JPH11512607A

JPH11512607A - 核酸分子を特性化する方法

Info

Publication number: JPH11512607A
Application number: JP9513594A
Authority: JP
Inventors: ジエー．ジエンドリサク，ジエローム; エム．ホフマン，レスリー; イー．スミス，ロバート
Original assignee: エピセンターテクノロジーズコーポレーシヨン
Priority date: 1995-09-27
Filing date: 1996-09-25
Publication date: 1999-11-02
Anticipated expiration: 2016-09-25
Also published as: EP0854936A4; JP3561523B2; AU7118396A; AU704625B2; EP0854936A1; CA2233079A1; WO1997012061A1; CA2233079C; US6190865B1

Abstract

(57)【要約】核酸分子を特性化する方法が開示されている。その方法とは、核酸鋳型、プライマー分子、ＤＮＡ分子が合成されるようにプライマーを伸長させる酵素、４つの標準的デオキシヌクレオシドトリホスフェート、及び少なくとも１つの非標準的デオキシヌクレオシドトリホスフェートを含む反応混合物の存在下でＤＮＡを合成することを特徴とする。この非標準的デオキシヌクレオシドトリホスフェートは、唯一つの標準的デオキシヌクレオシドトリホスフェートの一部分の代わりに、合成されたＤＮＡにとり込まれる。合成されたＤＮＡは、非標準的デオキシヌクレオシドトリホスフェートの塩基部分を、合成されたＤＮＡから切除するＮ−グリコシラーゼで処理される。ＤＮＡは、それからＤＮＡのホスホジエステルバックボーンが非塩基性部位のところで切断され、これによって少なくとも２つのＤＮＡ断片を創出するような方法で処理される。断片は大きさに従って分離される。

Description

【発明の詳細な説明】核酸分子を特性化する方法発明の分野本発明の分野は、核酸分子の特性化方法である。特に、本発明は非標準的（ノン−キャノニカル）デオキシヌクレオシドトリホスフェートの存在下でＤＮＡを合成し、非標準的デオキシヌクレオシドトリホスフェートの塩基部を取り除き、非塩基部位に於けるＤＮＡのホスホジエステルバックボーンを切断し、且つその結果得られたＤＮＡの断片を分析することによって、核酸分子の特性化をする（ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅ）ことに関する。発明の背景核酸分子の特性化方法核酸分子の特性化をすることに関しては多くの理由がある。例えば、人間や動・植物に多くの病気を引き起す、或いはこれらの病気に関係する遺伝子が直ちに同定され、且つ特性化られる。何か特定の遺伝子の中でも、特別な病気の状態の原因となる多数の変種（突然変異）が同定されている。このように既知および未知の突然変異を検出する多くの方法が開発されている（例えばコットン（Ｃｏｔｔｏｎ），１９９３年を参照）けれども、人間や他のゲノム類についての我々の知識が豊富になるにつれて、核酸を特性化するための新規で、より良く、且つより速い方法を開発することの重要性がいっそう増大している。診断に用いる他に、核酸を迅速に特性化するための改良方法は、人間の法廷論争、父であることのテスト、動・植物の品種改良、細胞組織の判定、危険に瀕した種をひそかに入手するスクリーニング、及び生物学上の研究を含む、多くの他の分野においても有用である。ＤＮＡ分子を特性化するための様々の方法が、当該技術分野において知られている。例えば、ＤＮＡ分子はアガロース、又はポリアクリルアミドのゲルを通過する電気泳動に基づく大きさによって特性化られる。この方法においては、マイナスに荷電したＤＮＡ分子がゲルを通ってプラスに荷電した電極の方向へ移動する。ゲル状のアガロース、或いはポリアクリルアミドの百分率が、電気泳動するＤＮＡ分子のサイズ範囲にとって適切であると仮定すると、ＤＮＡ分子が小さいほど、より大きなＤＮＡ分子に比べて、もっと迅速にゲルの穴を通って移動する。ＤＮＡ分子は大きさに依存する速度でゲル中を移動するために、ＤＮＡを色づけして目に見えるようにし、次に大きさがわかっている標識のＤＮＡ分子の移動と、標本（サンプル）のＤＮＡ分子の移動を比較することによって、分子の大きさを決定できる。適当な条件の下では、単一のヌクレオチドだけであっても、長さの異なる一本鎖のＤＮＡ分子が、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動法によって区別できる。ＤＮＡ分子の特性化をする他の方法は、各ＤＮＡ分子を１以上の制限エンドヌクレアーゼで処理し、次にこの処理の結果として生じた種々のＤＮＡ断片の大きさを、アガロースゲル電気泳動法によって決定することにある。制限エンドヌクレアーゼは、ＤＮＡ中の塩基（各ＤＮＡストランド上に、しばしば４、５、６又は時々８個の塩基）の特定の配列を認識し、次にＤＮＡのポリヌクレオチド鎖のホスホジエステル結合を認識した配列に従って切断する酵素である。異った認識配列をもった多くの制限エンドヌクレアーゼが手に入るために、他のどの制限酵素が与えられた制限酵素によって発生したＤＮＡの断片を切断するか、またその結果生じた全断片の大きさはどれだけであるかを決定することによって、制限酵素認識部位の位置と、それらの間の距離とを示すＤＮＡ分子全体の制限地図を得ることができる。このような制限地図は、特定のＤＮＡ分子に関して特徴的であり、特定の配列をおおよそ同定するのに使える。更にＤＮＡにおける突然変異によって引き起されるもののような変化が制限部位の消失（ロス）と増加（ゲイン）の結果になりうる、いわゆる“制限断片長さの多形現象”（ＲＦＬＰ）（カザジアンら（Ｋａｚａｚｉａｎ，ｅｔａｌ．），１９８９年）である。診断上重要なＲＦＬＰの例はベーターヘモグロビン遺伝子における単一塩基突然変異、即ちＤｄｅＩ制限部位を消去するＡからＴの変化であって、この変化によって鎌状細胞貧血症となる（カザジアンら（Ｋａｚａｚｉａｎ，ｅｔａｌ．），１９８９年）。ＤＮＡ分子を特性化するための最も情報を提供する方法の１つは、そのヌクレオチド配列を決定することである。ＤＮＡの配列を決める１つの方法（マキサムとギルバート（ＭａｘａｍａｎｄＧｉｌｂｅｒｔ），１９７７年）は、配列を決定するための５′−又は３′−末端にラベル化したＤＮＡ分子の１ストランドの４つのアリコートの各々を４つの異った化学試薬の１つで処理するとで達成される。即ち、１つ目の薬品がＤＮＡ中のグアニン塩基だけを特に修飾し、２つ目の薬品はシトシンだけを、また３つ目の薬品はグアニン又はアデニン塩基のいずれか、そして４つ目の薬品はチミン又はシトシン塩基のいずれかを修飾する。この化学処理は、修飾を受けやすい塩基の全体のうちの少しの割合いのものだけが現実に修飾されるような条件下で行われる。特定の型の１つの塩基だけ異なる一組の断片を発生させるために、化学反応が制限されることが重要である。例えば全てのＧ残基が修飾されるならば、この残基は全てホスホジエステル結合開裂を受けやすくなる。それ故、部分的に修飾された核酸を集めることが配列を決定するために要求される。ピペリジンでの後処理では、非塩基性部位（ａｂａｓｉｃｓｉｔｅ）でのＤＮＡ分子のホスホジエステル結合の開裂という結果となり、化学的な修飾の後、可能性のある有らゆる大きさのＤＮＡ分子の混合物を発生させ、且つ対応する感応性塩基の１つ１つの喪失という結果となる。その四つの反応の各々におけるＤＮＡ分子は、それからポリアクリルアミドゲルの隣接したレーンにおいて、電気泳動によって解析される。そしてＤＮＡ分子が放射線同位元素でラベルされれば、バンド模様がゲルをＸ線フィルムに暴すことによって明らかにされる。ＤＮＡの配列が、暴されたＸ線フィルムを分析することで明らかにされる。或いは、ＤＮＡ分子が蛍光、化学発光、又は何か他の非放射性のものでラベルされている場合には、その配列は当業界で公知の適当な方法によって明らかにされる。この当時にＤＮＡの配列を決定するために最も普通に使用している方法（サンガーら（Ｓａｎｇｅｒ，ｅｔａｌ．），１９７７年）は、ＤＮＡポリメラーゼを使用して配列決定のためのＤＮＡ内の四つの標準的塩基（Ａ＝アデニン、Ｃ＝シチジン、Ｇ＝グアニン、及びＴ＝タミン）の位置（配列）に依存して異った大きさの断片を造るという方法である。この方法においては、配列を決めるためのＤＮＡは試験管内でのＤＮＡ合成のための鋳型として使われる。全四種の標準的（キャノニカル）デオキシヌクレオチド（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ）に加えて、対応するジデオキシヌクレオチドによって少ない比率の標準的ヌクレオチドの無作為置換の結果となるような濃度で、２′，３′−ジデオキシヌクレオチドも又、各試験管内ＤＮＡ合成反応に含められうる。このようにして、各ＤＮＡ合成反応は、正常なデオキシヌクレオチドの替りにジデオキシヌクレオチドがどこに取り入れられようと、連鎖停止に対応して異った長さのＤＮＡ断片の混合物を産する。ＤＮＡ断片は幾つかの方法の１つによって放射能を使って、或いは放射能を使わないでラベルされ、且つそのラベルは、ラベルされたプライマーの伸長によって、或いはラベルされたデオキシ又はジデオキシヌクレオチドの取り込みによって、ＤＮＡの中に取入れられる。４つのジデオキシヌクレオチド（ｄｄＡＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰ）の各々に関してＤＮＡ合成反応を実施することによって、それから変性ポリアクリルアミドゲルの隣接したレーンにおける各反応生成物を分離し、且つ幾つかの方法の１つでもって、これらの生成物を検査することによって、ＤＮＡ鋳型の配列が直接読めるようになる。循環（サイクル）配列決定は、熱的に安定なＤＮＡポリメラーゼを使い、且つ鋳型ＤＮＡの変性の多ラウンドの各々を通じて、連鎖停止ＤＮＡ合成を繰返し（例えば９５℃で）、単一プライマー・オリゴヌクレオチドをアニールし（例えば５５℃で）、そして当該プライマーの伸長（例えば７０℃で）によって、配列シグナルの線状の増幅を成し遂げるサンガー配列決定のバリエーションである。核酸配列決定は、特定の核酸が同一であるか、否かをみることに関して最も高い確度を提供する。又、突然変異の部位が知られていなくても、核酸配列決定によって遺伝子中に突然変異があるか否かを検出することができる。又、配列決定データは、特別の突然変異、又は配列における変化に関する臨床上の重要性が見積れるだけの十分な情報を与えてくれうる。核酸を配列決定によって特性化するためには、核酸が特定の方法で使われるために、十分な量で単離されなければならない。核酸をプラスミド又は他のベクターに最初クローン化することによって、十分な量の核酸を得ることが可能であるけれども、この手続は時間がかかり過ぎ、且つ臨床上の診断のため、或いは他の目的で、標本のお定まりの分析をすることから、しばしば実用的でない。標本中の核酸の量が所定の方法での最適量より少ないときは、核酸分子の増幅部分用に開発されている幾つかの方法の１つを用いるのが好都合である。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）、自己抑制配列複製（３ＳＲ）、複写を介した増幅（ＴＭＡ）、及びストランド転位増幅（ＳＤＡ）、というのが核酸分子を試験管中で増幅するために開発された方法の幾つかの例である。更に例示すると、ＤＮＡ分子の特定の部位は、二つのプライマー（１つのプライマーはＤＮＡストランドの各々に対して相補的であり、且つ重要なＤＮＡ配列に接している）、熱的に安定なＤＮＡポリメラーゼ、及び４つの全ての標準的な２′−デオキシヌクレオシド−５′−トリホスフェート（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ）とを含む緩衝液中での標本ＤＮＡの温度循環によってＰＣＲを使って増幅されうる。特定の核酸配列は、約３０サイクルの変性（例えば９５℃で）、２つのプライマーのアニール（例えば５５℃で）、及びＤＮＡポリメラーゼによるこれらのプライマーの伸長（例えば７０℃で）を通じて幾何学的に増幅され、その結果、核酸配列の約１０億までのコピーが得られる。ＲＮＡはＲＴ−ＰＣＲの幾つかのプロトコルの１つを使って、例えば逆転写酵素をも持つ熱的に安定なＤＮＡポリメラーゼを使って反応を行うことによって、同様に増幅されうる（マイヤースとゲルファンド（ＭｙｅｒｓとＧｅｌｆａｎｄ），１９９１年）。上に論述したようなポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は以下のものを含む数多くの刊行物の主題である。ムリスら（Ｍｕｌｌｉｓ，ＫＢ，ｅｔａｌ），Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．４，６８３，２０２；Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．４，６８３，１９５；ムリス（Ｍｕｌｌｉｓ，ＫＢ），ＥＰ２０１，１８４；エールリッヒ（Ｅｈｒｌｉｃｈ，Ｈ．），ＥＰ５０，４２４，ＥＰ８４，７９６，ＥＰ２５８，０１７及びＥＰ２３７，３６２；エールリッヒ（Ｅｈｒｌｉｃｈ，Ｈ．），Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．４，５８２，７８８；サカキら（Ｓａｉｋｉ，Ｒ．，ｅｔａｌ．），Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．４，６８３，２０２；コールドスプリングハーバーＳｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｏｉｌ，５１：２６３におけるムリスら（Ｍｕｌｌｉｓ，ＫＢ，ｅｔａｌ．）（１９８６）；サイキら（ＳａｉｋｉＲ．，ｅｔａｌ．）（１９８５）Ｓｉｅｎｃｅ２３０：１３５０；サイキら（Ｓａｉｋｉ，ｅｔａｌ．）（１９８５）Ｓｉｅｎｃｅ２３１：４８７；及びローら（Ｌｏｈ，ＥＹ，ｅｔａｌ．）（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ３３５：１４１．二番目の例を挙げると、ＲＮＡ分子の全体又は特定の部位がＮＡＳＢＡ（ファイら（Ｆａｈｙ，ｅｔａｌ．）１９９１）を使い、下記のものを含む緩衝液中で標本ＲＮＡの等温温置によって増幅されうる。「以下のもの」とは、２つのプライマー（ＲＮＡ分子にとって相補的で、且つＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列をコードする第１のプライマーと、ＲＮＡ分子の逆転写から生じる第１のｃＤＮＡ鎖の３′−末端体にとって相補的な第２のプライマー）、ＲＮＡ分解酵素Ｈ活性（又は別個のＲＮＡ分解酵素Ｈ酵素）をも有するＲＮＡ−及びＤＮＡ−依存ＤＮＡポリメラーゼ、４つ全ての標準的２ ′−デオキシヌクレオシド−５′−トリホスフェート（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰ）、第１のプライマーのプロモーター配列を認識するＲＮＡポリメラーゼ、および４つ全てのリボヌクレオシド−５′−トリホスフェート（ｒＡＴＰ、ｒＣＴＰ、ｒＧＴＰ及びｒＵＴＰ）である。第１のｃＤＮＡストランドは、逆転写によって第１のプライマーの伸長によって合成される。それから、ＲＮＡ分解酵素Ｈは結果として生じたＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドのＲＮＡを消化（ダイジェスト）し、且つ第２のプライマーが第２のｃＤＮＡ鎖の合成を準備する。ＲＮＡポリメラーゼはそれから、もっと多くのＲＮＡの複製をつくり、これらの複製が順次ｃＤＮＡに逆転写され、結果として生じた二本鎖のＤＮＡ（ｄｓ−ＤＮＡ）分子をＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列から転写する。そして、このプロセスは再びいたるところで始まる。ＲＮＡ中間体を経由してｄｓ−ＤＮＡから、より多くのｄｓ−ＤＮＡへのこの一連の反応は、反応成分が消費され、又は酵素が不活性になるまで自己統一した方法で継続する。ＤＮＡ標本はまた、ＮＡＳＢＡ又は３ＳＲの他の変異によって増幅されうる。ストランド置換増幅（ＳＤＡ）は、もう１つ別の等温核酸増幅技術である（ウオーカー（Ｗａｌｋｅｒ），１９９４年）。ＳＤＡはプライマーの伸長、一本鎖の伸長生成物の置換、プライマーの伸長生成物（又は元の標的配列）へのアニーリング、及びその後のプライマーの伸長が反応混合物中で同時に生じるような核酸増幅の方法である。これは反応の温度抑制の結果として反応のステップが不連続相又はサイクル中で生じるＰＣＲと対称的である。ＳＤＡは以下の１）及び２）に基づいている。１）二本鎖の認識部位をもったヘミホスホロチオエート体の未修飾ストランドに切れ目をつける制限エンドヌクレアーゼの能力２）切れ目のところで複製を開始し、且つ川下の（ダウンストリーム）非鋳型ストランドを置き換える、或る種のポリメラーゼの能力プライマーのアニーリングのために、二本鎖の標的配列を変性するべく昇温（約９５℃）した状態での初めの温置の後、それに続いて新しく合成されたストランドのポリマー化や置換が一定の温度（通常約３７℃）のところで起る。標的配列の各々の新しいコピーの生産は以下の５つの工程からなる。１）増幅プライマーを、最初の標的配列に、又は予めポリマー化された一本鎖の伸長生成物であって置換されたものに、結合すること２）α−チオデオキシヌクレオシドトリホスフェートを含むエクソヌクレアーゼ−欠陥（ｅｘｏ^-）クレノーポリメラーゼによるプライマーの伸長３）ヘミホスホロチオエート二本鎖の制限部位に切れ目をつけること４）切れ目部位から制限酵素の解離５）川下の非鋳型ストランドの置換を伴うｅｘｏ^-クレノーによる切れ目の３ ′−末端からの伸長切れ目からの伸長は、他の切れ目可能な制限部位を再生するために、一定の温度では、切れ目、ポリマー化及び置換が同時かつ連続的に生じる。二本鎖の標的配列の両方のストランドにハイブリッド化するプライマーが使われるときは、増幅は、センス及び抗センスストランドが後続回の増幅において、相対立するプライマーの鋳型として働くので、指数関数的である。ＰＣＲ、ＮＡＳＢＡおよび核酸増幅の他の方法が、更なる特性化のためにもっと多量の核酸を入手することにとって非常に有用でありうる。しかしながら、一般に増幅した核酸分子は、配列のための使用に先立って、プライマーやヌクレオチドや不完全な増幅生成物や他の不純物を取り除いて精製されなければならない。その他、例えばＰＣＲプライマーはラベルをつけた配列プライマーと競争しうるし、またＰＣＲヌクレオチドがサンガージデオキシ配列決定のために使用される配列決定ヌクレオチド混合物と競争しうる。またサンガー配列決定はＰＣＲ又は他の増幅方法と同時には明らかになされえない、或いは少なくとも効率ではない。その理由は、配列決定のために利用されるジデオキシヌクレオチドは配列決定反応と同様に、ＤＮＡの増幅反応の終了という結果になるからである。１つのグループが、核酸の配列決定をするために要求される工程を減らすことを目的とした方法を開発している（シャウとポーター（ＳｈａｗとＰｏｒｔｅｒ），ＰＣＴＷＯ９５／０６７５２）。この方法によると、エクソヌクレアーゼ III（ｅｘｏIII）消化に対して耐性があることがわかった５′−アルファーボラノ−デオキシヌクレオシドトリホスフェートが、４つのプライマー伸長反応の１つに於いて、標準ヌクレオチド（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）の１つの替りに、試験管内でのＤＮＡ合成を通じてＤＮＡ中に含有された。ｅｘｏ III での処理は、アルファーボラノデオキシヌクレオシド含有の時点まで合成ＤＮＡを消化するであろう。ｅｘｏIII での消化と、ポリアクリルアミドゲル上でのラベルをつけた断片の分解の後、核酸の配列が決定される。アルファーボラノ／ｅｘｏIII 法の利点は、それがＰＣＲ増幅にとり込ませられうるということである。しかしながら、これにはまた欠点もある。主な欠点は、マキサム−ギルバート又はサンガーの配列決定法に比べて、配列データの精確さの程度が低いことである。その理由は、アルファーボラノ／ｅｘｏIII 法は、配列決定ゲル上に余分のバンドと欠損したバンドとの両方を与えるからである。これらの配列決定アーチファクトが発生する機構は未だ不確かではあるが、余分なバンドは多分ＤＮＡの非ホウ素化された部位のｅｘｏIII による不完全な消化によるものであろうと考えられ、他方、紛失したバンドは多分アルファーボラノ −ヌクレオを含む幾つかの配列を通して、ｅｘｏIII による選択的消化によるものであろうと考えられる。アルファーボラノ／ｅｘｏIII 法の他の重大な欠点は、ｅｘｏIII の基質要求に関係している。ｅｘｏIII は、各ストランドの３′− 未満に始って、二本鎖のＤＮＡだけを消化するために、配列がＰＣＲ生成物の各ストランドの３′−半分に関してだけで決定されうる。その結果、プライマーに近い配列を得ることができない。また、ｅｘｏIII 消化がフルサイズのＰＣＲ生成物の長さの５０％と１００％の間にある断片だけを生成するために、この方法によって配列決定されるＤＮＡのサイズ幅は多少制限される。例えば長さにおいて１０００の塩基対をもつＰＣＲ生成物がアルファーボラノ／ｅｘｏIII 法に従って配列決定されるならば、電気泳動にかけられる断片は、およそ５００〜１０００ヌチレオチドの長さであろう。そのような長さの断片は、ＤＮＡ配列決定ゲル中に分解させることはもっと困難である。ウラシルＮ−グリコシラーゼ “ウラシルＮ−グリコシラーゼ”又は“ウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼ”（ＵＮＧ又はＵＤＧ）は、ＤＮＡ中の塩基ウラシルと糖デオキシリボースの間のＮ −グリコシド結合を開裂するのに触媒作用を及ぼす酵素であり、前記ＤＮＡには非標準ヌクレオチド２′−デオキシウリジン−５′−トリホスフェート（ｄＵＴＰ）が標準的ヌクレオチドｄＴＴＰの代わりに含有されている（リンダール（Ｌｉｎｄａｈｌ），１９７９年）。ＵＤＧは遊離のｄＵＴＰ、遊離のデオキシウリジン又はＲＮＡからのウラシルの開裂に対して触媒作用を及ぼさない（ダンカン（Ｄｕｎｃａｎ），１９８１年）。Ｕ．Ｓ．特許５，０３５，９９６には、ＵＤＧが核酸増幅反応の汚染を抑制するために使用されるプロセスが記載されている（ハートリー（Ｈａｒｔｌｅｙ），Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，０３５，９９６）。この発明の目的は、他の標本の先の増幅に由来するウラシル含有ＤＮＡが破壊されてしまっており、もはや第２の増幅反応を汚染しないだろうという保証をするために、増幅がＵＤＧと一緒に行われるような新しい標本を含む反応混合物を予め処理しておくことであった。第２の増幅反応を実施するに先立って、第２の増幅混合物を消化することは、第１の増幅の残りの生成物が、更なる増幅の鋳型として働く能力を奪っている。ある程度、上と同様にＵＳ特許５，４１８，１４９は核酸の不特定増幅を減らすためにグリコシラーゼの使用を開示している。ＤＮＡに部位が特定された突然変異を導入するための方法が、また述べられている。この方法はＤＮＡ中においてチミンをウラシルで置換すること、及びウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼで行う後処理に依存している。Ｕ．Ｓ．特許４，８７３，１９２及びクンケル（Ｋｕｎｋｅｌ），１９８５年を参照。更に、ウラシル含有ファージが、遺伝子情報をウラシル−Ｎグリコシラーゼ欠陥細胞にだけ伝達し、自然に発生しているバクテリアに対しては伝達しないという生物学的封じ込めシステムの一部分として教唆された。ワーナーら（Ｗａｒｎｅｒ，ｅｔａｌ．），１９７９年参照。分子生物学におけるＵＤＧの他の用途は、ニッソンら（Ｎｉｓｓｏｎ，ｅｔａｌ．），１９９１年によって述べられている。ニッソンら（Ｎｉｓｓｏｎ，ｅｔａｌ．）において、ＵＤＧはＰＣＲ生成物の指向性クローニングを促進するために使用される。このようにして、ＰＣＲ増幅のために使用されるべくプライマーは、ｄＴＭＰの替りにｄＵＭＰを含む特定の１２−塩基５′配列を含むようにつくられる。それから、ＰＣＲ増幅後（反応混合物中のｄＵＴＰなしに）、増幅生成物は各５′末端にｄＵＭＰ残基を含むから、これらのＰＣＲ生成物をＵＤＧで処理することは、５′−末端からウラシル残基を取り除いてしまう。熱による後処理は、ウラシルが消失させられる非塩基部位でのホスホジエステル結合の開裂という結果となり、更にそれによって相補的末端をもつベクターに容易にクローン化されうる１２−塩基の結合性の強い末端を生じさせる。当業界において必要とされるものは、核酸および核酸間の差異を検出し、且つ同定する際に、マキサム−ギルバート又はサンガー配列と同程度に精確で且つ具体的であり、しかしもっと容易で、もっと速く、もっと高感度で及び／又は標本のＤＮＡが少なくて済む、そんな核酸の特性化方法である。この新しい方法は、また増幅生成物のような比較的不純な核酸標本用に、そしてこの標本からプライマーやヌクレオチドや他の不純物を取り除いて精製する必要なしに使われるべきである。この方法は、またアルファーボラノ／ｅｘｏIII 法に似た方法で、但し、この方法の欠点を有さないて、ＰＣＲのような増幅法の中に結合されうるべきである。発明の要約本発明は、核酸ポリマーを特性化するための、簡素で信頼できる方法を提供する。一実施態様において、本発明によって核酸ポリマー中での突然変異の検出と局在が可能である。また他の実施態様において、本発明では核酸分子が類似しているか、違っているかを決定でき、また類似又は相違の程度を決定できる。また、他の態様において本発明では核酸分子の配列を決定できる。本発明の方法に用いられる配列の限界を定める非標準的ヌクレオチドは、ＤＮＡ合成の連鎖ターミネーターではないがために、この方法は、またＰＣＲ、ＮＡＳＢＡ、又はＳＤＡのような増幅法の一部又はこれと一対をなすものでありうる。本発明において、ＤＮＡ分子は４つ全ての標準的デオキシヌクレオシドトリホスフェートと同様、核酸の鋳型、プライマー、ポリメラーゼ及び非標準的デオキシヌクレオシドトリホスフェートの存在下で合成される。試験管内で合成されたＤＮＡは、それから非標準的塩基をＤＮＡから取り去る酵素で処理され、それによって非塩基性部位が創出される。合成されたＤＮＡのホスホジエステル結合が非塩基性部位のところで切断され、そして長さの異った一連の分子が生じせしめられる。分子の大きさのクラスは、非標準的ヌクレオチドがその最初の配列内の標準的ヌクレオチドにとって代わる部位に対応している。開裂したＤＮＡ分子のセットについてのゲル電気泳動法、毛細管電気泳動法、又は他の方法によるサイズ分析では、非標準的ヌクレオチドによる個々の置換の位置を示している。一実施態様において、非標準的ヌクレオシドトリホスフェートはｄＵＴＰである。非標準残基を取り除く酵素は、好ましくはウラシルＮ−グリコシラーゼのようなＮ−グリコシラーゼである。本発明の一実施態様において、ＤＮＡ分子中のヌクレオチド配列が、４つの異った非標準的デオキシヌクレオシドトリホスフェートが標準的デオキシヌクレオシドトリホスフェートの各々の部分にとって代わる４つの異った反応を創出することで、またこれらの反応の生成物を比較することによって、導かれる。本発明の目的は、ヌクレオチドレベルで核酸分子を比較することである。本発明の他の目的は、突然変異を検出する方法を提供することである。本発明の他の目的は、増幅手順と適合しうる非標準デオキシヌクレオシドトリホスフェートを組入れる方法を提供することにある。本発明の他の目的は、核酸分子の配列を決定する方法を提供することにある。本発明の他の目的は、増幅生成物の配列を直接に決定する方法を提供することにある。その方法が正確で且つ再現性があることが、本発明の利点である。その方法は欠損バンドや複製したバンドなどの不自然な結果にならないことが、本発明の他の利点である。本発明の他の利点、特徴、及び目的は、明細書、特許請求の範囲および図面の審査の後で明らかになるであろう。図面の説明図１は、ＢＥＳＳ法の模式図（構成図）である。図２は、特定の突然変異の結果を評価するべくＢＥＳＳの使用を示す模式図である。図３は、一対となったＰＣＲとＢＥＳＳを示す模式図である。図４は、ＢＥＳＳを使ったＤＮＡ配列決定の模式図である。図５は、核酸分子が似ているか、違っているか、又どの程度似ているのか、違っているのかを決定すべくＢＥＳＳの使用を示す模式図である。発明の詳細な説明定義ここで使用されている“突然変異”（ミューテーション）という術語は、核酸のヌクレオチド組成物中における変化（変質）について言及しており、そして核酸配列における削除、挿入、単独又は複合の残基変化からなりうる。この変化は、普通には、ヌクレオチド残基を他の種類の普通に存在する（標準的な）ヌクレオチドによって置換することからなる。 “ヌクレオチド”は、塩基−糖ホスフェート化合物について言及している。又、ヌクレオチドはＲＮＡ及びＤＮＡという２つのタイプの核酸ポリマーのモノマー成分（サブユニット）である。“ヌクレオチド”は、ｒＡＴＰ、ｒＧＴＰ、ｒＵＴＰ及びｒＣＴＰのようなリボヌクレオシドトリホスフェート、及びｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ及びｄＣＴＰのようなデオキシリボヌクレオシドトリホスフェートに言及している。“ヌクレオシド”はホスフェート基のない塩基−糖の組合せについて言及している。“塩基”は例えばアデニン（Ａ）、シチジン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）及びチミン（Ｔ）のような含窒素塩基について言及している。 “とり込み”（インコーポレーション）は、核酸ポリマーの一部になることについて言及している。核酸前駆体の“とり込み”については、術語学上において柔軟性があることが知られている。例えば、ヌクレオチドｄＧＴＰはデオキシリボヌクレオシドトリホスフェートである。ＤＮＡへの“とり込み”で、それはｄＧＭＰ、或いはデオキシグアノシンモノホスフェート残基となる。ＤＮＡ中にはｄＧＴＰ分子はないけれども、ｄＧＴＰをＤＮＡにとり込ませると言ってもよい。 “標準的”（キャノニカル）という術語は、ＤＮＡ中で普通に見い出される４つの通常の核酸塩基であるアデニン、シトシン、グアニン及びチミンについて言及しているか、又は標準塩基をそれぞれ含むデオキシリボヌクレオシド、デオキシリボヌクレオチド、又は２′−デオキシリボヌクレオシド−５′−トリホスフェートについて言及するために使われている。 “非標準的”（ノン−キャノニカル）という術語は、前記の４つの標準的塩基以外のＤＮＡ中の核酸塩基について、又は非標準的塩基をそれぞれ含むデオキシリボヌクレオシド、デオキシリボヌクレオチド、又は２′−デオキシリボヌクレオシド−５′−トリホスフェートについて言及するために使われている。ウラシルはＤＮＡ中の普通の核酸塩基であるけれども、ウラシルはＤＮＡ中の非標準的塩基である。“非標準的塩基”は非標準的ヌクレオチドの含有の結果として、又は存在する塩基（標準的又は非標準的）の修飾の結果として、核酸中に見い出される。 “アンプリコン”という術語は、ＰＣＲ又は当業者に知られた、他の核酸増幅技術による増幅の生成物を記述するために登用した。ここで記述した温度の全ては、それと違って特定されていなければ、摂氏で表現されている。一般我々は核酸を特性化するための新しい方法を、“塩基切除配列スクリーニング ”或いは“ＢＥＳＳ（商標）”として言及して開示する。図１はＢＥＳＳの態様を記述している。ＢＥＳＳ法は、鋳型として特性化されるべく核酸を使って、試験管内でのＤＮＡ合成中に、ＤＮＡに非標準的ヌクレオチドをとり込ませることに基づいている。図１について言及すると、ラベルを付けたプライマーが、プライマーを伸長させることのできるポリメラーゼ、４つ全ての標準的デオキシヌクレオシドトリホスフェート、及び非標準的ヌクレオチドの存在下で、核酸の鋳型にアニールされる。図１において例示された特定の非標準的ヌクレオチドはｄＵＴＰである。ＤＮＡ合成の後、各非標準的塩基は、その塩基のための特定の酵素によってＤＮＡから切除される。図１の例において、この酵素はウラシルＤＮＡグリコシラーゼである。更にまた図１について言及すると、ＤＮＡ鎖はそれから各非標準的ヌクレオチドの位置に対応した非塩基性部位のところで破壊される。図１において説明された例は、ＡＰエンドヌクレアーゼとエンドヌクレアーゼIVを使って非塩基性部位のところでＤＮＡを破壊するものである。それから、その結果生じたＤＮＡ断片の分離は、非標準的塩基が除かれた位置で終る断片の模様を作り出す。試験管内で合成されたＤＮＡ内での各非標準的ヌクレオチドの位置は、特性化される核酸内の標準的ヌクレオチドの位置に対応している。ＢＥＳＳは、単独の非標準的ヌクレオチドに適用されたときでも、特定の核酸配列又はそれと他の核酸配列とが関係あることの存在又は不存在を特性化するために、ＤＮＡ断片の配列に関係するパターンを得るために使用できる（図２と５を参照）。ＢＥＳＳ法に使用される非標準的ヌクレオチドはＤＮＡ鎖の終りをなさないために、ＢＥＳＳはＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＮＡＳＢＡ又はＳＤＡのような増幅プロセス、又は試験管内でのＤＮＡ合成に係る他の方法の一部分でありうる（図３参照）。ＢＥＳＳは核酸分子の完全なヌクレオチド配列を決定するために使用されうる（図４参照）。ＢＥＳＳ反応中のＤＮＡ合成の好ましい方法は、ＰＣＲＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，グリフィンとグリフィン（Ｇｒｉｆｆｉｎ及びＧｒｉｆｆｉｎ），ｅｄｓ．，ＣＲＣＰｒｅｓｓ，ＢｏｃａＲａｔｏｎ，ＦＬ（１９９４）に記載されている。ＤＮＡ合成のための好ましい最小限の成分は、鋳型ＤＮＡ（二本鎖又は一本鎖のもの）、鋳型部分の逆さ補充物である配列のプライマーオリゴデオキシヌクレオチド、５０〜２５０マイクロモルの濃度での４つの標準的デオキシヌクレオシドトリホスフェート、ｐＨ６．５〜９．０の緩衝液、１〜１０ｍＭでのマグネシウムイオン、及びＤＮＡポリメラーゼ酵素である。非標準的デオキシヌクレオシドトリホスフェートの濃度、及び対応する標準的ヌクレオチドに対しての反応混合物中でのその割合は、各非標準的ヌクレオチドとＤＮＡポリメラーゼの組合せに関して経験的に決定される。本発明は、ポリヌクレオチドにそった、ある与えられた部位に関して全ての分子の断片だけがＮ−グリコシラーゼ酵素によって、その部位のところで開裂するように、多量の非標準的ヌクレオチドのとり込みを要求している。この非標準的ヌクレオチドは、ＤＮＡを合成するための４つの普通のヌクレオチド成分、即ちデオキシチミジントリホスフェート、デオキシアデノシントリホスフェート、デオキシシトシントリホスフェート、又はデオキシグアノシントリホスフェート、のいずれかの特定の置換体でありうる。幾つかの好ましい方法が以下の実施例で記述されている。ＢＥＳＳ法では、非標準的ヌクレオチドのとり込みは、標準的なＤＮＡ合成反応中に生じる。ＤＮＡ又はＲＮＡ分子のいずれかが鋳型として働く。当業者はこの反応を修飾するための多くの方法を知っている。この反応は、ヌクレオチド配列を含むラベルを付けたプライマーを使って遂行するのが好ましい。但し、このプライマーはその少なくとも一部が、鋳型とハイブリッド形成するのに、この鋳型分子の一部分と十分に相補的であることが好ましい。鋳型がＤＮＡ分子である場合には、ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼがプライマー分子を伸長することが好ましい。そして、このＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼが熱的に安定なＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼであることが最も好ましい。また、ＲＮＡ分子が鋳型である場合には、ＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素）が使用される。この酵素は熱的に安定であることが好ましい。放射能を利用してラベルを付けたプライマーを用いる場合には、分離した反応生成物をＸ線フィルム上に暴露することによって、この反応生成物を目で見えるようにすることができる。或いは、当業者に知られた放射能を利用しない方法でプライマーにラベルを付け、反応生成物を検出することもできる。非標準的ヌクレオチドとしてのｄＵＴＰ本発明の一態様において、非標準的ヌクレオチドｄＵＴＰはＤＮＡの合成中にＤＮＡ配列の中にとり込まれる。ＢＥＳＳ法とそれを使った幾つかが、例示的な非標準的ヌクレオチドとしてｄＵＴＰを、そして例示的なＮ−グリコシラーゼとしてウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼを用いて図解されている。例えば、デオキシチミジン（ｄＴ）残基の消失と増加が係わりをもつ特定の突然変異は、デオキシウリジン（ｄＵ）をＤＮＡにとり込ませた後に検出できる。ＵＤＧでｄＵ−置換された標本を消化したり、非塩基性部位（ｄＵ除去の地点）でホスホジエステル結合を加水分解することで、非塩基性部位の各々のところで終る入れ子形（ネスト）一そろいの断片ができる、この態様においては、突然変異によるｄＴ残基の消失又は増加は、ゲル電気泳動、又は他の分離法に従って検出されるであろう核酸の同じストランドの上で生じなければならない。 “とり込み”は、ＰＣＲ、又は当業界で知られたＤＮＡ合成が係わる他の増幅中でありうる。デオキシヌクレオチドｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ及びｄＵＴＰの混合物が、新しく合成されたＤＮＡへのとり込みのための前駆体プールとして使用される。鋳型ストランド上でｄＡと反対側にとり込まれたヌクレオチドは、合成されたＤＮＡ分子の大部分に関してｄＴであるけれども、ｄＵは合成されたＤＮＡ分子の断片に関して任意のそのような位置でヌクレオチドを構成する。合成された核酸は、それからウラシルがｄＵとして含有されている部位からウラシルだけを取り除く、ＵＤＧのようなＮ−グリコシラーゼでもって処理される。この除去は“非塩基性部位”を創出する。ウラシルが可能な含有部位をもつ断片だけに存在するために、核酸は分子の断片中のその位置のＵＤＧによって開裂させられる。ｄＵがｄＴを通常含む位置で、核酸中に随意にとり込まれる場合には、ＵＤＧ消化やホスホジエステル結合の切断によって、最初の核酸配列中にｄＴ残基間の距離だけ長さが異なる分子のかたまりが生じる。そのような入れ子形の一そろえの分子は、それから電気泳動法による分離手段によって分析されうる。そして、初めの核酸中でのｄＴ残基の精確な位置が推定されうる。突然変異の分析図２は、特定の突然変異を検査するためのＢＥＳＳ技術の使用を説明している。具体的には、図２は突然変異が野性型ＤＮＡ中の単独Ｔ残基の突然変異を起しＤＮＡ中のＣ残基による置換の結果として生じる具体例を示している。この変化は、ＢＥＳＳを使って、標本と野性型ＤＮＡとの組に比べて、標本と突然変異を起したＤＮＡとの組におけるＰＡＧＥゲル上でのバンドの消失として検出される。図２について更に言及すると、野性型ＤＮＡと突然変異を起したＤＮＡの両方がラベルしたプライマーで変性され、アニールされる。ＴからＣの転位を含むものに対して相補的なストランドは、ＤＮＡ合成のための鋳型として働く。適当な非標準的ヌクレオチドが標準的なヌクレオチドの少しの部分に代えてＤＮＡ合成反応中にとり込まれる。図２は野性型鋳型と、ＡからＧの突然変異をもった鋳型の生成物を記述している。更に図２について言及すると、生成物は適当なＮ−グリコシラーゼに暴露される。このＮ−グリコシラーゼはそれがとり込まれている全ての部位で非標準的塩基を切断する。ＤＮＡはそれから非塩基性部位でそれを開裂させるように処理され、そして断片が分離される。図２は野性型標本からのラベル付きの反応生成物と、突然変異を起した標本からのラベル付き反応生成物とを比較した結果を説明している。多様な断片が、非標準な塩基がＮ−グリコシラーゼによって取除かれた全ての非塩基性部位における開裂の結果として得られる。図２に示された例は、突然変異が観察される電気泳動法でのゲルの部分だけを描写している。上のプロセスが（１）異った検出レベルをもった二つのＰＣＲプライマーか、又は（２）２つの別個のＰＣＲ混合物か、のどちらかを使って、且つ各々がラベルを付けた２つのＰＣＲプライマーの異ったものを使って行われる場合には、ＤＮＡの両ストランド中のｄＴの位置が決定されうる。表１にみられるように、ＤＮＡの１２の可能な塩基置換突然変異のうちの１０が、１つ又は他のストランド上のＴの消失又は増加に係っている。そのため、非標準的ヌクレオチドとしてｄＵＴＰを使う本発明の態様は、突然変異の最大の要所を検出するために使用できる。表１は種々の突然変異と、ＵＤＧ消化後の突然変異の検出とを比較している。このように、１２の可能な主要突然変異のうちの１０が、ｄＵＴＰのとり込みとＵＤＧ消化を用いる本発明の態様と、二つの異った方法でラベルしたプライマーをもったＰＣＲとをカップリングさせることによって、非常に高い感度をもって検出できる。ラベルの付けられた１つのプライマーで、可能な突然変異の２分の１（１２のうちの６）が、本発明のこの態様を使って決定できる。他の二つの突然変異、即ちｄＧからｄＣ、及びｄＣからｄＧの検出には、具体的にはｄＧ又はｄＣの代わりに置換する非標準的なヌクレオチドと、各々それぞれの非標準的塩基を取除くＮ−グリコシラーゼとの使用が求められる。これら二つの突然変異は、二つの異ってラベルされたプライマー（ＤＮＡ鋳型の各ストランドを注入するためのもの）が使用されるならば、ｄＧＴＰ又はｄＣＴＰに代える１つだけの非標準的ヌクレオチドと、Ｎ−グリコシラーゼに対応するものを使用するだけで検出できる。他の非標準的なヌクレオチドの使用ｄＵＴＰ以外の非標準的ヌクレオチドが係わる本発明の態様に関しては、合成されたＤＮＡストランドからそれぞれの非標準的塩基を選択的に開裂させるＮ− グリコシラーゼを選択することが必要である。当業界で知られた他のＮ−グリコシラーゼ（デンプルとハリソン（ＤｅｍｐｌｅとＨａｒｒｉｓｏｎ），１９９４及びリンダール（Ｌｉｎｄａｈｌ），１９７９）であって、ＤＮＡから特定の非標準的ヌクレオチドを取り除くために使用できるかもしれないものがある。表２にこれらの酵素の幾つかが記載されている。本発明の非標準的デオキシヌクレオチドは、忠実にＤＮＡにとり込まれなければならないし、また次回のＤＮＡ合成中に生成物であるＤＮＡの成分として両立しうるものでなければならない。つまり、この非標準的デオキシヌクレオチドは生成物であるＤＮＡストランドの伸長を終了させてはいけないし、或いはポリメラーゼをひるませてはいけないし、或いは相補的のストランド上で突然変異を起させる結果となるようでもいけない。或る場合に於いては、普通でない非標準的ヌクレオチドが存在することによってＤＮＡの合成反応、或いはＤＮＡの物理的性質を変えるかもしれない（このヌクレオチドはＤＮＡ合成パラメーターが最適化される必要があるようにＤＮＡにとり込まれる）。本発明用に画かれる幾つかの他の一般的要求がある。非標準的ヌクレオチドは、例えば化学合成によって、ポリヌクレオチドの分解によって、酵素によるヌクレオチドの修飾によって、或いはこれらのプロセスの組合せによって、という具合いに或る種の手段によって得られうるものでなければならないし、また、この方法によって得られた生成物は、それからデオキシヌクレオシドトリホスフェートに変換されなければならない。更に非標準的塩基がとり込まれる核酸から、これを切除する、この特定のＮ−グリコシラーゼがなければならない。Ｎ−グリコシラーゼによって認識される非標準的ヌクレオチドのＤＮＡ合成中における直接のとり込みなしに、標準的ヌクレオチドの位置を特別に決定しうる想像された本発明のバリエーションがある。このように、ＤＮＡ中の標準的又は非標準的なヌクレオチドが、適当なグリコシラーゼ酵素のための特定の基質である非標準的ヌクレオチドに、最初に、特定的に変換される。Ｎ−グリコシラーゼによって具体的に認識された非標準的ヌクレオチドへのそのような変換が、化学的または酵素による手段によって達成できる。グリコキシラーゼ活性によって生じた非塩基性部位でのホスホジエステル結合がそれから、ここに述べたように破壊される。例えば、非塩基性部位をもったＤＮＡが、シトシンの脱アミド化と、それに続くＵＮＧとの処理によって調製される（サガーとストラウス（ＳａｇｈｅｒとＳｔｒａｕｓｓ），１９８５）。Ｎ−グリコシラーゼの使用他の具体的なＮ−グリコシラーゼは入手可能になり、また当業者に知られるようになるであろう。或るＮ−グリコシラーゼが本発明にとって適当であるか否かを決定するために、最初、非標準的ヌクレオチドを合成中のＤＮＡにとり込ませ、次に非標準的塩基が候補的Ｎ−グリコシラーゼによって特定的に除去できるかどうかを決定する。ＵＤＧの使用を記述している上の例は、比較用の対象として働くであろう。 “Ｎ−グリコシラーゼ”又は“ＤＮＡ−グリコシラーゼ”とは、Ｎ−グリコシラーゼ活性をもつ酵素を意味しており、この酵素が形式的にグリコシラーゼと呼ばれていようが、或いは他の酵素活性と組み合わさったグリコシラーゼ活性をもっていようが、関係はない。グリコシラーゼは時々“グリコシダーゼ”として言及され、そしてそれ故にＮ−グリコシラーゼとは、Ｎ−グリコシダーゼをもカバーするように定義されていることを意味している。ここに定義されるように、Ｎ−グリコシラーゼ又はＤＮＡグリコシラーゼはＤＮＡ中の非標準的核酸塩基と糖と結合の加水分解に触媒作用を及ぼし、非塩基性（ＡＰ）部位を発生させる酵素である。そのような酵素は多くの種の中に存在する。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉからの例は、ウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼであり（ＵＤＧ）、またウラシルＮ−グリコシラーゼ（ＵＮＧ）と呼ばれる。他の例はデンプルとハリソン（ＤｅｍｐｌｅとＨａｒｒｉｓｏｎ）（１９９４）によって、またダンカン（Ｄｕｎｃａｎ）（１９８１）によって記述されている。非塩基性部位での開裂一旦、非塩基性部位なるものが創出されると、本発明の方法では合成されたＤＮＡストランドが、この部位で開裂されることが要求される。非塩基性部位を開裂するための種々の方法が当業者に知られている。加熱及び／又は塩基性の条件が非塩基性部位でＤＮＡ分子を破壊するのに使える。例えば下記のようなプロトコールが使える：非標準的塩基の除去の後に、非塩基性（ＡＰ）部位を含む核酸がアミン、例えば２５ｍＭトリス−ＨＣｌ及び１〜５ｍＭマグネシウムイオンを含む緩衝液中で、１０〜３０分間、７０〜９５℃で加熱される。或いは、下記の処理が非塩基性部位でのＤＮＡを破壊するために使える。１．０Ｍのピペリジン塩基が、エタノールとともに沈殿させられ、真空乾燥されているＤＮＡに加えられる。この溶液はそれから９０℃で３０分間加熱され、そしてピペリジンを除去するために凍結乾燥される。非塩基性部位でＤＮＡポリマーを破壊するために酵素処理を利用するのが好ましい。例えばアプリン系又はアピリミジン系（ＡＰ）の部位でＤＮＡのホスホジエステル結合を開裂することのできるアプリン系／アピリミジン系のエンドヌクレアーゼ（ＡＰエンドヌクレアーゼ）が記述されているリンダール（Ｌｉｎｄａｈｌ），１９７９；デンプルとハリソン（ＤｅｍｐｌｅとＨａｒｒｉｓｏｎ），１９９４）。Ｅ．ｃｏｌｉからのエンドヌクレアーゼIVのようなＡＰエンドヌクレアーゼの使用は、ホスホジエステル結合の開裂のための好ましい方法であると考えられる。ここに定義されるように、ＡＰエンドヌクレアーゼは非塩基性（ＡＰ）部位でのＤＮＡ開裂に触媒作用を及ぼす任意の酵素である。そのような酵素は多くの種に存在している。ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉからのＡＰエンドヌクレアーゼの例としては、エンドヌクレアーゼIII とエンドヌクレアーゼIVが挙げられるが、これらのみに限定されるものではない。また、カルシウムイオンの存在におけるＥ．ｃｏｌｉエクソヌクレアーゼIII はＡＰエンドヌクレアーゼである。本発明に有用な酵素には、ＡＰエンドヌクレアーゼ様の活性をもつ任意の酵素（それがその名前で呼ばれていようと、他の名前で呼ばれていようと関係なく）が含まれる。エンドヌクレアーゼIVはＡＰ残基の５′−ホスフェート基と、隣接するヌクレオチドのデオキシリボース環との間で開裂させ、遊離の３′−ヒドロキシル基を生じさせる。ＡＰエンドヌクレアーゼで触発される開裂とは対照的に、ホスホジエステル結合の熱分解をＡＰ残基の片側に起させ、開裂生成物上に３′−ホスホリレート末端の混合物を生じさせうる。このように、エンドヌクレアーゼIVのようなＡＰエンドヌクレアーゼでのＡＰＤＮＡ開裂の結果は、熱分解で得られるものよりは、電気泳動後、一式のもっとシャープなバンドが得られることである。ＢＥＳＳ生成物の検査一旦、開裂が非塩基性部位で生じれば、ＢＥＳＳ生成物を分析したいと考えるであろう。この分析はゲル電気泳動法、又は毛細管電気泳動法によって行うのが好ましい。それから、断片の大きさは、ＤＮＡ分子に色をつけるか、又は放射能を利用してラベルをつけたＤＮＡ分子をＸ線フィルムに暴露することによって、目に見えるようにされるであろう。断片は当業者に知られた非放射能検出法によっても同様に目に見えるようにされうる。１、２、３、４又はそれより多いＢＥＳＳ反応からの反応生成物が、もし異った識別しうる非放射能ラベルが各反応用に使われるならば、電気泳動に用いられるゲル又は単一の毛細管の同じレーン中で可視可できる。ＢＥＳＳ断片の電気泳動法用に提案されるプロトコールは、６又は８％ポリアクリルアミドの０．２〜０．４ｍｍゲル、８９ｍＭトリス−ボレート、ｐＨ８．３、１ｍＭＥＤＴＡ（ＴＢＥ緩衝液）、及び７Ｍ尿素がＤＮＡの断片を分離するのに用いられる。変性させ、負荷をかけた緩衝液（９５％ホルムアミド、０．１％ブロモフェノールブルー、０．１％キシレンシアノール及び１０ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ７．６）が８５〜９５℃で５分間加熱した標本に加えられる。それから、標本がＴＢＥ緩衝液中、１２００〜２５００ボルトで電気泳動にかけられる。ＢＥＳＳプロトコールの利点ＢＥＳＳ法には幾つかの利点がある。主要な利点はヌクレオチド・レベルで核酸分子を特性化することができることである。この方法ではヌクレオチド・レベルで分析のためにＤＮＡ又はＲＮＡの特定部位を選ぶことができる。図３は、ＢＥＳＳプロトコールと増幅反応との一体化を示している。図３がＰＣＲ増幅中に標準的ヌクレオチドの少しの部分に代えて非標準的なヌクレオチドを含有させる工程を含んでいることに注目されたい。非増幅生成物に関して上に記述したように、ＰＣＲ生成物はＮ−グリコシラーゼが含有される全ての部位で非標準的塩基を切除するＮ−グリコシラーゼに暴露される。標本はそれから非塩基性部位でのストランドを開裂するように処理される。図３はストランド開裂後の予想される生成物と、分離された断片の分析結果を示している。本発明の現行技術に対する他の利点は、増幅生成物の同定を確認するために使用しうるバンドの模様の発生であろう（例えば図３参照）。当該技術での或るケースにおいては、正しい分子サイズをもったＰＣＲ生成物は、望ましい鋳型配列から誘導されると推定される。ＤＮＡの一部分は実際、他の核酸鋳型の増幅生成物でありうる。そして、その結果はそれ故に“フォールスポジティヴ（ｆａｌｓｅｐｏｓｉｔｉｖｅ）”である。もし、本発明によって生じたＰＣＲ生成物断片が、問題の配列から誘導される標準の一式の断片と比較されるならば、これらの断片は、たとえ突然変異があったとしても、ポジティブに同定されうる。突然変異は、バンドの通常の模様から逸脱として認識される。本発明では、アンプリコンの同定がＮ−グリコシラーゼ消化とホスホジエステル結合の切断の後での、その特徴的なバンド模様からチェックされうるので、フォールスポジディブの結果の発生を避けることができる。本発明の他の利点は、増幅プロセス自体が、生成物中に後で検出される非標準的ヌクレオチドをとり込むことができることにある。本発明の特に利点となる特徴は、増幅生成物が、非標準的ヌクレオチドが決定される前に、更なる精製を要求しないことにある。ＰＣＲ生成物の配列を決める現行の方法は、精製に労力が多くかかる工程と、この工程に続く、ラベルと連鎖終結するヌクレオチドをとり込みする、更なる一本鎖の増幅工程をかかえている。アンプリコンの精製では、通常、最初の増幅の成分、例えばヌクレオチド、プライマー、先端を切り取った伸長生成物や、望まない不特定の増幅生成物を取り除くことが必要である。本発明では、ヌクレオチドの配列の位置決めをする前の精製工程を行う必要がない。エクソヌクレアーゼIII 消化がアルファーボラノヌクレオチドとり込み部位の存在を決定するために使用できる、ＰＣＴＷＯ９５／０６７５２に記述されている方法も又、ＰＣＲ生成物の直接の配列決定を可能にする。しかしながら、この方法は配列決定ゲル中に余分な、又は喪失したバンドを生じさせる。これらのアーチファクトの理由は未だはっきりしていないが、余分なバンドはエキソヌクレアーゼIII（ｅｘｏIII）による不完全な消化によって引き起されうる。本発明は、ＤＮＡから特定の塩基を取り除くためのＮ−グリコシラーゼを使用し、そして、このことが次にＡＰ部位における連鎖開裂を許す結果となる。ＷＯ９５／０６７５２法と共通の配列決定ゲル・バンドアーチファクトが、本件発明を利用して生じてはならない。ヌクレオチド配列を決定するためのＢＥＳＳの利用４つの標準的デオキシヌクレオシドトリホスフェートの一部の代わりに、非標準的デオキシヌクレオシドトリホスフェートをとり込ませ、且つ適当なＮ−グリコシラーゼ酵素を使うことによって、４つ全ての標準的ヌクレオシドトリホスフェートの位置が、本発明を使って決定できる。そのために、ヌクレオチドの完全な配列が本発明を使って決定できる。この態様において、核酸中にとり込まれた各々特定の非標準的ヌクレオチドを取り除くための別々のＮ−グリコシラーゼがある（図４参照）。このようなケースでは、核酸の４つの変形の各々にとり込まれた独特の非標準的ヌクレオチドがある。これら４種の核酸はそれから、非標準的ヌクレオチドの各々にとって特有のＮ−グリコシラーゼによって別々に消化される。グリコシラーゼ消化とホスホジエステル結合開裂後、断片はゲル電気泳動法、毛細管電気泳動法、又は他の手段によって分離される。糖−ホスフェート残基のホスホジエステル結合の開裂が、酵素を使わないベーター除去、又は酵素を用いた手段によって行われる。もし、各非標準的ヌクレオチドが４つの普通のヌクレオチドの各々にとっての特定の置換体であれば、当該核酸の完全な配列が決定されうる。図４は、ラベルを付けたプライマーがＤＮＡの変性された標本に最初にアニールされるＤＮＡ配列決定法を記述している。別々のＡ，Ｔ，Ｇ及びＣの特定反応が、ＤＮＡ合成中に標準的ヌクレオチドの少しの部分の代わりに、適当な非標準的ヌクレオチドをとり込ませるために創出される。異った方法でラベル化された複数の非放射性プライマーが、単一のレーンで検出可能にするべく各反応のために使用されることに我々は注目している。図４を参照して、記号のＡｍ，Ｔｍ，Ｃｍ及びＧｍは、“修飾されたＡ”、“修飾されたＴ”、“修飾されたＣ”及び “修飾されたＧ”について述べている。これらの“修飾された塩基”は非標準的ヌクレオチドである。更に図４を参照して、各ヌクレオチド−特定の反応の生成物は、それから非標準的塩基がとり込まれる全ての部位のところで適当な非標準的塩基を特定的に切り取るＮ−グリコシラーゼと接触される。非標準的塩基の切除の後、この生成物は非塩基性部位で開裂させるために、好ましくはＥ．ｃｏｌｉエンドヌクレアーゼIVのようなＡＰエンドヌクレアーゼを使って処理される。これらの断片は、それから好ましくは変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動法、毛細管電気泳動法、又は他の手段によって分離され、そして分析される。鋳型分子の配列が、図４に説明されているように、その比較から決定される。図４はまた、もし異った方法でラベル化された複数の非放射性プライマーが各反応用に使われるならば、どのようにして配列が１つのレーンの電気泳動から決定できるのかを説明している。或いは、とり込まれた非標準的ヌクレオチドが突然変異誘発性の結果を引き起さないと仮定すると、一つの大きな反応中で全てのヌクレオチドの特定の反応を遂行できる。この反応は適当なＮ−グリコシラーゼでの処理のための別々の反応に分割できる。生成物はそれから分離され、そして先に述べたように分析されうる。非標準的ヌクレオチドは、四つのパラレル反応の各々が、４種の普通のヌクレオチドと一緒に一種の非標準的ヌクレオチドを含む、循環配列決定反応を使って、とり込まれうる。それから、とり込まれる非標準的ヌクレオチドが、それにとって特有のＮ−グリコシラーゼによって消化される。ホスホジエステル結合開裂後、得られた生成物は変性ゲル電気泳動法、又は先に述べたような他の方法を使って分析される。核酸間の類似性又は差異を決定するためのＢＥＳＳの使用ＤＮＡ分子の全体を異った制限酵素で消化することによって得られるＤＮＡ断片の電気泳動模様が、ＤＮＡ分子を（制限地図によって）特性化し、且つ大雑把に同定するために使われるのとちょうど同じように、ＢＥＳＳ法を使って生じるＤＮＡ断片の電気泳動模様が、もっと精確な分子レベル核酸分子を特性化し、且つ同定するために使用されうる。このように、ＢＥＳＳ法は、単独の非標準的ヌクレオチド及び単独のＮ−グリコシラーゼを使う場合であっても、ヌクレオチドのレベルで核酸の標本が類似しているか、又は異っているかどうか、及びどんな程度に異っているかを決定するために使われる。図５は、ＢＥＳＳ法を使って核酸間の類似性及び差異を決定するための方法を説明している。この方法は、ラベルをつけたプライマーとラベルをつけていない、又は違った方法でラベル化したプライマー２をアニールして、変性ＤＮＡ鋳型にすることから始まる（この反応は単独のプライマーだけを使ってもまた遂行される）。非標準的ヌクレオチドは、それから試験管内のＤＮＡ合成において使用する標準的ヌクレオチドの少しの部分の代わりにとり込まれる。図５は、評価されるための４つの異ったＤＮＡ鋳型標本からの合成生成物の例を説明している。各反応生成物は、とり込まれる非標準的塩基を、それがとり込まれている部位の全てにおいて、特定的に切除するＮ−グリコシラーゼで処理される。ＤＮＡは、それから非塩基性部位のところで、好ましくはＥ．ｃｏｌｉエンドヌクレアーゼIVのようなＡＰエンドヌクレアーゼを使って開裂するように処理される。更に図５を参照して、４つ全ての標本の開裂生成物が図解されている。これらの開裂生成物は、好ましくは変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動法又はここに記述されているような他の方法によって、分離され、且つラベルを付けた断片が検出される。多くのバンドは、ほとんどの標本から生成され、図５の標本は図解目的のためにほんの少しのバンドを示す。核酸を特性化するためのキット（ｋｉｔ）本発明はまた核酸を特性化するためのキットである。一実施態様において、このキットは核酸鋳型、４種の標準的デオキシヌクレオキシドトリホスフェート、少なくとも１種の非標準的デオキシヌクレオキシドトリホスフェート、各非標準的ヌクレオチドに対応するＮ−グリコシラーゼ及びＡＰエンドヌクレアーゼにハイブリッド化されたプライマーを伸長することのできる酵素を含んでなるであろう。このＡＰエンドヌクレアーゼはエンドヌクレアーゼIVであることが好ましい。キットの他の形は、特定のＤＮＡ鋳型上で特性化を遂行する者にとって有用であろう。キットのこの態様において、短いセクションの特定のＤＮＡ鋳型にハイブリッド化されるようにデザインされた少なくとも１つのプライマーがキット中に提供される。このキットはまたＢＥＳＳと増幅法とを一対にするよう要求される他の成分を含んでもよい。例えば、ＢＥＳＳと、特定の核酸配列のＰＣＲ増幅とを一対化するためのキットは、重要な配列の側面である２種の異ったプライマー、即ちラベルをつけたもの及び／又はラベルをつけていないもの、を含みうる。このキットの最も好ましい態様において、酵素は熱に安定なＤＮＡポリメラーゼであろう。このキットの他の態様も、ＤＮＡ配列決定用に設計されるであろう。この態様において、キットは非標準的塩基がＤＮＡにとり込まれた後に、４種の異った標準的ヌクレオチドの各々の一部分を置換するように設計された４種の異った非標準的ヌクレオチドと、これらの各々を特異的に除去することに触媒作用を及ぼす４種の異ったＮ−グリコシラーゼを含むであろう。或いは、このキットは、もし特定のＤＮＡの両方のストランドが配列決定されるべきであれば、２又は３の非標準的ヌクレチドだけを含みうる。例例１この例は、ＢＥＳＳ法を用いた、診断上重要な単独塩基突然変異の検出を説明している。この例はまた、ＢＥＳＳとＰＣＲとの一対化を説明している。ＢＥＳＳと増幅との一対化によって、いくつかの状況の下では制限される標本核酸を比較的少量使うことで結果を得ることができる。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）はプラスミドｐＨＢ４又はｐＳｉＣ２内に含まれる人間のβ−グロビン遺伝子の部位を増幅するために遂行された。プラスミドは人間のβ−グロビン遺伝子をベクターｐＴ７ブルーに挿入することで構成されたノバゲン（Ｎｏｖａｇｅｎ），Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）。これら二つのプラスミドは、ｐＳｉＣ２のグロビン遺伝子部分のセンスストランド中において、アデノシンをチミジンで置換することだけで異なる。人間のＤＮＡにおける、そのような突然変異はβ⁵又は鎌状のグロビン欠陥という分子上の原因であるカザジアン（Ｋａｚａｚｉａｎ），１９８９）グロビン遺伝子を増幅するのに使われるプライマーは、それぞれ標準的フォワード（ｆｏｒｗａｒｄ）及びリバース（ｒｅｖｅｒｓｅ）ＭＢ配列決定２４−ｍｅｒオリゴヌクレチド、（ＳＥＱＩＤＮｏｓ．：５及び６）であった。１００ピコグラムのプラスミドｐＨＢ４又はｐＳｉＣ２ＤＮＡが、５０ｍＭトリス−ＨＣｌｐＨ９．０、２０ｍＭ硫酸アンモニウム、１．５ｍＭの塩化マグネシウム、各０．２ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、及びｄＧＴＰ、０．１６ｍＭｄＴＴＰ、０．０４ｍＭｄＵＴＰ、０．１マイクグラムのラベルの付いていないフォワードプライマー、０．１のマイクログラムの³²Ｐ−末端ラベル化されたリバースプライマー、及び２．５ユニットのＴｔｈＤＮＡポリメラーゼ又はＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（パーキンエルマー社（Ｐｅｒｋｉｎ−ＥｌｍｅｓＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ），Ｂｒａｎｃｈｂｕｒｇ，ＮＪ）を含む５０マイクロリットルのＰＣＲ反応に加えられた。反応物は９４°で２分加熱され、更に９５°、３０秒、５５°３０秒及び７２°３０秒で３０回反復、循環され、最後に４°に保たれた。増幅の後、標本は３７°、２０分間、１単位のＵＤＧ（エピセンターテクノロジー（ＥｐｉｃｅｎｔｒｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ），Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）で処理された。更にアンプリコンのホスホジエステルバックボーンが、７０ °１０分間加熱することによってウリジン除去の部位で開裂された。この標本は９５％ホルムアミド、１０ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ９．５、１０ｍＭＮａＯＨ及び各々０．１％プロモフェノールブルー及びキシレンシアノールで希釈された。反応生成物の精製は行われなかった。むしろ、反応生成物は可熱変性され、且つ８％ポリアクリルアミドと８Ｍ尿素ゲル中で直接に電気泳動させられた。ゲルは凝固させ、乾燥してＸ線フィルムに暴露された。同じプラスミドの配列決定反応を含んだ同種のサンプルが³²Ｐ−末端でラベル化したリバースプライマー用の製造者の使用法に従ってシークイサーム（ＳｅｑｕｉＴｈｅｒｍ）（商標）循環配列決定キットを使ってつくられた。このテスト結果から、デオキシウリジンを含むｐＨＢ４アンプリコンのＵＤＧ −消化された生成物において、鎌状グロビン遺伝子に特徴的なＡからＴの突然変異の部位のところに、追加のバンドが見られることがわかる。循環配列決定によって得られた対応する配列が、比較のために隣接するレーンにおいて電気泳動された。ＵＤＧ−発生のレーンは、循環配列決定生成物の“Ｔ”レーンと同じバンドの模様を有する。但し、予想通りではあるが、ＵＤＧ−処理材料からのバンドは、わずかにより速く移動する点で異っている。鎌状遺伝子の突然変異もまた循環配列決定レーン中にはっきりと目でみることができる。同じ結果がＴｔｈＤＮＡポリメラーゼ又はＴａｑＤＮＡポリメラーゼのいずれかについても得られた。例２以下の例は、増幅法と一対となったＢＥＳＳが、突然変異が異型接合の個体の１つの対立遺伝子だけに存在しているときでも、診断上重要な単独塩基突然変異を検出できることを説明している。使用されたＤＮＡ標本は、正常な対立遺伝子に関して同型接合であるか、又は正常且つ突然変異体対立遺伝子に関して異型接合である人間から得られた。ＢＥＳＳを使って得られた結果は、別途に標準的な方法を使って、正常および突然変異体を含む両ＤＮＡ標本を配列決定することによって確認された。アルファ₁−抗トリプシン遺伝子が、例１のそれと類似したプロトコールを使って、人間のＤＮＡから増幅された。アルファ₁−抗トリプシン遺伝子のＺ遺伝子突然変異は、エクソン・ファイヴにおけるＧ−から−Ａ変移であり、このことは３４２ポジションでのグルタミン酸エステルからリシンへのアミノ酸変化へと導く。本発明の態様が異型接合のＭＺ個体の１つの対立遺伝子中にＺ遺伝子突然変異を検出するために使われた。アルファ₁−抗トリプシン遺伝子の“Ｍ”型は正常または野性型の状態である。増幅反応は、プラスミドＤＮＡの代わりに鋳型として明らかに正常又はアルファ₁−抗トリプシン異型接合人間（コリエルインスチチュートフォーメディカルリサーチ）（ＣｏｒｉｅｌｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｆｏｒＭｅｄｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈ），Ｃａｍｄｅ，ＮＪ）からのものであることが明らかな１／２マイクログラムの人間のゲノムＤＮＡを含んでいる。プライマーである（ＳＥＱＩＤＮＯｓ．：１と２）がアルファ₁−抗トリプシン遺伝子（コックス（Ｃｏｘ），１９９０）のイントロン・フォーとエキソン・ファイブの一部分を増幅するために選ばれた。反応（物）は５０ｍＭトリス−ＨＣｌｐＨ９．０、２０ｍＭ硫酸アンモニウム、１．５ｍＭ塩化マグネシウム、各０．２ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ及びｄＧＴＰ、０．１６ｍＭｄＴＴＰ、０．０４ｍＭｄＵＴＰ、各０．１マイクログラムの、上に記述したプライマー、及び２．５ユニットのＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（パーキンエルマー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ），Ｂｒｏｎｃｈｂｕｒｇ，ＮＪ）を含む。反応（物）に対し、９１°１．５分間、５５°３０秒間、及び６８°１分間からなるサイクルを３５回行い、最後に４°に保持した。ｄＵＴＰの存在下での増幅の結果として生じたアンプリコンは、例１に記述されるようにＵＤＧで処理され、熱分解された。更に精製工程なしに、ＵＤＧ−処理したアンプリコンと循環配列決定反応標本の両方が、例１に記述したようにポリアクリルアミド −尿素ゲル中で電気泳動された。ＭＺ異型接合のＤＮＡは、他のＴバンドの強度の１／２である突然変異の位置での追加の“Ｔ”バンドを生み出した。ＢＥＳＳを使って、ＡＡＴＺ突然変異は染色体異常のＤＮＡにおける正常及び突然変異体対立遺伝子の混合物から得られた増幅生成物中において検出可能であった。Ｚ突然変異の対照ディスプレーとして、正常及びＭＺ異型接合の遺伝子両方のＰＣＲ生成物の配列決定が行われた。ｄＵＴＰなしに合成され、四種の標準的デオキシヌクレオチドだけを含むアンプリコンが、ドデシル硫酸ナトリウム界面活性剤を含む不連続な１３％ポリアクリルアミドゲル中で電気泳動された。３１０ｂｐアンプリコンが臭化エチジウムで色づけすることによって、局在化され、その後、ゲルから切除された。ＰＣＲ生成物は、当業界で知られた方法を使って、ゲルを押しつぶし、更に０．５Ｍ酢酸アンモニウム、１ｍＭＥＤＴＡ、及び０．１％ＳＤＳ中に浸すことによって精製した。このＤＮＡは、シークイサーム（商標）循環配列決定キット（エピセンターテクノロジー（ＥｐｉｃｅｎｔｒｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））の生成物情報に記述されているような³²Ｐ− 未端でラベル化したプライマーを使って、循環配列決定データを生じせしめる鋳型として使われた。例１に記述したと同じようにして実施した（従来の）標準的循環配列決定によって、ＰＣＲと一対化したＢＥＳＳを使って得られた、正常と突然変異体のＤＮＡ標本の配列が、確認された。例３ＢＥＳＳを使って生じたＡＰＤＮＡのエンドヌクレアーゼIV消化の有効性が、例３に説明されている。参照用の標準として、シークイサーム−配列決定ＡＡＴＰＣＲ生成物（例２）のＴレーンが、その態様の幾つかにおいてＢＥＳＳの結果と比較された。最初の態様は、ｄＶ−置換ＰＣＲ生成物のＵＮＧ消化（３７°１０分間）と、それに続く熱分解（９０°２０分間）によって、ＡＰ部位におけるホスホジエステル結合を開裂することであった。２番目の態様は、エンドヌクレアーゼIVがＵＮＧとともに添加され、且つ９０° の加熱工程がそれに続かないことを除いて、最初の態様と同じである。３番目の態様は、ＥＤＴＡがＵＮＧとエンドヌクレアーゼIVの添加前に、１０ｍＭの最終濃縮（物）に加えられたことを除いて２番目の態様と同じである。この実験から幾つかの結論に達しうる：（１）ＡＰＤＮＡの熱分解生成物は、同じ増幅生成物のエンドヌクレアーゼIV 開裂の結果から生じたものよりもシャープでない電気泳動によるバンドを生じる結果となる。（２）エンドヌクレアーゼIV反応は、ポリメラーゼが、幾つかのケースでは開裂生成物の３′−ヒドロキシ末端を伸長させるままにしておく結果、にせのバンドが生じる。ＵＮＧやエンドヌクレアーゼIVの添加前、又はそれらとともに、ＥＤＴＡのようなキレート化剤を添加すると、ポリメラーゼが開裂生成物の末端を伸長させるのを防止し、そしてにせのバンドを消失させることができる。（３）予想されたように、ＢＥＳＳ生成物はシークイサーム（商標）を使ってサンガー循環配列決定反応から生じる対応する生成物よりも、電気泳動中にもっと迅速に移動する。その移動差は、電気泳動ゲルの底でより明らかである。（４）ＰＣＲ生成物の循環配列決定に於いて得られたアーチファクトのバンドは本発明を使って削除できる。もっと精確な配列情報が、当業界で現在知られた方法を使うよりも、本発明を使って、その好ましい態様において得られうる。例４人間のＨＬＡクラスII複とり込みのＤＱＢ１遺伝子の第二エキソンは、非常に多形の部位であるブガワンとエールリッヒ（ＢｕｇａｗａｎとＥｈｒｈｃｈ），１９９１；トルスビィとロンニンゲン（ＴｈｏｒｓｂｙとＲｏｎｎｉｎｇｅｎ），１９９３）。ＨＬＡ部位の分析は組織、又は臓器移植前に組織の型を決定したり、法廷での弁論または他の分野において、同定テストすることにとって有効である。ＱＢ１対立遺伝子と区別するＢＥＳＳの有用性を説明するために、ＨＬＡ遺伝子の幾つかの型がｐＵＣ１９プラスミドベクターにクローンされ、そしてＢＥＳＳを使って分析が行われた。この例においては、ＢＥＳＳ手法によるＤＮＡへの非標準的ヌクレオチドのとり込みが、単一のプライマーだけと熱サイクラー中での多数回のＤＮＡ合成を利用して行われた。このようにして、１ストランドだけの核酸鋳型の線状の増幅だけが循環配列決定に類似した方法で得られた。それ故、プラスミドからのＤＱＢ１遺伝子の一本鎖のコピーを線状に増幅するのにＢＥＳＳ手法が使われた。以前に記述したように、ｄＵが一本鎖の増幅生成物において、ｄＴの代わりに部分的に置換された。ＵＮＧとエンドヌクレアーゼIVでの消化の後、生成物が同じプラスミド標準的循環配列決定から得た“Ｔ”反応生成物に隣接した全てのレーンで電気泳動された。（ＳＥＱＩＤＮＯｓ：３及び４）（ブガワンとエールリッヒ（ＢｕｇａｗａｎとＥｈｒｌｉｃｈ），１９９１）が、人間の末梢血液ＤＮＡノバゲン（Ｎｏｖａｇｅｎ），Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）からのＤＱＢ１遺伝子のエキソン２を増幅するために使用された。５つの個体からの血液標本が、ＨＬＡ遺伝子標的の多くの対立遺伝子を含むＤＮＡ調製のために使用された。５０ｍＭトリス−ＨＣＬｐＨ９．０、２０ｍＭ硫酸アンモニウム、１．５ｍＭ塩化マグネシウム、各０．２ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ及びｄＣＴＰ、各０．１ミリグラムのＤＢ１３０及びＧＨ２９プライマー、０．５マイクログラムの人間ＤＮＡ、及び１ユニットのＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（パーキンエルマー（Ｐｅｒｋｉｎ −Ｅｌｍｅｒ）Ｂｒａｎｃｈｂｕｒｇ，ＮＪ）が、ＭＪリサーチＤＮＡエンジン熱サイクラー中で増幅された。標本は９４°３分間で変性され、それから９３°１０秒間、６０°４０秒間、及び次に７５°３分間のサイクルを３０回、この標本中に対して行った。熱サイクラーは、標本が指定された温度に到達したときに時間測定を始めるべくプログラミングされた。その結果生じた２５０ｂｐＰＣＲ生成物は、そのプライマーによって記号化された部位（ｒｅｇｉｏｎ）以内の生成物を開裂させる、制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩとＰｓｔＩによって消化された。ＰＣＲ生成物は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動及びゲルフラグメントからの溶出液によって精製された。プラスミドｐＵＣ１９がＢａｍＨＩ及びＰｓｔＩでもって消化され、ＨＫホスホターゼでもって処理されたエピセンターテクノロジー（ＥｐｉｃｅｎｔｒｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ），ＭａｄｉｓｏｎＷＩ）、及びＰＣＲ生成物でもってしばられた。アンピシリン耐性のあるコロニーが、標準的フォワードとリバースＭ１３プライマー（ＳＥＱＩＤＮＯ₅：５及び６）を使って、プラスミド中でのＰＣＲ生成物の存在に関して選別された。候補としてのバクテリア・コロニーが、ポリプロピレン・ピペットの先端ですくいとられて、ＤＮＡエンジン熱サイクラー中で、上に述べたように循環させられたＰＣＲ混合物に加えられた。ＨＬＡ遺伝子をコード化するＰＣＲ生成物が、制限エンドヌクレアーゼ消化によって地図で表されたミツナガら（Ｍｉｔｓｕｎａｇａ，ｅｔａｌ），１９９５）。三種の独特のクローンがＢＥＳＳを使う更なる分析のために選択された。ＢＥＳＳ分析のために、ＤＮＡ合成が、循環配列決定に類似した方法で、但しジデオキシ末端混合物の代わりに、以前に述べたようなｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＡＴＰ及びｄＵＴＰの混合物とともに、３つのＨＬＡクローンから準備された。３０回の線状増幅の一本鎖の生成物に対して、以前に述べたような１０ｍＭＥＤＴＡの存在下で、ＵＮＧとエンドヌクレアーゼIVとでの消化が行われ、更にこの結果生成したものが変性ポリアクリルアミドゲル中で電気泳動された。比較のために、同じ三つのクローンのヌクレオチド配列がシークイサームサイクルシークエンシングキット（ＳｅｑｉＴｈｅｒｍＣｙｃｌｅＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇＫｉｔ）エピセンターテクノロジー（ＥｐｉｃｅｎｔｒｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ），Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使って決定された。ＢＥＳＳ技法は、各クローンを循環配列決定することによって得られるＴ配列レーンと良い関係をもった各ＨＬＡ遺伝子型用の独特の１セットのバンドを与えた。但し、予測されたように、また先の例におけるように、ＢＥＳＳに由来したバンドは、対応する配列決定のバンドよりもゲル中でもっと迅速に移動した。ＢＥＳＳを使って得られた配列関係のデータは、標準的循環配列決定を使って得られたものよりも、もっと精確でさえあった。このように、ＢＥＳＳ生成物レーンに存在しない（ゲルの１つの部位における）ジデオキシ配列決定アーチファクトの存在が、ＤＮＡ配列データの正しい解決を助けた。この例から、本発明がＰＣＲ生成物又は二本鎖のＤＮＡ分子を選別する配列に限られないことは明らかである。キットは、ＢＥＳＳを使って人間のＤＮＡ標本のＨＬＡ遺伝子型を決定するためにつくられるであろう。以下にリスト化された試薬を含むキットが、ＰＣＲを遂行するために、Ｔｔｈ又はＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（パーキンエルマー社（Ｐｅｒｋｉｎ−ＥｌｍｅｒＣｏｒｐ．））のような熱に安定なＤＮＡポリメラーゼとともに使用できる。キットは下記のものを含みうる：マイクロリットル当り０．１マイクログラムでのＨＬＡ−特定プライマー；各２．５ｍＭのｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ及びｄＡＴＰ、２ｍＭｄＴＴＰ及び０．５ｍＭｄＵＴＰ、１．０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ９、及び４００ｍＭ硫酸アンモニウムを含むＤＮＡポリメラーゼ緩衝液；、マイクロリッター当り１ユニットのウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼ；５０ｍＭＥＤＴＡ；２５ｍＭ塩化マグネシウム；マイクロリッター当り１ユニットのＥ．ｃｏｌｉエンドヌクレアーゼIV；及び９５％ホルムアミド、１０ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ９．５、１０ｍＭＮａＯＨ及び各０．１％のブロモフェノール・ブルー及びキシレンシアノールを含むＤＮＡポリメラーゼ停止緩衝液。キットは例１〜４及び図１〜５に記述された方法と類似した方法で使用できる。具体的には、ＨＬＡ遺伝子のＤＱＢ１基は、以下のものを含む５０マイクロリットルの混合物中の、末梢血液又はほお（ほおの）スワブから得られた人間のＤＮＡから増幅されうる。即ち混合物中には５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ９．０、２０ｍＭ硫酸アンモニウム、１．５ｍＭ塩化マグネシウム、各０．２ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＣＴＰ、０．１６ｍＭｄＴＴＰ、０．０４ｍＭｄＵＴＰ、各０．１マイクログラムのプライマーＤＢ１３０及びＧＨ２９（ＳＥＱＩＤＮＯｓ：３及び４）、約０．５マイクロプログラムの人間のＤＮＡ、及び１ユニットのＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（パーキンエルマー（Ｐｅｒｋｉｎ− Ｅｌｍｅｒ））が含まれる。そして、この混合物は３分間９４℃で変性せられ、更にそれから９３℃１０秒間、６０℃４０秒間、及びそれから７５℃で１０分間の順で３０回、循環させられうる。それからＥＤＴＡを１０ｍＭの最終濃縮物に添加した後、増幅生成物が室温で１０分間、ウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼとエンドヌクレアーゼIVの各１ユニットで処理して開裂されうる。停止緩衝液の添加後、標本は９０℃５分間温置することによって変性され、そしてそれから８％ポリアクリルアミド−８Ｍ尿素ゲル中で電気泳動によって分析されうる。ＢＥＳＳ手法を使って標本から生じたバンドの移動が、多分キット中の対照として、又はキット中に含められうるＤＮＡサイズ標準（いっしょにクローンされたＤＱＢ１遺伝子からのＢＥＳＳ反応生成物と比較されうる。）キット中のプライマーは、幾つかの方法、好ましくは非放射能手段によってラベルされる。そしてオートメーション化されたスキャナー及び／又は画像分析システムが対照といっしょに標本のハンド模様を比較するために使われうる。参照文献ＵＳ特許文書Ｕ．Ｓ．特許４，６８３，２０２；Ｕ．Ｓ．特許４，８７３，１９２；Ｕ．Ｓ．特許５，０３５，９９６；Ｕ．Ｓ．特許５，４１８，１４９；国際特許出願ＷＯ９５／０６７５２；シャウとポーター（ＳｈａｗとＰｏｒｔｅｒ）；３／１９９５他の文献ベマンズら(Bessmans，et al.),「デオキシリボ核酸III の酵素合成、ピリミジンとプリン類似体のデオキシリボ核酸へのとり込み"Enzymatic Synthesis of Deoxyribonucleic Acid.III.The Incorporation of Pyrimidine and Purine Ana logs into Deoxyribonucleic Acid ")」，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 44:633- 640,1958．ブガワンとエールリッヒ(Bugawan and Ehrlich)，「非放射性オリゴマーヌクレオチドプローブと増幅されたＤＮＡを使うＨＬＡ−ＤＱＢ１ＤＮＡ多形性の高速型("Rapid Typing of HLA-DQB1 DNA Polymorphism Using Nonradioactive Oli gonuleotide probes and Amplified DNA")」，Immunopenetics 33:163-170,1991 ．キャノンら(Cannon，et al.)，「哺乳類組織内の５−ヒドロキシメチルシトシンＤＮＡグリコシラーゼ活性("5-hydroxymethyl Cytosine DNA Glycosyla se Activity in Mammalian Tissue")」, Biochem. Biophys. Res. Commun. 15 1:1173-1179,1988． Cook，et al.,「α−アンチトリプシン欠陥の検出のための酵素− 標識オリゴヌクレオチド、一地点突然変異欠陥のための酵素活性の最適化("Enzy me-Labeled Oligonucleotides for the Detection of Alpha,-Antitrypsin Defi ciency: Optimization of Enzyme Activity for single Point Mutation Detect ion")」，Annals of Clinical Biochemistry 32:91-93,1995． Cotton，「突然変異検出の現在の方法("Current Methods of Mutation Detection ")」,Mutation Ressearch 285:125-144,1993．コックス(Cox)，「アルファーアンチトリプシン欠陥("Alpha,-Antitrypsin Def iciency")」，in The Metabolic Basis of Inherited Disease,6th Edition,Scri ver,et al．eds.，McGraw-Hill,New York,pp.2409-2437,1990． Demple and Harrison,「ＤＮＡの酸化損傷の修正("Repair of Oxidative Damage to DNA")」,Annual Rev. Biochemistry 63:915-948,1994． Duncan,「ＤＮＡグリコシラーゼ("DNA Glycosylases")」,(1981),in The Enzymes ，Boyer ed.，14:565-586,1981． Fahy，et al.,「自立配列複製（３ＳＲ）、ＰＣＲに代わる同温転写基盤増幅システム("Self-Sustained Sequence Replication(3SR):An Isothermal Transcrip tion-based Amplification System Alternative to PCR")」，PCR Methods and A pplications 1:25-33,1991． Kwoh，et al.，「転写基盤増幅システムとベッド基盤サンドイッチハイブリダイゼーションフォーマットでの増幅されたヒト免疫欠陥ウイルスタイプＩの検出(" Transcription-based amplification system and detection of amplified huma n immunodeficiency viru s type I with a bead-besed sandwich hybridization format")」, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173-1177,1989． Lindahl,「脱アミノシトシン残基を含むＤＮＡからの遊離ウラシルを放出するＥ．ｃｏｌｉからのＮグリコシラーゼ("An N-Glycosylase from Escherichia col i That Releases Free Uracil from DNA Containing Deaminated Cytosine Resi dues")」，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 71:3649-3653,1974． Lindahl,「ＤＮＡグリコシラーゼ、アプリン／アピリミジン部位に対するエンドヌクレアーゼ、及び塩基切除−修正("DNA Glycosylases，Endonucleases for Ap urinic/Apyrimidinic Sites,and Base Excision-Repair")」，Progress in Nuc leic Acid Research 22:135-192,1979． Karran and Lindahl,「ポリデオキシヌクレオチド及びＤＮＡを含むデオキシイノシンモノフォスフェート残基からの遊離ヒポキサンチンの酵素的切り出し("Enzy matic Excision of Free Hypoxanthine from Polydeoxy-nucleotides and DNA C ontaining Deoxyinosine Monophosphate Residues")」,J. Biol. Chem. 253:5877 -5879,1978． Karran and Lindahl,(デオキシリボ核酸中のヒポキサンチン：アデニン残基の熱誘導加水分解による生成及びウシ胸線由来デオキシリボ核酸グリコシラーゼによる遊離状態での放出("Hypoxanthine in Deoxyribonucleic Acid:Generation by Heat-Induced Hydrolysis of Adenine residues and Release in Free Form by a Deoxyribonucleic Acid Glycosylase from Calf Thymus")」，Biochemistry 19 ;:6005-6011,1980． Kazazian，et al.,「鎌状赤血球貧血の出生前診断−１９９８("P renatal Diagnosis of Sickle Cell Anemia-1988")」，Annals of the New York Academv of Sciences 565:44-47,1989． Kunkel，1985，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488-492． Maxam and Gilbert,「ＤＮＡシークエンシングの新方法("A New Method for Sequ encing DNA")」，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:560-564,1977． Marajver，et al.,「散在性卵巣腫瘍中のＢＲＣＡＬ遺伝子中の体細胞変移("Som atic Mutations in the BRCAL Gane in Sporadic Ovarian Tumors")」，Nature Genetics 9:439-443,1995． Mitsunaga，et al.,「グループ特異的増幅及び制限断片長多型の組合せによる高解像度ＨＬＡ−ＤＱＢ１判定法("High Resolution HLA-DQB1 Typing by Combina tion of Group-Specific Amplification and Restriction Fragment Length Pol ymorphism")」，Human Immunology 42:307-314,1995． Myers and Gelfand,「サーモスサーモフィリウスＤＮＡポリメラーゼによる逆転写及びＤＮＡ増幅("Reverse Transcription and DNA Amplification by a Tther mus thermophilus DNA Polymerase")」, Biochemistry 30:7661-7666,1991． Nisson，et al.,「ウラシルＤＮＡグリコシラーゼを用いたＡｌｕ−ＰＣＲ生成物の迅速及び効果的なクローニング("Rapid and Efficient Cloning of Alu-PCR Products Using Uracil DNA Glycosylase",PCR Methods and Applications")」, 1:120-123,1991． Sagher and Strauras,「ＤＮＡ合成のための終止シグナルとしてのシトシンからの非塩基性部位("Abasic Sites From Cytosine as Termination Signals for DN A Synthesis")」，Nucl. Acids Res. 13(12):4285-4298,1985． Sanger et al.,「鎖終結疎外剤を有するＤＮＡシークエンシング("DNA Sequenc ing with chain-terminating inhibitors")」,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:5 463-5468,1977． Stahl and Chamberlin,「Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼによるプロモーター利用にＤＮＡヘリックスの外側のグループが影響する("Groups on the Outside of the DNA Helix Effect Promoter Utilization by T7 RNA Polymerase")」，in RNA Polym erase,Losich and Chamberlin eds.,Cold Spring Harbor Press ,Cold Spring H arbor，N.Y.,pp.429-440,1976． Thorsby and Ronningen,「"特異ＨＬＡ−ＤＱ分子がタイプ１（インシュリン依存）ジアベテスメタリス抵抗に対する感受性を決定するのに主要な役割を演じる(" Particular HLA-DQ Molecules play a Dominant Role in Datermining Suscepti bility to Resistance to Type 1(Insulin-Dependent)Diabetes Mellitus")」，D iabetologia 36:371-377,1993． Walker,「ストランド置換増幅("Strand Displacement Amplification")」,In:Nove l Amplification Technologies for DNA/RNA-BasesDiagnostics,サンフランシスコにおいて１９９４年４月２０〜２２日にその名前での会議で紹介された本(a b ook presented a meeting of that name on April 20-22,1994 in San Francisc o)，CA,organized by International Business Communications，Southborough ，MA,1772-1749． Warner，et al.，1979，J. Biol. Chem. 45(16):4734-7539． Yap and McGee,「ＰＣＲによる突然変異の検出("Detection of Mutations by PCR")」，in PCR Technology,Griffin and Griffin,eds.，CRC Pre ss，Boca Raton，FL，pp.107-120,1994．

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者スミス，ロバートイー. アメリカ合衆国 53719 ウイスコンシンマデイソンサウスホワイトニーウエイ 2504

Claims

【特許請求の範囲】１．下記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、及び（ｄ）を含んでなる核酸分子を特性化するための方法。（ａ）下記の（ｉ）〜（ｖ）を含んでなる混合物の存在下でＤＮＡを合成すること、（ｉ）核酸鋳型（ii）ヌクレオチド配列を含むプライマー分子であって、その少なくとも一部が、鋳型の１部分に対し、それとハイブリッド形成するに十分に相補的であるもの（iii）ＤＮＡ分子が合成されうるようにプライマーを伸長する酵素（iv）四種の標準的デオキシヌクレオシドトリホスフェート、及び（ｖ）少なくとも１種の非標準的デオキシヌクオシドトリホスフェートであって、そしてこのものは唯一の標準的デオキシヌクレオシドトリホスフェートの代わりに、合成されたＤＮＡにとり込まれるもので（ｂ）この合成されたＤＮＡから、非標準的デオキシヌクレオシドトリホスフェートの塩基部分を切除し、それによって非塩基性部位を創生せしめるＮ−グリコシラーゼと、当該ＤＮＡとを接触させること、（ｃ）結果として全ての非塩基性部位でのホスホジエステルバックボーンの開裂となり、それによって少なくとも２つのＤＮＡ断片が創生されるような方法でＤＮＡを処理すること、及び（ｄ）この断片を大きさによって分離すること２．この大きさで分離した断片を固体支持体上に移し、それからラベルされた相補的なプローブのそれとのハイブリッド形成によって、当該断片の存在をはっきり示すことによって、断片が検出される、請求項１の方法。３．合成されたＤＮＡが検出可能なプローブとともにラベルされている、請求項１の方法。４．鋳型がＤＮＡ分子であり、且つ工程（ａ）の酵素がＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼである、請求項１の方法。５．酵素が熱的に安定である、請求項４の方法。６．鋳型がＲＮＡ分子であり、且つ工程（ａ）の酵素がＲＮＡ−依存ＤＮＡポリメラーゼである、請求項１の方法。７．酵素が熱的に安定である、請求項６の方法。８．非標準的デオキシヌクレオシドトリホスフェートが２′−デオキシウリジン−５′−トリホスフェートであり、且つＮ−グリコシラーゼがウラシル−Ｎ− グリコシラーゼである、請求項１の方法。９．非標準的デオキシヌクレオシドトリホスフェートが２′−デオキシイノシン−５′−トリホスフェートであり、且つＮ−グリコシラーゼがヒポキサンチン −Ｎ−グリコシラーゼである、請求項１の方法。１０．修飾された塩基が、合成したＤＮＡをＮ−グリコシラーゼの処理で損失しやすい非標準的塩基になるように、この合成したＤＮＡを処理することによって、非標準的塩基が合成したＤＮＡへのとり込みの後に修飾される、請求項１の方法。１１．異った非標準的デオキシヌクレオシドトリホスフェートが各反応で使われる、全部で４つのＤＮＡ合成反応を提供するために３つの追加ＤＮＡ合成反応を提供する、更なる工程を含んでなる、請求項１の方法。１２．請求項１１の核酸断片を分析することによって、核酸鋳型の完全なヌクレオチド配列を決定するための方法。１３．工程（Ｃ）がＤＮＡを加熱して非塩基性部位でのホスホジエステルバックボーンを切断することを含んでなる、請求項１の方法。１４．工程（Ｃ）が塩基性溶液を使って、全ての非塩基性部位でのホスホジエステルバックボーンの切断を実施することを含んでなる、請求項１の方法。１５．工程（Ｃ）が酵素を使って、全ての非塩基性部位でのホスホジエステルバックボーンの切断を実施することを含んでなる、請求項１の方法。１６．工程（Ｃ）がＡＰエンドヌクレアーゼを使って、全ての非塩基性部位でのホスホジエステルバックボーンの切断を実施することを含んでなる、請求項１の方法。１７．合成工程に於いて少なくとも２つの異った非標準的ヌクレオチドを提供する工程を更に含んでなり、そして異ったＮ−グリコシラーゼが各アリコート用に提供されるように、反応が接触工程において別々のアリコートに分割される、請求項１の方法。１８．ＤＮＡ合成が鋳型核酸の増幅方法の一部分である、請求項１の方法。１９．ＤＮＡ合成が、ポリメラーゼ連鎖反応を使う鋳型核酸の増幅の一部分である、請求項１の方法。２０．ＤＮＡ合成がＮＡＳＢＡ反応の一部分である、請求項１の方法。２１．ＤＮＡ合成が３ＳＲの一部分である、請求項１の方法。２２．ＤＮＡ合成がストランド置換増幅の一部分である、請求項１の方法。２３．電気泳動がＤＮＡ断片を分離するために使われる、請求項１の方法。２４．ＤＮＡ分子が合成されうるように、核酸鋳型に結びつけられたプライマーを伸長することができる酵素、４つの標準的デオキシヌクレオシドトリホスフェート、少なくとも１つの非標準的デオキシヌクレオシドトリホスフェート、この合成されたＤＮＡから各々の非標準的デオキシヌクレオシドトリホスフェートの塩基部分を切除することができるＮ−グリコシラーゼ、及びＡＰエンドヌクレアーゼを含んでなる、核酸鋳型を特性化するためのキット。２５．更に少なくとも１つのプライマー分子を含んでなる、請求項２４のキット。