarse y los tipos de moléculas de doble cadena a los que se aplican también resultan aplicables a dicho método.

Tal como se indica en la presente memoria, un "falso positivo" es un resultado que indica que un atributo para cuya identificación se ha diseñado un ensayo se encuentra presente cuando no lo está. Lo anterior también se extiende a incrementos falsos, aparentes, de un atributo que pueden encontrarse presentes, aunque no en la medida indicada por el resultado. En el caso de un método de detección de secuencias, un falso positivo corresponde a la identificación de un nucleótido, base o secuencia particular, en el que ese nucleótido, base o secuencia no se encuentra presente, p.ej., se encuentra que un polinucleótido de ensayo contiene un PNU utilizando el método, aunque el PNU de hecho no aparece en el polinucleótido de ensayo.

Un "método de detección de secuencias" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a un método en el que se determina una secuencia de nucleótidos. Puede determinarse una secuencia completa o una secuencia parcial. En algunos casos, únicamente puede determinarse una sola base o bases (o uno o más nucleótidos) en una secuencia, aunque generalmente ello es en el contexto de una secuencia circundante y, de esta manera, por ejemplo, el ensayo confirma la presencia o la ausencia del PNU en su secuencia de contexto. Dependiendo del método utilizado, se determina por lo menos un nucleótido/base, p.ej., por lo menos 2, 3, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 4000, 6000 o 10000 o más nucleótidos, particularmente en el caso de que se utilicen múltiples ciclos del método.

La determinación de la secuencia de nucleótidos incluye la identificación de la base específica en una posición particular (es decir, A, T/U, G o C), es decir, la identificación absoluta, o proporciona una identificación parcial de esa base, p.ej., el método puede identificar un grupo de bases, de menos de 4 (es decir, 3 o 2) que consiste en las opciones para esa base, p.ej., A o T, aunque no G o C; o A, T o G, pero no C.

En dicho aspecto de la invención, el ddNTP, la polimerasa y el primer y segundo polinucleótidos se llevan a estar en contacto mutuo. El primer y segundo polinucleótidos se hibridan entre sí para formar el tercer polinucleótido (de doble cadena). De esta manera, el primer y segundo polinucleótidos se llevan a estar en contacto bajo condiciones apropiadas (p.ej., temperatura, concentración y condiciones de tampón) que permiten su hibridación. El ddNTP y la polimerasa también se llevan a ponerse en contacto con dichas moléculas (es decir, se permite el contacto físico con estas moléculas en el mismo recipiente de reacción). El ddNTP y/o la polimerasa pueden añadirse (o encontrarse presente en) la mezcla de reacción simultáneamente a la puesta en contacto del primer y segundo polinucleótidos entre sí, o pueden añadirse a la mezcla de reacción después de que uno o ambos de entre el primer y segundo polinucleótidos hayan sido añadidos a la mezcla, es decir, los cuatro elementos pueden añadirse a la mezcla de reacción en cualquier orden, consecutiva o simultáneamente (2 o más de los cuatro elementos). En este caso, la etapa de inactivar, degradar o eliminar dicha polimerasa, desfosforilando o eliminando dicho ddNTP, expulsando por competición dicho ddNTP y/o utilizando un polinucleótido con una región de cadena sencilla que es de por lo menos 1 nucleótido (3' protuberante) o de por lo menos 2 nucleótidos de longitud (5' protuberante) y/o utilizando un polinucleótido con una región de cadena sencilla en uno o en ambos extremos del polinucleótido que presenta una longitud de por lo menos un nucleótido y dicha región de cadena sencilla resulta, por lo menos en parte, de una no correspondencia entre uno o más pares de bases en dicho polinucleótido, puede llevarse a cabo antes, durante y/o después de generar dicho polinucleótido de doble cadena. De esta manera, en el caso de que deba añadirse una molécula particular, p.ej., una fosfatasa y/o proteasa y/o detergente, puede añadirse con los primeros reactivos o en un punto posterior de la reacción.

El método también puede llevarse a cabo en presencia de otros agentes. Debido a que el método puede seguir o producirse durante una reacción de extensión normal, también pueden encontrarse presentes otros reactivos utilizados para esa reacción de extensión, tales como uno o más dNTP.

Los métodos de detección de secuencia preferentes se basan en la incorporación de un ddNTP marcado en una reacción de extensión de cadena por una polimerasa y entre ellos se incluye el método dideoxi de Sanger y la secuenciación mediante ligación y corte en etapas. Sin embargo, en un aspecto preferente, se utiliza un método en el que la detección de secuencia implica la utilización de reacciones de extensión de cebador de una sola base.

De esta manera, en un aspecto preferente adicional, la presente invención proporciona un método para identificar una secuencia de nucleótidos diana en un polinucleótido de ensayo, que comprende:

(a) poner en contacto dicho polinucleótido de ensayo con un ddNTP y una sonda de marcaje no marcada, en donde la sonda se hibrida con dicha secuencia de nucleótidos diana, en caso de hallarse presente, en posición inmediatamente 5' respecto a una base que es complementaria a dicho ddNTP en dicha secuencia de nucleótidos diana, en presencia de una polimerasa, en la que dicho ddNTP porta un primer marcaje y en el caso de que dicha secuencia diana se encuentre presente en dicho polinucleótido diana, dicha sonda de marcaje no marcada se hibridará con dicho polinucleótido diana y será extendida en la dirección 3' por dicha polimerasa, uniendo dicho ddNTP marcado a dicha sonda de marcaje no marcada para formar una sonda de marcaje marcada.

(b) separar la sonda de marcaje, que puede estar marcada o no marcada, respecto del polinucleótido diana, (c) hibridar dicha sonda de marcaje con una sonda informadora que porta un segundo marcaje, formando un polinucleótido de doble cadena (tal como se ha definido anteriormente en la presente memoria), en el que el primer o segundo marcaje afecta a la señal generada por el otro marcaje en el caso de que los marcajes se encuentren próximos entre sí (en el que preferentemente dicho primer o segundo marcaje es un fluoróforo y el otro marcaje es una molécula que afecta a la fluorescencia de dicho fluoróforo en el caso de que se encuentre próximo a dicho fluoróforo), en el que, en caso de que dicha sonda de marcaje se encuentre no marcada, en el extremo más próximo al segundo marcaje, dicho polinucleótido de doble cadena es (i) de extremos romos, (ii) presenta un extremo 5' protuberante o (iii) presenta un extremo 3' protuberante, y en el extremo distal al segundo marcaje, dicho polinucleótido de doble cadena es (i) de extremos romos, (ii) presenta un extremo 5' protuberante o (iii) presenta un extremo 3' protuberante, en el que dichos extremos protuberantes consisten en una región de cadena sencilla y en el caso de que dicha región de cadena sencilla proporcione una secuencia 5' protuberante, no contiene una base complementaria a dicho ddNTP inmediatamente contigua a la región de doble cadena (preferentemente no contiene una base complementaria a dicho ddNTP en ningún sitio en dicha región de cadena sencilla), (d) inactivar, degradar o eliminar dicha polimerasa, desfosforilando o eliminando dicho ddNTP que no se unió en la etapa a), expulsando por competición dicho ddNTP con otro ddNTP y/o utilizando una sonda de marcaje y una sonda informadora que, cuando están unidas entre sí proporcionan una región de cadena sencilla que es de por lo menos 1 nucleótido (3' protuberante) o de por lo menos 2 nucleótidos de longitud (5' protuberante) y/o utilizando una sonda de mareaje y una sonda informadora que cuando están unidas entre sí proporcionan una región de cadena sencilla en uno o en ambos extremos del polinucleótido de doble cadena que presenta una longitud de por lo menos un nucleótido y dicha región de cadena sencilla resulta, por lo menos en parte, de una no correspondencia entre uno o más pares de bases en dicho polinucleótido de doble cadena, en el que la etapa (d) puede llevarse a cabo antes, durante y/o después de generar dicho polinucleótido de doble cadena, y

(e) determinar si dicha sonda de marcaje porta un primer marcaje mediante la evaluación de la señal asociada al polinucleótido de doble cadena, en el que un cambio en la señal del primer o segundo marcaje es indicativo de la presencia de dicha secuencia diana en dicho polinucleótido de ensayo.

En un aspecto preferente de dicho método, dependiendo de la forma de la molécula de doble cadena que se genera, el método puede modificarse de manera que:

(i) cuando un extremo o ambos extremos de dicho polinucleótido son extremos romos según la etapa (c), en la etapa (d) se inactiva dicha polimerasa, se degrada o se elimina, dicho ddNTP que no se unión en la etapa a) se desfosforila o se elimina y/o dicho ddNTP se expulsa por competición con otro ddNTP,

(ii) en el caso de que uno o ambos extremos de dicho polinucleótido presenten un extremo 5' protuberante según la etapa (c), en la etapa (d) dicha polimerasa se inactiva, degrada o elimina; dicho ddNTP que no se unió en la etapa a) se desfosforila o se elimina; dicho ddNTP es expulsado por competición con otro ddNTP y/o la sonda de marcaje y sonda informadora cuando están unidas entre sí, proporcionan una región de cadena sencilla que forma dicho extremo 5' protuberante que es de por lo menos 2 nucleótidos de longitud (que puede conseguirse utilizando bases no correspondientes o mediante extensión de una de las sondas, por ejemplo) y/o una sonda de marcaje y una sonda informadora que cuando están unidas proporcionan una región de cadena sencilla en uno o en ambos extremos del polinucleótido de doble cadena que es de por lo menos un nucleótido de longitud y dicha región de cadena sencilla resulta, por lo menos en parte, de un desapareamiento entre uno o más pares de bases en dicho polinucleótido de doble cadena, y/o

(iii) en el caso de que uno o ambos extremos de dicho polinucleótido presenten un extremo 3' protuberante según la etapa (c), en la etapa (d) dicha polimerasa se inactiva, degrada o elimina (preferentemente se degrada o se elimina); dicho ddNTP que no se unió en la etapa a) se desfosforila; dicho ddNTP es expulsado por competición con otro ddNTP y/o la sonda de marcaje y sonda informadora cuando están unidas entre sí, proporcionan una región de cadena sencilla que forma dicho extremo 3' protuberante que es de por lo menos 1 nucleótido de longitud (que puede conseguirse utilizando bases no correspondientes o mediante extensión de una de las sondas, por ejemplo) y/o una sonda de marcaje y una sonda informadora que, cuando están unidas, proporcionan una región de cadena sencilla en uno o en ambos extremos del polinucleótido de doble cadena que es de por lo menos un nucleótido de longitud y dicha región de cadena sencilla resulta, por lo menos en parte, de un desapareamiento entre uno o más pares de bases en dicho polinucleótido de doble cadena.

En el método anterior, preferentemente dicho primer o segundo marcaje es un fluoróforo y el otro marcaje es una molécula que afecta a la fluorescencia de dicho fluoróforo en el caso de que se encuentre próximo a dicho fluoróforo. En ese caso, para determinar si la sonda de marcaje porta un primer marcaje, se evalúa la fluorescencia del fluoróforo en el polinucleótido de doble cadena, en el que un cambio en la fluorescencia es indicativo de la presencia de dicha secuencia diana en dicho polinucleótido ensayo.

El método para identificar una secuencia de nucleótidos diana comprende un método de evitación de los falsos positivos en un método de detección de secuencia, un método para prevenir ddNTP y un método para evitar las lecturas falsas de Tf o los falsos efectos FRET, tal como se indica en la presente memoria. Los significados de los términos utilizados en el presente aspecto de la invención son tal como se ha indicado anteriormente en la presente memoria o tal como se indican posteriormente en la presente memoria.

En la presente memoria, la referencia a un polinucleótido "de ensayo" se refiere a un polinucleótido que se encuentra presente en una muestra que debe examinarse mediante el método para determinar si contiene (comprende o consiste en) una secuencia diana. La "muestra" es cualquier muestra que puede obtenerse o prepararse que puede contener un polinucleótido relevante. El polinucleótido puede proporcionarse en su forma original, p.ej., en una muestra biológica originada de un organismo, aunque más preferentemente es un producto amplificado de un polinucleótido nativo original. De esta manera, el polinucleótido de ensayo puede obtenerse mediante amplificación de ARN nativo (p.ej., ARNm o ARN ribosómico) o ADN para producir ADNc amplificado para la utilización en el método. Preferentemente, el polinucleótido de ensayo es ADN o ADNc. El polinucleótido de ensayo puede ser de doble cadena o de cadena sencilla.

El ARN nativo (que en primer lugar puede transcribirse inversamente a ADNc) o ADN nativo puede amplificarse mediante técnicas de amplificación conocidas, tales como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) mediante la utilización de cebadores apropiados (p.ej., directos o inversos), NASBA o reacción en cadena de la ligasa. Alternativamente, el ADN nativo o ADNc (o partes relevantes del mismo) puede clonarse con un vector, utilizado para transformar una bacteria, tal como E. coli, que a continuación puede cultivarse para multiplicar las moléculas de ácidos nucleicos. En el caso de que la secuencia del ADN o ADNc no sean conocidas, los cebadores pueden estar dirigidos a regiones de las moléculas de ácidos nucleicos que han sido introducidas. De esta manera, por ejemplo, pueden ligarse adaptadores a las moléculas de ADN y dirigirse cebadores a dichas partes para la amplificación de las moléculas de ADN. Alternativamente, en el caso de las muestras eucarióticas, puede aprovecharse la cola poliA y caperuza del ARN para preparar cebadores apropiados.

El polinucleótido nativo original se obtiene a partir de un organismo. Dicho polinucleótido puede obtenerse directamente, p.ej., del ser humano o animal no humano bajo investigación, p.ej., de tejidos, líquido corporal o residuos corporales, o en el caso de organismos procarióticos, del organismo mismo. La expresión "líquidos corporales" incluye sangre, saliva, líquido espinal, semen y linfa. La expresión "residuos corporales" incluye orina, materia expectorada (pacientes pulmonares), heces, etc. La expresión "muestras de tejido" incluye tejido obtenido mediante biopsia, mediante intervenciones quirúrgicas o por otros medios, p.ej., placenta. Estos tejidos, líquido corporal o residuos corporales, pueden proporcionar la muestra en la que se encuentra presente dicho polinucleótido de ensayo o a partir del cual puede derivarse dicho polinucleótido de ensayo, p.ej. mediante amplificación. Alternativamente, la muestra puede no derivarse del organismo mismo, aunque contiene material genético de dicho organismo, p.ej., una muestra ambiental (p.ej., que contiene células relevantes o material genético).

El organismo de interés es un organismo procariótico o eucariótico que puede ser cualquier organismo eucariótico, tal como seres humanos, otros mamíferos y animales, aves, insectos, peces y plantas, y cualquier organismo procariótico, tal como una bacteria.

Entre los animales no humanos preferentes se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, peces y mamíferos. Entre los mamíferos preferentes se incluyen primates, animales domésticos, vacas y animales laboratorios. De esta manera, entre los mamíferos preferentes se incluyen ratones, ratas, cobayas, gatos, perros, cerdos, vacas, cabras, ovejas y caballos.

La expresión "identificación de una secuencia de nucleótidos diana" presenta el mismo significado que el utilizado anteriormente en la presente memoria en relación a un método de detección de secuencias, es decir, una secuencia absoluta o parcial de por lo menos un nucleótido dentro de una secuencia.

La secuencia "diana" es una secuencia de interés que debe identificarse en un polinucleótido de ensayo. El método puede utilizarse para identificar un nucleótido particular (p.ej., un PNU) (y éste puede considerarse la secuencia que se identifica), aunque ello será en el contexto de su secuencia circundante y, de esta manera, se identifica la presencia de una secuencia diana. Preferentemente, la secuencia diana presenta una longitud de entre 6 y 30 nucleótidos.

La expresión "sonda de marcaje no marcada" (correspondiente al primer polinucleótido indicado anteriormente en la presente memoria) se refiere a un polinucleótido que es capaz de hibridarse con la secuencia de nucleótidos diana. La sonda presenta una longitud tal como se ha indicado anteriormente en la presente memoria que es suficientemente larga para hibridarse apropiadamente, aunque específicamente, con la secuencia diana, y no con otras secuencias que pueden encontrarse presentes, aunque suficientemente corta para evitar una síntesis química excesiva. Puede tolerarse algo de desapareamiento entre la sonda de marcaje y la secuencia diana contenida en la molécula de ensayo. Preferentemente, las regiones de las moléculas (en el caso de la sonda de marcaje, lo anterior puede ser la totalidad o una parte de esa molécula) que se hibridan entre sí presentan una complementariedad de 100% de una con otra. Sin embargo, lo anterior no resulta necesario y un apareamiento de bases perfecto no resulta necesario. De esta manera, los no apareamientos dentro de dicha región pueden tolerarse, proporcionando las dos moléculas con suficiente complementariedad para permitir la formación de un complejo que es suficientemente estable para realizar los análisis rutinarios de temperatura de fusión. De esta manera, por ejemplo, las regiones de las secuencias que se unen entre sí pueden compartir una complementariedad de sólo 80%, 90% o 95% (p.ej., pueden presentar uno, dos, tres o más desapareamientos). En algunas realizaciones de la invención, la utilización de desapareamientos resulta preferente tal como se indica en la presente memoria.

La sonda se encuentra no marcada en la medida en que no porta un marcaje tal como se ha indicado anteriormente en la presente memoria, que genera una señal detectable.

Las secuencias "hibridantes" son aquellas que se mantienen unidas bajo condiciones de alta astringencia, es decir, se unen bajo condiciones no restrictivas (por ejemplo, 6x SSC/formamida al 50% a temperatura ambiente) y se mantienen unidas al lavarlas bajo condiciones de alta astringencia (2x SSC, 65°C) (en donde SsC=NaCl 0,15 M, citrato sódico 0,015 M, pH 7,2, p.ej., par ala utilización con oligonucleótidos de 70 o más nucleótidos) (o solución de lavado de TMACl a 50-80°C) (en donde la solución de lavado de TMACl=TMACl 3,0 M, Tris-Cl 50 mM (pH 8,0), EDTA 0,2 mM (pH 7,6), SDS 1 mg/ml, p.ej., para la utilización con oligonucleótidos de entre 17 y 50 nucleótidos).

La sonda de marcaje se une a dicha secuencia de nucleótidos diana en posición inmediatamente 5' (es decir, cadena arriba) respecto a una base que es complementaria al ddNTP utilizado en el método. De esta manera, la sonda de marcaje se une únicamente a una parte de la secuencia de nucleótidos diana. En el caso de que la secuencia diana contenga un PNU, la sonda de marcaje puede unirse a la secuencia de nucleótidos diana completa, excepto la base en la que se encuentra el PNU. En este caso, se forma una molécula de doble cadena a la que el ddNPT seguidamente puede unirse mediante una reacción normal de extensión de cadena. En la presente memoria, la referencia a la unión en posición inmediatamente 5' respecto a la base se refiere a la unión a la secuencia diana de manera que el nucleótido terminal 3' final de la sonda de marcaje se une a un nucleótido en la secuencia diana que es contiguo y 5' respecto a la base que es complementaria al ddNTP. Lo anterior permite que se produzca la extensión de cadena en, por lo menos, dicha base complementaria. Tal como se comenta posteriormente en la presente memoria, la extensión de cadena más allá de dicho primer nucleótido también se encuentra contemplada.

La sonda de marcaje es preferentemente de por lo menos 5 nucleótidos, preferentemente de entre 5 y 200 nucleótidos, p.ej., de entre 10 y 100 nucleótidos, p.ej., de entre 20 y 50 nucleótidos de longitud.

La sonda de marcaje puede no ser perfectamente complementaria a la secuencia diana (tal como se ha comentado anteriormente en la presente memoria en relación a la unión entre la primera y segunda cadenas en el polinucleótido de doble cadena). El número de bases implicado en la unión complementaria debe resultar suficiente para permitir la producción de un complejo estable. Preferentemente por lo menos 5 bases consecutivas, preferentemente de entre 5 y 200 bases consecutivas, p.ej., de entre 10 y 100 bases consecutivas, p.ej., de entre 20 y 50 bases consecutivas de la sonda de marcaje son complementarias de las bases en la secuencia diana. Preferentemente, la sonda de marcaje es perfectamente (es decir, 100%) complementaria a la secuencia diana o una región de la misma.

En la presente memoria, la referencia a "complementariedad" define la relación entre dos moléculas (o regiones de las mismas) y denota el grado en que las moléculas contienen nucleótidos/bases complementarias de manera que pueda producirse la unión complementaria entre las moléculas, es decir, las bases complementarias se proporcionan en el mismo orden. En el caso de que las secuencias presenten una complementariedad de 100%, se une sin desapareamientos. En el caso de que presenten una complementariedad inferior a 100%, se encuentran presentes uno o más desapareamientos.

El ddNTP, polimerasa, primer y segundo marcajes son tal como se ha indicado anteriormente en la presente memoria. El segundo marcaje se une a la sonda informadora.

En el caso de que la secuencia diana se encuentre presente, la sonda de marcaje no marcada se hibrida con el polinucleótido de ensayo y es extendido en la dirección 3' por la polimerasa, uniendo el ddNTP marcado a la sonda de marcaje no marcada para formar una sonda de marcaje marcada. Para permitir que se lleve a cabo lo anterior, la sonda de marcaje, el ddNTP y la polimerasa se proporcionan bajo condiciones apropiadas (p.ej., temperatura y concentración) y durante el tiempo apropiado para permitir tanto la hibridación como la extensión de cadena. Las condiciones apropiadas para este fin son bien conocidas de la técnica (ver, p.ej., Sambrook et al. Molecular Cloning: A laboratory manual, 2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y, 1989).

La sonda de marcaje marcada formada de esta manera es un polinucleótido de cadena sencilla en el que se ha incorporado el ddNTP marcado mediante extensión de la cadena. El ddNTP puede incorporarse como el primer nucleótido en la reacción de extensión de la cadena o puede incorporarse como un segundo o posterior nucleótido (p.ej., en el caso de que también se utilicen dNTP).

En el caso de que la secuencia diana no se encuentre presente, p.ej., en el caso de que no se encuentre presente un PNU particular, la sonda de marcaje todavía puede unirse al polinucleótido de ensayo (en el caso de un PNU, la mayor parte de la secuencia del polinucleótido diana puede encontrarse presente (es decir, su secuencia de contexto cadena arriba), aunque no lo se encuentre presente el PNU particular), aunque no se produce extensión de la cadena y, de esta manera, la sonda de marcaje se mantiene sin marcar.

La separación de la sonda de marcaje del polinucleótido de ensayo requiere por lo menos la disrupción de la unión de los pares de bases entre dichas moléculas, es decir, la fusión del complejo hibridado. Convenientemente, lo anterior puede conseguirse mediante elevación de la temperatura de la solución en la que se mantiene el complejo hasta una temperatura superior a la temperatura de fusión (Tf, comentada posteriormente) de ese complejo.

Aunque no resulta necesario, puede llevarse a cabo la separación física adicional de la sonda de marcaje y el polinucleótido de ensayo. (Sin embargo, en un aspecto preferente, la separación física adicional de las moléculas en zonas separadas o soluciones no se lleva a cabo, p.ej., no se lleva a cabo una separación basada en la carga o en el tamaño para separar las diferentes moléculas y el ddNTP no unido). Lo anterior puede llevarse a cabo, por ejemplo, mediante afinidad, p.ej., en el que la sonda de marcaje o el polinucleótido de ensayo contiene una secuencia o molécula (p.ej., introducida durante la preparación o amplificación) que no se encuentra presente en la otra entidad (sonda de marcaje o polinucleótido de ensayo) y al que puede proporcionarse una pareja de unión (p.ej., unido a un soporte sólido). Por ejemplo, tal como se ha indicado anteriormente en la presente memoria, la sonda de marcaje puede portar una pareja de unión y puede recogerse mediante la unión de dicha pareja de unión a la otra pareja de unión del par de unión que puede portarse sobre un soporte sólido.

Una vez separado del polinucleótido de ensayo, la sonda de marcaje (marcada o no marcada) se hibrida con una sonda informadora que presenta un segundo marcaje. La hibridación y el segundo marcaje son tal como se han indicado anteriormente en la presente memoria. El polinucleótido de doble cadena que se forma mediante dicha hibridación también se ha indicado anteriormente en la presente memoria.

La sonda de marcaje (marcada y no marcada) y la sonda informadora corresponden al primer y segundo polinucleótidos tal como se han indicado anteriormente en la presente memoria, que al hibridarse entre sí forman el tercer polinucleótido (el polinucleótido de doble cadena indicado anteriormente en la presente memoria). De esta manera, resultan aplicables las definiciones proporcionadas para dichos polinucleótidos indicados anteriormente en la presente memoria. De esta manera, por ejemplo la sonda informadora preferentemente presenta una longitud de 5 nucleótidos, preferentemente de entre 5 y 200 nucleótidos, p.ej., de entre 10 y 100 nucleótidos, p.ej. de entre 20 y 50 nucleótidos, y está marcada con un segundo marcaje que es preferentemente el fluoróforo. La sonda informadora puede marcarse en cualquier nucleótido dentro de la molécula de sonda con la condición de que el primer y segundo marcajes se seleccionen de manera que pueda conseguirse la interacción requerida basándose en su proximidad. Preferentemente, la sonda informadora se marca en el extremo 5', p.ej., en uno de los tres nucleótidos en el extremo 5', p.ej., en el extremo 5'-terminal.

En el diseño de la sonda de marcaje y de la sonda informadora, deberían evitarse las bases que producirían una actividad inhibidora intrínseca (p.ej., tal como se muestra en los Ejemplos). De esta manera, deberían evitarse los residuos de guanina en estrecha proximidad al marcaje cuya señal debe medirse. De esta manera, en el caso de que la molécula informadora porte un marcaje en su extremo 5', debería evitarse una sonda de marcaje con un extremo 3' rico en G. Además, deberían evitarse las guaninas 5' en la molécula informadora.

El polinucleótido de doble cadena formado de esta manera presenta cadenas romas o protuberantes, que presentan los significados indicados anteriormente en la presente memoria, en uno o ambos extremos. El extremo más próximo al segundo marcaje es el extremo más próximo al nucleótido que porta el marcaje. En una característica preferente, el segundo marcaje aparece en el extremo 5' en la sonda informadora y la unión de la sonda de marcaje en este extremo (más próximo) genera un extremo romo o protuberante. El extremo distal a dicho marcaje, en este caso, se encuentra en el extremo 3' de la sonda informadora.

En una característica preferente, la región de cadena sencilla de la cadena protuberante es de uno, dos o tres nucleótidos de longitud.

Según el tipo de extremo (romo o protuberante), el polinucleótido de doble cadena puede tratarse tal como se ha indicado anteriormente en la presente memoria, es decir, mediante tratamiento o eliminación de la polimerasa, desfosforilación o eliminación de ddNNTP, expulsión por competición de ddNTP o utilización de una molécula de doble cadena con una región de cadena sencilla más larga o pares de bases desapareados. Tal como se ha indicado anteriormente, la polimerasa media en diferentes tipos de unión. Según el tipo de unión que debe evitarse, pueden seleccionarse apropiadamente los tiempos de dicho tratamiento. El tratamiento puede llevarse a cabo antes de generarse la molécula de doble cadena (para evitar la unión covalente inapropiada de ddNTP) y/o el tratamiento puede llevarse a cabo durante y/o después de la generación de la molécula de doble cadena (aunque antes de la detección de la señal), en donde el principal problema potencial son los falsos efectos FRET o los efectos de estabilización de la polimerasa. Convenientemente, el agente que debe utilizarse con este fin puede encontrarse presente durante la generación de la molécula de doble cadena, p.ej., puede añadirse una proteinasa o detergente simultáneamente a la generación de la molécula de doble cadena. Particularmente preferentemente, en el caso de que se utilice una proteinasa, se añade antes de la generación del polinucleótido de doble cadena. Preferentemente, en el caso de que se utilice detergente, en vista de sus efectos más rápidos, puede añadirse antes o durante la generación del polinucleótido de doble cadena.

Tras la realización de dicha etapa, sólo deberían encontrarse presentes marcajes que estaban presentes en los polinucleótidos tal como se prepararon o introdujeron originalmente durante la reacción de extensión de cadena que incorporó el ddNTP. Para determinar si la secuencia diana se encuentra presente resulta necesario determinar si la sonda de marcaje porta un primer marcaje (es decir, el ddNTP ha sido incorporado, indicando la existencia de la secuencia diana completa).

Dicha determinación puede realizarse mediante la evaluación de la señal asociada al polinucleótido de doble cadena. Dependiendo del marcaje utilizado y, por lo tanto, la señal generada, pueden utilizarse métodos apropiados de determinación. Tal como se indica en mayor detalle posteriormente en la presente memoria, por ejemplo, uno de los marcajes puede ser un fluoróforo y puede examinarse la medida de su señal (fluorescencia).

En la presente memoria, la referencia a un "cambio de señal" se refiere a una alteración del nivel (incluyendo la presencia o ausencia) o tipo de señal respecto a un valor de referencia. La alteración puede ser un incremento o una reducción de la señal. En la evaluación de si la formación del polinucleótido de doble cadena resulta en un cambio de señal, el valor de referencia es la señal del primer o segundo marcaje cuando no se encuentran próximos entre sí. De esta manera, por ejemplo en el caso de un fluoróforo y un inhibidor, en el caso de que el fluoróforo sea el segundo marcaje presente en la sonda informadora, y el primer marcaje en el ddNTP sea un inhibidor, al incorporar el ddNTP en la sonda de marcaje y unirse esa sonda a la sonda informadora de manera que los marcajes se encuentren próximos, la señal del fluoróforo resultará modificada (es decir, la fluorescencia resultará inhibida, reduciendo de esta manera la fluorescencia detectable de ese marcaje).

La determinación que se lleva a cabo puede ser cualitativa (es decir, la identificación de la presencia o ausencia de una secuencia de ensayo) y/o cuantitativa (es decir, la identificación de la cantidad o nivel de la secuencia de ensayo). Lo anterior puede expresarse como un valor absoluto, un porcentaje, una proporción o un indicador similar.

El cambio de señal puede evaluarse respecto a la señal inicial, p.ej., no unida, del marcaje, p.ej., la señal generada por la sonda informadora. Sin embargo, convenientemente el cambio de señal se evalúa mediante separación de la sonda informadora respecto de la sonda de marcaje (marcada o no marcada) y evaluación del cambio de señal durante esa disociación. Convenientemente, lo anterior se lleva a cabo utilizando el análisis de curvas de fusión.

De esta manera, en un aspecto preferente, la presente invención proporciona someter la molécula de doble cadena a disociación, en la que un cambio en la señal del primer o segundo marcaje (preferentemente la fluorescencia) durante dicha disociación es indicativo de la presencia de dicha secuencia diana en dicho polinucleótido de ensayo. Preferentemente, la disociación se consigue mediante calentamiento y el polinucleótido de doble cadena se somete a análisis de la curva de fusión.

En un aspecto preferente, se evalúa el nivel de fluorescencia del marcaje que es un fluoróforo (que preferentemente se encuentra en la sonda informadora). En el caso de que el fluoróforo se encuentre presente en la sonda informadora, la fluorescencia de esa molécula se encontrará presente, aunque puede resultar afectada dependiendo de si se encuentra presente el primer marcaje en la sonda de marcaje. En el caso de que el fluoróforo se encuentre presente en la sonda de marcaje (si está marcada), la fluorescencia se encontrará presente únicamente en el caso de que se encuentre presente esa sonda de marcaje, y esa fluorescencia resultará afectada por la presencia del segundo marcaje en la sonda informadora.

Puede utilizarse cualquier medio conveniente para evaluar la fluorescencia del fluoróforo. Por ejemplo, puede examinarse la espectroscopía de fluorescencia de resolución temporal por 2 fotones y por 3 fotones, las imágenes de tiempo de vida de fluorescencia o la transferencia de energía por resonancia fluorescente. La fluorescencia puede detectarse utilizando detectores apropiados, p.ej., microscopios de fluorescencia, escáners de fluorescencia, espectrofluorímetros o citómetros de flujo. Convenientemente se utilizan espectrofluorímetros. A título de ejemplo, convenientemente pueden utilizarse instrumentos tales como el instrumento 7500 Fast de Applied Biosystems o el instrumento Rotor-Q de Qiagen.

En los métodos de multiplexación, tal como se comenta en mayor detalle posteriormente en la presente memoria, puede utilizarse más de un marcaje fluorescente (p.ej., en el caso de que se utilice más de una sonda de marcaje o informadora) y en ese caso un detector capaz de discriminar entre la fluorescencia de diferentes marcajes, en caso necesario.

Preferentemente, el método está automatizado o semiautomatizado para el cribado de alto rendimiento. La automatización se controla convenientemente mediante software informático.

Tal como se ha indicado anteriormente, convenientemente la determinación se lleva a cabo mediante análisis de la curva de fusión. El análisis de curvas de fusión es una evaluación de las características de disociación del ADN de doble cadena durante el procedimiento de calentamiento. Una elevación de la temperatura conduce a la disociación de la molécula de doble cadena en cadenas sencillas al romper la unión entre los pares de bases. La temperatura de fusión (Tf) es la temperatura a la que el 50% de las moléculas de doble cadena se han disociado en moléculas de cadena sencilla. La temperatura de fusión se ve afectada por diversos factores, entre ellos el grado de complementariedad entre los pares de unión, la longitud de las moléculas implicadas y el contenido de GC de las moléculas, la totalidad de los cuales afecta a la estabilidad de la molécula de doble cadena.

En el presente caso, la molécula de doble cadena presenta dos formas diferentes, dependiendo de si la secuencia diana se encuentra presente o no. En el caso de que la secuencia diana se encuentre presente, la sonda de marcaje se marca con el primer marcaje. A continuación, ésta se une a la sonda informadora, que presenta un segundo marcaje. Uno de dichos marcajes afecta a la señal del otro marcaje. Preferentemente, uno de dichos marcajes es un fluoróforo y el otro marcaje afecta a su fluorescencia. En el caso de que la sonda de marcaje marcada y la sonda informadora se encuentren unidas, los marcajes se encuentran en suficiente proximidad para que la señal (p.ej., la fluorescencia del fluoróforo) resulte afectada. De esta manera, al hibridar dichas moléculas, resulta afectada la señal (p.ej., la fluorescencia del fluoróforo). Sin embargo, en el caso de que dichas moléculas estén disociadas (p.ej., durante el análisis de la curva de fusión), los marcajes se separan efectivamente, de manera que la señal (p.ej., la fluorescencia del fluoróforo) no resulta afectada. De esta manera, durante el curso del análisis de la curva de fusión, al disociarse las moléculas, la señal (p.ej., la fluorescencia del fluoróforo) cambia. Lo anterior puede monitorizarse mediante la evaluación de la señal (p.ej., la fluorescencia) durante el análisis de la curva de fusión. El análisis de la curva de fusión permite la identificación tanto de si el primer y segundo marcajes se encuentran presentes juntos como de la temperatura a la que se disocian los dos polinucleótidos portadores de dichos marcajes. La presencia de ambos marcajes es indicativa de que la sonda de marcaje ha sido marcada, es decir, de que el ddNTP se ha unido a la secuencia diana.

En lugar del método de disociación basado en calor, pueden utilizarse métodos alternativos de disociación. De esta manera, por ejemplo, pueden utilizarse otros métodos de desnaturalización, tales como la utilización de NaOH, formamida o una proteína de unión de cadena sencilla, para separar la sonda de mareaje y la sonda informadora. Dichos desnaturalizantes pueden aplicarse a diferentes concentraciones o durante un curso temporal a una sola concentración. Puede aplicarse un campo eléctrico para ayudar a la desnaturalización. El avance de la desnaturalización y disociación de las dos cadenas (y, por lo tanto, los efectos sobre la señal del marcaje) puede monitorizarse según resulte apropiado mediante la evaluación de los cambios en la señal (p.ej., la fluorescencia) durante la disociación, tal como se ha indicado anteriormente. Dichos métodos pueden someterse a multiplexación, tal como se indica en la presente memoria, ya que los diferentes complejos pueden disociarse en diferentes tipos/concentraciones en dichos métodos, dependiendo de las secuencias de las cadenas que constituyen las moléculas de doble cadena.

Preferentemente, los marcajes utilizados son un fluoróforo y un inhibidor. En este caso, durante el análisis de la curva de fusión, se incrementará la fluorescencia a medida que la molécula de doble cadena se disocie y el fluoróforo se separe del inhibidor.

En un aspecto preferente, el polinucleótido de doble cadena al que se hace referencia en la presente memoria (p.ej., la molécula que debe someterse a análisis de la curva de fusión es de extremos romos y/o presenta un extremo 5' protuberante en uno de sus extremos (p.ej., puede ser que presente los dos extremos romos, presentar un extremo 5' protuberante en ambos extremos o presentar un extremo romo y un extremo 5' protuberante). En caso de hallarse presente, el extremo 5' protuberante preferentemente presenta una protuberancia de uno, dos o tres nucleótidos. En el caso de que se utilicen pares de bases no correspondientes, puede encontrarse presente un extremo 5' protuberante, así como un extremo 3' protuberante en un extremo del polinucleótido de doble cadena.

Tal como se ha indicado anteriormente, la presencia de polimerasa también elevada la temperatura de fusión de los polinucleótidos de doble cadena, conduciendo de esta manera a una falsa Tf en los métodos de análisis de la curva de fusión. Además, se ha encontrado que la polimerasa es responsable de falsos efectos FRET (p.ej., un falso efecto de inhibición positiva) sobre los marcajes fluorescentes, incluso en ausencia de otro donante de fluorescencia o molécula de inhibidor. Lo anterior presenta el efecto de producir falsos resultados en métodos en los que el nivel de fluorescencia (que puede resultar influido por la inhibición y/o la fluorescencia del donante) de un marcaje fluorescente se utiliza para identificar o cuantificar una entidad de interés, p.ej., la unión de un polinucleótido a una molécula de inhibidor en proximidad suficientemente estrecha a un polinucleótido que porta un fluoróforo para afectar a la fluorescencia de este último. Típicamente, dichos efectos pueden monitorizarse en un método de análisis de la curva de fusión. Dichos efectos pueden superarse en los métodos anteriormente indicados mediante inactivación, desnaturalización o eliminación de la polimerasa.

De acuerdo con lo anterior, la presente invención proporciona, además, un método para evitar una falsa lectura de Tf y/o falsos efectos FRET (p.ej., una falsa inhibición positiva) (preferentemente en, o comprendiendo, un método de análisis de la curva de fusión), en el que dicho método comprende la etapa de poner en contacto una polimerasa, opcionalmente dNTP y/o ddNTP, y un primer y segundo polinucleótidos que se hibridan entre sí formando un tercer polinucleótido que es un polinucleótido de doble cadena con una región de cadena sencilla opcional, en el que, en el caso de que deban evitarse falsos efectos FRET (p.ej., una falsa inhibición positiva), dicho primer polinucleótido porta un fluoróforo, en el que dicho método comprende, además, inactivar, degradar o eliminar dicha polimerasa antes de evaluar la Tf y/o efectos FRET (p.ej., antes de dicho análisis de curva de fusión, en caso de utilizarse), y/o, en el caso de que deban evitarse falsos efectos FRET (p.ej., una falsa inhibición positiva) y se utilice dNTP y/o ddNTP en dicho método de desfosforilación o eliminación de dicho dNTP y/o ddNTP y/o expulsión por competición de dicho dNTP y/o ddNTP con otro dNTP y/o ddNTP, en el que dichos términos presentan los significados proporcionados anteriormente en la presente memoria,, excepto por dicho polinucleótido de doble cadena, que preferentemente presenta el significado indicado anteriormente en la presente memoria.

Pueden evitarse falsos efectos FRET mediante inactivación, degradación o eliminación de dicha polimerasa y/o eliminando y/o expulsando por competición dicho dNTP o ddNTP. El método de evitación de falsos efectos FRET (p.ej., una falsa inhibición positiva) puede utilizarse en un análisis de curva de fusión o en otros métodos, según resulte apropiado, p.ej., en donde un incremento o reducción del nivel de fluorescencia de un marcaje fluorescente es indicativo de la presencia (o cantidad) de una molécula o secuencia diana (por ejemplo, métodos que utilizan una o más sondas o cebadores portadores de un donante de fluorescencia o inhibidor cuya proximidad al marcaje fluorescente es indicativa de la presencia (o cantidad) de la molécula o secuencia diana). Entre dichos métodos se incluyen la utilización de sondas Taqman, sondas Scorpion y balizas moleculares, por ejemplo. El análisis de la curva de fusión puede llevarse a cabo tal como se ha indicado anteriormente en la presente memoria.

En el caso de que se utilicen dNTP en el método anteriormente indicado, pueden utilizarse en sustitución (o adicionalmente a) ddNTP que podrían utilizarse alternativamente en el método. Por lo tanto, las enseñanzas proporcionadas en la presente memoria en relación a los ddNTP pueden aplicarse de manera similar a los dNTP, según resulte apropiado.

La referencia en la presente memoria a una "lectura de falso Tf' se refiere a una temperatura de fusión diferente observada al llevar a cabo experimentalmente el método respecto a un cálculo in silico, y en el que el resultado experimental puede restaurarse a la lectura de Tf correcta mediante eliminación, inactivación o degradación de la polimerasa. Lo anterior puede identificarse fácilmente de manera experimental, tal como se muestra en los ejemplos, mediante la utilización de los protocolos descritos de manera general anteriormente, para evitar la falsa lectura, p.ej., realizando el análisis de la Tf en presencia de polimerasa con o sin una proteinasa o detergente. Sin respaldo teórico, aparentemente la polimerasa presenta un efecto estabilizador e incrementa la Tf del polinucleótido de doble cadena. Dicho incremento puede ser de por lo menos 1°C, preferentemente de por lo menos 3, 4 o 5°C, p.ej., de 3 o 5-10°C. Dicha lectura podría no evaluarse directamente en dicho método, es decir, la Tf precisa puede no evaluarse o registrarse, sino que, por el contrario, podría resultar evidente a partir de un examen de la curva de fusión en la medida en que una falsa Tf, p.ej., en ausencia de un pico discernible o un pico solapado con otro pico, resulte evidente. El término "evaluar' en referencia a la Tf cubre dicha observación.

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "falsos efectos FRET" se refiere a un incremento o reducción de la fluorescencia de un marcaje fluorescente que no resulta de la presencia de una molécula de inhibidor o donante de fluorescencia. FRET, tal como se utiliza en la presente memoria se refiere, por sus siglas en inglés, a la transferencia de energía por resonancia fluorescente. De esta manera, la polimerasa podría actuar como una molécula de inhibidor o donante de fluorescencia (aunque no se identifique como tal en el sistema). Dichas alteraciones de la fluorescencia pueden ser un incremento o reducción de la fluorescencia a una temperatura y/o longitud de onda dada. El término "evaluar' en relación a efectos FRET se extiende a examinar la fluorescencia durante la totalidad o parte de dicho método.

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "falsa inhibición positiva" se refiere a alteraciones (reducciones) de la fluorescencia de un fluoróforo que no resulta de la presencia de una molécula de inhibidor. De esta manera, la polimerasa podría actuar como una molécula de inhibidor (aunque no se identifica en el sistema como una molécula inhibidora).

El método de evitación de una lectura de falsa Tf resulta particularmente eficaz en moléculas de doble cadena en las que ambas cadenas son de menos de 60 nucleótidos de longitud, preferentemente de menos de 50, 40, 30 o 25 nucleótidos, p.ej., de 10 a 20 nucleótidos de longitud. Preferentemente, dicho método comprende adicionalmente la etapa de generar el polinucleótido de doble cadena mediante la puesta en contacto de un primer y un segundo polinucleótido bajo condiciones que permite su hibridación, y preferentemente dicha etapa de inactivar, degradar o eliminar dicha polimerasa o de desfosforilar, eliminar o expulsar por competición dicho dNTP o ddNTP se lleva a cabo antes, durante y/o después de generar dicho polinucleótido de doble cadena y realizado de acuerdo con el método indicado anteriormente en la presente memoria. Convenientemente, el agente que debe utilizarse con este fin puede encontrarse presente durante la generación de la molécula de doble cadena, p.ej., puede añadirse una proteinasa o detergente simultáneamente a la generación de la molécula de doble cadena. Preferentemente, en métodos en los que también se utilizan ddNTP, el detergente o proteinasa se añade antes de la formación de la molécula de doble cadena, para evitar también la incorporación errónea de ddNTP. En particular, en el caso de la proteinasa, lo anterior preferentemente se añade cierto tiempo antes de la generación de la molécula de doble cadena, en vista de la acción lenta de la proteinasa sobre la polimerasa. Puede añadirse detergente, en caso de utilizarse, en una etapa posterior en vista de su acción rápida, p.ej., durante la formación de la molécula de doble cadena. Puede utilizarse en el método uno o más agentes adecuados para los fines anteriormente indicados.

En el caso de que se utilice dNTP o ddNTP en el método, el dNTP o ddNTP y el polinucleótido pueden marcarse tal como se ha indicado anteriormente en la presente memoria. Sin embargo, en el caso de que no se utilice un dNTP o ddNTP, dicho primer polinucleótido porta un primer marcaje tal como se ha definido anteriormente en la presente memoria y opcionalmente dicho primer o segundo polinucleótido porta un segundo marcaje tal como se ha definido anteriormente en la presente memoria. Se observan falsos efectos FRET (p.ej., una falsa inhibición positiva) incluso en presencia de un fluoróforo únicamente y, por lo tanto, puede encontrarse presente únicamente un primer marcaje en dicho método. En particular, dicho fluoróforo puede ser HEX o FAM, tal como se ha indicado anteriormente en la presente memoria.

Dicho método presenta utilidad en cualquier método en el que se lleve a cabo un análisis de curva de fusión. De esta manera, por ejemplo en métodos en los que la presencia de una molécula diana portadora de un fluoróforo (o inhibidor) se identifica o se cuantifica basándose en si su fluorescencia ha sido inhibida o no (o si inhibe la fluorescencia de un fluoróforo), que es indicativa de su unión a una molécula de ensayo, el método anterior evita falsos resultados de FRET (p.ej., falsos resultados de inhibición positiva) a partir de la presencia de polimerasa que puede encontrarse presente. Diversos métodos utilizan la inhibición de la detección de fluorescencia a los que pueden aplicarse dichos métodos de la invención, p.ej., balizas moleculares o sondas Scorpion (en los que tanto el inhibidor como el fluoróforo es portador en el ensayo/sonda), sondas Taqman y particularmente el método anteriormente indicado en el que un primer y un segundo polinucleótidos, uno de los cuales porta una molécula inhibidora y uno porta un fluoróforo, se disocian durante el calentamiento y se monitorizan los cambios de fluorescencia. En dichos métodos, se lleva a cabo la eliminación/inactivación/degradación de la polimerasa únicamente una vez se han completado sus propiedades de extensión requeridas en el método.

El método también resulta de utilidad en el caso de que los valores de Tf resultan importantes para determinaciones cualitativas o cuantitativas. Los valores de Tf correctos resultan particularmente correctos en el caso de que se contemple la multiplexación y se requiere la separación de los picos para permitir la identificación de las diferentes moléculas diana.

El efecto de la polimerasa sobre los valores de Tf también puede considerarse en métodos de diseño y realización en los que la temperatura de fusión presenta un efecto sobre el rendimiento del método o sus resultados. De esta manera, por ejemplo, en el caso de que la polimerasa se encuentre presente durante las etapas de disociación y asociación en un método, será necesario considerar sus efectos. Por ejemplo, en métodos de PCR, deberían seleccionarse las temperaturas correspondientemente para considerar las posibles Tf más elevadas de las moléculas de doble cadena que se forman durante el procedimiento. El efecto de la Tf también debería utilizarse para interpretar los resultados en los que se observan valores de Tf más altos de lo esperado.

La presente invención también permite la selección de moléculas apropiadas para la realización del método o para la evaluación del grado de influencia de una polimerasa en un método particular.

De esta manera, en un aspecto adicional, la presente invención proporciona un método para evaluar el efecto de una polimerasa sobre la temperatura de fusión (Tf) y/o FRET (preferentemente la inhibición) de un polinucleótido de doble cadena con una región de cadena sencilla opcional, en el que preferentemente dicho método es un método de análisis de curva de fusión, en el que dicho método se lleva a cabo en dos muestras y para cada muestra, el método comprende la etapa de poner en contacto dicha polimerasa, opcionalmente ddNTP y/o dNTP, y un primer y segundo polinucleótidos que se hibridan entre sí formando un tercer polinucleótido que es dicho polinucleótido de doble cadena, en el que, en el caso de que deban evaluarse efectos FRET, dicho primer polinucleótido porta un marcaje fluorescente, en el que dicho método realizado en únicamente una de dichas muestras comprende además inactivar, degradar o eliminar dicha polimerasa antes de evaluar la Tf y/o efectos FRET, y/o, en el caso de que deban evaluarse efectos FRET y SE UTILICEN dNTP y/o ddNTP en dicho método, desfosforilando o eliminando dicho dNTP y/o ddNTP y/o expulsando por competición dicho dNTP y/o ddNTP con otro dNTP y/o ddNTP, sometiendo las dos muestras a análisis de temperatura de fusión y/o análisis FRET, y evaluando si la temperatura de fusión y/o los efectos FRET difieren en las dos muestras a fin de determinar el efecto de dicha polimerasa sobre la temperatura de fusión y/o FRET de dicho polinucleótido de doble cadena, en el que preferentemente dicho polinucleótido de doble cadena y/o preferentemente el rendimiento de las etapas es tal como se ha definido anteriormente en la presente memoria. Las definiciones de la polimerasa, polinucleótidos y otras entidades utilizadas en dicho método son tal como se indica en la presente memoria.

La polimerasa que debe utilizarse en el método puede ser una polimerasa de ensayo, p.ej., una variante de una polimerasa conocida para evaluar sus efectos sobre FRET/Tf. Lo anterior puede evaluarse respecto a una polimerasa conocida, p.ej., la polimerasa a partir de la que se deriva la variante, a fin de evaluar si las variaciones resultan en cualesquiera alteraciones de los efectos de FRET/Tf. Alternativamente, el polinucleótido de doble cadena puede ser una molécula de ensayo para evaluar como su FRET/Tf resulta afectada por la acción de una polimerasa. Lo anterior puede ayudar en el diseño de moléculas para la utilización en la secuenciación y en otros métodos en los que FRET/Tf desempeña una función. Opcionalmente, el método incluye comparar los resultados obtenidos con los resultados obtenidos con una polimerasa de control o polinucleótido.

Las dos muestras que se utilizan son esencialmente idénticas (es decir, el método se lleva a cabo por duplicado), aunque únicamente una de las muestras se somete a la etapa que sirve para eliminar las falsas lecturas de FRET/Tf.

El efecto sobre Tf/FRET se evalúa mediante la medición de los efectos sobre Tf o FRET tal como se ha indicado anteriormente en la presente memoria. Se observó un efecto diferente en el caso de que la lectura de Tf fuese diferente en las dos muestras o la presencia o nivel de fluorescencia fuese diferente.

También se proporcionan según la invención kits para poner en práctica los métodos indicados en la presente memoria. Dichos kits pueden contener uno o más de los componentes siguientes: por lo menos un ddNTP marcado con un primer marcaje (en el caso de que se utilice más de un ddNTP, puede utilizarse el mismo marcaje o preferentemente puede utilizarse un marcaje diferente, tal como se ha indicado anteriormente y se indica posteriormente en la presente memoria), por lo menos un primer polinucleótido (o sonda de marcaje), por lo menos un segundo polinucleótido (o sonda informadora) marcada con un segundo marcaje (en caso de que se utilice más de un segundo polinucleótido, puede utilizarse el mismo marcaje o preferentemente puede utilizarse un marcaje diferente, tal como se ha indicado anteriormente y se indica posteriormente en la presente memoria), una polimerasa, un medio para inactivar la polimerasa (p.ej., un detergente, tal como SDS), un medio para degradar la polimerasa (p.ej., una proteinasa, tal como proteinasa K o un detergente, tal como SDS), un medio para eliminar la polimerasa (p.ej., un anticuerpo específico para esa polimerasa o perlas magnéticas acopladas con estreptavidina en el caso de que se utilicen sondas de marcaje acopladas con biotina, separándolas de esta manera respecto de la polimerasa), un medio para desfosforilar los ddNTP (p.ej., una fosfatasa, tal como fosfatasa alcalina de camarón o fosfatasa intestinal bovina), un medio para eliminar los ddNTP (p.ej., reactivos para la extracción orgánica, perlas magnéticas acopladas con estreptavidina en el caso de que se utilicen sondas de marcaje acopladas con biotina, separándolas de esta manera respecto de los ddNTP), ddNTP no marcados para expulsar por competición los ddNTP marcados, y otros reactivos útiles para la utilización en el método, p.ej., dNTP y/o ddNTP no marcados.

Dichas entidades presentan las definiciones y opciones preferentes indicadas anteriormente en la presente memoria. De esta manera, en un aspecto preferente, la presente invención proporciona un kit que comprende:

a) por lo menos un ddNTP marcado con un primer marcaje, tal como se ha indicado anteriormente en la presente memoria,

b) por lo menos un primer polinucleótido (o sonda de marcaje) tal como se ha indicado anteriormente en la presente memoria,

c) por lo menos un segundo polinucleótido (o sonda informadora) marcada con un segundo marcaje, tal como se ha indicado anteriormente en la presente memoria,

d) una polimerasa y por lo menos uno de entre:

(i) medios para inactivar la polimerasa (p.ej., un detergente, tal como SDS),

(ii) medios para degradar la polimerasa (p.ej., una proteinasa, tal como proteinasa K o detergente, tal como SDS),

(iii) medios para eliminar la polimerasa (p.ej., un anticuerpo específico para esa polimerasa o perlas magnéticas acopladas con estreptavidina en el caso de que se utilicen sondas de marcaje acopladas con biotina, separándolas de esta manera de la polimerasa),

(iv) medios para desfosforilar el ddNTP (p.ej., una fosfatasa, tal como fosfatasa alcalina de camarón o fosfatasa intestinal bovina),

(v) medios para eliminar los ddNTP (p.ej., reactivos para la extracción orgánica o perlas magnéticas acopladas con estreptavidina en el caso de que se utilicen sondas de marcaje acopladas con biotina, separándolas de esta manera de los ddNTP), y

(vi) ddNTP no marcados para expulsar por competición los ddNTP marcados,

en el que el primer marcaje o el segundo marcaje afectan a la señal generada por el otro marcaje en el caso de que los marcajes se encuentren próximos entre sí.

El primer polinucleótido o sonda de marcaje tal como se utiliza en el kit es capaz de unión a una secuencia de nucleótidos diana. Dicha secuencia diana, y por lo tanto la sonda de marcaje, puede seleccionarse basándose en la utilidad pretendida del kit. Para los fines de la presente realización, la sonda de marcaje puede ser cualquier oligonucleótido o polinucleótido para el que pueda existir una secuencia diana.

Opcionalmente, el kit puede contener además materiales estandarizantes, p.ej., ARNm o ADNc procedente de organismos normales y/o enfermos con fines comparativos, o polinucleótidos de ensayo de referencia, cebadores de amplificación y/o enzimas, tampones o soluciones apropiados. Opcionalmente, dicho kit puede contener además un impreso en el paquete que describe cómo debería llevarse a cabo el método de la invención, proporcionando opcionalmente gráficos estándares, datos o software para la interpretación de los resultados obtenidos al llevar a cabo la invención.

La utilización de dichos kits para identificar una secuencia de nucleótidos diana en un polinucleótido de ensayo, tal como se ha indicado anteriormente en la presente memoria, forma un aspecto adicional de la invención.

A título ilustrativo, se describen métodos de puesta en práctica de la invención en mayor detalle posteriormente. Aunque la invención no se encuentra limitada a dichos métodos, son aspectos preferentes indicados en la presente memoria, aspectos preferentes aplicables a todos los métodos indicados en la presente memoria.

La identificación de una secuencia de nucleótidos diana en un polinucleótido de ensayo incluye la identificación de múltiples secuencias de nucleótidos diana en un polinucleótido de ensayo. La capacidad de identificar múltiples dianas durante un único método se denomina en la presente memoria multiplexación. De esta manera, el método permite la multiplexación, de manera que puede identificarse más de una secuencia de nucleótidos diana (p.ej., más de 2, 4, 8 o 16) en un único método. Lo anterior puede llevarse a cabo mediante la utilización de diferentes marcajes que presentan señales que pueden discriminarse. De esta manera, por ejemplo en el caso de que la detección del marcaje se basa en una señal de fluorescencia, pueden seleccionarse diferentes marcajes fluorescentes que emiten fluorescencia a una longitud de onda diferente y de esta manera pueden discriminarse.

Las diferentes secuencias de nucleótidos diana que deben detectarse pueden encontrarse presentes en una única molécula de ensayo y/o en múltiples moléculas de ensayo discretas. En el caso de que se encuentren presentes en la misma molécula de ensayo, las secuencias de nucleótidos diana pueden encontrarse en el mismo sitio o en sitios diferentes en la molécula de ensayo. En el caso de que se encuentren presentes en el mismo sitio, el método se utiliza para identificar cuál de entre varias posibles secuencias se encuentra presente en el sitio, p.ej., para detectar el alelo de PNU (en este caso, pueden utilizarse ddNTP con marcaje diferente). En el caso de que la secuencia diana no se encuentre en el mismo sitio, pueden detectarse diferentes secuencias diana en un único método, p.ej., múltiples PNU. Por lo tanto, en un aspecto preferente, el método se multiplexa mediante la utilización de más de un marcaje (que presentan señales que pueden discriminarse). Dichos diferentes mareajes pueden aparecer en los ddNTP y/o polinucleótidos marcados (p.ej., las sondas informadoras). En el caso de que se utilice una pareja de mareajes y la señal de un marcaje afecte al otro en caso de encontrarse próximo, deberían seleccionarse múltiples parejas de marcajes para la multiplexación, de manera que puedan discriminarse las señales resultantes. Por ejemplo, en el caso de que se utilice un fluoróforo y un inhibidor, las señales inhibida y no inhibida resultantes de cada pareja deberían ser distinguibles de cualquier señal generada por otra pareja de marcajes. Una pareja de marcajes puede presentar un marcaje en común con otra pareja de marcajes. De esta manera, por ejemplo puede utilizarse un inhibidor común en el caso de que pueda inhibir la emisión de dos fluoróforos distinguibles y puedan discriminarse las señales inhibidas resultantes.

De esta manera, en aspectos preferentes de la invención, se utilizan preferentemente por lo menos dos ddNTP, en la que preferentemente los primeros marcajes en los diferentes ddNTP son diferentes. Entre las realizaciones preferentes adicionales se incluyen la utilización de por lo menos dos sondas informadoras (y/o por lo menos dos sondas de marcaje), en las que preferentemente los segundos marcajes en las diferentes sondas informadoras son diferentes. En particular, pueden utilizarse múltiples parejas de marcajes, en los que cada pareja de marcajes comprende un primer marcaje en un ddNTP y un segundo marcaje en una sonda informadora, en el que cada pareja de marcajes es diferente a cualquier otra pareja de marcajes, en el que preferentemente cada pareja contiene un primer y un segundo marcaje que son diferentes a cualquier primer o segundo marcaje presente en cualquier otra pareja de marcajes.

Los métodos de detección pueden permitir otros medios de multiplexación del método. De esta manera, las moléculas de doble cadena resultantes pueden discriminarse no sólo basándose en los marcajes que portan, sino también basándose en la forma de la molécula de doble cadena. Lo anterior puede estar relacionado con la secuencia, la longitud u otras características distinguibles de la molécula de doble cadena. Pueden utilizarse diferentes secuencias para proporcionar una propiedad diferente, p.ej., la capacidad de unirse a una pareja (p.ej., en los métodos basados en la afinidad) o de unir entre sí las dos cadenas de la molécula de doble cadena con mayor o menor afinidad. Por ejemplo, en el caso de que el método de detección sea mediante análisis de la temperatura de fusión, las moléculas de doble cadena utilizadas en el método pueden seleccionarse de manera que presenten diferentes temperaturas de fusión. En este caso, la sonda de marcaje y la sonda informadora constituyen la molécula de doble cadena. Estas pueden seleccionarse apropiadamente para proporcionar una temperatura de fusión (Tf) específica, p.ej., mediante su longitud o secuencia. Por ejemplo, la Tf puede incrementarse mediante la selección de secuencias más largas, un contenido de GC superior y/o una complementariedad elevada (p.ej., de por lo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100%) entre las secuencias. La Tf puede reducirse mediante la utilización de secuencias más cortas, un contenido de GC inferior y/o una complementariedad inferior a 100% (p.ej., inferior a 95%, 90% o 80%).

Los diferentes valores de Tf pueden obtenerse mediante alteración de las propiedades de las sondas informadora y/o de marcaje que se utilicen. De esta manera, en un ejemplo, pueden utilizarse parejas de sondas informadora y de marcaje para detectar cada secuencia de ensayo, en donde cada pareja es diferente de cualquier otra pareja de sondas utilizada en el método, y generar un complejo (polinucleótido de doble cadena) que puede discriminarse (p.ej., en términos de su temperatura de fusión) respecto de cualquier otro complejo formado por cualesquiera otras parejas de sondas. Sin embargo, también resulta posible proporcionar únicamente una sonda informadora (o de marcaje), aunque diversas formas de la otra sonda, de manera que pueden formarse diversos complejos, cada uno de los cuales presenta diferentes propiedades (p.ej., temperatura de fusión). En dichos métodos, los complejos se distinguirían por su marcaje y propiedades de hibridación, p.ej., la temperatura de fusión.

De esta manera, en un aspecto preferente, se utilizan por lo menos dos sondas informadoras y/o por lo menos dos sondas de marcaje y en el caso de que se hibride la sonda o sondas informadoras y la sonda o sondas de marcaje entre sí, generan por lo menos dos polinucleótidos de doble cadena con diferentes temperaturas de fusión. En un aspecto preferente, se proporcionan múltiples parejas de sondas informadora y de marcaje, en el que cada pareja de sondas es diferente de cualquier otra pareja de sondas, en donde preferentemente el marcaje de la sonda informadora en cada pareja es diferente del marcaje de la sonda informadora en cualquier otra pareja de sondas.

Las secuencias se seleccionan para proporcionar Tf que puedan distinguirse en un análisis de curva de fusión, p.ej., una diferencia de Tf de entre 0,1°C y 40°C, preferentemente de por lo menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10°C.

En un aspecto preferente, se combinan métodos de multiplexación. De esta manera, por ejemplo, en el caso de un análisis de curva de fusión, se utilizan 2 o más parejas diferentes de primer y segundo marcaje y se utilizan 2 o más temperaturas de fusión diferentes. La utilización de 2 parejas diferentes de primer y segundo marcaje y 2 temperaturas de fusión diferentes permite detectar 4 secuencias diferentes (es decir, en el caso de que se utilicen ambas parejas de marcajes en cada temperatura de fusión diferente). La multiplexación de 9 secuencias diferentes puede conseguirse fácilmente utilizando 3 parejas diferentes de marcajes y 3 temperaturas de fusión diferentes, y de esta manera sucesivamente.

De esta manera, en métodos de la invención, convenientemente, puede proporcionarse más de un ddNTP marcado con un primer marcaje (preferentemente cada ddNTP presenta un primer marcaje diferente). De esta manera, por ejemplo, puede proporcionarse cada uno de entre ddATP, ddGTp, ddTTP (o ddUTP) y ddCTP con un primer marcaje diferente. La sonda informadora (o segundo polinucleótido) entonces puede proporcionarse con cuatro segundos mareajes diferentes (tal como se ha comentado anteriormente, pueden utilizarse algunos mareajes comunes en el caso de que las señales de los mareajes todavía puedan discriminarse entre las diferentes parejas). Pueden proporcionarse múltiples sondas de marcaje (o primeros polinucleótidos) no marcados dirigidos a diferentes secuencias de nucleótidos diana, que pueden discriminarse cuando están unidos a la sonda informadora (o segundo polinucleótido). Lo anterior puede conseguirse mediante la selección apropiada de la secuencia y/o longitud de las sondas de marcaje (o primeros polinucleótidos) no marcadas y/o las sondas informadoras (o segundos polinucleótidos).

Al llevar a cabo el método de detección de secuencia, en primer lugar, debería aislarse el polinucleótido de ensayo y prepararse para la secuenciación. Puede encontrarse presente más de un tipo de polinucleótido de ensayo en el caso de que deba utilizarse la multiplexación. Opcionalmente, el polinucleótido (p.ej., ADN genómico) obtenido de una muestra puede amplificarse tal como se ha indicado anteriormente en la presente memoria, para proporcionar amplicones que contienen la secuencia diana adecuada para la utilización en el método. Pueden seleccionarse apropiadamente cebadores para proporcionar un amplicón que contiene la secuencia diana. Pueden utilizarse múltiples cebadores en el caso de que deban utilizarse múltiples polinucleótidos de ensayo y/o múltiples secuencias diana. Pueden utilizarse cebadores directos e inversos. Convenientemente, el amplicón es de entre 50 y 5000 nucleótidos de longitud, p.ej., de entre 50 y 100, tal como de entre 100 y 500 nucleótidos de longitud.

Tras una PCR, puede añadirse una nucleasa, que degrada polinucleótidos de cadena sencilla, pero no productos de extensión de doble cadena (p.ej., exonucleasa 1) y una fosfatasa (p.ej., tal como se ha indicado anteriormente en la presente memoria) para degradar los cebadores de PCR y dNTP que han sido utilizados en la reacción. A continuación, dichos enzimas necesitan tratarse para conseguir su inactivación antes de avanzar a la siguiente etapa, p.ej., el tratamiento a 85°C.

Los ddNTP marcados y la sonda o sondas de marcaje (o primer polinucleótido o polinucleótidos) no marcados se ponen en contacto con el polinucleótido o polinucleótidos de ensayo y una polimerasa bajo condiciones que permiten la incorporación del ddNTP en el caso de que se encuentre presente la secuencia diana. Tal como se ha indicado anteriormente en la presente memoria, dichos componentes pueden añadirse juntos, en tiempos diferentes o en diversas combinaciones. Al llevar a cabo la multiplexación, los diversos ddNTP y/o sondas de marcaje no marcadas también pueden añadirse juntas, o secuencialmente, o en diversas combinaciones. Las condiciones permiten la unión de la sonda de marcaje (o primer polinucleótido) no marcada a la secuencia diana, en caso de encontrarse presente, y para que se produzca la extensión en cadena de la polimerasa.

El método puede llevarse a cabo en presencia de otras moléculas, tales como dNTP. Puede utilizarse uno o más dNTP (p.ej., dATP y dCTP). En métodos de este tipo, se producirá la extensión de la cadena hasta que se incorporen los ddNTP relevantes, lo que impedirá la extensión posterior. En dichos métodos, puede añadirse el ddNTP de interés y otros dNTP para proporcionar bases complementarias para todos los posibles nucleótidos (p.ej., ddATP, dTTP, dCTP y dGTP). También pueden utilizarse ddNTP no marcados, p.ej., para ddNTP diferentes del ddNTP marcado. Lo anterior evita la incorporación incorrecta del ddNTP marcado en el caso de que no haya complementariedad. Lo anterior también puede conseguirse utilizando una sonda de marcaje con un número discreto de no correspondencias respecto a la secuencia diana, de manera que no correspondencias adicionales sean menos probablemente toleradas. Estos mecanismos ayudan a la especificidad en el método.

Convenientemente, pueden llevarse a cabo múltiples ciclos de marcaje de ddNTP para maximizar el marcaje que se consigue (es decir, para mejorar la sensibilidad). Por ejemplo, tras llevar a cabo una primera ronda de marcaje, la reacción puede calentarse para proporcionar una molécula de cadena sencilla y después enfriarse para permitir la hibridación y la repetición de la etapa de marcaje. Convenientemente, se utilizan entre 1 y 50 ciclos, p.ej., entre 1 y 20, tal como entre 5 y 20 ciclos.

Dependiendo de cómo deba llevarse a cabo el método, una vez se ha conseguido la unión covalente, los complejos pueden lavarse para eliminar las bases no unidas y/o otros polinucleótidos, particularmente en el caso de que porten el marcaje cuya señal debe detectarse, que de otro modo resultaría en lecturas de fondo elevadas. Lo anterior puede conseguirse en el caso de que, por ejemplo, la sonda de marcaje (o primer polinucleótido) porte una fracción que pueda utilizarse para la unión por afinidad, p.ej., una pareja de unión de un par de unión en el que el otro par se encuentra sobre un soporte sólido. Sin embargo, el presente método permite convenientemente llevar a cabo el método completo en solución y llevar a cabo etapas posteriores del método en presencia de los reactivos de etapas anteriores. En un aspecto preferente, el método se lleva a cabo en solución sin necesidad de que las moléculas participantes estén unidas a un soporte sólido.

Siguiendo dicha etapa, la sonda o sondas de marcaje (o primer polinucleótido o polinucleótidos) (que pueden estar no marcados o no portar un marcaje en virtud de la incorporación de un ddNTP marcado, en caso de encontrarse separado del polinucleótido o polinucleótidos de ensayo). Convenientemente, lo anterior se consigue mediante calentamientos de los complejos para causar la disociación.

A continuación, las moléculas de cadena sencilla resultantes se ponen en contacto con la sonda o sondas informadoras (o uno o más segundos polinucleótidos) portadoras del segundo marcaje bajo condiciones que permiten la hibridación de la sonda o sondas de mareaje (primer polinucleótido o polinucleótidos) con la sonda o sondas informadoras (segundo polinucleótido o polinucleótidos). En el caso de que deban utilizarse métodos de multiplexación, las diferentes sondas informadoras (o segundos polinucleótidos) pueden añadirse juntos, por separado o en diversas combinaciones. La molécula de doble cadena resultante presenta extremos seleccionados de entre romos, 3' protuberantes o 5' protuberantes, tal como se ha indicado anteriormente en la presente memoria.

Para evitar la incorporación inapropiada del marcaje ddNTP, se lleva a cabo el tratamiento para eliminar/inactivar/degradar/expulsar por competición la polimerasa/ddNTP/alargar la parte de cadena sencilla tal como se ha indicado anteriormente en la presente memoria. Dicho tratamiento puede llevarse a cabo tan pronto como se inicie la reacción de extensión de la cadena en la que se incorpora el ddNTP (o durante ese proceso). De esta manera, dicho tratamiento puede iniciarse simultáneamente a la reacción de la polimerasa de incorporación del ddNTP (con la condición de que la polimerasa no resulte inactivada inmediatamente) o puede iniciarse durante dicha reacción o inmediatamente después de la etapa de marcaje de la sonda o sondas de marcaje (primer polinucleótido o polinucleótidos) y/o puede llevarse a cabo durante y/o después de la etapa de hibridación que implica la sonda o sondas de marcaje y la sonda o sondas informadoras (primer y segundo polinucleótido). Preferentemente, dicho tratamiento se lleva a cabo después de la reacción de la polimerasa de incorporación del ddNTP y antes de la etapa de hibridación/adición de la sonda informadora (o segundo polinucleótido).

Tras el tratamiento/preparación del polinucleótido de doble cadena, se lleva a cabo el análisis para determinar si se ha unido una sonda informadora (segundo polinucleótido) a una sonda de marcaje marcada (primer polinucleótido). La señal generada por el marcaje o marcajes puede detectarse en diversos puntos durante el método. En algunos casos, únicamente puede requerirse una sola medición, en el caso de que esa medición pueda compararse con niveles de control de la señal que son indicativos de si se ha unido o no el primer y segundo polinucleótidos entre sí (p.ej., en el caso de que se realicen mediciones cuantitativas). Las mediciones pueden realizarse antes, durante y/o después de la preparación de la molécula de doble cadena (para evaluar las diferencias de señal al formarse la molécula de doble cadena). Alternativa o adicionalmente, pueden realizarse mediciones antes, durante y/o después de la disociación de la molécula de doble cadena.

Convenientemente, tal como se ha indicado anteriormente, lo anterior puede llevarse a cabo mediante la utilización del análisis de curva de fusión. En ese caso, la señal se detecta continuamente o periódicamente durante un protocolo en el que se incrementa la temperatura, causando la fusión de la molécula de doble cadena.

En métodos en los que se lleva a cabo el análisis de la curva de fusión, si se desea, el análisis de curva de fusión puede repetirse mediante enfriamiento para permitir la hibridación y repitiendo el incremento de la temperatura para permitir la disociación. Aunque preferentemente el tratamiento (para eliminar la polimerasa, etc.) se lleva a cabo antes, durante y/o inmediatamente después de la preparación de la molécula de doble cadena, en un aspecto, el tratamiento puede llevarse a cabo únicamente después de un primer análisis de curva de fusión, p.ej., después de un primer, aunque antes de un segundo análisis de curva de fusión. Lo anterior tiene algún mérito en la identificación de los falsos efectos FRET dependientes de la polimerasa (y posiblemente la unión no covalente de ddNTP) que pueden eliminarse antes del segundo análisis, permitiendo la identificación cualitativa y cuantitativa de ese falso efecto FRET (y posiblemente la unión no covalente), frente a la unión covalente de ddNTP. También pueden llevarse a cabo reacciones de control mediante la realización de los métodos anteriormente indicados, con o sin los tratamientos anteriores (p.ej., con o sin una proteasa) y/o la utilización de controles internos para evaluar (cualitativa o cuantitativamente) el grado de falsa unión de ddNTP y/o los falsos efectos FRET. Por ejemplo, en el caso de que se lleven a cabo dos análisis de curva de fusión (ver los ejemplos) y se observe inhibición durante la primera curva de fusión, pero no se observe en la segunda curva de fusión que se genera después de la eliminación/inactivación/degradación de la polimerasa, la inhibición observada en la primera curva de fusión puede atribuirse al falso efecto FRET dependiente de la polimerasa (y posiblemente cierta unión no covalente de ddNTP).

En el caso de que deba llevarse a cabo la multiplexación en un método de análisis de curva de fusión, los cambios en la señal (p.ej., la fluorescencia) se monitorizan entre temperaturas por lo menos 5°C inferiores a la Tf más baja de cualquiera de los posibles complejos y por lo menos 5°C superiores a la Tf más elevada de cualquiera de los posibles complejos a medida que se incrementa la temperatura. En el caso de que se utilice una combinación de fluoróforo:marcaje de inhibidor y ambos marcajes se unan al mismo complejo de manera que el inhibidor afecte a la señal del fluoróforo, durante la fusión, la señal de fluorescencia cambiará (se incrementará) al separarse las cadenas. Este cambio en la señal (p.ej., la fluorescencia) puede monitorizarse, p.ej., tal como se ha indicado anteriormente en la presente memoria. En el caso de que se utilice la multiplexación, puede monitorizarse la fluorescencia a más de una longitud de onda. Los resultados obtenidos pueden representarse convenientemente como la derivada del cambio de fluorescencia con la temperatura (es decir, derivada de la fluorescencia (-dF/dT)) para permitir la identificación de la Tf como un pico.

El método anterior puede llevarse a cabo en ciclos si se desea, a fin de identificar más de una secuencia diana en el polinucleótido diana, mediante la utilización del polinucleótido diana en ciclos adicionales del método utilizando diferentes sondas de marcaje y moléculas informadoras.

El método puede utilizarse convenientemente para identificar una secuencia diana en un polinucleótido de ensayo. El método puede utilizarse para identificar uno o más nucleótidos desconocidos en una secuencia diana. Lo anterior puede llevarse a cabo, por ejemplo, mediante la utilización de múltiples sondas de marcaje (primeros polinucleótidos), cada uno dirigido a diferentes secuencias contiguas (que pueden discriminarse mediante la utilización de los métodos de multiplexación indicados anteriormente), p.ej., sondas de marcaje cuyos extremos se unen dentro de un nucleótido a otro en su extremo 3'. Alternativa (o adicionalmente), pueden utilizarse sondas de marcaje que son específicas para diferentes posibles secuencias (aunque se unen en el mismo sitio en la secuencia diana) e identificarse su señal basándose en su Tf específica y/o la señal del marcaje. De esta manera, por ejemplo, puede utilizarse un juego de sondas de marcaje en el que el nucleótido 3' terminal varía, p.ej., XXXXA, XXXXT, XXXXC, XXXXG. A continuación, estas sondas pueden utilizarse en una reacción de extensión para determinar la identidad del siguiente nucleótido mediante unión de ddNTP. En el caso de que dichas sondas de marcaje puedan distinguirse (por el marcaje en la sonda informadora a la que se unen o la Tf del complejo que se forma), pueden secuenciarse dos nucleótidos durante el método. De esta manera, pueden secuenciarse/identificarse uno, dos, tres o más nucleótidos en el método utilizando los métodos de multiplexación indicado anteriormente en la presente memoria.

En caso apropiado, pueden utilizarse juegos de sondas de marcaje en los que uno o más nucleótidos son degenerados en caso de que resulte posible la variación de la secuencia, aunque no debería impedir la unión de la sonda.

Convenientemente, el método se utiliza para detectar PNU. De esta manera, en un aspecto preferente, la secuencia del nucleótido diana es un PNU. En un aspecto preferente adicional, se detectan por lo menos dos secuencias de nucleótidos diana en dicho método, preferentemente por lo menos dos PNU (p.ej., por lo menos 4, 6, 8 o 16 PNU).

En este caso, la multiplexación se lleva a cabo convenientemente para permitir la evaluación de múltiples PNU en un único ensayo y/o para evaluar la homocigosidad del PNU. En el último caso, por ejemplo, el nucleótido en cuestión puede presentar una base de adenina o una base de guanina. Se utiliza una sonda de marcaje y por lo menos dos ddNTP (ddUTP y ddCTP), cada uno de los cuales porta un marcaje diferente, en la reacción de extensión de la cadena. A continuación, se evalúa la unión del ddUTP o ddCTP basándose en su señal al generar la molécula de doble cadena. En el caso de que se encuentre que se han unido tanto ddUTP como ddCTP, el genotipo es heterocigótico para A/G, aunque si sólo se uno de entre ddUTP y ddCTP, puede identificarse un homocigoto AA o GG.

El método de la invención puede utilizarse en cualesquiera métodos en los que se requiera la detección de ácidos nucleicos, p.ej. en el diagnóstico, detección de infecciones u organismos contaminantes o patógenos, monitorización clínica, investigación forense, seguridad alimentaria y medioambiental, y monitorización, para distinguir entre diferentes tipos celulares, análisis de detección de mutaciones de polimorfismo, p.ej., en el tipado de tejidos y como herramienta general de biología molecular.

El método encuentra particular aplicación en métodos en los que debe detectarse uno o más PNU rápida y eficientemente. El análisis de PNU presenta una serie de aplicaciones diagnósticas, tales como el ensayo para predisposición genética a enfermedades en seres humanos, animales y plantas, como marcadores asociados a parámetros de cría y para la detección, tipado y cuantificación de microorganismos en muestras biológicas y ambientales. El método puede utilizarse convenientemente en métodos de diagnóstico o genotipado. A título de ejemplo, el método puede utilizarse para identificar importantes marcadores genéticos, p.ej., para identificar una propensión o riesgo de enfermedad. Por ejemplo, pueden evaluarse marcadores genéticos de relevancia para la cría del salmón. Actualmente no existen tecnologías que puedan satisfacer eficiente y económicamente las necesidades de precribado relacionado con la cría que implique un número relativamente bajo (<100) de PNU en un número muy grande de individuos (<100.000 al año). Los métodos de la invención pueden utilizarse para identificar PNU en individuos a fin de determinar el pedigrí y la presencia de importantes caracteres de cría (p.ej., la resistencia a IPN).

También pueden evaluarse los estados heterocigóticos, tal como se ha comentado anteriormente. El método también puede utilizarse en el diagnóstico, p.ej. para diagnosticar el síndrome de intestino irritable (SII) mediante el examen de marcadores microbianos. Pueden evaluarse simultáneamente hasta 60 PNU.

De esta manera, en un aspecto preferente, el método puede utilizarse para detectar PNU, en particular puede utilizarse para diagnosticar SII en la que más de una bacteria es causativa, mediante la identificación de marcadores PNU para dichas bacterias. De esta manera, en un aspecto preferente adicional, el presente método proporciona un método de diagnóstico del síndrome de intestino irritable, que comprende un método tal como se ha indicado anteriormente en la presente memoria, en el que se detectan preferentemente por lo menos dos PNU en dicho método.

El método también puede utilizarse en el genotipado. De esta manera, en un aspecto preferente adicional, la presente invención proporciona un método de genotipado de un organismo, que comprende un método tal como se ha indicado anteriormente en la presente memoria, en el que se detectan preferentemente por lo menos dos PNU en dicho método.

La figura 1 proporciona una vista general de un método preferente de la invención en el que el método se utiliza para identificar la presencia de dos PNU en un polinucleótido de ensayo (tras la amplificación) (ver la figura 1B) o la identidad del alelo de PNU (ver la figura 1C). Los métodos indicados en los Ejemplos forman aspectos preferentes adicionales de la invención.

Todas las combinaciones de las características preferentes indicadas anteriormente se encuentran contempladas, particularmente tal como se indica en los Ejemplos. A continuación, se describe la invención mediante Ejemplos no limitativos en referencia a los dibujos, en los que:

La figura 1 muestra una vista general de tecnología de diagnóstico de matrices de líquidos (LAD, por sus siglas en inglés) para el tipado de PNU. (A) Etapas principales del LAD. (B) Aplicación de LAD al tipado de PNU para identificar/cuantificar especies bacterianas. (C) Aplicación de LAD al tipado de PNU en especies no haploides. La figura 2 proporciona una demostración de la inhibición no dependiente del molde y dependiente de la polimerasa. El complementario RP 2_1_in1bFAMRevComp se inhibe con sonda de marcaje no marcada en presencia de ddCTPTAMRA y HOT TERMIPol.

La figura 3 muestra que la eliminación de ddCTPTAMRA y/o HOT TERMIPol mediante extracción con cloroformo alivia el fenómeno de falsa inhibición positiva no dependiente del molde. Se disociaron nuevamente las mismas muestras "polimerasa " mostradas en la figura 2, siguiendo la extracción con cloroformo. Observar el aparente desplazamiento de Tf en la respuesta de inhibición.

La figura 4 muestra que la proteinasa K también alivia la falsa inhibición positiva. La inhibición de RP 2_1_in1bFAMRevComp se produce en presencia del complementario no marcado Lp 2_1 LP en presencia de HOT TERMIPol en ausencia de proteinasa K.

La figura 5 muestra tecnología de LAD que incorpora el tratamiento de proteinasa K y demuestra una respuesta de inhibición basada en el molde dependiente de la dosis.

La figura 6 proporciona una indicación de una actividad de tipo transferasa terminal para HOT TERMIPol. (A)-(C). Se agruparon tres dúplex L-RP en presencia de HOT TERMIPol, ddCTPTAMRA en presencia (curvas más páidas) o en ausencia (curvas más oscuras) de proteinasa K. (D)-(F). Las muestras no tratadas con proteinasa K de A-C se trataron con proteinasa K y todas las muestras se sometieron a una segunda disociación. A y D contienen el dúplex LP Faecali / Faecali RevComp 1 FAM que forma un extremo romo en un lado y un 5' FAM-G protuberante en el otro; B y E contienen el dúplex de dos extremos romos 2_1 LP/ 2_1_in1bFAMRevComp; C y F contienen el dúplex de dos extremos romos Lp Faecali / Faecali RevComp FAM.

La figura 7 muestra que el falso efecto FRET es dependiente de la polimerasa activa sola y no requiere ddNTP-inhibidor. Las reacciones de marcaje simulado, todas sin molde y que incluían todas las combinaciones de /- LP, /- ddUTP-ATTO540Q se incubaron en primer lugar a 95°C durante 10 minutos para activar la ADN polimerasa Hot TERMIpoI. A continuación, se dividió cada reacción en dos; se añadió proteinasa K (en 1X tampón C) a un juego a una concentración final de 58 pg/ml y el otro juego recibió un volumen igual de 1X tampón C. Ambos juegos de muestras se incubaron a 56°C durante 3o min, antes de generar curvas de fusión de 30°C a 95°C. (A) el RP C313Y RP (U)FAM marcado con FAM mostró una respuesta de inhibición en las muestras que contenían su complementario LP C313Y LP (C_U) con independencia de la presencia o ausencia de ddNTP-Q, aunque únicamente en los no tratados con proteinasa K se mantuvo activa la polimerasa. (B) Se observaron resultados similares en un canal de fluorescencia diferente para RP nt821 RP (U) h Ex marcado con HEX y su complementario LP nt821 (dell 1) LP (U).

La figura 8 muestra que el tratamiento de SDS resultó tan eficaz como la proteinasa K en la reducción del desplazamiento de la Tf. (A) El LP nt821 (del11) LP (U) en primer lugar se marcó con ddUTP-ATTO540Q en presencia de molde y posteriormente se incubó a 56°C en presencia de proteinasa K (58 pg/ml en tampón C 1X), SDS (al 0,1% en 1X tampón C), BSA (58 pg/ml en 1X tampón C), o se dejó sin tratar (1X tampón C) previamente a la adición de RP nt821 RP (U) HEX y la determinación de la curva de fusión. Tanto las muestras no tratadas como tratadas con BSA que todavía incluían ADN polimerasa Hot TERMIPol activa mostraban curvas de inhibición de una Tf más elevada que las muestras tratadas con proteinasa K y las tratadas con SDS. (B) Se observaron resultados similares para el dúplex LP/RP Q204X LP (C_U)/ Q204X RP2 (C) ROX.

La figura 9 muestra que el tratamiento de SDS es tan eficaz como la proteinasa K en la reducción del falso efecto FRET. (A) Se llevaron a cabo reacciones de marcaje simulado sin molde, aunque incluían LP nt821 (del11) LP (U), ddUTP-ATTO540Q, en un volumen de 50 pl. Después, se incubaron cuatro alícuotas de 10 pl a 56°C en presencia de proteinasa K (58 pg/ml en tampón C 1X), Sd S (al 0,1% en 1X tampón C), BSA (58 pg/ml en 1X tampón C), o se dejaron sin tratar (1X tampón C) previamente a la adición de RP nt821 RP (U) HEX y la determinación de la curva de fusión. Aunque las muestras tratadas con BSA y 1X tampón C mostraron un efecto de inhibición (FRET) dependiente de la temperatura, tanto las muestras tratadas con SDS como las tratadas con proteinasa K no lo mostraron. (B) se utilizó el mismo diseño experimental que anteriormente, aunque utilizando el dúplex LP/RP E291X LP (C)/E291X RP (C) CY5 y ddCTP-ATTO612Q. En este caso, las muestras no tratadas y las tratadas con BSA mostraron un efecto de inhibición (FRET) dependiente de la temperatura, mientras que las muestras tratadas con SDS y las tratadas con proteinasa K no lo mostraron.

La figura 10 muestra que hot FIREPol, una polimerasa Taq "normal", también estabiliza los dúplex LR-RP, causando un desplazamiento de Tf. Las sondas de marcaje se marcaron con ddNTP-inhibidores utilizando el enzima desonucleotidil-transferasa terminal (Tdt; NEB) bajo condiciones de reacción estándares a 37°C durante 60 min, seguido de la inactivación del enzima a 75°C durante 30 min. A continuación, se añadió Hot FIREPol a cada reacción, se activó a 95°C durante 10 minutos antes de la adición de la RP correspondiente a una concentración final de 0,1 pM en SDS al 0,1% (en 1X tampón TdT) o en 1X tampón TdT (sin tratamiento). Las muestras no tratadas en todos los paneles (A, LP=Q204X l P (C_U) marcado con ddUTP-ATTO540Q; RP=Q204X RP2 (U) FAM), (B, LP=E226X LP (U) marcado con ddUTP-ATTO540Q; RP=E226X RP (U)YY), (C, LP=Q204X LP (C_U) marcado con ddCTP-ATTO612Q; RP= Q204X RP3 (C) ROX), (D, LP= D182N LP (C_U) marcado con ddCTP-ATTO612Q; RP= D182N RP (C) CY5) mostraron una respuesta de inhibición a una temperatura más elevada que las tratadas con SDS (polimerasa inactivada).

La figura 11 muestra que la ADN polimerasa activa también estabiliza los dúplex LP-RP no marcados, según se detecta con el fluorocromo intercalante de ADNdc, EvaGreen. Los oligo dúplex complementarios se agruparon a una concentración de 0,1 pM en 40 pl (1X tampón C, 5 U Hot TERMIPol, 1X EvaGreen) y las reacciones se dividieron en tres alícuotas de 10 pl cada una. Se añadió proteinasa K, BSA o nada a una de cada juego de tres muestras a una concentración de 58 pg/ml (en 1X tampón C), y se incubaron a 56°C durante 30 minutos antes de la determinación de la curva de fusión. (A) muestra los resultados para los dúplex ASP16/SP60, (B) ASP20/SP60, (C) ASP30/SP60 y (D) ASP60/SP60. Para todos los dúplex, las muestras tratadas con BSA y no tratadas mostraban una curva de la derivada dF/dT de Tf aparente más elevada que aquellas en las que la polimerasa se había inactivado con proteinasa K, aunque los efectos de desplazamiento de la Tf fueron más pronunciados con los dúplex más cortos en los paneles (A) y (B).

La figura 12 muestra un ensayo LAD octoplex que utiliza 4 canales con 2 temperaturas de fusión en cada canal que distingue con éxito los heterocigotos en cuatro loci polimórficos bovinos. Se generaron tres amplicones multiplexados que representaban los nucleótidos 371-480, 2329-2688 and 4787-4976 del gen MYOSTATIN bovino (número de acceso Nc_007300 de 6 de enero, 2012) a partir de las secuencias que representaban heterocigotos para los 3 PNU y un polimorfismo indel. Los amplicones tratados con Exo-SAP se utilizaron a continuación en reacciones de marcaje de LP basado en Hot TERMIPol multiplexadas que contenían tanto ddUTP-ATTO540Q como ddCTP-ATTO612Q. Los ocho RP correspondientes marcados con cuatro fluorocromos diferentes se añadieron a continuación a una concentración de 0,1 pM en SDS al 0,1% y 1X tampón C. (A) muestra dos señales de inhibición de diferentes temperaturas de fusión en el canal FAM; (B) las correspondientes dos señales en el canal de amarillo Yakima (y Y), de manera similar para tanto el canal ROX (C) como el canal CY5 (D), proporcionando de esta manera el genotipo correcto de un heterocigoto cuádruple. El control negativo sin molde (sin flecha) no muestra señal de inhibición en ninguno de los paneles.

Ejemplos

Ejemplo 1

Materiales y métodos

Generación de moldes para el marcaje de LP

Los plásmidos que incluían secuencias de ARNr 16S de E. coli o Faecalibacterium spp. se utilizaron en reacciones en cadena de la polimerasa para generar moldes para el marcaje con sonda de marcaje (LP). Brevemente, se añadió 1 pl de un lisado de bacterias que alojaban el clon del plásmido, a los componentes de reacción siguiente: 1,25 U de ADN polimerasa HOT FIREPol®, 1X tampón B2, MgCh 2,5 mM (todos de Solis Biodyne, Estonia), dNTPs 0,1 mM (Thermo Fisher Scientific, EE.UU.), cebador HU 0,2 pM y cebador HR 0,2 pM (ver la Tabla 3 para las secuencias de los cebadores) en un volumen total de 30 pl. Se llevó a cabo la amplificación por PCR utilizando un ciclador térmico Veriti™ de Applied Biosystems (Life Technologies, EE.UU.) y se incluyó una etapa de activación inicial de 12 minutos a 95°C, seguido de 30 ciclos de 30 segundos de desnaturalización a 95°C, 30 segundos de hibridación a 65°C y alargamiento a 72°C durante 1 minuto y 30 segundos; también se incluyó una etapa de alargamiento final a 72°C durante 7 minutos. Los productos de PCR se visualizaron bajo iluminación de UV tras la electroforesis de 5 pl de cada reacción en geles de agarosa al 1% que contenía 1X tampón TAE y 0,6 pg/ml de bromuro de etidio. A los 25 pl remanentes de cada reacción, se añadieron 3 U de exonucleasa I (Exol; BioLabs Inc., Ipswich, MA, EE.UU.) y 8 U de fosfatasa alcalina de camarón (USB Corporation, Cleveland, OH, EE.UU.) antes de la incubación a 37°C durante 90 min, 80°C durante 15 min, antes de dejarlos sobre hielo.

Marcaje terminal de cebadores

Se añadieron cuatro pl de una serie de dilución (sin dilución, y dilución 10-1, 10'2, 10'3 y 10'4) de molde producto de PCR tratado con SAP (o H2O como control sin molde) a 16 pl de mezcla maestra de reacción de marcaje para un volumen total de reacción de 20 pl [5 U de ADN polimerasa h Ot TERMIPol®, 1X tampón de reacción C, MgCh 1 mM (todos de Solis Biodyne), ddCTPTAMRA 0,4 pM (ddeoxicitidina trifosfato marcada con TAMRA; Jena Bioscience, Alemania) y LP 0,1 pM (Tabla 3) en agua libre de ADNasa/ARNasa]. Las condiciones de termociclado fueron: etapa de activación inicial durante 10 a 12 minutos a 95°C, seguido de 10 ciclos de 30 segundos de desnaturalización a 96°C, una etapa de hibridación y alargamiento combinados de 1 minuto a 60°C y un tiempo de retención final a 10°C. Análisis de curva de fusión

A cada reacción de marcaje de LP se añadió una sonda informadora (RP) marcada fluorescentemente en 5' a una concentración final de 0,05 a 0,1 pM en presencia o en ausencia de proteinasa K (concentración final: 25 a 50 pg/ml). Las reacciones se introdujeron en un termociclador detector de fluorescencia (ABI 7500 Fast, Applied Biosystems) con el perfil de temperaturas siguiente: 56°C durante 30 minutos, 95°C durante 15 segundos, 40°C durante 15 s, 95°C durante 15 s y 60°C durante 15 s. Estas últimas cuatro etapas comprendían la etapa de disociación, en la que se detecta fluorescencia y se expresa en curvas de disociación como la derivada (dF/dT) de la fluorescencia vs. mediciones de la temperatura.

Extracción orgánica para eliminar la inhibición falsa positiva

En un experimento, se llevó a cabo una extracción con cloroformo (1:1 v/v) en la reacción de la curva de fusión tras la disociación inicial antes de llevar a cabo una segunda disociación (tal como se ha indicado anteriormente) para evaluar el efecto de la extracción.

Tratamiento de proteinasa K para eliminar la inhibición falsa positiva

Inicialmente, se añadió proteinasa K a una concentración final de 25 a 50 pg/ml simultáneamente a la sonda informadora antes del análisis de disociación. Después, se elevó la concentración a 100 pg/ml y se dejó que transcurriese el tratamiento con el enzima durante 30 minutos a 56°C antes de la adición de la sonda informadora. Además, las muestras sometidas a análisis de curva de fusión que no habían sido tratadas con proteinasa K se trataron seguidamente con el enzima antes de una segunda disociación.

Análisis de actividad de tipo transferasa terminal de la ADNpolimerasa HOT TERMIPol

Al someter a ensayo las interacciones entre los dúplex LP-RP y la ADN polimerasa HOT TERMIPol en presencia de ddCTPTAMRA, las reacciones se configuraron tal como anteriormente, con la polimerasa en 1X tampón C, el ddCTPTAMRA y MgCl2. Dichas reacciones se sometieron en primer lugar a 95°C durante 10 a 12 minutos para activar la polimerasa antes de añadir LP y dividir las reacciones en dos: una que recibió proteinasa K (50 pg/ml de concentración final) antes de la incubación durante 30 minutos a 56°C. A continuación, se añadieron RP correspondientes y las reacciones se dividieron adicionalmente en dos: un juego para la disociación, tal como anteriormente, y el otro para la electroforesis capilar (ver a continuación).

Electroforesis capilar

Con el fin de evaluar el marcaje basado en HOT TERMIPol covalente de oligonucleótidos (LP y/o RP) con ddCTPTAMRA en presencia o en ausencia de molde de marcaje (producto de PCR tratado con ExoSAP), oligonucleótidos complementarios o tratamiento de proteinasa K, reacciones de curva de fusión se trataron en primer lugar con fosfatasa intestinal bovina (CIP) para eliminar los grupos fosfato de ddCTPTAMRA no incorporado antes de someterlo a electroforesis capilar en un analizador genético ABI 3130xl (Applied Biosystems, EE.UU.) utilizando DyeSet G5, con o sin un estándar de tamaño GSLIZ120, en el que se detectó el marcaje TAMra coom el pigmento amarillo (NED) de dicho juego de pigmentos.

Resultados y comentario

La figura 1 muestra un ejemplo de un método que utiliza la tecnología de tipado de PNU de diagnóstico de matrices de líquidos (LAD). Brevemente, moldes que incluían cada PNU se amplificaron por PCR en multiplex a partir de ADN genómico (en aras de la simplicidad, la figura 1 muestra únicamente uno sólo de dichos moldes/PNU). Tras el tratamiento con exonucleasa I (Exo I) y fosfatasa alcalina de camarón (SAP) para eliminar los cebadores de PCR y los dNTP, respectivamente, se utilizó el producto de PCR como molde en una reacción de extensión de nucleótidos individuales utilizando ddNTP marcados con inhibidor complementarios a las variantes de PNU para marcar una sonda de marcaje (LP) que se hibrida con el molde en su extremo 3' inmediatamente contiguo al PNU. Para someter a ensayo el marcaje de LP, se añadió una sonda informadora (RP) marcada fluorescentemente en 5' complementaria y se llevó a cabo un análisis de curva de fusión; la inhibición dependiente de la temperatura y específica de fluorocromo indica marcaje de LP. Dicho método puede utilizarse para tipar PNU específicos de especie a fin de cuantificar la especie bacteriana presente en una muestra (figura 1B) o para tipar los alelos de PNU en especies no haploides (figura 1C). La utilización de dúplex de LP-RP de longitudes diferentes (Tf) para cada uno de varios canales de detección de fluorocromo incrementa el grado de multiplexación, permitiendo el tipado de 20 a 30 PNU en cada muestra.

Inhibición de falsos positivos y su reducción

Los experimentos iniciales de los presentes inventores desarrollaron la tecnología para cuantificar la presencia de especies bacterianas implicadas en la amplificación de secuencias de ADNr 16S para la utilización como molde para marcar terminalmente LP específicos de especie contiguos a una G en la cadena de molde. Estos experimentos utilizaron lisados de transformantes que alojaban plásmidos que contenían secuencias de ADNr 16S de E. coli y Faecalibacterium spp., y se utilizaron cebadores de PCR específicos de plásmido (HU y HR, ver la Tabla 3) para evitar la amplificación de secuencias del huésped bacteriano. Tal como se muestra en la figura 2, los presentes inventores inesperadamente observaron una relación inversa entre la cantidad de molde y la respuesta de inhibición, rindiendo el control "no molde" el mayor grado de inhibición. Además, con independencia de la concentración del molde, todas las respuestas de inhibición requirieron la presencia de la polimerasa. Los dúplex de cebador LP-RP se diseñaron de manera que el marcaje de LP crease una protrusión de 3' ddCTPTAMRA próxima al marcaje informador al formar dúplex con su RP respectivo; de esta manera, los dúplex de LP con RP no marcados formarán extremos romos (ambos extremos) de manera que no pueda producirse extensión del cebador falsa positiva dirigida por RP por la polimerasa todavía activa durante el análisis de la curva de fusión. Con el objetivo de someter a ensayo sin la polimerasa se estaba uniendo tanto al dúplex LP-RP no marcado como a ddCTPTAMRA, anclando de esta manera el inhibidor en proximidad al fluorocromo informador, los presentes inventores llevaron a cabo una extracción simple con cloroformo de las muestras positivas para inhibición de la figura 2. Tal como se muestra en la figura 3, la extracción orgánica aparentemente redujo el fenómeno de inhibición falsa positiva, revelando una respuesta de inhibición dependiente de la dosis de molde, aunque la Tf de la respuesta de inhibición se redujo de aproximadamente 72°C antes de la extracción orgánica (figura 2) a aproximadamente 66°C después (figura 3). Es probable que el cloroformo distribuya ddCTPTAMRA a la fase orgánica debido a la naturaleza hidrofóbica del marcaje TAMRA; algo de la polimerasa también podría haberse distribuido de manera similar. Este resultado también podría explicarse por un falso efecto FRET que resulta directamente de la polimerasa.

Como alternativa a la extracción orgánica, en concordancia con la observación de que el efecto falso positivo era enteramente dependiente de la polimerasa, los presentes inventores decidieron someter a ensayo si la inclusión de la etapa de proteinasa K para inactivar la polimerasa podía sustituir la extracción con cloroformo. La LP 2_1 y RP 2_1_in1bFAMRevComp (ver la Tabla 3 para las secuencias) se agruparon en presencia de ddCTPTAMRA y en presencia/ausencia de tanto la ADN polimerasa HOT TERMIPol como proteinasa K. Para permitir que la proteinasa K inactivase la polimerasa, se incluyó una incubación de 30 minutos a 56°C después de la activación de la polimerasa, aunque antes de la generación de la curva de fusión. Únicamente la muestra que incluía la polimerasa sin proteinasa K mostró una respuesta de inhibición (figura 4). No se observó inhibición falsa positiva en muestras sin polimerasa o después de haber sido tratadas con proteinasa K.

Mediante la utilización del tratamiento de proteinasa K para evitar el efecto falso positivo, los presentes inventores a continuación llevaron a cabo un nuevo ensayo del método LAD del propio laboratorio. La figura 5 muestra que, al incluir el tratamiento de proteinasa K antes de la disociación de LP-RP, el método LAD muestra un marcaje dependiente de la dosis de molde de la sonda de marcaje que rinde la respuesta de inhibición diferencial correspondiente; las muestras de control sin molde o ADN polimerasa no mostraron inhibición, tal como se esperaba.

La inhibición falsa positiva aparentemente implica actividad de tipo transferasa terminal

Aunque la inclusión de un tratamiento de proteinasa K para inactivar la polimerasa redujo el efecto falso positivo, permitiendo que el método LAD de los presentes inventores funcionase con éxito, los presentes inventores deseaban explorar el mecanismo subyacente al efecto falso positivo para proporcionar información que afectase a los parámetros de diseño del dúplex de sondas LP-RP. Para investigar si el mecanismo subyacente al efecto falso positivo posiblemente implicaba una adición covalente de ddCTPTAMRA, se llevó a cabo el experimento siguiente. Se introdujeron dos parejas de dúplex LP-RP (LP 2_1 / RP 2_1_in1bFAMRevComp y LP Faecali / Faecali RevComp FAM), cada uno de los cuales formaba dobles extremos romos y una tercera en la que RP formaba un extremo protuberante 5'-FAM-G en un extremo al formar dúplex con su LP complementario (LP Faecali / Faecali RevComp 1 FAM), cada una en una mezcla de reacción que contenía ADN polimerasa HOT TERMIPol activada, ddCTPTAMRA, tampón/MgCl2, con y sin proteinasa K. Las muestras en primer lugar se incubaron a 56°C durante 30 minutos; después se sometieron a análisis de curva de fusión. Las muestras no tratadas con proteinasa K a continuación se trataron con proteinasa K antes de disociar otra vez ambos grupos de muestras. Los primeros dos dúplex de extremos romos representan los utilizados en LAD, mientras que el tercero, con una G 5'-protuberante, se creía que funcionaba como control positivo para la actividad de extensión de cebador de la polimerasa, ya que el ddCTPTAMRA debería incorporarse frente a este residuo por la actividad 5'->3' polimerasa del enzima.

La figura 6 y la Tabla 4 resumen los resultados de estos experimentos. Tal como se muestra en la figura 6A-C (curvas más oscuras con picos en >70°C), los tres dúplex mostraban una respuesta de inhibición al dejar sin tratar con proteinasa K. Además, el dúplex de control positivo (dúplex 3 en la Tabla 4, que incluye la G 5'-protuberante) también mostró inhibición en la muestra tratada con proteinasa K (curva más pálida en la figura 6A, con pico en <70°C), mientras que los otros dúplex tratados con proteinasa K no la mostraban (las curvas más pálidas no mostraban picos, figuras 6B y C; dúplex 1 y 2 en la Tabla 4). La segunda disociación después del tratamiento de proteinasa K de las muestras previamente no tratadas revelaron resultados esperados para el dúplex de control positivo 3, es decir, ambas muestras mostraron una respuesta de inhibición (figura 6D), aunque la muestra de primera disociación no tratada con proteinasa K mostró inhibición con una Tf reducida similar a la de la muestra previamente tratada con proteinasa K de la primera disociación. Ninguna de las muestras de dúplex LP/RP 2_1 de doble extremo romo (Tabla 4) mostró inhibición (figuras 6B y 6E), mientras que la muestra de dúplex LP/RP Faecali de doble extremo romo (Tabla 4) que había mostrado inhibición durante la primera disociación (en caso de no tratarse con proteinasa K, figura 6C) continuó mostrando una inhibición significativa, aunque reducida, durante la segunda disociación, tras el tratamiento de proteinasa K, también, con una reducción aparente de la Tf (figura 6F).

Los resultados del dúplex de control positivo indican que el tratamiento de proteinasa K antes de la primera disociación no resultó suficiente para inhibir la extensión de LP dirigida por polimerasa con ddCTPTAMRA, mientras que la inactivación eventual por proteinasa K en ambas muestras conduce a una Tf aparentemente reducida de la respuesta de inhibición. El hecho de que ninguna de las muestras 2_1 de doble extremo romo mostrase inhibición en la figura 6E indica que este dúplex no resultó modificado covalentemente con ddCTPTAMRA por la polimerasa y que otro mecanismo subyace a la inhibición observada en la primera disociación de este dúplex (figura 6B). Los resultados para el dúlex de doble extremo romo 2 (LP Faecali / Faecali RevComp FAM) sugiere que, en ausencia de tratamiento de proteinasa K, la polimerasa era capaz de una adición no dependiente del molde de ddCTPTAMRA a uno o ambos extremos 3' del dúplex. Estos resultados apuntan a varios efectos de la ADN polimerasa HOT TERMIPol de tipo Thermosequenase en presencia de ddCTPTAMRA La polimerasa puede incluir actividad de transferasa terminal que puede añadir ddCTPTAMRA a dúplex seleccionados de extremos romos, aunque no a otros, indicando quizá una especificidad o preferencia de secuencia terminal de dicha actividad. (es conocido que ADN polimerasas seleccionadas, algunas de las cuales son termoestables, son capaces de ejercer una actividad de polimerasa independiente de molde, añadiendo un único 3' dAMP a dúplex de extremos romos (Clark, Nucleic Acids Research, 16:20, p9677-9686, 1988k), un hecho que ha sido ampliamente aprovechado en la clonación de T/A de amplicones por PCR. Sin embargo, lo anterior no ha sido observado para ddNTP).

La polimerasa también puede, en presencia de ddCTPTAMRA, dirigir una respuesta de inhibición falsa positiva de un RP marcado fluorescentemente cuando se encuentra en un dúplex con un LP no marcado complementario. En tercer lugar, la polimerasa presenta un aparente efecto de estabilización de los dúplex inhibidos, con independencia de la naturaleza de la unión/anclaje de ddCTPTAMRA; la inactivación de la polimerasa reduce la Tf de la respuesta de inhibición.

Estos resultados son inesperados en vista de las observaciones de Clark (1988, supra), quien encontró que los dúplex oligonucleótidos de extremos romos podían marcarse eficientemente con dATP mediante una actividad de desoxirribonucleotidiltransferasa terminal (TdT) no dependiente de molde de las ADN polimerasas termoestables; un marcaje similar con dGTP era mucho menos eficiente y prácticamente indetectable para dTTP y dCTP.

Verificación de la actividad de tipo TdT de HOT TERMIPol

En el experimento anterior, únicamente uno de los dos dúplex de extremos romos se marcó con la actividad de tipo TdT, posiblemente indicando una especificidad de contexto de secuencia de dicha actividad. Además, la proteinasa K se añadió simultáneamente con la sonda informadora, considerando la actividad de polimerasa anterior a la activación completa por la proteinasa K. La detección de la actividad de tipo TdT también era indirecta, basándose en la observación de la inhibición durante la generación de la curva de fusión. Los presentes inventores deseaban someter a ensayo el potencial marcaje basado en HOT TERMIpol de un tercer dúplex de LP-RP de doble extremo romo directamente mediante detección del marcaje de fluorescencia de oligonucleótidos mediante electroforesis capilar. Con el fin de determinar la dependencia de la polimerasa de cualquier marcaje de este tipo, los presentes inventores trataron las reacciones que contenían polimerasa activada con proteinasa K antes de la adición a RP. El resumen de estos experimentos se muestra en la Tabla 5. En presencia de ADN polimerasa HOT TERMIPol activa (es decir, en ausencia del tratamiento de proteinasa K), ambos oligonucleótidos del dúplex 4 mostraban un marcaje independiente del molde con ddCTPTAMRA y el dúplex mostraba las respuestas correspondientes de inhibición falsa positiva y de desplazamiento de la Tf. Debe indicarse que el dúplex también mostraba una respuesta de inhibición de fondo incluso al tratarlo con proteinasa K. El extremo 3' del LP en dicho dúplex contenía dos bases guanina terminales que presentan una actividad de inhibición intrínseca conocida (Marras et al., Nucleic Acids Research, e122, 2002; Seidel et al., J. Phys. Chem., 100, p5541-5553, 1996).

Estructuras de dúplex alternativas para evitar la actividad de tipo Tdt de HOT TERMIPol

Los presentes inventores demostraron que una nueva actividad de tipo TdT de laADN polimerasa HOT TERMIPol que pueda añadir un único ddCTP a los extremos de los dúplex oligonucleótidos de extremos romos. Además, la evidencia soporta la capacidad de la polimerasa activa de, mediante un mecanismo desconocido, anclar ddCTPTAMRA no incorporado en un dúplex que incluye un marcaje fluorescente, generando de esta manera una respuesta de inhibición dependiente de la temperatura que también muestra una Tf incrementada, indicativa de un efecto estabilizador de dúplex de la polimerasa. Lo anterior también puede resultar de falsos efectos FRET directos dependientes de polimerasa. Colectivamente, dichos efectos pueden superarse mediante la inclusión de una etapa de inactivación de polimerasa (mediante tratamiento con proteinasa K) antes del análisis de la curva de fusión.

Con el objetivo de reducir algunos o todos estos efectos, los presentes inventores evaluaron estructuras alternativas de dúplex que contenían combinaciones de extremos no complementarios 5' protuberantes y/o 3' protuberantes, algunos de los cuales se marcaron con un fluorocromo informador, y se sometieron a ensayo sus comportamientos de marcaje de ddCTPTAMRA y de inhibición dependiente de la temperatura en presencia de ADN polimerasa HOT TErMIPol activa o inactiva.

Tal como se muestra en la Tabla 6, ninguno de los oligonucleótidos de los dúplex 5 a 9 que forman protrusiones 5' T (una o dos T en presencia o en ausencia de un marcaje FAM) o protrusiones 3' C o G resulta marcado con ddCTPTAMRA en presencia o en ausencia de ADN polimerasa activa. La presencia de una protrusión 5' que contiene T marcado con FAM (dúplex 5) en cierta medida redujo el efecto de inhibición intrínseca de doble G de LP no marcado en ausencia de polimerasa activa en comparación con el del dúplex 4 (Tabla 5). La extensión de la distancia entre dichas dos bases G de LP y el marcaje 5' FAM en el dúplex 7 redujo adicionalmente dicho efecto. En presencia de polimerasa activa, no tratada con proteinasa K, ambos dúplex 5 y 7 mostraron una inhibición incrementada, una combinación del efecto de doble G y el falso efecto positivo de anclaje de ddCTPTAMRA y/o falso efecto FRET dependiente de polimerasa en el caso del dúplex 5, y menos del primero y más del segundo para el dúplex 7; ambos mostraron el correspondiente desplazamiento de la Tf. El dúplex 8 presentaba el marcaje fAm situado más próximo a las dos guaninas y rindió un efecto de inhibición de doble G correspondientemente incrementado.

Inesperadamente, la presencia de polimerasa activa ni incrementó la inhibición mediante el efecto de falso positivo, ni estabilizó el dúplex significativamente según el escaso incremento de la Tf. Este resultado podría indicar que la polimerasa muestra una unión reducida a los extremos del dúplex que alojan un extremo 5' cohesivo.

Los resultados de la Tabla 6 son consistentes con la visión de que los dúplex de cebador que contienen un LP con un extremo 3' rico en G presentarán propiedades intrínsecas de inhibición y la extensión del extremo 5' marcado con fluoróforo informador del RP correspondiente con una base (o dos, es decir, T) no complementaria al marcaje ddCTPTAMRA aparentemente redujo dicho efecto de inhibición mediado por G, aunque aparentemente no afectó al efecto de inhibición falso positivo causado por polimerasa activa en presencia de ddCTP marcado, tal como se observó para el dúplex 8. Las diferencias de comportamiento de inhibición falsa positiva de los dúplex podrían explicarse en la potencial diferencia en las eficiencias de unión de la polimerasa activa al extremo del ADNdc que contiene un rebaje 5' vs. una protrusión 5', incluso con una base que es no complementaria al dideoxinucleósido trifosfato libre.

Los presentes inventores deseaban someter a ensayo sin la inclusión de protrusiones 5' de LP que incluían una base no complementaria en el dúplex con RP que contenían protrusiones 5' similares o un rebaje 5' podían reducir adicionalmente el efecto de falso positivo. Tal como se muestra en la Tabla 7, los extremos 3' de los RP en dúplex con un LP que contiene una protrusión 5' T inesperadamente resultaron marcados con ddCTPTAMRA en presencia de polimerasa activa, tal como se verificó mediante electroforesis capilar (EC). La no observación de una extensión 3' similar de los LP frente a las extensiones de T de 5' RP (dúplex 10 a 12, Tabla 7, y dúplex 5 a 7, Tabla 6) podría indicar una especificidad de contexto de secuencia del extremo 3' para esta actividad; la presencia de un marcaje FAM en estos RP 5' aparentemente no explica dicha discrepancia al considerar los resultados para los dúplex 11 (Tabla 7) y 6 (Tabla 6). La evaluación del efecto de falso positivo de los dúplex en la Tabla 7 resultaba confundida por el efecto de doble G de fondo y el potencial de que un marcaje 3' TAMRA sobre RP ejerciese una inhibición intramolecular del marcaje FAM en su extremo 5'. Además, el agotamiento de ddCTPTAMRA no incorporado debido al marcaje de 3' RP también podría esperarse que redujese la inhibición falsa positiva por la polimerasa activa y/o la eliminación de la polimerasa para evitar los falsos efectos FRET dependientes de polimerasa. Estos efectos podrían ser más profundos en el dúplex 13, que mostró el mayor grado de marcaje de 3' RP de todos los dúplex analizados mediante EC (datos no mostrados) y en los que la distancia entre las fracciones 3'-TAMRA y 5'-FAM en el RP doblemente marcado es la más pequeña.

Conclusiones preliminares respecto a los dúplex de LAD óptimos y los tratamientos predisociación

A partir de los resultados presentados en la presente memoria, especialmente con respecto a las actividades de extensión de cebador de tipo TdT y no complementario hasta ahora no documentadas de la ADN polimerasa HOT TERMIPol de tipo Thermosequence, además de los efectos de falso positivo y de desplazamiento de Tf que se producen durante la disociación de dúplex con independencia de dichas actividades, los presentes inventores pueden resumir las características importantes de los dúplex de LAD óptimos.

1. Los LP no marcados en el dúplex con RP marcados con informador 5' deberían generar rebajes 5' de una sola base en ambos extremos. Los extremos romos presentan el potencial de resultar marcados por la actividad de tipo TdT de la polimerasa (dúplex 2 y 4 en las Tablas 4 y 5, respectivamente). Los dúplex que contienen protrusiones 5' complementarias al ddNTP deben evitarse, ya que corren el riesgo de resultar marcados por la actividad de extensión de cebador de la polimerasa. Dichas protrusiones también deberían evitarse, incluso cuando son no complementarias al ddNTP debido a la actividad de extensión de cebador no complementario de la polimerasa documentada en la presente memoria (dúplex 10 a 14).

2. Pueden diseñarse LP contiguos a cualquiera de los lados de un PNU y, en caso posible, deberían diseñarse para evitar guaninas en el extremo 3' para limitar sus efectos intrínsecos de inhibición. De manera similar, los RP pueden marcarse en 5' con un fluorocromo informador y deben evitarse las guaninas 5' en lo posible. No hay requisitos absolutos para que el método LAD funcione con éxito al medir la diferencia en la inhibición dependiente de la temperatura entre dúplex en los que el LP resulta extendido por el ddNTP acoplado a inhibidor vs. aquellos en los que el LP se mantiene sin marcar.

Debería indicarse que los dúplex de cebador que alojan extremos 5' rebajados probablemente también se verán sometidos a efectos de falso positivo y de desplazamiento de Tf de la polimerasa activa con independencia de si el ddNTP acoplado a inhibidor se encuentra presente o no. Los resultados del dúplex 8 sugieren que la polimerasa podría unirse a los extremos de ADNdc rebajados en 5' menos eficientemente que los extremos romos o los extremos 3' rebajados, reduciendo de esta manera los efectos de falso positivo y de desplazamiento de Tf. Dichos efectos podrían evitarse mediante inactivación de la polimerasa con el tratamiento de proteinasa K antes de la adición de RP y la disociación (tal como se ha indicado anteriormente). Lo anterior también puede utilizarse para dúplex con extremos romos y/o 3' rebajados, tanto para reducir efectos de falso positivo y de desplazamiento de la Tf, como también para evitar el marcaje de los dúplex predisociación por actividades de tipo TdT o de extensión de cebador de la polimerasa.

Los tratamientos alternativos para reducir el efecto de falso positivo pueden ser para tratar la muestra post-marcaje de LP con una fosfatasa para inactivar el ddNTP acoplado a inhibidor, o para añadir ddNTP no marcados para expulsar por competición el ddNTP acoplado a inhibidor, tal como se indica en la presente memoria. Para reducir los efectos de falso positivo y de desplazamiento de Tf, podría añadirse un anticuerpo anti-ADN polimerasa que reaccione cruzadamente con HOT TERMIPol a las muestras antes de la adición de RP y la disociación.

Tabla 3. Nombres y secuencias de cebadores (el marcaje FAM fluorescente está indicado en los extremos 5')

Nombre de cebador Secuencia (5'-3')

2_1 LP CAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGAT 2_1_in1bFAMRevComp FAM-ATCTCTACGCATTTCACCGCTACACCTG

Faecali LP CGTAGTTAGCCGTCACTTC

Faecali RevComp 1 FAM FAM-GGAAGT GACGGCT AACT ACG

Faecali RevComp FAM FAM-GAAGT GACGGCTAACTACG

LAD LP GP2 GAGCTGGGGTAGCAGG

LAD LP GP2 -1(5') AGCTGGGGTAGCAGG

LAD LP GP25'T TGAGCTGGGGTAGCAGG

LAD RP1 GP2atda -1 CTGCTACCCCAGCTC

LAD RP1 GP2atda -1 FAM FAM-CTGCTACCCCAGCTC

LAD RP1 GP2atda 1T TCCTGCTACCCCAGCTC

LAD RP1 GP2atda 1T FAM FAM-TCCTGCTACCCCAGCTC

LAD RP1 GP2atda 2T FAM FAM-TTCCTG CTACCCCAGCTC

LAD RP1 GP2atda 0 FAM FAM-CCTGCTACCCCAGCTC

HR GCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGG HU CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACG

Tabla 5. Verificación del mareaje de extremos romos de los dúplex oligonucleótidos por HOT TERMIPol (los círculos negros representan los marcajes FAM y los círculos moteados indican sitios de marcaje covalente de ddCTPTAMRA que puede explicar el comportamiento de inhibición observado).

Tabla 7. Mareaje no basado en el molde de extremos 3' rebajados frente a base no complementaria 5' protuberante (los círculos negros representan los marcajes FAM y los círculos moteados indican sitios de marcaje covalente de ddCTPTAMRA que puede explicar el comportamiento de inhibición observado)

Ejemplo 2

Materiales y métodos

Generación de moldes para el mareaje de LP

Los plásmidos que alojan secuencias de MYOSTATIN (MSTN) bovino se utilizaron en reacciones en cadena de la polimerasa para generar moldes para el marcaje con sonda de marcaje (LP). Brevemente, se añadieron 100 pg de ADN plasmídico a los componentes de reacción siguientes: 1,25 U de ADN polimerasa HOT FIREPol®, 1X tampón B2, MgCl21,5 mM (todos de Solis Biodyne, Estonia), dNTPs 0,1 mM (Thermo Fisher Scientific, EE.UU.), cebador de sentido (SP) 0,1-0,2 pM y cebador antisentido 0,1-0,2 pM (ASP; ver la Tabla 8 para las secuencias de los cebadores) en un volumen total de 30 pl. Se llevó a cabo la amplificación por PCR utilizando un ciclador térmico Veriti™ de Applied Biosystems (Life Technologies, EE.UU.) y se incluyó una etapa de activación inicial de 10 minutos a 95°C, seguido de 30 ciclos de 30 segundos de desnaturalización a 95°C, 30 segundos de hibridación a 50-60°C y alargamiento a 72°C durante 1 minuto y 30 segundos; también se incluyó una etapa de alargamiento final a 72°C durante 7 minutos. Los productos de PCR se visualizaron bajo iluminación de UV tras la electroforesis de 5 pl de cada reacción en geles de agarosa al 1% que contenía 1X tampón TAE y 0,6 pg/ml de bromuro de etidio. A los 25 pl remanentes de cada reacción, se añadieron 3 U de exonucleasa I (Exol; BioLabs Inc., Ipswich, MA, EE.UU.) y 8 U de fosfatasa alcalina de camarón (USB Corporation, Cleveland, OH, EE.UU.) antes de la incubación a 37°C durante 90 min, 80°C durante 15 min, antes de dejarlos sobre hielo.

Tabla 8. Nombres y secuencias de los cebadores. Se indican los marcajes de FAM fluorescente, HEX, amarillo Yakima (YY), ROX y CY5 de las sondas informadoras. Las letras en minúscula pueden indicar no correspondencias intencionadas o nucleótidos modificados (pdU, pdC o 5Me-C) utilizados para conseguir una buena resolución de Tf entre señales de inhibición en un canal de fluorescencia dado.

(continuación)

Mareaje terminal de cebadores

Se añadieron cuatro |jl de molde de producto de PCR tratado con Exo-SAP (o H2O como control de ausencia de molde) a 16 j l de mezcla maestra de reacción de marcaje para un volumen total de reacción de 20 j l [5 U de ADN polimerasa HOT TERMIPol®, 1X tampón de reacción C, MgCh 1 mM (todos de Solis Biodyne), ddcTpTAMRA 0,4 jM (dideoxiuridina trifosfato marcado con ATTO540Q, dideoxicitidina trifosfato marcado con ATTO612Q y marcado con DYQ660; Jena Bioscience, Alemania) y LP 0,1 jM (Tabla 8) en agua libre de ADNasa/ARNasa]. Las condiciones de termociclado fueron: etapa de activación inicial durante 10 a 12 minutos a 95°C, seguido de 10 ciclos de 30 segundos de desnaturalización a 96°C, una etapa de hibridación y alargamiento combinados de 1 minuto a 60°C y un tiempo de retención final a 10°C.

Marcaje de transferasa terminal

Las reacciones que incluían sonda de marcaje 0,1 jM , 1X tampón de TdT, ddNTPINHIBIDOR 0,5 Mm (dideoxiuridina trifosfato marcado con ATTO540Q, dideoxicitidina trifosfato marcado con ATTO612Q y marcado con DYQ660; Jena Bioscience, Alemania), CoCh 0,25 mM, 0,2 U /jl de (desoxinucleotidil) transferasa terminal (New England Biosciences) se incubaron a 37°C durante 1 hora y el enzima a continuación se inactivó por calor a 75°C durante 30 min.

Análisis de la curva de fusión

Previamente a la adición de sonda informadora y a la realización del análisis de la curva de fusión, las muestras se trataron con proteinasa K (concentración final: 25-58 jg/m l en H2O, 1X tampón C o 1X tampón de TdT), albúmina de suero bovino (BSA, concentración final de 25-58 jg/m l en H2O, 1X tampón C o 1X tampón de TdT), SDS (concentración final: 0,1-0,25% en H2O, 1X tampón C o 1X tampón de TdT), o simplemente se añadió un volumen idéntico de H2O, 1X tampón C o 1X tampón de TdT. A continuación, las muestras se incubaron a 56°C durante 30 min. Seguidamente las sondas informadoras se añadieron a una concentración final de 0,025 a 0,1 jM . Una vez se había determinado que SDS era tan eficaz como la proteinasa K en la inactivación de la polimerasa, reduciendo de esta manera los efectos tanto de desplazamiento de la Tf como falsos efectos FRET, se añadieron sondas informadoras directamente a una solución que contenía SDS (concentración final de 0,1 a 0,25% en H2O, 1X tampón C o 1X tampón de TdT). A continuación, las reacciones se introdujeron en un termociclador detector de fluorescencia (ABI 7500 Fast, Applied Biosystems) con el perfil de temperaturas siguiente: 95°C durante 15 segundos, 25°C a 30°C durante 15 s, 95°C durante 15 s y 60°C durante 15 s. Estas últimas cuatro etapas comprendían la etapa de disociación, en la que se detectó la fluorescencia y se expresó en curvas de disociación como la derivada (dF/dT) de la fluorescencia vs. mediciones de la temperatura. Las muestras que contenían dúplex en los que ningún oligonucleótido estaba conjugado con un fluoróforo, se añadió EvaGreen (Biotium) a una concentración final de 1X.

Resultados y comentario

El falso efecto FRET dependiente de polimerasa es independiente del inhibidor de ddNTP

Con el fin de investigar adicionalmente el posible mecanismo subyacente al efecto de falsa inhibición (FRET) dependiente de la polimerasa, los presente inventores llevaron a cabo reacciones de marcaje simulado sin molde y que incluían todas las combinaciones de /- LP (sonda de marcaje), /ddUTP-ATTO540Q que se incubaron en primer lugar a 95°C durante 10 minutos para activar la ADN polimerasa Hot TERMIpol antes de dividirla en dos juegos iguales de alícuotas. Se añadió proteinasa K (en 1X tampón C) a un juego a una concentración final de 58 pg/ml y el otro juego recibió un volumen igual de 1X tampón C. Ambos juegos de muestras se incubaron a 56°C durante 30 min, antes de generar curvas de fusión de 30°C a 95°C. El RP C313Y RP (U)FAM marcado con FAM y RP nt821 RP (U) HEX marcado con HEX mostraron respuestas de inhibición en las muestras que contenían sus LP complementarios respectivos: LP C313Y (C_U) y LP nt821 (del11) (U) con independencia de la presencia o ausencia de ddNTP marcado con inhibidor, aunque únicamente en los no tratados con proteinasa K se mantuvo activa la polimerasa (fig. 7, paneles A y B). Estos resultados también verifican que el falso efecto FRET dependiente de polimerasa no es específico de dúplex en los que uno de los oligonucleótidos está marcado con el fluorocromo FAM, ya que también se observó para los que contenían HEX (fig. 7, panel B).

El tratamiento de SDS reduce el desplazamiento de la Tf y los falsos efectos FRET

Para encontrar métodos alternativos para inactivar la polimerasa que no requerirían una etapa separada de tratamiento e incubación antes de la adición de una o más sondas informadoras, se utilizó SDS. El dodecilsulfato sódico (SDS) es un detergente y un potente desnaturalizante de proteínas que no afecta significativamente a la hibridación de los ácidos nucleicos a concentraciones inferiores a 1%. Se sometió a ensayo la adición de SDS a una concentración final de 0,1% a 0,25% a muestras que incluían LP antes de añadir RP y realizar el análisis de la curva de fusión.

La figura 8 muestra que la adición de SDS a 0,1% era tan eficiente como la proteinasa K en la reducción del efecto de desplazamiento de la Tf basado en la polimerasa observado en la reacción de control negativo tratada con 1X tampón C no suplementado. Se incluyó otra reacción de control para confirmar que la adición de proteína adicional no contribuía a la Tf más baja en las muestras tratadas con proteinasa K. Al añadir a concentraciones idénticas, la albúmina de suero bovino (BSA) no mostró el desplazamiento de Tf observado para las muestras tratadas con proteinasa K, indicando que el desplazamiento de la Tf es el resultado de la actividad inactivadora de la polimerasa de la proteinasa K y no sus propiedades genéricas como proteína.

Al añadirla a LP no marcadas antes de la adición de RP y de la generación de la curva de fusión, el SDS al 0,1% también resultó tan eficaz como la proteinasa K en la reducción del falso efecto FRET observado en la reacción de control negativo tratada con 1X tampón C no suplementado (figura 9). Se incluyó otra reacción de control para confirmar que la adición de proteína adicional no contribuía a la reducción del falso FRET observado en las muestras tratadas con proteinasa K. Al añadir a concentraciones idénticas, la albúmina de suero bovino (BSA) mostró un falso FRET y, de esta manera, no mostró dicha reducción observada para las muestras tratadas con proteinasa K, indicando que la reducción del falso FRET es el resultado de la actividad inactivadora de la polimerasa de la proteinasa K y no sus propiedades genéricas como proteína. También resulta de interés observar que para el fluorocromo CY5, el falso FRET basado en polimerasa no se manifestó como inhibición sino por el contrario como un incremento dependiente de la temperatura de la fluorescencia, también una forma de FRET (fig. 9, panel B).

La utilización de SDS para inactivar la polimerasa representa una mejora significativa del método LAD al obviar una etapa de adición de reactivo adicional y el periodo de incubación intermedio; la sonda o sondas informadoras pueden añadirse simultáneamente con SDS y puede iniciarse directamente la determinación de la curva de fusión.

El efecto de desplazamiento de Tf del dúplex es una propiedad genérica de las ADN polimerasas

Las ADN polimerasas no de tipo Termosequenase no incorporan ddNTP conjugados con fluorocromo en el ADN eficientemente, de manera que someten a ensayo la capacidad de una ADN polimerasa analizable mediante PCR convencional (p.ej., Hot FIREPol) para inducir el efecto de desplazamiento de Tf estabilizador de dúplex observado para Hot TERMlPol, las sondas de marcaje se marcaron con ddNTP marcados con inhibidor mediante la utilización de la (desoxinucleotidil) transferasa terminal termolábil. Una vez se había completado la reacción de marcaje a 37°C, se eliminó la actividad de transferasa terminal mediante incubación a 75°C durante 30 minutos. A continuación, se añadió Hot FIREPol a las reacciones, se activó térmicamente a 95°C durante 10 a 12 minutos antes de añadir la sonda

Claims (8)

1. REIVINDICACIONES

   i . Método para evitar falsos positivos en un método de detección de secuencias en el que un ddNTP portador de un primer marcaje ha sido incorporado en una reacción de extensión de cadena por una polimerasa, en el que dicho método de detección de secuencias comprende la etapa de poner en contacto un ddNTP que porta un primer marcaje, una polimerasa y un primer y un segundo polinucleótido, en el que el primer polinucleótido puede haber sido o no marcado en la reacción de extensión de cadena y el primer y el segundo polinucleótido se hibridan entre sí para formar un tercer polinucleótido que es un polinucleótido de doble cadena con una región de cadena sencilla opcional, en el que dicha región de cadena sencilla es de hasta 10 nucleótidos de longitud y en el caso de que dicha región de cadena sencilla proporcione una secuencia 5' protuberante, no contiene una base complementaria a dicho ddNTP inmediatamente contigua a la región de doble cadena y dicho tercer polinucleótido porta un segundo marcaje, en el que dicho método evita la unión de dicho ddNTP a dicho tercer polinucleótido en presencia de una polimerasa mediante un método que comprende inactivar, degradar o eliminar dicha polimerasa en un periodo posterior a dicha reacción de extensión de cadena y antes o durante la generación de dicho tercer polinucleótido y en el que dicho método comprende el análisis de la curva de fusión de dicho tercer polinucleótido para determinar si el primer polinucleótido se encuentra marcado.
2. 2. Método según la reivindicación 1, en el que, en el caso de que dicha región de cadena sencilla proporcione una secuencia 5' protuberante, no contiene una base complementaria a dicho ddNTP en ningún sitio en dicha región de cadena sencilla.
3. 3. Método según la reivindicación 1 o 2, en el que dicho primer o segundo marcaje afecta a la señal generada por el otro marcaje en el caso de que los marcajes se encuentren próximos entre sí, en el que preferentemente dicho primer o segundo marcaje es un fluoróforo y el otro marcaje es una molécula que afecta a la fluorescencia de dicho fluoróforo en el caso de que se encuentre próxima a dicho fluoróforo, en el que preferentemente el otro marcaje es una molécula inhibidora.
4. 4. Método según la reivindicación 3, en el que dicho segundo marcaje en dicho tercer polinucleótido es un (i) fluoróforo y/o (ii) en el extremo 5' de una de las cadenas que constituyen dicho tercer polinucleótido de doble cadena.
5. 5. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que:

   (i) dicha polimerasa se inactiva o se degrada con proteinasa K,

   (ii) dicha polimerasa se inactiva o se degrada con un detergente, preferentemente dodecilsulfato sódico, o

   (iii) la eliminación de dicha polimerasa comprende separar dicha cadena o cadenas de dicho tercer polinucleótido de doble cadena respecto de dicha polimerasa mediante unión por afinidad, preferentemente en el que dicho tercer polinucleótido de doble cadena porta una pareja de unión de un par de unión, preferentemente biotina.
6. 6. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicho primer y/o dicho segundo polinucleótido es de entre 10 y 100 nucleótidos de longitud.
7. 7. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 para evitar una lectura de falsa temperatura de fusión (Tf) y/o falsos efectos FRET (preferentemente falsa inhibición positiva), en el que en dicho método para evitar una lectura de falsa Tf, dicho método comprende la etapa de poner en contacto una polimerasa, ddNTP y opcionalmente dNTP, y un primer y segundo polinucleótido que se hibridan entre sí para formar dicho tercer polinucleótido, en el que dicho método comprende además inactivar, degradar o eliminar dicha polimerasa antes de evaluar la Tf, y

   en dicho método para evitar falsos efectos FRET, dicho método comprende la etapa de poner en contacto una polimerasa, ddNTP y opcionalmente dNTP, y un primer y segundo polinucleótido que se hibridan entre sí para formar dicho tercer polinucleótido, en el que dicho primer polinucleótido porta un marcaje fluorescente, en el que dicho método comprende además inactivar, degradar o eliminar dicha polimerasa antes de evaluar los efectos de FRET,

   en el que preferentemente dicho dNTP y/o ddNTP y dicho polinucleótido se marcan tal como se define en la reivindicación 3 o 4.
8. 8. Método de identificación de una secuencia de nucleótidos diana en un polinucleótido de ensayo, que comprende:

   (a) poner en contacto dicho polinucleótido de ensayo con un ddNTP y una sonda de marcaje no marcada, en donde la sonda se hibrida con dicha secuencia de nucleótidos diana, en caso de hallarse presente, en posición inmediatamente 5' respecto a una base que es complementaria a dicho ddNTP en dicha secuencia de nucleótidos diana, en presencia de una polimerasa, en la que dicho ddNTP porta un primer mareaje y en el caso de que dicha secuencia diana se encuentre presente en dicho polinucleótido diana, dicha sonda de marcaje no marcada se hibridará con dicho polinucleótido diana y será extendida en la dirección 3' por dicha polimerasa, uniendo dicho ddNTP marcado a dicha sonda de marcaje no marcada para formar una sonda de marcaje marcada.

   (b) separar la sonda de marcaje (el primer polinucleótido), que puede encontrarse marcado o no marcado, respecto del polinucleótido de ensayo,

   (c) hibridar dicha sonda de marcaje con una sonda informadora (el segundo polinucleótido) que porta un segundo marcaje para formar un polinucleótido de doble cadena, en el que el primer o segundo marcaje afecta a la señal generada por el otro marcaje en el caso de que los marcajes se encuentren próximos entre sí (en el que preferentemente dicho primer o segundo marcaje es un fluoróforo y el otro marcaje es una molécula que afecta a la fluorescencia de dicho fluoróforo en el caso de que se encuentre próximo a dicho fluoróforo), en el que, en el caso de que dicha sonda de marcaje se encuentre no marcada, en el extremo más próximo al segundo marcaje, dicho polinucleótido de doble cadena es (i) de extremos romos, (ii) presenta un extremo 5' protuberante o (iii) presenta un extremo 3' protuberante, y en el extremo distal al segundo marcaje, dicho polinucleótido de doble cadena es (i) de extremos romos, (ii) presenta un extremo 5' protuberante o (iii) presenta un extremo 3' protuberante, en el que dichos extremos protuberantes consisten en una región de cadena sencilla y en el caso de que dicha región de cadena sencilla proporcione una secuencia 5' protuberante, no contiene una base complementaria a dicho ddNTP inmediatamente contigua a la región de doble cadena (preferentemente no contiene una base complementaria a dicho ddNTP en ningún sitio en dicha región de cadena sencilla),

   (d) inactivar, degradar o eliminar dicha polimerasa en el periodo durante o después de la etapa a) y antes o durante la generación de dicho tercer polinucleótido de doble cadena de la etapa c), en el que, en el caso de que dicha inactivación, degradación o eliminación se inicie durante la etapa a), la polimerasa no resulta inmediatamente inactivada, y

   (e) determinar si dicha sonda de marcaje porta un primer marcaje mediante la evaluación de la señal asociada al polinucleótido de doble cadena, en el que un cambio en la señal del primer o segundo marcaje es indicativo de la presencia de dicha secuencia diana en dicho polinucleótido de ensayo,

   en el que preferentemente dicho primer y/o segundo marcaje según se define en la reivindicación 2 o 3 y/o dicha sonda de marcaje y/o sonda informadora es de entre 10 y 100 nucleótidos de longitud, en el que dicho método comprende el análisis de la curva de fusión.

   Método según la reivindicación 8, en el que la etapa (d) se lleva a cabo después de la etapa (a) y antes de la etapa (c).

   Método según la reivindicación 8 o 9, en el que:

   (i) dicha polimerasa se inactiva o se degrada con proteinasa K o SDS,

   (ii) la eliminación de dicha polimerasa comprende separar dicha sonda de marcaje y/o sonda informadora respecto de dicha polimerasa mediante unión por afinidad, preferentemente en el que dicha sonda de marcaje o sonda informadora porta una pareja de unión de un par de unión, preferentemente biotina, (iii) dicha secuencia de nucleótidos diana es un polimorfismo de nucleótido único (PNU), y/o

   (iv) en el que se detectan en dicho método por lo menos dos secuencias de nucleótidos diana, por lo menos dos PNU.

   Método según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, en el que:

   (i) se utilizan por lo menos dos ddNTP que están marcados, en el que preferentemente los primeros marcajes en los ddNTP diferentes son diferentes, y/o

   (ii) se utilizan por lo menos dos sondas informadoras (y/o sondas de marcaje), en el que preferentemente los segundos marcajes en las diferentes sondas informadoras son diferentes, en el que se utilizan preferentemente por lo menos dos sondas informadoras y/o por lo menos dos sondas de marcaje y en el caso de que se hibride la sonda o sondas informadoras y la sonda o sondas de marcaje entre sí, generan por lo menos dos polinucleótidos de doble cadena con diferentes temperaturas de fusión,

   en el que preferentemente se proporcionan múltiples parejas de marcajes, en las que cada pareja de marcajes comprende un primer marcaje en un ddNTP y un segundo marcaje en una sonda informadora, en el que cada pareja de marcajes es diferente a cualquier otra pareja de marcajes, en el que preferentemente cada pareja contiene un primer y un segundo marcaje que son diferentes a cualquier primer o segundo marcaje presente en cualquier otro par de marcajes.

   Método según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11, en el que:

   (i) la sonda informadora está marcada en uno de los tres nucleótidos en el extremo 5', preferentemente en el extremo 5'-terminal, y/o

   (ii) en la etapa (e) dicho polinucleótido de doble cadena se somete a análisis de la curva de fusión en el que un cambio en la señal del primer o segundo marcaje (preferentemente la fluorescencia) durante la disociación que se produce durante dicho análisis de curva de fusión es indicativo de la presencia de dicha secuencia de diana en dicho polinucleótido de ensayo.

   Método de genotipado de un organismo, que comprende un método según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 12, en el que se detectan preferentemente por lo menos dos PNU en dicho método.

   Kit que comprende:

   (a) por lo menos un ddNTP marcado con un primer marcaje, en el que preferentemente dicho marcaje es tal como se define en la reivindicación 3 o 11,

   (b) por lo menos un primer polinucleótido (o sonda de marcaje) que comprende entre 5 y 200 nucleótidos, en el que preferentemente dicho primer polinucleótido (o sonda de marcaje) es tal como se define en la reivindicación 8 o 11,

   (c) por lo menos un segundo polinucleótido (o sonda informadora) que comprende entre 5 y 200 nucleótidos marcados con un segundo marcaje, en el que dicho primer y segundo polinucleótido son complementarios entre sí en 80% a 100% de la longitud total de sus secuencias, en el que preferentemente dicho segundo polinucleótido (o sonda informadora) es tal como se define en la reivindicación 4, 8, 11 o 12,

   (d) una polimerasa, y

   (e) por lo menos uno de entre:

   (i) un medio para inactivar la polimerasa (preferentemente un detergente, preferentemente SDS), (ii) un medio para degradar la polimerasa (preferentemente una proteinasa, preferentemente la proteinasa K o un detergente, preferentemente SDS), y

   (iii) un medio para eliminar la polimerasa,

   en el que el primer marcaje o el segundo marcaje afectan a la señal generada por el otro marcaje en el caso de que los marcajes se encuentren próximos entre sí.

   Método de evaluación del efecto de una polimerasa sobre la temperatura de fusión (Tf) y/o FRET (preferentemente la inhibición) de un polinucleótido de doble cadena con una región de cadena sencilla opcional, en el que dicho método es un método de análisis de la curva de fusión y comprende un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12,

   en el que, en el caso de que dicho método sea para evaluar el efecto de una polimerasa sobre la Tf, dicho método se lleva a cabo en dos muestras y para cada muestra el método comprende la etapa de poner en contacto dicha polimerasa, ddNTP y opcionalmente dNTP, y un primer y segundo polinucleótido que se hibridan entre sí para formar un tercer polinucleótido que es dicho polinucleótido de doble cadena, en el que dicho método llevado a cabo en únicamente una de dichas muestras comprende además inactivar, degradar o eliminar dicha polimerasa antes de evaluar la Tf, sometiendo las dos muestras a análisis de la temperatura de fusión, y

   evaluar si la temperatura de fusión difiere entre las dos muestras a fin de de determinar el efecto de dicha polimerasa sobre la temperatura de fusión de dicho polinucleótido de doble cadena, y

   en el caso de que dicho método sea para evaluar el efecto de una polimerasa sobre FRET dicho método se lleva a cabo en dos muestras y para cada muestra el método comprende la etapa de poner en contacto dicha polimerasa, ddNTP y opcionalmente dNTP, y un primer y segundo polinucleótido que se hibridan entre sí para formar un tercer polinucleótido que es dicho polinucleótido de doble cadena, en el que dicho primer polinucleótido porta un marcaje fluorescente,

   en el que dicho método llevado a cabo en únicamente una de dichas muestras comprende además inactivar, degradar o eliminar dicha polimerasa antes de evaluar los efectos de FRET,

   someter las dos muestras a análisis de FRET, y

   evaluar si los efectos de FRET difieren entre las dos muestras a fin de determinar el efecto de dicha polimerasa sobre FRET de dicho polinucleótido de doble cadena,

   en el que dicha inactivación, degradación o eliminación de dicha polimerasa se lleva a cabo antes o durante la generación de dicho polinucleótido de doble cadena, preferentemente mediante un método tal como se define en la reivindicación 5 y/o preferentemente dicho polinucleótido de doble cadena es tal como se define en la reivindicación 1.