CN1656233A - 利用切割剂扩增核酸片段 - Google Patents

利用切割剂扩增核酸片段 Download PDF

Info

Publication number
CN1656233A
CN1656233A CN02818014.3A CN02818014A CN1656233A CN 1656233 A CN1656233 A CN 1656233A CN 02818014 A CN02818014 A CN 02818014A CN 1656233 A CN1656233 A CN 1656233A
Authority
CN
China
Prior art keywords
nucleic acid
odnp
chain
target nucleic
sequence
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN02818014.3A
Other languages
English (en)
Inventor
J·范尼斯
D·J·格拉斯
L·K·范尼斯
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Keck Graduate Institute of Applied Life Sciences
Original Assignee
Keck Graduate Institute of Applied Life Sciences
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Keck Graduate Institute of Applied Life Sciences filed Critical Keck Graduate Institute of Applied Life Sciences
Publication of CN1656233A publication Critical patent/CN1656233A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
    • C12Q1/683—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism involving restriction enzymes, e.g. restriction fragment length polymorphism [RFLP]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00603—Making arrays on substantially continuous surfaces
    • B01J2219/00605—Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being directly bound or immobilised to solid supports
    • B01J2219/00608—DNA chips
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00603—Making arrays on substantially continuous surfaces
    • B01J2219/00605—Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being directly bound or immobilised to solid supports
    • B01J2219/00614—Delimitation of the attachment areas
    • B01J2219/00621—Delimitation of the attachment areas by physical means, e.g. trenches, raised areas
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00603—Making arrays on substantially continuous surfaces
    • B01J2219/00659—Two-dimensional arrays
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00718—Type of compounds synthesised
    • B01J2219/0072—Organic compounds
    • B01J2219/00722—Nucleotides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2521/00—Reaction characterised by the enzymatic activity
    • C12Q2521/30—Phosphoric diester hydrolysing, i.e. nuclease
    • C12Q2521/313—Type II endonucleases, i.e. cutting outside recognition site
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2521/00—Reaction characterised by the enzymatic activity
    • C12Q2521/50—Other enzymatic activities
    • C12Q2521/513—Winding/unwinding enzyme, e.g. helicase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2525/00—Reactions involving modified oligonucleotides, nucleic acids, or nucleotides
    • C12Q2525/10—Modifications characterised by
    • C12Q2525/155—Modifications characterised by incorporating/generating a new priming site
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2527/00—Reactions demanding special reaction conditions
    • C12Q2527/107—Temperature of melting, i.e. Tm
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2531/00—Reactions of nucleic acids characterised by
    • C12Q2531/10—Reactions of nucleic acids characterised by the purpose being amplify/increase the copy number of target nucleic acid
    • C12Q2531/119—Strand displacement amplification [SDA]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B40/00—Libraries per se, e.g. arrays, mixtures
    • C40B40/04—Libraries containing only organic compounds
    • C40B40/06—Libraries containing nucleotides or polynucleotides, or derivatives thereof

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及化合物、试剂盒和方法，该化合物、试剂盒和方法用于探测目标核酸中的遗传变异，用于探测生物学样品中特定核酸的存在与否，用于制备单链核酸探针及用于探测目标cDNA分子或cDNA群体中信使RNA前体的差异剪接。它在单链核酸片段的扩增中使用切割剂，该单链核酸片段含有目标核酸中的遗传变异、具有与特定核酸相关的唯一序列、与目标核酸互补或者包含外显子－外显子连接。对该短的单链核酸片段的探测和/或表征鉴定了目标核酸的遗传变异、显示了样品中特定核酸的存在、制备了目标核酸的单链核酸探针或探测了目标cDNA分子或cDNA探针中外显子－外显子连接的存在。

Description

利用切割剂扩增核酸片段
发明背景
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，更特别地涉及包括核酸的方法和组合物，且更加特别地涉及利用切割剂(nicking agent)扩增核酸片段的方法和组合物。
相关技术描述
通过人类基因组计划(Human Genome Project)获得的80,000～100,000个人类基因中每一个的染色体作图和核酸序列提供了鉴定负责遗传疾病的核苷酸座位的广泛方法的可能性。150-200种普通的遗传疾病和约600-800种较稀有的遗传疾病中的多数是与一个或多个缺陷基因相关的。在其中，已知超过200种人类疾病是由单个基因中的缺陷导致的，这经常导致单个氨基酸残基的改变。(Olsen，“Biotechnology：An Industry Comes of Age”(National AcademicPress，1986))。
体细胞中发生的突变如果影响了涉及细胞分裂控制的基因时可诱导疾病，从而导致如肿瘤形成。在种系中，许多基因中的功能丧失型突变可导致人类中可探测的表型。雄性种系中从一个配子到后代中的一个配子时种系中的细胞世代数比雌性中的多大约20倍。在雌性中，卵子是在第二次减数分裂之后形成的并持续40年。因此不同类型种系突变和染色体畸变的发生率依赖于亲本来源。
种系或体细胞的大部分突变对于生物体具有很小的影响，这是因为基因组的大部分是缺乏编码功能的(约94％)。即使在外显子区域中也对突变有一些耐受性，这是由于遗传密码的简并性及因为氨基酸替代可仅对蛋白质功能具有轻微的作用。(参见如Strong等人，NewEngland Journal of Medicine 325：1597(1991))。随着用于在大的DNA区段中探测突变的日益有效的方法的发展，对预测突变的功能结果(如临床表型)的需要变得更加重要了。
分子遗传学技术尚未以显著的程度应用于遗传和恶性疾病中染色体畸变的诊断；细胞遗传学仍然是研究这些重要的遗传机制的优选技术。在具有肿瘤抑制基因的一个突变拷贝的个体中，每103-104个细胞中就有一个细胞其剩余正常等位基因可被第二个拷贝的突变等位基因替代。导致该替代的机制包括染色体不分离、有丝分裂重组和基因转变。相反，破坏剩余基因拷贝的功能的独立突变估计发生于106个细胞中的一个细胞。
敏感性突变探测技术提供了用于突变筛选的异常可能性。例如，即使在受精卵植入之前也可进行分析。(Holding等人，Lancet 3：532(1989))。日益有效的遗传检验也允许从与健康体检有关的呼吸道或膀胱中剥落的细胞中筛选致癌突变。(Sidransky等人，Science252：706，1991)。可选择地，当未知基因导致遗传疾病时，监控DNA序列变体的方法对于通过遗传连锁分析研究该疾病的遗传是有用的。尽管有这些在单个基因中探测突变的独特应用，实现这种应用的现有方法学继续引起技术上和经济上的挑战。尽管已经寻求了几个不同的方法，但没有一个是充分有效的且对于大规模应用是成本有效的。
在限定的核苷酸座位探测突变的常规方法包括在家族中用有限的遗传标记组进行耗时的连锁分析，其中这些遗传标记是难以“读出(readout)”的。这种方法包括如DNA标记单倍型方法(可鉴定具有受影响的基因的染色体)以及用于探测较大的重排如大的缺失、重复、转位和单碱基对突变的方法。这些方法包括扫描、筛选和基于荧光共振能量转移(FRET)的技术。(参见Cotton，“Mutation Detection”(Oxford University Press，1997))。
探测低丰度突变的高灵敏性测定依赖于PCR以扩增目标序列。然而，这些测定却遭受与PCR试剂相关的高成本的限制。此外，探测和/或表征含有突变的扩增核酸片段的现有方法没有充分发展以使得能够对遗传变异进行高程度的多元鉴定。
部分由于探测遗传突变的现有方法学中的缺点，一直需要快速且灵敏地对目标核酸的限定核苷酸座位探测突变的方法。本发明通过提供在目标核酸的限定核苷酸座位探测突变的方法而满足了该需要及其他相关的需要，该方法还展示了增加的速度和方便性以及降低的成本。如在下文中详细公开的，本发明的方法基于用切割剂在限定的位置扩增含有遗传变异的核酸片段。此外，本发明也提供了方法和组合物以用于探测生物学样品中特定核酸的存在与否；用于制备单链核酸探针；以及用于探测在mRNA分子或cDNA分子中两个外显子之间连接(junction)的存在与否。
发明概述
在一方面，本发明提供了一种方法，该方法包括：(a)使模板核酸分子与切割剂(NA)接触，其中模板核酸分子(“模板”)包括可由NA识别的切割剂识别序列(NARS)。在一个实施方案中，模板是部分双链的，其中在一个实施方案中NARS是在模板的单链部分，而在另一个实施方案中NARS是在模板的双链部分。在另一个实施方案中，模板是完全双链的。(b)如果模板不包括可由NA切割的切割位点(NS)，那么该方法提供模板一条链的延伸从而使得形成模板的延伸产物，而该延伸产物包括可由NA切割的NS。(c)在NS切割模板或其延伸产物。这将在NS提供3’和5’末端。如下文描述的，多拷贝的在切割位点具有5’末端的核酸片段将通过下面的步骤进行制备。(d)在NS从3’末端延伸步骤(c)的切割产物。(e)重复步骤(c)和(d)以扩增单链核酸片段。在本发明的各个实施方案中，该单链核酸片段具有不超过50或45或40或35或30或25或24或23或22或21或20或19或18或17或16或15或14或13或12或11或10或9或8或7或6或5或4或3或2或1个核苷酸。通常，形成具有不超过50、45等的核苷酸的单链核酸片段相对于形成具有超过50、45等的核苷酸的片段是有利的，这是因为至少下面的原因：片段形成的速率和效率是较高的，较小的片段更容易由一些表征方法表征到较高的区别水平，该方法如质谱分析法和液相层析，且延伸步骤可用不必具有链置换活性的DNA聚合酶来进行。
下面的标准是可用于进一步描述本发明的方法的额外标准的例子。任何如在此处所公开的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个等标准(包括下面的标准)可组合起来描述本发明的方法。当两个标准(A和B)相互不一致时，它们可组合在可选择的方法中，即该方法可描述为包括标准A或标准B。这些标准包括：NA是切割性内切核酸酶(NE)；NA是限制性内切核酸酶(RE)；步骤(c)是在选自下列DNA聚合酶的DNA聚合酶存在时进行的，而对潜在的DNA聚合酶的列表可进行缩减从而包括下面DNA聚合酶的任何2个、3个、4个、5个、6个、7个等：exo-Vent、exo-Deep Vent、exo-Bst、exo-Pfu、exo-Bca、Taq、DNA聚合酶I的Klenow片段、T5 DNA聚合酶、Phi29 DNA聚合酶、噬菌体M2 DNA聚合酶、噬菌体phiPRD1 DNA聚合酶、测序酶、PRD1DNA聚合酶、9°NmTM DNA聚合酶和T4 DNA聚合酶，如步骤(c)可在选自exo-Bst聚合酶、exo-Bca聚合酶、9°NmTM DNA聚合酶或exo-Vent聚合酶的DNA聚合酶存在时进行；步骤(b)、(c)、(d)和(e)中的两个或多个，优选地为3个或4个且更优选地为所有4个均是在相同的等温条件下进行的；该方法包括表征步骤(e)中扩增的单链核酸片段的步骤；该方法包括由一种或多种方法表征步骤(e)中扩增的单链核酸片段的步骤，所述一种或多种方法选自发光光谱法、荧光光谱法、质谱分析法、液相层析、荧光偏振、电子电离、凝胶电泳和毛细管电泳，例如该方法包括用质谱分析法(即用质谱分析法本身或包括质谱分析法的方法)表征步骤(e)中扩增的单链核酸片段的步骤；模板核酸具有位于NS的3’的遗传变异，并且该遗传变异与NS位于同一单链上，从而该遗传变异整合入扩增的单链核酸片段中；模板核酸可由包括下面步骤(i)和(ii)以及进一步可包括步骤(iii)的方法形成：(i)形成包括第一个寡核苷酸引物(ODNP)、第二个ODNP和目标核酸的混合物，而目标核酸包括要研究的遗传变异，其中如果(a)目标核酸是具有第一链和第二链的双链核酸，那么第一个ODNP包含切割性内切核酸酶识别序列(NERS)的有义链的核苷酸序列和至少基本与位于遗传变异互补链3’的目标核酸第一链的核苷酸序列互补的核苷酸序列，且第二个ODNP包含至少基本与位于遗传变异3’的目标核酸第二链的核苷酸序列互补的核苷酸序列，且可选择地包含限制性内切核酸酶识别序列(RERS)的一条链的序列，然而，如果(b)目标核酸是单链核酸，那么第一个ODNP包含切割性内切核酸酶识别序列(NERS)的有义链的序列和至少基本与位于遗传变异5’的目标核酸相同的核苷酸序列，且第二个ODNP包含至少基本与位于遗传变异3’的目标核酸的核苷酸序列互补的核苷酸序列，且可选择地包含限制性内切核酸酶识别序列(RERS)的一条链的序列。(ii)延伸第一个和第二个ODNP以生产具有NERS和RERS两者的片段。该方法可选择地包括(iii)用识别RERS的限制性内切核酸酶切割步骤(ii)的延伸产物；模板核酸可由包括下面步骤(i)和(ii)的方法形成，如下：(i)形成包括第一个ODNP、第二个ODNP和包含遗传变异的目标核酸的混合物，其中如果(a)目标核酸是具有第一链和第二链的双链核酸，那么第一个ODNP包含第一个限制性内切核酸酶识别序列(RERS)的一条链的核苷酸序列和至少基本与位于遗传变异互补链3’的目标核酸第一链的核苷酸序列互补的核苷酸序列，且第二个ODNP包含第二个RERS的一条链的序列和至少基本与位于遗传变异3’的目标核酸第二链的核苷酸序列互补的核苷酸序列，然而，如果(b)目标核酸是单链核酸，那么第一个ODNP包含第一个限制性内切核酸酶识别序列(RERS)的一条链的序列和至少基本与位于遗传变异5’的目标核酸的核酸序列互补的核苷酸序列，且第二个ODNP包含第二个RERS的一条链的序列和至少基本与位于遗传变异3’的目标核酸的核苷酸序列互补的核苷酸序列。(ii)在脱氧核苷三磷酸和至少一种修饰的脱氧核苷三磷酸存在时延伸第一个和第二个ODNP以生产具有第一个和第二个RERS两者的片段；模板核酸可由包括(i)和(ii)的方法形成，如下：(i)形成包括第一个ODNP、第二个ODNP和包含遗传变异的目标核酸的混合物，其中如果(a)目标核酸是具有第一链和第二链的双链核酸，那么第一个ODNP包含至少基本与位于遗传变异互补链3’的目标核酸第一链的核苷酸序列互补的核苷酸序列，且第二个ODNP包含至少基本与位于遗传变异3’的目标核酸第二链的核苷酸序列互补的核苷酸序列，然而，如果(b)目标核酸是单链核酸，那么第一个ODNP包含至少基本与位于遗传变异5’的目标核酸的核苷酸序列相同的核苷酸序列，且第二个ODNP包含至少基本与位于遗传变异3’的目标核酸的核苷酸序列互补的核苷酸序列；而在每一种情况下，第一个和第二个ODNP各自进一步包含NERS的有义链的序列。(ii)延伸第一个和第二个ODNP以生产具有两个NERS的片段；模板核酸分子进一步在含有NS的链中包括5’突出端，其中突出端包括至少基本与目标核酸互补的核酸序列；模板核酸分子进一步在不含有NS的链中包括3’突出端，其中突出端包括至少基本与目标核酸互补的核酸序列；在模板含有突出端的情况下，本发明可选择地进行下面的额外步骤(i)、(ii)和(iii)：(i)在一定条件下使模板核酸与生物学样品中的核酸分子混合，而生物学样品可能含有目标核酸，该条件为当目标核酸存在于生物学样品中时，它可与模板核酸的突出端进行杂交。(ii)在进行步骤(a)之前从步骤(i)的混合物中去除未杂交的模板核酸。(iii)组合杂交的模板核酸与NA；双链模板核酸分子包括IIs型限制性内切核酸酶识别序列(TRERS)；双链模板核酸是以某种方式使核酸连接物与双链目标核酸进行连接而提供的，从而(i)根据本方法形成的扩增的单链核酸分子包括目标核酸的一部分，(ii)核酸连接物包括IIs型限制性内切核酸酶识别序列(TRERS)，(iii)核酸连接物在不与含有NS的模板链连接的连接物链上包括NARS，(iv)识别TRERS的IIs型限制性内切核酸酶的切割位点位于(a)双链目标核酸片段和(b)相应于NS的位置的5’；模板核酸包括位于NS的3’的上游外显子(Exon A)和下游外显子(Exon B)之间的连接，从而在连接两边的与连接邻近的核苷酸可整合入扩增的单链核酸片段中；模板核酸是由包括如下(i)和(ii)的方法形成的：(i)使第一个寡核苷酸引物(ODNP)、第二个ODNP和cDNA混合，其中第一个ODNP包含至少基本与靠近反义链中Exon A的5’末端的Exon A的反义链的部分互补的序列，第二个ODNP包含至少基本与靠近有义链中Exon B的5’末端的Exon B的有义链的部分互补的序列，且第一个ODNP和第二个ODNP中的至少一个进一步包括切割剂识别序列(NARS)的有义链的序列。(ii)延伸第一个ODNP和第二个ODNP以提供包含第一个ODNP和第二个ODNP的模板核酸；有时在步骤(e)之前，模板核酸可固定于固体支持体上，而在一个实施方案中不含有切割位点的核酸链附着于固体支持体上，可选择地为在该链的3’末端或可选择地在该链的5’末端附着，而在另一个实施方案中包括通过在NS进行切割形成的3’末端的核酸片段的5’末端附着于固体支持体上，而在另外一个实施方案中包括通过在NS进行切割形成的5’末端的核酸片段的3’末端附着于固体支持体上；例如，当将cDNA用于制备模板核酸时，则该cDNA分子可附着于固体支持体上；作为另一个例子，当将目标核酸用于制备模板核酸时，则该目标核酸可附着于固体支持体上。在相关的实施方案中，本发明提供了一种可用于探测cDNA分子中基因的上游外显子A(Exon A)和下游外显子(Exon B)之间的连接存在与否的试剂盒，而该试剂盒包括至少一对如在此处所描述的探测方法中所使用的ODNP。此外，这些试剂盒可进一步包括，或者可进一步表征为包括一种或多种下面的成分/条件：识别NARS的切割剂(NA)；限制性内切核酸酶(RE)；RE的缓冲液；切割性内切核酸酶(NE)；NE的缓冲液；N.BstNB I；第一个ODNP包含NERS和第二个ODNP包含RERS；第一个ODNP包含RERS和第二个ODNP包含NERS；RERS是IIs型限制性内切核酸酶可识别的；IIs型限制性内切核酸酶；IIs型限制性内切核酸酶的缓冲液；已知为Bpm I的IIs型限制性内切核酸酶；识别NERS的NE；DNA聚合酶；DNA聚合酶的缓冲液；exo-Bst聚合酶、exo-Bca聚合酶、9°NmTM DNA聚合酶和exo-Vent聚合酶中的一种或多种；使用试剂盒的说明书；液相层析柱；包含水和与有机或无机酸复合的仲或叔胺铵盐的缓冲液A；包含缓冲液A和有机溶剂的缓冲液B；一种铵盐，其胺成分选自三乙胺、二烯丙基胺、二异丙基胺、N，N-二甲基-N-环己基胺、N，N-二甲基-N-异丙基胺和N，N-二甲基-N-丁胺；与有机酸复合的仲或叔胺，且有机酸选自乙酸、丙酸及其卤化形式；甲醇；乙腈；反相层析柱；海藻糖；脱氧核苷三磷酸；修饰的脱氧核苷三磷酸；寡核苷酸标准；和/或用于设计或定购ODNP对的软件存取码。
在另一方面，本发明提供了在目标核酸中限定位置鉴定遗传变异的方法，而遗传变异可为如单核苷酸多态(SNP)。例如，在一个实施方案中，该方法包括：(a)提供一种模板核酸(“模板”)，该模板核酸包括目标核酸的一些或全部，且特别地包括在目标核酸的限定位置包含遗传变异的核苷酸序列。模板进一步包括切割剂(NA)的切割位点(NS)，而NS位于遗传变异的5’。模板可为部分或完全双链的。(b)在DNA聚合酶和在NS进行切割的NA存在时扩增单链核酸片段，该单链核酸片段具有包括遗传变异的核苷酸序列。该单链核酸片段具有通过在NS切割形成的5’末端。(c)表征单链核酸片段以借此鉴定遗传变异。在另一个实施方案中，本发明在目标核酸的限定位点鉴定遗传变异(该遗传变异可为如SNP)的方法包括：(a)形成包括第一个寡核苷酸引物(ODNP)、第二个ODNP和目标核酸的混合物，其中如果(i)目标核酸是具有第一链和第二链的双链核酸，那么第一个ODNP包含切割性内切核酸酶识别序列(NERS)的有义链的核苷酸序列和至少基本与位于遗传变异互补链3’的目标核酸第一链的核苷酸序列互补的核苷酸序列，且第二个ODNP包含至少基本与位于遗传变异3’的目标核酸第二链的核苷酸序列互补的核苷酸序列，且可选择地包含限制性内切核酸酶识别序列(RERS)的一条链的序列，然而，如果(ii)目标核酸是单链核酸，那么第一个ODNP包含NERS的有义链的核苷酸序列和至少基本与位于遗传变异5’的目标核酸的核苷酸序列相同的核苷酸序列，且第二个ODNP包含至少基本与位于遗传变异3’的目标核酸的核苷酸序列互补的核苷酸序列且可选择地包含RERS。b)延伸第一个和第二个ODNP以生产包含第一个ODNP和第二个ODNP的延伸产物。(c)可选择地用识别RERS的限制性内切核酸酶消化步骤(b)中的延伸产物以生产消化产物。(d)用步骤(b)的延伸产物或步骤(c)的消化产物的一条链作为模板，在识别NERS的切割性内切核酸酶(NE)存在时扩增单链核酸片段。(e)表征步骤(d)的单链片段以在目标核酸中鉴定遗传变异。作为进一步的例子，本发明提供了在目标核酸的限定位置鉴定遗传变异的方法，而该遗传变异可为如SPN，该方法包括：(a)形成包括第一个ODNP、第二个ODNP和目标核酸的混合物，其中如果(i)目标核酸是具有第一链和第二链的双链核酸，那么第一个ODNP包含第一个限制性内切核酸酶识别序列(RERS)的一条链的核苷酸序列和至少基本与位于遗传变异互补链3’的目标核酸第一链的核苷酸序列互补的核苷酸序列，且第二个ODNP包含第二个RERS的一条链的核苷酸序列和至少基本与位于遗传变异3’的目标核酸第二链的核苷酸序列互补的核苷酸序列，然而，如果(ii)目标核酸是单链核酸，那么第一个ODNP包含第一个RERS的一条链的核苷酸序列和至少基本与位于遗传变异互补链5’的目标核酸的核苷酸序列相同的核苷酸序列，且第二个ODNP包含第二个RERS的一条链的序列和至少基本与位于遗传变异3’的目标核酸的核苷酸序列互补的核苷酸序列。(b)在脱氧核苷三磷酸和至少一种修饰的脱氧核苷三磷酸存在时延伸第一个和第二个ODNP以生产具有第一个和第二个RERS两者的延伸产物。(c)用步骤(b)的延伸产物的一条链作为模板，在识别第一个和第二个RERS的限制性内切核酸酶(RE)存在时扩增单链核酸片段，其中单链核酸片段长度不超过35个核苷酸。(d)表征步骤(c)的单链片段以鉴定遗传变异。另一个方面，本发明涉及在目标核酸的限定位置鉴定遗传变异的方法，而该遗传变异可为如SNP，该方法包括：(a)形成包括第一个寡核苷酸引物(ODNP)、第二个ODNP和目标核酸的混合物，其中如果(i)目标核酸是具有第一链和第二链的双链核酸，那么第一个ODNP包含至少基本与位于遗传变异互补链3’的目标核酸第一链的核苷酸序列互补的核苷酸序列，且第二个ODNP包含至少基本与位于遗传变异3’的目标核酸第二链的核苷酸序列互补的核苷酸序列，然而，如果(ii)目标核酸是单链核酸，那么第一个ODNP包含至少基本与位于遗传变异5’的目标核酸的核苷酸序列相同的核苷酸序列，且第二个ODNP包含至少基本与位于遗传变异3’的目标核酸的核苷酸序列互补的核苷酸序列，而第一个和第二个ODNP各自进一步包含切割性内切核酸酶识别序列(NERS)的有义链的核苷酸序列。(b)延伸第一个和第二个ODNP以生产包含两个NERS的延伸产物。(c)用步骤(b)的延伸产物的一条链作为模板，在识别NERS的一种或多种切割性内切核酸酶(NE)存在时扩增单链核酸片段。(d)表征步骤(c)的单链片段以鉴定遗传变异。在相关方面，本发明提供了在单链目标核酸的限定位置鉴定遗传变异的方法，该方法包括：(a)形成第一个寡核苷酸引物(ODNP)、第二个ODNP和目标核酸的混合物，其中第一个ODNP包含至少基本与位于限定位置3’的目标核酸的核苷酸序列互补的核苷酸序列，第二个ODNP包含至少基本与目标核酸互补链的核苷酸序列互补的核苷酸序列，该核苷酸序列位于限定位置的核苷酸的至少基本互补的核苷酸的3’，第一个和第二个ODNP各自进一步包含中断的限制性内切核酸酶识别序列(IRERS)(而不是完整的IRERS)的第一条链的第一个不变识别序列(CRS)和第二条链的第二个CRS，完整的IRERS是具有第一链和第二链的双链核酸且包含由可变识别序列(VRS)连接的第一个和第二个CRS，且第一个或第二个ODNP进一步包含位于第一个CRS或第二个CRS的5’的NERS。(b)延伸第一个和第二个ODNP以生产具有NERS和完整IRERS的片段，其中遗传变异位于VRS中。(c)用步骤(b)的延伸产物的一条链作为模板，在识别NERS的切割性内切核酸酶(NE)存在时扩增单链核酸片段。(d)表征单链片段以鉴定遗传变异。在进一步描述需要CRS、VRS和IRERS的该方法中，可利用一种或多种下面的标准，而下面标准的任何两个或多个均可进行组合，且这些标准仅是在此处阐明的例示性标准：单链目标核酸是变性的双链核酸的一条链；双链核酸是基因组核酸；双链DNA是cDNA；至少基本与目标核酸互补的第一个ODNP的核苷酸序列长度至少为12个核苷酸；至少基本与目标核酸的互补链互补的第二个ODNP的核苷酸序列长度至少为12个核苷酸；第一个ODNP长度为15-85个核苷酸；第二个ODNP长度为15-85个核苷酸；第一个ODNP进一步包含至少基本与第一个CRS的3’末端的目标核酸互补的一个或多个核苷酸；第二个ODNP进一步包含至少基本与第二个CRS的3’末端的目标核酸互补的一个或多个核苷酸；所有步骤(a)～(d)均在单个容器中进行；IRERS可由选自Bsl I、Mwo I和Xcm I的限制性内切核酸酶识别；NERS可由N.BstNB I识别；步骤(d)至少部分是通过用选自质谱分析法、液相层析、荧光偏振、电子电离、凝胶电泳和毛细管电泳的技术进行的。
在限定位置鉴定遗传变异的这些方法的每一个(包括遗传变异是SNP的方法)可根据本发明由下面标准的一个或多个进行进一步的描述，而下面标准的任何两个或多个可进行组合以描述任何方法，且这些标准仅是例示性的，其他标准也可用于进一步描述根据本发明在目标核酸的限定位置鉴定遗传变异的方法：遗传变异是单核苷酸多态(SNP)；遗传变异与疾病相关；遗传变异与人类遗传疾病相关；遗传变异与病原微生物的药物抗性相关；目标核酸是基因组核酸；目标核酸是cDNA；目标核酸源自病原病毒的基因组；目标核酸源自病原细菌的基因组；目标核酸源自病原细菌的附加体；NA是切割性内切核酸酶(NE)；NA是N.BstNB I；扩增是在等温条件下进行的；扩增是在50℃-70℃的温度范围内进行的；扩增是在60℃进行的；扩增是在55±5℃进行的；扩增是在60±5℃进行的；扩增是在65±5℃进行的；扩增是在70±5℃进行的；扩增是在最高温度和最低温度之间的温度进行的，而最高温度比最低温度高20℃之内；扩增是在最高温度和最低温度之间的温度进行的，而最高温度比最低温度高15℃之内；扩增是在最高温度和最低温度之间的温度进行的，而最高温度比最低温度高10℃之内；扩增是在最高温度和最低温度之间的温度进行的，而最高温度比最低温度高5℃之内；扩增是在DNA聚合酶的存在下进行的，而DNA聚合酶是exo-Vent、exo-Deep Vent、exo-Bst、exo-Pfu、exo-Bca、Taq、DNA聚合酶I的Klenow片段、T5 DNA聚合酶、Phi29 DNA聚合酶、噬菌体M2 DNA聚合酶、噬菌体phiPRD1 DNA聚合酶、测序酶、PRD1DNA聚合酶、9°NmTM DNA聚合酶和T4 DNA聚合酶的任何一种，且这些DNA聚合酶的任何两个或多个可形成所述的可用于扩增的DNA聚合酶组，如DNA聚合酶选自exo-Bst聚合酶、exo-Bca聚合酶、9°NmTM DNA聚合酶和exo-Vent聚合酶；单链核酸片段是由选自质谱分析法、液相层析、荧光偏振和电泳的一种或多种技术进行表征的，如单链核酸片段是由一种或多种包括液相层析的技术进行表征的，或者如另一个例子，单链核酸片段是由一种或多种包括质谱分析法的技术进行表征的，或者如另外一个例子，单链核酸片段是由一种或多种包括液相层析和质谱分析法两者的技术进行表征的；当方法包括使用引物即ODNP时，在本发明的各个实施方案中，方法中所用的每一个ODNP的长度都独立地为至少8个、或至少9个、或至少10个、或至少11个、或至少12个、或至少13个、或至少14个、或至少15个、或至少16个、或至少17个、或至少18个、或至少19个、或至少20个核苷酸；当本发明的方法包括使用引物即ODNP时，那么在本发明的各个实施方案中，方法中所用的每一个ODNP的长度都独立地不超过50个、或不超过45个、或不超过40个、或不超过35个、或不超过30个、或不超过29个、或不超过28个、或不超过27个、或不超过26个、或不超过25个、或不超过24个、或不超过23个、或不超过22个、或不超过21个、或不超过20个、或不超过19个、或不超过18个核苷酸；当方法包括使用包括至少基本与目标核酸的核苷酸序列互补的核苷酸序列的引物时，那么在本发明的各个实施方案中，引物中该核苷酸序列的长度在每一个引物中独立地为至少4个、或至少5个、或至少6个、或至少7个、或至少8个、或至少9个、或至少10个、或至少11个、或至少12个、或至少13个、或至少14个、或至少15个、或至少16个、或至少17个、或至少18个、或至少19个、或至少20个核苷酸；当本发明的方法包括使用包括至少基本与目标核酸的核苷酸序列互补的核苷酸序列的引物时，那么在本发明的各个实施方案中，引物中该核苷酸序列的长度在每一个引物中独立地不超过20个、或不超过19个、或不超过18个、或不超过17个、或不超过16个、或不超过15个、或不超过14个、或不超过13个、或不超过12个、或不超过11个、或不超过10个、或不超过9个、或不超过8个、或不超过7个、或不超过6个、或不超过5个核苷酸；当本发明的方法需要使用含有RERS的核酸分子时，那么在一个实施方案中RERS可由II型限制性内切核酸酶识别；当本发明的方法需要使用含有RERS的核酸分子时，那么在一个实施方案中RERS可由IIs型限制性内切核酸酶识别；当本发明的方法需要使用含有RERS的核酸分子时，那么在一个实施方案中RERS可由Bpm I识别；当本发明的方法需要使用含有一种或多种RERS的核酸分子时，或者该方法需要使用各自具有RERS的一个或多个分子时，那么在各个实施方案中RERS可由选自Ava I、Bsl I、BsmA I、BsoB I、Bsr I、BstN I、BstO I、Fnu4H I、Hinc II、Hind II和Nci I的RE识别，而从这些Re的任何两个或多个中可形成一个组；当本发明的方法需要使用含有RERS的核酸分子时，那么在一个实施方案中RERS可由间断的限制性内切核酸酶识别；当方法包括两个RERS时，那么在一个实施方案中第一个RERS的核苷酸序列不与第二个RERS相同，而在另一个实施方案中，第一个RERS的核苷酸序列与第二个RERS相同；当本发明的方法需要使用含有NERS的核酸分子时，那么在一个实施方案中NERS具有核苷酸序列为5’GAGTC3’的有义链；当本发明的方法需要延伸核酸分子时，那么在一个实施方案中该延伸是通过聚合酶链反应进行的；该方法利用双链的目标核酸；该方法利用单链的目标核酸；当方法包括可选择的用限制性内切核酸酶消化延伸产物的步骤时，那么在本发明的一个实施方案中，该方法包括用限制性内切核酸酶消化延伸产物的步骤，而在另一个实施方案中省略了用限制性内切核酸酶消化延伸产物的步骤；有时在表征单链核酸片段以获得有关遗传变异的信息之前，模板核酸可固定于固体支持体上，而在一个实施方案中，不含有切割位点的核酸链附着于固体支持体上，可选择地在该链的3’末端或者可选择地在该链的5’末端附着，而在另一个实施方案中，包括经过在NS进行切割形成的3’末端的核酸片段的5’末端附着于固体支持体上，而在另一个实施方案中，包括经过在NS进行切割形成的5’末端的核酸片段的3’末端附着于固体支持体上；在有些情况下，目标核酸和第一个和第二个ODNP可用于形成模板，该模板经过扩增程序可提供单链核酸片段，且在这些情况下，目标核酸或第一个ODNP或第二个ODNP可固定于固体支持体上，而进行延伸以形成模板的第一个或第二个ODNP的末端优选地不是连接到固体支持体上的ODNP的末端，且目标核酸可非特异性地(即在任一个末端)或者更优选地在目标核酸的3’末端或5’末端进行固定。
如前文提及的，本发明提供了在目标核酸的限定位置鉴定遗传变异的方法，而该遗传变异可为单核苷酸多态(SNP)。例如，在一方面，本发明提供了在目标核酸的限定位置鉴定SNP的方法，而该方法包括：(a)提供部分或完全双链的模板核酸，该模板核酸包含在限定位置包括SNP的目标核酸的一部分，并进一步包含位于遗传变异的5’即SNP的5’的切割位点(NS)。(b)在DNA聚合酶和在NS进行切割的切割性内切核酸酶(NE)存在时在等温条件下扩增单链核酸片段，该单链核酸片段包含遗传变异即SNP、含有不超过17个核苷酸，且其5’末端位于NS。(c)至少用液相层析和/或质谱分析法表征单链核酸片段以借此鉴定SNP。作为另一个例子，在另一方面，本发明提供了在目标核酸的限定位点鉴定SNP的方法，该方法包括：(a)形成包括第一个寡核苷酸引物(ODNP)、第二个ODNP和目标核酸的混合物，其中如果(i)目标核酸是具有第一链和第二链的双链核酸，那么第一个ODNP包含切割性内切核酸酶识别序列(NERS)的有义链的核苷酸序列和至少基本与位于SNP互补链3’的目标核酸第一链的核苷酸序列互补的核苷酸序列，且第二个ODNP包含至少基本与位于SNP的3’的目标核酸第二链的核苷酸序列互补的核苷酸序列，且进一步包含限制性内切核酸酶识别序列(RERS)的一条链的序列，然而，如果(ii)目标核酸是单链核酸，那么第一个ODNP包含NERS的有义链的核苷酸序列和至少基本与位于SNP的5’的目标核酸的核苷酸序列相同的核苷酸序列，且第二个ODNP包含至少基本与位于SNP的3’的目标核酸的核苷酸序列互补的核苷酸序列且进一步包含RERS。(b)延伸第一个和第二个ODNP以生产包含第一个ODNP和第二个ODNP的延伸产物。(c)用识别RERS的限制性内切核酸酶(RE)消化步骤(b)中的延伸产物以生产消化产物。(d)用步骤(b)的延伸产物或步骤(c)的消化产物的一条链作为模板，在识别NERS的切割性内切核酸酶(NE)存在时，于等温条件下扩增含有不超过17个核苷酸的单链核酸片段。(e)至少部分用液相层析和/或质谱分析法表征步骤(d)的单链片段以借此在目标核酸中鉴定SNP。本发明也提供了在目标核酸的限定位置鉴定单核苷酸多态(SNP)的方法，该方法包括：(a)形成包括第一个ODNP、第二个ODNP和目标核酸的混合物，其中如果(i)目标核酸是具有第一链和第二链的双链核酸，那么第一个ODNP包含第一个限制性内切核酸酶识别序列(RERS)的一条链的核苷酸序列和至少基本与位于SNP互补链3’的目标核酸第一链的核苷酸序列互补的核苷酸序列，且第二个ODNP包含第二个RERS的一条链的核苷酸序列和至少基本与位于SNP的3’的目标核酸第二链的核苷酸序列互补的核苷酸序列，然而，如果(ii)目标核酸是单链核酸，那么第一个ODNP包含第一个RERS的一条链的核苷酸序列和至少基本与位于SNP互补链5’的目标核酸的核苷酸序列相同的核苷酸序列，且第二个ODNP包含第二个RERS的一条链的核苷酸序列和至少基本与位于SNP的3’的目标核酸的核苷酸序列互补的核苷酸序列。(b)在脱氧核苷三磷酸和至少一种修饰的脱氧核苷三磷酸存在时延伸第一个和第二个ODNP以生产包含第一个和第二个RERS两者的延伸产物。(c)用步骤(b)的延伸产物的一条链作为模板，在识别第一个RERS和第二个RERS的限制性内切核酸酶(RE)存在时，于等温条件下扩增含有不超过17个核苷酸的单链核酸片段。(d)至少部分用液相层析和/或质谱分析法表征步骤(c)的单链片段以借此鉴定SNP。本发明也提供了在目标核酸的限定位置鉴定SNP的方法，该方法包括(a)形成包括第一个寡核苷酸引物(ODNP)、第二个ODNP和目标核酸的混合物，其中如果(i)目标核酸是具有第一链和第二链的双链核酸，那么第一个ODNP包含至少基本与位于SNP互补链3’的目标核酸第一链的核苷酸序列互补的核苷酸序列，且第二个ODNP包含至少基本与位于SNP的3’的目标核酸第二链的核苷酸序列互补的核苷酸序列，然而，如果(ii)目标核酸是单链核酸，那么第一个ODNP包含至少基本与位于SNP的5’的目标核酸的核苷酸序列相同的核苷酸序列，且第二个ODNP包含至少基本与位于SNP的3’的目标核酸的核苷酸序列互补的核苷酸序列，而第一个和第二个ODNP各自进一步包含相同切割性内切核酸酶识别序列(NERS)的有义链的核苷酸序列。(b)延伸第一个和第二个ODNP以生产包含两个NERS的延伸产物。(c)用步骤(b)的延伸产物的一条链作为模板，在识别NERS的切割性内切核酸酶(NE)存在时，于等温条件下扩增含有不超过17个核苷酸的单链核酸片段。(d)至少部分用液相层析和/或质谱分析法表征步骤(c)的单链片段以借此鉴定SNP。在另外一个方面，本发明提供了在单链目标核酸的限定位置鉴定单核苷酸多态(SNP)的方法，该方法包括：(a)形成包括第一个寡核苷酸引物(ODNP)、第二个ODNP和目标核酸的混合物，其中第一个ODNP包含至少基本与位于限定位置3’的目标核酸的核苷酸序列互补的核苷酸序列，第二个ODNP包含至少基本与目标核酸互补链的核苷酸序列互补的核苷酸序列，所述目标核酸互补链的核苷酸序列位于限定位置的核苷酸的至少基本互补的核苷酸的3’，第一个和第二个ODNP各自进一步包含中断的限制性内切核酸酶识别序列(IRERS)(而不是完整的IRERS)的第一条链的第一个不变识别序列(CRS)和第二条链的第二个CRS，完整的IRERS是具有第一链和第二链的双链核酸且包含由可变识别序列(VRS)连接的第一个和第二个CRS，且第一个或第二个ODNP进一步包含位于第一个CRS或第二个CRS的5’的NERS。(b)延伸第一个和第二个ODNP以生产具有NERS和完整IRERS的片段，其中SNP位于VRS中。(c)用步骤(b)的延伸产物的一条链作为模板，在识别NERS的切割性内切核酸酶(NE)存在时，于等温条件下扩增单链核酸片段，其中单链片段含有不超过17个核苷酸。(d)至少部分用液相层析和/或质谱分析法表征步骤(c)的单链片段以借此鉴定SNP。
作为实行在目标核酸的限定位置鉴定遗传变异如SNP的方法的方便方式，本发明提供了各种试剂盒。在一方面，当目标核酸是双链即具有第一和第二链时，特别有用的本发明的试剂盒包括：(i)包括切割性内切核酸酶识别序列(NERS)的有义链的核苷酸序列且也包括至少基本与位于遗传变异互补链3’的目标核酸第一链的核苷酸序列互补的核苷酸序列的第一个寡核苷酸引物(ODNP)。(ii)包括至少基本与位于遗传变异3’的目标核酸的第二链的核苷酸序列互补的核苷酸序列的第二个ODNP。第二个ODNP可选择地也含有限制性内切核酸酶识别序列(RERS)的一条链的核苷酸序列。在另一方面，当目标核酸是单链时，特别有用的本发明的试剂盒包括：(i)包括与NERS的有义链相同的核苷酸序列且进一步包括至少基本与位于遗传变异互补链5’的目标核酸中存在的核苷酸序列相同的核苷酸序列的第一个ODNP。(ii)包括至少基本与位于遗传变异3’的目标核酸中存在的核苷酸序列互补的核苷酸序列的第二个ODNP。第二个ODNP可选择地包括RERS的一条链中存在的核苷酸序列。在另外一个方面，本发明提供了在目标核酸的限定位置鉴定遗传变异的试剂盒，该试剂盒当目标核酸是双链即具有第一链和第二链时特别有用，该试剂盒包括：(i)包括至少基本与位于遗传变异互补链3’的目标核酸的第一链的核苷酸序列互补的核苷酸序列的第一个ODNP。(ii)包括至少基本与位于遗传变异3’的目标核酸的第二链的核苷酸序列互补的核苷酸序列的第二个ODNP。在该试剂盒中，第一个和第二个ODNP各自进一步包括切割性内切核酸酶识别序列(NERS)的有义链的序列。在另外一个方面，本发明提供了在目标核酸的限定位置鉴定遗传变异的试剂盒，该试剂盒当目标核酸是单链时特别有用，该试剂盒包括：(i)包括至少基本与位于遗传变异5’的目标核酸的核苷酸序列相同的核苷酸序列的第一个ODNP。(ii)包括至少基本与位于遗传变异3’的目标核酸的核苷酸序列互补的核苷酸序列的第二个ODNP。在该试剂盒中，第一个和第二个ODNP各自进一步包括切割性内切核酸酶识别序列(NERS)的有义链的序列。本发明也提供了在具有第一和第二链的目标核酸的限定位置鉴定遗传变异的试剂盒，包含：第一个寡核苷酸引物(ODNP)和第二个寡核苷酸引物(ODNP)，其中(a)第一个ODNP包含至少基本与位于遗传变异互补链3’的目标核酸的第一链的核苷酸序列互补的核苷酸序列，(b)第二个ODNP包含至少基本与位于遗传变异3’的目标核酸的第二链的核苷酸序列互补的核苷酸序列，(c)第一个和第二个ODNP各自进一步包含切割性内切核酸酶识别序列(NERS)的有义链的序列；和(d)由识别NERS的切割性内切核酸酶在一条链产生的切割位点(NS)和相应于由NE在另一条链上产生的NS的位置之间的距离不超过25个核苷酸。本发明也提供了在单链目标核酸的限定位置鉴定遗传变异的试剂盒，包含：第一个寡核苷酸引物(ODNP)和第二个寡核苷酸引物(ODNP)，其中(a)第一个ODNP包含至少基本与位于遗传变异5’的目标核酸的核苷酸序列相同的核苷酸序列，(b)第二个ODNP包含至少基本与位于遗传变异3’的目标核酸的核苷酸序列互补的核苷酸序列，(c)第一个和第二个ODNP各自进一步包含切割性内切核酸酶识别序列(NERS)的有义链的序列，和(d)由识别NERS的切割性内切核酸酶在一条链产生的切割位点(NS)和相应于由NE在另一条链上产生的NS的位置之间的距离不超过25个核苷酸。
可选择地，在这些在目标核酸的限定位置鉴定遗传变异如SNP的试剂盒中，可存在下面的标准和/或成分，而任何两个标准和/或成分可以进行组合以描述试剂盒或其内容：在根据本发明的方法用第一个和第二个ODNP作为引物及用目标核酸作为模板进行扩增的双链核酸分子中，由识别NERS的切割性内切核酸酶(NE)在一条链产生的切割位点(NS)和相应于由识别RERS的限制性内切核酸酶(RE)在另一条链上产生的切割位点的位置之间的距离不超过40个、或不超过39个、或不超过38个、或不超过37个、或不超过36个、或不超过35个、或不超过34个、或不超过33个、或不超过32个、或不超过31个、或不超过30个、或不超过29个、或不超过28个、或不超过27个、或不超过26个、或不超过25个、或不超过24个、或不超过23个、或不超过22个、或不超过21个、或不超过20个、或不超过19个、或不超过18个、或不超过17个、或不超过16个、或不超过15个、或不超过14个、或不超过13个、或不超过12个、或不超过11个、或不超过10个、或不超过9个、或不超过8个、或不超过7个、或不超过6个、或不超过5个核苷酸；在用第一个和第二个ODNP作为引物及用目标核酸作为模板进行扩增的双链核酸分子中，由识别NERS的切割性内切核酸酶(NE)在一条链产生的切割位点(NS)和相应于由NE在另一条链上产生的NS的位置之间的距离不超过40个、或不超过39个、或不超过38个、或不超过37个、或不超过36个、或不超过35个、或不超过34个、或不超过33个、或不超过32个、或不超过31个、或不超过30个、或不超过29个、或不超过28个、或不超过27个、或不超过26个、或不超过25个、或不超过24个、或不超过23个、或不超过22个、或不超过21个、或不超过20个、或不超过19个、或不超过18个、或不超过17个、或不超过16个、或不超过15个、或不超过14个、或不超过13个、或不超过12个、或不超过11个、或不超过10个、或不超过9个、或不超过8个、或不超过7个、或不超过6个、或不超过5个核苷酸；NERS具有序列5’GAGTC3’；N.BstNB I；N.BstNB I的缓冲液；识别RERS的限制性内切核酸酶(RE)；RE的缓冲液；DNA聚合酶；选自exo-Bst聚合酶、exo-Bca聚合酶、9°NmTM DNA聚合酶和exo-Vent聚合酶的DNA聚合酶；DNA聚合酶的缓冲液；NE和DNA聚合酶两者的缓冲液；使用试剂盒的说明书；液相层析柱；反相液相层析柱；包含水和与有机或无机酸复合的仲或叔胺铵盐的缓冲液A，该铵盐的胺成分可选择地选自三乙胺、二烯丙基胺、二异丙基胺、N，N-二甲基-N-环己基胺、N，N-二甲基-N-异丙基胺和N，N-二甲基-N-丁胺，该仲或叔胺可选择地与有机酸复合，该有机酸可选择地选自乙酸、丙酸及其卤化形式；包含缓冲液A和有机溶剂的缓冲液B，该有机溶剂可选择地选自甲醇和乙腈；脱氧核苷三磷酸；修饰的脱氧核苷三磷酸；对照模板核酸分子和对照ODNP对；海藻糖；寡核苷酸标准；和/或用于设计或定购ODNP对的软件存取码。例如，试剂盒可进一步包括识别RERS的RE和RE的缓冲液、识别NERS的NE和NE的缓冲液以及DNA聚合酶和DNA聚合酶的缓冲液。
除提供了在目标核酸的限定位置鉴定遗传变异的方法之外，本发明还提供了在(多个)目标核酸的限定位置多重鉴定(多个)遗传变异的方法。因而，单个样品可含有两个或多个核酸，每一个核酸均具有遗传变异。通过适当选择引物，可分析具有特定遗传变异的核酸的存在与否，或特定遗传变异是否存在于特定核酸样品中，该样品含有多个潜在的遗传变异。例如，在一方面，本发明提供了在目标核酸的限定位置多重鉴定遗传变异的方法，该方法包括：(a)对于所研究的目标核酸中的每一个遗传变异，(i)形成包括第一个寡核苷酸引物(ODNP)、第二个ODNP和目标核酸的混合物，其中a)如果研究中的目标核酸是具有第一链和第二链的双链核酸，那么第一个ODNP包含切割性内切核酸酶识别序列(NERS)的有义链的序列和至少基本与位于遗传变异互补链3’的目标核酸第一链的核苷酸序列互补的核苷酸序列，且第二个ODNP包含限制性内切核酸酶识别序列(RERS)的一条链的可选择的序列和至少基本与位于遗传变异3’的目标核酸第二链的核苷酸序列互补的核苷酸序列，而b)如果研究中的目标核酸是单链核酸，那么第一个ODNP包含NERS的有义链的序列和至少基本与位于遗传变异5’的目标核酸的核苷酸序列相同的核苷酸序列，且第二个ODNP包含RERS的一条链的可选择的序列和至少基本与位于遗传变异3’的目标核酸的核苷酸序列互补的核苷酸序列。(ii)延伸第一个和第二个ODNP以生产由第一个和第二个ODNP包围的片段，其中延伸反应可单独对每一个目标核酸或共同对超过一个目标核酸来进行。(b)可选择地，即该步骤可根据本发明的方法进行或不进行，用识别RERS的RE切割延伸产物以提供消化产物。(c)用步骤(a)(ii)的每一个延伸产物或步骤(c)的每一个消化产物的一条链作为模板，在识别NERS的切割性内切核酸酶(NE)存在时扩增单链核酸片段。(d)表征扩增的单链片段以借此鉴定遗传变异。在相关方面，本发明提供了在目标核酸的限定位置多重鉴定单核苷酸多态的方法，该方法包括：(a)对于每一个目标核酸，(i)形成包括第一个寡核苷酸引物(ODNP)、第二个ODNP和目标核酸的混合物，其中a)如果目标核酸是具有第一链和第二链的双链核酸，那么第一个ODNP包含切割性内切核酸酶识别序列(NERS)的有义链的序列和至少基本与位于SNP互补链3’的目标核酸第一链的核苷酸序列互补的核苷酸序列，且第二个ODNP包含限制性内切核酸酶识别序列(RERS)的一条链的序列和至少基本与位于SNP的3’的目标核酸第二链的核苷酸序列互补的核苷酸序列，或者如果b)目标核酸是单链核酸，那么第一个ODNP包含NERS的有义链的序列和至少基本与位于SNP的5’的目标核酸的核苷酸序列相同的核苷酸序列，且第二个ODNP包含RERS的一条链的序列和至少基本与位于SNP的3’的目标核酸的核苷酸序列互补的核苷酸序列。(ii)延伸第一个和第二个ODNP以生产由第一个和第二个ODNP包围的片段，其中延伸反应可单独对每一个目标核酸或共同对超过一个目标核酸来进行。(b)用识别RERS的RE切割延伸产物以提供消化产物。(c)用步骤(a)(ii)的每一个延伸产物或步骤(c)的每一个消化产物的一条链作为模板，在识别NERS的切割性内切核酸酶存在时扩增单链核酸片段，优选在等温条件下。(d)至少部分用液相层析和/或质谱分析法来表征单链片段以借此鉴定遗传变异。
在相关方面，本发明提供了在目标核酸的限定位置多重鉴定遗传变异的方法，该方法包括：(a)对于每一个目标核酸，(i)形成包括第一个寡核苷酸引物(ODNP)、第二个ODNP和目标核酸的混合物，其中a)如果且当目标核酸是具有第一链和第二链的双链核酸时，那么第一个ODNP包含至少基本与位于遗传变异互补链3’的目标核酸第一链的核苷酸序列互补的核苷酸序列，且第二个ODNP包含至少基本与位于遗传变异3’的目标核酸第二链的核苷酸序列互补的核苷酸序列，然而，如果且当b)目标核酸是单链核酸时，那么第一个ODNP包含至少基本与位于遗传变异5’的目标核酸的核苷酸序列相同的核苷酸序列，且第二个ODNP包含至少基本与位于遗传变异3’的目标核酸的核苷酸序列互补的核苷酸序列，在每一种情况下，第一个和第二个ODNP各自进一步包含切割性内切核酸酶识别序列(NERS)的有义链的序列，(ii)延伸第一个和第二个ODNP以生产具有两个NERS的片段，其中延伸反应可单独对每一个目标核酸或共同对超过一个目标核酸来进行。(b)用每一个延伸产物的一条链作为模板，在识别NERS的切割性内切核酸酶(NE)存在时扩增单链核酸片段。(c)表征步骤(b)的单链片段以借此鉴定遗传变异。在相关方面，本发明提供了在目标核酸的限定位置多重鉴定单核苷酸多态(SNP)的方法，该方法包括：(a)对于每一个目标核酸，(i)形成包括第一个寡核苷酸引物(ODNP)、第二个ODNP和目标核酸的混合物，其中如果a)目标核酸是具有第一链和第二链的双链核酸，那么第一个ODNP包含至少基本与位于SNP互补链3’的目标核酸第一链的核苷酸序列互补的核苷酸序列，且第二个ODNP包含至少基本与位于SNP的3’的目标核酸第二链的核苷酸序列互补的核苷酸序列，然而，如果b)目标核酸是单链核酸，那么第一个ODNP包含至少基本与位于SNP的5’的目标核酸的核苷酸序列相同的核苷酸序列，且第二个ODNP包含至少基本与位于SNP的3’的目标核酸的核苷酸序列互补的核苷酸序列，在每一种情况下，第一个和第二个ODNP各自进一步包含同一切割性内切核酸酶识别序列(NERS)的有义链的序列；且(ii)延伸第一个和第二个ODNP以生产具有两个NERS的片段，其中延伸反应可单独对每一个目标核酸或共同对超过一个目标核酸来进行。(b)用每一个延伸产物的一条链作为模板，在识别NERS的切割性内切核酸酶(NE)存在时，于等温条件下扩增单链核酸片段，其中单链核酸片段各自优选地含有不超过17个核苷酸。(c)至少部分用液相层析和/或质谱分析法来表征步骤(b)的单链片段以借此鉴定遗传变异。
在(多个)目标核酸的限定位置多重鉴定(多个)遗传变异的方法中，一种或多种额外的标准可用于描述该方法，而这些额外的标准在此处公开并包括那些在上文中连同用于在目标核酸的限定位置鉴定遗传变异如SNP的本发明的方法一起阐明的标准，这些标准的任何一个或多个可用于描述本发明的方法。例如，一些可用于描述在(多个)目标核酸的限定位置多重鉴定(多个)遗传变异的方法的标准包括：至少一个遗传变异是SNP；至少一个遗传变异与疾病如人类遗传疾病相关；至少一个遗传变异与病原微生物的药物抗性相关；至少一个目标核酸是基因组核酸；至少一个目标核酸是cDNA；至少一个目标核酸源自病原病毒的基因组；至少一个目标核酸源自病原细菌的基因组；至少一个目标核酸源自病原细菌的附加体；如果目标核酸是双链时至少基本与目标核酸第一链互补的或如果目标核酸是单链时与目标核酸相同的第一个ODNP的核苷酸序列长度为至少8个、或至少9个、或至少10个、或至少11个、或至少12个、或至少13个、或至少14个、或至少15个核苷酸；如果目标核酸是双链时至少基本与目标核酸第二链互补的或如果目标核酸是双链时与目标核酸互补的第二个ODNP的核苷酸序列长度为至少8个、或至少9个、或至少10个、或至少11个、或至少12个、或至少13个、或至少14个、或至少15个核苷酸；RERS可由II型限制性内切核酸酶识别；RERS可由IIs型限制性内切核酸酶识别；RERS可由Bpm I识别；RERS可由间断的限制性内切核酸酶识别；NERS是5’GAGTC3’；延伸是用聚合酶链反应进行的；扩增是在DNA聚合酶如exo-Bst聚合酶、exo-Bca聚合酶、9°NmTM DNA聚合酶或exo-Vent聚合酶存在时进行的；扩增是在等温条件下进行的；步骤(c)的单链核酸片段含有不超过20个、或不超过19个、或不超过18个、或不超过17个、或不超过16个、或不超过15个、或不超过14个、或不超过13个、或不超过12个、或不超过11个、或不超过10个核苷酸；表征包括一种或多种选自质谱分析法、液相层析、荧光偏振、电子电离、凝胶电泳和毛细管电泳的技术；表征是由包括质谱分析法的一种或多种方法进行的；该方法进一步包括在进行步骤(c)之前组合步骤(a)(ii)中至少两个延伸反应的产物的步骤；在进行步骤(c)之前组合步骤(a)(ii)中每一个延伸反应的产物的步骤；该方法包括用识别RERS的RE切割延伸产物以提供消化产物的步骤；该方法省略了用识别RERS的RE切割延伸产物的步骤，从而未形成消化产物。
在另一套相关的实施方案中，本发明提供了可用于在目标核酸的位置多重鉴定遗传变异的方法的试剂盒。在这些实施方案之一中，对于每一个研究中的目标核酸，该试剂盒包括：(a)如果目标核酸是具有第一和第二链的双链核酸，那么试剂盒具有(i)包含切割性内切核酸酶识别序列(NERS)的有义链的序列及至少基本与位于遗传变异互补链3’的目标核酸第一链的核苷酸序列互补的核苷酸序列的第一个寡核苷酸引物(ODNP)，和(ii)可选择地包括限制性内切核酸酶识别序列(RERS)的一条链的核苷酸序列的且具有至少基本与位于遗传变异3’的目标核酸第二链的核苷酸序列互补的核苷酸序列的第二个ODNP；且如果(b)一个或多个目标核酸是单链的，那么对于每一个单链目标核酸，该试剂盒包括：(i)包含NERS的有义链的序列和至少基本与位于遗传变异5’的目标核酸的核苷酸序列相同的核苷酸序列的第一个ODNP，和(ii)第二个ODNP，该ODNP可选择地包含与RERS的一条链相同的核苷酸序列，并且必须含有至少基本与位于遗传变异3’的目标核酸的核苷酸序列互补的核苷酸序列。在相关方面，本发明提供了用于在目标核酸的限定位置多重鉴定遗传变异的方法的试剂盒，对于每一个研究中的目标核酸，该试剂盒包括：(a)如果特别的目标核酸是具有第一链和第二链的双链核酸，那么对于每一个类型的目标核酸，该试剂盒具有(i)包含至少基本与位于遗传变异互补链3’的目标核酸第一链的核苷酸序列互补的核苷酸序列的第一个寡核苷酸引物(ODNP)，和(ii)包含至少基本与位于遗传变异3’的目标核酸第二链的核苷酸序列互补的核苷酸序列的第二个ODNP；然而对于(b)每一个研究中的目标核酸是单链核酸，该试剂盒包括：(i)包含至少基本与位于遗传变异5’的目标核酸的核苷酸序列相同的核苷酸序列的第一个ODNP，和(ii)包含至少基本与位于遗传变异3’的目标核酸的核苷酸序列互补的核苷酸序列的第二个ODNP，其中第一个和第二个ODNP进一步包含切割性内切核酸酶识别序列(NERS)的有义链的序列。
在目标核酸的位置多重鉴定遗传变异的方法中特别有用的本发明的试剂盒中，一种或多种下面的标准可用于描述该试剂盒，而这些标准可进行任何组合，且该试剂盒设计为用于如在此处所描述的多重鉴定遗传变异的方法中，且这些标准是非限制性的，即其他标准可在文中其它地方出现：存在于核酸分子中的NERS具有序列5’GAGTC3’；N.BstNB I存在于试剂盒中；该试剂盒含有N.BstNB I的缓冲液；该试剂盒含有识别RERS的限制性内切核酸酶(RE)；该试剂盒含有RE的缓冲液；该试剂盒含有DNA聚合酶；该试剂盒含有一种或多种exo-Bst聚合酶、exo-Bca聚合酶、9°NmTM DNA聚合酶或exo-Vent聚合酶；该试剂盒含有DNA聚合酶的缓冲液；该试剂盒含有适合于切割性内切核酸酶和DNA聚合酶的缓冲液；该试剂盒含有适合于NE的缓冲液和适合于DNA聚合酶的不同缓冲液；使用试剂盒的说明书；液相层析柱；反相液相层析柱；包含水和与有机或无机酸复合的仲或叔胺铵盐的缓冲液A，该铵盐的胺成分可选择地选自三乙胺、二烯丙基胺、二异丙基胺、N，N-二甲基-N-环己基胺、N，N-二甲基-N-异丙基胺和N，N-二甲基-N-丁胺，该仲或叔胺可选择地与有机酸复合，该有机酸可选择地选自乙酸、丙酸及其卤化形式；包含缓冲液A和有机溶剂的缓冲液B，该有机溶剂可选择地选自甲醇和乙腈；脱氧核苷三磷酸；修饰的脱氧核苷三磷酸；对照模板核酸分子和对照ODNP对；海藻糖；寡核苷酸标准；和/或用于设计或定购ODNP对的软件存取码。例如，试剂盒可进一步包括识别RERS的RE和RE的缓冲液、识别NERS的NE和NE的缓冲液以及DNA聚合酶和DNA聚合酶的缓冲液。
在另一方面，本发明提供了确定样品中目标核酸存在与否的方法。这些方法在诊断中是特别有用的，在该诊断中，想要的是确定特定样品如来自病人的样品是否含有特定目标核酸，如在致病生物体中通常发现的核酸。在一个实施方案中，该方法包括：(a)使存在于样品中的核酸分子与部分双链的寡核苷酸探针混合。使核酸分子与探针在允许探针与可能存在于样品中的目标核酸进行杂交的条件下混合。该探针特征在于具有：(i)可由切割剂(NA)识别的切割剂识别序列(NARS)，该切割剂在切割位点(NS)进行切割，和(ii)含有NS或进行延伸能含有NS的一条链中的5’突出端，或者不含有NS或不能进行延伸以含有NS的一条链中的3’突出端，其中在每一种情况下，突出端包括至少基本与存在于目标核酸中的核苷酸序列互补的核苷酸序列。(b)从步骤(a)的混合物中去除未杂交的探针。(c)在NA和DNA聚合酶存在时进行扩增反应以提供扩增产物，该扩增反应优选地是在与目标核酸杂交的探针上进行的。(d)探测步骤(c)的扩增产物的存在与否以借此确定样品中目标核酸的存在与否。在相关的涉及确定生物学样品中目标核酸存在与否的方法的方面，该方法包括(a)使样品的核酸分子与部分双链的寡核苷酸探针混合以使得探针与目标核酸进行杂交，该探针包含(i)可由切割性内切核酸酶(NE)识别的切割性内切核酸酶识别序列(NERS)，当识别了NERS之后，NE在双链核酸的称作切割位点(NS)的位置上产生了切口，和(ii)含有NS的探针链中的或进行延伸并在延伸后含有NS的探针链中的5’突出端，或者不含有NS的或不能进行延伸以含有NS的链中的3’突出端，其中突出端(不论5’还是3’)包含至少基本与目标核酸互补的核苷酸序列。(b)从步骤(a)的混合物中去除未杂交的探针。(c)在NA和DNA聚合酶存在时，优选地于等温条件下进行扩增反应以提供扩增产物，该扩增产物优选地含有不超过17个核苷酸。(d)优选地至少部分用液相层析和/或质谱分析法探测步骤(c)的扩增产物的存在与否，该探测步骤使得能够确定目标核酸是否存在于样品中。在相关方面，本发明提供了确定样品中是否存在目标核酸的方法，该方法包括：(A)形成混合物，该混合物包括：(i)来自目标样品的核酸分子，这些核酸分子可包括或不包括目标核酸；(ii)单链核酸探针，该探针从3’到5’包含：(a)至少基本与存在于目标核酸中的核苷酸序列互补的第一个核苷酸序列，(b)切割剂识别序列(NARS)反义链的核苷酸序列，和(c)第二个序列；(iii)识别NARS的切割性内切核酸酶(NA)、DNA聚合酶和一种或多种脱氧核苷三磷酸。(B)在一定条件下维持步骤(A)中的混合物，在该条件下如果目标核酸存在于样品中则可用单链核酸探针作为模板扩增单链核酸片段。在一个实施方案中，单链核酸片段长度最多为25个核苷酸。(C)探测步骤(B)中扩增的单链核酸片段的存在与否以确定样品中目标核酸的存在与否。在相关的实施方案中，本发明提供了确定样品中是否存在目标核酸的方法，该方法包括：(A)形成混合物，该混合物包括：(i)来自样品的核酸分子；(ii)单链核酸探针，该探针从3’到5’包含：(a)至少基本与存在于所研究的目标核酸中的核苷酸序列互补的核苷酸序列，(b)切割剂识别序列(NARS)有义链的核苷酸序列，和(iii)识别第一个NARS的切割性内切核酸酶(NA)、DNA聚合酶和一种或多种脱氧核苷三磷酸。(B)在一定条件下维持混合物，该条件使得如果目标核酸存在于样品中则能够扩增至少基本与目标核酸互补的单链核酸片段。在一个实施方案中，单链核酸片段长度最多为25个核苷酸。(C)探测步骤(B)中扩增的单链核酸片段的存在与否以确定样品中目标核酸的存在与否。在相关方面，本发明提供了确定样品中是否存在目标核酸的方法，该目标核酸包括切割剂识别序列(NARS)。该方法包括：(A)形成混合物，该混合物包括：(i)样品的核酸分子，和(ii)识别NARS的切割剂(NA)、DNA聚合酶和一种或多种脱氧核苷三磷酸。(B)在一定条件下维持(A)中的混合物，该条件使得如果目标核酸存在于样品中则可用目标核酸的部分作为模板扩增单链核酸片段。(C)探测步骤(B)中扩增的单链核酸片段的存在与否以确定样品中目标核酸的存在与否。在相关方面，本发明提供了确定目标核酸是否存在的方法，该目标核酸具有包括第一个切割剂识别序列(NARS)的核苷酸序列的核苷酸序列。该方法包括：(A)形成混合物，该混合物包括：(i)样品的核酸分子，(ii)基本与目标核酸的一条链相同且包含与NARS的反义链核苷酸序列相同的核苷酸序列的单链核酸探针，和(iii)识别NARS的切割剂(NA)、DNA聚合酶和一种或多种脱氧核苷三磷酸。(B)在一定条件下维持混合物，该条件使得在目标核酸存在于样品中的情况下可用探针的部分作为模板扩增单链核酸片段。(C)探测步骤(B)中单链核酸片段的存在与否以确定样品中目标核酸的存在与否。在相关的方法中，本发明提供了确定样品中是否存在目标核酸的方法。该方法包括：(A)形成包括第一个寡核苷酸引物(ODNP)、第二个ODNP和样品核酸分子的混合物，其中(i)如果目标核酸是具有第一链和第二链的双链核酸，那么第一个ODNP包含第一个限制性内切核酸酶识别序列(RERS)的有义链的核苷酸序列和至少基本与目标核酸第一链的第一部分互补的核苷酸序列，且第二个ODNP包含至少基本与目标核酸第二链的第二部分互补的核苷酸序列且包含第二个RERS的有义链的序列，其中该第二部分位于目标核酸第二链中第一部分互补链的3’，然而，如果(ii)目标核酸是单链核酸，那么第一个ODNP包含第一个RERS的有义链的核苷酸序列和至少基本与目标核酸第一部分相同的核苷酸序列，且第二个ODNP包含至少基本与目标核酸第二部分互补的核苷酸序列且包含第二个RERS的有义链的序列，其中该第二部分位于目标核酸中第一部分的5’。(B)将(A)的混合物置于一定条件下，如果目标核酸存在于样品中，该条件将：(i)延伸第一个和第二个ODNP以生产包含第一个和第二个RERS两者的延伸产物；和(ii)用步骤(B)(i)的延伸产物的一条链作为模板，在识别第一个和第二个RERS的一种或多种限制性内切核酸酶(RE)存在时扩增单链核酸片段。在一个实施方案中，单链核酸片段长度最多为25个核苷酸。(C)探测步骤(B)中扩增的单链核酸片段的存在与否以确定样品中目标核酸的存在与否。可选择地，第一个RERS与第二个RERS相同。在相关方面，本发明提供了确定样品中是否存在目标核酸的方法。该方法包括：(A)形成包括第一个寡核苷酸引物(ODNP)、第二个ODNP和样品核酸分子的混合物，其中(i)如果目标核酸是具有第一链和第二链的双链核酸，那么第一个ODNP包含存在于第一个切割性内切核酸酶识别序列(NERS)的有义链中的核苷酸序列和至少基本与目标核酸第一链的第一部分互补的核苷酸序列，且第二个ODNP包含至少基本与目标核酸第二链的第二部分互补的核苷酸序列且进一步包含第二个NERS的有义链的核苷酸序列，其中该第二部分位于目标核酸第二链中第一部分互补链的3’，或者，如果(ii)目标核酸是单链核酸，那么第一个ODNP包含第一个NERS的有义链的核苷酸序列和至少基本与目标核酸第一部分相同的核苷酸序列，而第二个ODNP包含至少基本与目标核酸第二部分互补的核苷酸序列且进一步包含第二个NERS的有义链的序列，其中该第二部分位于目标核酸中第一部分的5’。(B)将混合物置于一定条件下，如果目标核酸存在于样品中，则(i)延伸第一个和第二个ODNP以生产包含第一个和第二个NERS两者的延伸产物；和(ii)用步骤(B)(i)的延伸产物的一条链作为模板，在识别第一个和第二个NERS的一种或多种切割性内切核酸酶(NE)存在时扩增单链核酸片段。在一个实施方案中，单链核酸片段长度为最多25个核苷酸。(C)探测步骤(B)中扩增的单链核酸片段的存在与否以确定样品中目标核酸的存在与否。在一个实施方案中，第一个NERS与第二个NERS相同。在另一个相关方面，本发明提供了确定样品中是否存在目标核酸的方法，该方法包括：(A)形成混合物，该混合物包括：(i)来自样品的核酸分子，和(ii)单链核酸探针，该探针从3’到5’包含至少基本与位于或靠近目标核酸5’末端的目标核酸部分互补的核苷酸序列和切割剂识别序列(NARS)反义链的序列。(B)将与目标杂交的探针分子如果存在与那些未与目标杂交的进行分离。(C)在与目标杂交的探针分子(如果存在)和识别NARS的切割剂(NA)存在时进行扩增反应。(D)探测步骤(C)中用单链核酸探针作为模板扩增的单链核酸片段的存在与否以确定样品中目标核酸的存在与否。在本发明涉及确定样品中是否存在目标核酸的方法的另一个相关方面，本发明提供了方法，包括：(A)形成混合物，该混合物包括：(i)样品的核酸分子，(ii)经由其5’末端固定于固体支持体上的单链核酸探针，该探针从3’到5’的方向包含：(a)至少基本与位于或靠近目标的3’末端的目标部分互补的核苷酸序列，和(b)切割剂识别序列有义链的序列。(B)去除样品中未与探针进行杂交的核酸分子，使其不与固体支持体接触。(C)在固定于步骤(B)的固体支持体上的探针和识别切割剂识别序列的切割剂存在时进行扩增反应。(D)探测步骤(C)中用目标核酸的部分作为模板扩增的单链核酸片段的存在与否以确定样品中目标核酸的存在与否。
在本发明涉及确定样品中目标核酸存在与否的各个实施方案中，一种或多种下面的标准可用于描述实施方案，而任何2个、3个、4个等标准可进行组合以描述实施方案，且这些实施方案是附加于其他在别处描述的实施方案的：步骤(d)至少部分由选自发光光谱法、荧光光谱法、质谱分析法、液相层析、荧光偏振、凝胶电泳和毛细管电泳的技术进行，而表征可由这些技术的1种、2种、3种或更多来进行，和/或表征可用其他适当的和/或易于采用的表征技术加上这些技术的1种、2种、3种或更多来进行；样品中的目标核酸均为单链的；样品中的目标核酸均为双链的；样品中的目标核酸是单链和双链目标核酸的混合物；含有目标核酸或目标核酸所源自的生物学样品源自哺乳动物，如人类、母牛、马、狗、绵羊、鹿、猪，或可描述为来自患者的；目标核酸是源自宿主的核酸分子，该宿主选自细菌、和/或病毒、和/或真菌、和/或寄生物；NA是N.BstNB I；扩增是在DNA聚合酶存在时进行的，下面是示例性的适当的DNA聚合酶，且下面的DNA聚合酶中的任何两个或更多可进行组合以形成本发明所用的DNA聚合酶所选自的组合：exo-Vent、exo-Deep Vent、exo-Bst、exo-Pfu、exo-Bca、Taq、DNA聚合酶I的Klenow片段、T5 DNA聚合酶、Phi29 DNA聚合酶、噬菌体M2 DNA聚合酶、噬菌体phiPRD1 DNA聚合酶、测序酶、PRD1DNA聚合酶、9°NmTM DNA聚合酶和T4 DNA聚合酶，例如，聚合酶可选自exo-Bst聚合酶、exo-Bca聚合酶、9°NmTM DNA聚合酶或exo-Vent聚合酶；扩增是在等温条件下进行的；扩增是在标记的脱氧核苷三磷酸存在时进行的；扩增是在标记的脱氧核苷三磷酸存在时进行的，该标记的脱氧核苷三磷酸是与标记连接的脱氧核苷三磷酸，该标记可为放射性标记和/或酶和/或荧光染料和/或洋地黄毒苷和/或生物素，这些是示例性的标记；探测扩增产物是否已形成，且如果已形成了，则进一步探测扩增产物的一些或全部核苷酸序列，这是至少部分由一种或多种包括发光光谱法、荧光光谱法、质谱分析法、液相层析、荧光偏振、凝胶电泳和毛细管电泳的技术实现的，例如，分析可用发光光谱法、荧光光谱法或质谱分析法实现；如果存在，扩增产物含有不超过3个、或4个、或5个、或6个、或7个、或8个、或9个、或10个、或11个、或12个、或13个、或14个、或15个、或16个、或17个、或18个、或19个、或20个、或21个、或22个、或23个、或24个、或25个、或26个、或27个、或28个、或29个、或30个、或31个、或32个、或33个、或34个、或35个、或36个、或37个、或38个、或39个、或40个、或41个、或42个、或43个、或44个、或45个、或46个、或47个、或48个、或49个、或不超过50个核苷酸；存在于样品中的核酸分子固定于固体支持体上；扩增产物在探测之前固定于固体基质上；单链核酸探针固定于固体支持体上。
作为进行确定特定目标核酸是否存在于样品中的方法的方式，本发明提供了各种试剂盒。在各个实施方案中，试剂盒包括一种或多种下面的成分，而这些成分的任何两个或多个可进行组合以描述根据本发明的试剂盒：如在前文描述的涉及确定样品中目标核酸是否存在的方法中的部分双链寡核苷酸探针；两个单链寡核苷酸，当它们相互退火时，产生如在前文涉及确定样品中目标核酸是否存在的方法中描述的双链寡核苷酸探针；其中NARS由N.BstNB I识别的试剂盒；包括N.BstNB I的试剂盒；N.BstNB I的缓冲液；识别NARS的NA；DNA聚合酶；DNA聚合酶的缓冲液；适合于NE和DNA聚合酶两者的缓冲液；适合于NE的缓冲液和适合于DNA聚合酶的不同缓冲液；exo-Bst聚合酶、exo-Bca聚合酶、9°NmTM DNA聚合酶和exo-Vent聚合酶中的至少一种；标记的脱氧核苷三磷酸，该标记的脱氧核苷三磷酸可为如与放射性标记连接的、与酶连接的、与荧光染料连接的、与洋地黄毒苷连接的或与生物素连接的脱氧核苷三磷酸；使用试剂盒的说明书；液相层析柱；反相液相层析柱；包含水和与有机或无机酸复合的仲或叔胺铵盐的缓冲液A，该铵盐的胺成分可选择地选自三乙胺、二烯丙基胺、二异丙基胺、N，N-二甲基-N-环己基胺、N，N-二甲基-N-异丙基胺和N，N-二甲基-N-丁胺，该仲或叔胺可选择地与有机酸复合，该有机酸可选择地选自乙酸、丙酸及其卤化形式；包含缓冲液A和有机溶剂的缓冲液B，该有机溶剂可选择地选自甲醇和乙腈；脱氧核苷三磷酸；修饰的脱氧核苷三磷酸；对照模板核酸分子和对照ODNP对；海藻糖；寡核苷酸标准；用于设计或定购探针的软件存取码；用可结合核酸分子的化学层包被的针，例如用聚乙烯亚胺层包被的针，或用PDADMAC即聚二烯丙基二甲基氯化铵(polydiallyldimethylammonium chloride)包被的针；和/或海藻糖。
本发明也提供了多重确定生物学样品中多个目标核酸存在与否的方法。在一个实施方案中，该方法包括：(a)使来自生物学样品中的核酸分子与部分双链的寡核苷酸探针混合以使得探针与可能存在于样品中的任何目标核酸进行杂交，其中每一个探针包含：(1)可由NA识别的切割剂识别序列(NARS)，当识别了NARS之后，NA将在位于称作切割位点(NS)的位置切割核酸的双链部分，(2)含有NS或能延伸以含有NS的链中的5’突出端，或者不含有NS且根据本发明的方法不能进行延伸以形成NS的链中的3’突出端，该突出端(不论是5’还是3’)包含至少基本与存在于目标核酸互补的核苷酸序列，和(3)位于不含有NS且根据本发明的方法不能进行延伸以形成NS的链中的序列，该序列位于相应于NS的位置的5’，且该序列唯一地与目标核酸(其中突出端与该目标核酸至少基本互补)相关。(3)的序列有效地提供了对于特定目标核酸唯一的信号，从而对该信号的探测表示由(3)的序列“编码”的特定目标核酸的存在。(b)从步骤(a)的混合物中去除未杂交的探针。(c)在NA和DNA聚合酶存在时进行扩增反应。(d)探测步骤(c)的扩增产物的存在与否以借此确定生物学样品中与扩增产物序列相关的目标核酸的存在与否。在另一个相关方面，本发明提供了多重确定生物学样品中目标核酸存在与否的方法，该方法包括：(a)使生物学样品中的核酸分子与部分双链的寡核苷酸探针在使得探针能够与目标核酸进行杂交的条件下混合，其中每一个探针包含：(1)可由切割性内切核酸酶(NE)识别的切割性内切核酸酶识别序列(NERS)，该NE可在靠近NERS的称作切割位点(NS)的位点切割双链核酸分子，(2)不含有NS且根据本发明的方法不能进行延伸以形成NS的链中的5’突出端，或者不含有NS且根据本发明的方法不能进行延伸以形成NS的链中的3’突出端，该突出端(不论是5’还是3’突出端)包含至少基本与目标核酸互补的核苷酸序列，和(3)位于不含有NS且根据本发明的方法不能进行延伸以形成NS的链中的序列，该序列位于相应于NS的位置的5’，且该序列唯一地与目标核酸(其中突出端与该目标核酸至少基本互补)相关。(3)的序列有效地提供了对于特定目标核酸唯一的信号，从而对该信号的探测表示由(3)的序列“编码”的特定目标核酸的存在。(b)从步骤(a)的混合物中去除未杂交的探针。(c)在NE和DNA聚合酶存在时，优选地于等温条件下进行扩增反应以提供扩增产物。在各个实施方案中，扩增产物各自含有不超过17、16、15、14、13或12个核苷酸。(d)探测步骤(c)的扩增产物的存在与否以确定生物学样品中与扩增产物的序列相关的目标核酸的存在。可选择地，探测步骤需要至少部分使用液相层析和/或质谱分析法。
在进一步描述本发明涉及多重确定生物学样品中目标核酸存在与否的方法中，可利用一个或多个额外的标准。部分地，在上文中连同本发明涉及确定样品中目标核酸存在与否的方法一起阐明的标准也可以任何组合用于进一步表征本发明涉及多重确定生物学样品中目标核酸存在与否的方法。例如，样品可来自患者。其他适合于进一步表征多重确定生物学样品中目标核酸存在与否的标准可出现于文中别处。同样地，该方法可用固定于固体支持体上的核酸分子来进行。例如，可将探针以任何阵列形式固定于固体支持体上的唯一位置。可选择地，可将探针无区别地固定于固体支持体上。在每一种情况下，含有目标核酸的样品将与固定的探针接触。可选择地，可将目标核酸固定于固体支持体上，然后将探针添加到支持体上以使其与固定的目标接触。
本发明也提供了可用于如在此处所描述的多重确定生物学样品中几个目标核酸存在与否的方法中的试剂盒。这些试剂盒可包括前文中对用于非多重方法中的试剂盒描述的成分中的一些或全部，该非多重方法为确定一个生物学样品中一个目标核酸存在与否的方法。对于多重方法特别有用的该试剂盒可简单地包括更多探针，或更多可用于制备探针的单链寡核苷酸，从而检验多个目标的存在。同样地，当试剂盒含有多个探针(或探针成分)时，设计该多个探针或其成分以对不同目标提供独特信号。在一方面，该试剂盒含有2个不同的探针(或探针成分)，而在另一方面，试剂盒含有3个、或4个、或5个、或6个、或7个、或8个、或9个、或10个、或11个、或12个、或13个、或14个、或15个、或16个、或17个、或18个、或19个、或20个、或22个、或24个、或26个、或28个、或30个、或35个、或40个、或45个、或50个、或55个、或60个、或65个、或70个、或75个、或80个、或85个、或90个、或95个、或100个不同的探针或探针成分。该试剂盒可包括固定的探针，如在固体表面固定于唯一位置的探针，或在固体表面无区别地固定的探针。
当核酸根据本发明的方法或组合物或试剂盒固定于固体支持体上时，适当的固体支持体包括完全或部分由硅、玻璃、纸、陶瓷、金属、准金属(metalloid)和塑料形成的材料。在一个实施方案中，固体支持体是用结合核酸分子的化学层包被的。一种适当的化学层由聚乙烯亚胺形成。另一种适当的化学层由PDADMAC即聚二烯丙基二甲基氯化铵形成。
在另一方面，本发明提供了确定核酸分子群体中第一个核酸分子的数目与第二个核酸分子的数目之间的比率的方法，其中第一个和第二个核酸分子的核苷酸序列除限定的位置之外是相同的。该方法包括：(a)混合第一个寡核苷酸引物(ODNP)、第二个ODNP和核酸群体，其中如果(i)第一个和第二个核酸是双链的，均具有第一链和第二链，那么(a)第一个ODNP包含至少基本与存在于第一个核酸分子第一链的核酸序列互补的核苷酸序列，该序列位于限定位置的3’，和(b)第二个ODNP包含至少基本与存在于第一个核酸第二链的核酸序列互补的核苷酸序列，该核苷酸序列也位于限定位置的3’，然而，如果(ii)第一个和第二个核酸是单链的，那么(a)第一个ODNP包含至少基本与存在于第一个核酸分子中的核酸序列相同的核苷酸序列，该核苷酸序列位于限定位置的5’，和(b)第二个ODNP包含至少基本与存在于第一个核酸中的核酸序列互补的核苷酸序列，该序列位于限定位置的3’。此外，第一个ODNP和第二个ODNP的至少一个进一步包含切割剂识别序列(NARS)的有义链的核苷酸序列。(b)延伸第一个和第二个ODNP以生产包含第一个和第二个ODNP的片段。(c)在DNA聚合酶和识别NARS的切割剂(NA)存在时扩增单链核酸片段。(d)确定源自第一个核酸的步骤(c)的单链核酸片段的数目相对于源自第二个核酸的单链核酸片段数目的比率。本发明也提供了确定核酸分子群体中第一个核酸分子的数目与第二个核酸分子的数目之间的比率的方法，其中第一个和第二个核酸分子的核苷酸序列除限定的位置之外是相同的。该方法包括：(a)混合第一个ODNP、第二个ODNP和核酸群体，其中如果(i)第一个和第二个核酸是双链的(即每一个均具有第一链和第二链)，那么(a)第一个ODNP包含至少基本与第一个核酸分子第一链的核苷酸序列互补的核苷酸序列，该核苷酸序列位于限定位置的3’，和(b)第二个ODNP包含至少基本与第一个核酸第二链的核苷酸序列互补的核苷酸序列，该核苷酸序列位于限定位置的3’，或者，如果(ii)第一个和第二个核酸各自是单链的，那么(a)第一个ODNP包含至少基本与存在于第一个核酸分子中的核酸序列相同的核苷酸序列，该核苷酸序列在第一个核酸中位于限定位置的5’，和(b)第二个ODNP包含至少基本与存在于第一个核酸中的核苷酸序列互补的核苷酸序列，该核苷酸序列位于第一个核酸中限定位置的3’。此外，第一个ODNP和第二个ODNP的至少一个进一步包含切割性内切核酸酶识别序列(NERS)的有义链的核苷酸序列。(b)延伸第一个和第二个ODNP以生产包含第一个和第二个ODNP的片段。(c)在DNA聚合酶和识别NERS的切割性内切核酸酶(NE)存在时，优选地于等温条件下扩增单链核酸片段。在各个实施方案中，单链核酸片段各自含有不超过20个、或18个、或18个、或17个、或16个、或15个、或14个、或13个、或12个、或11个、或10个等核苷酸。(d)确定源自第一个核酸分子的步骤(c)的单链核酸片段的数目相对于源自第二个核酸分子的数目的比率。该确定可用如液相层析和质谱分析法的一种或两种来进行。在相关方法中，本发明提供了对在限定位置具有遗传变异的目标核酸分子的等位基因频率的确定，该目标核酸分子存在于核酸群体中。该方法包括：(a)混合第一个寡核苷酸引物(ODNP)、第二个ODNP和核酸群体，其中如果(i)目标核酸是双链的，从而具有第一链和第二链，那么(a)第一个ODNP包含至少基本与存在于目标核酸第一链的核苷酸序列互补的核苷酸序列，该核苷酸序列位于目标核酸中限定位置的3’，和(b)第二个ODNP包含至少基本与目标核酸第二链的核苷酸序列互补的核苷酸序列，该核苷酸序列位于目标核酸中限定位置的3’，然而，如果(ii)目标核酸是单链的，那么(a)第一个ODNP包含至少基本与存在于目标核酸中的核苷酸序列相同的核苷酸序列，该核苷酸序列位于目标核酸中限定位置的5’，和(b)第二个ODNP包含至少基本与存在于目标核酸中的核苷酸序列互补的核苷酸序列，该核苷酸序列位于目标核酸中限定位置的3’，且不论目标核酸是单链的还是双链的，第一个ODNP和第二个ODNP的至少一个进一步包含切割剂识别序列(NARS)的有义链的序列。(b)延伸第一个和第二个ODNP以生产包含第一个和第二个ODNP的片段。(c)在DNA聚合酶和识别NARS的切割剂(NA)存在时扩增单链核酸片段。(d)确定具有遗传变异的目标核酸分子相对于存在于样品中的所有目标核酸分子的等位基因频率。该确定为通过确定步骤(c)中形成的含有可选择地存在于目标核酸中的遗传变异的单链核酸片段(产物A)相对于步骤(c)中与产物A相同(除研究的遗传变异之外)的所有单链核酸片段的百分比以借此确定目标核酸的等位基因频率。在相关的实施方案中，本发明提供了确定在限定位置具有遗传变异的目标核酸分子的等位基因频率的方法，该目标核酸包含于核酸群体中。该方法包括：(a)混合第一个寡核苷酸引物(ODNP)、第二个ODNP和核酸分子群体(其中一些为目标核酸)，其中如果(i)目标核酸是双链的，从而具有第一链和第二链，那么(a)第一个ODNP包含至少基本与存在于目标核酸第一链的核苷酸序列互补的核苷酸序列，该核苷酸序列位于限定位置的3’，和(b)第二个ODNP包含至少基本与存在于目标核酸第二链的核苷酸序列互补的核苷酸序列，该核苷酸序列位于限定位置的3’，或者，如果(ii)目标核酸是单链的，那么(a)第一个ODNP包含至少基本与存在于目标核酸中的核苷酸序列相同的核苷酸序列，该核苷酸序列位于限定位置的5’，和(b)第二个ODNP包含至少基本与存在于目标核酸中的核苷酸序列互补的核苷酸序列，该核苷酸序列位于目标核酸中限定位置的3’。此外，第一个ODNP和第二个ODNP的至少一个进一步包含切割性内切核酸酶识别序列(NERS)的有义链的序列。(b)延伸第一个和第二个ODNP以生产包含第一个和第二个ODNP的片段。(c)在DNA聚合酶和识别NERS的切割性内切核酸酶(NE)存在时，优选地于等温条件下扩增单链核酸片段。在一个实施方案中，单链核酸片段各自含有不超过20个、或19个、或18个、或17个、或16个、或15个、或14个、或13个、或12个、或11个、或10个等核苷酸。(d)确定目标核酸中遗传变异的等位基因频率。该确定为通过如确定步骤(c)中形成的含有可选择地存在于目标核酸中的遗传变异的单链核酸片段(产物A)相对于步骤(c)中与产物A相同(除遗传变异之外)的所有单链核酸片段的百分比。这种确定可用液相层析和质谱分析法之一或二者来进行，这些技术仅仅是示例性的。
在相关的实施方案中，本发明方法涉及(i)确定存在于核酸分子群体中的第一个核酸分子的数目与存在于核酸分子群体中的第二个核酸分子的数目之间的比率，和(ii)确定核酸分子群体中具有遗传变异的目标核酸分子的等位基因频率。这些方法可各自同时在超过一个目标核酸分子上进行，即该方法可通过多重确定而进行。例如，在一方面，本发明提供了多重确定各自在限定位置具有遗传变异的目标核酸分子的等位基因频率的方法，其中这些目标核酸分子存在于核酸群体中，该方法包括：(a)混合核酸群体和ODNP对，每一个ODNP对相应于目标核酸之一并包含第一个ODNP和第二个ODNP，其中如果(i)研究中的目标核酸是双链的，从而具有第一链和第二链，那么(a)第一个ODNP包含至少基本与存在于目标核酸第一链的核苷酸序列互补的核苷酸序列，该核苷酸序列位于目标核酸中限定位置的3’，和(b)第二个ODNP包含至少基本与存在于目标核酸第二链的核苷酸序列互补的核苷酸序列，该核苷酸序列位于目标核酸中限定位置的3’，或者，如果(ii)研究中的目标核酸是单链的，那么(a)第一个ODNP包含至少基本与存在于目标核酸中的核苷酸序列相同的核苷酸序列，并且该核苷酸序列位于目标核酸中限定位置的5’，和(b)第二个ODNP包含至少基本与存在于目标核酸中的核苷酸序列互补的核苷酸序列，并且该核苷酸序列位于目标核酸中限定位置的3’。此外，第一个ODNP和第二个ODNP的至少一个进一步包含切割剂识别序列(NARS)的有义链的序列。(b)延伸每一个ODNP对的第一个和第二个ODNP以生产包含第一个和第二个ODNP的片段。(c)在DNA聚合酶和识别NARS的切割剂(NA)存在时，用步骤(b)的延伸产物作为模板扩增单链核酸片段。(d)对于每一个目标核酸，确定步骤(c)的含有目标核酸中的遗传变异的单链核酸片段(产物A)相对于步骤(c)中与产物A在遗传变异之外的部分相同的所有单链核酸片段的百分比以借此确定目标核酸的等位基因频率。
在相关方面，本发明提供了多重确定在限定位置具有遗传变异的目标核酸分子的等位基因频率的方法，这些目标核酸分子包含于核酸群体中，且该方法包括：(a)混合核酸群体和ODNP对，每一个ODNP对相应于目标核酸之一并包含第一个ODNP和第二个ODNP，其中如果(i)研究中的目标核酸是双链的(从而具有第一链和第二链)，那么(a)第一个ODNP包含至少基本与存在于目标核酸第一链的核苷酸序列互补的核苷酸序列，该核苷酸序列位于限定位置的3’，和(b)第二个ODNP包含至少基本与存在于目标核酸第二链的核苷酸序列互补的核苷酸序列，该核苷酸序列位于限定位置的3’，或者，如果(ii)研究中的目标核酸是单链的，那么(a)第一个ODNP包含至少基本与目标核酸的核苷酸序列相同的核苷酸序列，并且该核苷酸序列位于限定位置的5’，和(b)第二个ODNP包含至少基本与目标核酸的核苷酸序列互补的核苷酸序列，该核苷酸序列位于限定位置的3’。此外，第一个ODNP和第二个ODNP的至少一个进一步包含切割性内切核酸酶识别序列(NERS)的有义链的序列。(b)延伸每一个ODNP对的第一个和第二个ODNP以生产包含第一个和第二个ODNP的片段。(c)在DNA聚合酶和识别NERS的切割性内切核酸酶(NE)存在时，用步骤(b)的延伸产物作为模板，优选地于等温条件下扩增单链核酸片段。可选择地，单链核酸片段各自含有不超过20个、或19个、或18个、或17个、或16个、或15个、或14个、或13个、或12个、或11个、或10个等核苷酸。(d)对于每一个目标核酸，确定步骤(c)中的含有可选择地存在于目标核酸中的遗传变异的单链核酸片段(产物A)相对于步骤(c)中与产物A在遗传变异之外的部分相同的所有单链核酸片段的百分比，以借此确定目标核酸的等位基因频率。
在本发明这些涉及(i)确定存在于核酸分子群体中的第一个核酸分子的数目与存在于核酸分子群体中的第二个核酸分子的数目之间的比率，和(ii)确定核酸分子群体中具有遗传变异的目标核酸分子的等位基因频率的方法中，可利用一种或多种下面的标准来描述该方法，下面标准中的任何2个、3个、4个、5个等可进行组合以描述该方法，且下面标准中的任何1个、2个、3个、4个等可与在此处阐明的其他标准进行组合以描述本发明的方法：由扩增步骤形成的且含有进行等位基因频率测量或确定上述比率所需的信息的单链核酸片段具有至少1个、或至少2个、或至少3个、或至少4个、或至少5个、或至少6个、或至少7个、或至少8个、或至少9个、或至少10个、或至少11个、或至少12个、或至少13个、或至少14个、或至少15个、或至少16个、或至少17个、或至少18个、或至少19个、或至少20个；由扩增步骤形成的单链核酸片段具有不超过3个、或4个、或5个、或6个、或7个、或8个、或9个、或10个、或11个、或12个、或13个、或14个、或15个、或16个、或17个、或18个、或19个、或20个、或21个、或22个、或23个、或24个、或25个、或26个、或27个、或28个、或29个、或30个、或31个、或32个、或33个、或34个、或35个、或36个、或37个、或38个、或39个、或40个、或41个、或42个、或43个、或44个、或45个、或46个、或47个、或48个、或49个、或50个核苷酸；该方法中所用的NARS是限制性内切核酸酶识别序列(RERS)；延伸反应是在至少一种修饰的脱氧核苷三磷酸存在时进行的；该方法中所用的NARS是切割性内切核酸酶识别序列(NERS)；第一个ODNP和第二个ODNP两者均包含NARS有义链的序列；NARS是可由N.BstNB I识别的NERS；第一个ODNP包含RERS一条链的核苷酸序列，但不包含NERS的有义链的核苷酸序列；第二个ODNP包含RERS一条链的核苷酸序列，但不包含NERS的有义链的核苷酸序列；由延伸步骤产生的片段不含有半修饰的RERS；RERS可由IIs型限制性内切核酸酶识别；在进行步骤(c)之前步骤(b)的片段是由识别RERS的RE消化的；限定位置的核苷酸是与疾病相关的；核酸群体来自哺乳动物如人类、狗、猫、猪、马或兔，DNA聚合酶是exo-Vent、exo-Deep Vent、exo-Bst、exo-Pfu、exo-Bca、Taq、DNA聚合酶I的Klenow片段、T5 DNA聚合酶、Phi29 DNA聚合酶、噬菌体M2 DNA聚合酶、噬菌体phiPRD1 DNA聚合酶、测序酶、PRD1 DNA聚合酶、9°NmTM DNA聚合酶和T4 DNA聚合酶中的任何一种，所用的DNA聚合酶的任何两种或多种可进行组合以形成所阐明的用于本发明的可能的DNA聚合酶组合，如DNA聚合酶是exo-Bst聚合酶、exo-Bca聚合酶、9°NmTM DNA聚合酶或exo-Vent聚合酶；延伸反应由聚合酶链反应进行；扩增是在等温条件下进行的；扩增是在50℃-70℃的温度范围内进行的；扩增是在60℃进行的；扩增是在55±5℃进行的；扩增是在60±5℃进行的；扩增是在65±5℃进行的；扩增是在70±5℃进行的；扩增是在最高温度和最低温度之间的温度进行的，而最高温度比最低温度高20℃之内；扩增是在最高温度和最低温度之间的温度进行的，而最高温度比最低温度高15℃之内；扩增是在最高温度和最低温度之间的温度进行的，而最高温度比最低温度高10℃之内；扩增是在最高温度和最低温度之间的温度进行的，而最高温度比最低温度高5℃之内；在本发明的各个实施方案中，该方法中所用的每一个ODNP的长度都独立地为至少8个、或至少9个、或至少10个、或至少11个、或至少12个、或至少13个、或至少14个、或至少15个、或至少16个、或至少17个、或至少18个、或至少19个、或至少20个核苷酸；该方法中所用的每一个ODNP的长度都独立地且可选择地不超过50个、或不超过45个、或不超过40个、或不超过35个、或不超过30个、或不超过29个、或不超过28个、或不超过27个、或不超过26个、或不超过25个、或不超过24个、或不超过23个、或不超过22个、或不超过21个、或不超过20个、或不超过19个、或不超过18个核苷酸；当方法包括使用包括至少基本与目标核酸的核苷酸序列互补的核苷酸序列的引物时，那么在本发明的各个实施方案中，引物中该核苷酸序列的长度在每一个引物中独立地为至少4个、或至少5个、或至少6个、或至少7个、或至少8个、或至少9个、或至少10个、或至少11个、或至少12个、或至少13个、或至少14个、或至少15个、或至少16个、或至少17个、或至少18个、或至少19个、或至少20个核苷酸；当本发明的方法包括使用包括至少基本与目标核酸的核苷酸序列互补的核苷酸序列的引物时，那么在本发明的各个实施方案中，引物中该核苷酸序列的长度在每一个引物中独立地不超过20个、或不超过19个、或不超过18个、或不超过17个、或不超过16个、或不超过15个、或不超过14个、或不超过13个、或不超过12个、或不超过11个、或不超过10个、或不超过9个、或不超过8个、或不超过7个、或不超过6个、或不超过5个核苷酸；为获得想要的信息而对扩增产物上进行的测量包括下面分析方法中的1种、或任何2种、或任何3种或更多，而额外的分析方法也依赖于特定情况而采用，如仪器的可用性：发光光谱法、荧光光谱法、质谱分析法、液相层析、荧光偏振、凝胶电泳和毛细管电泳，如测量可至少部分由质谱分析法进行，或测量可至少部分由液相层析进行，且测量可由包括质谱分析法和液相层析两者的分析技术来进行。
在另一方面，本发明提供了探测cDNA分子中基因的上游外显子(Exon A)和下游外显子(Exon B)之间的连接存在与否的方法，该方法包括：(a)混合第一个ODNP、第二个ODNP和cDNA。第一个ODNP包括至少基本与靠近反义链中Exon A的5’末端的Exon A反义链的部分互补的核苷酸序列。第二个ODNP包括至少基本与靠近有义链中Exon B的5’末端的Exon B有义链的部分互补的核苷酸序列。此外，第一个ODNP和第二个ODNP的至少一个进一步包括切割剂识别序列(NARS)的有义链的核苷酸序列。(b)在如果Exon A和Exon B均存在于cDNA中时可产生由第一个ODNP和第二个ODNP包围的片段的条件下进行延伸反应。(c)在DNA聚合酶和识别NARS的切割剂(NA)存在时进行扩增反应。(d)表征步骤(c)的扩增产物以借此确定ExonA和Exon B之间连接的存在与否。在相关方面，本发明提供了探测cDNA分子中基因的上游外显子(Exon A)和下游外显子(Exon B)之间的连接存在与否的方法，该方法包括：(a)混合第一个ODNP、第二个ODNP和cDNA。第一个ODNP包括至少基本与靠近反义链中Exon A的5’末端的Exon A反义链的部分互补的核苷酸序列。第二个ODNP具有包括至少基本与靠近有义链中Exon B的5’末端的Exon B有义链的部分互补的序列的核苷酸序列。此外，第一个ODNP和第二个ODNP的至少一个进一步包括切割性内切核酸酶识别序列(NERS)的有义链的核苷酸序列。(b)在如果Exon A和Exon B均存在于cDNA中时可产生由第一个ODNP和第二个ODNP包围的片段的条件下进行延伸反应。(c)在DNA聚合酶和识别NERS的切割性内切核酸酶(NE)存在时，优选地于等温条件下进行扩增反应。(d)表征步骤(c)的扩增产物以借此确定Exon A和Exon B之间连接的存在与否。该表征可至少部分用液相层析和/或质谱分析法进行。在这些方法可选择的实施方案中，一种或多种下面的标准可用于描述该方法：NARS是限制性内切核酸酶识别序列(RERS)且延伸反应是在至少一种修饰的脱氧核苷三磷酸存在时进行的；NARS是切割性内切核酸酶识别序列(NERS)；第一个ODNP和第二个ODNP两者均包含NARS有义链的序列；NARS是RERS且延伸是在至少一种修饰的脱氧核苷三磷酸存在时进行的；NARS是NERS；NARS可由N.BstNB I识别；第一个ODNP不含有NERS有义链的核苷酸序列，但包括RERS的一条链的核苷酸序列；第二个ODNP不含有NERS有义链的核苷酸序列，但包括RERS的一条链的核苷酸序列；由延伸反应产生的片段不含有半修饰的RERS；RERS可由IIs型限制性内切核酸酶(RE)识别；在进行步骤(c)之前步骤(b)的延伸产物是由识别RERS的RE消化的；基因与疾病相关；基因与人类疾病相关；DNA聚合酶是exo-Vent、exo-Deep Vent、exo-Bst、exo-Pfu、exo-Bca、Taq、DNA聚合酶I的K1enow片段、T5 DNA聚合酶、Phi29 DNA聚合酶、噬菌体M2 DNA聚合酶、噬菌体phiPRD1 DNA聚合酶、测序酶、PRD1 DNA聚合酶、9°NmTM DNA聚合酶和T4 DNA聚合酶，这些DNA聚合酶的任何两种或多种可组合在一起以形成本发明方法中所用的DNA聚合酶所选自的组合，如DNA聚合酶是exo-Bst聚合酶、exo-Bca聚合酶、9°NmTM DNA聚合酶或exo-Vent聚合酶；延伸反应由聚合酶链反应进行；扩增是在等温条件下进行的；扩增产物如果存在则是含有不超过35个、或不超过17个、或不超过12个核苷酸的单链核酸片段；表征是至少部分由选自发光光谱法、荧光光谱法、质谱分析法、液相层析、荧光偏振、凝胶电泳和毛细管电泳的分析技术来实现的，如表征可至少部分由质谱分析法进行。
在另一方面，本发明提供了在cDNA分子或cDNA群体中探测包含n个外显子的基因的每两个外显子之间的连接存在与否的方法，其中n是等于或大于2的整数，Exon A是存在于基因中的外显子中最上游的外显子，而Exon N是最下游的外显子，该方法包括：(a)混合第一套寡核苷酸引物(ODNP)、第二套ODNP和cDNA分子或cDNA群体。第一套ODNP包括n-1个ODNP，该套中的每一个成员相应于基因中除ExonA之外的n个外显子之一，且此外每一个ODNP包含至少基本与靠近该链中相应外显子5’末端的该外显子有义链的部分互补的核苷酸序列。第二套ODNP包括相应于除Exon N之外的每一个外显子的n-1个ODNP，而每一个ODNP包含至少基本与靠近该链中相应外显子5’末端的该外显子反义链的部分互补的核苷酸序列。在本发明的第一个实施方案中是第一套ODNP成员的、或在本发明的第二个实施方案中是第二套ODNP成员的、或在本发明的第三个实施方案中是第一套或第二套ODNP成员的每一个ODNP进一步包含切割剂识别序列(NARS)的有义链的核苷酸序列。(b)扩增包含来自第一套ODNP的一个ODNP和来自第二套ODNP的另一个ODNP的片段。(c)在DNA聚合酶和识别NARS的切割剂(NA)存在时进行扩增反应。(d)探测来自步骤(c)的扩增产物的存在与否以借此确定每一个潜在连接的存在与否。
在相关方面，本发明提供了在cDNA分子或cDNA群体中探测包含n个外显子的基因的每两个外显子之间的连接存在与否的方法，其中n是等于或大于2的整数，Exon A是存在于基因中的外显子中最上游的外显子，而Exon N是最下游的外显子，该方法包括：(a)混合第一套寡核苷酸引物(ODNP)、第二套ODNP和cDNA分子或cDNA群体。第一套ODNP包括n-1个ODNP，该套中的每一个成员相应于除Exon A之外的唯一一个外显子，且每一个ODNP也包含至少基本与靠近该链中相应外显子5’末端的该外显子有义链的部分互补的核苷酸序列。第二套ODNP包括n-1个ODNP，该套中的每一个成员相应于除Exon N之外的唯一一个外显子，且每一个ODNP进一步包含至少基本与靠近该链中相应外显子5’末端的该外显子反义链的部分互补的核苷酸序列。此外，在本发明的第一个实施方案中是第一套ODNP成员的、或在本发明的第二个实施方案中是第二套ODNP成员的、或在本发明的第三个实施方案中是第一套或第二套ODNP成员的每一个ODNP进一步包含切割性内切核酸酶识别序列(NERS)的有义链的核苷酸序列。(b)扩增由来自第一套ODNP的一个ODNP和来自第二套ODNP的另一个ODNP包围的片段。(c)在DNA聚合酶和识别NERS的切割性内切核酸酶(NE)存在时，优选地于等温条件下进行扩增反应。(d)探测步骤(c)的扩增产物的存在与否。在一个实施方案中，该探测是由液相层析和/或质谱分析法进行的。该探测使得随后能够确定研究中的每一个潜在连接的存在与否。在一个实施方案中，步骤(c)的扩增产物如果存在则含有不超过17个核苷酸。在本发明的各个实施方案中，一种或多种下面的标准可用于描述该实施方案：NARS是限制性内切核酸酶识别序列(RERS)且步骤(b)是在至少一种修饰的脱氧核苷三磷酸存在时进行的；NARS是切割性内切核酸酶识别序列(NERS)；第一套ODNP和第二套ODNP两者均包含NARS有义链的序列；NARS是RERS且步骤(b)是在至少一种修饰的脱氧核苷三磷酸存在时进行的；NARS是NERS；NERS可由N.BstNB I识别；第一套中的ODNP或第二套中的ODNP含有RERS一条链的核苷酸序列，但不包含NERS的有义链的序列；由步骤(b)产生的片段不含有半修饰的RERS；RERS可由IIs型限制性内切核酸酶(RE)识别；在进行步骤(c)之前步骤(b)的扩增片段是由识别RERS的RE消化的；基因与疾病相关；基因与人类疾病相关；步骤(b)是由聚合酶链反应进行的；步骤(c)是在等温条件下进行的；步骤(c)中的扩增产物如果存在则是含有不超过35个核苷酸的单链核酸片段；该单链核酸片段含有不超过17个核苷酸；该单链核酸片段含有不超过12个核苷酸；步骤(d)是至少部分由选自发光光谱法、荧光光谱法、质谱分析法、液相层析、荧光偏振、凝胶电泳和毛细管电泳的分析技术来实现的；步骤(d)至少部分由质谱分析法进行。
在其他方面，本发明提供了探测cDNA群体中基因的可变剪接的方法。在一个实施方案中，该方法包括：(a)根据在此处描述的本发明的方法确定基因的任何两个外显子之间每一个潜在连接的存在与否。(b)对于基因的至少一个外显子来说，如果在该外显子的至少一个末端存在超过一个的连接，则显示cDNA群体中存在基因可变剪接。在相关的实施方案中，该方法提供了对cDNA群体中基因可变剪接的多重探测，对于每一个基因，该方法包括：(a)根据在此处描述的本发明的方法确定基因的任何两个外显子之间每一个潜在连接的存在与否。(b)对于基因的至少一个外显子来说，如果在该外显子的至少一个末端存在超过一个的连接，则显示cDNA群体中存在基因的可变剪接。在相关的实施方案中，本发明提供了探测两个生物学样品之间基因的可变剪接的方法，该方法包括：(a)通过进行根据本发明的方法对每一个生物学样品确定基因的任何两个外显子之间每一个潜在连接的存在与否。(b)如果在一个生物学样品中存在至少一个连接，而在另一个生物学样品中不存在，则显示两个生物学样品之间存在基因的可变剪接。在相关的实施方案中，本发明提供了多重探测两个生物学样品之间基因的可变剪接的方法，对于每一个基因，该方法包括：(a)根据在此处描述的本发明的方法对每一个生物学样品确定基因的任何两个外显子之间每一个潜在连接的存在与否。(b)如果在一个生物学样品中存在至少一个连接，而在另一个生物学样品中不存在，则显示两个生物学样品之间存在基因的可变剪接。在相关的实施方案中，本发明提供了用于探测cDNA分子中基因的上游外显子(Exon A)和下游外显子(Exon B)之间是否存在连接的寡核苷酸引物(ODNP)对，其中：(a)第一个ODNP包含至少基本与靠近反义链中Exon A的5’末端的Exon A反义链的部分互补的核苷酸序列。第二个ODNP包含至少基本与靠近有义链中Exon B的5’末端的Exon B有义链的部分互补的核苷酸序列。此外，第一个ODNP和第二个ODNP的至少一个进一步包含切割剂识别序列(NARS)有义链的核苷酸序列。在本发明的该ODNP对的各个实施方案中，下面的标准可用于描述该ODNP对，而下面的标准的任何两个或多个可以可选择地与在文中别处描述的其他标准进行组合：NARS是限制性内切核酸酶识别序列(RERS)；NARS是切割性内切核酸酶识别序列(NERS)；第一个ODNP和第二个ODNP两者均包含NARS有义链的序列；NARS是RERS；NARS是NERS；NERS可由N.BstNB I识别；第一个ODNP包含NERS有义链的核苷酸序列，且第二个ODNP包含RERS一条链(在一个实施方案中为有义链，而在另一个实施方案中为反义链)的核苷酸序列；第一个ODNP包含RERS一条链的核苷酸序列，且第二个ODNP包含NERS有义链的核苷酸序列；RERS可由IIs型限制性内切核酸酶(RE)识别；基因与疾病相关；第一个ODNP长度至少为12个核苷酸；第二个ODNP长度至少为12个核苷酸。
在另一方面，本发明提供了制备用于合成单链cDNA分子的模板核酸分子的方法，该方法包括：(a)提供双链cDNA分子。(b)使双链cDNA分子与包含切割剂识别序列(NARS)的核酸连接物连接，从而在识别NARS的切割剂(NA)和DNA聚合酶存在时，用连接产物作为模板扩增的单链核酸分子包含双链cDNA分子一条链的至少一部分。另一方面，本发明提供了制备cDNA文库的方法，该方法包括：(a)提供从生物学样品中分离的mRNA分子。(b)用分离的mRNA分子作为模板制备双链cDNA分子。(c)使双链cDNA分子与包含切割剂识别序列(NARS)的核酸连接物连接，从而在(i)识别NARS的切割剂和(ii)DNA聚合酶存在时，用连接产物作为模板扩增的单链核酸分子包含双链cDNA分子一条链的至少一部分。在可选择的实施方案中，本发明的这些方法可进一步由下面标准的一种或多种进行表征，这些标准的任何两个或多个可进行组合以表征本发明的方法，且这些标准是非排它性的：所述部分长度为至少40个、或至少38个、或至少36个、或至少34个、或至少32个、或至少30个、或至少28个、或至少26个、或至少24个、或至少22个、或至少20个、或至少19个、或至少18个、或至少17个、或至少16个、或至少15个、或至少14个、或至少13个、或至少12个、或至少11个、或至少10个、或至少9个、或至少8个、或至少7个、或至少6个、或至少5个、或至少4个核苷酸；所述部分长度不超过100个、或不超过90个、或不超过80个、或不超过70个、或不超过60个、或不超过50个、或不超过40个、或不超过38个、或不超过36个、或不超过34个、或不超过32个、或不超过30个、或不超过28个、或不超过26个、或不超过24个、或不超过22个、或不超过20个、或不超过18个、或不超过17个、或不超过16个、或不超过15个、或不超过14个、或不超过13个、或不超过12个、或不超过11个、或不超过10个、或不超过9个、或不超过8个、或不超过7个、或不超过6个、或不超过5个核苷酸；双链cDNA分子是经由不参与双链cDNA分子和核酸连接物的连接的末端固定的；核酸连接物是经由不参与双链cDNA分子和核酸连接物的连接的末端固定的；NA是切割性内切核酸酶(NE)；NA是N.BstNB I；NARS是半修饰的限制性内切核酸酶识别序列；当包括连接物时，那么双链cDNA分子或核酸连接物是通过固定材料的末端固定的，其中该末端不参与双链cDNA分子和核酸连接物之间的连接。
在另一方面，本发明提供了一种方法，包括：(a)提供一种双链核酸分子，该双链核酸分子包括(i)作为可选择地存在的序列的IIs型限制性内切核酸酶识别序列(TRERS)，(ii)切割剂识别序列(NARS)和(iii)目标核酸的片段。在该双链核酸中，特别是在不含有识别NARS的切割剂(NA)的切割位点(NS)的链中，(1)目标核酸片段位于NARS的5’，和(2)如果存在TRERS，那么识别TRERS的IIs型限制性内切核酸酶的切割位点位于目标核酸片段内和相应于NS的位置的5’。(b)作为可选择的步骤，用识别TRERS的IIs型限制性内切核酸酶切割双链核酸。(c)在识别NARS的NA存在时扩增单链核酸片段。在相关方面，本发明提供了一种方法，包括：(a)提供一种双链核酸分子，该双链核酸分子包括：(i)IIs型限制性内切核酸酶识别序列(TRERS)，(ii)切割性内切核酸酶识别序列(NERS)和(iii)目标核酸的片段。在该双链核酸分子中，特别是在不含有识别NERS的切割性内切核酸酶(NE)的切割位点(NS)的链中，(1)目标核酸片段位于NERS的5’，和(2)识别TRERS的IIs型限制性内切核酸酶的切割位点位于目标核酸片段内和相应于NS的位置的5’。(b)用识别TRERS的IIs型限制性内切核酸酶切割双链核酸。(c)在识别NARS的NA存在时可选择地于等温条件下扩增单链核酸片段。在一个实施方案中，单链核酸片段含有不超过17个核苷酸。另一方面，本发明提供了制备多个单链核酸探针的方法，该方法包括：(a)提供双链核酸分子，每一个双链核酸分子包括：(i)IIs型限制性内切核酸酶识别序列(TRERS)，而这是双链核酸分子中的可选择的成分；(ii)切割剂识别序列(NARS)，和(iii)目标核酸的片段。此外，在不含有识别NARS的切割剂(NA)的切割位点(NS)的链中，(1)目标核酸片段位于NARS的5’，和(2)如果存在TRERS，那么识别TRERS的IIs型限制性内切核酸酶的切割位点位于目标核酸片段内和相应于NS的位置的5’。(b)该方法包括用识别TRERS的IIs型限制性内切核酸酶切割双链核酸的可选择的步骤。(c)在识别NARS的NA存在时扩增单链核酸片段。在相关方面，本发明提供了制备多个单链核酸探针的方法，该方法包括：(a)提供多个双链核酸分子，每一个双链核酸分子包括：(i)IIs型限制性内切核酸酶识别序列(TRERS)，(ii)切割性内切核酸酶识别序列(NERS)，和(iii)目标核酸的片段。在这些双链核酸分子中，特别是在不含有识别NERS的切割性内切核酸酶(NE)的切割位点(NS)的链中，(1)目标核酸片段位于NERS的5’，和(2)识别TRERS的IIs型限制性内切核酸酶的切割位点位于目标核酸片段内和相应于NS的位置的5’。(b)用识别TRERS的IIs型限制性内切核酸酶切割双链核酸。(c)在识别NERS的NE存在时，优选地于等温条件下扩增单链核酸片段。可选择地，该单链核酸片段各自含有不超过25个或不超过17个核苷酸。本发明的这些方法可进一步由下面标准的一种或多种进行描述，下面标准的任何两种或多种可进行组合以描述本发明的这些方法：NA是切割性内切核酸酶(NE)；NA是N.BstNB I；NARS是半修饰的限制性内切核酸酶识别序列；NARS可由选自Ava I、Bsl I、BsmA I、BsoB I、Bsr I、BstN I、BstO I、Fnu4H I、Hinc II、Hind II和Nci I的限制性内切核酸酶(RE)识别；TRERS可由Bpm I或Mme I识别；双链核酸分子是至少部分通过向双链目标核酸片段连接在此处描述的连接物分子并整合NARS而进行的，且可选择地，双链目标核酸片段在与连接物连接之前用限制性内切核酸酶(RE)进行切割，且同样可选择地，双链目标核酸片段是cDNA片段，该cDNA片段可选择地固定于固体支持体上，且该固定的cDNA可选择地是通过一定方法产生的，该方法包含：(i)用固定的寡核苷酸引物从生物学样品中分离mRNA；和(ii)用mRNA作为模板合成双链cDNA；扩增是在DNA聚合酶的存在下进行的，该DNA聚合酶是exo-Vent、exo-Deep Vent、exo-Bst、exo-Pfu、exo-Bca、Taq、DNA聚合酶I的Klenow片段、T5 DNA聚合酶、Phi29 DNA聚合酶、噬菌体M2 DNA聚合酶、噬菌体phiPRD1 DNA聚合酶、测序酶、PRD1 DNA聚合酶、9°NmTM DNA聚合酶和T4 DNA聚合酶的一种或由其两种或更多组成的任何组合，如聚合酶是exo-Bst聚合酶、exo-Bca聚合酶、9°NmTM DNA聚合酶或exo-Vent聚合酶；扩增是在等温条件下进行的；扩增的单链核酸片段含有不超过25个核苷酸；单链核酸片段长度为15-50个核苷酸；单链核酸片段长度为51-20,000个核苷酸。
另一方面，本发明提供了扩增单链核酸分子的方法，该方法包括：(A)形成混合物，该混合物包括：(i)目标核酸；和(ii)寡核苷酸引物，该寡核苷酸引物(a)包括可由切割剂(NA)识别的双链切割剂识别序列(NARS)有义链的核苷酸序列，该切割剂在位于识别序列之外的切割位点(NS)进行切割，和(b)包括至少基本与目标核酸互补的核苷酸序列。(B)用目标核酸的部分作为模板，在切割剂存在时扩增单链核酸分子。可选择地，双链切割剂识别序列可由N.BstNB I识别。可选择地，当寡核苷酸引物与目标核酸退火时，双链切割剂识别序列有义链的核苷酸序列内的一个核苷酸与目标核酸的另一个核苷酸不形成常规的碱基配对。可选择地，当寡核苷酸引物与目标核酸退火时，双链切割剂识别序列有义链的核苷酸序列内的两个或更多核苷酸与目标核酸的核苷酸不形成常规的碱基配对。可选择地，目标核酸是固定的。可选择地，寡核苷酸引物是在其5’末端固定的。
另一方面，本发明提供了方法，包括：(A)形成混合物，该混合物包括：(i)目标核酸；(ii)寡核苷酸引物，该寡核苷酸引物(a)包括可由切割剂识别的NARS有义链的核苷酸序列，该切割剂在识别序列之外进行切割，和(b)是至少基本与目标核酸的第一个区域互补的；和(iii)部分双链的核酸，该部分双链的核酸(a)包含双链的IIs型限制性内切核酸酶识别序列，和(b)至少基本与位于第一个区域5’的目标核酸的第二个区域互补的3’突出端。这些成分在一定条件下进行组合，该条件使得寡核苷酸引物和目标的第一个区域之间及部分双链的核酸的3’突出端和目标的第二个区域之间能够进行杂交。(B)消化与寡核苷酸引物和第二个区域中的部分双链的核酸杂交的目标核酸。(C)用步骤(B)中消化的目标核酸的部分作为模板，在切割剂存在时扩增单链核酸分子。在相关的实施方案中，本发明提供了方法，包括：(A)形成混合物，该混合物包含：(i)目标核酸；(ii)寡核苷酸引物，该寡核苷酸引物(a)包含可由切割剂识别的NARS有义链的核苷酸序列，该切割剂在识别序列之外进行切割，和(b)是至少基本与目标核酸的第一个区域互补的；和(iii)单链核酸分子，该单链核酸分子(1)是至少基本与位于第一个区域5’的目标核酸的第二个区域互补的。这些成分在一定条件下进行组合，该条件使得寡核苷酸引物和目标的第一个区域之间及单链核酸分子和目标的第二个区域之间能够进行杂交。(B)用目标核酸的部分作为模板，在切割剂和DNA聚合酶存在时扩增单链核酸分子。优选地，该DNA聚合酶不具有链置换活性，从而实际上单链核酸分子阻断了由DNA聚合酶进行的进一步的延伸反应。根据本发明的这些方面，优选地在等温条件下产生了多个单链核酸分子，该单链核酸分子优选地具有比基于目标核酸分子的长度可产生的全长更短的长度。在一个实施方案中，在NARS中有一个错配的碱基对，而在另一个实施方案中，在NARS中有两个错配的碱基对，而在另一个实施方案中，形成NARS的所有碱基对均是错配的，而在另一个实施方案中，形成NARS的n-1个碱基对是错配的，其中n碱基对形成NARS。在一个实施方案中，在NARS中有一个未配对的核苷酸。在另一个实施方案中，形成NARS有义链的所有核苷酸是未配对的。
另一方面，本发明提供了方法，包括：(a)形成以下组分的混合物：(i)包含切割剂识别序列(NARS)的部分或完全双链的模板核酸分子，(ii)识别NARS的切割剂(NA)，(iii)DNA聚合酶，和(iv)一种或多种脱氧核苷三磷酸。(b)在一定条件下维持步骤(a)中的混合物，该条件使得能够扩增单链核酸片段，在该条件下，单链核酸片段在不存在任何DNA聚合酶或链置换促进剂的链置换活性时能够自发地从模板核酸中解离。在相关方面，本发明提供了方法，包括：(a)使部分或完全双链的模板核酸与切割剂(NA)接触，该模板包含切割剂识别序列(NARS)。(b)如果模板不包含可由NA切割的切割位点(NS)，则延伸模板以提供NS。(c)在NS切割模板或其延伸产物以提供在NS包含新3’末端的切割产物和在NS包含新的5’末端的切割产物；其中在NS包含新5’末端的切割产物和包含NARS反义链序列的模板链或其延伸产物之间形成的双链体的熔解温度比在NS包含新3’末端的切割产物和相同的模板链或其延伸产物之间形成的双链体的高。(d)延伸在NS包含新3’末端的步骤(c)中的切割产物。(e)重复步骤(c)和(d)以扩增单链核酸片段。可选择地，切割、延伸和/或扩增是在等温条件下进行的。可选择地，步骤(b)、(c)、(d)和(e)进行的温度处于在NS包含新5’末端的切割产物和包含NARS反义链序列的模板链或其延伸产物之间形成的双链体的熔解温度和在NS包含新3’末端的切割产物和相同的模板链或其延伸产物之间形成的双链体的熔解温度之间。
只要单链核酸片段是由本发明任何方法中的扩增步骤形成的，且特别地(但不是必需的)当该单链核酸片段含有目标信息时，如在特定位置具有特定核苷酸，或具有特定核苷酸序列，其中该信息使得能够允许进行确定，那么在本发明方法的各个实施方案中，单链核酸片段具有至少1个、或至少2个、或至少3个、或至少4个、或至少5个、或至少6个、或至少7个、或至少8个、或至少9个、或至少10个、或至少11个、或至少12个、或至少13个、或至少14个、或至少15个、或至少16个、或至少17个、或至少18个、或至少19个、或至少20个核苷酸。此外，由本发明的扩增步骤形成的单链核酸片段可表征为含有不超过3个、或不超过4个、或不超过5个、或不超过6个、或不超过7个、或不超过8个、或不超过9个、或不超过10个、或不超过11个、或不超过12个、或不超过13个、或不超过14个、或不超过15个、或不超过16个、或不超过17个、或不超过18个、或不超过19个、或不超过20个、或不超过21个、或不超过22个、或不超过23个、或不超过24个、或不超过25个、或不超过26个、或不超过27个、或不超过28个、或不超过29个、或不超过30个、或不超过31个、或不超过32个、或不超过33个、或不超过34个、或不超过35个、或不超过36个、或不超过37个、或不超过38个、或不超过39个、或不超过40个、或不超过41个、或不超过42个、或不超过43个、或不超过44个、或不超过45个、或不超过46个、或不超过47个、或不超过48个、或不超过49个、或不超过50个核苷酸。
当消化产物是在本发明的任何方法中形成的时，那么在各个实施方案中，消化产物具有至少8个、或至少10个、或至少12个、或至少14个、或至少16个、或至少18个、或至少20个、或至少22个、或至少24个、或至少26个、或至少28个、或至少30个、或至少32个、或至少34个、或至少36个、或至少38个、或至少40个、或至少42个、或至少44个、或至少46个、或至少48个、或至少50个、或至少52个、或至少54个、或至少56个、或至少58个、或至少60个、或至少62个、或至少64个、或至少66个、或至少68个、或至少70个、或至少72个、或至少74个、或至少76个、或至少78个、或至少80个、或至少82个、或至少84个、或至少86个、或至少88个、或至少90个、或至少92个、或至少94个、或至少96个、或至少98个、或至少100个核苷酸；当形成了消化产物时，在各个实施方案中，消化产物具有不超过200个、或不超过180个、或不超过160个、或不超过140个、或不超过120个、或不超过110个、或不超过100个、或不超过90个、或不超过80个、或不超过70个、或不超过60个、或不超过50个、或不超过40个、或不超过38个、或不超过36个、或不超过34个、或不超过32个、或不超过30个、或不超过28个、或不超过26个、或不超过24个、或不超过22个、或不超过20个、或不超过18个、或不超过16个、或不超过14个、或不超过12个、或不超过10个核苷酸。
在包括NARS的本发明的任何方法或化合物或组合物中，该NARS可含有一个或多个错配的核苷酸。换句话说，形成NARS的一个或多个核苷酸碱基对可能不根据常规的沃森-克里克碱基配对法则进行杂交。然而，当错配碱基存在于NARS中时，那么至少所有形成NARS有义链的核苷酸是存在的。
当本发明的任何方法需要使用修饰的脱氧核苷三磷酸时，那么在一个实施方案中，修饰的脱氧核苷三磷酸是α-硫代脱氧核苷三磷酸。
当在本发明的任何方法中使用DNA聚合酶时，该DNA聚合酶是exo-Vent、exo-Deep Vent、exo-Bst、exo-Pfu、exo-Bca、Taq、DNA聚合酶I的Klenow片段、T5 DNA聚合酶、Phi29 DNA聚合酶、噬菌体M2 DNA聚合酶、噬菌体phiPRD1 DNA聚合酶、测序酶、PRD1 DNA聚合酶、9°NmTM DNA聚合酶和T4 DNA聚合酶的任何一种或多种，一个适当的DNA聚合酶的组合可通过对所列的这些聚合酶的任何2种、或任何3种、或任何4种等进行组合而形成，如聚合酶可选自exo-Bst聚合酶、exo-Bca聚合酶、9°NmTM DNA聚合酶或exo-Vent聚合酶。
除上文简述的和在此处更详细描述的方法、试剂盒和组合物之外，本发明在下面也提供了可用于或可由本发明的方法和试剂盒生成的化合物、组合物和试剂盒：
部分双链的寡核苷酸探针，该探针包括(a)可由切割剂(NA)识别的切割剂识别序列(NARS)，该NA将在切割位点(NS)切割该探针或其延伸产物，(b)或者(i)在含有NS的链中的5’突出端，其中该突出端包括至少基本与目标核酸中的核苷酸序列互补的核苷酸序列，或(ii)在不含有NS的链中的3’突出端，其中该突出端包括至少基本与目标核酸中的核苷酸序列互补的核苷酸序列；和(c)在既不含有NS也不能进行延伸以含有NS的探针链中的核苷酸序列，该核苷酸序列位于相应于NS的位置的5’，且该核苷酸序列唯一地与目标核酸相关，其中该突出端至少基本与所述目标核酸互补。该探针在下面的方法中是特别有用的，在该方法中使怀疑含有目标核酸的检验样品与探针进行组合；不与样品中的核酸进行杂交的探针可以和与样品中的核酸进行杂交的探针分离；然后用切割剂和聚合酶对与样品中的核酸进行杂交的探针进行处理以扩增单链核酸片段，该单链核酸片段含有唯一地与样品中的核酸相关的核苷酸序列；且对扩增的核酸片段进行表征以至少确定其核苷酸序列是唯一与样品中该核酸的存在相关的序列。例如，可将目标或探针进行固定，然后将非固定的目标(当探针固定时)或非固定的探针(当目标固定时)与固定的材料进行组合，然后将未固定的或没有与固定材料杂交的任何材料洗掉，并根据本发明对固定的材料进行重复切割和延伸以提供扩增的单链核酸片段，然后对扩增的单链片段进行表征以至少鉴定存在于探针中的唯一与目标相关的核苷酸序列的互补链，然后确定目标(即设计探针以与其“唯一相关”的目标)是否存在于样品中。本质上，唯一与目标核酸相关的探针中的核苷酸序列是特定目标核酸的有效的特异性信号。在一方面，本发明提供了一种化合物，其中目标核酸与探针是杂交的。另一方面，本发明提供了一种化合物，其中目标核酸固定于固体支持体上并与探针杂交。另一方面，本发明提供了固定于固体支持体上的探针。另一方面，本发明提供了固定于固体支持体上的探针和与探针进行杂交的目标核酸。在本发明的各个实施方案中，一种或多种下面的标准可用于描述探针和/或探针与目标的杂交产物：目标核酸是变性的双链核酸的一条链，而双链核酸可为如基因组核酸和/或可为cDNA；目标核酸源自病原病毒的基因组；目标核酸源自病原细菌的基因组；目标核酸源自病原细菌的附加体；探针的双链区域长度为10-22个、或11-21个、或12-20个、或13-19个、或8-25个、或8-30个、或8-35个、或10-25个、或10-30个、或10-35个核苷酸；探针在不含有NS的链中具有3’突出端；探针在含有NS的链中具有5’突出端；5’突出端或3’突出端长度为5-25个、或6-22个、或8-20个、或10-18个核苷酸；探针含有少于200个核苷酸；探针含有少于150个核苷酸；探针含有少于100个核苷酸；探针含有少于90个、或少于80个、或少于70个、或少于60个、或少于50个核苷酸；探针含有至少20个、或至少21个、或至少22个、或至少23个、或至少24个、或至少25个、或至少26个、或至少27个、或至少28个、或至少29个、或至少30个核苷酸；NS可由切割性内切核酸酶切割；NS可由N.BstNB I切割；本发明也提供了包括多个上述的唯一探针的组合物，其中该探针由于其具有根据探针的特性(c)的序列而是唯一的，即与组合物中的其他探针不同，该探针唯一地以某种方式与目标核酸相关，该方式不同于任何其他探针与特定目标核酸相关的方式，或者该探针具有与目标核酸唯一相关的序列，而组合物中无其他探针也与该特定目标核酸相关。在一方面，这多个探针是以阵列形式组织的，如该多个探针是在支持体上的不同限定位置固定于固体支持体上的。
一对寡核苷酸引物(ODNP)，或包括一对ODNP的试剂盒或组合物，该引物对定义为第一个ODNP和第二个ODNP，其中(a)第一个ODNP至少部分是由至少基本与位于单链目标核酸中限定位置3’的核苷酸序列互补的核苷酸序列形成的，(b)第二个ODNP至少部分是由至少基本与存在于目标核酸互补链中的核苷酸序列互补的核苷酸序列形成的，其中存在于互补链中的该核苷酸序列位于限定位置互补链的3’；(c)第一个和第二个ODNP进一步包括中断的限制性内切核酸酶识别序列(IRERS)(而不是完整的IRERS)的第一条链的第一个不变识别序列(CRS)和第二条链的第二个CRS，完整的IRERS是从第一条和第二条链形成的双链核酸序列，其中第一个和第二个CRS由可变识别序列(VRS)连接，和(d)第一个或第二个ODNP进一步包含位于第一个CRS或第二个CRS的5’的NERS。除可在此处阐明的其他标准之外，下面的标准可进一步用于描述单独的ODNP，或存在于组合物或试剂盒中的ODNP，可将这些标准的任何两个或多个进行组合以描述ODNP：至少基本与目标核酸互补的第一个ODNP的核苷酸序列长度为至少8个、或9个、或10个、或11个、或12个、或13个、或14个、或15个、或16个、或17个、或18个、或19个、或20个核苷酸；至少基本与目标核酸的互补链互补的第二个ODNP的核苷酸序列长度为至少8个、或9个、或10个、或11个、或12个、或1 3个、或14个、或15个、或16个、或17个、或18个、或19个、或20个核苷酸；第一个ODNP长度为15-85个、或16-70个、或17-60个、或18-50个、或18-40个、或20-30个、或15-30个、或15-40个、或15-50个核苷酸；第二个ODNP长度为15-85个、或16-70个、或17-60个、或18-50个、或18-40个、或20-30个、或15-30个、或15-40个、或15-50个核苷酸；第一个ODNP包含至少基本与存在于目标核酸中的第一个CRS的3’末端的核苷酸互补的一个或多个核苷酸；第二个ODNP包含至少基本与存在于目标核酸中的第二个CRS的3’末端的核苷酸互补的一个或多个核苷酸；单链目标核酸是双链核酸的一条链；而双链核酸可为如基因组核酸和/或可为cDNA；目标核酸源自病原病毒的基因组；目标核酸源自病原细菌的基因组；目标核酸源自病原细菌的附加体。该组合物可进一步包含目标核酸和/或目标核酸的互补链。该组合物或试剂盒可进一步包括一种或多种：识别IRERS的限制性内切核酸酶；Bsl I；识别NERS的切割性内切核酸酶(NE)；N.BstNB I；DNA聚合酶；运行ODNP测定法的适当缓冲液；和使用试剂盒的说明书。例如，本发明提供了基因型试剂盒，该试剂盒包括刚刚描述的引物对，以及识别NERS的NE、识别IRERS的RE、DNA聚合酶和使用试剂盒的说明书。
包含切割剂识别序列(NARS)的核酸连接物。本发明提供了连接物、含有该连接物的试剂盒、使用该连接物的方法和含有该连接物的组合物。在本发明的各个实施方案中，下面的标准可用于进一步表征连接物，而任何两个或更多标准可进行组合，这些标准仅仅是示例性的并补充在文中别处阐明的任何标准：它含有NARS的有义和反义序列两者；它含有双链切割位点(NS)，在该位点仅仅一条链被识别NARS的切割剂切割；它含有少于200个、或少于175个、或少于150个、或少于125个、或少于100个、或少于90个、或少于80个、或少于70个、或少于65个、或少于60个、或少于55个、或少于50个、或少于45个、或少于40个、或少于35个、或少于30个、或少于25个、或少于20个核苷酸；它含有超过10个、或超过15个、或超过20个、或超过25个、或超过30个、或超过35个、或超过40个、或超过45个、或超过50个核苷酸；它含有用于与目标核酸连接的3’突出端；它含有用于与目标核酸连接的5’突出端；它含有用于与目标核酸连接的平端；它是固定于固体支持体上的，它是通过连接物的3’末端固定于固体支持体上的；它是通过连接物的5’末端固定于固体支持体上的；NARS可由切割性内切核酸酶识别；NARS可由N.BstNB I识别；NARS是半修饰的限制性内切核酸酶识别序列；NARS可由选自AvaI、Bsl I、BsmA I、BsoB I、Bsr I、BstN I、BstO I、Fnu4HI、Hinc II、Hind II和Nci I的限制性内切核酸酶(RE)识别；连接物设计为，当连接物与双链目标核酸片段连接时，目标核酸链位于NARS的部分的5’，该NARS的部分位于不含有NS的连接物的链中；它含有IIs型限制性内切核酸酶识别序列(TRERS)；它含有IIs型限制性内切核酸酶识别序列(TRERS)，识别TRERS的IIs型限制性内切核酸酶的切割位点同时位于(i)双链目标核酸片段中，和(ii)相应于由NA切割的NS的位置的5’；它含有IIs型限制性内切核酸酶识别序列(TRERS)且该TRERS位于含有NS链的NARS的5’；它含有IIs型限制性内切核酸酶识别序列(TRERS)且该TRERS位于含有NS的链中NARS的3’；它含有可由Bpm I识别的IIs型限制性内切核酸酶识别序列(TRERS)；它含有可由Mme I识别的IIs型限制性内切核酸酶识别序列(TRERS)。本发明也提供了包括连接物的组合物和试剂盒。该组合物和试剂盒可用于如合成如在此处所述的寡核苷酸探针。除连接物之外，组合物和试剂盒的可选择成分包括一种或多种：识别NARS的切割剂；识别NARS的切割性内切核酸酶(NE)；NE的缓冲液；识别TRERS的IIs型限制性内切核酸酶；IIs型限制性内切核酸酶的缓冲液；DNA聚合酶(如选自exo-Bst聚合酶、exo-Bca聚合酶、9°NmTM DNA聚合酶和/或exo-Vent聚合酶的DNA聚合酶)；DNA聚合酶的缓冲液；可连接连接物与目标核酸的连接酶；DNA连接酶的缓冲液；使用试剂盒的说明书；固定于固体支持体上的包含poly(dT)寡核苷酸的引物；反转录酶；链置换促进剂，如海藻糖。本发明也提供了包含连接物和双链目标核酸的组合物。可选择地，双链目标核酸片段是cDNA片段。可选择地，双链目标核酸是固定于固体支持体上的。可选择地，该组合物进一步包括连接酶和/或聚合酶和/或限制性内切核酸酶和/或切割性内切核酸酶。例如，本发明提供了包含(a)IIs型限制性内切核酸酶识别序列(TRERS)；和(b)切割剂识别序列(NARS)的核酸连接物，其中当该连接物与双链目标核酸片段连接时，在不含有识别NARS的切割剂(NA)的切割位点(NS)的链中，目标核酸片段位于NARS的5’，那么识别该链中的TRERS(如果TRERS存在)的IIs型限制性内切核酸酶的切割位点则同时位于(i)双链目标核酸片段中，和(ii)相应于NS的位置的5’。
可用于合成单链cDNA分子的模板核酸分子。该模板核酸分子包括：(a)可表征为源自双链cDNA分子或其片段的部分；和(b)可表征为源自核酸连接物的部分，其中(a)部分连接到(b)部分。核酸连接物(b)部分包括切割剂识别序列(NARS)。在同时存在(i)模板核酸分子，(ii)识别NARS的切割剂(NA)和(iii)DNA聚合酶时，扩增了单链分子，其中该单链分子的至少部分具有与双链cDNA的一条链核苷酸序列的至少一部分相同的核苷酸序列。优选地，该部分长度为至少6个、或至少7个、或至少8个、或至少9个、或至少10个、或至少11个、或至少12个、或至少13个、或至少14个、或至少15个、或至少16个、或至少17个、或至少18个、或至少19个、或至少20个核苷酸。下面的标准可单独或以任何组合用于进一步表征本发明的模板核酸分子：识别NARS的NA是切割性内切核酸酶(NE)；识别NARS的NA是N.BstNB I；NARS是半修饰的限制性内切核酸酶。可选择地，模板核酸分子的至少一条链固定于固体支持体上。该固定可例如通过双链cDNA分子或核酸连接物的末端进行，该末端现在不、过去不且将来也不参与双链cDNA分子和核酸连接物之间的连接。可选择地，在固体支持体和固定于固体支持体上的模板核酸分子的末端之间可存在连接体分子。可选择地，在固体支持体和最直接固定于固体支持体上的模板核酸分子的末端之间可存在连接体半分子，该连接体包含限制性内切核酸酶识别序列(RERS)一条链的序列。许多这种模板核酸分子可用于形成cDNA文库。在一个实施方案中，形成文库的许多模板核酸分子中的每一个都固定于固体支持体上。可选择地，在该文库中，识别NARS的NA是切割性内切核酸酶(NE)，如N.BstNB I。可选择地，如已经提及的，NARS可为半修饰的限制性内切核酸酶。
本发明的这些和相关方面及实施方案将在下文中更详细地进行阐明。
附图简述
图1是本发明方法中主要步骤的示意图，该方法用于用示例性的ODNP对在目标核酸的限定位置鉴定遗传变异，该ODNP对分别含有切割性内切核酸酶识别序列(NERS)有义链的序列和IIs型限制性内切核酸酶识别序列(TRERS)一条链的序列，
图2是本发明方法中主要步骤的示意图，该方法用于用各自含有NERS有义链的序列的示例性ODNP对在目标核酸的限定位置鉴定遗传变异。
图3是本发明方法中主要步骤的图示，该方法使用ODNP对、作为示例性IRERS的Bst I和作为示例性NERS的N.BstNB I在目标核酸的限定位置鉴定核苷酸。
图4是中断的限制性内切核酸酶识别序列主要成分的示意图。A1A2...Am是由m个核苷酸组成的特定的核苷酸序列，而A’1A’2...A’m是A1A2...Am的互补链序列。由A1A2...Am和A’1A’2...A’m组成的双链片段形成了第一个CRS。N1N2...Nn是由n个核苷酸组成的可变核苷酸序列，其中核苷酸的任何一个都可含有四个碱基的任何一个(A、C、T或G)。N’1N’2...N’n是N1N2...Nn的互补链并与N1N2...Nn组合形成了VRS。C1C2...Ci是由i个核苷酸组成的特定的核苷酸序列，而C’1C’2...C’i是C1C2...Ci的互补链。由C1C2...Ci和C’1C’2...C’i组成的双链片段形成了第二个CRS。
图5是本发明方法中主要步骤的示意图，该方法使用各自含有半修饰的RERS有义链的序列的示例性ODNP对在目标核酸的限定位置鉴定遗传变异。虚线代表具有整合的修饰脱氧核苷酸的延伸/扩增产物。
图6是本发明用于探测生物学样品中目标核酸存在与否的方法中主要步骤的示意图。
图7是从对4-聚体ODN(5’-ACGA-3’)的1∶10稀释物的电喷射-液相-层析/质谱分析法-飞行时间(ES-LC/MS-TOF)分析中获得的层析谱。
图8是从对4-聚体ODN(5’-ACGA-3’)的1∶100稀释物的(ES-LC/MS-TOF)分析中获得的层析谱。
图9是从对4-聚体ODN(5’-ACGA-3’)的1∶1000稀释物的(ES-LC/MS-TOF)分析中获得的层析谱。
图10A和10B是从对6-聚体ODN(5’-ACGATG-3’)的1∶10稀释物的(ES-LC/MS-TOF)分析中获得的层析谱。
图11是从对6-聚体ODN(5’-ACGATG-3’)的1∶100稀释物的(ES-LC/MS-TOF)分析中获得的层析谱。
图12是从对6-聚体ODN(5’-ACGATG-3’)的1∶1000稀释物的(ES-LC/MS-TOF)分析中获得的层析谱。
图13A和13B是从对8-聚体ODN(5’-ACGATGCA-3’)的1∶10稀释物的(ES-LC/MS-TOF)分析中获得的层析谱。
图14是从对8-聚体ODN(5’-ACGATGCA-3’)的1∶100稀释物的(ES-LC/MS-TOF)分析中获得的层析谱。
图15A和15B是从对10-聚体ODN(5’-GAACATCCAT-3’)的1∶10稀释物的(ES-LC/MS-TOF)分析中获得的层析谱。
图16是从对10-聚体ODN(5’-GAACATCCAT-3’)的1∶100稀释物的(ES-LC/MS-TOF)分析中获得的层析谱。
图17是从对10-聚体ODN(5’-GAACATCCAT-3’)的1∶1000稀释物的(ES-LC/MS-TOF)分析中获得的层析谱。
图18是一套4个、6个、8个和10个核苷酸的ODNP的高压液相层析(HPLC)的层析谱。
图19A和19B表示对3个8-聚体(图19A)和3个10-聚体(图19B)的HPLC分级分离和探测。
图20A和20B表示对1个4-聚体、1个6-聚体、3个8-聚体和3个10-聚体的HPLC分离(图20A)和对2个6-聚体的洗脱(图20B)。
图21是PCR反应产物用N.BstNB I和Bsl I两者消化后的UV层析谱。箭头显示单链核酸消化产物。
图22A和22B分别是PCR反应产物用N.BstNB I和Bsl I两者消化后的单个离子层析谱和总离子层析谱。
图23表示用N.BstNB I和Bsl I双消化从双链PCR产物中切割的单链寡核苷酸的质谱。
图24A和24B表示从一个个体的基因组DNA中扩增的序列5’-GAGCACAGGATG-3’(顶部链)和5’-CATCCTGTGCTC-3’(底部链)的UV层析谱(图24A)和抽取(extracted)的离子流图(图24B)。
图25A和25B表示从另一个个体的基因组DNA中扩增的序列5’-GAGCACAGGATG-3’(顶部链)和5’-CATCCTGTGCTC-3’(底部链)的UV层析谱(图25A)和抽取(extracted)的离子流图(图25B)。
图26A和26B表示无模板对照中的UV层析谱(图26A)和抽取的离子流图(图26B)。
图27A和27B表示顶部片段(m/z＝3@1265amu)(图27B)和底部片段(m/z＝3@1216amu)(图27A)的质谱。
图28是本发明用于制备单链核酸探针的示例性方法中主要步骤的示意图。固定的poly(dT)探针用于分离mRNA并充当合成cDNA的引物。然后使合成的cDNA与本发明的示例性连接物连接，该连接物包含切割性内切核酸酶识别序列(NERS)和IIs型限制性内切核酸酶识别序列(TRERS)。然后将连接的核酸片段用IIs型限制性内切核酸酶消化并用作模板以在DNA聚合酶和识别核酸连接物中的NERS的切割性内切核酸酶存在时合成短的单链核酸探针。
图29A-H是示例性连接物和目标核酸的连接产物的示意图。目标核酸由虚线代表。TRERS(“IIs型限制性内切核酸酶识别序列”的缩写)上面或下面的箭头显示从TRERS到识别TRERS的限制性内切核酸酶(RE)的切割位点的方向。同样地，NERS(“切割性内切核酸酶识别序列”的缩写)上面或下面的箭头显示从NERS到识别NERS的切割性内切核酸酶(NE)的切割位点的方向。
图30A和30B表示本发明方法中主要步骤的示意图，该方法用于确定目标cDNA分子中特定外显子-外显子连接(Exon A和Exon B之间的连接)的存在(图30A)或不存在(图30B)。
图31A-C表示用于本发明确定源自目标基因的cDNA中每一个外显子-外显子连接存在与否的方法中主要步骤的示意图。图31A是用于本发明方法中的目标基因和两套ODNP的示意图。虚线代表未显示的基因部分。图31B是目标cDNA分子(目标cDNA I)和扩增的模板核酸片段的示意图。图31C是另一个目标cDNA(目标cDNA II)和扩增的模板核酸片段的示意图。
图32表示源自1号个体的含有二等位基因(biallelic)的SNP(即A或T)或其互补核苷酸的扩增单链片段的质谱分析，该1号个体对于A等位基因是纯合的。上面的试验组表示含有T等位基因的互补核苷酸的片段(称为“T等位基因的底部链”)的抽取的离子流层析谱。第二个试验组表示含有T等位基因的片段(称为“T等位基因的顶部链”)的抽取的离子流层析谱。第三个试验组表示含有A等位基因的互补核苷酸的片段(称为“A等位基因的底部链”)的抽取的离子流层析谱。第四个试验组表示含有A等位基因的片段(称为“A等位基因的顶部链”)的抽取的离子流层析谱。下面的试验组表示总离子流的层析谱。
图33表示源自2号个体的含有二等位基因(biallelic)的SNP(即A或T)或其互补核苷酸的扩增单链片段的质谱分析，该2号个体对于A和T等位基因是杂合的。上面的试验组表示含有T等位基因的互补核苷酸的片段(称为“T等位基因的底部链”)的抽取的离子流层析谱。第二个试验组表示含有T等位基因的片段(称为“T等位基因的顶部链”)的抽取的离子流层析谱。第三个试验组表示含有A等位基因的互补核苷酸的片段(称为“A等位基因的底部链”)的抽取的离子流层析谱。第四个试验组表示含有A等位基因的片段(称为“A等位基因的顶部链”)的抽取的离子流层析谱。下面的试验组表示总离子流的层析谱。
图34表示源自样本的含有二等位基因(biallelic)的SNP(即A或T)或其互补核苷酸的扩增单链片段的质谱分析，该样本取自200个对于A等位基因是纯合的个体和1个对于T等位基因是纯合的个体。上面的试验组表示含有T等位基因的互补核苷酸的片段(称为“T等位基因的底部链”)的抽取的离子流层析谱。第二个试验组表示含有T等位基因的片段(称为“T等位基因的底部链”)的抽取的离子流层析谱。第三个试验组表示含有A等位基因的互补核苷酸的片段(称为“A等位基因的底部链”)的抽取的离子流层析谱。第四个试验组表示含有A等位基因的片段(称为“A等位基因的顶部链”)的抽取的离子流层析谱。下面的试验组表示总离子流的层析谱。
图35表示对与图34中相同的扩增寡核苷酸片段在2.5分钟和5分钟之间的二极管阵列追踪(UV追踪)(上面试验组)与总离子流(下面试验组)。
图36表示通过使源自基因组DNA的引发核酸与单链核酸探针退火及随后扩增单链核酸分子而制备模板核酸分子的主要步骤的示意图。
图37表示从基因组DNA制备模板核酸分子及随后扩增单链核酸分子的主要步骤的示意图。该基因组DNA包含切割剂识别序列。该模板分子是通过使基因组DNA片段的一条链与单链核酸探针退火而制备的，该单链核酸探针是基因组DNA片段的另一条链的部分。
图38表示从基因组DNA制备模板核酸分子及随后扩增单链核酸分子的主要步骤的示意图。该基因组DNA包含切割剂识别序列和限制性内切核酸酶识别序列。将可在其识别序列之外进行切割的切割性内切核酸酶所识别的切割性内切核酸酶识别序列用作示例性的切割剂识别序列。
图39表示用两个寡核苷酸引物从目标核酸制备模板核酸分子及随后扩增单链核酸分子的主要步骤的示意图。一个引物包含NERS有义链的序列而另一个引物包含IIs型限制性内切核酸酶识别序列(TRERS)的一条链。
图40表示用两个ODNP制备模板核酸分子及随后扩增单链核酸分子的主要步骤的示意图。在该示例性的实施方案中，两个ODNP均包含NERS有义链的序列。
图41表示在示例性的实施方案中用两个ODNP制备模板核酸分子及随后扩增单链核酸分子的主要步骤的示意图。两个ODNP均包含RERS一条链的序列。该扩增是在用作示例性的修饰脱氧核苷三磷酸的α-硫代脱氧核苷三磷酸存在时进行的。
图42表示用包含NARS反义链序列的单链核酸探针探测固定的目标核酸的方法的示意图。
图43表示用包含切割剂识别序列有义链序列的寡核苷酸引物扩增单链核酸分子的方法的示意图。
图44表示用固定的单链核酸探针探测目标核酸存在的方法的示意图，该单链核酸探针包含NARS有义链的序列和至少基本与目标核酸3’部分互补的序列。
图45表示用固定的单链核酸探针探测目标核酸存在的方法的示意图，该单链核酸探针包含NARS有义链的序列和至少基本与目标核酸互补的序列。
图46表示用寡核苷酸引物扩增单链核酸分子的方法的示意图，该寡核苷酸探针包含切割剂识别序列有义链的序列和包含双链IIs型限制性内切核酸酶识别序列(TRERS)的部分双链的核酸分子。
发明详述
本发明提供了用于扩增单链核酸片段的方法、组合物和试剂盒，该扩增方法用于如：鉴定遗传变异；制备寡核苷酸探针；和探测生物学样品中的核酸存在与否，和cDNA和mRNA中外显子之间连接的存在与否。该扩增是通过组合(a)包含切割剂识别序列(NARS)的模板双链核酸和(b)识别NARS的切割剂(NA)的识别位点(NS)而进行的。然后用切割剂在NS对双链核酸模板进行切割以借此在NS生成3’末端。在5’→3’外切核酸酶缺陷的DNA聚合酶存在时，延伸了NS的3’末端，从而替换了下游的单链DNA片段(即在NS具有5’末端的单链DNA片段)。然后用切割剂切割延伸产物，并将这样在NS形成的3’末端再次用DNA聚合酶进行延伸以形成另一个延伸产物。使该切割-延伸过程重复多次，从而导致具有由切割剂在NS生成的5’末端的单链DNA片段的扩增。
在各个方面，本发明在各个有用的应用中使用上述扩增方法，该应用包括在目标核酸中鉴定遗传变异、寡核苷酸探针的制备和探测生物学样品中特定核酸的存在与否或者cDNA或mRNA分子或群体中特定外显子-外显子连接的存在与否。这种应用在许多方面是有用的，包括遗传疾病的遗传分析、肿瘤或病原体诊断、鉴定疾病的诱因、法律、亲子确定、创建和监控作物培养或动物优质育种项目、细胞功能和/或疾病标记基因的表达描述、鉴定和/或表征在植物或动物中导致传染性疾病和/或与食品安全相关的传染性生物。
A. 规定/定义
在提供对本发明更详细的描述之前，如在下文中定义一些在此处所用的规定和术语对于理解是有帮助的。额外的定义可在贯穿本发明的描述中发现。
术语“3’”和“5’”在此处用于描述核酸单链中特定位点的位置。当核酸中的位置为参考核苷酸或参考核苷酸序列“3’”时，这意味着该位置在参考核苷酸或参考核苷酸序列的3’末端和该核酸链的3’羟基之间。同样地，当核酸中的位置为参考核苷酸或参考核苷酸序列“5’”时，这意味着该位置在参考核苷酸或参考核苷酸序列的5’末端和该核酸链的5’磷酸之间。进一步地，当所讨论核酸序列为参考核苷酸或参考核苷酸序列的“直接3’”时，这意味着该所讨论核酸序列直接邻接参考核苷酸或参考核苷酸序列的3’末端。类似地，当所讨论核酸序列为参考核苷酸或参考核苷酸序列“直接5’(5’to)”或“的直接5’(5’of)”，这意味着该所讨论核酸序列直接邻接参考核苷酸或参考核苷酸序列的5’末端。
如在此处所用的，“切割”指在相对于由进行切割的酶识别的核苷酸序列的特定位置对双链核酸分子的仅仅一条链或部分双链核酸分子的双链部分的切割。将核酸进行切割的该特定位置称为“切割位点”(NS)。
“切割剂”(NA)是识别完全或部分双链核酸分子的特定核苷酸序列并仅在相对于识别序列的特定位置切割核酸分子的一条链的酶。当双链(或部分双链的)核酸分子含有半修饰的识别/切割序列时，其中一条链含有至少一个阻止限制性内切核酸酶对该链(即含有衍生的核苷酸的链)进行裂解的衍生的核苷酸，该切割剂包括但不局限于切割性内切核酸酶(如N.BstNB I)和限制性内切核酸酶(如Hinc II)。
如在此处所用的，“切割性内切核酸酶”(NE)指识别完全或部分双链核酸分子的核苷酸序列并仅在相对于识别序列的特定位置对核酸分子的一条链进行切割的内切核酸酶。与限制性内切核酸酶(RE)不同，该限制性内切核酸酶(RE)需要其识别序列通过含有至少一个衍生的核苷酸而进行修饰以阻止对完全或部分双链核酸分子含有衍生的核苷酸的链进行切割，NE一般识别仅包含天然核苷酸的核苷酸序列并仅在含有该核苷酸序列的完全或部分双链核酸分子的一条链进行切割。
如在此处所用的，“天然核苷酸”指腺苷酸、鸟苷酸、胞苷酸、胸苷酸或尿苷酸。“ 衍生的核苷酸”指除天然核苷酸之外的核苷酸。
完全或部分双链的核酸分子中被NA识别的核苷酸序列称为“切割剂识别序列”(NARS)。同样地，完全或部分双链的核酸分子中被NE识别的核苷酸序列称为“切割性内切核酸酶识别序列”(NERS)。RE识别的特定序列称为“限制性内切核酸酶识别序列”(RERS)。如在此处所用的，“半修饰的RERS”指双链RERS，其中识别序列的一条链含有至少一个衍生的核苷酸(如α-硫代脱氧核苷酸)，该衍生的核苷酸阻止识别RERS的RE对该链(即在识别序列含有衍生的核苷酸的链)进行裂解。
在某些实施方案中，NARS是双链核苷酸序列，其中序列的一条链中的每一个核苷酸均与另一条链中相应位置的核苷酸互补。在这种实施方案中，含有可由识别NARS的NA切割的NS的链中的NARS序列称为“NARS有义链的序列”或“双链NARS有义链的序列”，而不含有NS的链中的NARS序列称为“NARS反义链的序列”或“双链NARS反义链的序列”。
同样地，在NERS是其中一条链精确地与另一条链互补的双链核苷酸序列的实施方案中，位于含有可由识别NERS的NE切割的NS的链中的NERS序列称为“NERS有义链的序列”或“双链NERS有义链的序列”，而位于不含有NS的链中的NERS序列称为“NERS反义链的序列”或“双链NERS反义链的序列”。例如，示例性切割性内切核酸酶N.BstNB I的识别序列和切割位点如下面所示，“”指示切割位点且N指示任何核苷酸：
            
5′-GAGTCNNNNN-3′
3′-CTCAGNNNNN-5′
N.BstNB I识别序列有义链的序列为5’-GAGTC-3’，而反义链的为5’-GACTC-3’。
类似地，含有可由识别半修饰的RERS(即不含有任何衍生的核苷酸的链)的RE切割的NS的链中的半修饰RERS序列称为“半修饰RERS有义链的序列”并位于“半修饰RERS有义链”中，而位于不含有NS的链(即含有衍生的核苷酸的链)中的半修饰RERS序列称为“半修饰RERS反义链的序列”并位于“半修饰RERS反义链”中。
在某些其他的实施方案中，NARS是具有一个或多个核苷酸错配的至多部分双链的核苷酸序列，但含有如上所述的双链NARS的完整有义链。根据此处所用的规定，在描述NARS的上下文中，当两个核酸分子相互退火从而形成杂交产物时，且该杂交产物包括NARS时，且在杂交产物的NARS中有至少一个错配的碱基对时，则认为该NARS是仅仅部分双链的。这种NARS可由某些切割剂(如N.BstNB I)识别，该切割剂仅需要双链识别序列的一条链来发挥其切割活性。例如，在某些实施方案中，N.BstNB I的NARS可含有如下完整有义链：
5′-GAGTC-3′
3′-NNNNN-5′
其中N指示任何核苷酸，且一个位置上的N可以与另一个位置上的N相同或不同，然而在该识别序列中有至少一个错配碱基对。在该情况下，可将NARS表征为具有至少一个错配的核苷酸。
在某些其他的实施方案中，NARS是具有一个或多个未配对核苷酸的部分或完全单链核苷酸序列，但含有如上所述的双链NARS的完整有义链。根据此处所用的规定，在描述NARS的上下文中，当两个核酸分子(即第一链和第二链)相互退火从而形成杂交产物时，且该杂交产物在第一链中包括由NA识别的核苷酸序列时(即杂交产物含有NARS时)，且当形成杂交产物时由NA识别的序列中至少一个核苷酸不相应于第二链中的核苷酸(即不在第二链中核苷酸的对面)，则在杂交产物的NARS中有至少一个未配对的核苷酸，且认为该NARS是部分或完全单链的。这种NARS可由某些切割剂(如N.BstNB I)识别，该切割剂仅需要双链识别序列的一条链来发挥其切割活性。例如，在某些实施方案中，N.BstNB I的NARS可含有如下完整有义链：
5′-GAGTC-3′
3′-N0-4-5′
(其中“N”指示任何核苷酸，0-4指核苷酸“N”的数目，且一个位置上的“N”可以与另一个位置上的“N”相同或不同)，该链含有N.BstNB I的双链识别序列有义链的序列。在该情况下，G、A、G、T或C的至少一个是未配对的，从而在互补链中没有相应的核苷酸。例如在杂交产物中有“环”时，且特别地当在环中存在有义链(完全或部分)时，这种情况会产生。
在本发明的一些方面，扩增的单链核酸片段是长度为最多5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、60个、70个、80个、90个或100个核苷酸的单链核酸片段。这种片段的短的长度促进了通过各种技术对其进行探测和/或表征，包括质谱分析法和液相层析，如在下文详细描述的。然而，在一些方面的某些实施方案中(如制备单链核酸探针)，扩增的单链核酸片段相对较长，例如其长度可为51-1000个核苷酸。
位于“相应于”双链核酸另一条链(第二链)的位置(即限定位置)的位置的双链核酸的一条链(第一链)中的核苷酸指，当第一条和第二条链相互杂交从而形成双链核酸时与第二链中限定位置的核苷酸形成氢键并互补的第一链中的核苷酸。同样地，“相应于”双链核酸的另一条链(第二链)中的切割位点的双链核酸的一条链(第一链)中的位置指第一链中两个核苷酸之间的位置，该两个核苷酸与围绕切割位点的第二链中的两个核苷酸互补。
B. 遗传变异的探测
在一方面，本发明提供了探测目标核酸中遗传变异的方法、化合物和试剂盒。
1. 探测遗传变异的方法
本发明提供了在目标核酸的限定位置探测遗传变异的方法。该方法包含（a)提供包含目标核酸片段和位于遗传变异5’的切割位点(NS)的双链模板核酸；(b)在DNA聚合酶和在NS进行切割的切割剂存在时扩增包含遗传变异的单链片段，该单链片段的5’末端位于NS；和(c)表征单链片段并借此鉴定遗传变异。在一个实施方案中，单链片段是在切割性内切核酸酶存在时扩增的。在另一个实施方案中，该片段是在限制性内切核酸酶存在时扩增的。
至于使用切割性内切核酸酶的方法，双链模板核酸可通过首先形成第一个寡核苷酸引物(ODNP)、第二个ODNP和在限定位置含有遗传变异的目标核酸的混合物而提供。在目标核酸是双链的情况下，如图1所示，第一个ODNP包含NERS有义链的核苷酸序列和至少基本与位于遗传变异互补链3’的目标核酸一条链的核苷酸序列互补的核苷酸序列。第二个ODNP包含至少基本与位于目标核酸另一条链上的遗传变异的3’的核苷酸序列互补的核苷酸序列，且可选择地包含限制性内切核酸酶识别序列(RERS)一条链的核苷酸序列。
在目标核酸是单链的情况下，第一个ODNP包含NERS有义链的核苷酸序列和至少基本与位于遗传变异5’的目标核酸相同的核苷酸序列，而第二个ODNP包含至少基本与位于遗传变异3’的目标核酸的核苷酸序列互补的核苷酸序列，且可选择地包含RERS一条链的核苷酸序列。
用目标核酸作为模板对第一个和第二个ODNP的延伸产生了具有NERS和可选择地具有RERS的延伸产物，其中遗传变异位于NERS和RERS之间。该延伸产物是包含目标核酸片段和位于遗传变异5’的NS的想要的双链模板核酸。如果其含有RERS，那么延伸产物可用识别RERS的限制性内切核酸酶进行裂解，并在识别NERS的NE存在时用作扩增单链核酸分子的模板。否则，延伸产物可直接用作扩增单链核酸分子的模板。该方法的示例性过程如图1所示，其中用TRERS(IIs型限制性内切核酸酶识别序列)作为示例性的RERS。
可选择地，如图2所示，双链模板核酸可通过首先形成第一个寡核苷酸引物(ODNP)、第二个ODNP和在限定位置含有遗传变异的双链目标核酸的混合物而提供。第一个ODNP包含NERS有义链的核苷酸序列和至少基本与位于遗传变异互补链5’的目标核酸一条链的核苷酸序列互补的核苷酸序列。第二个ODNP包含NERS有义链的序列，而不是如上所述的RERS。用目标核酸作为模板对第一个和第二个ODNP的延伸产生了具有两个NERS的延伸产物。该延伸产物是包含目标核酸片段和位于遗传变异5’的NS的想要的双链模板核酸。然后该延伸产物可用作在识别NERS的NE存在时扩增单链核酸片段的模板，该单链核酸片段的5’末端位于NS。
至于使用限制性内切核酸酶切割双链核酸的方法，双链模板核酸可通过首先形成第一个ODNP、第二个ODNP和双链目标核酸的混合物而提供(图5)。在目标核酸是双链的情况下，第一个ODNP包含第一个限制性内切核酸酶识别序列(RERS)一条链的序列和至少基本与位于遗传变异互补链3’的目标核酸一条链的核苷酸序列互补的核苷酸序列，而第二个ODNP包含第二个RERS一条链的序列和至少基本与位于限定位置3’的目标核酸第二链的核苷酸序列互补的核苷酸序列。在目标核酸是单链的情况下，第一个ODNP包含第一个RERS一条链的序列和至少基本与位于遗传变异互补链5’的目标核酸的核苷酸序列相同的核苷酸序列，而第二个ODNP包含第二个RERS一条链的序列和至少基本与位于遗传变异3’的目标核酸的核苷酸序列互补的核苷酸序列。在脱氧核苷三磷酸和至少一种修饰的脱氧核苷三磷酸存在时对第一个和第二个ODNP的延伸产生了具有第一个和第二个半修饰的RERS的片段。这种延伸产物可用作模板以在识别第一个RERS和第二个RERS的RE存在时扩增单链核酸分子。在某些实施方案中，第一个RERS与第二个RERS相同。因而，延伸产物可在识别第一个和第二个RERS两者的RE存在时进行扩增。
在所有上述的实施方案中，单链核酸分子的扩增是在切割剂和DNA聚合酶存在时实现的。该扩增的单链核酸分子含有目标核酸的遗传变异并进而进行了表征。借此鉴定了目标核酸的遗传变异。
a. 目标核酸
涉及鉴定遗传变异的本发明的目标核酸是任何如下核酸分子，该核酸分子用野生型核酸序列作为参考时可含有遗传变异，且可充当引物延伸反应的模板，即可与寡核苷酸引物形成碱基对。
术语“核酸”一般指整合了核糖核酸或其类似物单位的任何分子，优选地指多聚体分子。目标核酸可为单链或双链的。单链目标核酸可为变性的双链DNA的一条链。可选择地，它可为不源自任何双链DNA的单链核酸。在一方面，目标核酸是DNA。另一方面，目标是RNA。适当的核酸分子是DNA，包括基因组DNA、核糖体DNA和cDNA。其他适当的核酸分子是RNA，包括mRNA、rRNA和tRNA。核酸分子可天然存在，如在基因组DNA中，或它可为合成的，即基于人工作用制备的，或者可为两者的组合。
在一方面，目标核酸是天然存在的核酸或者源自天然存在的核酸。天然存在的目标核酸是从生物学样品中获得的。优选的生物学样品包括一种或多种哺乳动物组织，优选地为人类组织(如血液、血浆/血清、毛发、皮肤、淋巴结、脾、肝等)和/或细胞或细胞系。生物学样品可包含一种或多种人类组织和/或细胞。哺乳动物和/或人类组织和/或细胞可进一步包含一种或多种肿瘤组织和/或细胞。
从生物学样品中分离核酸群体的方法是众所周知的且对于本发明领域中技术人员而言是易于获得的。示例性的技术描述于如下面的实验室研究手册中：Sambrook等人，“Molecular Cloning”Cold SpringHarbor Press，3rd Edition，2001)和Ausubel等人，“Short Protocolsin Molecular Biology”(1999)(在此处整体引入作为参考)。核酸分离试剂盒在许多公司中也是商业上可购得的，且可用于简化和加速分离过程。
合成的目标核酸是通过人工干预生产的。目前，许多公司从事于制备和销售可用作本发明的目标核酸分子的合成核酸。这些公司可以或也将制备用于本发明的引物。参见如Applied Bio ProductsBionexus(www.bionexus.net)；Commonwealth Biotechnologies，Inc.(Richmond，VA；www.cbi-biotech.com)；Gemini Biotech(Alachua，Florida；www.geminibio.com)；INTERACTIVABiotechnologie GmbH(Ulm，德国；www.interactiva.de)；Microsynth(Balgach，瑞士；www.microsynth.ch)；Midland Certified ReagentCompany(Midland，TX；www.mcrc.com)；Oligos Etc.(Wilsonyille，OR；www.oligosetc.com)；Operon Technologies Inc.(Alameda，CA；www.operon.com)；Scandanavian Gene Synthesis AB(Kping，瑞典；www.sgs.dna)；Sigma-Genosys(The Woodlands，Texas；www.genosys.com)；Synthetic Genetics(San Diego，CA；www.syntheticgenetics.com，由Epoch Biosciences，Inc.(Bothell，WA；www.epochbio.com)所有)；和许多其他的。
合成的核酸目标可用扩增反应制备。该扩增反应可为如聚合酶链反应(PCR)。
合成的核酸目标可用重组DNA方法通过在一种或多种原核或真核生物中制备，该生物如大肠杆菌(E.coli)、酵母、果蝇(Drosophila)或哺乳动物组织培养细胞系。
目标核酸分子可以且通常会含有一种或多种存在于核苷酸中的天然碱基，即腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)和在RNA的情况下为尿嘧啶(U)。此外，且特别地当核酸是合成的分子时，目标核酸可包括“非天然的”核苷酸。非天然的核苷酸是化学半分子(moiety)，该半分子可替代核苷酸链中的一种或多种天然核苷酸而不导致核酸丧失其充当引物延伸反应模板的能力。该替代除碱基替代之外，可包括糖和/或磷酸替代。
这种半分子是本领域中众所周知的，且已知有许多名称，包括如无碱基核苷酸，该无碱基核苷酸不含有通常公认的核苷酸碱基如腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶或胸腺嘧啶(参见如Takeshita等人“Oligonucleotides containing synthetic abasic sites”TheJournal of Biological Chemistry，262卷，pp.10171-10179 1987；Iyer等人“Abasic oligodeoxyribonucleoside phosphorothioates：synthesis and evaluation as anti-HIV-1 agents”Nucleic acidsResearch，18卷，pp.2855-2859 1990；和美国专利6,117,657)；碱基或核苷酸类似物(参见如Ma等人，“Design and Synthesis ofRNA Miniduplexes via a Synthetic Linker Approach.2.Generationof Covalently Closed，Double-Stranded Cyclic HIV-1 TAR RNAAnalogs with High Tat-Binding Affinity”，Nucleic acids Research21：2585(1993)。一些碱基已知是通用的错配碱基类似物，如无碱基的3-硝基吡咯；convertides(参见如Hoops等人，Nucleic AcidsRes.25：4866-4871(1997)；修饰的核苷酸(参见如Millican等人，“Synthesis and biophysical studies of shortoligodeoxynucleotides with novel modifications：A possibleapproach to the problem of mixed base oligodeoxynucleotidesynthesis”，Nucleic acids Research 12：7435-7453(1984))；核苷酸模拟物；核酸相关化合物；间隔区(参见如Nielsen等人，Science 254：1497-1500(1991)；和特异性间隔区(参见如PCT国际公开号WO 98/13527)。
非天然核苷酸的额外的例子阐明于：Jaschke等人，TetrahedronLett.34：301(1993)；Seela和Kaiser，Nucleic acids Research15：3113(1990)和Nucleic acids Research 18：6353(1990)；Usman等人，PCT国际专利申请No.PCT/US 93/00833；Eckstein，PCT国际专利申请No.PCT/EP91/01811；Sproat等人，美国专利No.5,334,711，和Buhr和Matteucci，PCT国际公开号WO 91/06556；Augustyns，K.A.等人，Nucleic Acids Res.，1991，19，2587-2593)；和美国专利Nos.5,959,099和5,840,876。
当用于本发明的目标核酸分子和/或引物含有非天然的核苷酸时，那么在目标和引物之间将发生碱基对错配。术语“碱基对错配”指所有单个或多个核苷酸替代，该替代通过用半分子替代核苷酸而扰乱了常规碱基对(如G:C、A:T和A:U)之间的氢键，其中所述半分子不能根据标准的沃森-克里克模型与寡核苷酸双链体的另一条链上的相应核苷酸杂交。这种碱基对错配包括如G:G、G:T、G:A、G:U、C:C、C:A、C:T、C:U、T:T、T:U、U:U和A:A。同样包括于碱基对错配定义中的是扰乱了完美碱基配对的双链体的正常氢键的单个或多个核苷酸缺失或插入。此外，当碱基对中的一个或两个核苷酸进行了破坏碱基之间正常的氢键的共价修饰(如碱基的甲基化)时可引起碱基对错配。碱基对错配也包括非共价修饰，如那些由于整合了嵌入剂如溴化乙锭等而导致的，其中该嵌入剂可通过改变核酸双链体的螺旋性和/或碱基堆积而扰乱氢键。
除含有核酸或其类似物之外，目标也含有一种或多种特性未知的天然碱基(即潜在的遗传变异)。本发明提供了使未知核苷酸的特性变为已知和使遗传变异得到鉴定的组合物和方法。特性未知的碱基存在于“核苷酸座位”(或“限定位置”或“限定座位”)上，这是指特定的核苷酸或包含一个或多个其在目标核酸上具有精确位置的核苷酸的区域。
在某些实施方案中，目标核酸是固定于固体支持体上的。可使用任何核酸分子可直接或间接附着其上的固体支持体。这种支持体包括硝酸纤维素、尼龙、玻璃和金属。目标核酸可不经过纯化或分离而固定于固体支持体上。可选择地，它们可首先从含有目标核酸的样品中纯化，然后再固定于固体支持体上。将核酸分子固定于固体支持体上的方法是本领域中众所周知的，如组织印迹(tissue printing)和聚乙烯亚胺的使用。
如在此处所用的，术语“多态”和“遗传变异”指群体中的小区域中(即长度为一个到几个(如2、3、4、5、6、7或8个)核苷酸)两个或多个遗传上确定的替代序列或等位基因的出现。在选择的群体中最经常发生的等位基因形式称为野生型形式。其他等位基因形式命名为变体形式。二倍体生物对于等位基因形式可为纯合的或杂合的。
遗传变异可对基因表达产生或不产生影响，包括表达水平和表达产物(即编码的肽)。影响基因表达的遗传变异也称为“突变”，包括点突变、移码突变、调节性突变、无义突变和错义突变。“点突变”指在核酸样品中限定的核苷酸座位上野生型碱基(即A、C、G或T)被一个其他的标准碱基替代的突变。它可通过碱基替代或碱基缺失导致。“移码突变”是由小的缺失或插入导致的，该缺失或插入反过来导致基因的可读框移动，并因而形成新的肽。“调节性突变”指非编码区内的突变，如内含子、位于编码区5’或3’的区域，该突变影响了正确的基因表达(如表达量、蛋白质定位、表达时间)。“无义突变”是导致三联体密码(在该处发生了突变)被读为“终止”密码子的单核苷酸改变，从而导致肽延长的过早终止，即导致截断的肽。“错义突变”是导致一个氨基酸变为不同氨基酸的突变。该突变可导致肽折叠(3-维结构)和/或在多聚体蛋白质中与其他肽的正确结合的改变。
在本发明的一个方面，遗传变异是“单核苷酸多态”(SNP)，这是指任何单核苷酸序列变异，优选地为生物群体中常见的且以孟德尔模式遗传的。一般地，SNP是两个可能的碱基的任何一个，且不可能在SNP位点发现第三个或第四个核苷酸实体。
遗传变异可与疾病或病症相关，或可导致疾病或病症。如在此处所用的，术语“与...相关”指在遗传变异的发生和宿主中出现疾病或病症之间存在正相关。这种疾病或病症可为人类遗传疾病或病症，且包括但不局限于膀胱癌、结肠直肠癌、镰状细胞贫血、地中海贫血、al-抗胰蛋白酶缺乏症(al-antitrypsin deficiency)、自毁容貌综合症、囊性纤维化/粘液粘稠病、杜兴氏/Becker氏肌营养不良、阿尔茨海默氏病、X-染色体依赖性精神薄弱和Huntington氏舞蹈病、苯丙酮尿症、半乳糖血症、威尔逊病、血色病、恶性复合免疫缺陷症、α-1-抗胰蛋白酶缺乏症、白化病、尿黑酸症、溶酶体贮积病、埃-当二氏综合症、血友病、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶紊乱、无丙种球蛋白血症、尿崩症、Wiskott-Aldrich氏病、法布莱氏病、脆性X-综合症、家族性高胆固醇血症、多囊肾、遗传性球形红细胞贫血症、Marfan氏综合症、冯维勒布兰德氏病、神经纤维瘤、结节性脑硬化、遗传性出血毛细血管扩张症、家族性结肠息肉病、埃-当二氏综合症、肌强直性营养不良、成骨不全、急性间歇性血卟啉病、和脑视网膜血管瘤病。
目标核酸可在与下文所述的ODNP进行组合之前进行扩增。可使用任何已知的扩增核酸的方法。示例性的方法包括但不局限于使用Qβ复制酶、链置换扩增(Walker等人，Nucleic Acids Research 20：1691-6，1995)、转录介导的扩增(Kwoh等人，PCT Int’l.Pat.Appl.Pub.No.WO88/10315)、RACE(Frohman，Methods Enzymol.218：340-56，1993)、单侧PCR(one-sided PCR)(Ohara等人，Proc.Natl.Acad.Sc.86：5673-7，1989)和缺口-LCR(Abravaya等人，NucleicAcids Res.23：675-82，1995)。引用的文章和PCT国际专利申请在此处整体引入作为参考。
b. 制备双链模板核酸
如上文所提到的，含有来自目标核酸的遗传变异的单链核酸分子可在切割剂(如NE或RE)和DNA聚合酶存在时进行扩增。对于用NE作为切割剂对单链核酸分子的扩增，用于扩增的模板核酸必须含有NERS(有时称为第一个NERS)。此外，模板核酸也可含有RERS或第二个NERS。除第一个NERS之外RERS或第二个NERS的存在使得能够在不含有NS的模板链中进行切割，该切割靠近相应于由与第一个NERS结合的NE产生的切割位点的位点。这样的切割使得从模板扩增的单链核酸分子相对较小，并因而促进对整合入单链核酸分子中的遗传变异的表征。对于用RE作为切割剂对单链核酸分子的扩增，用于扩增的模板核酸必须含有半修饰的RERS且可含有额外的RERS。如果存在两个半修饰的RERS，那么它们可为相同的或不同的。与含有两个NERS的模板相似，第二个半修饰的RERS的存在也使得扩增的单链核酸分子相对较小。
i. 寡核苷酸引物(ODNP)的设计
本发明的模板核酸可通过用特定设计的ODNP扩增含有遗传变异的目标核酸片段而提供。术语“寡核苷酸”(ODN)指用常规的自动核酸(如DNA)合成仪合成获得的核酸片段(一般为DNA或RNA)。寡核苷酸与术语多核苷酸同义使用。术语“寡核苷酸引物”(ODNP)指用于杂交、延伸和/或扩增反应的任何具有两个或多个核苷酸的多聚体。ODNP可包含脱氧核苷酸、核苷酸或每一个的类似物。如在此处杂交、延伸和扩增反应所用的，ODNP长度一般为8～200个碱基。更优选的是长度在12～50个碱基之间的ODNP，且更加优选的为长度在18～32个碱基之间的ODNP。
在一方面，本发明提供了用于产生模板核酸的ODNP对(称作“第一个ODNP对”)，其中所述模板核酸含有NERS且可选择地含有RERS，而遗传变异位于NERS和可选择地存在的RERS之间。为方便起见，将双链目标核酸用于下面对ODNP对的描述中。第一个ODNP对的一个ODNP(称作“第一个ODNP”)包含(1)NERS有义链的序列和(2)至少基本与含有遗传变异互补核苷酸的目标核酸链的核苷酸序列互补的核苷酸序列。与第一个ODNP的部分互补的目标的核苷酸序列位于遗传变异的互补核苷酸的3’。这样的设计使得第一个ODNP的延伸产物能够整合遗传变异。短语“至少基本互补”指ODNP的部分与目标核酸互补的程度足以使得ODNP特异性地与目标进行退火并充当延伸/扩增的引物。在优选的实施方案中，互补指精确互补。与目标互补的ODNP的序列可位于NERS有义链序列的3’或5’。优选地，存在至少基本与目标互补的序列，其位于NERS有义链序列的5’和3’。位于NERS有义链序列3’的基本或精确互补序列的存在促进了引物与模板在预定的位置进行退火并增加了延伸/扩增效率。位于NERS有义链序列5’的基本或精确互补序列的存在减少了成功和有效退火和延伸所需要的位于NERS有义链序列3’的核苷酸数目，且也缩短了如在下文详细描述的随后扩增的单链核酸分子的长度。ODNP的NERS有义链的完整序列可以与目标的相应区域互补或不互补。在一方面，ODNP的NERS有义链的完整序列与目标的相应区域不是精确互补的。通常，ODNP含有至少6个、优选地为8个、更优选地为10个、最优选地为12、14或16个与目标核酸精确互补的核苷酸。
第一个ODNP对的另一个ODNP(称作“第二个ODNP”)包含(1)至少基本与含有遗传变异的目标核酸链的核苷酸序列互补的核苷酸序列；和可选择地(2)RERS一条链的序列。与目标的部分至少基本互补的ODNP的核苷酸序列设计为位于遗传变异3’。这样的设计使得第二个ODNP的延伸产物能够整合遗传变异的互补链。与第一个ODNP相似，第二个ODNP的退火部分与目标的相应部分的互补不必是精确的，但必须足以使得第二个ODNP特异性地与目标在想要的位置进行退火并充当延伸/扩增的引物。如果存在RERS，那么至少基本与目标互补的第二个ODNP的序列可位于RERS一条链序列的3’或5’。优选地，存在至少基本与目标互补的序列，其位于RERS序列的5’和3’。第二个ODNP的RERS的序列可以与目标的相应区域互补或不互补，且一般它将不与目标的相应区域精确互补。通常，第二个ODNP含有至少6个、优选地为8个、更优选地为10个、最优选地为12、14或16个与目标核酸精确互补的核苷酸。
尽管第一个ODNP对已与双链的目标核酸一起在上文进行了描述，但本领域的技术人员利用在此处提供的指南，易于设计该ODNP对以及其他用于目标核酸是单链的情况下的ODNP对(即如在下文描述的第二个ODNP对和第三个ODNP对)。简言之，如果目标核酸是单链的，则第一个ODNP包含NERS有义链的核苷酸序列和至少基本与位于遗传变异5’的目标核酸的核苷酸序列相同的核苷酸序列，而第二个ODNP包含至少基本与位于遗传变异5’的目标核酸的核苷酸序列互补的核苷酸序列且可选择地包含RERS一条链的序列。术语“至少基本相同”指ODNP核苷酸序列的部分和目标核酸的相应部分之间的一致性程度足以使得ODNP能够特异性地与包含与目标核酸的相应部分精确互补的序列的核酸进行退火，并能够充当以该核酸作为模板的延伸/扩增的引物。在某个优选的实施方案中，第一个ODNP核苷酸序列的部分与目标核酸的部分精确相同。
另一方面，本发明提供了用于生产含有一个或两个NERS的模板核酸的ODNP对(称为“第二个ODNP对”)，且如果存在第二个NERS，那么来自目标的遗传变异位于两个NERS之间。第二个ODNP对的第一个ODNP与上述第一个ODNP对的第一个ODNP相同。除了第一个ODNP对的第二个ODNP中RERS一条链的序列被第二个ODNP对的第二个ODNP中NERS有义链的序列替代之外，第二个ODNP对的第二个ODNP与第一个ODNP对的第二个ODNP相同。
另外一方面，本发明提供了用于生产含有一个或两个半修饰的RERS的模板核酸的ODNP对(称为“第三个ODNP对”)，且如果存在第二个半修饰的RERS，那么遗传变异位于两个半修饰的RERS之间。除了第一个ODNP对的第一个ODNP中NERS有义链的序列被半修饰的RERS有义链替代之外，第三个ODNP对的第一个ODNP与上述第一个ODNP对的第一个ODNP相同。除了第一个ODNP对的第二个ODNP中RERS一条链的序列被第三个ODNP对的第二个ODNP中半修饰的RERS有义链的序列替代之外，第三个ODNP对的第二个ODNP与第一个ODNP对的第二个ODNP相同。第三个ODNP对中，第一个ODNP中半修饰的RERS有义链的序列可以与第二个ODNP的相同或不同。优选地，它们是相同的。
在进一步的方面，本发明提供了用于生产在限定位置含有待鉴定的遗传变异的单链核酸部分的ODNP对(称为“第四个ODNP对”)(图3)。为方便起见，将单链目标核酸用于下面对ODNP对的描述中。然而，利用在此处提供的指南设计其中目标核酸是双链的ODNP对是在技术人员的技术范围之内的。
第四个ODNP对的一个引物(“第一个ODNP”)包含至少基本与位于限定位置3’的目标核酸的核苷酸序列(“目标核酸的第一个区域”)互补的核苷酸序列，而第四个ODNP对的另一个引物(“第二个ODNP”)包含至少基本与位于限定位置核苷酸的互补核苷酸3’的目标核酸互补链的核苷酸序列(“互补链的第一个区域”)互补的核苷酸序列。ODNP和其相应目标核酸或其互补链的互补不必是精确的，但必须足以使得ODNP能够选择性地与目标核酸或其互补链进行杂交，从而该ODNP能够充当用目标核酸或其互补链作为模板的延伸和/或扩增的引物。通常，每一个ODNP含有至少6个、优选地为8个、更优选地为10个、最优选地为12、14或16个与目标核酸或其互补链精确互补的核苷酸。因为第四个ODNP对的每一个ODNP与目标核酸或其互补链在位于目标的限定位置或目标互补链的互补位置的3’杂交，所以从第四个ODNP对所得的延伸和/或扩增产物整合了在限定位置待鉴定的核苷酸或其互补链。
本发明的第四个ODNP对的每一个ODNP进一步包含位于且优选地直接位于上述核酸序列(即与目标核酸或其互补链互补的序列)3’的中断的限制性内切核酸酶识别序列(IRERS)一条链的部分序列，但不包含IRERS该链的完整序列。如在下面更详细描述的，完整的IRERS是包含由可变识别序列(VRS)连接的第一个不变识别序列(CRS)和第二个CRS的双链核苷酸序列(图4)。通常，第一个ODNP和第二个ODNP分别包含IRERS第一链的第一个CRS和IRERS第二链的第二个CRS。此外，第一个ODNP和第二个ODNP是这样间隔的，从而(1)用第四个ODNP对作为引物和用目标核酸作为模板的延伸和/或扩增产物含有完整的IRERS和(2)要鉴定的核酸整合入VRS中。换句话说，第一个和第二个CRS之间的核苷酸数目就是VRS中核苷酸的数目，从而来自第四个ODNP对的延伸和/或扩增产物可由识别完整IRERS的RE消化。每一个ODNP中的部分IRERS可以与目标核酸互补或不互补。
在优选的实施方案中，第四个ODNP对的每一个ODNP进一步在CRS3’的位置或优选地在CRS的3’末端含有一个或多个与目标核酸或其互补链互补的核苷酸(分别为“目标核酸的第二个区域”和“互补链的第二个区域”)。这种核苷酸是VRS的一部分(图3和4)。目标核酸或其互补链的第一个和第二个区域之间的核苷酸数目可多于或少于，但优选等于位于与目标核酸或其互补链互补的相应第一个和第二个区域之间的ODNP核苷酸数目。此外，在一方面，第一个ODNP进一步在IRERS第一链第一个CRS的5’位置含有NERS有义链的序列。可选择地，第二个ODNP进一步在IRERS第二链第二个CRS的5’位置含有NERS有义链的序列。这种NERS的存在使得能够在用下述识别INERS的NE和识别IRERS的RE消化来自ODNP的延伸/扩增产物时产生短的单链寡核苷酸。
设计序列特异性引物的通用技术是众所周知的。例如，这些技术描述于书中，如1993年由Bruce A.White编辑的PCR Protocols：Current Methods and Application；1995年由Carl W.Dieffenbach和Gabriela S.Dveksler编辑的PCR Primer：A Laboratory Manual；McPherson等人的PCR(Basics：From Background to Bench)；1999年由Michael A.Innis编辑的PCR Applications：Protocols forFunctional Genomics；1997年Newton和Graham的PCR：Introductionto Biotechniques Series；1990年Gelfand等人的PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications；Michael A.Innis的PCRStrategies；1994年Griffin和Griffin的PCR Technology：CurrentInnovations；和由J.F.Burke编辑的PCR：Essential Techniques。此外，设计引物的软件程序也是可用的，包括Primer Master(参见Proutski和Holmes，“Primer Master：A new program for the designand analysis of PCR primers”Comput.Appl.Biosci.12：253-5，1996)和来自Molecular Biology Insights，Inc.(Cascade，CO，美国)的OLIGO Primer Analysis Software。上述参考书和软件程序的描述在此处整体引入作为参考。
根据本发明的ODNP可通过任何本领域中公知的寡核苷酸合成方法进行合成，如公开于美国专利No.6,166,198、6,043,353、6,040,439和5,945,524中的(在此处将其整体引入作为参考)。例如，固相寡核苷酸合成可通过依次将5’封闭的核苷酸连接到附着于树脂上的新生寡核苷酸上，随后进行氧化和去封闭以形成磷酸二酯键来进行。然后可分离本发明的ODNP。此处所用的术语“分离的”指基本不含不想要的杂质(如具有其他序列的分子)的分子。
ii. 寡核苷酸引物的固定
在某些实施方案中，本发明的ODNP可进行固定。通常，ODNP可以以下面两种途径固定到基质上：(1)直接在基质上合成ODNP(通常称为“原位合成”)，或(2)独立合成ODNP，然后将其定位并结合到基质上(有时称为“合成后附着”)。对于原位合成，主要的技术是光刻法(photolithography)。简言之，该技术包括用光不稳定的基团修饰固体支持体的表面，该基团可保护如通过连接元件结合到基质上的氧原子。该保护的羟基基团的阵列通过光蚀刻面罩进行光照，从而在受照射的区域产生了反应性的羟基基团。然后使在5’羟基用相同光不稳定基团保护的3’-O-亚磷酰胺-活化的脱氧核苷处于表面，在受照射的区域通过羟基基团发生了偶联。在进一步的化学反应之后，将该基质进行漂洗并使其表面通过第二个面罩进行光照以暴露额外的羟基基团用于偶联。将第二个5’-保护的、3’-O-亚磷酰胺-活化的脱氧核苷处于表面。使选择性的光-去保护和偶联循环重复直到获得了想要的产物组。在阵列制作中使用光刻法的详细描述可发现于下面的专利或公布的专利申请中：美国专利No.5,143,854、5,424,186、5,856,101、5,593,839、5,908,926、5,737,257；和公布的PCT专利申请No.WO99/40105、WO99/60156、WO00/35931。
合成后附着方法需要将预先存在的寡核苷酸附着到基质上的方法。一种方法利用生物学-链霉抗生物素相互作用。简言之，众所周知生物素和链霉抗生物素形成了非共价的但非常强的相互作用，其强度可认为与共价键的强度相等。可选择地，人们可将预先合成的寡核苷酸共价地结合到基质上。例如，碳二亚胺通常用于使DNA偶联到固体支持体上的三种不同方法中。在一个方法中，支持体用酰肼基团包被，然后用碳二亚胺和羧基-修饰的寡核苷酸处理。可选择地，具有多个羧酸基团的基质可用氨基-修饰的寡核苷酸和碳二亚胺处理。基于环氧化物的化学物也与胺修饰的寡核苷酸一起使用。将预先存在的寡核苷酸与基质附着的方法的详细描述可发现于下面的参考文献中：美国专利No.6,030,782、5,760,130、5,919,626；公布的PCT专利申请No.WO00/40593；Stimpson等人Proc.Natl.Acad.Sci. 92：6379-6383(1995)；Beattie等人Clin.Chem. 41：700-706(1995)；Lamture等人Nucleic Acids Res. 22：2121-2125(1994)；Chrisey等人NucleicAcids Res. 24：3031-3039(1996)；和Holmstrom等人，Anal.Biochem.209：278-283(1993)。
主要的合成后附着方法包括喷墨法(ink jetting)和机械打点法(mechanical spotting)。喷墨法包括用源自喷墨印刷工业的分液器分配寡核苷酸。将寡核苷酸从源盘上取出并置于喷头中，然后移动到基质上面的位置。然后用压力使寡核苷酸经过小孔，从而导致液滴从喷头喷射到基质表面上。阵列制作中利用喷墨法的详细描述可发现于下面的专利中：美国专利No.5,700,637、6,054,270、5,658,802、5,958,342、6,136,962和6,001,309。
机械打点法包括刚性针的使用。将针浸入寡核苷酸溶液，借此将小体积的溶液转移到针尖上。针尖与基质的接触产生了斑点，其直径是由针的表面能量、寡核苷酸溶液和基质确定的。机械打点法可用一个寡核苷酸荷载产生多个阵列斑点。阵列制作中利用机械打点法的详细描述可发现于下面的专利或公布的专利申请中：美国专利No.6,054,270、6,040,193、5,429,807、5,807,522、6,110,426、6,063,339、6,101,946和公布的PCT专利申请No.WO99/36760、99/05308、00/01859、00/01798。
本领域的技术人员可以理解除上述方法之外，其他方法也可用于将ODNP固定于基质上。这种方法的描述可发现于但不局限于下面的专利或公布的专利申请中：美国专利No.5,677,195、6,030,782、5,760,130、5,919,626和公布的PCT专利申请No.WO98/01221、WO99/41007、WO99/42813、WO99/43688、WO99/63385、WO00/40593、WO99/19341、WO00/07022。这些专利和专利申请以及所有本部分(即ODNP的固定)引用的参考文献(包括专利、专利申请和杂志文章)均在此处整体引入作为参考。
iii. 杂交
本发明的方法、试剂盒和组合物可包含或涉及与目标核酸杂交的ODNP，该ODNP促进目标核酸中限定的核苷酸座位的产生和/或扩增。因而使ODNP和目标核酸在使得能够进行杂交和/或扩增的碱基配对条件下进行组合。适当的核酸杂交和/或扩增条件的选择在本领域技术人员的技术范围内，且可通过参考如下面的实验室研究手册而得到辅助：Sambrook等人，“Molecular Cloning”(Cold Spring Harbor Press，1989)和Ausubel等人，“Short Protocols in Molecular biology”(1999)(在此处整体引入作为参考)。
依赖于预想的应用，技术人员可改变杂交条件以获得ODNP对目标序列期望的选择性程度。对于需要高选择性的应用，可采用相对严格性条件进行杂交，如低盐和/或高温条件(如在约50℃～约70℃的温度下约0.02M～约0.15M盐)。这种选择条件相对地不能容忍ODNP和目标核酸之间大的错配。
可选择地，ODNP的杂交可在中等严格性条件下实现，如于60℃在10mM Tris，pH 8.3；50mM KCl；1.5 mM MgCl2中，该条件允许包含核苷酸错配的ODNP与目标核酸进行杂交。可选择的杂交条件的设计是在技术人员的技术范围之内的。
iv. 核酸延伸/扩增
为了获得包含在限定位置含有遗传变异的目标核酸的部分和识别序列的各种组合(如NERS和RERS(包括IRERS)，两个NERS或两个半修饰的RERS)的模板核酸，使一对引物与目标核酸进行杂交，且ODNP对的每一个引物均是用本领域中公知的方法延伸的，如聚合酶链反应(PCR)和修饰的连接酶链反应(LCR)。通常，需要进行至少三轮对上述ODNP对的延伸反应。简言之，第一轮延伸是针对具有酶识别序列(ERS)(“第一个ERS”)(如半修饰的RERS、NERS)有义链的序列的第一个引物的，以将目标核酸的遗传变异整合入第一个延伸产物中。然后使可选择地具有另一个ERS(“第二个ERS”)一条链的额外序列的第二个引物与第一个扩增产物杂交并用第一个扩增产物作为模板，借此将遗传变异的互补链和第一个ERS的互补链整合入第二个延伸产物中，其中该第二个ERS可以与第一个ERS相同或不同。然后使未延伸的第一个引物与第二个延伸产物杂交并以第二个延伸产物作为模板进行延伸，以借此与第二个延伸产物组合形成双链核酸片段，该双链核酸片段含有遗传变异及其互补链以及两个完整的ERS。
尽管三轮延伸反应足以产生含有目标核酸的遗传变异和两个ERS的片段，但优选地应进行超过三次延伸反应以扩增模板。如本领域技术人员可理解的，在随后的延伸中，第一个引物可以与目标核酸、第二个延伸产物和第三个延伸产物的互补链中的任何一个杂交并以其作为模板进行延伸。类似地，在随后的延伸中，第二个引物可以与第一个延伸产物或第三个延伸产物杂交并以其作为模板进行延伸。然而，因为第三个延伸产物及其互补链比目标核酸、第一个延伸产物和第二个延伸产物的任何一个短，所以它是随后对第一个或第二个ODNP的延伸反应的优选模板。这是因为以短片段作为模板的延伸效率比以长片段作为模板的高。随着延伸反应数目的增加，含有遗传变异和第一个ERS两者以及可选择地第二个ERS的双链片段比反应混合物中其他分子更快地累积。这种累积增加了随后对用上述模板核酸作为模板扩增的单链核酸的表征的灵敏性。
延伸/扩增反应可用本领域中公知的任何方法实施。例如，可使用描述于美国专利No.4,683,195、4,683,202和4,800,159中的PCR方法。也可使用其他如在书中描述的PCR方法，如Gelfand等人，“PCRProtocols：A Guide to Methods and Application”(1990)；Burke(ed)，“PCR：Essential Techniques”，和McPherson等人“PCR(Basics：From Background to Bench)”。上述参考文献的每一个均在此处整体引入作为参考。简言之，在PCR中，制备了两个ODNP，该ODNP与目标核酸序列的相对互补链的区域互补。将过量的脱氧核苷三磷酸与DNA聚合酶(如Taq或Pfu聚合酶)一起加入到反应混合物中。如果在样品中存在目标核酸序列，那么ODNP将结合到目标上，且聚合酶将导致ODNP沿目标核酸序列通过添加核苷酸而延伸。通过提高和降低反应混合物的温度，延伸的ODNP将从目标中解离以形成反应产物，过量的ODNP将结合到目标和反应产物上。且重复该程序。
根据本发明的示例性PCR条件可包括但不局限于下面的：100μl包含100ng目标核酸的PCR反应物；各自0.5μM的第一个ODNP和第二个ODNP；10mM Tris，pH 8.3；50mM KCl；1.5mM MgCl2；各自200μM的dNTP；4单位的TaqTM DNA聚合酶(Boehringer Mannheim；Indianapolis，IN)和880ng TaqStartTM抗体(Clontech，Palo Alto，CA)。示例性的热循环条件可为如下：94℃初始变性5分钟；94℃30秒、60℃30秒、72℃1分钟进行45个循环；最后72℃延伸5分钟。示例性的核酸聚合酶可包括一种本领域中易于获得的热稳定性DNA聚合酶，如TaqTM、VentTM或PFUTM。依赖于预期的特定应用，优选地是采用一种具有缺陷的3’到5’外切核酸酶活性的核酸聚合酶。
制备和/或扩增含有要鉴定的核苷酸的片段的可选择的途径是通过修饰的连接酶链反应，称为缺口-LCR(Abravaya等人，Nucleic AcidsRes.23：675-682(1995))。简言之，在目标序列存在时，该套中的每一对将结合到目标或其互补链上，从而位于目标核酸中目标核苷酸的5’和3’(在其每一侧)。在聚合酶和连接酶存在时，每一对中两个ODNP间的缺口将被填充并且每一对的ODNP将被连接以形成单个单位。通过温度循环，如在PCR中的，结合的连接单位将从目标中解离并充当“目标序列”以用于过量ODNP对的连接。因而，LCR用核酸聚合酶和核酸连接酶两者来驱动反应。示例性的核酸聚合酶可包括一种本领域中易于获得的热稳定性DNA聚合酶，如TaqTM、VentTM或PFUTM。示例性的核酸连接酶可包括T4 DNA连接酶或热稳定性的Tsc或PfuDNA连接酶。在此处整体引入作为参考的美国专利No.4,883,750描述了一种与LCR相似的可选择的扩增方法以使ODNP对与目标序列结合。
示例性的缺口-LCR条件可包括但不局限于下面的：50μl包含500ng DNA的LCR反应物；含有50mM EPPS，pH7.8的缓冲液、30mM MgCl2、20mM K+、10μM NAD、1-10μM缺口填充核苷酸、各自30nM寡核苷酸引物、1U缺失3’→5’外切核酸酶活性的黄栖热菌(Thermusflavus)DNA聚合酶(MBR，Milwaukee，WI)和5000U嗜热栖热菌(T.thermophilus)DNA连接酶(Abbott Laboratories)。循环条件由85℃温育30秒和60℃温育30秒进行25个循环组成，且可在标准的PCR机器如Perkin Elmer 9600热循环仪上进行。
为了防止含有两个RERS的模板核酸在两链中被裂解，可在修饰的脱氧核苷三磷酸(如α-硫代脱氧核苷三磷酸)存在时进行对第三个ODNP对的延伸/扩增。修饰的脱氧核苷三磷酸在RERS一条链中的整合阻断了识别RERS的RE在修饰的链中的切割。因此，只有作为ODNP的部分的RERS有义链可被切割。
任何有利于抑制包含RERS的DNA双链中的一条被切割的修饰的脱氧核苷三磷酸可用于本发明中。示例性修饰的脱氧核苷三磷酸包括，但不局限于2’-脱氧胞苷5’-O-(1-硫代三磷酸)[即dCTP(αS)]、2’-脱氧鸟苷5’-O-(1-硫代三磷酸)、胸苷-5’-O-(1-硫代三磷酸)、2’-脱氧胞苷5’-O(1-硫代三磷酸)、2’-脱氧尿苷5’-三磷酸、5-甲基脱氧胞苷5’-三磷酸和7-脱氮-2’-脱氧鸟苷5’-三磷酸。
在某些实施方案中，可使用超过一种修饰的脱氧核苷三磷酸。在一些其他的实施方案中，对某些适当核苷酸的合成后修饰提供了使用修饰的脱氧核苷三磷酸的替代方法。
在目标核酸是RNA分子(如mRNA)的一些实施方案中，可能需要用RNA分子作为模板的DNA聚合酶(如反转录酶)。由DNA聚合酶合成的单链DNA分子可进一步用作模板，以在DNA聚合酶存在时，用DNA分子作为模板合成和/或扩增双链DNA分子。
本发明也可用于多重鉴定目标核酸中限定位置上的遗传变异。在这种应用中，多个目标核酸和对这些目标核酸特异性的ODNP对可在扩增条件下组合在一起。该组合减少了与扩增所需的试剂和DNA聚合酶相关的花费。结果所得的扩增产物将随后用作模板以扩增单链核酸分子，且因此模板的扩增通常不必是大量的，这是因为单链核酸分子的第二次扩增增加了能被随后的探测方法探测的样品的量。
在一些实施方案中，本发明的模板核酸可用与在下面详细描述的单链核酸分子扩增中所用的相同的DNA聚合酶来获得。
v. 限制性内切核酸酶和消化条件
如上所述扩增的模板核酸如果含有RERS(不包括半修饰的RERS)，则一般由识别RERS的RE进行消化。术语“限制性内切核酸酶”(RE)指一类识别唯一的双链核酸序列并在双链核酸中产生裂解的核酸酶，结果产生平头双链末端或具有5’或3’突出端的单链末端。RE通常分为3类：I型、II型和III型，其中II型是最经常用于分子生物学操作中的。可用于本发明中的RE包括任何II型RE，如(1)识别长度为4个、5个或6个核苷酸且展示二重对称的特定序列的大多数II型RE(如EcoR I，BamH I)，(2)IIs型RE(TSRE)和(3)中断的RE(IRE)。“IIs型限制性内切核酸酶”是在其识别序列之外裂解的II型限制性内切核酸酶。示例性的TSRE包括，但不局限于Fok I、BsgI和Bpm I。“中断的限制性内切核酸酶”是识别中断的限制性内切核酸酶识别序列(IRERS)的II型限制性内切核酸酶。IRERS定义为由“第一个不变识别序列(CRS)”、“第二个CRS”和连接第一个和第二个CRS的“可变识别序列(VRS)”组成的限制性内切核酸酶识别序列(图4)。IRER的所有这三个成分均是双链的。根据本发明，“第一个CRS”定义为含有在一侧直接邻接于IRERS的VRE的IRERS不变(不可变化的)核苷酸的IRERS区域，其中“第二个CRS”定义为含有在另一侧直接邻接于IRERS的VRE的IRERS不变(不可变化的)核苷酸的IRERS区域。根据本发明，“VRE”定义为位于第一个和第二个CRS之间的一个或多个可变核苷酸的区段。示例性的IRE包括，但不局限于Bsl I、EcoN I、Dra III和Dde I。
用于本发明的RE可购自各个公司，如New England Biolabs Inc.(Beverly，MA；www.neb.com)；Stratagene(La Jolla，CA；www.stratagene.com)，Promega(Madison，WI，www.promega.com)和Clontech(Palo Alto，CA；www.clontech.com)。非商业可购的限制性酶可基于本领域中可用的指导进行分离和/或纯化。例如，下面的文章描述了几个适合于本发明的非商业可购的限制性酶的分离和/或纯化方法，并在此处整体引入作为参考：对于限制性酶ApaB I，Grones和Turna，Biochim.Biophys.Acta 1162：323-325(1993)，Grones和Turna，Biologia(Bratisl)46：1103-1108(1991)；对于EcoH I，Glatman等人，Mol.Gen.Mikrobiol.Virusol.3：32(1990)；对于Fmu I，Rebentish等人Biotekhnologiya 3：15-16(1994)；对于HpyB II，FEMS Microbiol.Lett.179：175-180(1999)；对于Sse8647 I，Nomura等人，欧洲专利申请No.0698663A1，Ishino等人，Nucleic Acids Res.23：742-744(1995)；对于Unb I，Kawalec等人，Acta Biochim.Pol.44：849-852(1997)；对于VpaK11A I，Miyahara等人J.Food.Hyg.Sci.Japan 35：605-609(1994)。
对根据本发明使用的限制性内切核酸酶的贮存和使用条件的描述在本领域中是易于获得的，且发现于如实验室手册中，如Sambrook等人，见上文和Ausubel等人，见上文。简言之，可加入到反应中的RE的单位数量可根据核酸底物的变化的裂解速率进行计算和调节。1单位的限制性内切核酸酶在50μl反应物中于60分钟内将消化1μg底物核酸。通常，片段(如扩增子)要切割完全需要超过1单位/μg。限制性酶的缓冲液在反应中一般以1X浓度使用。一些限制性内切核酸酶需要牛血清白蛋白(BSA)(通常以100μg/ml的终浓度使用以获得最适活性)。如果在反应中存在BSA，那么那些最适活性不需要牛血清白蛋白(BSA)的限制性内切核酸酶不受不良影响。
大多数限制性内切核酸酶当在推荐的贮存缓冲液中贮存于-20℃时是稳定的。只要可能应该使向超过-20℃的暴露减到最少。当没有贮存于冰箱中时，所有限制性内切核酸酶应该保存于冰上。酶永远应该是最后加入到反应中的成分。
对于大多数限制性内切核酸酶推荐的温育温度为约37℃。从嗜热细菌分离的限制性内切核酸酶需要较高的温育温度，一般在50℃～65℃。如果向反应中加入了过量的限制性内切核酸酶，那么温育时间常可缩短。较长的温育时间常用于以较少的限制性内切核酸酶单位使反应进行完全。
当同时使用两个RE时，包括温育时间和反应缓冲液的反应条件需要最适化以同时适合两个酶。然而，如果没有同时适合于两个不同的RE的消化条件，一个RE的消化可在另一个RE的消化之前进行。在双消化是用NE和RE实施的情况下，从用本发明的引物对（如第四个ODNP对)获得的延伸/扩增产物中所得的产物是双链寡核苷酸和单链寡核苷酸(参见如图3)。
c. 单链核酸的扩增
根据本发明，将包含NARS、NS和NS的3’的遗传变异的模板核酸用作模板以扩增包含遗传变异或其互补链的单链核酸。扩增是通过重复切割模板然后从切割位点延伸而复制模板进行的。因而，将模板核酸首先用识别模板的NARS的NA进行切割以产生在NS的3’末端。然后将具有链置换能力但缺失5’→3’外切核酸酶活性的DNA聚合酶用于从NS的3’末端延伸切割的模板，因而置换下游的单链核酸。该延伸产生了NA的新切割位点。切割-延伸过程的重复进行扩增了在由NA产生的NS具有5’末端的单链核酸。因为遗传变异位于模板中NS的3’，所以遗传变异整合入扩增的单链核酸中。因而，随后对扩增的单链核酸的表征使得能够鉴定源自目标核酸的遗传变异。
在本发明的某些实施方案中，如模板核酸包含NERS有义链的序列和RERS一条链的序列两者(参见如图1)时，在用识别RERS的RE消化后对模板核酸的切割产生了短的核酸片段，该核酸片段易于从模板核酸的剩余部分解离。在这些实施方案中，不具有链置换能力和/或不是5’→3’外切核酸酶缺失的DNA聚合酶可用于扩增短的单链核酸片段。当模板核酸含有两个NARS(如两个NERS或两个未修饰的RERS或一个NERS和一个半修饰的RERS)时也可使用这种DNA聚合酶，其中该两个NARS相互足够靠近从而(1)识别两个NARS的NA对模板核酸的初始切割产生了两个部分双链的核酸片段，该核酸片段在切割反应条件下可相互解离，和(2)随后对切割的模板核酸的延伸产物进行的切割产生了易于从延伸产物其他部分解离的短核酸片段(参见如图2和5)。在扩增单链核酸片段不需要DNA聚合酶的链置换活性的这些实施方案中，扩增是用消化或切割的模板核酸的单链部分作为模板进行的，这与传统链置换扩增是不同的，在传统的链置换扩增中扩增单链核酸片段的模板是双链。
i. 模板核酸的切割
本发明的模板核酸可用识别模板核酸中切割剂识别序列(NARS)的任何切割剂进行切割。优选地，切割剂是识别特定的双链核酸序列且仅在核酸的一条链进行切割的酶。这种酶可为识别由天然核苷酸组成的特定序列的切割性内切核酸酶或识别半修饰的识别序列的限制性内切核酸酶。
切割性内切核酸酶可具有或不具有与其识别序列重叠的切割位点。在其识别序列之外进行切割的示例性NE是N.BstNB I，它识别包含5’-GAGTC-3’的唯一核酸序列，但在识别序列的3’末端之外4个核苷酸处进行切割。N.BstNB I的识别序列和切割位点如下所示，“”表示切割位点，而字母N代表任何核苷酸：
            
5′-GAGTCNNNNN-3′
3′-CTCAGNNNNN-5′
N.BstNB I可如描述于U.S.Pat.No.6,191,267中的方法进行制备和分离。使用该切割性内切核酸酶的缓冲液和条件也描述于’267专利中。在其识别序列之外进行切割的额外的示例性NE是N.Alw I，它识别下面的双链识别序列：
            
5′-GGATCNNNNN-3′
3′-CCTAGNNNNN-5′
N.Alw I的切割位点也以符号“”表示。这两个NE均可购自NewEngland Biolabs(NEB)。N.Alw I也可通过使IIs型RE即Alw I突变而制备，如Xu等人(Proc.Natl.Acad.sci.USA 98：12990-5，2001)所描述的。
在其NERS中进行切割的示例性NE包括N.BbvC I-a和N.BbvC I-b。两个NE的识别序列和NS(用符号“”表示)如下所示：
N.BbvCI-a
                 
            5′-CCTCAGC-3′
            3′-GGAGTCG-5′
N.BbvCI-b
                 
            5′-GCTGAGG-3′
            3′-CGACTCC-5′
两个NE均可购自NEB。
额外的示例性切割性内切核酸酶(非限制地)包括N.BstSE I(Abdurashitov等人，Mol.Biol.(Mosk)30：1261-7，1996)、加工过的EcoR V(Stahl等人，Proc.Natl.Acad.sci.USA 93：6175-80，1996)、加工过的Fok I(Kim等人，Gene 203：43-49，1997)、来自海栖热袍菌(Thermotoga maritima)的内切核酸酶V(Huang等人，Biochem.40：8738-48，2001)、Cvi切口酶(如CviNY2A、CviNYSI、Megabase Research Products，Lincoln，Nebraska)(Zhang等人，Virology 240：366-75，1998；Nelson等人，Biol.Chem.379：423-8，1998；Xia等人，Nucleic Acids Res.16：9477-87，1988)和加工过的Mly I(即N.Mly I)(Besnier和Kong，EMBO Reports2：782-6，2001)。额外的NE可通过用与那些加工EcoR V、Alw I、Fok I和/或Mly I的相似的方法对其他限制性内切核酸酶(尤其是IIs型限制性内切核酸酶)进行加工而获得。
对本发明模板核酸的切割可用任何在其半修饰的识别序列切割双链核酸的限制性内切核酸酶来进行。“半修饰的识别序列”是RE的双链识别序列，在其中识别序列的一条链含有至少一个衍生的核苷酸(如α-硫代脱氧核苷酸)，这阻止了限制性内切核酸酶对一条链(即含有衍生的核苷酸的链或不含有衍生的核苷酸的另一条链)的切割。切割其半修饰的双链识别序列的示例性RE包括，但不局限于Ava I、BstI、BsmA I、BsoB I、Bsr I、BstN I、BstO I、Fnu4H I、HincII、Hind II和Nci I。切割半修饰的识别序列的额外的RE可通过描述于美国专利No.5,631,147中的链保护测定法进行筛选，该专利在此处整体引入作为参考。简言之，合成了单链模板，该单链模板包含限制性内切核酸酶/裂解位点和与除识别/裂解位点之外的模板部分互补的引物。然后将该模板和引物标记，如放射性标记。使引物和模板退火，且通过引物的延伸整合了修饰的dNTP，结果生成含有半修饰的限制性内切核酸酶识别/裂解位点的完全双链分子。然后使该分子与限制性内切核酸酶在适合于双链裂解的条件下组合。然后通过变性电泳分析消化产物以通过生成的片段大小确定识别/裂解位点是切割的、裂解的还是未切开的。消化产物的大小也用于确定识别/裂解位点的两条链的哪一条(即修饰的或未修饰的)被保护免受裂解。
切割半修饰的限制性内切核酸酶识别序列的RE可购自各个公司，如 New England Biolabs Inc.(Beverly，MA；www.neb.com)；Stratagene(La Jolla，CA；www.stratagene.com)，Promega(Madison，WI：www.promega.com)和Clontech(Palo Alto，CA；www.clontech.com)。非商业购得的限制性酶可基于本领域中可用的指导进行分离和/或纯化。使用限制性内切核酸酶切割模板核酸的条件可以与那些裂解双链核酸的相同或不同。这些条件可用本领域的常规技术对RE的切割活性进行最适化(参见如Walker，PCR Methods Appl.3：1-6，1993，在此处整体引入作为参考)。
在某些实施方案中，切割剂可识别DNA-RNA双链体中的核苷酸序列并在双链体中的一条链上进行切割。在某些其他的实施方案中，切割剂可识别双链RNA中的核苷酸序列并在RNA的一条链上进行切割。
ii. 延伸
对模板核酸的切割产生了切割位点的3’末端，从该末端可用未切割的链作为模板在DNA聚合酶存在时进行延伸。当DNA聚合酶缺乏5’→3’外切核酸酶活性但具有链置换活性时，切割的模板核酸在切割位点延伸置换了下游的单链核酸片段。这种置换使得能够累积并因而扩增单链核酸片段。
任何5’→3’外切核酸酶缺陷的但具有链置换活性的DNA聚合酶可用于从切割的模板核酸延伸并随后在切割剂持续存在时扩增单链核酸。这种DNA聚合酶包括，但不局限于exo-Deep Vent、exo-Bst、exo-Pfu和exo-Bca。用于本发明的额外的DNA聚合酶可用描述于美国专利No.5,631,147的方法筛选或产生，该专利在此处整体引入作为参考。简言之，聚合酶筛选系统是检验聚合酶置换起始于双链模板中切割位点下游的链的能力的延伸测定法。它也检验5’→3’外切核酸酶活性的存在与否。5’→3’外切核酸酶活性可通过本领域公知的常规方法而失活(如PCT公布的专利申请WO 92/06200)。使聚合酶的外切核酸酶活性失活的一个途径是克隆聚合酶的基因，鉴定编码负责外切核酸酶活性的蛋白质结构域的基因部分，然后通过体外诱变使其失活。可选择地，外切核酸酶活性可通过用蛋白酶处理聚合酶并其后分离仅显示想要的聚合作用和置换活性的片段而失活。DNA聚合酶的链置换活性可进一步由如下文所述的链置换促进剂的存在而加强。
“链置换促进剂”是在由DNA聚合酶催化的在切割位点3’的核酸延伸中促进链置换的任何化合物或组合物。用于本发明的链置换促进剂包括，但不局限于BMRF1聚合酶副亚基(Tsurumi等人，J.Virology67：7648-53，1993)、腺病毒DNA-结合蛋白质(Zijderveld和van derVliet，J.Virology 68：1158-64，1994)、单纯疱疹病毒蛋白ICP8(Boehmer和Lehman，J.Virology 67：711-5，1993；Skaliter和Lehman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：10665-9，1994)、单链DNA结合蛋白质(Rigler和Romano，J.Biol.Chem.270：8910-9，1995)、噬菌体T4基因32蛋白质(Villemain和Giedroc，Biochemistry35：14395-4404，1996)、小牛胸腺螺旋酶(Siegel等人，J.Biol.Chem.267：13629-35，1992)和海藻糖。
此外，如上所述，在某些实施方案中也可使用不具有链置换活性和/或非5’→3’外切核酸酶缺陷的DNA聚合酶，在这些方案中由切割剂对模板核酸或其消化产物的切割或对切割的模板核酸的延伸产物的再次切割产生了短单链核酸片段，并且该单链核酸片段易于从模板核酸的剩余部分解离。不具有链置换活性的DNA聚合酶包括，但不局限于exo-Vent、Taq、DNA聚合酶I的Klenow片段、T5 DNA聚合酶和Phi29 DNA聚合酶。
该短的单链核酸片段可含有如最多2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个核苷酸。随着这种核酸片段长度的增加，这些片段与其模板核酸的相应互补链之间通过氢键的相互作用可变得足够强，从而它们不能从其互补链中解离。在这种情况下，单链核酸片段的扩增需要具有链置换能力的DNA聚合酶、链置换促进剂的存在或两者。能够易于从模板核酸的其他部分解离的扩增单链核酸片段的最大长度也依赖于切割-延伸反应条件。例如，在相对高的切割-延伸反应温度(如55℃)下扩增的易于从其互补链解离的单链核酸片段的最大长度比那些在相对低的反应温度(如37℃或22℃)下扩增的要大。
用于本发明的额外的示例性DNA聚合酶包括，但不局限于噬菌体M2 DNA聚合酶(Matsumoto等人，Gene 84：247，1989)、噬菌体phiPRD1DNA聚合酶(Jung等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：8287，1987)、T5 DNA聚合酶(Chatterjee等人，Gene 97：13-19，1991)、测序酶(U.S.Biochemicals)、PRD1 DNA聚合酶(Zhu和Ito，Biochim.Biophys.Acta.1219：267-76，1994)、9°NmTM DNA聚合酶(NewEngland Biolabs)(Southworth等人，Proc.Natl.Acad.sci.93：5281-5，1996；Rodriquez等人，J.Mol.Biol.302：447-62，2000)和T4 DNA聚合酶全酶(Kaboord和Benkovic，Curr.Biol.5：149-57，1995)。
在其中切割剂在RNA-DNA双链体中的DNA链进行切割的某些实施方案中，可使用RNA-依赖性DNA聚合酶。在其中切割剂在RNA-DNA双链体中的RNA链进行切割的某些实施方案中，可使用从DNA引物延伸的DNA-依赖性DNA聚合酶，如禽类成髓细胞瘤病毒(avianmyeloblastosis virus)反转录酶(Promega)。在两种情况下，目标mRNA不必反转录为cDNA，而可直接与至少基本与目标mRNA互补的模板核酸分子混合。
iii. 单链核酸的扩增
由DNA聚合酶对切割的核酸从切割位点3’末端的延伸产生了新的切割位点。该新的切割位点可由切割剂再次切割并在DNA聚合酶存在时再次延伸。这种切割-延伸过程可重复多次，结果导致切割位点下游的单链核酸片段的扩增。
优选地，在切割/延伸反应混合物中存在切割剂(如NE或RE)和DNA聚合酶两者，且混合物已最适化而适合于切割剂和DNA聚合酶两者。例如，如果N.BstNB I是切割剂而exo-Vent是DNA聚合酶，则切割-延伸缓冲液可为0.5X的N.BstNB I缓冲液和1X的DNA聚合酶缓冲液。示例性的1X N.BstNB I缓冲液可为10mM Tris-HCl、10mMMgCl2、150mM KCl和1mM二硫苏糖醇(25℃时pH 7.5)。示例性的1X DNA聚合酶缓冲液可为10mM KCl、20mM Tris-HCl(25℃时pH 8.8)、10mM(NH4)2SO4、2mM MgSO4和0.1％Triton X-100。
同样优选地，本发明的切割和延伸反应是在等温条件下进行的。如在此处所用的，“等温的”和“等温条件”指一套反应条件，其中在扩增过程中反应的温度基本保持恒定(即在相同温度或在相同的狭窄温度范围内，其中高温和低温之间的差异不超过20℃)。本发明扩增方法的一个优点是不必在高温和低温间循环温度。切割和延伸反应两者均可在相同温度或在相同的狭窄温度范围内工作。如果用于维持温度的设备使得反应混合物的温度能够稍微改变几度，那么这种波动对于扩增反应不是有害的。等温扩增的示例性温度包括，但不局限于50℃～70℃之间的任何温度(即51、52、53...69)或50℃～70℃、55℃～70℃、60℃～70℃、65℃～70℃、50℃～55℃、50℃～60℃、50℃～65℃之间的温度范围。许多NA和DNA聚合酶在上述示例性温度或在上述示例性温度范围内是有活性的。例如，使用N.BstNB I(NewEngland Biolabs)的切割反应和使用exo-Bst聚合酶(BioRad)的延伸反应两者均可在约55℃进行。在约50℃～70℃之间有活性的其他聚合酶包括，但不局限于exo-Vent(New England Biolabs)、exo-DeepVent(New England Biolabs)、exo-Pfu(Strategene)、exo-Bca(Panvera)和测序级的Taq(Promega)。
如上所述，在某些优选实施方案中，在用于合成模板核酸的ODNP对的两个成员中存在NARS的同一条链的序列。在这些实施方案中，在识别NARS的NA和DNA聚合酶存在时扩增了两个互补的单链核酸片段。用在下面详细描述的方法对两个扩增核酸片段的探测增加了本方法的可靠性和/或准确性。
如上所述，在某些实施方案中，在不存在DNA聚合酶的任何链置换活性或链置换促进剂时，扩增的单链核酸可相对较短且易于从模板核酸的其他部分解离。扩增的单链分子的较短长度可为有利的，这是因为这增加了扩增效率和速率。此外，这使得能够使用不具有链置换活性或不是5’→3’外切核酸酶缺陷的DNA聚合酶。这也促进了通过某些技术如质谱分析对A1分子的探测，其中A1用作起始扩增的引物。
在不存在链置换活性或链置换促进剂时扩增的单链核酸的解离可在如下条件下进行，其中在扩增的单链核酸及其互补链之间形成的双链体的熔解温度(Tm)低于在切割位点包含3’末端的切割产物与其互补链之间形成的双链体的熔解温度，且扩增是在上述两个熔解温度之间进行的。熔解温度的计算是本领域中公知的。对于本发明，核酸双链体的熔解温度是由Baldino等人，Methods Enzymol.168：761-777，1989的方法计算的。
本发明也提供了多重确定目标核酸限定位置上的遗传变异的方法。在这种应用中，多个模板核酸可一起组合在切割-延伸反应中。该组合减少了与用于反应的试剂、切割剂和DNA聚合酶相关的花费。这也增加了随后对扩增的单链核酸分子的探测/表征测定法的通量。
d. 表征扩增的单链核酸片段的方法学
如上所述，本发明提供了扩增含有源自模板核酸的遗传变并的单链核酸片段的方法学。随后对扩增的单链核酸片段的表征使得人们能够确定目标核酸中遗传变异的特性。因而，本发明将遗传变异的信息从相对大的目标核酸转移到相对小的核酸片段中。该转移促进了对遗传变异的表征，这是因为对小核酸片段的直接和完全的表征常常比对大核酸目标的表征更可行。
根据本发明，对核酸片段(即扩增的单链核酸)的表征可直接进行，即不需要向片段整合标签或标记。可选择地，在一些实施方案中，利用一种或多种可探测的标记是有利的。两种表征方法均在下文更详细地描述。此外，如在下文中对于表征目标核酸的方法详细描述的用于表征核酸片段的技术也可用于探测遗传变异的方法中。
i. 直接表征
本发明将目标核苷酸(即遗传变异)的信息从相对大的目标核酸转移到相对小的单链核酸片段中。在许多情况下，对小片段的直接表征可提供有关目标核苷酸的信息，特别是目标核苷酸的特性。例如，小的核酸片段可通过各种质谱分析方法学(如在下文描述的)以及紫外线(UV)吸收进行直接探测。
在根据本发明的许多情况下，对于短的核酸片段，除单个核苷酸之外的完整核苷酸序列即使在其形成前也是已知的。问题则变为在同时探测短的核酸片段时产生的“噪音”中对目标核苷酸进行探测。然而，如果其他核苷酸的特性是已知的，且在探测方法中它们的信号是已知的，那么可将该信号从片段的全部信号中减去以剩下有关目标核苷酸的信息。该方法基本采用于质谱分析法中以表征小核酸片段。如在此处更详细描述的其他适当的方法包括确定小核酸片段的质荷比(mass-to-charge ratio)、测量片段的荧光偏振和/或定量片段的紫外线(UV)吸收。
在一些情况下，表征小的核酸片段需要简单地确定单链片段的大小，且技术人员从该信息可推断目标核酸在限定核苷酸座位含有一个还是多个突变。显而易见的是单链片段的大小可通过本领域中易于获得的许多方法来确定。在此处公开的测量单链核酸片段的大小和/或分子量的示例性方法包括，但不局限于荧光(包括荧光偏振(FP))、质谱分析法(MS)、紫外线(UV)吸收、可切割的质量标签(cleavablemass tags)、Taqman(同源的)、荧光共振能量转移(FRET)、比色法、采用辣根过氧化物酶(HRP)和/或碱性磷酸酶(AP)底物的发光和/或荧光方法以及采用放射性的方法。
在本发明的某些实施方案中，质谱分析法(MS)用于表征核酸片段，优选地为短的核酸片段，该片段包含来自目标核酸的目标核苷酸座位。MS在那些想要在探测前省去分级分离步骤的应用中是特别有利的。可选择地，如在下文描述的，MS也可与分级分离方法一起应用，如一种液相层析方法学，包括HPLC和DHPLC。一般地，MS探测不需要向小核酸片段添加标签或标记。相反，核酸片段可直接在质谱仪上充分鉴定和/或表征。
如在此处公开的，MS可特别适合于探测小到1个核苷酸到大到几百个核苷酸的小核酸片段。更优选地，MS可用于鉴定和/或表征1～50个核苷酸的片段，更优选地为1～17个核苷酸的片段。
灵敏度可达到至少1道尔顿。核酸碱基中最小的质量差异为腺嘌呤和胸腺嘧啶之间的，为9道尔顿。
特别优选的MS方法学采用液相层析-飞行时间质谱分析法(Liquidchromatography-Time-of-Flight Mass Spectrometry)(LC-TOF-MS)。LC-TOF-MS包含用于气压流电离(API)分析的直角加速飞行时间(TOF)MS探测器，该气压流电离(API)分析使用电喷射(ES)或气压流化学电离(APCI)。LC-TOF-MS与扫描四极仪器(scanning quadrupoleinstruments)相比提供了高的质量分辨率(5000FWHM)、高的质量测量准确性(在5ppm之内)和非常好的灵敏性(能够探测皮摩尔量的DNA多聚体)。TOF仪器通常比四极更灵敏，但也是更昂贵的。在一个实施方案中，在对片段进行MS分析之前可使用固相提取(SPE)法代替LC以纯化核酸片段。
LC-TOF-MS具有非常有效的责任周期(duty cycle)，这是因为现有仪器依次一次分析一个质量而拒绝所有其他的(这称为单离子监控(SIM))。LC-TOF-MS可同时对所有进入TOF分析仪的离子进行取样和检查。这导致更高的灵敏性并提供了灵敏性改善10～100倍的定量数据。增强的分辨率(5000FWHM)和好于5ppm的质量测量准确性提示核苷酸之间小到9amu(道尔顿)的差异可准确进行测量。TOF质量分析仪在整个目标质量范围内同时对所有离子进行高频率的取样(10谱/秒)。LC-TOF-MS的责任周期使得高灵敏谱能够被快速连续地记录，使得该仪器与高效分离技术兼容，如窄孔LC、毛细管层析和毛细管电色谱(CEC)。使离子脉冲到分析仪上，该分析仪有效地给在任何时间存在的离子拍取“快照”。
在ES或APCI的第一个阶段，使气溶胶喷雾垂直地经过样品锥体，该样品锥体从仪器的中心轴移置。离子从喷雾中被直角地吸取至样品锥体中，从而使大的液滴、非挥发性的材料、颗粒和其他不想要的成分收集于用可更换的衬垫保护的出口中。第二个直角步骤使得与常规的API来源相比从大气中取样的气体(和离子)体积增加。大气压的气体是通过孔取样而进入部分真空的，并形成自由扩张的喷射(iet)，这代表与周围的真空相比高效的区域。当该喷射进入常规API界面的第二个孔时，它增加了通过第二个孔的气流。因此在MS-TOF中维持适当的真空对这种LC界面上的孔最大直径设置了限制。离子团的部分真空中的离子是静电地吸取到六极离子桥(hexapole ion bridge)中的，该六极离子桥可有效地将离子转运到分析仪中。
在一方面，TOF质量分析仪是与MUX-技术偶联的，以使得在单个LC-TOF-MS中能够平行连接多达8个HPLC柱。(Micromass，Manchester英国)。多重电喷射(ESI)界面可用于即时的LC-MS，该即时的LC-MS利用附加的级动马达(indexed stepper motor)来连续从多达8个HPLC柱或平行操作的液体入口取样。
LC-TOF-MS的使用通常优于MALDI-TOF的使用，这是因为LC-TOF-MS是分析多聚物分子量的定量方法。LC-TOF-MS不使多聚物成为片段，且它采用与基质辅助的激光解吸电离(MALDI)相比更温和的电离过程。因为每一个MALDI冲击是不同的，所以电离不是定量的。然而，LC-TOF-MS对于多聚物产生了不同的m/z值，但如在实施例1和图7-17中公开的，该性质提供了减少背景及提供补充信息的额外优点。
在一方面，将串联MS或MS/MS用于对分子离子或片段的结构确定。在串联MS中，目标离子在第一个分析仪(MS-1)中选择，在碰撞室中用惰性气体原子碰撞，然后碰撞形成的片段用第二个分析仪(MS-2)分离。在离子捕获和傅立叶变换实验中，分析是在一个分析仪中进行的，且各个事件是在时间上分离而不是在空间上分离的。该信息可用于对多肽和小DNA和RNA寡聚物测序。
在一方面，将有时称为“高分辨率测量”的精确质量测量法用于确定样品分子离子或离子片段的元素组成。该方法的基础是每一种元素具有唯一的质量亏损(偏离于整数质量)。该测量是通过用内部校准(在EI或CI模式中)的扫描或通过峰值匹配(在FAB模式中)来进行的。元素组成是通过比较许多可能组分的质量与测得的质量而确定的。该方法对于具有高达800Da的片段是非常可靠的。在较高质量时，需要较高的精度和/或关于预期组成的知识以明确确定元素组成。
电子电离(EI)广泛用于对相对挥发性的样品的质谱分析法中，该样品对热不敏感且具有相对低的分子量。通常含有许多片段一离子峰的质谱可用于结构表征和鉴定。样品中小的杂质易于探测。化学电离(CI)应用于类似的样品；它用于增强分子离子的丰度。对于两种电离方法，分子量范围是50-800Da，因而当片段在所述的范围内时根据本发明可使用这些电离方法中的任何一个。在少数情况下，可能分析高分子量的样品。在较低的分辨能力时质量测量的准确性是±0.1道尔顿，而在高分辨模式时是±5ppm。
快速原子轰击电离法(FAB，或有时称为液体二级电离MS，LSIMS)是比EI温和的电离方法。该光谱常含有电离所必需的基质的峰、少数片段的峰和质子化的或去质子化的样品分子的峰。FAB用于获得敏感的非挥发性化合物的分子量。该方法易于受小杂质的抑制作用。分子量范围为100～4000Da。精确的质量测量通常是通过峰值匹配实现的。质量的准确性与在EI、CI中获得的相同，因而这是用于表征用此处描述的方法制备的片段的另一个适当的电离方法。
基质辅助激光解吸(MALDI)已用于确定肽、蛋白质、寡核苷酸和其他生物来源的化合物以及小的合成多聚物的分子量。所需的样品的量是非常低的(皮摩尔或更少)。分析可在线性模式(高质量、低分辨率)中在高达m/z为300,000的分子量(少数情况中)中进行或在反射(reflectron)模式(低质量、高分辨率)中在高达10,000的分子量中进行。该分析对污染是相对不敏感的，因此当表征包括MS时通常不需要纯化步骤作为表征过程的一部分。然而，在某些实施方案中，在将单链核酸片段进行MALDI之前，LC或SPE可用于分离或纯化这些片段。常规MALDI的质量准确性(0.1～0.01％)不象其他质谱分析法的那样高。然而，最近延迟抽取TOF(Delayed Extraction TOF)中的进展使得能够有更高的分辨能力和质量准确性。因而，MALDI用于本发明的一个方面。此外，在扩增的单链核酸分子首先通过液相层析纯化或分离的实施方案中，MALDI使得能够在质谱分析之前汇集液相层析的多个级分，从而确保了高通量。
电喷射电离(ESI)使得能够直接从溶液中的样品中产生分子离子。它可用于小的和大的分子量的生物多聚物(肽、蛋白质、糖类和DNA片段)和脂质。与脉冲性的MALDI不同，ESI是可以与HPLC或毛细管电泳接合的连续电离方法。通常产生带多电荷的离子。ESI可认为是对MALDI的补充，且可根据本发明而使用。样品必须是可溶的、在溶液中稳定的、极性的和相对干净的(不含非挥发性的缓冲液、去污剂、盐等)。
电子捕获(有时称为阴离子化学电离或NICI)用于含有卤素、NO2、CN等的分子，且通常需要对分析物进行衍生化以使其含有高的电子捕获半分子(如氟原子或硝基苯甲基基团)。这种半分子在分离后且在质谱分析之前通常插入到目标分析物中。NICI分析的灵敏性通常比PCI或EI分析高2～3个数量级。在NICI中几乎不发生片段化。因此当核酸片段具有所需的化学或原子基团或当这种基团如下所述加入到片段中时可应用电子捕获法。
各种质量分析仪可用于分析已电离的样品。这种分析仪包括飞行时间、四极、磁性扇区(magnetic sector)和离子捕获质量分析仪。对于各种类型电离方法和质量分析仪的一般描述，参见Siuzdak，MassSpectrometry for Biotechnology，Academic Press，1996。
ii. 间接表征
在本发明的一些实施方案中，向短的单链核酸片段或其反应产物(如短的核酸片段的部分或完整互补链)中添加一种或多种可探测的标记是有利的。这种标记可促进对片段的表征并借此鉴定片段中的目标核苷酸和/或遗传变异。
表1和2分别总结了示例性的标记和探测器，该标记和探测器通常适用于探测小核酸片段的方法中且可用于探测由在此处描述的方法产生的核酸片段。
                             表1
            适用于探测小核酸片段的方法学中的标记
记技术   属性
荧光团FRET荧光猝灭时间分辨荧光(Time-resolved fluorescene)胶体金质量标签(CMSTs)质量标签(Electrophore)放射性标记化学发光比色法测定产物＝“标签”   多色的、重叠的发射光谱、不昂贵的探测器高灵敏性测定形式均一低背景好的灵敏性高水平的多元性高水平的多元性优异的灵敏性优异的灵敏性不昂贵的准确的、不昂贵的、直接的
                        表2
      适用于探测小核酸片段的方法中的探测器
指示物     属性
胶卷闪烁计数器荧光板阅读器荧光偏振时间分辨荧光PCR的荧光监控ABI-377毛细管仪器化学发光板阅读器CCD四极MSGC/MSMaldi-TOF平板阅读器(比色测定)细胞分选仪光学显微镜(共聚焦)电子显微镜Amphoteric deviceDHPLC(HPLC/UV)HPLC/荧光文本扫描仪UV盒(用于染色)     不昂贵的可靠的、灵敏的可靠的、不昂贵的、灵敏的、多色的允许均一的测定形式，一些仪器非常灵敏低背景、灵敏的在PCR过程中的有用信息可靠的高通量的、昂贵的可靠的、灵敏的通用的、灵敏的广谱的、定量的广谱的、非定量的可靠的、不昂贵的、灵敏的高通量的优异的灵敏性灵敏性多元性的能力可靠的、相对不昂贵的可靠的、灵敏的、相对不昂贵的非常不昂贵的、进行你自己的测定非常不昂贵的
这些标签和标记的探测器可以以普通的和非普通的仪器购得。普通的仪器是通常阅读96-孔或384-孔形式微量平板的平板阅读器，且能够识别多个颜色(4-6个荧光标签)。这些仪器可以以定制的型号存在，以进行更专业的测量如时间分辨荧光(TFR)或荧光偏振。PAGE测序和成束的毛细管仪器的探测器是高度专业的和非普通的。普通的质谱仪MALDI-TOF、电喷射-TOF和APCI-四极(及其组合，包括离子捕获仪器)是具有通用性的明确规划的(opened-ended)仪器。对组合化学应用已开发了适当的软件包，且该软件包易于应用于在此处描述的片段的探测中。闪烁计数器是专用的，这是因为它们需要与放射性同位素一起使用，但可用于广泛的测定形式。
下面描述了示例性的间接表征方法。然而，本发明不受这些例子的限制。本领域中公知的任何适用于表征小核酸片段并借此确定限定位置的核苷酸的特性的方法均可用于本发明中。
(a)测序
在本发明的一个方面，单链核酸片段是通过进行完整核苷酸分析而表征的。本领域中公知有许多技术用于鉴定核酸片段中的每一个碱基从而获得碱基序列信息。例如，两个在1977年发展的且除其他名称之外普遍称为“桑格测序法”和“化学测序法”的不同DNA测序法现在仍然广泛应用并是本领域技术人员众所周知的。参见如Sanger，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)74：5463，1977，和Maxam和Gilbert，Proc.Natl.Acad.sci.(USA)74：560，1977。两种方法产生了较短片段的群体，该片段从特定点开始而终止于在要测序的核酸片段中发现的每一个碱基处。较短的核酸片段通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，且DNA碱基的顺序(分别为腺嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、鸟嘌呤；也称为A、C、T、G)可从凝胶的放射自显影中读出。这些方法通常对于相对长的单链核酸片段是成功的。
也可使用自动DNA测序方法。这种方法在对长和短的核酸分子的测序中具有广泛的商业应用。在一个方法中，这些方法使用荧光标记的引物或ddNTP-终止物来代替放射性标记的成分。自动化成分可利用已导致线性扩增策略的发展的聚合酶链反应(PCR)技术。目前的商业测序使得所有4个双脱氧终止物反应均在一个泳道上进行。每一个双脱氧终止物反应由唯一的荧光引物代表(每一个碱基类型用一种荧光团：A、T、C、G)。每一个泳道仅代表一个模板DNA(即DNA样品)。目前的凝胶允许同时在64个不同的泳道上电泳多达64个样品。不同的ddNTP-终止的片段是通过用光照射凝胶泳道和随后探测从荧光团发出的光而探测的。每一个电泳步骤为约4-6小时长。每一个电泳分离可分辨多达约400-600个核苷酸，因此，每个测序仪每小时可测序约6000nt。
Gilbert描述了一种由寡聚物合成仪、膜上的阵列、探测杂交的探测仪和中央计算机组成的自动DNA测序仪(EPA，92108678.2)。该合成仪合成并标记多个具有随意预测序列的寡聚物。该寡聚物用于探测膜上固定的DNA。探测仪鉴定了杂交模式，然后将这些模式输入计算机，该计算机构建一个序列然后预测下一轮寡聚物合成物的序列。通过迭代的过程，可在自动的模式中获得DNA序列。该方法可用于表征根据本发明的短的核酸片段(双链或单链，更常见的为单链)。
也已描述了用于研究核酸的单体组成的质谱分析法的应用(Hignite，“Biochemical Applications of Mass Spectrometry”，Walker和Dermer(eds.)，Wiley-Interscience，16章，527页，1972)。简言之，对于较大的寡聚物，早期的显著成功是通过对多达14个碱基长的保护的合成寡核苷酸和对多达4个碱基长的未保护的寡核苷酸的等离子体解吸获得的。如同对于蛋白质的，已证明了ESI-MS对寡核苷酸的应用性(Covey等人，Rapid Comm.in Mass Spec.2：249-256，1988)。这些种类在溶液中是电离的，其电荷位于酸性的桥接磷酸二酯键上和/或末端磷酸半分子中，并在气相时除钠加合物之外获得了多个带电荷的分子阴离子。这些表征核酸的方法可根据本发明来使用。
用普通的酶促ddNTP技术对少于100个碱基的核酸的测序比对较长的核酸模板更复杂，从而有时采用化学降解法。然而，化学降解法需要约50pmol放射性32P末端标记的材料、6个化学步骤、电泳分离和胶卷暴光。对于小的寡核苷酸(＜14nt)，例如需要根据本发明进行表征的，电喷射电离(ESI)和傅立叶变换(FT)质谱分析法(MS)的组合是更快和更加灵敏的，且是本发明优选的方法。在高(105)分辨能力测量的带多个电荷的离子的解离产物代表了连续的对主链的裂解，从而在少于一分钟内对低于皮摩尔量的样品提供了全长序列(Little等人，J.Am.Chem.Soc.116：4893，1994)。对于分子量测量，ESI/MS已应用于较大的片段上(Potier等人，Nuc.Acids Res.22：3895，1994)。ESI/FTMS是对长达100-聚体的核苷酸进行测序并查明其中的突变的经典方法的有价值的补充。最近光谱数据已用更灵敏的ESI来源加载3 x 10-13mol的50-聚体而获得(Valaskovic，Anal.Chem.68：259，1995)。
其他获得核酸分子的完整或接近完整的碱基序列信息的方法描述于下面的参考文献中：Brennen等人(Biol.Mass Spec.，New York，Elsevier，p.219，1990)；美国专利No.5,403,708；PCT专利申请No.PCT/US94/02938；和PCT专利申请No.PCT/US94/11918。这些表征技术的每一个均可用于表征在此处所述产生的单链核酸片段。
(b)流体处理
如在此处所用的，术语“流体处理”指那些基于微量滴定板的且使用荧光、荧光偏振、发光、放射性(闪烁计数器)或比色读出器的测定法。当表征方法应用对短的核酸片段的修饰时流体处理是有用的，如当将标签或标记整合入短的核酸片段中时。这些测定可用酶如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶来放大，这些酶可从可溶性底物或灵敏性发光产物中生成可溶性的或不溶性的比色产物。这些测定具有大的动力学范围(6-8logs)且可为可靠的。使用微量滴定板的流体处理能够很好地缩放且已部分通过使用384-孔板而小型化了。流体处理尤其与商业的自动化和读出系统如荧光计和平板阅读器兼容。数据易于存档和处理。
iii. 分级分离方法学
根据本发明，小的核酸片段可在探测步骤之前进行分级分离的步骤。分级分离步骤可简单地从目标小片段中去除不想要的杂质以使得对片段能够更方便和/或更准确地表征。这类分级分离步骤可称为纯化。可选择地，或者附加地，分级分离可将核酸从其他核酸中分离(如在层析中)，且该探测技术简单地确定核酸是否在特定时间和空间存在(如用紫外线探测以确定核酸是否从层析柱中洗脱出来了)。
因而，依赖于所应用的特定探测方法，使探测方法和一种或多种使小的核酸分子分级分离的方法偶联将是有利的。如下文所述，这种分级分离方法包括，但不局限于包括聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶电泳和毛细管电泳的电泳技术和包括高压液相层析(HPLC)和变性的高压液相层析(DHPLC)的液相层析技术(LC)。
(a)凝胶电泳
如在此处所用的，术语“电泳”通常指那些基于核酸在电场中的移动性的分离技术。带负电荷的核酸向正电极移动，而带正电荷的核酸向负电极移动。带电荷的种类依赖于其总的电荷、大小和形状具有不同的移动速率，因此可被分离。
电泳设备由高压电源、电极、缓冲液和缓冲液的支持体如聚丙烯酰胺凝胶或毛细管组成。开口的毛细管用于许多类型的样品，且其他凝胶支持体通常用于生物学样品如蛋白质混合物或核酸片段。
核酸片段最有力的分离方法是PAGE，通常为厚平板凝胶形式。现有技术的主要限制是对在测序反应中产生的核酸片段进行凝胶电泳需要相对长的时间。利用毛细管电泳可获得增加的量级(10-倍)，该毛细管电泳使用超细的凝胶。
各种形式的毛细管电泳(CE)是快速、高分辨率地分离复杂混合物的非常小量的样品体积的适当技术，该CE包括自由溶液、等速电泳、等电聚焦、PAGE和胶束电动“层析”。与质谱分析法固有的灵敏性和选择性结合后(CE-MS；见下文)，CE是有力的生物分析技术。在此处公开的方法学中，这两种方法的结合提供了比现有测序方法更好的优异DNA测序方法。
作为可选择地实施方案，CE可与电喷射电离(ESI)流速结合使用。已描述了毛细管区带电泳(CZE)和毛细管等速电泳两者与基于ESI的四极质谱仪的组合。(Olivares等人，Anal.Chem.59：1230(1987)；Smith等人，Anal.Chem.60：436(1988)；Loo等人，Anal.Chem.179：404(1989)；Edmonds等人，J.Chroma.474：21(1989)；Loo等人，J.Microcolumn Sep.1：223(1989)；Lee等人J.Chromatog.458：313(1988)；Smith等人，J.Chromatog.480：211(1989)；Grese等人，J.Am.Chem.Soc.111：2835(1989)，每一个均在此处整体引入作为参考)。小的核酸易于进行具有良好(千万亿分之一摩尔)灵敏性的CZE分析。
如上所述的那些聚丙烯酰胺凝胶可应用于CE方法学中。用交联的聚丙烯酰胺已获得了每米异常大的平板数目。(参见如Cohen等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 85：9660(1988)报道了每米10+7个平板)。所述的这种CE柱可应用于核酸(特别是DNA)测序中。在标准的测序仪上CE方法原则上比平板凝胶电泳快25倍。例如，每小时可读出约300个碱基.分离速率在平板凝胶电泳中受电场强度的限制，因为该电场强度要应用于凝胶而又不产生过量的热。因此，CE的更大速率是通过使用更高的场强而实现的(CE中的300V/cm对平板电泳中的10V/cm)。毛细管形式减少了安培数并因而减少了功率和结果生成的热。
在本发明可选择的实施方案中，多个毛细管可平行用于增加通量并可与高通量的测序结合使用。(Smith等人，Nuc.Acids.Res.18：4417(1990)；Mathies等人，Nature 359：167(1992)；Huang等人，Anal.Chem.64：967(1992)；Huang等人，Anal.Chem.64：2149(1992))。毛细管电泳的主要缺点是可加载到毛细管中的有限的样品体积。该限制可通过在加载到毛细管中之前浓缩大的样品体积而克服，同时还伴随有在探测中＞10-倍的增强的优点。在本发明的一方面，小的单链核酸片段在表征前是预先浓缩的。
CE中适当的预先浓缩方法是样品堆积(sample stacking)。(Chien等人，Anal.Chem.64：489A(1992))。样品堆积依赖于样品缓冲液和毛细管缓冲液之间的基质差异(即pH和离子强度)，从而跨过样品区带的电场比毛细管区域的大。在样品堆积中，将在低浓度缓冲液中的大体积样品引入到毛细管柱的顶部以进行预先浓缩。毛细管是用相同组成但浓度较高的缓冲液填充的。当样品离子到达毛细管缓冲液和较低的电场时，它们即堆积成浓缩的区带。样品堆积使可探测性增加了1-3个数量级。
可选择地，预先浓缩可通过在对分析物的自由区带CE分离之前应用等速电泳(ITP)而实现。ITP是使得微升体积的样品能够加入到毛细管中的电泳技术，这与一般与CE相关的低nL注射体积相反。该技术依赖于在较高和较低移动性的两个缓冲液(前导和拖尾电解质)之间插入样品，其中该缓冲液紧随着分析物。该技术本身是一种浓缩技术，其中分析物浓缩到以相同速率迁移的纯区带中。该技术一般比上述堆积方法是不优选的，这是因为它需要几个前导和拖尾电解质的选择，以及在分离过程中仅分离阳离子或阴离子种类的能力。
处于核酸测序过程中心的是可以对核酸片段达到的显著选择性的电泳分离。一般地可以对序列仅差别单个核苷酸的片段进行分离。该方法适合于分离长达1000bp的片段。
进一步的优点可通过用可裂解的标记测序来实现。参见如欧洲专利No.0 868 535、0840 804和0 850 320以及美国专利No.6,027,890。当使用可裂解的标记时，当用PAGE分离核酸片段就不需要用平板凝胶形式。因为组合了许多样品(4～2000)，所以不需要像在现有的染料-引物或染料-终止物方法(即ABI 373测序仪)中那样平行运行样品。因为没有理由运行平行的泳道，所以也没有理由使用平板凝胶。因此，人们对于电泳分离方法可应用管状凝胶形式。已显示当管状凝胶形式代替平板凝胶形式使用时获得了相当大的益处。(Grossman等人，Genet.Anal.Tech.Appl.9：9(1992))。这是由于与平板凝胶相比管状形式具有分散焦耳热的更大的能力，从而导致更快的运行时间(增大50％)及对高分子量核酸片段的更大的分辨率(大于1000nt)。长的读出量在基因组测序中是关键的。因此，测序中可裂解的标记的使用具有额外的益处，使得用户能够应用更有效和更灵敏的核酸分离方法，该方法同时也具有最高的分辨率。
如上所述，CE是核酸测序的有力方法，特别对于DNA测序、法律分析、PCR产物分析和限制性片段大小分析。CE比传统的平板PAGE快，这是因为用毛细管凝胶可应用更高的电压场，但具有每个凝胶只能处理一个样品的缺点。因而，作为根据本发明的可选择的实施方案，将微加工的设备(MFD)与CE的快速分离时间结合应用，以具有平行分析多个样品的能力。
MFD允许通过使泳道尺寸小型化到约100微米而增加电泳中的信息密度。毛细管阵列中的电流密度受限于毛细管的外直径。对通道的微加工产生了较高密度的阵列。微加工也允许玻璃纤维所不可能进行的物理组装，并使通道直接与芯片上的其他设备连接。气相层析和液相层析已加工到硅芯片上，但这些设备尚未广泛应用。(Terry等人，IEEE Trans.Electron Device ED-26：1880(1979)和Manz等人，Sens.Actuators B1：249(1990))。几个研究组已报道在MFD上分离荧光染料和氨基酸。(Manz等人，J.Chromatography 593：253(1992)；Effenhauser等人，Anal.Chem.65：2637(1993))。
光刻法和化学蚀刻法可用于在玻璃基质上制备大量的分离通道。该通道用羟乙基纤维素(HEC)分离基质填充。DNA限制性片段可在少至2分钟内分离。(Woolley等人，Proc.Natl.Acad.sci.91：11348(1994))。
(b)液相层析(LC)
包括HPLC和DHPLC的液相层析可与上述的一种探测方法结合使用，如荧光偏振、质谱分析法和/或电子电离。可选择地，LC、HPLC和/或DHPLC可以与UV探测方法结合使用。不管所用的探测方法如何，液相层析在探测前提供了对非挥发性化合物的复杂混合物的分离。在本发明的某些实施方案中，LC单独可用于鉴定和/或区别小的核酸分子，因而使得能够鉴定目标核酸中的目标核苷酸(基于对如在此处所述从目标核酸中制备的短的核酸片段的表征)。
异乎寻常地，两个核酸分子可具有相同的长度，即含有相同数目的核苷酸，且相互只在其序列中一个核苷酸位置有差异，然而这两个分子可基于从根据本发明进行的液相层析分析中获得的存留时间而相互区别。同样异乎寻常的是两个具有相同长度和相同核苷酸组成但相互仅在核苷酸组织的顺序上有差别的核酸分子可基于从根据本发明进行的液相层析分析中获得的存留时间而相互区别。作为一个例子，可将核酸分子中两个核苷酸的顺序转换以提供变化的核酸分子，且初始的和变化的核酸分子可通过它们由液相层析分析观察到的不同保留时间而区别(参见如实施例1中的8聚体B和8聚体C)。能够实现用保留时间区别两个相似的核酸分子的重要因素是层析分析的流动相的选择，因而该主题在下面详细描述。
流动相是从两个缓冲液(缓冲液A和缓冲液B)形成的梯度。即在将核酸分子应用到柱子中后，将缓冲液A或大部分是缓冲液A的洗脱缓冲液用于洗脱分子。在层析过程中，逐渐(渐增地)将缓冲液B加入到缓冲液A中，从而洗脱缓冲液逐渐变为富含缓冲液B特异性的成分。缓冲液A是(一种或多种)铵盐的水溶液，而缓冲液B是(一种或多种)铵盐的有机溶液。如在此处所述的，水溶液必须含有水，但也可含有非水成分包括有机成分，如有机溶剂。如在此处所述的，有机溶液必须含有有机材料，但可以且一般也含有非有机成分包括无机成分，如作为溶剂的水。用于缓冲液A和/或B的水优选地为HPLC级别的水，该水的质量是本领域众所周知的。
存在于缓冲液A中的铵盐不必与存在于缓冲液B中的铵盐相同，然而，在本发明的一个方面，缓冲液A和缓冲液B含有相同的铵盐。缓冲液A或缓冲液B各自独立地可含有超过一种铵盐，然而在本发明的一个方面，缓冲液A和缓冲液B各自含有单一的铵盐结构。本发明的一个方面缓冲液A和缓冲液B各自含有单一的铵盐，并且进一步这两个缓冲液含有相同的铵盐。
至于缓冲液A，在本发明的一个方面，水是该缓冲液中存在的仅有的溶剂。在本发明的另一个方面，水构成了缓冲液A中存在的溶剂总体积的至少99％、至少97％、至少95％、至少90％、至少85％或至少80％。至于缓冲液B，在本发明的一个方面，该缓冲液含有有机溶剂和水两者。一般地，水必须存在于缓冲液B中以溶解缓冲液中的铵盐。在本发明的各个方面，有机溶剂构成了缓冲液B中存在的溶剂总体积的高达75％、高达60％、高达45％、高达30％或高达15％，而水贡献了溶剂的剩余体积。在本发明的各个方面，缓冲液B中有机溶剂∶水的体积比为5-75∶95-25，或10-50∶90-50；或15-40∶85-60；或20-35∶80-65，其中有机溶剂和水的总和等于100。
关于有机溶剂，优选地为非常易与水混合的溶剂。优选地，有机溶剂与水易于混合的程度基于水和有机溶剂的总体积为至少5vol％，且在各个方面易于混合的程度为10vol％、20vol％、30vol％、40vol％或50vol％(即等体积的水和有机溶剂形成均一的溶液)。如在此处所述的，溶剂是“有机的”只要其含有至少一个碳。有机溶剂在室内(环境、标准)温度和压力时优选地为液体。这种溶剂是本领域众所周知的。在一方面，有机溶剂是醇，即在室温含有至少一个羟基(OH)基团的有机液体。示例性的醇不限制地包括甲醇、乙醇、乙二醇、异丙醇、正丙醇、丙二醇和甘油。一般地，随着醇中存在的碳原子数目的增加，醇变得不易溶于水，且醇必须含有超过一个羟基以实现与水的可溶性。另一方面，有机溶剂是乙腈。在另外一个方面有机溶剂是二甲基亚砜(DMSO)。
关于铵盐，这些是选自与质子酸(H-A)复合的伯(RNH2)、仲(R2NH)和叔(R3N)胺。一方面，铵盐整合了伯胺，另一方面，铵盐整合了仲胺，另外一方面，铵盐整合了叔胺。另一方面，铵盐选自仲胺和叔胺盐。铵盐在形成缓冲液的溶剂中应该是可溶的，其中在该缓冲液中将加入该铵盐。在各个方面，铵盐以高达1,000mM、或高到800mM、或高到600mM、或高到400mM、或高到200mM、或高到100mM的浓度溶于水中。特别地如果液相层析分析将伴随有质谱分析，想要的是使从液相层析中获得的级分中铵盐的量最小化。高浓度的铵盐可损害质谱仪的电离效率，特别当质谱仪通过电喷射电离运行时。只要形成铵盐的R基团整体不是太疏水的，则铵盐一般显示水溶性。在各个方面，选择铵盐以提供具有pH范围为5.0～9.0、或5.5～8.5、或6.0～8.0、或6.5～7.5的水溶液。
在各个方面，铵分子中各自独立存在的R基团对于每一个伯、仲和叔铵盐来说是烃基，即R基团是：完全由氢和碳形成的；具有1-10个碳的烃基；具有1-6个碳的烃基；具有5-8个碳的烃基；选自烷基和环烷基；选自甲基、乙基、丙基(包括其几何异构体)、丁基(包括其几何异构体)、戊基(包括其几何异构体)、己基(包括其几何异构体)、环己基和环戊基(包括甲基-取代的环戊基)；选自具有15-250的原子质量的有机基团，该基团可包括或不包括除碳和氢之外的原子；一次取代的卤化物；和/或二次取代的卤化物；R基团根据本发明可表现这些特征的两个或多个的组合，只要两个特征不矛盾。如在此处所述的，烷基和环烷基基团可含有不饱和的如双键，然而环烷基不包括芳香环。然而，在一方面，R基团是选自苯基和C1-C6烷基取代的苯基。另一方面，R基团是具有芳基取代的烷基基团，如苄基。一方面，铵盐是具有5-8个碳原子的烷基或环烷基基团的仲或叔铵盐。一方面，铵盐含有阳离子，即质子化形式的三乙胺、二烯丙基胺、二异丙基胺、N，N-二甲基-N-环己基胺或N，N-二甲基-N-异丙基胺。一方面，铵盐是N，N-二甲基氨基丁烷的盐形式。另一方面，铵盐是N，N-二甲基环己基胺的盐形式。另一方面，铵盐是三乙胺的盐形式。
铵盐中氨基成分的选择对用伴随有质谱分析法的液相层析从核酸分子中生成的信号有影响。例如，尽管二甲基氨基丁烷和二甲基环己基胺提供相似的反应，但三乙胺与二甲基氨基丁烷相比减少了约25％的反应，如由液相层析后质谱分析法所观察的。
在一方面，铵盐的质子酸具有分子式Ra-COOH，从而铵基团的阴离子反荷离子(counterion)具有分子式Ra-COO-。在各个方面，Ra是氢(即反荷离子源自甲酸)、甲基、乙基、丙基、选自甲基和乙基或选自甲基、乙基和丙基及其单-或多-卤化形式。另一方面，用于形成铵盐的质子酸是阴离子碳酸盐家族的质子化形式，即碳酸氢盐(HCO3)和/或碳酸盐(CO3)是铵基团的阴离子反荷离子。在本发明的另一方面，质子酸是无机酸，如HCl和HBr。通常，按优选顺序，铵盐的质子酸是乙酸、甲酸、碳酸(从而提供碳酸氢盐阴离子)或氯化氢。
在本发明的一方面，铵基团是具有上述R基团的叔铵基团，且反荷离子是乙酸盐(不包括卤化的乙酸盐)、碳酸盐/碳酸氢盐，或选自乙酸盐(不包括卤化的乙酸盐)和碳酸盐/碳酸氢盐。当反荷离子是乙酸盐时，示例性的铵盐不限制地包括乙酸三乙胺、乙酸二甲基丁胺、乙酸二甲基异丙基胺、乙酸二甲基已基胺、乙酸二甲基环己基胺和乙酸二异丙基胺。
除缓冲液A和B的选择之外，运行液相层析的条件在能够分解或区分两个相同长度的但具有一些不同的核苷酸碱基序列的核酸结构中是重要的。例如，本发明的液相层析分析通常是在室温即约25℃或在升高的温度进行的。一般地，升高的温度低于75℃。在各个方面，层析中层析柱是在下面温度范围内维持的：20℃-80℃、25℃-70℃、25℃-65℃、25℃-60℃、30℃-80℃、30℃-70℃、30℃-65℃、30℃-60℃、30℃-55℃、30℃-50℃或30℃-45℃。升高的温度一般是想要的，这是因为它提供了其中峰更高、更窄和/或显示更大分辨率的层析谱。然而，当温度超过70℃时，有时可观察到洗脱液中气泡的形成，这将导致分辨率的损失。
如上所述，洗脱缓冲液的pH也是成功的层析分析的重要因素。通常，洗脱缓冲液维持如上所述约5.0～9.0的pH范围。一般地，只要洗脱缓冲液的pH维持在该pH范围之内，保留时间就不受影响。
层析一般是在压力下运行的，即压力用于将洗脱缓冲液推过柱子。随压力的增加，一般缓冲液经过柱子的流速也增加。约200-1600巴的压力和每分钟约10μL～2000μL的流速一般是运行柱层析的合适条件。
液相层析柱的长度和固定相是必须选择的另外两个参数。一般地，柱子长度为10-500mm。在各个方面，柱子长度为10、18、25、50、100、250或500mm，且可在微量或大量等级(micro-or macro-scale)。选择固定相以提供反相柱子，即具有围绕固相的疏水相的柱子。适当的反相柱子是购自Varian Inc.(Palo Alto，CA； www.varianinc.com)的MICROSORBTM C18柱子。该柱子是单体硅柱，具有5微米的球形颗粒、300的孔、C18固定相、12％的碳荷载且是末端加盖(endcap)的。基本等价的柱子是由Phenomenex U.S.A.(Torrance，CA；www.phenomenex.com)制备的JUPITERTM C18柱子。相似的柱子是购自Waters(Milford，MA； www.waters.com)的XTERRATM柱子，该柱子含有硅和多聚物的杂交颗粒以延伸pH稳定性，具有120的孔大小和2.5微米～5微米的颗粒大小。也可使用具有完全多聚固体支持体的柱子。在本发明的一个优选的方面，反相柱子具有C18固定相和至少120的孔大小。为了使拖尾最小化及改善峰形状，硅柱的末端加盖是优选的，因此优选的柱子具有该特征。柱子的碳荷载对于确保足够的保留是重要的(碳荷载不应用于多聚柱子)，且优选地为5-20％。颗粒大小一般为约2微米到约10微米，这是目前商业上可购得的柱子的一般大小。较小的颗粒大小通常导致改善的层析，因此小于5μM的颗粒大小是优选的。柱子的尺寸不是关键的，但可基于分析的等级和类型进行选择。通常对于小样品(＜25μL或250μg分析物)的快速、较高通量的分析，小柱子是优选的，如2.1×15mm(直径×长度)的XTERRATM柱子，该柱子具有2.5μM的颗粒，使得能够以250μL/分钟的流速在4分钟内完全运行一次。当注射更大的样品体积时，一般优选地使用更大的柱子，该更大的柱子直径为约4.6mm且长度为约250mm。具有0.3mm～4.6mm的内径和10mm～250mm长度的柱子从许多商业供应商(如Water)可购得且适用于本发明。一般的LCMS柱子将为1mm×50mm。流速将依赖于柱子大小，且将从对于0.3mm ID柱子的每分钟几微升变化到对于4.6mmID柱子的每分钟约1500-2000微升。
如上文所解释的，流动相优选地是通过渐增地组合两种不同的溶液(缓冲液A和B)而形成的。在组合溶液中盐优选地以1mM～200mM的浓度存在，更优选地在1mM～100mM的浓度，更加优选地在5mM～50mM的浓度。特别当液相层析后伴随着质谱分析时，较低的盐浓度是优选的，且在这样的情况下，约5mM的盐浓度是优选的。缓冲液B优选地含有缓冲液A中10-90％(体积/体积)的极性有机分子(如乙腈、甲醇或异丙醇)。缓冲液A和/或B可含有可选择的成分，且在一方面，在缓冲液A中存在的可选择成分也存在于缓冲液B中。适当的可选择成分是EDTA，其中EDTA可以在缓冲液中以约0.1mM的浓度使用。
例如，根据本发明的液相层析可如下进行。首先，乙腈或其他适当的溶剂的浅梯度可用于洗脱核酸分子并清洁样品。例如，当使用乙腈时，该梯度可起始于约5％并增加到约20％，其中这些百分数值指水中有机溶剂对于洗脱缓冲液的体积百分数。甲醇可代替乙腈使用，但甲醇的使用需要将最终梯度组成增加到50％或甚至75％的甲醇。所需的溶剂组分部分依赖于所使用的柱子，且也依赖于要分析的核酸分子的长度范围。通常将在运行的末期将强的溶剂洗涤应用于柱子以洗脱任何大的疏水成分。在优选的实施方案中，梯度的分析部分起始于5％的乙腈，并在约90秒内增加到15％，随后伴随以快速用45％的乙腈“填料(plug)”加入到柱子中洗涤仅仅几秒钟，然后再回到5％的乙腈的起始条件。优选的缓冲液系统包含5mM乙酸N，N-二甲基氨基丁酯并在pH 7运行。1mM～50mM的铵盐浓度在质谱仪中具有相等的反应(即在该范围内无离子抑制的证据)，但偏离该范围的铵盐浓度对于核酸分子的保留时间具有轻微的影响。保留时间的变化可通过在LC运行中调节溶剂的组成而补偿。如上所述，pH范围是可变的，其中可使用pH6～pH 8的范围，而在产出中无显而易见的变化，即对核酸的保留时间有小的影响或没有影响。
在某些其他的实施方案中，可使用高效液相层析(HPLC)。HPLC是分离溶解于溶液中的化合物的层析技术。HPLC仪器由流动相的贮存器、泵、注射器、分离柱和探测器组成。化合物通过将等份试样的样品注射入柱子中而分离。化合物中不同的成分由于其在流动相和固定相之间的分配行为不同而以不同的速率经过柱子。泵提供了没有脉动的稳定的高压，且可进行编程以在分离过程中改变溶剂的组成。
用于本发明的方法中的示例性的探测器包括UV-VIS吸收或用适当的波长激发后的荧光、质谱仪和IR分光计。在半自动的序列分析、微测序和基因型分析中可用荧光染料标记的寡核苷酸代替放射性标记的寡核苷酸。(Smith等人，Nature 321：674(1986))。
在本发明的一方面，(短的)单链核酸片段是单独由在此处所述的层析与适合于含有核酸的单位的探测仪结合表征的。在另一方面，表征步骤需要如上所述用层析分离核酸片段并对分离的片段进行质谱分析。
在具有化学结合的烷基链的非孔状PS/DVB上的IP-RO-HPLC可用于分析单链和双链核酸。(Huber等人，Anal.Biochem.212：351(1993)；Huber等人，Nuc.Acids.Res.21：1061(1993)；Huber等人，Biotechniques 16：898(1993))。与不总是作为链长的函数来保留双链DNA(因为AT碱基对与带正电荷的固定相的相互作用比GC碱基对的更强)的离子交换层析相反，IP-RP-HPLC能够进行严格的大小依赖性分离。
已发展了用100mM乙酸三乙铵作为离子配对试剂的方法，从而磷酸二酯核苷酸可成功地依靠高效液相层析在烷基化的非孔性2.3μM的聚(苯乙烯-二乙烯苯)颗粒上进行分离。(Oefner等人，Anal.Biochem.223：39(1994))。描述的技术使得能够分离大小范围在50～200个核苷酸的长度上仅差异4～8个碱基对的PCR产物。
变性HPLC(DHPLC)是离子配对反相高效液相层析方法(IP-RP-HPLC)，该方法使用非孔性的C-18柱子作为固定相，该柱子可用于表征如在此处所产生的(短的)单链核酸片段。该柱子包含聚苯乙烯-二乙烯苯共聚物。流动相包含介导DNA与固定相结合的乙酸三乙铵(TEAA)离子配对剂，且包含乙腈(ACN)作为有机试剂以实现随后DNA从柱子中的分离。乙腈的线性梯度使得能够进行分离。DHPLC基于对PCR扩增的双链DNA上错配核苷酸之间的异双链体的形成的探测鉴定突变和多态。序列变异在野生型和突变DNA片段的再次退火中基于异双链体的大小和/或存在生成了异双链体和同双链体的混合群体(这是DHPLC技术的传统应用)。当该混合物在部分变性温度下由HPLC分析时，异双链体比同双链体更早从柱子中洗脱出来，这是因为其降低的熔解温度。可对单个样品进行分析以确定杂合性，或对混合样品进行分析以鉴定个体间的序列变异。
在某些应用中，优选地是以非变性的模式使用DHPLC以分离大小相同但具有不同核苷酸组成的DNA片段。例如，非变性模式可应用于例如含有C→T单核苷酸多态(SNP)的6-聚体中，如野生型单链DNA片段具有核苷酸序列5’-AACCCC-3’而突变的单链DNA片段具有核苷酸序列5’-AATCCC-3’。少至1-聚体、2-、3-、4-、5-、6-、7-、8-到16-聚体的片段在DHPLC仪器中显示不同的流动性(保留时间)。作为采用非孔性材料进行对小核酸片段的层析应用的替代方案，作为区分大小和DHPLC应用的HPLC也可在广泛的基于孔性硅的材料上进行。孔性材料具有对于半制备工作的高样品容量的优点。这由Hewlett-Packard(Palo Alto，CA)随同其Eclipse dsDNA柱子一起销售。
e. 等位基因频率确定
探测和/或表征扩增的单链核酸片段的许多方法也可用于测量扩增反应混合物中特定的扩增单链核酸片段的量。例如，在扩增的单链核酸分子首先由液相层析从扩增反应混合物其他分子中分离并进行质谱分析的实施方案中，扩增的单链核酸分子的量可通过对含有核酸分子的级分的液相层析或者通过对与核酸分子相应的质谱分析峰的离子流测量来定量。
这种方法可用于确定核酸群体中目标核酸的等位基因频率，其中目标核酸的等位基因变体也可存在。如在此处所用的，“等位基因变体”指除目标核酸的限定位置之外与目标核酸具有相同序列的核酸分子。目标核酸在限定位置的序列和目标核酸的等位基因变体在相同限定位置序列在此处可称为“遗传变异”。如在此处所用的，“核酸群体中目标核酸的等位基因频率”指目标核酸及其等位基因变体的总量在目标核酸的核酸群体中的百分比。因为如在此处所描述的本发明的ODNP对设计为与位于目标中存在的目标遗传变异两侧的目标核酸部分退火，所以用ODNP作为引物和用含有目标核酸的核酸群体作为模板的扩增产生了含有目标核酸的遗传变异的核酸片段(称为“源自目标核酸的模板核酸片段”)以及(如果核酸群体中存在变体时)含有目标核酸的等位基因变体的遗传变异的核酸片段(称为“源自目标核酸的等位基因变体的模板核酸片段”)。因为目标核酸及其等位基因变体的序列仅在限定位置有差异，所以源自目标核酸的模板核酸片段和那些源自变体的可以以相同或相似的效率扩增。同样地，在分别用源自目标核酸的模板核酸片段和源自目标核酸等位变体的模板核酸片段作为模板时，含有目标核酸的遗传变异的单链核酸分子(称为“单链目标”)的扩增和含有目标核酸等位基因变体的遗传变异的单链核酸分子(称为“单链变体”)的扩增是以相同或相似的效率进行的。因此，单链目标在总的扩增单链核酸(即单链目标和单链变体的总和)中的百分比反映了核酸群体中目标核酸的等位基因频率。
本发明也提供了多重确定核酸群体中许多目标核酸的等位基因频率的方法。在这种方法中，对于每一个单独的目标核酸设计ODNP对以制备在目标核酸的限定位置含有遗传变异的模板核酸和在目标核酸等位基因变体的(相应)限定位置含有该序列的模板核酸。然后将对于每一个目标核酸或其消化产物扩增的模板核酸(如其中ODNP对的一个ODNP包含RERS)用作模板以扩增含有目标核酸或目标核酸的等位基因变体的遗传变异的单链核酸片段。因为本发明的探测/表征方法(如液相层析和质谱分析法)可区别来自一个目标核酸或其等位基因变体的扩增单链核酸与来自另一个目标核酸或其等位基因变体的扩增单链核酸，所以多个目标核酸分子的等位基因频率可同时确定。
2 .鉴定遗传变异的试剂盒
本发明也提供了鉴定遗传变异的试剂盒。这种试剂盒通常包含上述用于制备模板核酸的ODNP对，该模板核酸含有切割位点和位于NS的3’的遗传变异。它们也可进一步包含下面成分的至少一种、两种、几种或每一个：(1)识别ODNP对的至少一个引物中的切割剂识别序列(NARS)的切割剂(如NE或RE)；(2)切割剂(1)的适当缓冲液；(3)识别存在于ODNP对的至少一个引物中的RERS的RE；(4)RE(3)的适当缓冲液；(5)用于制备模板核酸的DNA聚合酶(即从上面ODNP对的3’末端延伸)；(6)DNA聚合酶(5)的适当缓冲液；(7)用于扩增单链核酸片段的DNA聚合酶；(8)DNA聚合酶(7)的适当缓冲液；(9)dNTPs；(10)修饰的dNTP；(11)用于扩增模板核酸的对照模板和/或对照寡核苷酸引物；(12)层析柱；(13)层析柱的缓冲液A；(14)层析柱的缓冲液B；(15)水；(16)链置换促进剂(如1M海藻糖)；(17)微量滴定板或微孔板；(18)用于液相层析和/或质谱分析法的寡核苷酸标准(如6聚体、7聚体、8聚体、12聚体和16聚体)；(19)使用试剂盒的说明书小册子；和(20)用于设计和/或定购ODNP对的软件存取码。许多上述成分的详细描述已在上文提供。
示例性的切割剂是切割性内切核酸酶N.BstNB I。该切割性内切核酸酶的缓冲液可为10mM Tris-HCl、10mM MgCl2、150mM KCl和1mM二硫苏糖醇(25℃时pH 7.5)。N.BstNB I可贮存于下面的贮存缓冲液中：50mM KCl、10mM Tris-HCl(pH 7.5)、0.1mM EDTA、1mM DTT、200μg/ml BSA和50％的甘油。
示例性的5’→3’外切核酸酶缺陷的DNA聚合酶是exo-Vent。该聚合酶的反应缓冲液可为10mM KCl，20mM Tris-HCl(25℃时pH 8.8)、10mM (NH4)2SO4、2mM MgSO4和0.1％Triton X-100。
如上所述，缓冲液A包含溶于水中的铵盐，其中水优选地应该是HPLC等级的水。铵盐可为任何一种或多种上面所述的铵盐。例如，在一方面，铵盐是具有反荷离子的N，N-二甲基-N-丁铵，且在进一步的方面，该反荷离子是乙酸盐。在优选的实施方案中，铵盐是以约1-200mM的浓度存在于水中的，优选地为约1-100mM，优选地为约5-50mM，且更优选地为约5mM。容器可含有高于100mM浓度的铵盐，但在这种情况下，容器中的成分可能需要用水稀释以形成有效的缓冲液。铵盐和水的该溶液优选地具有约7.0-7.5的pH，且一般为约7.2，并在此处称为缓冲液A。一方面，该容器仅含有溶于水的铵盐。
同样如上所述，缓冲液B包含铵盐、水和有机溶剂。一方面，成分包含缓冲液A和有机溶剂，其中混合物优选地是均一的，即有机溶剂溶于缓冲液A或可与后者互溶。在一方面有机溶剂是乙腈。另一方面，有机溶剂是甲醇。在各个方面，有机溶剂(在体积百分数的基础上)基于容器中成分的总体积组成了15％-20％、20％-25％、25％-30％、30％-35％、35％-40％、40％-45％、45％-50％或50％-55％或55％-60％或65％-70％或75％-80％。在优选的实施方案中有机溶剂由25％的乙腈组成。在另一个优选的实施方案中，有机溶剂由50％乙腈组成。因而，优选的成分是75vol％的缓冲液A和25vol％的乙腈的溶液，而另一种优选的成分是50vol％的缓冲液A和50vol％的乙腈的溶液。
层析柱优选地为反相层析柱，更优选地为C18反相层析柱。优选的C18反相层析柱可具有下面特征的一个、两个或全部：至少120的孔大小、2微米～10微米的颗粒大小和0.3mm～4.6mm的内径和10mm～250mm的长度。
3. 本发明遗传变异鉴定方法的应用
如在上文详细描述的，本发明提供了探测和/或鉴定目标核酸中遗传变异的方法。同样在此处提供的是各种“读出”技术，该技术可与本发明的方法一起用于探测如包含突变和/或遗传变异的一个或多个单链片段的大小和/或分子量。根据本发明的方法可用于广泛的应用中，在这些应用中想要的或必需的是鉴定限定核苷酸座位上的突变或测量遗传变异。这种应用包括，但不局限于对遗传传递的疾病的遗传分析、肿瘤诊断、疾病诱因、法律、亲子确定、作物培养或动物育种的增强、细胞功能和/或疾病标记基因的表达描述、鉴定和/或表征在植物或动物中导致传染性疾病和/或与食品安全相关的传染性生物。此外，与目前本领域中可用的常规方法相比，本方法、组合物和试剂盒可用于大大增加测定的特异性、灵敏性和通量，同时又降低成本。下面描述的是本发明应用的某些示例。
a. 表达描述
大多数mRNA是从单拷贝的序列转录的。cDNA的另一个特征是它们代表了基因组的较长区域，这是由于在大多数基因的染色体形式中存在内含子。该代表因基因而异，但是是非常重要的，这是因为许多在单个cDNA中代表的基因在基因组DNA中覆盖超过100kb。分子描述的一个可能的应用是用来自一个物种的探针来寻找从另一个物种制备的克隆。小鼠和人类mRNA之间的序列差异允许长序列的特异性交叉再组合，但大多数高度保守的区域除外，并防止PCR引物的交叉杂交。
用从单个细胞制备的cDNA探针在复杂的生物学样品如发育中的神经系统中进行示差筛选目前由于基于PCR和基于cRNA的扩增技术的发展而是可能的。几个研究组前面已报道从少量自10-50个细胞中制备的poly(A+)RNA(1ng或更少)生成的cDNA文库(Belyav等人，Nuc.Acids Res.17：2919，1989)。尽管文库足以代表mRNA的复杂性，但这些文库的平均cDNA插入大小是相当小的(＜2kb)。
最近，已组合了方法来从单个细胞中生成基于PCR(Lambolez等人，Neuron 9：247，1992)的和基于cRNA(Van Gelder等人，Proc.Natl.Acad.sci.USA 87：1663，1990)的探针。电记录之后，将单个细胞的细胞质内容物用膜片钳微电极吸出以进行原位cDNA合成和扩增。将PcR用于扩增器官型小脑培养物中来自单个浦肯野细胞的选择性谷氨酸受体mRNA的cDNA和来自单个神经胶质的GFAP mRNA(Lambolez等人，Neuron 9：247，1992)。在cRNA扩增的情况下，将转录启动子序列设计入用于cDNA合成的引物，且复杂的反义cRNA可通过用噬菌体RNA聚合酶的体外转录而生成。
本发明的方法也用于确定特定cDNA分子是否存在于来自生物学样品的cDNA中，并进一步确定遗传变异是否存在于cDNA分子中。
b. 法律
在DNA序列变异水平上对个体的鉴定提供了许多比这种常规标准如指纹、血型或身体特征更好的实践优点。与大多数表型标记相反，DNA分析更易于允许推断个体间的相关性，如亲子检验中所需要的。遗传分析已证明在骨髓移植中是高度有用的，在骨髓移植中必须区别密切相关的供体和受体细胞。目前有两类探针用于通过DNA印迹的DNA指纹分析。多态的小卫星DNA探针鉴定多个DNA序列，这些DNA序列的每一个均以可变形式存在于不同的个体中，因而生成了复杂的且在各个个体间高度可变的模式。VNTR探针鉴定基因组中的单个序列，但这些序列可以以高达30个不同的形式存在于人类群体中，如由鉴定的片段的大小所区分的。不相关个体对于多个VNTR或小卫星探针具有相同杂交模式的概率是非常低的。比DNA印迹所需的少许多的组织，甚至单根头发即可提供足够的DNA用于对遗传标记的基于PCR的分析。同样地，因为仅需要小的DNA片段，所以部分降解的组织可用于分析。本发明的方法可用于表征样品DNA的多态，因此可用于法律DNA分析中。例如，对样品中22个单独的基因序列(其中该基因序列的每一个均以两个不同的形式存在于群体中)的分析可生成1010个不同的结果，从而允许对人类个体的唯一鉴定。
c. 肿瘤诊断
病毒或细胞致癌基因的探测是核酸诊断的另一个重要的应用领域。病毒致癌基因(v-致癌基因)是由反转录病毒传递的，而其细胞等价物(c-致癌基因)是已存在于正常细胞中的。然而细胞致癌基因可通过特定的修饰如点突变(如膀胱癌和结肠直肠癌中的c-K-ras致癌基因中的)、小的缺失和小的插入而活化。每一个活化过程与额外的退化过程结合导致不受控制的细胞生长。此外，点突变、小的缺失或插入也可使所谓的“隐性致癌基因”失活并因此导致肿瘤的形成(如在成视网膜细胞瘤(Rb)基因和骨肉瘤中的)。因此，本发明可用于探测或鉴定活化致癌基因或失活隐性致癌基因并因而导致癌的点突变、小的缺失和小的突变。
d. 移植分析
移植组织的排斥反应是由组织相容性抗原(HLA)的特定类型决定性地控制的。它们在抗原呈递血液细胞如巨噬细胞的表面表达。HLA和外源抗原之间的复合物由T-辅助细胞通过细胞表面相应的T-细胞受体来识别。HLA、抗原和T-细胞受体之间的相互作用触发了复杂的防御反应，这导致身体的级联性的免疫反应。
不同外源抗原的识别是由T-细胞受体的可变的抗原特异性区域介导的——类似于抗体反应。在移植排斥中，表达与外源抗原适配的特异性T-细胞受体的T-细胞可因此从T-细胞库中去除。这种分析通过鉴定由PCR扩增并因此选择性增加的抗原特异性可变DNA序列而是可能的。特异性扩增反应允许对特异性T-细胞受体的单细胞特异性鉴定。
目前对于自身免疫疾病如幼年糖尿病、动脉硬化、多发性硬化、类风湿性关节炎或脑脊髓炎的鉴定进行了相似的分析。
因此，本发明可用于确定T-细胞受体基因中的基因变异，该T-细胞受体基因编码参与各种外源抗原识别的可变的抗原特异性区域。
e. 基因组诊断
所有新生儿的4％具有遗传缺陷；在描述的由仅仅一个基因的修饰所导致的3,500个遗传疾病中，仅对其中的约400个知道主要的分子缺陷。
遗传疾病长期以来一直通过表型分析(既往病史，如血液缺陷：地中海贫血)、染色体分析(核型，如先天愚型：21三体性)或基因产物分析(修饰的蛋白质，如苯丙酮尿症：苯丙氨酸羟化酶缺陷导致苯丙酮酸增高的水平)来诊断的。核酸探测方法的额外应用相当大地增加了基因组诊断的范围。
在某些遗传疾病的情况下，两个等位基因中仅仅一个的修饰就足以导致疾病(显性传递的单基因缺陷)；在许多情况下，必须两个等位基因都修饰(隐性传递的单基因缺陷)。在第三类遗传缺陷中，疾病的发生不仅由基因修饰确定，而且由诸如进食习惯(在糖尿病或动脉硬化的情况下)或生活方式(在癌症的情况下)的因素确定。这些疾病经常出现于老年阶段。如精神分裂症、躁狂抑郁症或癫痫的疾病也应该在此处提及；关于这些情况中的疾病是否依赖于环境因素以及对不同染色体位置上几个基因的修饰正在研究中。
利用直接和间接的DNA分析，对一系列遗传疾病的诊断已变为可能：膀胱癌、结肠直肠癌、镰状细胞贫血、地中海贫血、al-抗胰蛋白酶缺乏症、自毁容貌综合症、囊性纤维化/粘液粘稠病、杜兴氏/Becker氏肌营养不良、阿尔茨海默氏病、X-染色体依赖性精神薄弱和Huntington氏舞蹈病、苯丙酮尿症、半乳糖血症、威尔逊病、血色病、恶性复合免疫缺陷症、α-1-抗胰蛋白酶缺乏症、白化病、尿黑酸症、溶酶体贮积病、埃-当二氏综合症、血友病、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶紊乱、无丙种球蛋白血症、尿崩症、Wiskott-Aldrizh氏病、法布莱氏病、脆性X-综合症、家族性高胆固醇血症、多囊肾、遗传性球形红细胞贫血症、Marfan氏综合症、冯维勒布兰德氏病、神经纤维瘤、结节性脑硬化、遗传性出血毛细血管扩张症、家族性结肠息肉病、埃-当二氏综合症、肌强直性营养不良、成骨不全、急性间歇性血卟啉病、和VHL病。本发明可用于诊断任何由限定位置的点突变、小的缺失或小的插入导致的遗传疾病。
f. 传染病
重组DNA方法用于诊断传染病的应用已最广泛地应用于病毒感染中，其中现有的方法是麻烦的且结果是延迟的。组织或培养的细胞的原位杂交使得对急性和慢性疱疹感染的诊断成为可能。已报道新鲜的和福尔马林固定的组织均适合于探测侵袭性宫颈癌中的乳头瘤病毒(papillomavirus)和探测HIV，而培养的细胞已用于探测巨细胞病毒(cytomegalovirus)和EB病毒(Epstein-Barr virus)。如果可满足成本-效益性、速度和准确性，重组DNA方法在诊断微生物疾病中的应用具有替代现有的微生物生长方法的潜力。已开始应用重组DNA方法的临床状况包括通过转座子的存在对青霉素具有抗性的淋病奈氏球菌(Neisseria gonorrhoeae)的鉴定、难生长的衣原体的鉴定、食物中的微生物的鉴定；以及追踪感染在群体中传播的简单方式。世界性地涉及寄生物如利什曼原虫属和疟原虫的疾病流行病学挑战已由重组方法来应付。
本发明可用于探测和/或测量参与传染病的遗传变异，尤其是那些在药物抗性基因中的。因而，本发明促进了对导致传染病的生物的表征和分类并因此促进了对由这些生物导致的这种疾病的治疗。
g. 额外的应用
除上述应用之外，本发明也可用于检验疾病易感性。某些遗传变异尽管不直接导致疾病，但是与疾病相关。换句话说，被试者带有这种基因变异将使得被试者易于患病。用本发明的方法对这种基因变异的探测使得能够鉴定对某些疾病易感的被试者和随后应用预防措施。
本发明也应用于药物基因组学中。例如，它可用于探测或鉴定参与药物耐受性的基因，如细胞色素P450基因的各个等位基因。
此外，本发明提供了用于探测或表征剩余的疾病的方法。换句话说，本发明的方法可用于探测或鉴定剩余的突变基因型，如在经过某些治疗如化学疗法手术后的癌症中。它也可用于鉴定出现的突变体，如某些基因中赋予病原生物药物抗性的遗传变异。
C. 生物学样品中核酸的探测
在各个方面，本发明提供了探测生物学样品中目标核酸存在与否的方法、化合物、组合物和试剂盒。
1. 探测目标核酸的方法
本发明提供了探测生物学样品中目标核酸存在与否的方法。在某些实施方案中，该方法利用部分双链的核酸探针(在下文更详细地描述)，该探针包含(1)至少基本与目标核酸互补的突出端，(2)NARS，和(3)唯一与目标核酸相关的序列。与目标核酸“唯一相关”的序列指仅存在于对某一目标核酸特异性的部分双链核酸探针中，而不存在于对另一个目标核酸特异性的部分双链核酸探针中的序列。如果其突出端至少基本与目标核酸互补，则称部分双链核酸探针是对目标核酸“特异性的”。在某些实施方案中，探针的突出端是与目标的部分精确互补的。在某些实施方案中(如下文所述探测紧密相关的核酸分子时)，目标核酸可为具有简并序列的核酸，该核酸代表相互基本相同的各个核酸分子。
根据本发明，上述探针与可能含有目标核酸的生物学样品在一定条件下组合，该条件使得如果在生物学样品中存在目标核酸，那么探针即可与目标核酸进行杂交。将未杂交的探针从反应混合物中去除，而将杂交的探针用作模板以在识别NARS的切割剂存在时扩增单链核酸。因为扩增的单链核酸片段具有与探针中的序列互补的序列，其中该探针唯一与目标核酸相关，所以对单链核酸片段的探测和/或表征显示了样品中目标核酸的存在。
在其他实施方案中，本发明用单链核酸探针或各个ODNP对以制备包含NARS的模板。单链核酸探针和ODNP对对模板核酸是特异性的，且可用于仅当目标核酸存在于生物学样品中时制备模板核酸。然后该模板核酸可用于在识别NARS的切割剂存在时扩增单链核酸。对扩增的单链核酸的探测和/或表征显示了样品中目标核酸的存在。
上述方法可多重化(multiplexed)以探测样品中多个目标核酸的存在与否。例如，可将多个部分双链的核酸探针与样品进行组合。多个探针的每一个在不含有NS的链中具有核苷酸序列，该核苷酸序列位于相应于NS的位置的5’且唯一地与特定目标核酸相关。这种序列可用作模板以在(i)识别NARS的NA和(ii)DNA聚合酶存在时扩增单链核酸片段。对单链核酸的探测/表征显示了该探针的部分唯一相关的特定目标核酸的存在。
a. 生物学样品和目标核酸
本发明的生物学样品包括源自生物且含有感兴趣的核酸(即目标核酸)的任何样品。它们可通过从被试者或生物学来源获得血液样品、活体解剖标本、组织外植体、器官培养物或其他组织或细胞制剂而提供。生物学样品也包括在固体支持体上制备的组织印迹。被试者或生物学来源可为人类或非人类的动物、植物、原代细胞培养物或适应培养的细胞系。在本发明某些优选的实施方案中，被试者或生物学来源可被怀疑含有或有具有遗传疾病或病原体感染的风险。在其他优选的实施方案中，被试者或生物学来源可为具有遗传疾病或病原体感染的患者。在某些其他的实施方案中，被试者或生物学来源可为不具有遗传疾病或病原体感染的对照被试者。
目标核酸可为存在于生物学样品中的任何核酸。它们可为DNA或RNA，单链或双链的。在某些优选的实施方案中，目标核酸源自病原体生物如细菌、病毒、真菌或寄生物。示例性的病原体生物在下面对单链核酸探针制备的描述中提供。目标核酸可具有特定物种或亚种共有但不存在于其他物种或亚种中的序列。对这种目标核酸的探测显示生物学样品中该物种或亚种的存在，且可用作对特定生物或该物种或亚种中特定生物的初始筛选。可进一步对生物学样品进行表征以确定样品中特定生物的存在与否。在其他优选的实施方案中，目标核酸是其表达与疾病相关的mRNA。
在某些实施方案中，生物学样品的核酸在与本发明部分双链或单链的寡核苷酸探针进行杂交之前进行固定。目标核酸的固定使得在扩增单链核酸分子之前易于将未杂交的探针从杂交混合物中去除。固定目标核酸的技术是众所周知的，且固定可由本领域中公知的任何技术实现。例如，生物学样品可用固定剂进行固定，该固定剂可维持样品中细胞的形态完整性，但不大量交联或沉淀细胞的蛋白质以致于防止核酸探针和其他试剂的穿入。这种固定使得能够进行目标核酸的原位探测。可选择地，可用本领域中公知的技术将生物学样品的核酸转移到固体支持体(如硝酸纤维素膜)上，如组织印迹。在某些实施方案中，目标核酸可首先从生物学样品中分离并随后固定在固体支持体上。固体支持体可由各种材料制备，包括但不局限于硅、玻璃、纸、陶瓷、金属(如不锈钢)、准金属和塑料。固体支持体可进一步用可与核酸分子结合的化学层包被，从而当包被的固体支持体与那些核酸分子接触时它可进一步经过化学层被从生物学样品分离的核酸分子包被。可形成用于与核酸分子结合的适当化学层的示例性化学物包括，但不局限于PADMAC和聚乙烯亚胺(PEI)。用适当的化学层包被的固体支持体的方法是公知的(参见如U.S.Pat.No.6,150,103；现已授权的U.S.Pat.Appl.No.09/120,689，两者均在此处整体引入作为参考)。
在某些优选的实施方案中，用化学层包被以与核酸结合的固体支持体是针形的。这种固体支持体可根据U.S.Patent Appl.No.09/323,695(审查中)而制备，在此处将其整体引入作为参考。固体支持体的这种类型使得在此处描述的诊断方法能够自动化。例如，可将多个携带从单个生物学样品中分离的核酸分子的针同时置于多孔板的单个孔中，其中每一个孔均含有对于探测特定目标核酸分子特异的部分双链或单链的核酸探针以及单链核酸扩增所必需的其他成分(如切割剂、DNA聚合酶和dNTP)。在扩增反应完成之后，将针从孔中去除，且孔中扩增的单链核酸分子可平行表征。对扩增的核酸分子的这种表征使得能够确定生物学样品中特定目标核酸的存在与否。
同样地，可将多个携带从不同生物学样品中分离的核酸分子的针同时置于多孔板的单个孔中，其中每一个孔均含有相同的对于探测特定目标核酸分子特异的部分双链或单链的核酸探针以及单链核酸扩增所必需的其他成分(如切割剂、DNA聚合酶和dNTP)。在扩增反应完成之后，将针从孔中去除，且孔中扩增的单链核酸分子可平行表征。对扩增的核酸分子的这种表征使得能够确定各个生物学样品中特定目标核酸的存在与否。
b. 制备模板核酸的方法
用于诊断应用的模板核酸分子可通过各种方法提供。例如，模板可通过引发核酸与单链核酸探针的退火而制备，其中引发核酸源自来自病原体生物的核酸分子。可选择地，模板可直接源自来自病原体生物的双链核酸分子。模板也可为具有突出端的部分双链的核酸分子，该突出端源自目标核酸并充当单链核酸扩增的模板，或者该突出端能够与目标核酸杂交但不充当单链核酸扩增的模板。提供与诊断应用相关的模板的这些及其他方法在下面描述。
i. 提供模板分子的第一类示例性方法
在本发明的某些实施方案中，其中模板分子是通过使引发核酸与单链核酸探针退火而提供的，该引发核酸可源自来自病原体生物的DNA分子(如基因组DNA分子)或RNA分子(如mRNA分子)。如果源自病原体生物的核酸分子是单链的，那么它可直接用作引发核酸。可选择地，可对单链核酸进行切割以产生较短的片段，其中这些片段的一种或多种可用作引发核酸。如果源自病原体生物的核酸分子是双链的，那么可使其变性并直接用作引发核酸，或其变性产物可进行切割以提供多个较短的单链片段，其中这些片段的一种或多种可用作引发核酸。可选择地，可将其首先切割以获得多个较短的双链片段，然后使较短的片段变性以提供一种或多种引发核酸。
单链核酸探针必须至少基本与引发核酸互补，从而当引发核酸所源自的目标核酸存在于生物学样品中时，该探针能够与目标进行退火。此外，该探针包含NARS一条链的序列，从而使得引发核酸与探针退火时形成的双链体的延伸产物包含切割剂识别序列。
制备模板分子的第一类方法的例子如图36所示。如在该图中所示的，双链基因组DNA首先用限制性内切核酸酶进行切割。可使消化产物变性，且一个消化产物的一条链可用作引发核酸以起始核酸扩增反应。
ii. 提供模板分子的第二类示例性方法
在本发明的某些实施方案中，其中模板分子是通过使引发核酸与单链核酸探针退火而提供的，引发核酸可包含NARS有义链的序列。该引发核酸可源自来自病原体生物的目标核酸(如基因组核酸)。其中模板核酸包含可由切割性内切核酸酶(如N.BstNB I)识别的NERS的特定实施方案如图37所示，该切割性内切核酸酶在其识别序列之外进行切割。如该图所示，包含NERS的基因组DNA或其片段被变性，且基因组DNA的一条链或该链的片段与单链核酸探针退火。该探针是基因组DNA其他链的部分，该链包含NERS反义链的序列。引发核酸与探针的退火提供了用于扩增反应的模板核酸。扩增反应混合物中探针分子的数目优选地大于含有NERS有义链序列的基因组DNA链或其片段的数目。
在相关的实施方案中，其中引发核酸源自目标核酸并包含NARS有义链的序列，单链核酸探针可至少基本与引发核酸在探针的3’部分而不是5’部分互补。探针的3’部分包括NARS反义链的序列，从而通过使探针与引发核酸退火而形成的模板核酸包含双链NARS。在识别NARS的NA存在时，模板分子受到切割。然后切割位点的3’末端可用位于模板分子中NARS反义链序列5’的区域作为模板进行延伸。结果所得的扩增产物是单链核酸分子，该单链核酸分子与位于NARS反义链序列5’的探针区域而不是引发核酸的部分互补。
在某些实施方案中，单链核酸探针可固定于固体支持体上。可选择地，单链核酸探针可不附着到任何固体支持体上。
iii. 提供模板分子的第三类示例性方法
在本发明的某些实施方案中，模板核酸是直接源自含有NARS和RERS两者的基因组核酸的双链核酸，其中相应于NARS的NS位于NARS中或位于NARS和RERS之间，且RERS靠近NARS。当RERS和NARS之间的距离最大为500个、400个、300个、200个、100个、50个、40个、30个、20个、15个或10个碱基对时RERS是靠近NARS的。用可由切割性内切核酸酶(如N.BstNB I)识别的NERS作为示例性NARS的实施方案如图38所示，其中该切割性内切核酸酶在其识别序列之外进行切割。如该图所示，基因组DNA可用识别基因组DNA中RERS的限制性内切核酸酶进行消化。含有NERS的消化产物可充当模板核酸。
iv. 提供模板分子的第四类示例性方法
在本发明的某些实施方案中，模板核酸是用各个ODNP对产生的完全或部分双链的核酸分子。用ODNP对制备模板分子的方法在下文与图39-41一起描述，该方法与图1、2和5中的相似。
在一个实施方案中，模板核酸的前体含有双链NARS和RERS。NARS和RERS是用ODNP对整合入前体中的。用可由在其识别序列之外进行切割的NE(如N.BstNB I)识别的NERS作为示例性NARS的，以及用IIs型限制性内切核酸酶识别序列(TRERS)作为示例性RERS的实施方案如图39所示。如在该图中所示的，第一个ODNP包含NERS一条链的序列而第二个ODNP包含TRERS一条链的序列。当将这两个ODNP用作引物以扩增目标核酸的部分时，结果所得的扩增产物(即模板核酸前体)含有双链的NERS和双链的TRERS两者。在识别TRERS的IIs型限制性内切核酸酶存在时，将扩增产物进行消化以产生包含双链NERS的模板核酸分子。
在另一个实施方案中，模板核酸的前体含有两个双链NARS。这两个NARS是用两个ODNP整合入前体中的。用可由在其识别序列之外进行切割的切割性内切核酸酶识别的NERS作为示例性NARS的实施方案如图40所示。如在该图中所示的，两个ODNP均包含NERS有义链的序列。当将这两个ODNP用作引物以扩增目标核酸的部分时，结果所得的扩增产物含有两个NERS。这两个NERS相互可为相同的或不同的，但优选地为相同的。在识别NERS的NE或多个NE存在时，将扩增产物切割两次(在每一条链上一次)以产生各自包含双链NERS的两个模板核酸分子。
在另外一个实施方案中，模板核酸前体含有两个半修饰的RERS。这两个半修饰的RERS是用两个ODNP整合入前体中的。这一实施方案如图41所示。如在该图中所示的，第一个和第二个ODNP均包含RERS一条链的序列。当将这两个ODNP用作引物以在修饰的脱氧核苷三磷酸存在时扩增目标核酸的部分时，结果所得的扩增产物含有两个半修饰的RERS。这两个半修饰的RERS相互可为相同的或不同的。在识别半修饰的RERS的RE或多个RE存在时，将上述扩增产物进行切割以产生两个部分双链模板核酸分子，该模板核酸分子各自包含半修饰的RERS的至少一条链的序列。
V. 提供模板分子的第五类示例性方法
在本发明的其他实施方案中，部分双链的核酸探针可充当模板核酸分子。该探针包含(1)可由切割剂进行裂解以产生切割位点(NS)的切割剂识别序列(NARS)；(2)在自身或其延伸产物中含有NS的链中的5’突出端或在自身或其延伸产物中均不含有NS的链中的3’突出端，其中该突出端包含至少部分与目标核酸互补的核苷酸序列；和(3)在自身或其延伸产物中均不含有NS的链中的核苷酸序列，该核苷酸序列位于相应于NS的位置的5’并唯一地与目标核酸相关。示例性实施方案如图6所示，其中目标核酸具有可由在其识别序列之外进行切割的切割性内切核酸酶识别的NERS作为示例性NARS。使探针与可含有目标核酸的生物学样品在一定条件下组合，该条件使得如果在样品中存在目标核酸，则探针可与目标核酸进行杂交。将未杂交的探针去除，而将杂交的探针用作模板以在识别NARS的切割剂存在时扩增单链核酸。因为扩增的单链核酸片段具有与唯一与目标核酸相关的探针中的序列互补的序列，所以对扩增的单链核酸的探测和/或表征显示样品中目标核酸的存在。
未杂交的探针的去除可通过对生物学样品中核酸分子的固定而促进。这种固定可用如上所述本领域中公知的任何方法来进行。当将具有基本与特定目标核酸分子互补的突出端的部分双链核酸探针应用于样品时，如果目标核酸存在于样品中，则该探针与目标核酸通过其突出端进行杂交。接着洗涤样品以除去任何未杂交的探针。在DNA聚合酶和识别探针中NARS的切割剂存在时，可扩增单链核酸分子。然而，如果目标核酸不存在于样品中，则探针不能与样品中的任何核酸分子杂交并因而从样品中洗涤出去。因而，当洗涤的生物学样品与核酸扩增反应混合物(即含有用探针的部分作为模板的单链核酸扩增所必需的所有成分的混合物，该成分如识别探针中NARS的NA和DNA聚合酶)温育时，没有与上述探针部分互补的单链核酸分子得到扩增。因而，模板分子仅当N1与特定的固定序列进行杂交时形成。
除固定目标核酸分子之外，已与目标核酸退火的探针分子可用与目标核酸相关的功能基团而与那些不与目标核酸退火的进行分离。例如，目标核酸可用生物素分子进行标记，且与目标核酸退火的探针分子可通过与目标相关的生物素分子而与那些不与目标核酸退火的进行分离。例如，目标核酸以及已与目标退火的探针可用固定的链霉抗生物素进行沉淀。
探针的NARS可为任何切割剂的识别序列，它包括但不局限于NERS和半修饰的RERS。NS可在NARS之内或在NARS之外。在某些实施方案中，NS可不存在于探针中，但可通过在DNA聚合酶存在时延伸探针而生成。在优选的实施方案中，NARS可由切割性内切核酸酶N.BstNB I识别。
探针的双链部分必须足够长以使得两条链能够在一定条件下相互退火，该条件用于将未杂交的探针从样品中去除或用于在NA和DNA聚合酶存在时扩增单链核酸片段。该部分长度可为至少8个、10个、12个、15个、20个核苷酸。它含有NARS且可含有或不含相应的切割位点。
探针的突出端(在含有NS或其延伸产物中含有NS的链中的5’突出端或者另一条链中的3’突出端)也必须足够长以使得突出端和目标核酸之间能够进行特异性的杂交。这种杂交不应该在将未杂交的探针从样品中去除或随后扩增单链核酸的条件下解离。该突出端长度可为至少6个、8个、10个、12个、14个、16个、18个或20个核苷酸。
探针也必须在自身或其延伸产物均不含有NS的链中含有核苷酸序列，该核苷酸序列位于相应于NS的位置的5’。该序列将用作模板以在切割剂和DNA聚合酶存在时扩增单链核酸片段。它可在探针的双链部分或单链部分中。当将多个探针用于探测多个目标核酸存在与否时，每个探针的上述序列必须相互不同，从而每一个可唯一地与特定目标核酸相关。
本发明的探针可用本领域公知的任何可用的方法来合成。每一条链可单独合成并随后退火以形成部分双链的核酸探针。
在某些相关的实施方案中，模板核酸是通过使来自生物学样品的固定的目标核酸与单链核酸探针进行杂交而形成的。使用可由在NARS之外进行切割的切割剂识别的NARS的这些实施方案的例子如图42所示。如在该图中所示的，生物学样品的核酸是通过其5’末端固定的。然后将结果所得的固定的核酸与单链探针进行杂交。该单链探针从3’到5’包含至少基本与怀疑存在于生物学样品中的目标核酸互补的序列以及NARS反义链的序列。如果目标核酸存在于生物学样品中，则探针分子与目标核酸进行杂交以形成模板分子。模板分子可通过洗涤目标核酸所附着的固相而与未杂交的探针分子分离。在DNA聚合酶和识别NARS的切割剂存在时，可将模板核酸用作模板以扩增单链核酸分子。然而，如果目标核酸不存在于样品中，则单链探针不能与样品中的任何核酸分子进行杂交，因而则从固体支持体中洗涤出来。因此，不能形成与固体支持体附着的模板核酸，且不能扩增与模板核酸的部分互补的单链核酸分子。
在其他相关的实施方案中，模板核酸是通过使来自生物学样品的目标核酸与固定的单链核酸探针进行杂交而形成的。这些实施方案的一个例子是其中目标核酸是未固定的，但如上所述的单链核酸探针经过其5’末端固定在固体支持体上。如果目标核酸存在于样品中，则样品的核酸与探针的杂交使得当洗涤固体支持体时目标能够维持附着在固体支持体上。在识别切割剂识别序列(其中该切割剂识别序列的反义链存在于探针中)的切割剂和DNA聚合酶存在时，单链核酸分子可用位于探针中识别序列反义链序列的5’的序列作为模板进行扩增。如果目标不存在于样品中，则样品的核酸将从探针所附着的固体支持体上洗涤出去。因而用探针的部分作为模板不能扩增单链核酸分子。
上述使用可由在NARS之外进行切割的切割剂识别的NARS的实施方案的另一个例子如图44所示。如在该图中所示的，单链核酸探针是通过其5’末端固定在固体支持体上的。该探针从5’到3’包含NARS有义链的序列和至少基本与目标核酸的3’部分互补的序列。将该探针与来自生物学样品的核酸混合。如果目标核酸存在于样品中，则探针分子与目标进行杂交以形成模板分子。当洗涤探针所附着的固体支持体时，目标通过其与探针的杂交而附着于固体支持体上。在DNA聚合酶存在时，目标可用探针作为模板从其3’末端进行延伸。在目标的延伸产物和探针的延伸产物之间形成的双链体包含双链NARS。在识别NARS的切割剂以及DNA聚合酶存在时，单链核酸分子可用目标核酸的部分作为模板进行扩增。然而，如果目标核酸不存在于样品中，则探针将不能与目标进行杂交。因而，用目标作为模板将不能扩增单链核酸分子。
上述实施方案的另一个例子如图45所示。在该例子中，固定的单链核酸探针基本与目标核酸互补，但不必与目标的3’部分互补。探针也包含切割剂识别序列有义链的序列。如果目标存在于生物学样品中，那么当探针与样品中的核酸混合时，它可与目标进行杂交。当洗涤探针所附着的固体支持体时，目标通过其与探针的杂交而附着在固体支持体上。在DNA聚合酶和识别NARS的切割剂存在时，即使当在某些情况下，NARS有义链序列中的一个或多个核苷酸不与目标中的核苷酸形成常规的碱基对，单链核酸也可用目标的部分作为模板进行扩增。对当模板核酸不包含双链NARS时扩增单链核酸的情况的详细描述在下面与制备单链核酸分子相关的部分提供。然而，如果目标核酸不存在于样品中，那么探针将不与目标杂交。因而，用目标作为模板将不能扩增单链核酸分子。
c. 特异性
本发明的方法可用于探测样品中特定病原体生物的存在与否，以及用于探测几个紧密相关的病原体生物的存在。例如，关于上述的第一类和第二类示例性方法，与单链核酸探针退火的引发核酸的部分可源自对于要探测的病原体生物特异性的目标核酸或其部分。可选择地，引发核酸的这种部分可源自在几个紧密相关的病原体生物中基本或完全保守的目标核酸或其部分，但该目标核酸或其部分不存在于相关性更远的或不相关的病原体生物中。
如在此处所用的，对特定病原体生物“特异性的”目标核酸或其部分指具有存在于特定生物中但不存在于任何其他生物(包括那些与特定生物紧密相关的生物)中的序列的目标核酸或其部分。此外，如在此处所用的，在几个紧密相关的病原体生物中“基本保守的”目标核酸中的区域指目标核酸中的这样一种区域，在该区域中存在能够与几个紧密相关的生物的每一个中的相应区域在适当条件下杂交的核酸分子，但该核酸分子同时又不能与来自相关性更远的或不相关的生物的目标核酸的类似区域在相同条件下进行杂交。同样地，如在此处所用的，在几个紧密相关的病原体生物中“完全保守的”目标核酸中的区域指在来自几个紧密相关的生物的每一个中的目标核酸中具有相同序列的区域。
相似地，关于上文第四类示例性方法，用引物扩增的目标核酸的部分可为对特定病原体生物特异性的区域，或者为在几个紧密相关的病原体生物中基本或完全保守但不存在于相关性更远的或不相关的病原体生物中的区域。此外，目标核酸扩增的部分可为几个紧密相关的病原体生物中目标核酸的可变区域。如在此处所用的，目标核酸中“可变的”区域指在来自紧密相关的生物的目标核酸中具有少于50％的序列一致性的区域，但该区域在每一侧由在来自相同的紧密相关的生物的目标核酸中具有高于80％的序列一致性的区域包围。如在此处所用的，两个核酸的百分比一致性是用Altschul等人(J.Mol.Biol.215：403-10，1990)的BLAST程序以其默认的参数确定的。这些程序执行经Karlin和Altschul修改的(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-7，1993)Karlin和Altschul算法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA87：2264-8，1990)。BLAST程序可从如网站http：//www.ncbi.nlm.nih.gov获得。
同样地，关于上文第五类示例性方法，部分双链核酸探针的突出端可至少基本与对病原体生物特异性的目标核酸中的区域互补，或与在几个紧密相关的病原体生物中基本或完全保守的目标核酸中的区域互补。当突出端完全与来自特定生物的目标核酸或其部分互补，同时也基本与来自一个或多个紧密相关的生物的目标核酸或其部分互补时，人们可改变杂交严格性以探测特定生物的存在或探测任何一种紧密相关的生物的存在。例如，当双链核酸探针与来自生物学样品的核酸在高严格性条件下进行杂交时，在去除未杂交的探针之后用探针分子的部分作为模板的核酸扩增将显示生物学样品中特定生物的存在。另一方面，当探针与来自生物学样品的核酸在中等或低严格性条件下杂交时，用探针分子的部分作为模板的核酸扩增(在将未杂交的探针分子去除之后)将显示特定生物和/或与特定生物紧密相关的一种或多种生物的存在。对杂交条件严格性的调节是本领域中众所周知的，且详细讨论可发现于如Sambrook和Russell，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Press，2001。
在其中模板核酸是通过使引发核酸与单链核酸探针退火而提供的实施方案中，引发核酸或其部分与位于NARS一条链序列3’的探针分子的部分相互可为基本互补的，而不是完全互补的。例如，当引发核酸源自在几个紧密相关的病原体生物中基本保守的目标核酸的区域且需要探测这几个生物的任何一个的存在时，可使用基本与引发核酸互补的探针分子。在这种情况下，引物延伸反应需要在一定条件下进行，该条件不要太严格以致于阻止了引发核酸与探针分子的退火或阻止了用探针分子的部分作为模板对引发核酸的延伸。然而，这种条件也需要足够严格以防止探针分子与引发核酸之外的核酸分子非特异性的退火。当引发核酸或其部分基本与探针分子的部分互补时，适合于核酸扩增的条件可通过调节反应温度和/或反应缓冲液组成或浓度而实现。通常，与杂交条件相似地，反应温度的增加将增加扩增反应的严格性。
本发明也用于探测RNA或DNA目标序列或两者的存在。可选择具有用RNA或DNA作为模板的能力的DNA聚合酶。对于RNA目标序列的探测，可使生物学样品如固定的细胞或组织直接与核酸探针进行杂交。因为DNA分子一般以双链存在于样品中，所以它们不能与核酸探针进行杂交。对于DNA目标序列的探测，生物学样品可首先用RNase或NaOH(约0.1M)进行处理以降解潜在的RNA目标序列。然后将处理的样品加热以使双链目标核酸变性，从而使得结果所得的单链能够与核酸探针进行杂交。如果加热步骤在样品和核酸探针杂交之前(没有RNase处理)进行，那么DNA和RNA目标序列均可与探针杂交并因而可被探测。这种杂交对于本发明的大多数诊断应用是优选的，这是因为它给出了与目标序列杂交的最大数目的探针并因而给出了扩增的单链核酸分子的最好结果。
在其中目标核酸固定在固体支持体上的某些实施方案中，具有固定的目标核酸的固体支持体可首先与阻断剂进行温育以在与探针进行杂交之前阻断探针对固体支持体的非特异性附着。这种阻断剂是本领域中公知的且对于本领域的技术人员来说是易于获得的(参见Sambrook等人，见上文)。
d. 单链核酸扩增
单链核酸扩增基本如上文对遗传变异探测方法的描述。为了促进探测(在下文更详细描述)，可将标记的双脱氧核苷三磷酸用于扩增中并随后整合入扩增的单链核酸中。适合于整合入核酸片段中的标记及随后探测该片段的方法是本领域中公知的，且示例性的标记描述于上文对遗传变异的鉴定方法中。在某些实施方案中，标记可为放射性标记如32P、33P、125I或35S；能够产生颜色反应产物的酶如碱性磷酸酶；荧光标记如异硫氰酸荧光素(FITC)；生物素；抗生物素蛋白；洋地黄毒苷；抗原；半抗原或荧光染料。标记的存在也可促进扩增的单链核酸分子在细胞中的保留以使得能够原位探测目标核酸。
如上所述，单链核酸分子是用模板核酸的部分作为模板扩增的。在某些实施方案中，扩增的单链核酸可为相对较短的且具有最多25个、20个、17个、15个、10个或8个核苷酸。这种短的长度可通过适当设计用于扩增模板分子的单链核酸探针或ODNP而实现。例如，对于提供模板分子的第二类(图37)，单链核酸探针可设计为具有位于NARS反义链序列5’的短的区域。对于提供模板分子的第四类(图39-41)，ODNP对可设计为当引物与目标核酸退火时可相互靠近。对于提供模板核酸分子的第五类(图6)，部分双链的探针可设计为具有位于NARS反义链序列5’的短的区域。扩增的单链核酸分子的短的长度可为有利的，这是因为这增加了扩增效率和速率。此外，这使得能够使用不具有链置换活性的DNA聚合酶。这也促进了通过某些技术如质谱分析对扩增的单链核酸分子的探测。
e. 扩增的单链核酸分子的探测/表征
本发明对扩增的单链核酸分子的探测/表征方法包括本领域中公知的适合于探测和/或表征短的核酸片段的方法。示例性的方法也描述于上文遗传变异的鉴定方法中。对扩增的单链核酸分子的探测可在原位或在分子已经从样品中释放和/或去除之后进行。在某些实施方案中，其中首先将目标核酸从生物学样品中分离并随后固定于固体支持体上，扩增的单链核酸分子可在用如MALDI-TOF的技术进行探测之前转移到另一个固体支持体(也称为“固体基质”)上。这种程序易于多重化并因而用于形成源自来自多个不同的生物学样品的目标核酸的扩增单链核酸分子的阵列。可同时探测和/或表征许多扩增的单链核酸分子的技术(如MALDI-TOF)的应用增加了本发明诊断方法的通量。
如上所述，在某些实施方案中，扩增的单链核酸分子是通过整合标记的脱氧核苷三磷酸而标记的。某些这样标记的分子(如那些用放射性同位素、荧光半分子和染料)可直接用如下技术进行探测，如放射显影术、荧光光谱法或分光测定法和发光光谱法或分光测定法。其他标记的分子(如能够产生颜色反应产物的酶、生物素、抗生物素蛋白、洋地黄毒苷、抗原、半抗原或荧光染料)可能必须间接探测。例如，碱性磷酸酶可通过与底物如Vector Red/Vector Blue(VectorLabs，CA)、5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸(BCIP)/氮蓝四唑(NBT)(SigmaChem.CO.，MO)或Nuclear Fast Red(Sigma Chem.Co.)的反应进行探测。生物素(或抗生物素蛋白)标记可通过与标记的抗生物素蛋白(或标记的生物素)的结合而探测。洋地黄毒苷和半抗原标记可通过标记的抗-洋地黄毒苷或抗-半抗原的抗体而探测。
荧光偏振(FP)也可用于探测单链核酸分子的扩增。FP基于以下事实，即当荧光分子由平面偏振光激发时，如果标记的分子在激发和发射之间不显著地旋转，那么它向固定的平面发出偏振的荧光。然而，如果分子足够小且在空间旋转和翻滚，那么荧光偏振则不能完全由探测仪观察到。
分子的荧光偏振与分子的旋转驰豫时间(通常为旋转68.5°所需要的时间)成比例，该时间与溶液的性质相关，如粘度、温度和分析物或生物分子的分子体积。因此，如果粘度和温度保持恒定，那么荧光偏振直接与分子体积成比例，并进而直接与分子量成比例。较大的标记分子在空间旋转和翻滚较慢，因此，可获得荧光偏振值。相反，较小的分子旋转和翻滚较快，因此荧光偏振不可测量。
在一方面，本发明利用荧光偏振来探测荧光标记的核苷酸向单链核苷酸的整合。荧光标记的核苷三磷酸是小的，且在溶液中快速旋转。因而，如果未向小的核酸片段中整合，那么荧光标记的核苷三磷酸不可由荧光偏振来探测。上述向核酸分子中整合荧光标记的核苷三磷酸的单链核酸分子的扩增将荧光团的分子量增加了约20-倍。由于分子量的增加，寡核苷酸的荧光偏振可进行探测和测量。
在本发明中可应用各种荧光染料或探针。荧光染料大多数是直接根据其吸收和荧光发射波长和亮度来鉴定和定量的。发射光谱(荧光和磷光)比吸收光谱更灵敏和特异。其他光物理学特征(如荧光各向异性)是较不优选的。有用的亮度参数对于荧光是量子产额(QY)，而对于吸收是摩尔消光系数(ε)。QY是总的光子发射对整个荧光光谱图的度量，而ε的值在给定的波长(通常为探针的最大吸收)下确定。通常将窄的光带宽(＜25nm)用于荧光激发(通过吸收)，而荧光探测带宽是更可变的，其从最大灵敏性的全光谱到最大分辨率的窄带(～20nm)。每个探针分子的荧光亮度与ε和QY的乘积成比例。适用于本发明的商业上重要的和示例性的荧光染料为荧光素、四甲基罗丹明、丽丝胺(lissamine)、德克萨斯红和BODIPY。
荧光标记目前普遍用于探测已由CE和HPLC分离的小核酸片段。一组可根据本目的应用的标记是那些基于近红外(近-IR)的荧光染料。在水溶液中，这些类型的标记在＞680nm的光下具有最大的吸收，随后为在近-IR波长的荧光发射(发射最大值，＞700nm)。用该类荧光进行探测的一个优点是它发生于这样的光谱区域，其中由于其他可能存在于生物学样品中的混合物的吸收或发射相对较小。这和大多数近IR探针可用商业上可购得的激光进行激发的事实一起使该方法具有低的背景信号和阿托摩尔(attomole)范围的探测极限。
荧光光谱法的一个限制是自身荧光现象。避免自身荧光的一种方法是应用具有显著长的发射延迟时间的荧光染料。这些荧光染料通常为在ODN探针或引物的5’-末端附着的发光金属螯合物。
使得时间分辨(time-resolved)荧光染料能够整合入“天然的”核酸中的铽脱氧核苷三磷酸是可购得的。这些探针具有大的斯托克司频移(Stokes shift)、窄的发射带和长的寿命的优点。时间分辨荧光光谱法特别用于结构生物学中，且用于监控分子相互作用和在百亿分之一秒-十亿分之一秒时间范围内发生的运动。时间分辨荧光光谱法已开始主导生物分子结构和动力学的分析，并可用作根据本发明的探测/表征技术。
可整合入本发明的小核酸片段中并因而提供一种对小核酸的有效表征方法的脱氧核苷类似物包括，但不局限于：荧光素-12-dUTP、香豆素-5-dUTP、四甲基罗丹明-6-dUTP、德克萨斯红-5-dUTP、萘荧光素(Napthofluorescein)-5-dUTP、FluoresceinChlorotriazinyl-4-dUTP、芘-8-dUTP、二乙基氨基香豆素-5-dUTP、花菁3-dUTP、花菁5-dUTP、香豆素-5-dCTP、荧光素-12-dCTP、四甲基罗丹明-6-dCTP、德克萨斯红-5-dCTP、丽丝胺TM-5-dCTP、萘荧光素-5-dCTP、Fluorescein Chlorotriazinyl-4-dCTP、芘-8-dCTP、二乙基氨基香豆素-5-dCTP、花菁3-dCTP、花菁5-dCTP、香豆素-5-dATP、二乙基氨基香豆素-5-dATP、Fluorescein-12-dATP、FluoresceinChlorotriazinyl-4-dATP、丽丝胺TM-5-dATP、萘荧光素-5-dATP、芘-8-dATP、四甲基罗丹明-6-dATP、德克萨斯红-5-dATP、花菁3-dATP、花菁5-dATP、香豆素-5-dGTP、荧光素-12-dGTP、四甲基罗丹明-6-dGTP、德克萨斯红-5-dGTP和丽丝胺TM-5-dGTP。
核苷类似物包括但不局限于：荧光素-12-UTP、香豆素-5-UTP、四甲基罗丹明-6-UTP、德克萨斯红-5-UTP、丽丝胺TM-5-UTP、萘荧光素-5-UTP、Fluorescein Chlorotriazinyl-4-UTP、芘-8-UTP、花菁3-UTP、花菁5-UTP、香豆素-5-CTP、荧光素-12-CTP、四甲基罗丹明-6-CTP、德克萨斯红-5-CTP、丽丝胺TM-5-CTP、萘荧光素-5-CTP、Fluorescein Chlorotriaziny1-4-CTP、芘-8-CTP、花菁3-CTP、花菁5-CTP、香豆素-5-ATP、荧光素-12-ATP、四甲基罗丹明-6-ATP、德克萨斯红-5-ATP、丽丝胺TM-5-ATP、香豆素-5-GTP、荧光素-12-GTP、四甲基罗丹明-6-GTP、德克萨斯红-5-GTP和丽丝胺TM-5-GTP。
双脱氧类似物包括但不局限于：荧光素-12-ddUTP、FAM-ddUTP、ROX-ddUTP、R6G-ddUTP、TAMRA-ddUTP、JOE-ddUTP、R110-ddUTP、荧光素-12-ddCTP、FAM-ddCTP、ROX-ddCTP、R6G-ddCTP、TAMRA-ddCTP、JOE-ddCTP、R110-ddCTP、荧光素-12-ddGTP、FAM-ddGTP、ROX-ddGTP、R6G-ddGTP、TAMRA-ddGTP、JOE-ddGTP、R110-ddGTP、荧光素-12-ddATP、FAM-ddATP、ROX-ddATP、R6G-ddATP、TAMRA-ddATP、JOE-ddATP和R110-ddATP。
所有上述类似物均可进一步用3H、氘、32P、14C、35S和其他的放射性同位素标记。
类似物也可为非天然的核苷类似物，包括但不局限于下面的：8-溴-2’-脱氧腺苷-TTP、8-氧代-2’-脱氧腺苷、乙烯-2’-脱氧腺苷-TTP、乙烯-2’-脱氧腺苷-TTP、N6-甲基-2’-脱氧腺苷-TTP、2，6-二氨基嘌呤-2’-脱氧核苷-TTP、8-溴-2’-脱氧鸟苷-TTP、7-脱氮-2’-脱氧鸟苷-TTP、2’-脱氧鸟苷-TTP、-氧代-2’-脱氧鸟苷-TTP、O6-甲基-2’-脱氧鸟苷-TTP、S6-DNP-2’-脱氧硫代鸟苷-TTP、3-硝基吡咯-2’-脱氧核苷-TTP、5-丙炔-2’-脱氧尿苷-TTP、5-氟-2’-脱氧尿苷-TTP、2’-脱氧尿苷-TTP、5-溴-2’-脱氧尿苷-TTP、5-碘-2’-脱氧尿苷-TTP和4-三唑基-2’-脱氧尿苷-TTP。
目前，偏振荧光计和超过50个荧光偏振免疫测定(FPIA)是商业上可购得的，其中许多是常规用于临床实验室中以用于测量生物学流体中的治疗物、代谢物和药物滥用。(参见如Checovich等人，Nature375：254-256(1995)；出现于Nature 375：520(1995)的发表的勘误，两者均在此处整体引入作为参考)。
如果仅将一个本发明的核酸探针用于与其中存在目标核酸的生物学样品进行杂交，那么对扩增的单链核酸分子的探测单独可足以显示目标核酸的存在。然而，当将多个核酸探针用于确定生物学样品中多个目标核酸的存在与否时，通常需要表征扩增的单链核酸片段。这种表征使得能够鉴定每一个扩增的分子并随后鉴定其相关的目标核酸。如上所述，本领域中适合于表征小的核苷酸片段的任何技术均可用于表征扩增的核酸分子。在某些优选的实施方案中，这些分子是用LC/MS表征的。
2. 探测目标核酸的试剂盒
本发明也提供了在生物学样品中探测目标核酸的试剂盒。这种试剂盒通常包含如上所述的部分双链的核酸探针或两个退火时产生部分双链的核酸探针的单链寡核苷酸。它们也可进一步包含下面成分的至少一种、两种、几种或每一种：(1)识别探针中NARS的切割剂(例如NE或RE)和/或其缓冲液；(2)扩增单链核酸片段的DNA聚合酶和/或其缓冲液；(3)dNTP(一些dNTP可为标记的)；(4)对照目标核酸和对照探针；(4)杂交缓冲液；(5)用于去除未杂交的探针的洗涤缓冲液；(6)液相层析柱；(7)层析柱的缓冲液A；(8)层析柱的缓冲液B；(9)水；(10)用可与核酸结合的化学物包被的固体支持体(如PEI包被的不锈钢针)；(11)微管或微孔板；(12)链置换促进剂(如1M海藻糖)；和(13)使用试剂盒的说明书小册子。对用于探测遗传变异的试剂盒普遍的成分也描述于关于那些试剂盒的部分。
3. 本发明目标核酸探测方法的应用
如在上文详细描述的，本发明提供了在生物学样品中探测目标核酸的方法。这些方法可用于广泛的应用中，其中必需确定生物学样品中目标核酸的存在与否。这种应用包括，但不局限于疾病诊断和诱因、作物培养和动物育种、细胞功能和/或疾病标记基因的表达描述、鉴定和/或表征在植物或动物中导致传染性疾病和/或与食品安全相关的传染性生物。
本发明可用于快速探测任何目标核酸的存在。在某些实施方案中，目标核酸源自或来自病原体生物(如导致传染病的生物)。这种病原体生物包括那些带来生物威胁的病原体生物，如炭疽和天花。此外，本发明的方法可用于探测特定病原体生物的存在以及用于探测几个紧密相关的病原体生物的存在。本发明也可用于探测对某些抗生素具有抗性的生物。例如，本发明的方法、组合物或试剂盒可用于探测被试者中某些病原体生物的存在，该被试者已用抗生素或抗生素组合进行了治疗。它也可用于探测与特定特征(如疾病抗性或易感性)相关的核酸的存在与否，并用于预测特定被试者具有特定特征的可能性，其中样品是从该被试者中获得的。
此外，本发明也提供了多重鉴定样品中多个目标核酸存在与否的方法。当样品(如活体解剖标本)难以获得、样品的量不足或从其中获取样品的患者具有在不同的病症或疾病中共有的症状时，这些方法特别有价值。这些方法使得人们能够用稀少的样品确定与各种病症或疾病相关的多个核酸的存在与否，并因而促进对患者的疾病诊断。
D. 单链核酸探针和cDNA文库的制备
在另一方面，本发明提供了制备用于各种核酸分析的单链核酸分子和cDNA文库的方法、化合物和试剂盒。它在某些实施方案中使用核酸连接物而在其他的实施方案中使用寡核苷酸引物。
1. 用核酸连接物制备单链核酸分子和cDNA文库的方法
本发明提供了制备用于各种核酸分析的单链核酸分子或探针的方法。在某些实施方案中，该方法利用包含切割剂识别序列(NARS)的核酸连接物。该核酸连接物与双链目标核酸片段以一定方向连接，从而在不含有识别NARS的切割剂(NA)的切割位点(NS)的链中，目标核酸位于NARS的5’。这种连接使得能够用目标核酸的该链作为模板以在识别NARS的NA和DNA聚合酶存在时合成单链核酸探针。在某些实施方案中，目标核酸连接物进一步包含IIs型限制性内切核酸酶识别序列(TRERS)。TRERS位于连接物中，从而当连接物和双链目标核酸片段以上述方向连接时，识别不含有NS的链中的TRERS的IIs型限制性内切核酸酶的裂解位点同时位于双链核酸片段中和相应于NS的位置的5’。在双链目标核酸与连接物连接且结果所得的连接产物由识别TRERS的IIs型限制性内切核酸酶进行消化后，连接物中TRERS的这种位置使得能够用目标核酸一条链的部分作为模板核酸以合成单链核酸探针。TRERS的存在使得能够制备相对较短的单链核酸探针。
上述方法可用于多重制备多个单链核酸探针。对于这种应用，本发明的连接物(在下面进一步详细描述)与多个目标核酸以如上所述的方向进行连接。然后将每一个目标核酸用作模板以合成单链核酸探针，该单链核酸探针能够与每一个目标核酸的一条链进行特异性杂交。结果所得的单链核酸探针的混合物可用于下面详细描述的各种核酸分析中。
在相关方面，本发明也提供了制备和/或扩增cDNA文库的方法。这些方法的一般方案与上述多重制备单链核酸探针的(其中双链目标核酸片段是双链cDNA分子)相似。简言之，将用从生物学样品分离的mRNA合成的双链核酸分子与包含NARS的核酸连接物连接，从而在不含有识别连接物中NARS的NA的NS的链中，cDNA位于NARS的5’。该连接产物组合形成对来自生物学样品的mRNA特异的cDNA文库。该cDNA文库可通过首先用双链DNA分子的一条链作为模板在识别连接物中NARS的NA存在时扩增单链cDNA分子而扩增。一般地，连接物不进一步包含TRERS。连接物中TRERS的不存在使得能够用与连接物连接的cDNA分子的一条链作为模板来扩增相对长的单链cDNA分子。扩增的单链核酸分子可进一步充当合成或扩增其互补链的模板。双链cDNA分子两条链的合成和/或扩增因而扩增了cDNA文库，在该文库中双链cDNA是其成分。
与需要体内核酸扩增的常规cDNA文库(如λ噬菌体中的cDNA文库)的扩增相比较，这种cDNA文库的扩增可在体外进行。此外，初始的cDNA文库可进行贮存并在理论上可用作模板进行无限次的文库扩增，尤其当固定到固体支持体上时。因为每一次文库扩增都用初始的cDNA文库作为模板，本发明cDNA文库的扩增减少或消除了cDNA文库中cDNA内含物的失真，其中后一cDNA文库是当初始cDNA文库用完之后用扩增的cDNA文库作为模板制备的。这种失真可归因于文库扩增中不同cDNA克隆之间不平衡的扩增效率。此外，本发明的cDNA文库和扩增这种文库的方法减少了构建cDNA文库所需的总RNA或mRNA的量、增加了样品的产出并减少了用户的操作。
a. 目标核酸和cDNA分子
用于提供合成单链核酸探针所需的模板的目标核酸可为任何目标核酸。它们包括但不局限于cDNA、基因组DNA、RNA和人工合成的核酸。除那些人工合成的之外的目标核酸可直接从目标核酸所源自的生物中分离。可选择地，它们可从核酸文库中或经过重组核酸技术制备。
在某些优选的实施方案中，目标核酸是与病原体生物相关的核酸和/或是病原体生物的特征性核酸，这些病原体生物例如是在生物学流体、组织、食物和水供应中发现的病原体细菌、病毒、霉菌、寄生物和真菌。能够提供用于合成单链核酸探针的目标核酸序列的示例性病原体细菌包括，但不局限于炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)、肉毒芽孢杆菌(Bacillus botulinus(Closrtidium botulinum))、痢疾志贺氏菌(Bacillus dysenterea)、肠炎芽孢杆菌(Bacillusenteritidis(肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis)))、Bacilluspneumoniae(Diplococcus pneumoniae、肠炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae))、破伤风芽孢杆菌(Bacillus tetani(破伤风梭菌(Closrtidium tetani)))、Bacillus typhosus(伤寒沙门氏菌(Salmonella typhosus))、包涵体结膜炎衣原体(Chlamydiaoculogenitalis)、产气荚膜梭菌(Closrtidium perfringens)、Hemophilus influenzae、百日咳嗜血菌(Hemophilus pertussis)、结核分支杆菌(Mycobacteria tuberculosis)、淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhoeae)、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、副痢疾志贺氏菌(Shigella paradysenteriae)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)、粪链球菌(Streptococcus faecalis)、溶血链球菌(Streptococcus hemolyticus)、缓症链球菌(Streptococcusmitis)、Streptococcus pyrogenes、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、逗号弧菌(Vibrio comma)、胎儿弧菌(Vibrio fetus)、空肠弧菌(Vibrio jejuni)、梅氏弧菌(Vibrio metchniKovii)和黑色弧菌(Vibrio niger)。能够提供用于合成单链核酸探针的目标核酸序列的包括反转录病毒的示例性病毒包括，但不局限于HSV-I、HSV-I、HIV、CMV、麻疹、脊髓灰质炎、乙型肝炎、丙型肝炎、流感等。具有每一个这些物种的特征的核酸序列都是本领域公知的且整体或部分适用于作为本发明方法中的目标核酸序列。
在某些其他的实施方案中，目标核酸是与植物、动物或人类疾病或病症相关或具有其特征的核酸序列。在一些其他的实施方案中，目标核酸是源自不具有目标疾病或病症的正常(或对照)植物、动物或人类的核酸序列。在另外其他优选的实施方案中，目标核酸是与植物或动物中的想要性状相关或具有其特征的，如疾病抗性和高的产量或畜牧产量。
在一些实施方案中，目标核酸是源自从目标生物或生物学样品分离的mRNA的cDNA。此外，这种cDNA也可用于根据本发明的方法制备和/或扩增cDNA文库。
分离mRNA和cDNA合成物的方法是本领域中众所周知的(参见如Sambrook等人，见上文；Chomczynski等人，Anal.Biochem.162：156，1987)。这种方法一般包含通过提取程序回收细胞、组织或样品裂解物和RNA。这些程序特别可通过用离液剂如硫氰酸胍处理并伴随以用溶剂如苯酚和氯仿的RNA提取而进行。它们可易于通过使用用于总RNA分离的商业上可购得的试剂盒如US73750试剂盒(Amersham)来实施。mRNA分子可用结合mRNA分子的poly(A)尾巴的oligo(dT)引物从总的细胞RNA中纯化(参见Jacobson，Metho.Enzymol.152：254，1987，在此处引入作为参考)。在这一点上，mRNA的制备可用商业上可购得的试剂盒如US72700试剂盒(Amersham)来实施。可选择地，可将随机引物(即具有随机序列的引物)用于从总细胞RNA中纯化mRNA(参见，Singh等人，Cell 52：415，1988；Vinson等人，Genes Dev.2：801，1988)。oligo(dT)引物或随机引物均可进行固定以促进mRNA的纯化。在某些其他的实施方案中，mRNA可直接从生物学样品中分离，而不首先分离总RNA。
然后可将分离的/纯化的mRNA用作模板以根据常规分子生物学技术通过反转录合成第一链cDNA(参见如Sambrook等人，见上文)。反转录通常是用反转录酶和引物进行的。
许多反转录酶已描述于文献中并是商业上可购得的(如1483188试剂盒，Boehringer)。示例性的反转录酶包括，但不局限于那些源自禽病毒AMV(禽类成髓细胞瘤病毒)、源自鼠类白血病毒MMLV(莫洛尼鼠类白血病毒)的、源自Yhermus flavus和Thermus thermophilusHB-8(Promega，目录号M1941和M2101)的。应用于这些酶的操作条件是本领域技术人员众所周知的。
用于反转录的引物可为各种类型的。它可为包含4～10个核苷酸的随机寡核苷酸，优选地为六核苷酸。这类随机引物的应用已描述于文献中并使得能够在RNA分子内的不同位点随机起始反转录。可选择地，可使用包含4～20-聚体的poly(dT)引物，优选地为15聚体。在某些实施方案中，用于分离mRNA的引物也用于cDNA合成。
第二链cDNA可用RNase H和DNA聚合酶合成。可选择地，它可通过首先使连接物序列与第一链cDNA分子进行连接并用第一链cDNA作为模板延伸与连接物序列互补的引物而合成。
合成的cDNA可在溶液中或连接到固体支持体上，例如，通过用于分离和合成cDNA的固定的引物。
b. 核酸连接物
本发明提供了用于合成单链核酸探针以及用于制备和/或扩增cDNA文库的核酸连接物。该连接物包含切割剂识别序列(NARS)，且包括或不包括切割位点(NS)。在某些实施方案中，该连接物进一步包含IIs型限制性内切核酸酶识别序列(TRERS)，该识别序列可位于NARS的任一侧。TRERS的存在使得能够生产特别适用于探测相似的短寡核苷酸阵列的相对短的寡核苷酸探针(如长度为15-20个寡核苷酸)。
为了扩增单链核酸分子，其中该单链核酸分子可用作核酸探针以探测目标核酸的存在或用作第一链cDNA模板以合成第二链cDNA，必须将本发明的连接物与目标核酸(包括cDNA分子或其片段)以某一方向连接，从而在不含有NS的连接产物链中，目标核酸片段位于NARS反义链序列的5’(参见如图29A-D，其中将NERS用作示例性的NARS)。这种排列方式是随后扩增探针以含有与目标核酸一条链的部分互补的序列所必需的，这是因为仅有由NA生成的NS的3’-OH可进行延伸且结果所得的延伸产物可进一步进行扩增。因而，连接物和目标核酸以其他方向的连接产物不能作为模板以扩增可与目标核酸进行杂交的核酸探针(参见如图29E-H，其中将NERS用作示例性的NARS)。
除连接物和NERS之间的定向连接之外，识别TRERS的限制性内切核酸酶(RE)的裂解位点也需要同时位于(1)目标核酸中和(2)相应于NS的位置的5’。TRERS的这种位置使得能够生产具有含有目标核酸的部分的5’突出端的部分双链核酸分子，该5’突出端由NA(生成相应于5’突出端的凹入的3’末端)和RE(生成5’突出端)生成。因而，当将该5’突出端用作模板以在NA和DNA聚合酶存在时合成单链核酸探针时，合成的探针含有与目标核酸的部分互补的序列。
在某些优选的实施方案中，NARS是可由在其识别序列之外进行切割的NE(如N.BstNB I)识别的切割性内切核酸酶识别序列(NERS)。在这种实施方案中，为了满足上述两个条件，从TRERS到识别TRERS的RE的切割位点的方向(由图29A-29D中在TRERS上部或下部的箭头表示)和从NERS到识别NERS的NE的NS的方向(由在NERS上部或下部的箭头表示)应该是相同的(图29A和29C)。
本发明的核酸连接物可通过本领域中公知的任何制备短的核酸片段的方法制备。例如，核酸连接物的每一条链均可单独合成并随后与其互补链退火。在某些实施方案中，核酸连接物可固定于固体支持体上。
c. 连接物和目标核酸之间的连接
如上所述，为了生产用于合成单链核酸探针的模板或制备和/或扩增cDNA文库，本发明的核酸连接物需要定向与目标核酸或cDNA分子或其片段进行连接，从而在结果所得的不含有NS的链中，目标核酸片段或cDNA分子或其片段位于NARS的5’。
在本发明中可使用任何用于定向将核酸连接物与另一个双链核酸片段进行连接的本领域中公知的方法。例如，如果目标核酸(包括cDNA分子或其片段)是固定于固体支持体上的，那么仅有目标核酸的一个末端能够与核酸连接物进行连接。目标核酸可用的末端和核酸连接物适当的末端(即自身或其连接产物含有NS的连接物链的3’末端)之间的定向连接可通过设计如下连接物而实现，该连接物与目标连接的末端为平端，而另一个末端具有3’或5’突出端。在其他末端中，3’或5’突出端的存在防止了该末端与目标核酸或cDNA或其片段的连接。
在某些实施方案中，目标核酸是通过用引物对核酸的扩增提供的。该引物可含有限制性内切核酸酶识别序列(RERS)，该序列用限制性内切核酸酶消化后可产生突出的末端。该突出的末端可与在目标核酸的适当末端有目的地设计的相容的突出末端进行连接。这些相容的突出末端使得目标核酸和核酸连接物之间能够定向连接。可选择地，参与目标和连接物之间连接的目标核酸的末端和核酸连接物的末端两者均为平端的，而目标的其他末端和连接物的其他末端是突出的，但相互不相容。两个突出末端之间的不相容性防止了目标和连接物在这些末端之间的连接。
在某些优选的实施方案中，用于合成单链核酸探针或用于扩增cDNA文库的模板核酸可通过目标核酸(包括cDNA分子或其片段)的末端或通过核酸连接物的末端进行固定。这种固定使得模板核酸能够易于与核酸扩增反应混合物(包括扩增的核酸分子)中的其他成分进行分离。固定的模板核酸因而可易于洗涤并贮存以备将来使用。
d. 单链核酸扩增
单链核酸扩增基本与上文对遗传变异探测方法的描述相同。此外，在某些实施方案中，由于扩增的单链核酸分子用作核酸探针，所以一般对它们进行标记以促进随后在核酸分析中的探测。适合于整合入核酸片段中的标记和随后探测片段的方法是本领域中公知的。示例性的标记和探测方法描述于上文遗传变异探测方法和目标核酸探测方法中。
在某些实施方案中，扩增的单链核酸是相对较短的(如长度为15-50个核苷酸)。如上所述，这种短的核酸分子一般是用含有TRERS的核酸连接物制备的。在其他的实施方案中，生产了较长的单链核酸分子(如长度为51-20,000个核苷酸)。为了扩增这种较长的单链核酸分子，可将链置换促进剂(如海藻糖)用于增强DNA聚合酶的链置换能力。
2. 用寡核苷酸引物制备单链核酸分子的方法
在某些实施方案中，本发明提供了用寡核苷酸引物制备单链核酸分子的方法。该方法基于本发明的以下发现，即对于某些切割剂，其切割活性仅需要其双链切割剂识别序列的有义链，而不是需要双链切割剂识别序列的两条链。目标核酸是单链的示例性方法如图43所示。本领域的技术人员可理解本发明的方法也可用于扩增双链目标核酸一条链的部分。
参见图43，以单链目标核酸的部分作为模板用寡核苷酸引物来扩增单链核酸分子。该引物从5’到3’包含三个区域：A区、B区和C区。B区由双链切割剂识别序列的有义链组成，而A区和C区是分别直接位于B区5’和3’的区域。寡核苷酸引物至少基本与目标核酸互补，从而在使得单链核酸能扩增的条件下，寡核苷酸引物能够与目标退火并在DNA聚合酶存在时从其3’末端进行延伸。结果所得的延伸产物可在识别双链切割剂识别序列的切割剂存在时进行切割，即使在寡核苷酸引物的B区有一个或多个不与目标核酸中的核苷酸形成常规的碱基对的核苷酸。“常规的碱基对”是根据标准的沃森-克里克模型(如G:C、A:T和A:U)在完全或部分双链核酸的一条链的核苷酸和该核酸另一条链的另一个核苷酸之间形成的碱基对。含有5’末端的切割产物如果是相对较短的(如不长于18个核苷酸)，则易于从目标核酸中解离，或由在切割位点含有3’末端的切割产物的延伸而置换。如果切割剂在其识别序列之外进行切割，那么延伸产物保留寡核苷酸引物的B区(即切割剂识别序列有义链的序列)且因而可由切割剂再次切割。上述切割-延伸的循环可重复多次，结果导致在切割位点含有5’末端的单链核酸分子的扩增。
在其中在B区和其在目标核酸中的相应区域之间有一个或多个错配的实施方案中，识别B区的切割剂的切割活性随着B区与其在目标中的相应区域之间错配数目的增加而降低。例如，N.BstNB I在切割包含其双链识别序列有义链的序列但在其识别序列与其在双链体相对链中的相应区域之间有一个错配的双链体时的活性约是在切割包含双链识别序列的双链体时的一半。当N.BstNB I切割如下双链体时其活性降低到最高水平的约10％～20％，该双链体包含其双链识别序列有义链的序列，但在另一条链中不具有任何与识别序列有义链中的任何核苷酸形成常规碱基对的核苷酸。
在某些实施方案中，也可使用在其识别序列内进行切割的切割剂，其中不与目标中的核苷酸形成常规的碱基对的B区的核苷酸位于B区中切割位点的5’。在寡核苷酸和目标之间形成的双链体被切割剂在B区中进行切割之后，可将切割位点的3’末端延伸以生成B区。这种再生使得能够重复切割-延伸循环。此外，B区与其在目标中的相应区域之间的错配必须不影响从切割位点3’末端的延伸。通常，切割位点和B区中不形成常规的碱基对的核苷酸之间的距离越长，错配对延伸的不利影响越小。
A区促进或使得寡核苷酸引物能够与目标核酸退火。此外，它促进或使得在切割位点含有3’末端的切割产物能够维持与模板的退火及在DNA聚合酶存在时从3’末端进行延伸。在某些实施方案中，A区长度最多为100个、75个、50个、25个、20个、15个、14个、13个、12个、11个、10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个或2个核苷酸。在一些实施方案中，在A区中可能有一个或多个核苷酸不能与目标核酸中的核苷酸形成常规的碱基对。
寡核苷酸引物可具有或不具有C区。在某些实施方案中，如果存在C区，则它长度最多为100个、75个、50个、25个、20个、15个、14个、13个、12个、11个、10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个核苷酸。C区与其在目标核酸中的相应区域之间可能有错配。然而，错配的存在仍然需要使得能够切割在寡核苷酸引物和目标之间形成的双链体或切割双链体的延伸产物。此外，错配的存在仍然需要使得在切割位点含有3’末端的切割产物能够在DNA聚合酶存在时从该末端延伸。如果C区包含可由识别B区的切割剂切割的切割位点，那么C区5’末端和切割位点之间的核苷酸通常可与目标中的核苷酸形成常规的碱基对。
在某些实施方案中，本发明的寡核苷酸引物优选地是在其5’末端固定的。在引物所附着的固相和引物的3’或5’末端之间可以有连接体。此外，可将多个寡核苷酸引物固定到单个固相上以产生寡核苷酸引物阵列。在不连续的位置的多个寡核苷酸引物可具有相同的序列。可选择地，它们在阵列的不同位置可具有不同的序列。这种阵列可用于扩增具有不同序列的多个单链核酸分子。在某些实施方案中，在阵列的不同位置进行的扩增反应是物理上分离的，如在平板的微孔中，从而在不同位置的扩增产物不相互混合并可单独表征。
本发明可用于用任何感兴趣的核酸作为目标核酸以扩增单链核酸。该目标核酸包括在上文用核酸连接物制备单链核酸和cDNA文库的部分中所描述的。在某些实施方案中，目标核酸以及样品中的其他核酸是固定的。
在某些实施方案中，其中想要的是合成相对较短的单链核酸，可首先对目标核酸进行酶促的、化学的或机械的裂解。相对较短的单链核酸包括那些具有最多200个、150个、100个、75个、50个、40个、30个、25个、20个、18个、16个、14个、12个、10个、9个、8个、7个、6个、5个或4个核苷酸的。酶促裂解可通过例如用识别目标核酸中特定序列的限制性内切核酸酶消化核酸分子而实现。可选择地，酶促裂解也可通过用识别核酸分子中特定序列的切割剂切割目标核酸而实现。酶促裂解也可为根据Szybalski(U.S.Pat.No.4,935,357)的寡核苷酸指导的裂解。化学和机械裂解可通过本领域中公知的适合于裂解核酸分子的任何方法如剪切来实现。裂解产物如果是双链的，则可首先变性并随后与上述寡核苷酸引物进行退火。
目标核酸酶促裂解和随后扩增与目标的部分互补的单链核酸的一个示例性的实施方案如图46所示。使包含双链切割剂识别序列有义链序列的寡核苷酸引物与单链目标核酸的第一个区域退火，而使部分双链的核酸与位于第一个区域5’的目标核酸的第二个区域退火。双链核酸分子在双链部分包含IIs型限制性内切核酸酶识别序列(TRERS)的双链识别序列和至少基本(优选地完全)与目标核酸第二个区域的部分互补的3’突出端。因为IIs型限制性内切核酸酶在其双链识别序列之外裂解核酸，所以部分双链的核酸分子可设计为在部分双链核酸分子的3’突出端和目标核酸的第二个区域之间形成的双链体内进行裂解。这种裂解产生用作模板以扩增单链核酸片段的较短的目标核酸片段。
上述实施方案可用于扩增与目标核酸的任何部分精确互补的单链核酸片段。因为寡核苷酸引物的B区中一个或多个核苷酸不需要与目标核酸的核苷酸形成常规的碱基对，所以引物可设计为与目标的任何区域退火。此外，上述实施方案可用于扩增任意长度的单链核酸分子。如上所述，目标核酸可在部分双链核酸分子的3’突出端所退火的部分进行切割。通过设计部分双链核酸分子的3’突出端，由识别部分双链核酸的TRERS的IIs型限制性内切核酸酶对目标核酸的裂解位点可位于目标的第一个区域任意远的距离。因而，用目标的一部分扩增的单链核酸可具有任何感兴趣的长度，其中该目标的一部分位于相应于可由识别B区的切割剂切割的切割位点的位置和IIs型限制性内切核酸酶裂解位点之间。
在某些实施方案中，其有义链存在于寡核苷酸引物的B区的双链切割剂识别序列可与双链TRERS相同。例如，寡核苷酸引物的B区可由切割性内切核酸酶N.BstNB I识别的序列“5’-GAGTC-3’”组成，而部分双链核酸分子中的TRERS可为可由IIs型限制性内切核酸酶PleI和Mly I识别的
5’-GAGTC-3’
3’-CTCAG-5’
在这种实施方案中，在寡核苷酸引物的B区和目标核酸中的相应区域之间需要有错配。换句话说，B区中的一个或多个核苷酸不与目标中的核苷酸形成常规的碱基对。错配的存在防止了识别TRERS的IIs型限制性内切核酸酶对双链体的裂解，其中该双链体为在寡核苷酸引物和目标的第一个区域之间形成的。
3. 制备单链核酸分子的试剂盒
本发明也提供了用于制备核酸分子或用于制备和/或扩增cDNA文库的试剂盒。这种试剂盒通常包含如上所述的核酸连接物、两个当退火时可产生核酸连接物的单链寡核苷酸或如上所述的寡核苷酸引物。它们进一步包含下面成分的至少一种、两种、几种或每一个：(1)识别核酸连接物中的NARS的切割剂(如NE或RE)和/或其缓冲液；(2)DNA聚合酶和/或其缓冲液；(3)dNTP(一些dNTP可为标记的)；(4)固定于固体支持体上的poly(dT)寡核苷酸引物；(5)反转录酶和/或其缓冲液；(6)DNA连接酶和/或其缓冲液；(7)微孔板或管；(8)链置换促进剂(如1M海藻糖)；和(9)使用试剂盒的说明书小册子。对许多成分的详细描述提供于上文及本发明描述其他试剂盒的相关部分。
4. 单链核酸分子和cDNA文库的应用
如在上文详细讨论的，本发明提供了制备单链核酸分子和制备和/或扩增cDNA文库的方法和组合物。这些分子和cDNA文库将用于广泛的应用中，在所述应用中确定样品中目标核酸的存在与否是必需的且需要比较两个核酸群体。这种应用包括，但不局限于对导致植物或动物中的传染病的或与食物安全相关的传染性生物的鉴定和/或表征，及对与植物、动物或人类中的疾病相关的或者与植物或动物中想要的性状相关的基因的鉴定和/或表征，该性状如高的作物产量、增加的疾病抗性和高的营养值。
例如，本发明的核酸分子或探针可为对源自病原体(如病毒、细菌、真菌或寄生物)的核酸特异性的，并因而可用于确定目标生物学样品中病原体的存在与否。可选择地，它可特异于已知与特定性状(如疾病抗性或易感性)相关的基因，并因而可用于预测从其中获得样品的特定被试者具有特定性状的可能性。
此外，本发明也提供了同时制备多个核酸分子或探针的方法，如那些目标核酸是特定cDNA群体的。这些分子或探针可用于与根据本发明制备的含有另一个cDNA群体的表达阵列或cDNA文库进行杂交，以确定两个cDNA群体共有的cDNA分子和那些存在于一个群体中但不存在于其他群体中的cDNA。这种确定有助于鉴定和/或表征与一定性状相关的核酸分子，该性状仅由从其中分离了某个cDNA群体的一个生物具有，而不由从其中制备了其他cDNA群体的其他生物具有。
E. 信使RNA前体可变剪接的探测
在一方面，本发明提供了探测mRNA可变剪接存在与否的方法、化合物和试剂盒。
1. 探测信使RNA前体可变剪接的方法
本发明提供了探测mRNA分子或cDNA分子中基因的上游外显子(称为“Exon A”)和下游外显子(称为“Exon B”)之间连接存在与否的方法。该方法利用ODNP对合成用于扩增单链核酸片段的模板核酸。该ODNP对可包含下面两个ODNP：包含与在反义链中靠近Exon A的5’末端的Exon A反义链的部分互补的序列的第一个ODNP，和包含与在有义链中靠近Exon B的5’末端的Exon B有义链的部分互补的序列的第二个ODNP。此外，ODNP对的至少一个ODNP必需进一步包含切割剂识别序列(NARS)有义链的序列。然后使ODNP对与目标cDNA在一定条件下组合，如果Exon A和Exon B均存在于cDNA中，则该条件产生了由第一个ODNP和第二个ODNP包围的片段。然后将延伸产物用作模板在DNA聚合酶和识别NARS的切割剂(NA)存在时扩增单链核酸片段。然后对该扩增的核酸片段进行表征以确定Exon A和Exon B之间是否存在连接。
如在此处所用的，cDNA分子的“有义链”指与mRNA分子(除了mRNA中的核苷酸“U”被cDNA分子中的核苷酸“T”替代之外)具有相同序列的链，其中cDNA分子是源自该mRNA的。另一方面，cDNA分子的“反义链”指与cDNA分子所源自的mRNA分子互补的链。
目标cDNA分子指源自目标基因的cDNA分子。换句话说，它是对从目标基因转录所得的mRNA分子的反转录的产物。目标cDNA可具有部分的序列(即从部分的mRNA分子反转录的)，但优选地为全长的序列。
如在此处所用的，“外显子”是在成熟RNA产物中代表的间断基因的任何区段。“内含子”指转录的但通过同时将其两侧的序列(外显子)剪接在一起而从转录物中去除的DNA区段。
当Exon A有义链的序列位于Exon B有义链的序列的5’时，则认为外显子(Exon A)是相同基因中另一个外显子(Exon B)“上游”的。Exon A和Exon B分别可进一步称为上游外显子和下游外显子。
由第一个ODNP和第二个ODNP包围的核酸片段指这样一种双链核酸片段，其一条链由第一个ODNP的序列、第二个ODNP的互补序列和第一个ODNP和第二个ODNP互补序列之间的序列组成；而另一条链由第一ODNP的互补序列、第二个ODNP的序列和第一个ODNP的互补序列和第二个ODNP的序列之间的序列组成。
“差异剪接”也称为“可变剪接”，是从相同的基因转录物中产生至少两个不同的mRNA分子。例如，转录物中的特定区段可存在于一个mRNA分子中，但可从其他mRNA分子中剪接掉。
除探测两个特定外显子之间的连接之外，本发明也提供了在cDNA分子或cDNA群体中探测基因的任何两个外显子之间的每一个潜在连接存在与否的方法。为了描述的方便性，假定基因含有n个外显子(n是等于或大于2的整数)，其中Exon A是最上游的外显子，而Exon N是最下游的外显子(图31)。本发明的方法利用下面两套ONDP以制备用于扩增单链核酸片段的模板核酸分子：(1)包含n-1个分别相应于除Exon N之外的一个外显子的ODNP的第一套ODNP，每一个ODNP包含与靠近有义链中相应外显子的5’末端的该相应外显子有义链的部分互补的序列，和(2)包含n-1个分别相应于除Exon A之外的一个外显子的ODNP的第二套ODNP，每一个ODNP包含与靠近反义链中相应外显子的5’末端的该相应外显子反义链的部分互补的序列。此外，至少一套ODNP的每个ODNP进一步包含NARS。
在本发明的方法中，将上述两套ODNP与要表征的目标cDNA分子或含有该目标cDNA分子的cDNA群体组合并随后进行延伸以生产由来自第一套ODNP的一个ODNP和来自第二套ODNP的另一个ODNP包围的片段。然后将结果所得的延伸产物用作模板以在DNA聚合酶和识别NARS的切割剂存在时合成单链核酸片段。对扩增的单链核酸片段进行探测和/或表征以借此确定每一个潜在连接的存在与否。
cDNA群体中基因的任何两个外显子之间的每一个潜在连接是否存在的信息可用于探测cDNA群体中基因的可变剪接。对于基因的任何一个外显子，如果在外显子的至少一个末端存在超过一个类型的连接，则显示基因的mRNA在该外显子的该末端是差异剪接的。
此外，相似的方法可用于探测两个生物学样品之间基因的可变剪接。对来自每一个生物学样品的cDNA分子或cDNA群体中基因的任何两个外显子之间的每一个潜在连接的存在与否进行鉴定并随后进行比较。在这两个生物学样品之间的任何特定外显子连接中存在任何差异则显示从该基因转录的mRNA在两个样品之间是可变剪接的。
此外，本领域的技术人员将理解上述方法可进一步多重化以探测cDNA群体中或两个生物学样品之间多个基因的转录物的可变剪接。
a. 生物学样品和cDNA分子或群体
本发明的生物学样品包括源自生物的且可含有目标mRNA分子的任何样品。特别地，生物学样品可为任何细胞、器官、组织、活体解剖材料等。感兴趣的是源自哺乳动物(尤其是人类)、植物、细菌和低等真核细胞如酵母、真菌细胞的样品。示例性生物学样品包括，但不局限于癌症活体解剖、神经退行性斑点、展示神经退行性迹象的大脑区带活体解剖、皮肤样品、血液细胞样品、结肠直肠活体解剖等。示例性的细胞包括肌细胞、肝细胞、成纤维细胞、神经细胞、表皮细胞和真皮细胞、血液细胞如B-、T-淋巴细胞、肥大细胞、单核细胞、粒细胞和巨噬细胞。
如上所述，在某些实施方案中，对来自两个不同的生物学样品的cDNA分子或群体进行了比较以探测这些样品之间的mRNA差异剪接。对于这种比较，一个样品可来自怀疑具有或有可能具有遗传疾病或病原体感染的被试者，而另一个样品可为健康的对照被试者。可选择地，这两个样品可来自不同发育时期的相同生物学来源。在某些实施方案中，一个样品可来自具有想要的性状(如疾病抗性)的被试者，而其他的可来自不具有这一性状的被试者。在其他实施方案中，一个样品来自已用化学药物(如药物或毒性材料)处理过的被试者，而其他的来自未处理的对照被试者。
要表征的cDNA分子可源自任何目标mRNA分子。在某些优选地实施方案中，相应于cDNA的基因是与疾病或病症相关的，特别是人类疾病或病症。在其他优选的实施方案中，该基因是与该基因所源自的生物的想要性状相关的。在另外其他优选的实施方案中，该基因参与被试者的发育，其中该基因是从该被试者中分离的。在一些实施方案中，该基因参与它所源自的生物对外部刺激(如光、药物和应激处理)的反应。
在某些实施方案中，cDNA分子是固定于固体支持体上的。固定cDNA分子的方法是本领域中公知的。例如，cDNA分子可通过在其合成中使用的固定引物进行固定。
可分离目标mRNA分子且相应的cDNA可根据本领域中公知的常规方法进行合成(参见上文制备单链核酸探针的“目标核酸”部分)。要表征的cDNA分子可为部分长度的，然而优选地为全长的。全长的cDNA分子可通过用cDNA分子的部分作为探针用常规方法筛选cDNA文库而分离(参见Sambrook等人，见上文)。可选择地，可将基于PCR的方法用于这种筛选(Wilfinger等人，BioTechniques 22：481-486，1997)。
b. 双链模板核酸的制备
如上所述，本发明提供了探测信使RNA前体可变剪接的方法，包括对在cDNA分子或cDNA群体中基因的特定外显子的末端和在cDNA分子或cDNA群体中基因的每一个外显子的每一个末端的可变剪接的探测。此外，本发明的方法可多重化以同时探测cDNA群体中多个目标基因中的每一个基因的特定(或每一个)外显子的特定(或每一个)末端的可变剪接。
本发明的方法使用ODNP对或两套ODNP生产双链核酸片段(在此处称为“模板核酸片段”)，该双链核酸片段包含与特定外显子-外显子连接侧面相接的目标DNA分子的核苷酸序列。此外，模板核酸片段进一步包含NARS，这使得在DNA聚合酶和识别NARS的NA存在时能够扩增单链核酸片段。此外，识别NARS的NA的切割位点(NS)位于特定外显子-外显子连接的5’，从而扩增的单链核酸片段含有与外显子-外显子连接侧面相接的核苷酸序列。然后对扩增的单链核酸片段进行了表征。因为依赖于外显子-内含子连接的同源性可对每一个外显子分配一个特异性末端，所以本领域的技术人员能够预测与每一个潜在的外显子-外显子连接侧面相接的序列。扩增的单链核酸片段的特征与预测的与外显子-外显子连接侧面相接的序列的特征的比较使得能够确定特定的外显子-外显子连接是否存在于目标cDNA分子或目标cDNA群体中。
i. 寡核苷酸引物(ODNP)的设计
本发明用于扩增含有目标cDNA的特定的外显子-外显子连接的单链核酸片段的模板核酸可通过首先用特定设计的ODNP扩增目标cDNA的片段而提供。因此，在一方面，本发明提供了用于生产上述模板核酸的ODNP对。
在某些实施方案中，ODNP对包含下面两个ODNP：(1)包含与靠近反义链中Exon A的5’末端的Exon A反义链的部分互补的第一个ODNP，和(2)包含与靠近有义链中Exon B的5’末端的Exon B有义链的部分互补的第二个ODNP。第一个ODNP和Exon A反义链的部分之间的互补不必是精确的，但必须足以使得ODNP能够特异性地与Exon A的该部分退火。同样地，第二个ODNP和Exon B有义链的部分之间的互补不必是精确的，但必须足以使得ODNP能够特异性地与Exon B的该部分退火。第一个ODNP和Exon A及第二个ODNP和Exon B之间的这种互补使得如果在cDNA中存在Exon A和Exon B之间的连接，则能够扩增与该连接侧面相接的序列。如果外显子链的一个部分在该链末端的距离在100个、90个、80个、70个、60个、50个、40个、35个、30个、25个、20个、15个或10个核苷酸之内，则认为该部分靠近外显子的该末端。ODNP对的两个ODNP之间的这种间隔排列使得能够扩增被ODNP对包围的相对短的片段。
除ODNP对的每一个ODNP和其相应外显子的一条链之间的序列互补之外，第一个ODNP或第二个ODNP必须进一步包含NARS有义链的序列。在某些优选的实施方案中，第一个ODNP和第二个ODNP均进一步包含NARS。NARS的存在使得由第一个ODNP和第二个ODNP包围的扩增的核酸片段能够充当模板核酸以在DNA聚合酶和识别NARS的NA存在时扩增单链核酸片段，如在下文详细描述的。
其一条链存在于ODNP中的NARS可为各种类型的。例如，它可为限制性内切核酸酶识别序列(RERS)。可选择地，它可为切割性内切核酸酶识别序列(NERS)。如果NARS是RERS，模板核酸的扩增一般是在修饰的脱氧核苷三磷酸存在时进行的，从而扩增的模板含有半修饰的RERS，而不是由天然核苷酸组成的RERS。半修饰的RERS的存在使得能够由识别RERS的限制性内切核酸酶切割模板的仅仅一条链。如果NARS是NERS，那么ODNP中NERS有义链的序列需要以一定的方向存在，从而由识别NERS的NE产生的切割位点位于Exon A和Exon B之间连接的5’。这种排列使得随后扩增的单链核酸片段能够包含与Exon A和Exon B之间的连接侧面相接的序列，如在下文详细描述的。在一些实施方案中，其中仅有ODNP对的一条链含有NERS有义链的序列，不含有NERS序列的其他ODNP可包含RERS一条链的序列。在这些实施方案中，模板核酸的扩增是在不存在任何修饰的脱氧核苷三磷酸时进行的，从而扩增的模板核酸片段中的RERS不是半修饰的。RERS优选地是由IIs型限制性内切核酸酶识别的。这种RERS的存在使得能够生产相对较小的单链核酸片段以用作模板进行随后对单链核酸片段的合成。相对较小的核酸片段的生产可通过用识别RERS的IIs型限制性内切核酸酶消化扩增的模板核酸片段而实现，该扩增的模板核酸片段由ODNP对的两个ODNP包围。
本发明也提供了用于探测cDNA分子或cDNA群体中基因的任何两个外显子之间的每一个潜在连接存在与否的ODNP套。为了方便描述ODNP套，假定目标基因含有n个外显子，其中n是等于或大于2的整数，且最上游的外显子和最下游的外显子分别表示为Exon A和Exon N。下面两套ODNP可用于制备模板核酸，该模板核酸含有存在于要表征的cDNA分子或cDNA群体中的基因的所有外显子-外显子连接：(1)包含n-1个分别相应于除Exon A之外的一个外显子的ODNP的第一套ODNP，每一个ODNP包含与靠近有义链中相应外显子的5’末端的相应外显子有义链的部分互补的序列，和(2)包含n-1个分别相应于除Exon N之外的一个外显子的ODNP的第二套ODNP，每一个ODNP包含与靠近反义链中相应外显子的5’末端的相应外显子反义链的部分互补的序列。第一套中每一个ODNP和相应外显子有义链的部分之间的互补不必是精确的，但必须足以使得每一个ODNP能够特异性地与相应外显子的互补部分退火。同样地，第二套中每一个ODNP和相应外显子反义链的部分之间的互补不必是精确的，但必须足以使得每一个ODNP能够特异性地与相应外显子的互补部分退火。两套中每一个ODNP及其相应外显子之间的这种互补使得能够扩增这样一种序列，该序列与存在于要表征的cDNA分子或cDNA群体中的基因的每一个外显子-外显子连接侧面相接。
除两套ODNP的每一个ODNP和相应外显子一条链之间的序列互补之外，用第一套的一个ODNP和第二套的另一个ODNP作为引物及用源自目标基因的cDNA分子作为模板合成的每一个片段必须含有NARS，包括但不局限于NERS或半修饰的RERS。在某些优选的实施方案中，第一套的每一个ODNP或第二套的每一个ODNP均含有NARS有义链的序列。在一些其他优选的实施方案中，第一套和第二套的每一个ODNP均含有NARS。
与其一条链存在于用于探测特定外显子-外显子连接的存在与否的ODNP对中的NARS相似，其一条链存在于ODNP套中的NARS也可有各种形式。例如，它可为限制性内切核酸酶识别序列(RERS)。可选择地，它可为切割性内切核酸酶识别序列(NERS)。如果NARS是RERS，那么模板核酸的扩增一般是在修饰的脱氧核苷三磷酸存在时进行的，从而扩增的模板含有半修饰的RERS而不是由天然核苷酸组成的RERS。如果NARS是NERS，那么ODNP中NERS有义链的序列需要以一定的方向存在，从而由识别NERS的切割性内切核酸酶产生的切割位点位于外显子-外显子连接的5’。这种排列使得随后扩增的单链核酸片段能够包含与外显子-外显子连接侧面相接的序列。在一些实施方案中，其中仅有一套ODNP的ODNP含有NERS有义链的序列，不含有NERS序列的其他套的ODNP可包含RERS一条链的序列。在这些实施方案中，模板核酸的扩增是在不存在任何修饰的脱氧核苷三磷酸时进行的，从而扩增的模板核酸片段中的RERS不是半修饰的。RERS优选地是由IIs型限制性内切核酸酶识别的。这种RERS的存在使得能够通过用识别RERS的IIs型限制性内切核酸酶消化由第一套的一个ODNP和第二套的另一个ODNP包围的扩增的模板核酸片段而生产相对较小的核酸片段。生产的该相对较小的核酸片段可用作模板以合成包含与外显子-外显子连接侧面相接的序列的短的单链核酸片段。合成的片段的较短长度促进了由某些分离和分析技术对其进行的探测和/或表征。
设计序列特异性引物的通用技术是众所周知的且也在上文描述于本发明的遗传变异探测方法中。
ii. 核酸杂交、延伸、扩增和消化
使上述ODNP对或套与目标cDNA分子或含有目标cDNA分子的cDNA群体在一定条件下组合，该条件使得ODNP能够与其在cDNA分子中的互补序列特异性地退火。确定并提供这种条件是在本领域技术人员的技术范围内的。示例性的条件也提供于描述本发明的遗传变异探测方法的杂交部分和实施例中。
在退火后，利用本领域公知的及描述于本发明的遗传变异探测方法相关部分的各种方法，使ODNP进行延伸以产生由两个ODNP包围的且包含目标cDNA分子的一部分的片段。为了确定特定外显子-外显子连接(如上游Exon A和下游Exon B之间的连接)的存在与否，目标cDNA必须包含Exon A和Exon B两者以从与Exon A的部分互补的ODNP(称为“第一个ODNP”)和与Exon B的部分互补的ODNP(称为“第二个ODNP”)两者开始延伸(图30A和30B)。如果在目标cDNA分子中存在Exon A和Exon B之间的连接，则将扩增含有Exon A和Exon B之间连接的并且由第一个ODNP和第二个ODNP包围的小片段图30A)。如果在目标cDNA分子中不存在Exon A和Exon B之间的连接，但ExonA和Exon B两者均存在(即在Exon A和Exon B之间存在额外的区段)，那么将扩增除Exon A和Exon B之外还含有额外区段的并且由第一个ODNP和第二个ODNP包围的大片段(图30B)。
为了确定目标cDNA分子或含有目标cDNA分子的cDNA群体中目标基因的任何两个外显子之间的每一个潜在连接的存在与否，将两套上述的ODNP进行延伸以产生各种模板核酸片段。因为两套ODNP共同含有能够与目标cDNA分子的每一条链在靠近每一个外显子的5’末端进行退火的ODNP，该外显子可与该链中的另一个外显子连接，所以扩增的模板核酸片段含有目标cDNA分子中的所有外显子-外显子连接。
上述观点可进一步通过参考图31而解释。图31A阐明了含有n个外显子的示例性目标基因，其中Exon A是最上游的而Exon N是最下游的。图31B和31C阐明了由目标基因的相同转录物的可变剪接产生的两个cDNA分子(“目标cDNA I”和“目标cDNA II”)。特别地，Exon B存在于目标cDNA I中，但不存在于目标cDNA II中，在目标cDNA II中Exon A和Exon C直接连接在一起。当使两套特定地对如上所述的目标基因设计的ODNP与目标cDNA I在使得ODNP能够与其相应外显子中的互补序列退火的条件下组合时，可产生由第一个ODNP(该ODNP与靠近反义链中Exon A的5’末端的Exon A反义链退火)和第二个ODNP(该ODNP与靠近有义链中Exon B的5’末端的Exon B有义链退火)包围的核酸片段(称为“模板1-2”)，和由第三个ODNP(该ODNP与靠近反义链中Exon B的5’末端的Exon B反义链退火)和第四个ODNP(该ODNP与靠近有义链中Exon C的5’末端的Exon C有义链退火)包围的核酸片段(称为“模板3-4”)以及由其他ODNP对包围的片段。这些片段包含含有外显子-外显子连接的目标cDNA I的部分。换句话说，每一个片段均包含与特定外显子-外显子连接侧面相接的序列。另一方面，当使两套特定地对根据本发明的目标基因设计的ODNP与目标cDNA II组合以使得ODNP能够与其相应外显子中的互补序列退火，从而可产生由第一个ODNP和第四个ODNP包围的核酸片段(称为“模板1-4”)以及由其他ODNP对包围的片段。由于目标cDNA II中不存在Exon B，所以不能产生模板1-2和模板3-4。然而，因为在Exon A和Exon B之间或Exon B和Exon C之间没有连接，所以模板1-2和模板3-4的不存在不与如下观点相矛盾，即用本发明的两套ODNP作为引物和用目标cDNA分子作为模板的扩增产物共同含有存在于目标cDNA分子中的所有外显子-外显子连接。
扩增反应混合物中多个ODNP的存在可能导致从一个给定的引物得到多个产物。例如，在图32B中，除用第二个ODNP扩增模板1-2之外，第一个ODNP也可与来自第一套ODNP的其他ODNP(如第四个ODNP)配对以扩增较大的核酸片段(如包含Exon A的部分、全长Exon B和ExonC的部分的模板1-B-2)。然而，因为较小的片段比较大的片段更有效地扩增，所以随着扩增循环的增加，模板1-2分子比其他较大的模板分子更快的累积。
如上所述，在某些实施方案中，其一条链存在于本发明的ODNP中的NARS是NERS。在某些实施方案中，为了获得含有半修饰的RERS的模板核酸，使ODNP在修饰的脱氧核苷三磷酸存在时进行延伸。适当的修饰的脱氧核苷三磷酸和在这些修饰的脱氧核苷三磷酸存在时核酸片段的扩增是本领域中公知的并也描述于本发明遗传变异探测方法的相关部分中。
如在上文所讨论的，在某些其他的实施方案中，一套ODNP的每一个ODNP包含NERS有义链的序列，而另一套ODNP的每一个ODNP包含RERS一条链的序列。当这两套ODNP用作引物以在不存在任何修饰的脱氧核苷三磷酸时合成含有与外显子-外显子连接在侧面相接的序列的模板核酸片段时，结果所得的模板核酸含有NERS和RERS两者。这些模板核酸可用识别RERS的限制性内切核酸酶消化并在模板核酸的两条链进行裂解。这种消化产生了较小的模板核酸并因此使得当将较小的模板核酸用作上述扩增的模板时能够扩增较短的单链核酸片段。
c. 单链核酸片段的扩增和探测
将上述模板核酸用作模板以在切割剂和DNA聚合酶存在时扩增单链核酸片段，该切割剂识别用于合成模板的ODNP中的NARS。这种扩增基本如上文对遗传变异探测方法的描述。随后对结果所得的单链核酸片段进行表征以确定目标cDNA分子或含有目标cDNA分子的cDNA群体中特定外显子-外显子连接的存在与否。
如上所述，在将两套ODNP用于合成模板核酸的实施方案中，尽管大多数合成的模板核酸仅含有一个外显子-外显子连接，但一些模板核酸含有超过一个外显子-外显子连接(如图31B中的模板1-B-2)。在扩增单链核酸的反应混合物中这些相对长的模板的存在可导致比那些使用仅含有一个外显子-外显子连接的模板所得到的更长的单链核酸的扩增。在某些实施方案中，这些较长的单链核酸的扩增可在一定条件下消除或减少，该条件抑制或阻止相对长的单链核酸的扩增。例如，缺乏链置换活性的DNA聚合酶可用于仅扩增短的单链核酸分子。链置换活性的缺乏阻止了DNA聚合酶从由切割剂产生的切割位点的3’末端的扩增，其中在切割位点含有5’末端的切割的链的部分仍然与其未切割的链的互补序列退火。仅当在切割位点含有5’末端的切割的链的部分相对短(如含有少于17个核苷酸)，从而它可易于从其互补链解离时，它才可在切割剂存在时用不具有链置换活性的DNA聚合酶进行扩增。
从仅含有一个外显子-外显子连接的模板核酸扩增的单链核酸分子优选地长度最多为约100个、90个、80个、70个、60个、50个、40个、35个、30个、25个、20个、25个、10个、8个、6个、4个或2个核苷酸，且可用本领域中公知的适合于探测或表征小的单链核酸分子的任何方法进行探测和/或表征。示例性的方法在上文本发明的遗传变异探测方法和目标核酸探测方法的相关部分描述。随后将扩增的单链核酸片段的特征(如通过质谱分析获得的质荷比)与预测的单链核酸片段的特征进行比较，该预测的单链核酸片段的特征是根据用于制备模板核酸片段的ODNP的位置和组成并假设存在两个外显子(与ODNP互补)之间的连接而预测的。如果扩增的和预测的核酸片段的特征是相同的，那么假定存在于目标cDNA分子中的特定外显子-外显子连接事实上存在于该目标cDNA分子中。对将扩增的单链核酸片段的序列和特征(如质荷比)的预测基于对靠近外显子-内含子连接(也称为“剪接连接”)的一致序列的知识。该知识使得本领域的技术人员能够查明外显子-内含子连接并因而预测当将两个外显子之间的内含子剪接掉时外显子-外显子连接的精确位置。
2. 用于信使RNA前体差异剪接探测的试剂盒
本发明也提供了用于探测信使RNA前体差异剪接的试剂盒。这种试剂盒通常包含上述ODNP对，如果外显子-外显子连接存在于目标cDNA分子时，该ODNP对可用于制备含有与该连接侧面相接的序列的模板核酸。它们也可进一步包含下面成分的至少一种、两种、几种或每一种：(1)识别ODNP对的至少一个引物中的切割剂识别序列(NARS)的切割剂(如NE或RE)；(2)切割剂(1)的缓冲液；(3)识别存在于ODNP的至少一个引物中的RERS的RE；(4)RE(3)的缓冲液；(5)用于制备模板核酸的DNA聚合酶(即从上面ODNP对的3’末端延伸)；(6)DNA聚合酶(5)的缓冲液；(7)用于扩增单链核酸片段的DNA聚合酶；(8)DNA聚合酶(7)的缓冲液；(9)dNTPs；(10)修饰的dNTP；(11)用于扩增模板核酸的对照模板和/或对照寡核苷酸引物；(12)层析柱；(13)层析柱的缓冲液A；(14)层析柱的缓冲液B；(15)水；(16)链置换促进剂(如1M海藻糖)；(17)微量滴定板或微孔板；(18)寡核苷酸标准(如6聚体、7聚体、8聚体、12聚体和16聚体)；(19)使用试剂盒的说明书小册子；和(20)用于设计和/或定购ODNP对的软件存取码。许多上述成分的详细描述在上文提供。
3. 信使RNA前体差异剪接探测方法的应用
信使RNA的可变剪接是高等真核生物中调节基因表达的重要机制。根据最近的估计，～30％的人类基因的原初转录物要进行可变剪接，通常在正常的发育中以特定的空间/时间模式进行调节。在复杂的基因中，可变剪接从单个转录物可生成数十个或甚至数百个不同的mRNA同种型(Breitbart和Nadal-Ginard，Annu.Rev.Biochem.56：467-95，1987；Missler和Sudhof，Trends Genet 14：20-6，1998；Gascard等人，Blood 92：4404-14，1998)。在许多情况下可变剪接的外显子编码在功能上对于催化活性或结合相互作用重要的蛋白质结构域，结果所得的蛋白质可展示不同的甚至拮抗的活性。
如在上文更详细描述的，本发明提供了探测信使RNA前体可变剪接的方法、组合物和试剂盒，包括对在cDNA分子或cDNA群体中基因的特定外显子的末端及在cDNA分子或cDNA群体中基因的每一个外显子的每一个末端的可变剪接的探测。由于信使RNA前体剪接的重要性，这些方法、组合物和试剂盒将用于广泛的应用中，如疾病诊断、诱因和治疗、作物培养和动物育种、植物和动物的发育调节、药物开发和生物对外部刺激(如极端的温度、毒物和光)的反应的操作。
例如，本发明可用于鉴定和/或表征对病理学状况唯一的信使RNA前体剪接模式。许多基因的异常信使RNA前体剪接出现于各种疾病或病症中，尤其是在癌症中。在小细胞肺癌中，属于成视网膜细胞瘤蛋白质家族的蛋白质p130的基因是在一致的剪接位点突变的。该突变导致外显子2的去除和由于过早的终止密码子的存在而导致的蛋白质合成的缺乏。同样地，在某些非小细胞肺癌中，蛋白质p161NK4A的基因是在供体剪接位点突变的，该基因是细胞周期蛋白依赖性激酶cdk4和cdk6的抑制物。该突变导致截断的短半衰期的蛋白质的产生。此外，维耳姆斯氏瘤抑制基因WT1可转录为几个由可变剪接形成的信使RNA。在乳腺癌中，与健康组织相比，不同变体的相对比例被修饰了，因此产生了对理解WT1的各个功能结构域在肿瘤进程中的重要性的诊断工具或认识。在神经元纤维(neurofibrin)NF1中也发现了影响细胞转化过程中不同mRNA形式和蛋白质同种型之间比例的相似的改变过程。此外，在头和颈癌症中，p53失活的一个机制涉及在一致剪接位点上的突变。此外，IRF-1肿瘤抑制基因转录物的改变的剪接模式导致了肿瘤抑制物的失活，且IRF-1 mRNA中外显子跳越(skipping)的加速是许多造血紊乱的指示，包括骨髓异常增生综合症的overt leukemia、急性骨髓白血病和骨髓异常增生综合症(U.S.Pat.No.5,643,729)。
本发明的方法可用于已知或怀疑与疾病(或病症)状况相关的基因转录物的剪接模式，并用于鉴定其存在与否特异于疾病(或病症)状况的外显子，或用于鉴定特异于疾病(或病症)状况的不同剪接变体中的比例的改变。对不存在于疾病(或病症)状况中的外显子的鉴定显示由该外显子编码的结构域对于健康细胞的正常功能是重要的，且涉及该结构域的信号转导途径可为了治疗而进行恢复。另一方面，对特异地存在于疾病(或病症)状况中的外显子的鉴定可用作诊断工具，且其编码的结构域可作为筛选低分子量化合物的靶标，其中该低分子量的化合物用于拮抗由该结构域介导的信号转导。此外，与这些结构域有特异性亲和力的抗体也可用作对该疾病(或病症)状况的诊断工具。
本发明的方法也可用于鉴定和/或表征生物发育中重要的信使RNA前体的差异剪接。可变剪接在果蝇的性别确定、人类的抗体反应和其他组织或发育阶段特异性的过程中起重要的作用(Chabot，TrendsGenet.12：472-8；Smith等人，Annu.Rev.Genet.23：527-77，1989；Breitbart等人，Gell 49：793-803，1987)。因而，本发明的方法可用于比较已知或怀疑参与不同发育阶段的发育调节的基因的信使RNA剪接模式。对基因中差异剪接是否存在的鉴定和/或表征可提供调节相应的发育过程以获得想要的性状的指南(如更大的果实、更高蛋白质或油含量的种子、更高的奶产量)。
本发明的方法也可用于鉴定和/或表征在生物对各个外部刺激的反应中重要的信使RNA前体差异剪接。可将已知或怀疑在对特定刺激(如病原体攻击)的反应中起重要作用的未处理的生物的基因的信使RNA前体剪接模式与受到刺激的生物的进行比较。特异于受到刺激的生物的剪接模式的鉴定和/或表征可提供操作相应的反应过程以增强(如果该反应是想要的)或减少/消除(如果该反应是不想要的)该反应的指导。
下面的实施例是以阐明而不是限制的方式提供的。
                       实施例
                      实施例1
用电喷射-液相层析/质谱分析法对寡核苷酸片段的探测
本实施例公开了应用电喷射-液相层析/质谱分析法(ES-LC/MS)确定长度为4个、6个、8个和10个核苷酸的单链寡核苷酸(ODN)片段的分子量(表3)。
寡核苷酸(ODN)是用Midland TX的Midland Certified试剂合成的。将ODN在0.01M Tris-HCl、0.1mM EDTA中稀释到0.5nm/μl的浓度以生成贮存液。随后将每一个ODN的贮存液在纯化的水中稀释1∶10、1∶100和1∶1000。将5微升的每一种溶液注射入电喷射-液相层析/质谱分析法-飞行时间(ES-LC/MS-TOF)系统中，该系统使用负离子全扫描，锥体＝35伏，原料在100℃，去溶剂化在250℃，使用Xterra柱，C8，2.1×50mm，流速为300μl/分，直接，等度在水、甲醇+0.05％TEA中运行。
层析是用下面的系统进行的：包含两个泵、一个柱烤箱、一个UV探测仪、一个脱气装置、一个混合器和一个自动注射器的ProStarHelix System(目录号Helixsys01)。该柱子为Varian Microsorb MV(目录号R0086203F5)，以5μM的颗粒大小填充的C18，300埃的孔大小，4.6mm×50mm。柱子是在30℃～40℃以在100mM乙酸三乙胺(TEAA)和0.1mM的EDTA中的乙腈梯度运行的。将下面的HPLC方法用于在柱子上分离片段：缓冲液A是100mM的TEAA和0.1mM的EDTA，缓冲液B是100mM的TEAA和0.1mM的EDTA和25％(V/V)的乙腈，在0-3分钟梯度为20％B～25％B，在3.01分钟～4分钟梯度升至45％B，在4.01～4.5分钟梯度升至95％B，在4.51分钟维持20％B1分钟以重新平衡柱子。通过将柱烤箱调节至40℃而使柱子运行于40℃。流速为每分钟1.5ml。每10μl的体积注射入约200纳克片段。UV探测仪测量柱子的流出液。
                                   表3
                        ODN和相应序列和分子量
ODN        序列               长度      分子量(道尔顿)   SEQ ID NO.
Fok0001    5’-ACGA-3’                4-聚体     1181Da          SEQ ID NO：1
Fok0002    5’-ACGATG-3’            6-聚体     1816Da          SEQ ID NO：2
Fok0003    5’-ACGATGCA-3’        8-聚体     2418.6Da        SEQ ID NO：3
Fok0004    5’-GAACATCCAT-3’    10-聚体    2996Da          SEQ ID NO：4
在表3中详细描述的ODN的分子量是用ES-LC/MS确定的，且确定了探测的下限。
对于具有预期分子量1181道尔顿的4-聚体，在1181.102和1181.7之间抽取的总离子流为0.41。图7表示4-聚体的1/10稀释物的层析谱，其1181.4的峰标准化为100％。1181.4的峰代表其中质量/电荷(m/z)比例＝1的带单电荷的种类。质量为590.2的带双电荷的4-聚体以1181.4种类强度的80％显示。590.2的质量代表m/z值是那些带单电荷的种类的0.5(即590.2的种类具有两个电荷)。同样注意在590.7和591.2可看到n+0.5和n+1的电荷。这对多聚体分子的电喷射电离是典型的。
在1/100的稀释时，质谱与1/10稀释的相似，具有预期分子量1181.4和590.2的峰。在1203.5的峰是4-聚体的Na+加合物(+23道尔顿)。在621.2、659.2、868.3、948.3的峰是产物片段的或背景的(图8)。
在图9中，显示了1/1000的稀释物，这大约已是ES-TOF探测的下限。在1181.5和590.2的峰相对于背景是明显可见的。如果下推探测的下限，在光谱中可看到更多的“背景”。
对于具有预期分子量1816道尔顿的6-聚体，在906.6和907.5之间抽取的总离子流为0.35(带双电荷的种类)。图10A表示6-聚体的1/10稀释物的层析谱，其906.7的峰标准化为100％(这是带双电荷的种类，其中m/z＝0.5(质量/电荷＝0.5))。906.7的质量代表m/z值是那些带单电荷的种类的0.5(即906.7的种类具有两个电荷)。同样注意在907.3和907.8可看到n+0.5和n+1的电荷。这对多聚体分子的电喷射电离是典型的。在图10B中，质谱显示预期分子量1815.6的峰。在1837.5的峰是6-聚体的Na+加合物(+23道尔顿)。图11表示6-聚体的1/100稀释物的层析谱，其906.8的峰标准化为100％。在图12中，显示了1/1000的稀释物，这大约已是ES-TOF探测的下限。在906.8的峰相对于背景是明显可见的。如果下推探测的下限，在光谱中可看到更多的“背景”。
对于具有预期分子量2418.6道尔顿的8-聚体，在1207.602和1210.1之间抽取的总离子流为0.37(带双电荷的种类)。图13A和13B表示8-聚体的1/10稀释物的层析谱，其1208.4的峰标准化为100％(这是带双电荷的种类，其中m/z＝0.5(质量/电荷＝0.5))。805.3的质量代表m/z值是那些带单电荷的种类的0.33(即805.3的种类具有三个电荷)。同样注意在805.9和806.3可看到n+0.5和n+1的电荷。这对多聚体分子的电喷射电离是典型的。在1/100的稀释时(图14)，质谱显示预期分子量1207.9(带双电荷的)和804.9(带三电荷的)的峰。
对于具有预期分子量2996道尔顿的10-聚体，在1496.199和1500.182之间抽取的总离子流为0.37(带双电荷的种类)。图15A和15B表示10-聚体的1/10稀释物的层析谱，其1497.0的峰标准化为100％(这是带双电荷的种类，其中m/z＝0.5(质量/电荷＝0.5))。1497.0的质量代表m/z值是那些带单电荷的种类的0.5(即1497.0的种类具有两个电荷)。同样注意在748.5和749对于具有四个电荷的种类可看到n+0.5和n+1的电荷。这对多聚体分子的电喷射电离是典型的。图15B表示具有预期分子量2996的峰的质谱。在3017.9的峰是10-聚体的Na+加合物(+23道尔顿)。图16表示10-聚体的1/100稀释物，其1497.1的峰标准化为100％。在图17中，显示了1/1000的稀释物，这大约已是ES-TOF探测的下限。在1497.1(带双电荷的种类)的峰与带三电荷的种类(997.6)和带四电荷的种类(748)一样相对于背景是明显可见的。如果下推探测的下限，在光谱中可看到更多的“背景”。
探测的下限计算为约2.5皮摩尔的4-、6-、8-或10-聚体。电喷射-TOF比MALDI-TOF具有更大的优点，这是因为电喷射可进行定量。数据显示少至10微升PCR反应物的1/100也可用ES-TOF进行探测。
                    实施例2
用HPLC对仅差别单个核苷酸的寡核苷酸片段的分离和鉴定
本实施例描述了用液相层析对短DNA片段的分离和鉴定。对DNA片段的探测是通过UV吸收进行的，而鉴定是通过在柱子上的保留时间与标准相比较进行的。
层析系统来自Varian(Walnut Creek，CA)且为ProStar HelixSystem(目录号Helixsys01)，该系统包含两个泵、一个柱烤箱、一个UV探测仪、一个脱气装置、一个混合器和一个自动注射器。该柱子为Varian Microsorb MV(目录号R0086203F5)，以5μM的颗粒大小填充的C18，300埃的孔大小，4.6mm×50mm。柱子是在30℃～40℃以在100mM乙酸三乙胺(TEAA)和0.1mM的EDTA中的乙腈梯度运行的。梯度的类型在文中描述。
对下面各自含有特定的单核苷酸多态的基因型片段进行了检验并成功分离。
4-聚体A：5′-ACGA-3′(SEQ ID NO：1)
6-聚体A：5′-ACGATG-3’(SEQ ID NO：2)
8-聚体A：5′-A CGA CGCA-3′(SEQ ID NO：5)
8-聚体B：5′-A TGACGCA-3′(SEQ ID NO：6)
8-聚体C：5′-ACGA TGCA-3′(SEQ ID NO：3)
10-聚体A：5′-GAA TATCCA T-3′(SEQ ID NO：7)
10-聚体B：5′-GAATATCCA C-3′(SEQ ID NO：8)
10-聚体C：5′-GAA CATCCAT-3′(SEQ ID NO：4)
8-聚体和10-聚体中的多态是加下划线的。8-聚体B和C与8-聚体A仅差别单个碱基。10-聚体B和C与10-聚体A仅仅差别单个碱基。
将下面的HPLC方法用于在柱子上分离片段：缓冲液A是100mM的TEAA和0.1mM的EDTA，缓冲液B是100mM的TEAA和0.1mM的EDTA和25％(V/V)的乙腈，在0-3分钟时梯度为20％B～25％B，在3.01分钟～4分钟梯度上升至45％B，在4.01～4.5分钟梯度上升至95％B，在4.51分钟维持20％B1分钟以重新平衡柱子。通过调节柱烤箱到40℃使柱子在40℃运行。流速为每分钟1.5ml。注射体积为10微升，并在每10μl的体积注射入约200纳克片段。将4-聚体、6-聚体、8-聚体和10-聚体的不同组合注射以确定层析表现。
第一个结果显示于图18中。在图18的轨迹1中，包含4-聚体、6-聚体、8-聚体和10-聚体的所有8个片段均得到了分离。所有3个8-聚体和所有3个10-聚体也得到了分离，即使它们仅差别单个碱基。片段是单链的。轨迹1中的洗脱顺序(从左到右)是：4-聚体、6-聚体、8-聚体B、8-聚体A、10-聚体A、8-聚体C、10-聚体B、10-聚体C。在轨迹2中，将6-聚体和10-聚体C共注射，且6-聚体和10-聚体C的洗脱时间与在轨迹1中看到的相同。在轨迹3中，将3个10-聚体共注射和分离。3个10-聚体的洗脱时间与在轨迹1中看到的相同。在轨迹4中，将3个8-聚体共注射和分离。3个8-聚体的洗脱时间与在轨迹1中看到的相同。轨迹5表示8-聚体A的单峰，而轨迹6表示8-聚体B的单轨迹。基因型可直接从层析中的保留时间推断，即使该片段仅差别单个碱基。
图19A和19B表示对3个8-聚体(图19A)和3个10-聚体(图19B)的HPLC分级和探测。在图19A中，1st8-聚体的位置2的“T”等位基因与2nd8-聚体的位置2的“C”等位基因相区别，而2nd8-聚体的位置5的“T”等位基因与3rd 8-聚体的位置5的℃”等位基因相区别。在图19B中，3rd10-聚体的位置4的“T”等位基因与2nd10-聚体的位置4的“C”等位基因相区别，而2nd10-聚体的位置10的“C”等位基因与1st10-聚体的位置10的“T”等位基因相区别。基因型可直接从层析中的保留时间推断，即使该片段仅差别单个碱基。
在图20A中，分离了一个4-聚体(4-聚体A)、一个6-聚体(6-聚体A)、3个8-聚体(8-聚体A、8-聚体B和8-聚体C)和3个10-聚体(10-聚体A、10-聚体B和10-聚体C)。在图20B中，两个6-聚体在2和3分钟之间洗脱。该6-聚体是通过对41-聚体的双Fok I消化产生的，该41-聚体含有由6个核苷酸分隔的正向和反向Fok I识别位点。
                        实施例3
用液相层析对基因型片段的分离和用UV探测器和飞行时间质谱分
                     析法进行的探测
下面的实施例描述了特定的序列从人类基因组中的扩增，其中引物含有Bsl I和N.BstNB I限制性内切核酸酶识别序列的一个或两个。结果所得的扩增子含有双切割位点，可释放小的寡核苷酸片段，该片段然后进行层析步骤并根据质荷比进行鉴定。
50μl的PCR反应物包含25ng基因组DNA、各自0.5μM的正向和反向引物、10mM Tris(pH 8.3)、50mM KCl、1.5mM MgCl2、各自200μM的dNTP、1单位的DNA聚合酶购自Epicentre Technologies，Madison WI的MasterAmpTMTaq DNA聚合酶或New England BioLabs，Beverly MA的Vent exo-聚合酶)。热循环条件如下：95℃初始变性3分钟；92℃40秒、60℃30秒、72℃30秒进行30个循环。将MJ ResearchPTC-100热循环仪(MJ Research，Watertown，MA)用于所有的PCR反应。引物购自MWG Biotech(High Point，NC)。
在热循环结束之后，制备了含有N.BstNB I、Bsl I和10xN.BstNB I缓冲液(New England BioLabs，Beverly MA)的酶混合物。将混合物加入到每一个孔中以得到如下终浓度，即在150mM KCl、10mM Tris-HCl、10mM MgCl2、1mM DTT、pH 7.5中有一单位的每一种酶。使反应在55℃进行超过60分钟。反应物是直接注射的，而无进一步的操作。
层析系统是Varian Prostar Helix System，包含二元泵、一个脱气装置、一个柱烤箱、一个二极管阵列探测仪和一个自动调温的微孔板自动注射器(Varian Inc.Walnut Creek，CA)。该柱子为VarianMicrosorb MV，整合了以3μM的颗粒大小填充的C18，具300埃的孔大小，2.1mm×50mm(Varian Inc.Walnut Creek，CA)。柱子是在30℃以在5mM乙酸三乙胺(TEAA)中的乙腈梯度运行的。缓冲液A是5mM TEAA，缓冲液B是5mM TEAA和25％(V/V)的乙腈。梯度起始于10％B并维持1分钟，然后在4分钟内上升至50％B，随后在95％B持续30秒，最终返回到10％B，总的运行时间为6分钟。柱子的温度在30℃保持恒定。流速为每分钟0.416ml。注射体积为10微升。流入质谱仪为200μl/分钟，用“T”形物将一半LC的流体导入废液缸。质谱仪是具有电喷射进口的Micromass LCT飞行时间(Micromass Inc.Manchester英国)。样品是用1秒的扫描时间在700～2300amu的扫描范围内以电喷射负离子模式运行的。设备参数为：TDC起始电压700，TDC终止电压50，TDC阈值0，TDC增益控制(gain control)0，TDC边缘控制0，Lteff 1117.5，Veff 4600。原料参数：去溶剂化气体862L/hr，毛细管3000V，样品锥体25V，RF透镜200V，抽取锥体2V，去溶剂化温度250C，原料温度150C，RF DC补偿(offset)14V，FR DC补偿(offset)21V，孔6V，加速200V，聚焦，10V，Steering 0V，MCP探测仪2700V，Pusher循环时间(人工的)60，离子能量40V，管透镜0V，栅格274V，TOF飞行管4620V，Reflectron 1790V。
对含有特定的单核苷酸多态(T→缺失)的细胞色素2D6基因进行了检验并成功分离和鉴定。该基因中围绕SNP的部分序列在下面显示，其中多态的位置用斜体和粗体显示，而充当使用一对内部引物的扩增反应的模板的区域(在下文描述)加下划线：
a gcagaggcg   ctt ctccgtg tccaccttgc gcaact tggg  cctgggcaag aagtcgctgg agcagtgggt
g accgaggag  gccgcctgcc tttgtgccgc cttcgc caac   cactccggtg ggtgatgggc(SEQ ID NO：9)
将两个引物用于扩增含有SNP的细胞色素2D6基因的区域。外部引物设计为仅扩增细胞色素2D6基因而不是其假基因。内部引物设计为具有部分的Bsl I识别序列并用于扩增含有SNP的细胞色素2D6基因的较小区域。内部引物之一也含有位于Bsl I识别序列5’的N.BstNB I识别序列。这两个引物对的序列以及最终扩增产物的序列在下面显示，其中将形成Bsl I识别序列的碱基以粗体突出，而那些是N.BstNB I识别序列的为斜体。Bsl I识别序列和/或N.BstNB I识别序列中的一些或全部碱基可与模板序列错配。
外部正向引物：5′-GAGACCAGG GGGAGCATA-3′(SEQ ID NO：l0)
外部反向引物：5′-GGC GAT CAC GTT GCT CA-3′(SEQ ID NO：11)
内部正向引物：5′-TGGGCCTGGGAGTCAAGTCGCTGGCCCAG-3′
              (SEQ ID NO：12)
内部反向引物：5′-GGC CTC CTC GGT CCC CC-3′(SEQ ID NO：13)
最终扩增产物  tgggcctgggagtcaagtcgctggcccagtgggggaccgaggaggcc
              (SEQ ID NO：14)
然后用Bsl I和N.BstNB I消化最终扩增产物，结果释放了单链
核酸片段 CGCTGGCCCAG TG(SEQ ID NO：15)。该序列的质量(包括3’OH和5’PO4)是4031.6amu。
图21表示在用N.BstNB I和Bsl I消化后的PCR反应产物的UV层析谱。大的峰表示含有PCR成分的前两分钟。箭头指示由Bsl I和N.BstNB I产生的单链核酸片段。在运行结束时的较大的峰含有过量的引物和双链产物。
图22A和22B分别是用N.BstNB I和Bsl I消化后的PCR反应产物的单离子层析谱和总离子层析谱。单离子层析谱图示了对每一个记录的扫描的目标离子的强度，其中选择性地将其与背景拉开。
图23表示从用N.BstNB I和Bsl I双消化的双链PCR产物中切割的单链寡核苷酸的质谱。该片段质量为1342amu，比计算的质量4031amu正好小3倍。这归因于片段中多个电荷状态的存在。生物分子在电离时带多个电荷是普遍的，通常由这种测定生成的片段将具有2个、3个或4个电荷。预期的质量可提前用简单公式M/Z-1来计算，其中M是片段的质量，Z是电荷数目(1、2、3等)，减去1是由于在电离中质子的丧失从而导致带负电荷的分子。在本情况下，仅有的带电状态是带三个电荷的形式(并不总是这种情况，对于单个寡核苷酸同时可看到带1个、2个或几个电荷的状态)，因而4031/3-1＝1342amu。
                     实施例4
用液相层析对基因型片段的分离和用等温扩增以及UV探测仪和飞行
                 时间质谱仪进行的探测
下面的实施例描述了特定的序列用引物对从人类基因组中的扩增，其中每一个引物都含有N.BstNB I识别序列.结果所得的扩增子当用N.BstNB I切割时可产生两个每一个均含有3’凹末端的双链核酸片段。然后将3’凹末端用5’→3’外切核酸酶缺陷的Bst DNA聚合酶填充。填充的片段然后再次用N.BstNB I切割，且结果所得的3’凹末端再次用Bst聚合酶填充。使切割-填充3’凹末端的过程重复，从而扩增两个短的单链核酸片段。然后对这种短的片段进行层析分离并通过其质荷比进行鉴定。
为了用上述引物对扩增含有SNP的人类基因组序列，制备了50μl的PCR反应混合物以含有25ng基因组DNA、各自0.5μM的正向和反向引物、10mM Tris(pH 8.3)、50mM KCl、1.5mM MgCl2、各自200μM的dNTP、1单位的DNA聚合酶(购自Epicentre Technologies，Madison WI的MasterAmpTM Taq DNA聚合酶或New England BioLabs，Beverly MA的Vent exo-聚合酶)。热循环条件如下：95℃初始变性3分钟；92℃40秒、60℃30秒、72℃30秒进行30个循环。将MJ ResearchPTC-100热循环仪(MJ Research，Watertown，MA)用于所有的PCR反应。引物购自MWG Biotech(High Point，NC)。
在热循环结束之后，制备了含有N.BstNB I、Bst聚合酶和10xN.BstNB I缓冲液(New England BioLabs，Beverly MA)的酶混合物。将该混合物加入PCR混合物中，从而每一个反应容器在150mM KCl、10mM Tris-HCl、10mM MgCl2、1mM DTT、pH 7.5中具有30单位的N.BstNB I和2单位的Bst聚合酶。使切割反应和填充结果所得的3’凹末端在60℃进行30分钟。反应物是直接注射的，而无进一步的操作。该注射在冷却的平板固定器上于4℃进行。
层析系统是Agilent 1100系统，包含二元泵、一个脱气装置、一个柱烤箱、一个二极管阵列探测仪和一个自动调温的微孔板自动注射器(Palo Alto CA)。该柱子为Varian Microsorb MV，整合了以3μM的颗粒大小填充的C18，具300埃的孔大小，2.1mm×50mm(VarianInc.Walnut Creek，CA)。柱子是在30℃以在5mM乙酸三乙胺(TEAA)中的乙腈梯度运行的。缓冲液A是5mM TEAA，缓冲液B是5mM TEAA和25％(V/V)的乙腈。梯度起始于10％B并维持1分钟，然后在4分钟内上升至50％B，随后在95％B持续30秒，最终返回到10％B，总的运行时间为6分钟。柱子的温度在30℃保持恒定。流速为每分钟0.416ml。注射体积为10微升。流入质谱仪的流速为200μl/分钟，用“T”形物将一半LC流体异入废液缸。质谱仪是具有电喷射进口的Micromass LCT飞行时间(Micromass Inc.Manchester英国)。样品是用1秒的扫描时间在700～2300amu的扫描范围内以电喷射负离子模式运行的。设备参数为：TDC起始电压700，TDC终止电压50，TDC阈值0，TDC增益控制0，TDC边缘控制0，Lteff 1117.5，Veff 4600。原料参数：去溶剂化气体862L/hr，毛细管3000V，样品锥体25V，RF透镜200V，抽取锥体2V，去溶剂化温度250C，原料温度150C，RFDC补偿(offset)14V，FR DC补偿(offset)21V，孔6V，加速200V，聚焦，10V，Steering 0V，MCP探测仪2700V，Pusher循环时间(人工的)60，离子能量40V，管透镜0V，栅格274V，TOF飞行管4620V，Reflectron 1790V。
对含有非二等位基因SNP(即G→C或A)的细胞色素P450 2D6基因进行了检验并成功分离和鉴定了含有该SNP的片段。用于扩增片段的引物对以及PCR扩增产物的序列在下面显示，其中组成N.BstNB I识别序列的碱基以粗体来突出，而SNP由可为G、C或A的“N”显示：
正向引物：5′-ACC-CAG-CTG-GAT-GAG-GAG-TCA-ACT-GAG-CAC-3′
          (SEQ ID NO：15)
反向引物：5′-GGG-CTG-GCT-GGG-AGT-CAG-GTC-ATC-C-3′(SEQ
          ID NO：16)
扩增产物：
5′-acc-cag-ctg-gat-gag-gag-tca-act-gag-cac-ngg-atg-acc-tga-ctc-cca-gcc-agc-cc-
3′
3′-tgg-gtc-gac-cta-ctc-ctc-agt-tga-ctc-gtg-n′cc-tac-tgg-act-gag-ggt-cgg-tcg-gg-
5′
N.BstNB I的消化产生了下面两个单链DNA片段，每一个片段均具有3’凹末端：
5′-ACC-CAG-CTG-GAT-GAG-GAG-TCA-ACT-3′
3′-TGG-GTC-GAC-CTA-CTC-CTC-AGT-TGA-CTC-GTG-NCC-TAC-5′
和
5′-GAG-CAC-NGG-ATG-ACC-TGA-CTC-CCA-GCC-AGC-CC-3′
3′-TGG-ACT-GAG-GGT-CGG-TCG-GG-5′
在Bst聚合酶存在时，扩增并然后释放了两个单链核酸片段：
底部链：5′-CAT-CCN-GTG-CTC-3′
顶部链：5′-GAG-CAC-NGG-ATG-3′
含有各个单核苷酸多态(SNP)的扩增的单链序列的质量(包括其3’OH和5’PO4)在表4中显示。
                  表4
     含有各个SNP的扩增的单链序列的质量
“A”等位基因的M/Z  顶部链  底部链
  1  3799  3652
  2  1899.5  1826
  3  1266.3  1217
  4  949  913
“G”等位基因的M/Z  顶部链  底部链
  1  3775.4  3677.4
  2  1887.7  1838.7
  3  1258.5  1225.8
  4  943.9  919.4
“C”等位基因的M/Z  顶部链  底部链
  1  3815.5  3637.3
  2  1907.8  1836.6
  3  1271.8  1212.4
  4  953.0  909.3
来自两个家族(28个个体)的基因型的结果在表5中显示，该结果显示所有检验的成员对于稀有的变体等位基因(即在SNP位点是A)是纯合的。
                               表5
                     28个个体的基因型数据
个体  A等位基因顶部链  底部链 G等位基因顶部链 底部链 C等位基因顶部链 底部链
1  1265  1216 无 无 无 无
2  1265  1216 无 无 无 无
3  1265  1216 无 无 无 无
4  1265  1216 无 无 无 无
5  1265  1216 无 无 无 无
6  1265  1216 无 无 无 无
7  1265  1216 无 无 无 无
8  1265  1216 无 无 无 无
9  1265  1216 无 无 无 无
10  1265  1216 无 无 无 无
11  1265  1216 无 无 无 无
12  1265  1216 无 无 无 无
13  1265  1216 无 无 无 无
14  1265  1216 无 无 无 无
15  1265  1216 无 无 无 无
16  1265  1216 无 无 无 无
17  1265  1216 无 无 无 无
18  1265  1216 无 无 无 无
19  1265  1216 无 无 无 无
20  1265  1216 无 无 无 无
21  1265  1216 无 无 无 无
22  1265  1216 无 无 无 无
23  1265  1216 无 无 无 无
24  1265  1216 无 无 无 无
25  1265  1216 无 无 无 无
26  1265  1216 无 无 无 无
27  1265  1216 无 无 无 无
28  1265  1216 无 无 无 无
图24和25表示两个个体的顶部链和底部链的示例性的UV层析谱和抽取的离子流。M/Z值1265和1216比表5中所示的低1道尔顿，这是因为质谱仪是在阴极模式运行的。
图26表示无模板的对照的UV层析谱和抽取的离子流。
图27表示顶部片段(在1265amu时m/z＝3)和底部片段(在1216amu时m/z＝3)的质谱。
                        实施例5
用等温扩增测定法和液相层析/质谱分析法对单核苷酸多态的测量
本实施例描述了用引物对对含有单核苷酸多态(SNP)的基因组片段的扩增，该引物对的每一个均含有N.BstNB I识别序列有义链的序列。结果所得的扩增子当用N.BstNB I切割时，可产生两个双链核酸片段，每一个片段均含有3’凹末端。然后该3’凹末端用exo-Vent聚合酶填充。填充的片段然后再用N.BstNB I进行切割且结果所得的3’凹末端再次用exo-Vent聚合酶填充。使切割-填充3’凹末端的过程重复，从而扩增两个短的核酸片段。然后使这种短的片段进行层析分离并通过质谱分析根据其质荷比进行鉴定。
为了扩增含有SNP的基因组序列，设计并从MWG Biotch(HighPoint，NC)购买了下面两个引物，其中N.BstNB I识别序列有义链的序列加下划线：
正向引物：5′-tcccatggaaaga gagtcaaag-3′
反向引物：5′tgaaataccgagctt gagtcaaaa-3′
将0.4μmol上述正向和反向引物用于在4℃配制的PCR混合物中。96-孔微量滴定板(Fisher，St.Louis MO)上每孔50微升的总反应体积中也含有400微摩尔dNTP、5纳克基因组DNA(购自CoriellInstitute，Bethesda MD的Coriell DNA)、1x PCR缓冲液(EpiCentreTechnologies，Austin TX)、1x增强溶液(EpicentreTechnologies，Austin TX)和1单位Taq聚合酶。将平板用聚丙烯平板密封物密封然后转移到热的(95℃)热循环仪(MWG，NC)上。然后对该平板进行称为降温(touchdown)程序的热循环程序，该程序在30个循环中起始于70℃并终止于60℃。在30个循环结束时，将平板置于4℃。PCR过程产生了长度为61个核苷酸的寡核苷酸片段。
扩增的寡核苷酸片段可进一步用作模板以在exo-Vent聚合酶和切割性内切核酸酶N.BstNB I存在时扩增两个单链核酸片段。将下面的混合物组合然后将15微升的混合物加入到微量滴定板上的每一个孔中。
250μl 10x Thermopol缓冲液(NEB，Beverly，MA)
125μl 10x N.BstNB I(NEB)
100μl 25mM dNTP(NEB)
1000μl 1M海藻糖(Sigma，St.Louis，MO)
250单位N.BstNB I切割性酶(NEB)
50单位exo-Vent DNA聚合酶(NEB)
1020μl超纯水
将平板再次在4℃密封，然后将平板加热到60℃进行1小时。在本实施例中，SNP是二等位基因的且是A到T的替代。换句话说，对于该SNP，较多的等位基因是A而稀有的等位基因是T。对于较多的等位基因(即等位基因A)，两个扩增的单链核酸片段如下所示，其SNP及其互补的核苷酸由大写字母表示：
顶部链：5′-ggagaaacacAtttg-3′
底部链：3′-cctctttgtgTaaac-5′
同样地，对于稀有的等位基因(即等位基因T)，两个扩增的单链核酸片段如下所示，其SNP及其互补的核苷酸由大写字母表示：
顶部链：5′ggagaaacacTtttg-3′
底部链：3′cctctttgtgAaaac-5′
当由负离子模式的电喷射的质谱分析法分析时上述4个片段的质量/电荷计算值如下所示：
 顶部链等位基因A  底部链等位基因A  顶部链等位基因T  底部链等位基因T
质量(道尔顿)  4705.10  4598.03  4696.09  4607.04
质荷比＝2  2351.55  2298.02  2347.05  2302.52
质荷比＝3  1567.37  1531.68  1564.36  1534.68
质荷比＝4  1175.28  1148.51  1173.02  1150.76
在单链核酸扩增反应结束之后，将反应混合物加入到LC/MS(Micromass LTD，Manchester英国和Beverly，MA，美国)，其中质谱分析是通过LCT飞行时间用负离子模式的电喷射来进行的。
所用的层析系统是层析系统是Agilent HPLC-1100系统，包含二元泵、一个脱气装置、一个柱烤箱、一个二极管阵列探测仪和一个自动调温的微孔板自动注射器(Palo Alto CA)。该柱子为Waters Xterra，整合了以3μM的颗粒大小填充的C18，具300埃的孔大小，2.1mm×50mm(Waters Inc.Milford，MA)。柱子是在30℃以在5mM乙酸三乙胺(TEAA)中的乙腈梯度运行的。缓冲液A是5mM TEAA，缓冲液B是5mM TEAA和25％(V/V)的乙腈。梯度起始于20％B并维持3分钟，然后上升至50％B持续30秒，随后在80％B持续1.5分钟，总的运行时间为6分钟。柱子的温度在30℃保持恒定。流速为每分钟0.5ml。注射体积为10微升。流入质谱仪的流速为200μl/分钟，用“T”形物将一半LC流体异入废液缸。
所用的质谱仪是具有电喷射进口的Micromass LCT飞行时间(Micromass Inc.Manchester英国)。样品是用1秒的扫描时间在700～2000amu的扫描范围内以电喷射负离子模式运行的。设备参数为：TDC起始电压700，TDC终止电压200，TDC阈值0，TDC增益控制0，TDC边缘控制0，Lteff 1118.3，Veff 4600。原料参数：去溶剂化气体862L/hr，毛细管3000V，样品锥体30V，RF透镜250V，抽取锥体3V，去溶剂化温度325℃，原料温度150℃，RF DC补偿(offset)15V，FRDC补偿(offset)22V，孔0V，加速200V，聚焦，1V，Steering0V，MCP探测仪2700V，Pusher循环时间(人工的)60，离子能量40V，管透镜44V，栅格250V，TOF飞行管4620V，Reflectron 1785V。
对较多的和稀有的等位基因给出了切割和分析的序列以及其各自预期的质荷比。通常，大于14,000的质荷比是不记录的。
监控了下面抽取的离子流：
1534.6+1150.7(对于T等位基因的底部链)
1564.3+1173.2(对于T等位基因的顶部链)
1531.6+1148.5(对于A等位基因的底部链)
1567.3+1175.2(对于A等位基因的顶部链)
1号个体(来自Coriell的1号样品)的结果在图32中显示。上面的试验组表示T等位基因的底部链的抽取的离子流层析谱。第二个试验组表示T等位基因的顶部链的抽取的离子流层析谱。第三个试验组表示A等位基因的底部链的抽取的离子流层析谱。第四个试验组表示A等位基因的顶部链的抽取的离子流层析谱。下面的试验组表示总离子流的层析谱。如图32所示，T或A等位基因顶部或底部链的离子流如下：
1534.6+1150.7(对于T等位基因的底部链)：0单位
1564.3+1173.2(对于T等位基因的顶部链)：0单位
1531.6+148.5(对于A等位基因的底部链)：17.23单位
1567.3+1175.2(对于A等位基因的顶部链)：17.99单位
因此，1号个体对于A等位基因是纯合的。
2号个体(来自Coriell的1号样品)的结果在图33中显示。上面的试验组表示T等位基因的底部链的抽取的离子流层析谱。第二个试验组表示T等位基因的顶部链的抽取的离子流层析谱。第三个试验组表示A等位基因的底部链的抽取的离子流层析谱。第四个试验组表示A等位基因的顶部链的抽取的离子流层析谱。下面的试验组表示总的离子流的层析谱。如图33所示，T或A等位基因顶部或底部链的离子流如下：
1534.6+1150.7(对于T等位基因的底部链)：33.56单位
1564.3+1173.2(对于T等位基因的顶部链)：35.98单位
1531.6+1148.5(对于A等位基因的底部链)：44.82单位
1567.3+1175.2(对于A等位基因的顶部链)：55.95单位
因此，2号个体对于T和A等位基因都是杂合的。
                        实施例6
用等温扩增测定法和液相层析/质谱分析法对等位基因频率的测量
本实施例描述了用引物对在收集的复杂样品中对含有单核苷酸多态(SNP)的基因组片段的扩增，该引物对的每一个均含有N.BstNB I识别序列有义链的序列。每一个结果所得的扩增子当用N.BstNB I切割时，可产生两个双链核酸片段，每一个片段均含有3’凹末端。然后该3’凹末端用exo-Vent聚合酶填充。填充的片段然后再用N.BstNBI进行切割且结果所得的3’凹末端再次用exo-Vent聚合酶填充。使切割一填充3’凹末端的过程重复，从而扩增两个短的核酸片段。然后使这种短的片段进行层析分离并用质谱分析根据其质荷比进行鉴定。这些含有相同或不同等位基因的短片段的鉴定使得能够计算检验的样品中特定等位基因的频率。
为了扩增含有SNP的基因组序列，设计并从MWG Biotch(HighPoint，NC)购买了下面两个引物，其中N.BstNB I识别序列有义链的序列加下划线：
正向引物：5′tcccatggaaaga gagtcaaag-3′
反向引物：5′tgaaataccgagctt gagtcaaaa-3′
在本实施例中，SNP是二等位基因的且是A到T的替代。换句话说，对于该SNP，较多的等位基因是A而稀有的等位基因是T。
将5纳克从Coriell Institute(Bethesda，MD)获得的200个不同个体中每一个的基因组DNA在1.5ml的离心管中汇集在一起。所有200个个体对于A等位基因都是纯合的。向汇集的DNA样品中加入5ng来自预先确定是T等位基因纯合的个体的DNA。因此，汇集的样品中含有200份对A等位基因纯合的基因组DNA和1份对T等位基因纯合的基因组DNA。使样品在-20℃在rotovap上干燥然后在10微升0.01M Tris-HCl(pH 7.6)中再次水化。
下面的PCR混合物在4℃配制。96-孔微量滴定板(Fisher，St.Louis MO)上每孔50微升的总反应体积中也含有下面的组分：400微摩尔正向和反向引物、400微摩尔dNTP、1005纳克基因组DNA(购自Coriell Institute，Bethesda MD的Coriell DNA)、1x PCR缓冲液(EpiCentre Technologies，Austin TX)、1x增强溶液(EpiCentreTechnologies，Austin TX)和1单位Taq聚合酶。将平板用聚丙烯平板密封物密封。制备平板反应物并在4℃密封然后转移到热的(95℃)热循环仪(MWG，NC)上。然后对该平板进行称为降温(touchdown)程序的热循环程序，该程序进行30个循环，起始于70℃并终止于60℃。
每一个扩增的寡核苷酸片段可进一步用作模板以在exo-Vent聚合酶和切割性内切核酸酶N.BstNB I存在时扩增两个单链核酸片段。将下面的混合物组合然后将15微升的混合物加入到微量滴定板上的每一个孔中。
250μl 10x Thermopol缓冲液(NEB，Beverly，MA)
125μl 10x N.BstNB I(NEB)
100μl 25mM dNTP(NEB)
1000μl 1M海藻糖(Sigma，St.Louis，MO)
250单位N.BstNB I切割性酶(NEB)
50单位exo-Vent DNA聚合酶(NEB)
1020μl超纯水
将平板再次在4℃密封，然后将平板加热到60℃进行1小时。
对于较多的等位基因(即等位基因A)，两个扩增的单链核酸片段
如下所示，其SNP及其互补的核苷酸由大写字母表示：
顶部链：5′-ggagaaacacAtttg-3′
底部链：3′-cctctttgtgTaaac-5′
同样地，对于稀有的等位基因(即等位基因T)，两个扩增的单链核酸片段如下所示，其SNP及其互补的核苷酸由大写字母表示：
顶部链：5′-ggagaaacacTtttg-3′
底部链：3′-cctctttgtgAaaac-5′
当由负离子模式的电喷射的质谱分析法分析时上述4个片段的质量/电荷计算值如下所示：
 顶部链等位基因A  底部链等位基因A  顶部链等位基因T 底部链等位基因T
质量(道尔顿)  4705.10  4598.03  4696.09 4607.04
质荷比＝2  2351.55  2298.02  2347.05 2302.52
质荷比＝3  1567.37  1531.68  1564.36 1534.68
质荷比＝4  1175.28  1148.51  1173.02 1150.76
在单链核酸扩增反应结束之后，将反应混合物加入到LC/MS(Micromass LTD，Manchester英国和Beverly，MA，美国)，其中质谱分析是通过LCT飞行时间用负离子模式的电喷射来进行的。
所用的层析系统是Agilent HPLC-1100系统，包含二元泵、一个脱气装置、一个柱烤箱、一个二极管阵列探测仪和一个自动调温的微孔板自动注射器(Palo Alto CA)。该柱子为Waters Xterra，整合了以3μM的颗粒大小填充的C18，具300埃的孔大小，2.1mm×50mm(Waters Inc.Milford，MA)。柱子是在30℃以在5mM乙酸三乙胺(TEAA)中的乙腈梯度运行的。缓冲液A是5mM TEAA，缓冲液B是5mM TEAA和25％(V/V)的乙腈。梯度起始于20％B并维持3分钟，然后上升至50％B持续30秒，随后在80％B持续1.5分钟，总的运行时间为6分钟。柱子的温度在30℃保持恒定。流速为每分钟0.5ml。注射体积为10微升。流入质谱仪的流速为200μl/分钟，用“T”形物将一半LC流体导入废液缸。
质谱仪是具有电喷射进口的Micromass LCT飞行时间(MicromassInc.Manchester英国)。样品是用1秒的扫描时间在700～2000amu的扫描范围内以电喷射负离子模式运行的。设备参数为：TDC起始电压700，TDC终止电压200，TDC阈值0，TDC增益控制0，TDC边缘控制0，Lteff 1118.3，Veff 4600。原料参数：去溶剂化气体862L/hr，毛细管3000V，样品锥体30V，RF透镜250V，抽取锥体3V，去溶剂化温度325℃，原料温度150℃，RF DC补偿(offset)15V，FR DC补偿(offset)22V，孔0V，加速200V，聚焦，1V，Steering 0V，MCP探测仪2700V，Pusher循环时间(人工的)60，离子能量40V，管透镜44V，栅格2 50V，TOF飞行管4620V，Reflectron 1785V。
对较多的和稀有的等位基因给出了切割和分析的序列以及其各自预期的质荷比。通常，大于14,000的质荷比是不记录的。
监控了下面抽取的离子流：
1534.6+1150.7(对于T等位基因的底部链)
1564.3+1173.2(对于T等位基因的顶部链)
1531.6+1148.5(对于A等位基因的底部链)
1567.3+1175.2(对于A等位基因的顶部链)
汇集的样品的结果在图34中显示。上面的试验组表示T等位基因的底部链的抽取的离子流层析谱。第二个试验组表示T等位基因的顶部链的抽取的离子流层析谱。第三个试验组表示A等位基因的底部链的抽取的离子流层析谱。第四个试验组表示A等位基因的顶部链的抽取的离子流层析谱。下面的试验组表示总离子流的层析谱。如图34所示，T或A等位基因顶部或底部链的离子流如下：
1534.6+1150.7(对于T等位基因的底部链)：10.0单位
1564.3+1173.2(对于T等位基因的顶部链)：3.6单位
1531.6+1148.5(对于A等位基因的底部链)：151.9单位
1567.3+1175.2(对于A等位基因的顶部链)：166.3单位
这些结果显示对于T等位基因观察到了13.6单位的信号(即来自T等位基因底部和顶部链的信号的和)，而对于A等位基因观察到了为318.2单位的信号(即来自A等位基因底部和顶部链的信号的和)。因而在该DNA群体中T等位基因的频率为0.004(即13.6除以318.2)或约1份比200份。
图35表示对扩增寡核苷酸片段在2.5分钟和5分钟(上面试验组)之间的二极管阵列追踪(UV追踪)与总离子流(下面试验组)。基因型片段在二极管阵列追踪中具有3.82分钟的总保留时间，而在总离子流层析谱中具有3.93分钟。
                            实施例7
cDNA在固体支持体上的合成及用切割剂和DNA聚合酶制备单链核酸探
                              针
本实施例描述了cDNA在固体支持体上的合成及随后用合成的cDNA作为模板在切割性内切核酸酶和DNA聚合酶存在时对单链核酸探针的制备。该扩增方案的设计是要解决现有的cDNA-依赖性技术所存在的下列问题：所需RNA的高输入量、低数目的样品通量、许多用户操作、有机提取和沉淀及差的适应性。
细胞刺激和总RNA分离
在10ng/ml佛波醇-12-肉豆蔻酸-13乙酸酯(Calbiochem，SanDiego，CA)和100ng/ml离子霉素(calbiochem)存在时将无血清RPMI培养基(Life Technologies，Gaithersburg，MD)上细胞密度为1×106细胞/ml的Jurkat line JRT 3.5刺激6小时。将细胞沉淀、在1xPBS(Life Technologies)中洗涤、再次沉淀。将含有106细胞的每一个级分在0.5ml缓冲液中裂解，该缓冲液含有4M异硫氰酸胍、1％的N-月桂基肌氨酸和25mM柠檬酸钠(pH 7.1)(Fisher Scientific，Pittsburgh，PA)。加入十分之一体积pH 4.2的2M乙酸钠(FisherScientific)并随后加入1体积的水饱和的苯酚(Amresco.Solon，OH)。混合后，加入四分之一体积的氯仿∶异戊醇(29∶1)(FisherScientific)，并将溶液激烈混合，然后在冰上温育10分钟。然后离心裂解物，吸取水相并用等体积的氯仿：异戊醇提取。然后将水相汇集并用2体积的乙醇(Quantum Chemical Corp.Tuscola，IL)沉淀RNA。离心后，将乙醇倾倒掉并简单地将RNA在空气中干燥，然后重悬于无RNase的水中至1～5mg/ml的浓度。
除了用上述通过酸-胍-苯酚提取制备的总RNA作为来源以捕获mRNA之外，也可对细胞裂解和杂交两者采用使用离液剂(如GuSCN或盐酸胍)的同步裂解-mRNA捕获规程，而无需首先分离总RNA。该替代方法允许裂解小数目的细胞，并避免了与标准RNA制备中固有的有机相提取和一系列乙醇沉淀相关的损失。
Oligo(dT)-固体末端(或珠子)的制备
为了捕获mRNA，制备了附着有包含oligo(dT)的下列寡核苷酸的固体末端(或珠子)，其中Asc I识别序列加下划线：
5′-ACTACTGATCA GGCGCGCCTTTTTTTTTTTTTTTT-3′
       间隔物   AscI          (polydT)20
上述核苷酸是用标准的氰乙基-N，N-二异丙基氨基-亚磷酰胺(CED亚磷酰胺)化学物在商业合成仪上合成的。氨基尾巴是用商业上可用的N-单甲氧基三苯甲基氨基六-6-基氧基-CED-亚磷酰胺整合入5’末端的。可选择地，寡核苷酸可商业上购得(Midland CertifiedReagents，Midland，TX)。
寡核苷酸末端(或珠子)是如前文所述制备的(Van Ness等人，Nucl.Acids Res.19：3345，1991)。寡核苷酸末端(或珠子)含有0.1～1.2μg/末端(或珠子)的共价固定的寡核苷酸。
捕获聚腺苷酰化的mRNA
聚腺苷酰化的mRNA是通过首先将混合物加热到65-70℃，加入高盐杂交溶液然后置于活动的平台如旋转混合器中而捕获于上文制备的珠子上的。足够的混合是通过各种设备实现的，包括连续涡旋器、定轨摇床、旋转摇杆和配备有旋转器的杂交箱。
捕获持续时间依赖于输入的RNA量。在环境温度下，10μg总RNA在约2小时内足以实现对珠子的90％的饱和。在一般的静止细胞中，这相应于每个珠子结合约100ng poly(A)+mRNA。40μg来自相同来源的总RNA在30分钟内得到相同水平的饱和。在另一系列的实验中，将刺激的人类T-细胞系用作RNA来源，且在相同的捕获条件下于1小时内用10μg总RNA输入达到了饱和。已捕获了几个RNA来源，包括小鼠、仓鼠和人类细胞系，且每10μg总RNA均在1～2小时内达到了90％饱和的范围。
在一个实验中，在无菌的1.5ml微量离心管(Fisher Scientific)中，将10μg从如上所述刺激的Jurkat line JRT 3.5细胞中分离的总细胞RNA与具有共价连接的包含poly(dT)的寡核苷酸的珠子混合并在足量的无RNase水中稀释以覆盖珠子。将RNA和珠子在65℃温育5分钟。将等体积的由50mM Tris(pH 7.5)、1M NaCl(FisherScientific)和20μg/ml乙酰化的BSA(New England Biolabs，Beverly，MA)组成的2X mRNA杂交缓冲液加入到每一个中，并将管子于室温轻轻摇动2小时。将上清液去除并将珠子在1X mRNA杂交缓冲液中洗涤3次。
第一链cDNA合成
在捕获了poly(A)+mRNA之后，将珠子在杂交缓冲液中洗涤3次以去除未结合的RNA。反转录是在30μl体积中用MMLV-反转录酶(MMLV-RT)和最适化的缓冲液系统在1～2小时内于42℃在杂交箱旋转器架上进行的。至于捕获步骤，有效的第一链合成需要试剂的持续混合。初始的实验中，每个固体支持体产生了50-100ng cDNA。反转录产物已间接通过对从固体支持体切割的标记的双链cDNA的放射自显影来测定，并通过琼脂糖凝胶电泳来区分大小。在几个实验中，拷贝的mRNA种类的大小范围与常规方法相当，且经常优于常规方法。cDNA的大小分布在0.5Kb～20Kb，平均为约2.0Kb。
在一个实验中，将来自如上所述制备的刺激的Jurkat line JRT3.5细胞的捕获的mRNA重悬于反转录混合物中，该混合物由1X MMLV-反转录酶缓冲液、1mM dNTP混合物、2mM DTT(Life Technologies)、20单位RNA酶抑制剂(Promega.Madison，WI)和10μg/ml乙酰化的BSA(New England Biolabs)组成，随后加入600单位的MMLV-反转录酶(Life Technologies)。将该反应体系在42℃轻轻摇动2小时以合成第一链cDNA。
第一链cDNA合成是固体支持体cDNA方法中的第一个分支点。剩余的RNA模板可用RNaseH消化、在NaOH中水解或通过热变性除去，从而剩下单链cDNA模板。然后单链cDNA模板可用于寡核苷酸指导的第二链cDNA合成、PCR、随机引物指导的探针生产或利用标记的寡核苷酸的基因表达研究。
第二链cDNA合成
在第一链cDNA合成后，第二链cDNA可用RNase H和DNA聚合酶合成。可选择地，可将连接物连接到第一链cDNA的3’末端，且互补引物然后可与连接物杂交。第二链cDNA随后可用第一链cDNA作为模板来合成。
在一个实验中，在反转录后，将珠子洗涤3次以去除反应物和酶。第二链合成是在40μl体积中用每25单位大肠杆菌DNA聚合酶I中1单位RNase H来进行的。将反应于室温在旋转器摇杆上温育6小时或过夜。未均匀延伸的末端可通过去除第二链反应物并添加T4 DNA聚合酶和dNTP而修饰”(polish)以进行随后的连接。该温育于37℃在杂交箱中的旋转器上进行30分钟。产物可直接通过使反应在32P-标记的dNTP存在时进行及煮沸第二链产物或用限制性酶Asc I从支持体上切割而显现。将放射性标记的产物在凝胶上运行并置于胶卷上以显影。从一般10μg的总RNA中可能的是回收50-120ng的双链cDNA。在反转录之后，热稳定性的DNA聚合酶也可与具有RNaseH活性的酶一起使用，如MMLV-RT。比较第二链合成中RNaseH/DNA pol I和Tth IDNA聚合酶的实验证明在Asc I-切割的产物的量或由对选择的基因如GAPDH和IL-2的PCR扩增检验的产物的含量方面几乎没有差异。TthI DNA聚合酶的应用将在室温6小时的温育时间减少到在70℃的1小时。Tth I聚合酶在Mn2+存在时也显示反转录酶活性，但由于在二价阳离子存在时RNA在高温降解的可能性所以温育时间需要非常短。在高温的DNA多聚化也具有熔解二级结构区域的优点，这对于从高度结构化的mRNA合成cDNA是有利的。
在另一个实验中，向用来自刺激的Jurkat line JRT 3.5的mRNA作为模板的第一链cDNA合成的反应混合物(如上所述)中加入1单位的RNase H(Boehringer-Mannheim，Indianapolis，IN)。使反应继续进行另外0.5小时。将上清液去除，且将每一个珠子在含有10mMTris(pH 8)和1mM EDTA(pH 8)(Fisher Scientific)的TE缓冲液中洗涤3次。剩余的RNA模板可通过将珠子在具有0.01％SDS(Fisher Scientific)的TE缓冲液中煮沸而去除。
第二链cDNA的合成代表了固体支持体cDNA方法的第二个分支点。在此，可选择使连接物与cDNA连接，这将支持诸如全长单链cDNA探针、文库生产、体外转录和5’RACE的方法。
按比例缩减
通过在包含于标准cDNA文库生产中的许多操作中使材料的损失最小化，应该可能的是按比例缩减RNA输入水平10-100倍。已显示在固体支持体上从10μg的总RNA可合成约100ng的双链cDNA，这些起始材料比商业上可购得的试剂盒所要求的低50-倍。可能的是缩减上述比例多达10-倍而不显著改变上述规程，但在低于缩减的规模时，可能需要包括一些扩增步骤。一个方法是在cDNA合成后用包含N.BstNB I识别序列的连接物进行连接。结果所得的连接产物可用作模板以合成与双链cDNA分子的一条链相同的单链核酸分子，该单链核酸分子进而可用作cDNA探针或模板以合成其互补链，并借此产生双链cDNA分子。
连接物连接
为了促进固相cDNA文库的构建或cDNA探针的生产，使半磷酸化的连接物与双链cDNA在30μl体积中以5-10∶l的连接物：cDNA末端摩尔比在含有10％PEG的缓冲液中连接。使连接物-cDNA混合物与T4DNA聚合酶在旋转器摇杆上于室温温育过夜。然后将固体支持体洗涤3次以去除多余的连接体(linker)。连接后，将连接物上的5’-羟基基团用T4多核苷酸激酶和ATP于37℃在杂交箱旋转架上磷酸化1小时。该反应通过将珠子在TE中洗涤3次而终止。如果将cDNA用于另一个应用，那么磷酸化步骤将不是必需的。
如上所述，在某些情况下，可将合成的双链cDNA与包含N.BstNBI识别序列的连接物连接。这种连接产物可用作模板以制备单链cDNA探针或进一步制备双链cDNA分子。
用固体支持体上合成的cDNA作为模板对cDNA探针的制备
已合成了N.BstNB I连接物并使其与从10μg总RNA制备的珠子上的双链cDNA连接。将珠子置于标准的Cetus PCR管(ABI，FosterCity，CA)中并在60℃温育1小时。将结合的双链cDNA连续地切割，从而产生许多拷贝的双链cDNA分子的单链。温育后，使产物热变性并在琼脂糖凝胶上运行以显现单链cDNA的长度范围。大小在大约500bp～大于20Kb的范围，这与双链cDNA的大小一致，其中该双链cDNA与对照实验平行地进行了标记、从珠子上切割、通过电泳分离并通过放射自显影显现。
N.BstNB I的反应缓冲液(购自NEB)为10mM Tris-HCl、10mMMgCl2、150mM KCl、1mM二硫苏糖醇(25℃时pH 7.5)。切割反应是在55℃-60℃进行的。切割性内切核酸酶可通过在80℃温育20分钟而热失活。
这些实验中检验的聚合酶为exo-Vent、exo-Deep Vent和Bst(NEB)。聚合酶的反应缓冲液为1X ThermoPol缓冲液，该缓冲液含有10mMKCl、20mM Tris-HCl(25℃时pH 8.8)、10mM(NH4)2SO4、2mM MgSO4、0.1％的Triton X-100、dNTP(400微摩尔)和DNA。exo-Vent和exo-DeepVent DNA聚合酶在72℃～80℃具有最大活性并以2,000单位/ml的浓度提供。
为了确定扩增的单链cDNA是否代表最初的mRNA群体，对几个已知给定类型的细胞中以高水平、低水平存在或根本不存在的基因设计了PCR引物。这样设计引物，从而所有产物均为大约相同的长度(400-600bp)，且将位于或靠近cDNA的5’末端，从而可获得对第一链合成质量的很好的近似。将刺激的人类Jurkat T-细胞系用作RNA来源。分析了下面的基因：IL-2、IL-4、GM-CSF、GAPDH、c-fos、CTLA4和Werner氏解旋酶。将小鼠鸟苷酸激酶用作负对照。除了那些用对CTLA4或小鼠鸟苷酸激酶特异性的引物的PCR反应之外，所有用对上述基因特异性的引物的PCR反应给出了预期大小的产物。IL-2的产物用DNA印迹进行了证实，其中将50ng推定的IL-2进行了32P-标记并与含有来自刺激的(PMA和离子霉素)Jurkat细胞和未刺激的Jurkat细胞两者的固定的RNA的印迹杂交。在高度严格性洗涤后，未刺激的RNA几乎不显示信号，而刺激的样品显示与IL-2信使预期的大小一致的强信号。
                       实施例8
                  寡核苷酸的线性扩增
本实施例阐明了寡核苷酸从模板双链体的线性扩增。模板双链体是通过将如下所示的两个寡核苷酸相互退火而形成的。N.BstNB I的识别序列如下所示：
ITATOP：5′-ccgatctagt gagtcgctc-3′
NbBT16：3′-ggctagatca ctcagcgagtcaaggtcagcatacc-5′
在DNA聚合酶存在时，可填充上述双链体的凹端以产生下面的延伸产物：
5′-ccgatctagt gagtcgtcagttccagtcgtatgg-3′
3′-ggctagatca ctcagcgagtcaaggtcagcatacc-5′
在N.BstNB I存在时，可对上述延伸产物进行切割以产生下面的切割产物：
5′-ccgatctagt gagtcgctc-3′+5′-agttccagtcgtatgg-3′
3′-ggctagatca ctcagcgagtcaaggtcagcatacc-5′
上述延伸和切割循环可重复多次，结果导致片段5’-agttccagtcgtatgg-3’的扩增。该片段可通过液相层析和质谱分析法进行探测和表征。它在1663.1具有质荷比3，在1247.1具有质荷比4，且在997.1道尔顿具有质荷比5。
在4℃配制下面的反应物：
740μl无核酸酶的去离子水
110μl 10X N.BstNB I缓冲液(NEB)
55μl 10X N.BstNB I缓冲液(NEB)
1μl 1皮摩尔/μl的NBbt16寡核苷酸
1μl 1皮摩尔/μl的ITATOP寡核苷酸
80μl 2000单位/ml的N.BstNB I(NEB)
24μl 5000单位/ml的9°NmTM DNA聚合酶(NEB)
16μl 25mM的dNTP(NEB)
将反应混合物分为20个PCR管中的50μl等份试样。将管于60℃置于MJ热循环仪上并以所显示的时间温育。然后将样品进行下面的液相层析质谱分析。
柱缓冲液如下：缓冲液A含有0.05M的乙酸二甲基丁胺(pH 7.6)，而缓冲液B含有0.05M的乙酸二甲基丁胺(pH 7.6)，50％的乙腈。
将乙腈的浅梯度用于洗脱寡核苷酸并清理样品。梯度的分析部分起始于5％的乙腈并在约90秒内增加到15％，随后为几秒钟的快速将45％乙腈的“填料”推到柱子中的洗涤，随后返回到5％乙腈的起始条件。
所用的柱子是Guard柱子Xterra 2.X 20mm，3.5微米，MSC18。在柱子的前面是玻璃料固定器中的玻璃料(具有0.5微米Upchurch A701 Peek Prefilter Frit的Upchurch A356玻璃料固定器)。
将来自液相层析的级分注射入质谱仪中(具有电喷射入口的Micromass LCT Time-of-Flight，Micromass Inc.，Manchester，英国)。注射体积为10微升。样品是在800～2000amu的扫描范围以电喷射负离子模式运行的。在1247.1道尔顿的相对质量单位的时间进程结果显示于下表中：
   时间 相对质量单位
    1     16
    2     33
    3     49
    4     63
    5     82
    6     98
    7     116
    8     123
    9     156
    10     177
    12.5     208
    15     255
    20     310
    30     512
    45     730
    60     955
    75     1233
    90     1553
                         实施例9
利用在切割剂识别序列中包含错配的模板核酸的核酸扩增
合成并从MWG(MWG Biotech Inc.，High Point，NC)购得了下面的寡核苷酸.将该寡核苷酸以每微升100皮摩尔的浓度置于0.01MTris-HCl和0.001M EDTA中。N.BstNB I双链识别序列有义链的序列加下划线，而与N.BstNB I双链识别序列反义链中相应位置的核苷酸不同的核苷酸以斜体表示
B-1： 5′CC TAC GAC TGG AAC AGA    CTC  ACC TAC GAC TGG A-3′
B-2： 5′CC TAC GAC TGG AAC AAT    AAA  ACC TAC GAC TGG A-3′
B-3： 5′CC TAC GAC TGG AAC AGA    TTC  ACC TAC GAC TGG A-3′
B-4： 5′CC TAC GAC TGG AAC AGA    CAC  ACC TAC GAC TGG A-3′
B-5： 5′CC TAC GAC TGG AAC AGT    CTC  ACC TAC GAC TGG A-3′
B-6： 5′CC TAC GAC TGG AAC AGA    AAC  ACC TAC GAC TGG A-3′
B-7： 5′CC TAC GAC TGG AAC AGT    AAC  ACC TAC GAC TGG A-3′
T-1： 3′GG ATG CTG ACC TTG T CT  GAG TGG ATG CTG ACC T-5′
T-1a：3′GG ATG CTG ACC TTG T CT  GAG TGG ATG CTG ACC T-5′
T-1b：3′GG ATG CTG ACC TTG T CT  GAG TGG ATG CTG ACC -5′
T-1c：3′GG ATG CTG ACC TTG T CT  GAG TGG ATG CTG AC -5′
T-1d：3′GG ATG CTG ACC TTG T CT  GAG TGG ATG CTG A -5′
T-1e：3′GG ATG CTG ACC TTG T CT  GAG TGG ATG CTG -5′
T-1f：3′GG ATG CTG ACC TTG T CT  GAG TGG ATG CT -5′
T-1g：3′GG ATG CTG ACC TTG T CT  GAG TGG ATG C -5′
T-1h：3′GG ATG CTG ACC TTG T CT  GAG TGG ATG -5′
T-1i：3′GG ATG CTG ACC TTG T CT  GAG TGG AT -5′
T-1j：3′GG ATG CTG ACC TTG T CT  GAG TGG A -5′
T-1k：3′GG ATG CTG ACC TTG T CT  GAG TGG -5′
T-1l：3′GG ATG CTG ACC TTG T CT  GAG TG -5′
T-1m：3′GG ATG CTG ACC TTG T CT  GAG T -5′
T-1n：3′GG ATG CTG ACC TTG T CT  GAG -5′
将下面的混合物组合然后将25微升混合物加入到微量滴定板上的每一个孔中。
250μl 10x Thermopol缓冲液(NEB Biolabs，Beverly，MA)
125μl 10x N.BstNB I(NEB Biolabs，Beverly，MA)
100μl 25mM dNTP(NEB Biolabs，Beverly，MA)
1000μl 1M海藻糖(Sigma，St.Louis，MO)
250单位N.BstNB I切割性酶(NEB Biolabs，Beverly，MA)
50单位Vent exo-DNA聚合酶(NEB Biolabs，Beverly，MA)
1020μl超纯水
然后将25微升各个双链体的每一个加入到微量滴定板上。双链体是通过首先稀释两个寡核苷酸引物并将它们以每微升1皮摩尔的终浓度置于下面的溶液中而形成的：1x Thermopol缓冲液(New EnglandBiolabs，Beverly，MA)和0.5x N.BstNB I缓冲液.1x Thermopol缓冲液由10mM KCl、10mM(NH4)2SO4、20mM Tris-HCl(pH8.8)、0.1％的Triton X-100、2mM MgSO4组成，而1x N.BstNB I缓冲液由150mM KCl、10mM Tris-HCl、10mM MgCl2、1mM DTT组成。然后将混合物加热到100℃持续1分钟，然后于50℃维持10分钟以使得能够形成双链体。将平板于4℃再次密封，然后加热到60℃持续1小时。
检验了下面的双链体：
#1(完全碱基配对)
T-1：3′GG ATG CTG ACC TTG T CT  GAG TGG ATG CTG ACC T-5′
B-1：5′CC TAC GAC TGG AAC AGA    CTC  ACC TAC GAC TGG A-3′
#2(完全错配)
T-1：3′GG ATG CTG ACC TTG T CT  GAG TGG ATG CTG ACC T-5′
B-2：5′CC TAC GAC TGG AAC AAT    AAA  ACC TAC GAC TGG A-3′
#3(单个错配)
T-1：3′GG ATG CTG ACC TTG T CT  GAG TGG ATG CTG ACC T-5′
B-3：5′CC TAC GAC TGG AAC AGA    TTC  ACC TAC GAC TGG A-3′
#4 (单个错配)
T-1：3′GG ATG CTG ACC TTG T CT  GAG TGG ATG CTG ACC T-5′
B-4：5′CC TAC GAC TGG AAC AGA    CAC  ACC TAC GAC TGG A-3′
#5(单个错配)
T-1：3′GG ATG CTG ACC TTG T CT  GAG TGG ATG CTG ACC T-5′
B-5：5′CC TAC GAC TGG AAC AGT    CTC  ACC TAC GAC TGG A-3′
#6(2错配)
T-1：3′GG ATG CTG ACC TTG T CT  GAG TGG ATG CTG ACC T-5′
B-6：5′CC TAC GAC TGG AAC AGA    AAC  ACC TAC GAC TGG A-3′
#7(3错配)
T-1：3′GG ATG CTG ACC TTG T CT  GAG TGG ATG CTG ACC T-5′
B-7：5′CC TAC GAC TGG AAC AGT    AAC  ACC TAC GAC TGG A-3′
#8a.
T-1：3′GG ATG CTG ACC TTG T CT  GAG TGG ATG CTG ACC T-5′
B-7：5′CC TAC GAC TGG AAC AGT    AAC  ACC TAC GAC TGG A-3′
#8b.
T-1：3′GG ATG CTG ACC TTG T CT  GAG TGG ATG CTG ACC -5′
B-7：5′CC TAC GAC TGG AAC AGT    AAC  ACC TAC GAC TGG A-3′
#8c.
T-1：3′GG ATG CTG ACC TTG T CT  GAG TGG ATG CTG AC -5′
B-7：5′CC TAC GAC TGG AAC AGT    AAC  ACC TAC GAC TGG A-3′
#8d.
T-1：3′GG ATG CTG ACC TTG T CT  GAG TGG ATG CTG A-5′
B-7：5′CC TAC GAC TGG AAC AGT    AAC  ACC TAC GAC TGG A-3′
#8e.
T-1：3′GG ATG CTG ACC TTG T CT  GAG TGG ATG CTG -5′
B-7：5′CC TAC GAC TGG AAC AGT    AAC  ACC TAC GAC TGG A-3′
#8f
T-1：3′GG ATG CTG ACC TTG T CT  GAG TGG ATG CT -5′
B-7：5′CC TAC GAC TGG AAC AGT    AAC  ACC TAC GAC TGG A-3′
#8g.
T-1：3′GG ATG CTG ACC TTG T CT  GAG TGG ATG C-5′
B-7：5′CC TAC GAC TGG AAC AGT    AAC  ACC TAC GAC TGG A-3′
#8h.
T-1：3′GG ATG CTG ACC TTG T CT  GAG TGG ATG-5′
B-7：5′CC TAC GAC TGG AAC AGT    AAC  ACC TAC GAC TGG A-3′
#8i.
T-1：3′GG ATG CTG ACC TTG T CT  GAG TGG AT-5′
B-7：5′CC TAC GAC TGG AAC AGT    AAC  ACC TAC GAC TGG A-3′
#8j.
T-1：3′GG ATG CTG ACC TTG T CT  GAG TGG A-5′
B-7：5′CC TAC GAC TGG AAC AGT    AAC  ACC TAC GAC TGG A-3′
#8k.
T-1：3′GG ATG CTG ACC TTG T CT  GAG TGG-5′
B-7：5′CC TAC GAC TGG AAC AGT    AAC  ACC TAC GAC TGG A-3′
#8l.
T-1：3′GG ATG CTG ACC TTG T CT  GAG TG-5′
B-7：5′CC TAC GAC TGG AAC AGT    AAC  ACC TAC GAC TGG A-3′
#8m.
T-1：3′GG ATG CTG ACC TTG T CT  GAG T-5′
B-7：5′CC TAC GAC TGG AAC AGT    AAC  ACC TAC GAC TGG A-3′
#8n.
T-1：3′GG ATG CTG ACC TTG T CT  GAG -5′
B-7：5′CC TAC GAC TGG AAC AGT    AAC  ACC TAC GAC TGG A-3′
#9a.
T-1：3′GG ATG CTG ACC TTG T CT  GAG TGG ATG CTG ACC T-5′
B-2：5′CC TAC GAC TGG AAC AAT    AAA  ACC TAC GAC TGG A-3′
#9b.
T-1：3′GG ATG CTG ACC TTG T CT  GAG TGG ATG CTG ACC -5′
B-2：5′CC TAC GAC TGG AAC AAT    AAA  ACC TAC GAC TGG A-3′
#9c.
T-1：3′GG ATG CTG ACC TTG T CT  GAG TGG ATG CTG AC -5′
B-2：5′CC TAC GAC TGG AAC AAT    AAA  ACC TAC GAC TGG A-3′
#9d.
T-1：3′GG ATG CTG ACC TTG T CT  GAG TGG ATG CTG A -5′
B-2：5′CC TAC GAC TGG AAC AAT    AAA  ACC TAC GAC TGG A-3′
#9e.
T-1：3′GG ATG CTG ACC TTG T CT  GAG TGG ATG CTG -5′
B-2：5′CC TAC GAC TGG AAC AAT    AAA  ACC TAC GAC TGG A-3′
#9f.
T-1：3′GG ATG CTG ACC TTG T CT  GAG TGG ATG CT-5′
B-2：5′CC TAC GAC TGG AAC AAT    AAA  ACC TAC GAC TGG A-3′
#9g.
T-1：3′GG ATG CTG ACC TTG T CT  GAG TGG ATG C-5′
B-2：5′CC TAC GAC TGG AAC AAT    AAA  ACC TAC GAC TGG A-3′
#9h.
T-1：3′GG ATG CTG ACC TTG T CT  GAG TGG ATG -5′
B-2：5′CC TAC GAC TGG AAC AAT    AAA  ACC TAC GAC TGG A-3′
#9i.
T-1：3′GG ATG CTG ACC TTG T CT  GAG TGG AT-5′
B-2：5′CC TAC GAC TGG AAC AAT    AAA  ACC TAC GAC TGG A-3′
#9j.
T-1：3′GG ATG CTG ACC TTG T CT  GAG TGG A-5′
B-2：5′CC TAC GAC TGG AAC AAT    AAA  ACC TAC GAC TGG A-3 ′
#9k.
T-1：3′GG ATG CTG ACC TTG T CT  GAG TGG-5′
B-2：5′CC TAC GAC TGG AAC AAT    AAA  ACC TAC GAC TGG A-3′
#9l.
T-1：3′GG ATG CTG ACC TTG T CT  GAG TG-5′
B-2：5′CC TAC GAC TGG AAC AAT    AAA  ACC TAC GAC TGG A-3′
#9m.
T-1：3′GG ATG CTG ACC TTG T CT  GAG T-5′
B-2：5′CC TAC GAC TGG AAC AAT    AAA  ACC TAC GAC TGG A-3′
#9n.
T-1：3′GG ATG CTG ACC TTG T CT  GAG-5′
B-2：5′CC TAC GAC TGG AAC AAT    AAA  ACC TAC GAC TGG A-3′
将平板加载到LC/MS上(Micromass LTD，Manchester，英国和Beverly，MA，美国)，该LC/MS是以负离子模式使用电喷射的LCT飞行时间。条件如下：
层析系统是Agilent HPLC-1100系统，包含二元泵、一个脱气装置、一个柱烤箱、一个二极管阵列探测仪和一个自动调温的微孔板自动注射器(Palo Alto CA)。该柱子为Waters Xterra，整合了以3μM的颗粒大小填充的C18，具300埃的孔大小，2.1mm×50mm(WatersInc.Milford，MA)。柱子是在30℃以在5mM乙酸三乙胺(TEAA)中的乙腈梯度运行的。缓冲液A是5mM TEAA，缓冲液B是5mM TEAA和25％(V/V)的乙腈。梯度起始于10％B并维持1分钟，然后在4分钟内上升至50％B，随后在95％B持续30秒，最终返回到10％B，总的运行时间为6分钟。柱子的温度在30℃保持恒定。流速为每分钟0.416ml注射体积为10微升。流入质谱仪的流速为200μl/分钟，用“T”形物将一半LC流体导入废液缸。质谱仪是具有电喷射进口的Micromass LCT飞行时间(Micromass Inc.Manchester英国)。样品是用1秒的扫描时间在700～2300amu的扫描范围内以电喷射负离子模式运行的。设备参数为：TDC起始电压700，TDC终止电压50，TDC阈值0，TDC增益控制0，TDC边缘控制0，Lteff 1117.5，Veff 4600。原料参数：去溶剂化气体862L/hr，毛细管3000V，样品锥体25V，RF透镜200V，抽取锥体2V，去溶剂化温度250C，原料温度150C，RFDC补偿(offset)1 4V，FR DC补偿(offset)2 1V，孔6V，加速200V，聚焦10V，Steering 0V，MCP探测仪2700V，Pusher循环时间(人工的)60，离子能量40V，管透镜0V，栅格274V，TOF飞行管4620V，Reflectron 1790V。
监控了下面抽取的离子流：对于下面要释放的片段为约1144.7道尔顿加或减1道尔顿：
3′GG ATG CTG ACC-5′
该片段从下面的双链体以及从上面所列的其他双链体释放：
T-1：3′GG ATG CTG ACC TTG T CT  GAG TGG ATG CTG ACC T-5′
B-1：5′CC TAC GAC TGG AAC AGA    CTC  ACC TAC GAC TGG A-3′
结果显示于下表中：
双链体名称  双链N.BstNB1识别序列中的错配数目  观察到的相对质量单位
1  0  121.0
2  5  18.5
3  1  66.7
4  1  61.5
5  1  63.0
6  2  45.0
7  3  21.2
8a  3  23.4
8b  3  28.3
8c  3  11.5
8d  3  29.2
8e  3  14.6
8f  3  17.8
8g  3  20.8
8h  3  12.3
8i  3  14.9
8j  3  18.3
8k  3  19.3
8l  3  15.6
8m  3  18.3
8n  3  12.5
9a  5  21.3
9b  5  17.8
9c  5  19.2
9d  5  15.3
9e  5  14.0
9f  5  15.9
9g  5  28.3
9h  5  22.7
9i  5  23.9
9j  5  21.4
9k  5  22.6
9l  5  22.5
9m  5  13.5
9n  5  14.3
所有在本说明书中所引用和/或列于本申请数据页中的美国专利、美国专利申请出版物、美国专利申请、外国专利、外国专利申请和非专利出版物均在此处整体引入作为参考。
从前文所述中应该理解的是尽管本发明特定的实施方案已在此处以阐明的目的进行了描述，但可进行各种修改而不背离本发明的精神和范围。因此，除附加的权利要求之外本发明不受本申请其它部分的限制。

Claims (120)

1.一种方法，包含
(a)使部分或完全双链的模板核酸分子与切割剂(NA)接触，该模板包含可由NA识别的切割剂识别序列(NARS)；
(b)如果模板不包含可由NA切割的切割位点(NS)，则延伸该模板以提供NS；
(c)在NS切割模板或其延伸产物；
(d)在NS从3’末端延伸步骤(c)的切割产物；
(e)重复步骤(c)和(d)以借此扩增单链核酸片段。
2.权利要求1的方法，其中(e)的单链核酸片段具有不超过25个核苷酸。
3.权利要求1的方法，其中步骤(c)是在DNA聚合酶存在时进行的，该DNA聚合酶选自exo-Vent、exo-Deep Vent、exo-Bst、exo-Pfu、exo-Bca、Taq、DNA聚合酶I的Klenow片段、T5 DNA聚合酶、Phi29 DNA聚合酶、噬菌体M2 DNA聚合酶、噬菌体phiPRD1 DNA聚合酶、测序酶、PRD1 DNA聚合酶、9°NmTM DNA聚合酶和T4 DNA聚合酶。
4.权利要求1的方法，其中步骤(b)、(c)、(d)和(e)在相同的等温条件下进行。
5.权利要求1的方法，其中NA是切割性内切核酸酶(NE)。
6.权利要求1的方法，其中模板核酸分子固定在固体支持体上。
7.权利要求1-6的方法，其中模板核酸进一步包含位于NS的3’的并与NS位于该分子的相同链上的遗传变异，从而该遗传变异整合入扩增的单链核酸片段中。
8.权利要求1-7的方法，其中模板核酸由下面的方法形成，该方法包含
(i)形成第一个寡核苷酸引物(ODNP)、第二个ODNP和包含遗传变异的目标核酸的混合物，其中
(a)如果目标核酸是具有第一链和第二链的双链核酸，那么
第一个ODNP包含切割性内切核酸酶识别序列(NERS)的有义链的核苷酸序列和至少基本与位于遗传变异互补链3’的目标核酸第一链的核苷酸序列互补的核苷酸序列，且
第二个ODNP包含至少基本与位于遗传变异3’的目标核酸第二链的核苷酸序列互补的核苷酸序列，且可选择地包含限制性内切核酸酶识别序列(RERS)的一条链的序列，
或
(b)如果目标核酸是单链核酸，那么
第一个ODNP包含切割性内切核酸酶识别序列(NERS)的有义链的序列和至少基本与位于遗传变异5’的目标核酸相同的核苷酸序列，且
第二个ODNP包含至少基本与位于遗传变异3’的目标核酸的核苷酸序列互补的核苷酸序列，且可选择地包含限制性内切核酸酶识别序列(RERS)的一条链的序列；
(ii)延伸第一个和第二个ODNP以生产具有NERS和RERS两者的片段；和
(iii)可选择地用识别RERS的限制性内切核酸酶切割步骤(ii)的延伸产物。
9.权利要求1-7的方法，其中模板核酸由下面的方法形成，该方法包含
(i)形成第一个ODNP、第二个ODNP和包含遗传变异的目标核酸的混合物，其中
(a)如果目标核酸是具有第一链和第二链的双链核酸，那么
第一个ODNP包含第一个限制性内切核酸酶识别序列(RERS)的一条链的核苷酸序列和至少基本与位于遗传变异互补链3’的目标核酸第一链的核苷酸序列互补的核苷酸序列，且
第二个ODNP包含第二个RERS的一条链的序列和至少基本与位于遗传变异3’的目标核酸第二链的核苷酸序列互补的核苷酸序列，
或
(b)如果目标核酸是单链核酸，那么
第一个ODNP包含第一个限制性内切核酸酶识别序列(RERS)的一条链的序列和至少基本与位于遗传变异5’的目标核酸的核酸序列互补的核苷酸序列，且
第二个ODNP包含第二个RERS的一条链的序列和至少基本与位于遗传变异3’的目标核酸的核苷酸序列互补的核苷酸序列；
(ii)在脱氧核苷三磷酸和至少一种修饰的脱氧核苷三磷酸存在时延伸第一个和第二个ODNP以生产具有第一个和第二个RERS两者的片段。
10.权利要求1-7的方法，其中模板核酸由下面的方法形成，该方法包含
(i)形成第一个ODNP、第二个ODNP和包含遗传变异的目标核酸的混合物，其中
(a)如果目标核酸是具有第一链和第二链的双链核酸，那么
第一个ODNP包含至少基本与位于遗传变异互补链3’的目标核酸第一链的核苷酸序列互补的核苷酸序列，且
第二个ODNP包含至少基本与位于遗传变异3’的目标核酸第二链的核苷酸序列互补的核苷酸序列，
或
(b)如果目标核酸是单链核酸，那么
第一个ODNP包含至少基本与位于遗传变异5’的目标核酸的核苷酸序列相同的核苷酸序列，且
第二个ODNP包含至少基本与位于遗传变异3’的目标核酸的核苷酸序列互补的核苷酸序列；
第一个和第二个ODNP各自进一步包含NERS的有义链的序列；
(ii)延伸第一个和第二个ODNP以生产具有两个NERS的片段。
11.权利要求1的方法，其中模板核酸分子进一步在含有NS的链中包含5’突出端或在不含有NS的链中包含3’突出端，其中突出端包含至少基本与目标核酸互补的核酸序列。
12.权利要求11的方法，该方法进一步包含：
(i)在一定条件下使模板核酸与生物学样品中的核酸分子混合，其中该生物学样品可能含有目标核酸，并且所述条件为：当目标核酸存在于生物学样品中时，该目标核酸可与模板核酸的突出端进行杂交；和
(ii)在进行步骤(a)之前从步骤(i)的混合物中去除未杂交的模板核酸；和
(iii)使杂交的模板核酸与NA组合。
13.权利要求1的方法，其中双链模板核酸分子进一步包含IIs型限制性内切核酸酶识别序列(TRERS)，并且是通过使核酸连接物与双链目标核酸连接而提供的，从而扩增的单链核酸分子包含目标核酸的一部分、包含IIs型限制性内切核酸酶识别序列(TRERS)的核酸连接物和NARS，其中在不含有NS的链上，识别TRERS的IIs型限制性内切核酸酶的裂解位点位于双链目标核酸片段中且在相应于NS的位置的5’。
14.权利要求1-7的方法，其中模板核酸进一步包含位于NS的3’的上游外显子(Exon A)和下游外显子(Exon B)之间的连接，从而在连接的两边与该连接相邻的核苷酸整合入扩增的单链核酸片段中。
15.权利要求14的方法，其中模板核酸由下面的方法形成，该方法包含
(i)使第一个寡核苷酸引物(ODNP)、第二个ODNP和cDNA混合，其中
第一个ODNP包含至少基本与靠近反义链中Exon A的5’末端的ExonA的反义链的部分互补的序列，
第二个ODNP包含至少基本与靠近有义链中Exon B的5’末端的ExonB的有义链的部分互补的序列，且
第一个ODNP和第二个ODNP中的至少一个进一步包括切割剂识别序列(NARS)的有义链的序列；和
(ii)延伸第一个ODNP和第二个ODNP以提供包含第一个ODNP和第二个ODNP的模板核酸。
16.一种扩增单链核酸分子的方法，该方法包含：
(A)形成混合物，该混合物包含：
(i)目标核酸；
(ii)寡核苷酸引物，该引物
(a)包含可由在识别序列之外进行切割的切割剂识别的双链切割剂识别序列的有义链的序列，和
(b)至少基本与目标核酸互补；和
(B)用模板核酸的部分作为模板在切割剂存在时扩增单链核酸分子。
17.权利要求16的方法，其中双链切割剂识别序列可由N.BstNBI识别。
18.权利要求16的方法，其中当寡核苷酸引物与目标核酸退火时，双链切割剂识别序列有义链的序列内的一个核苷酸与目标核酸的另一个核苷酸不形成常规的碱基配对。
19.权利要求16的方法，其中当寡核苷酸引物与目标核酸退火时，双链切割剂识别序列有义链的序列内的两个或更多核苷酸与目标核酸的核苷酸不形成常规的碱基配对。
20.一种方法，该方法包含：
(A)形成混合物，该混合物包含：
(i)目标核酸；
(ii)寡核苷酸引物，该引物
(a)包含可由切割剂(NA)识别的NARS有义链的核苷酸序列，其中该切割剂在NARS之外进行切割，和
(b)至少基本与目标核酸的第一个区域互补；和
(iii)部分双链的核酸，该部分双链的核酸
(a)包含双链的IIs型限制性内切核酸酶识别序列，和
(b)至少基本与位于第一个区域的5’的目标核酸的第二个区域互补的3’突出端；
上述形成混合物的步骤是在一定条件下进行的，该条件使得寡核苷酸引物和目标的第一个区域之间及部分双链的核酸的3’突出端和目标的第二个区域之间能够进行杂交；
(B)消化与寡核苷酸引物杂交和在第二个区域与部分双链核酸杂交的目标核酸；
(C)用步骤(B)中消化的目标核酸的部分作为模板在切割剂存在时扩增单链核酸分子。
21.一种在目标核酸的限定位置鉴定遗传变异的方法，该方法包括：
(a)提供部分或完全双链的模板核酸，该模板核酸包含目标核酸的一部分，该部分包括限定位置的遗传变异，并且该模板核酸进一步包含位于遗传变异5’的切割位点(NS)；
(b)在DNA聚合酶和在NS切割的切割剂(NA)存在时扩增单链核酸片段，该单链核酸片段包含遗传变异，且其5’末端位于NS；和
(c)表征单链核酸片段以借此鉴定遗传变异。
22.权利要求21的方法，其中遗传变异是单核苷酸多态。
23.权利要求21的方法，其中单链核酸片段含有不超过25个核苷酸。
24.权利要求21的方法，其中目标核酸是基因组核酸或cDNA。
25.权利要求21的方法，其中NA是切割性内切核酸酶(NE)。
26.权利要求21的方法，其中步骤(b)在等温条件下进行。
27.权利要求21的方法，其中扩增的单链核酸片段含有不超过17个核苷酸。
28.权利要求21的方法，其中步骤(c)的表征是至少部分通过使用选自质谱分析法、液相层析、荧光偏振和电泳的技术进行的。
29.一种根据权利要求21的在目标核酸的限定位置鉴定遗传变异的方法，该方法包含：
(a)形成包括第一个寡核苷酸引物(ODNP)、第二个ODNP和目标核酸的混合物，其中
(i)如果目标核酸是具有第一链和第二链的双链核酸，那么
第一个ODNP包含至少基本与位于遗传变异互补链3’的目标核酸第一链的核苷酸序列互补的核苷酸序列，且
第二个ODNP包含至少基本与位于遗传变异3’的目标核酸第二链的核苷酸序列互补的核苷酸序列，
或
(ii)如果目标核酸是单链核酸，那么
第一个ODNP包含至少基本与位于遗传变异5’的目标核酸的核苷酸序列相同的核苷酸序列，且
第二个ODNP包含至少基本与位于遗传变异3’的目标核酸的核苷酸序列互补的核苷酸序列，
第一个和第二个ODNP各自进一步包含切割性内切核酸酶识别序列(NERS)的有义链的核苷酸序列；
(b)延伸第一个和第二个ODNP以生产包含两个NERS的延伸产物；
(c)用步骤(b)的延伸产物的一条链作为模板在识别NERS的一种或多种切割性内切核酸酶(NE)存在时扩增单链核酸片段；和
(d)表征步骤(c)的单链片段以借此鉴定遗传变异。
30.一种确定核酸群体中第一个核酸分子的数目与第二个核酸分子的数目之间的比率的方法，其中第一个和第二个核酸分子的序列除限定位置之外是相同的，该方法包含：
(a)混合第一个寡核苷酸引物(ODNP)、第二个ODNP和核酸群体，其中
(i)如果第一个和第二个核酸是双链的，均具有第一链和第二链，
(a)第一个ODNP包含至少基本与位于限定位置3’的第一个核酸第一链的核酸序列互补的核苷酸序列，和
(b)第二个ODNP包含至少基本与位于限定位置3’的第一个核酸第二链的核酸序列互补的核苷酸序列，
或
(ii)如果第一个和第二个核酸是单链的，
(a)第一个ODNP包含至少基本与位于限定位置5’的第一个核酸的核酸序列相同的核苷酸序列，和
(b)第二个ODNP包含至少基本与位于限定位置3’的第一个核酸中的核酸序列互补的核苷酸序列；和
第一个ODNP和第二个ODNP中的至少一个进一步包含切割剂识别序列(NARS)的有义链的序列；
(b)延伸第一个和第二个ODNP以生产由第一个和第二个ODNP包围的片段；
(c)在DNA聚合酶和识别NARS的切割剂(NA)存在时扩增单链核酸片段；和
(d)确定步骤(c)中源自第一个核酸的单链核酸片段的数目相对于源自第二个核酸的单链核酸片段数目的比率。
31.权利要求30的方法，其中第一个ODNP或第二个ODNP包含RERS一条链的序列，但不包含NERS有义链的序列；且由步骤(b)产生的片段不含有半修饰的RERS。
32.权利要求30的方法，其中在进行步骤(c)之前，步骤(b)扩增的片段可由识别RERS的RE消化。
33.权利要求30的方法，其中步骤(c)的扩增产物是含有不超过35个核苷酸的单链核酸片段。
34.一种确定样品中目标核酸存在与否的方法，该方法包含：
(a)使样品中的核酸分子与部分双链的寡核苷酸探针混合，从而使得探针与目标核酸进行杂交，该探针包含
(i)可由切割剂(NA)裂解以产生切割位点(NS)的切割剂识别序列(NARS)，和
(ii)自身或其延伸产物含有NS的链中的5’突出端，或
自身或其延伸产物均不含有NS的链中的3’突出端，
其中突出端包含至少基本与目标核酸互补的核酸序列，
(b)从未杂交的探针中分离未杂交的探针；
(c)在NA、DNA聚合酶和杂交的探针存在时进行扩增反应以提供扩增产物；和
(d)探测步骤(c)的扩增产物的存在与否以借此确定样品中目标核酸的存在与否。
35.权利要求34的方法，其中目标核酸是源自选自细菌、病毒、真菌和寄生物的成员的核酸分子。
36.权利要求34的方法，其中NA是N.BstNB I。
37.权利要求34的方法，其中步骤(c)在等温条件下实施。
38.权利要求34的方法，其中步骤(c)在标记的脱氧核苷三磷酸存在时进行，该标记的脱氧核苷三磷酸是与标记连接的脱氧核苷三磷酸，且该标记选自放射性标记、酶、荧光染料、洋地黄毒苷和生物素。
39.权利要求34的方法，其中扩增产物如果存在则含有不超过35个核苷酸。
40.权利要求34的方法，其中样品中的核酸分子固定于固体支持体上。
41.权利要求34的方法，其中在步骤(d)探测之前，步骤(c)的扩增产物固定于固体基质上。
42.一种确定样品中是否存在目标核酸的方法，该方法包含：
(A)形成混合物，该混合物包含：
(i)样品的核酸分子；
(ii)单链核酸探针，该探针从3’到5’包含：
(a)至少基本与目标核酸互补的第一个序列，
(b)切割剂识别序列(NARS)的反义链的序列，和
(c)第二个序列；
(iii)识别NARS的切割性内切核酸酶(NA)、DNA聚合酶和一种或多种脱氧核苷三磷酸；
(B)在一定条件下维持混合物，该条件为：如果目标核酸存在于样品中则可用单链核酸探针作为模板扩增单链核酸片段，其中该单链核酸片段长度最多为25个核苷酸；和
(C)探测步骤(B)中扩增的单链核酸片段的存在与否以确定样品中目标核酸的存在与否。
43.一种确定样品中是否存在目标核酸的方法，该方法包含：
(A)形成混合物，该混合物包含：
(i)样品的核酸分子；
(ii)单链核酸探针，该探针从3’到5’包含：
(a)至少基本与目标核酸互补的序列，
(b)切割剂识别序列(NARS)的有义链的序列，
(iii)识别第一个NARS的切割性内切核酸酶(NA)、DNA聚合酶和一种或多种脱氧核苷三磷酸；
(B)在一定条件下维持混合物，该条件为：如果目标核酸存在于样品中则能够扩增至少基本与目标核酸互补的单链核酸片段，其中该单链核酸片段长度最多为25个核苷酸；和
(C)探测步骤(B)中扩增的单链核酸片段的存在与否以确定样品中目标核酸的存在与否。
44.一种确定样品中是否存在包含切割剂识别序列(NARS)的目标核酸的方法，该方法包含：
(A)形成混合物，该混合物包含：
(i)样品的核酸分子；
(ii)识别NARS的切割剂(NA)、DNA聚合酶和一种或多种脱氧核苷三磷酸；
(B)在一定条件下维持混合物，该条件为：如果目标核酸存在于样品中则可用目标核酸的部分作为模板扩增单链核酸片段；和
(C)探测步骤(B)中扩增的单链核酸片段的存在与否以确定样品中目标核酸的存在与否。
45.一种确定样品中是否存在包含切割剂识别序列(NARS)的目标核酸的方法，该方法包含：
(A)形成混合物，该混合物包含：
(i)样品的核酸分子；
(ii)基本与目标核酸的一条链相同且包含NARS的反义链序列的单链核酸探针；
(iii)识别NARS的切割剂(NA)、DNA聚合酶和一种或多种脱氧核苷三磷酸；
(B)在一定条件下维持混合物，该条件为：如果目标核酸存在于样品中则可用探针的部分作为模板扩增单链核酸片段；和
(C)探测步骤(B)中该单链核酸片段的存在与否以确定样品中目标核酸的存在与否。
46.权利要求42-45的方法，其中步骤(B)的单链核酸片段长度最多为25个核苷酸。
47.权利要求42-46的方法，其中样品的核酸分子是固定的。
48.权利要求42-46的方法，其中单链核酸探针固定于固体支持体上。
49.权利要求1或34的方法，其中NARS含有错配的碱基对。
50.一种探测cDNA分子中基因的上游外显子(Exon A)和下游外显子(Exon B)之间的连接存在与否的方法，该方法包含：
(a)混合第一个寡核苷酸引物(ODNP)、第二个ODNP和cDNA，其中
第一个ODNP包含至少基本与靠近反义链中Exon A的5’末端的ExonA反义链的部分互补的序列，
第二个ODNP包含至少基本与靠近有义链中Exon B的5’末端的ExonB有义链的部分互补的序列，和
第一个ODNP和第二个ODNP中的至少一个进一步包含切割剂识别序列(NARS)的有义链的序列；
(b)在如果Exon A和Exon B均存在于cDNA中时可产生由第一个ODNP和第二个ODNP包围的片段的条件下进行延伸反应；
(c)在DNA聚合酶和识别NARS的切割剂(NA)存在时进行扩增反应；和
(d)如果存在步骤(c)的扩增产物，则表征扩增产物以借此确定Exon A和Exon B之间连接的存在与否。
51.权利要求50的方法，其中第一个ODNP和第二个ODNP两者均包含NARS有义链的序列。
52.权利要求50的方法，其中NERS可由N.BstNB I识别。
53.权利要求50的方法，其中第一个ODNP或第二个ODNP不含有NERS有义链的序列，但包含RERS一条链的序列；且由步骤(b)产生的片段不含有半修饰的RERS。
54.权利要求50的方法，其中步骤(c)在等温条件下进行。
55.权利要求50的方法，其中扩增产物如果存在则是含有不超过35个核苷酸的单链核酸片段。
56.用于探测cDNA分子中基因的上游外显子(Exon A)和下游外显子(Exon B)之间的连接存在与否的寡核苷酸引物(ODNP)对，包含
(a)第一个ODNP包含至少基本与靠近反义链中Exon A的5’末端的Exon A反义链的部分互补的序列，和
第二个ODNP包含至少基本与靠近有义链中Exon B的5’末端的ExonB有义链的部分互补的序列；和
其中第一个ODNP和第二个ODNP中的至少一个进一步包含切割剂识别序列(NARS)的有义链的序列。
57.权利要求56的ODNP对，其中NARS是切割性内切核酸酶识别序列(NERS)。
58.权利要求56的ODNP对，其中第一个ODNP和第二个ODNP均包含NARS有义链的序列。
59.权利要求58的ODNP对，其中NARS是NERS。
60.权利要求56的ODNP对，其中第一个ODNP包含NERS有义链的序列，而第二个ODNP包含RERS一条链的序列。
61.权利要求56的ODNP对，其中第一个ODNP包含RERS一条链的序列，而第二个ODNP包含NERS有义链的序列。
62.权利要求56的ODNP对，其中第二个ODNP长度至少为12个核苷酸。
63.一种制备用于合成单链cDNA分子的模板核酸分子的方法，该方法包含
a.提供双链cDNA分子；和
b.使双链cDNA分子与包含切割剂识别序列(NARS)的核酸连接物连接，从而在识别NARS的切割剂(NA)和DNA聚合酶存在时用该连接产物作为模板扩增的单链核酸分子包含所述双链cDNA分子一条链的至少一部分。
64.权利要求63的方法，其中所述部分的长度至少为8个核苷酸。
65.权利要求63的方法，其中所述部分的长度至少为12个核苷酸。
66.权利要求63的方法，其中双链cDNA分子或核酸连接物通过末端固定，该末端不参与双链cDNA分子和核酸连接物之间的连接。
67.权利要求63的方法，其中NA是切割性内切核酸酶(NE)。
68.一种制备cDNA文库的方法，该方法包含
a.提供从生物学样品中分离的mRNA分子；
b.用mRNA分子作为模板制备双链cDNA分子；和
c.使双链cDNA分子与包含切割剂识别序列(NARS)的核酸连接物连接，从而在识别NARS的切割剂和DNA聚合酶存在时用该连接产物作为模板扩增的单链核酸分子包含所述双链cDNA分子一条链的至少一部分。
69.权利要求68的方法，其中所述部分的长度至少为8个核苷酸。
70.一种在目标核酸的限定位置鉴定单核苷酸多态(SNP)的方法，该方法包含
(a)提供部分或完全双链的模板核酸，该模板核酸包含在限定位置包括SNP的目标核酸的一部分，并进一步包含位于遗传变异5’的切割位点(NS)；
(b)在DNA聚合酶和在NS进行切割的切割性内切核酸酶(NE)存在时于等温条件下扩增单链核酸片段，该单链核酸片段包含遗传变异、含有不超过17个核苷酸，且其5’末端位于NS；和
(c)至少部分用液相层析和/或质谱分析法表征单链核酸片段以借此鉴定SNP。
71.权利要求70的方法，其中NE是N.BstNB I。
72.权利要求70的方法，其中步骤(b)是在50℃～70℃进行的。
73.一种确定来自哺乳动物被试者的生物学样品中目标核酸存在与否的方法，该方法包含：
(a)使样品中的核酸分子与部分双链的寡核苷酸探针混合，从而使得探针与目标核酸进行杂交，该探针包含
(i)可由切割性内切核酸酶(NE)裂解以产生切割位点(NS)的切割性内切核酸酶识别序列(NERS)，和
(ii)自身或其延伸产物含有NS的链中的5’突出端，或
自身或其延伸产物均不含有NS的链中的3’突出端，
其中突出端包含至少基本与目标核酸互补的核酸序列，
(b)从步骤(a)的混合物中去除未杂交的探针；
(c)在NE和DNA聚合酶存在时于等温条件下进行扩增反应以提供含有不超过17个核苷酸的扩增产物；和
(d)至少部分用液相层析和/或质谱分析法探测步骤(c)的扩增产物的存在与否以借此确定样品中目标核酸的存在与否。
74.权利要求73的方法，其中步骤(c)的扩增产物含有不超过12个核苷酸。
75.一种在各自含有第一链和第二链的目标核酸的限定位置多重鉴定遗传变异的方法，该方法包含，
(a)对于每一个目标核酸，
(i)形成第一个寡核苷酸引物(ODNP)、第二个ODNP和目标核酸的混合物，其中
a)如果目标核酸是具有第一链和第二链的双链核酸，那么
第一个ODNP包含切割性内切核酸酶识别序列(NERS)的有义链的序列和至少基本与位于遗传变异互补链3’的目标核酸第一链的核苷酸序列互补的核苷酸序列，且
第二个ODNP包含可选择的限制性内切核酸酶识别序列(RERS)的一条链的序列和至少基本与位于遗传变异3’的目标核酸第二链的核苷酸序列互补的核苷酸序列
或
b)如果目标核酸是单链核酸，那么
第一个ODNP包含NERS的有义链的序列和至少基本与位于遗传变异5’的目标核酸的核苷酸序列相同的核苷酸序列，且
第二个ODNP包含可选择的RERS的一条链的序列和至少基本与位于遗传变异3’的目标核酸的核苷酸序列互补的核苷酸序列；
(ii)延伸第一个和第二个ODNP以生产由第一个ODNP和第二个ODNP包围的片段，其中延伸反应可单独对每一个目标核酸进行或共同对超过一个目标核酸来进行；
(b)可选择地用识别RERS的RE切割延伸产物；
(c)用步骤(b)的每种延伸产物或步骤(c)的每种消化产物的一条链作为模板在识别NERS的切割性内切核酸酶存在时扩增单链核酸片段；和
(d)表征所述单链片段以借此鉴定遗传变异。
76.权利要求75的方法，其中，当目标核酸为双链时与该目标核酸第一链至少基本互补的第一个ODNP的核苷酸序列长度，或当目标核酸是单链时与该目标核酸基本相同的第一个ODNP的核苷酸序列长度至少为12个核苷酸。
77.权利要求75的方法，其中，当目标核酸是双链时与该目标核酸的第二链或该目标核酸至少基本互补的第二个ODNP的核苷酸序列长度至少为12个核苷酸。
78.权利要求75的方法，其中RERS可由间断的限制性内切核酸酶识别。
79.权利要求75的方法，其中NERS是5’GAGTC3’。
80.权利要求75的方法，其中步骤(c)在等温条件下进行。
81.权利要求75的方法，其中步骤(c)的单链核酸片段含有不超过17个核苷酸。
82.权利要求75的方法，该方法进一步包含在进行步骤(c)之前组合步骤(a)(ii)中至少2个延伸反应的产物。
83.权利要求75的方法，其中至少一个遗传变异是单核苷酸多态。
84.一种用于在目标核酸的限定位置鉴定遗传变异的试剂盒，该试剂盒包含：
(a)如果目标核酸是具有第一链和第二链的双链核酸，
(i)第一个寡核苷酸引物(ODNP)包含切割性内切核酸酶识别序列(NERS)的有义链的序列及至少基本与位于遗传变异互补链3’的目标核酸第一链的核苷酸序列互补的核苷酸序列，和
(ii)第二个ODNP包含可选择的限制性内切核酸酶识别序列(RERS)的一条链的序列和至少基本与位于遗传变异3’的目标核酸第二链的核苷酸序列互补的核苷酸序列；
或
(b)如果目标核酸是单链核酸，那么
(i)第一个ODNP包含NERS的有义链的序列和至少基本与位于遗传变异5’的目标核酸的核苷酸序列相同的核苷酸序列，和
(ii)第二个ODNP包含可选择的RERS的一条链的序列和至少基本与位于遗传变异3’的目标核酸的核苷酸序列互补的核苷酸序列。
85.权利要求84的试剂盒，其中在用第一个和第二个ODNP作为引物并以目标核酸作为模板扩增的双链核酸分子中，一条链中由识别NERS的切割性内切核酸酶(NE)产生的切割位点(NS)和相应于另一条链中由识别RERS的限制性内切核酸酶(RE)产生的裂解位点的位置之间的距离不超过35个核苷酸。
86.权利要求84的试剂盒，其中一条链中的NS和相应于另一条链中RE的裂解位点的位置之间的距离不超过25个核苷酸。
87.部分双链的寡核苷酸探针，该探针包含
(a)可由切割剂(NA)裂解以产生切割位点(NS)的切割剂识别序列(NARS)；
(b)在含有NS的链中的5’突出端或在不含有NS的链中的3’突出端，其中每一个突出端包含至少基本与目标核酸互补的核酸序列；和
(c)在自身和其延伸产物均不含有NS的链中的序列，该序列位于相应于NS的位置的5’，且该序列特异性地与目标核酸相关，其中所述突出端至少基本与所述目标核酸互补。
88.权利要求87的寡核苷酸探针，其中目标核酸是变性的双链核酸的一条链。
89.权利要求87的寡核苷酸探针，其中双链核酸是基因组核酸或cDNA。
90.权利要求87的寡核苷酸探针，其中双链区域长度为12-20个核苷酸。
91.权利要求87的寡核苷酸探针，其中5’突出端或3’突出端长度为8-20个核苷酸。
92.包含第一个ODNP和第二个ODNP的寡核苷酸引物(ODNP)对，其中
(a)第一个ODNP包含至少基本与位于限定位置3’的单链目标核酸的核苷酸序列互补的核苷酸序列；
(b)第二个ODNP包含至少基本与目标核酸互补链的核苷酸序列互补的核苷酸序列，该目标核酸互补链的核苷酸序列位于限定位置的核苷酸的至少基本互补的核苷酸的3’；
(c)第一个和第二个ODNP进一步分别包含间断的限制性内切核酸酶识别序列(IRERS)而不是完整的IRERS的第一条链的第一个不变识别序列(CRS)和第二条链的第二个CRS，其中，完整的IRERS是具有第一链和第二链的双链核酸，且包含由可变识别序列(VRS)连接的第一个和第二个CRS；和
(d)第一个或第二个ODNP进一步包含位于第一个CRS或第二个CRS的5’的NERS。
93.一种确定核酸分子群体中第一个核酸分子的数目与第二个核酸分子的数目之间的比率的方法，其中第一个和第二个核酸分子的核苷酸序列除限定位置之外是相同的，该方法包含：
(a)混合第一个寡核苷酸引物(ODNP)、第二个ODNP和核酸群体，其中
(i)如果第一个和第二个核酸是双链的，均具有第一链和第二链，那么
(a)第一个ODNP包含至少基本与位于限定位置3’的第一个核酸第一链的核酸序列互补的核苷酸序列，和
(b)第二个ODNP包含至少基本与位于限定位置3’的第一个核酸第二链的核酸序列互补的核苷酸序列，
或，
(ii)如果第一个和第二个核酸是单链的，那么
(a)第一个ODNP包含至少基本与位于限定位置5’的第一个核酸的核酸序列相同的核苷酸序列，和
(b)第二个ODNP包含至少基本与位于限定位置3’的第一个核酸中的核酸序列互补的核苷酸序列；和
第一个ODNP和第二个ODNP中的至少一个进一步包含切割性内切核酸酶识别序列(NERS)的有义链的序列；
(b)延伸第一个和第二个ODNP以生产由第一个和第二个ODNP包围的片段；
(c)在DNA聚合酶和识别NERS的切割性内切核酸酶(NE)存在时于等温条件下扩增单链核酸片段，其中单链核酸片段各自含有不超过17个核苷酸；和
(d)至少部分用液相层析和/或质谱分析法确定步骤(c)中源自第一个核酸的单链核酸片段的数目相对于源自第二个核酸的单链核酸片段数目的比率。
94.一种确定核酸群体中在限定位置具有遗传变异的目标核酸分子的等位基因频率的方法，该方法包含：
(a)混合第一个寡核苷酸引物(ODNP)、第二个ODNP和核酸群体，其中
(i)如果目标核酸是双链的，均具有第一链和第二链，那么
(a)第一个ODNP包含至少基本与位于限定位置3’的目标核酸第一链的核酸序列互补的核苷酸序列，和
(b)第二个ODNP包含至少基本与位于限定位置3’的目标核酸第二链的核酸序列互补的核苷酸序列，
或，
(ii)如果目标核酸是单链的，那么
(a)第一个ODNP包含至少基本与位于限定位置5’的目标核酸的核酸序列相同的核苷酸序列，和
(b)第二个ODNP包含至少基本与位于限定位置3’的目标核酸中的核酸序列互补的核苷酸序列；和
第一个ODNP和第二个ODNP中的至少一个进一步包含切割性内切核酸酶识别序列(NERS)的有义链的序列；
(b)延伸第一个和第二个ODNP以生产由第一个和第二个ODNP包围的片段；
(c)在DNA聚合酶和识别NERS的切割性内切核酸酶(NE)存在时于等温条件下扩增单链核酸片段，其中单链核酸片段各自含有不超过17个核苷酸；和
(d)至少部分用液相层析和质谱分析法确定含有目标核酸中的遗传变异的步骤(c)的单链核酸片段(产物A)占与产物A除遗传变异之外相同的步骤(c)中所有单链核酸片段的百分比，以借此确定该目标核酸的等位基因频率。
95.一种核酸连接物，该连接物包含
(a)可选择的IIs型限制性内切核酸酶识别序列(TRERS)；和
(b)切割剂识别序列(NARS)，
其中当该连接物与双链目标核酸片段连接，从而在不含有识别NARS的切割剂(NA)的切割位点(NS)的链中，目标核酸片段位于NARS的5’时，如果TRERS存在，那么识别该链中的TRERS的IIs型限制性内切核酸酶的裂解位点则同时位于
(i)双链目标核酸片段中，和
(ii)相应于NS的位置的5’。
96.权利要求95的核酸连接物，其中NA是切割性内切核酸酶(NE)。
97.权利要求95的核酸连接物，其中在含有NS的链中，TRERS位于NARS的5’。
98.权利要求95的核酸连接物，其中在含有NS的链中，TRERS位于NARS的3’。
99.权利要求95的核酸连接物，其中TRERS可由Bpm I或Mme I识别。
100.权利要求95的核酸连接物，其中连接物具有用于与目标核酸片段连接的3’突出端。
101.权利要求95的核酸连接物，其中连接物具有用于与目标核酸片段连接的5’突出端。
102.权利要求95的核酸连接物，其中连接物具有用于与目标核酸片段连接的平头末端。
103.一种核酸连接物，该连接物包含
(a)IIs型限制性内切核酸酶识别序列(TRERS)；和
(b)切割剂识别序列(NARS)，
其中当该连接物与双链目标核酸片段连接，从而在不含有识别NARS的切割剂(NA)的切割位点(NS)的链中，目标核酸片段位于NARS的5’时，识别该链中的TRERS的IIs型限制性内切核酸酶的裂解位点则同时位于
(i)双链目标核酸片段中，和
(ii)相应于NS的位置的5’。
104.用于合成单链cDNA分子的模板核酸分子，该模板核酸分子包含
(a)双链cDNA分子或其片段；和
(b)核酸连接物，其中该核酸连接物包含与双链cDNA分子或其片段连接的切割剂识别序列(NARS)，从而在识别NARS的切割剂(NA)和DNA聚合酶存在时用该连接产物作为模板扩增的单链cDNA分子包含双链cDNA或其片段一条链的至少一部分，该部分长度为至少8个核苷酸。
105.权利要求104的模板核酸分子，其中模板核酸分子的至少一条链是通过双链cDNA分子或核酸连接物的末端固定于固体支持体上的，并且该末端是不参与双链cDNA分子和核酸连接物之间的连接的末端。
106.权利要求104的模板核酸分子，其中在固相和模板核酸分子的末端之间存在连接体分子。
107.权利要求106的模板核酸分子，其中连接体包含限制性内切核酸酶识别序列(RERS)一条链的序列。
108.一种方法，该方法包含
(a)提供一种双链核酸，该双链核酸包含
(i)可选择的IIs型限制性内切核酸酶识别序列(TRERS)，
(ii)切割剂识别序列(NARS)，和
(iii)目标核酸片段，
其中在不含有识别NARS的切割剂(NA)的切割位点(NS)的链中，
(1)目标核酸片段位于NARS的5’，和
(2)如果存在TRERS，那么识别TRERS的IIs型限制性内切核酸酶的裂解位点位于目标核酸片段内和相应于NS的位置的5’；
(b)可选择地用识别TRERS的IIs型限制性内切核酸酶裂解双链核酸；和
(c)在识别NARS的NA存在时扩增单链核酸片段。
109.一种方法，该方法包含
(a)提供一种双链核酸，该双链核酸包含
(i)IIs型限制性内切核酸酶识别序列(TRERS)，
(ii)切割性内切核酸酶识别序列(NERS)，和
(iii)目标核酸的片段，
其中在不含有识别NERS的切割性内切核酸酶(NE)的切割位点(NS)的链中，
(1)目标核酸片段位于NERS的5’，和
(2)识别TRERS的IIs型限制性内切核酸酶的裂解位点位于目标核酸片段内和相应于NS的位置的5’；
(b)用识别TRERS的IIs型限制性内切核酸酶裂解双链核酸；和
(c)在识别NARS的NA存在时于等温条件下扩增单链核酸片段，其中该单链核酸片段含有不超过25个核苷酸。
110.一种制备多个单链核酸探针的方法，该方法包含
(a)提供双链核酸，每一个双链核酸包含
(i)可选择的IIs型限制性内切核酸酶识别序列(TRERS)，
(ii)切割剂识别序列(NARS)，和
(iii)目标核酸片段，
其中在不含有识别NARS的切割剂(NA)的切割位点(NS)的链中，
(1)目标核酸片段位于NARS的5’，和
(2)如果存在TRERS，那么识别TRERS的IIs型限制性内切核酸酶的裂解位点位于目标核酸片段内和相应于NS的位置的5’；
(b)可选择地用识别TRERS的IIs型限制性内切核酸酶裂解双链核酸；和
(c)在识别NARS的NA存在时扩增单链核酸片段。
111.一种制备多个单链核酸探针的方法，该方法包含
(a)提供双链核酸，每一个双链核酸包含
(i)IIs型限制性内切核酸酶识别序列(TRERS)，
(ii)切割性内切核酸酶识别序列(NERS)，和
(iii)目标核酸片段，
其中在不含有识别NERS的切割性内切核酸酶(NE)的切割位点(NS)的链中，
(1)目标核酸片段位于NARS的5’，和
(2)如果存在TRERS，那么识别TRERS的IIs型限制性内切核酸酶的裂解位点位于目标核酸片段内和相应于NS的位置的5’；
(b)用识别TRERS的IIs型限制性内切核酸酶裂解双链核酸；和
(c)在识别NERS的NE存在时于等温条件下扩增单链核酸片段，其中该单链核酸片段每一个含有不超过25个核苷酸。
112.一种探测cDNA分子中基因的上游外显子(Exon A)和下游外显子(Exon B)之间的连接存在与否的方法，该方法包含：
(a)混合第一个寡核苷酸引物(ODNP)、第二个ODNP和cDNA，其中
第一个ODNP包含至少基本与靠近反义链中Exon A的5’末端的ExonA反义链的部分互补的序列，
第二个ODNP包含至少基本与靠近有义链中Exon B的5’末端的ExonB有义链的部分互补的序列，和
第一个ODNP和第二个ODNP中的至少一个进一步包含切割性内切核酸酶识别序列(NERS)的有义链的序列；
(b)在如果Exon A和Exon B均存在于cDNA中时可产生由第一个ODNP和第二个ODNP包围的片段的条件下进行延伸反应；
(c)在DNA聚合酶和识别NERS的切割性内切核酸酶(NE)存在时于等温条件下进行扩增反应；和
(d)如果存在步骤(c)的扩增产物，则至少部分用液相层析和/或质谱分析法表征扩增产物以借此确定Exon A和Exon B之间连接的存在与否。
113.一种在cDNA分子或cDNA群体中探测包含n个外显子的基因的任何两个外显子之间的每一个潜在的连接存在与否的方法，其中n是等于或大于2的整数，Exon A是最上游的外显子，而Exon N是最下游的外显子；该方法包含：
(a)混合第一套寡核苷酸引物(ODNP)、第二套ODNP和cDNA分子或cDNA群体，其中
第一套ODNP包含分别相应于除Exon A之外的一个外显子的n-1个ODNP，每一个ODNP包含至少基本与靠近有义链中相应外显子5’末端的该外显子有义链的部分互补的序列，
第二套ODNP包含分别相应于除Exon N之外的一个外显子的n-1个ODNP，每一个ODNP包含至少基本与靠近反义链中相应外显子5’末端的该外显子反义链的部分互补的序列，
至少一套ODNP中的每一个ODNP进一步包含切割剂识别序列(NARS)的有义链的序列；
(b)扩增由来自第一套ODNP的一个ODNP和来自第二套ODNP的另一个ODNP包围的片段；
(c)在DNA聚合酶和识别NARS的切割剂(NA)存在时进行扩增反应；和
(d)探测步骤(c)的扩增产物的存在与否以借此确定每一个潜在连接的存在与否。
114.一种在cDNA分子或cDNA群体中探测包含n个外显子的基因的每两个外显子之间的连接存在与否的方法，其中n是等于或大于2的整数，Exon A是最上游的外显子，而Exon N是最下游的外显子；该方法包含：
(a)混合第一套寡核苷酸引物(ODNP)、第二套ODNP和cDNA分子或cDNA群体，其中
第一套ODNP包含分别相应于除Exon A之外的一个外显子的n-1个ODNP，且每一个ODNP也包含至少基本与靠近有义链中相应外显子5’末端的该外显子有义链的部分互补的序列，
第二套ODNP包含分别相应于除Exon N之外的一个外显子的n-1个ODNP，且每一个ODNP包含至少基本与靠近反义链中相应外显子5’末端的该外显子反义链的部分互补的序列，
至少一套ODNP中的每一个ODNP进一步包含切割性内切核酸酶识别序列(NERS)的有义链的序列；
(b)扩增由来自第一套ODNP的一个ODNP和来自第二套ODNP的另一个ODNP包围的片段；
(c)在DNA聚合酶和识别NERS的切割性内切核酸酶(NE)存在时于等温条件下进行扩增反应；和
(d)至少部分用液相层析和/或质谱分析法探测步骤(c)的扩增产物的存在与否以借此确定每一个潜在连接的存在与否。
115.一种探测cDNA群体中基因的可变剪接的方法，该方法包含
(a)根据权利要求114的方法确定基因的任何两个外显子之间每一个潜在连接的存在与否；和
(b)对于基因的至少一个外显子，如果在该外显子的至少一个末端存在超过一个的连接，则显示cDNA群体中存在基因的可变剪接。
116.一种用于在具有第一和第二链的目标核酸的限定位置鉴定遗传变异的试剂盒，包含：
(A)第一个寡核苷酸引物(ODNP)和第二个寡核苷酸引物(ODNP)，其中
(1)如果目标核酸是具有第一链和第二链的双链核酸，那么
(a)第一个ODNP包含至少基本与位于遗传变异互补链3’的目标核酸第一链的核苷酸序列互补的核苷酸序列，和
(b)第二个ODNP包含至少基本与位于遗传变异3’的目标核酸第二链的核苷酸序列互补的核苷酸序列；
或
如果目标核酸是单链核酸，那么
(a)第一个ODNP包含至少基本与位于遗传变异5’的目标核酸的核苷酸序列相同的核苷酸序列，和
(b)第二个ODNP包含至少基本与位于遗传变异3’的目标核酸的核苷酸序列互补的核苷酸序列；
(2)其中第一个和第二个ODNP各自进一步包含切割性内切核酸酶识别序列(NERS)的有义链的序列；和
(3)其中由识别NERS的切割性内切核酸酶在一条链产生的切割位点(NS)和相应于由NE在另一条链上产生的NS的位置之间的距离不超过25个核苷酸；
(B)一种识别切割性内切核酸酶识别序列的切割性内切核酸酶；
(C)一种DNA聚合酶；
(D)一种液相层析柱；
(E)包含水和与有机或无机酸复合的仲胺或叔胺铵盐的缓冲液A；
(F)包含缓冲液A和有机溶剂的缓冲液B；和
(G)一种链置换促进剂。
117.一种方法，该方法包含
(a)形成下列物质的混合物：包含切割剂识别序列(NARS)的部分或完全双链的模板核酸分子、识别NARS的切割剂(NA)、DNA聚合酶和一种或多种脱氧核苷三磷酸；
(b)在一定条件下维持步骤(a)中的混合物，该条件使得能够扩增单链核酸片段，其中单链核酸片段在不存在任何DNA聚合酶或链置换促进剂的链置换活性时能够从模板核酸中解离。
118.一种方法，该方法包含
(a)使部分或完全双链的模板核酸与切割剂(NA)接触，该模板包含切割剂识别序列(NARS)；
(b)如果模板不包含可由NA切割的切割位点(NS)，则延伸模板以提供NS；
(c)在NS切割模板或其延伸产物以提供在NS包含新3’末端的切割产物和在NS包含新的5’末端的切割产物；其中在NS包含新5’末端的切割产物和包含NARS反义链序列的模板链或其延伸产物之间形成的双链体的熔解温度比在NS包含新3’末端的切割产物和相同的模板链或其延伸产物之间形成的双链体的熔解温度高；
(d)延伸步骤(c)中的在NS包含新3’末端的切割产物；
(e)重复步骤(c)和(d)以扩增单链核酸片段。
119.根据权利要求63、73、117或188中任何一项的方法，其中NARS包括至少一个错配碱基对。
120.权利要求87的探针，其中NARS包括至少一个错配碱基对。
CN02818014.3A 2001-07-15 2002-07-15 利用切割剂扩增核酸片段 Pending CN1656233A (zh)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US30563701P 2001-07-15 2001-07-15
US60/305,637 2001-07-15
US34544502P 2002-01-02 2002-01-02
US60/345,445 2002-01-02

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN1656233A true CN1656233A (zh) 2005-08-17

Family

ID=26974700

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN02818014.3A Pending CN1656233A (zh) 2001-07-15 2002-07-15 利用切割剂扩增核酸片段

Country Status (10)

Country Link
US (1) US6884586B2 (zh)
EP (1) EP1409732A2 (zh)
JP (1) JP2004535815A (zh)
KR (1) KR20040036900A (zh)
CN (1) CN1656233A (zh)
AU (2) AU2002318253A1 (zh)
BR (1) BR0211155A (zh)
CA (1) CA2492007A1 (zh)
MX (1) MXPA04000432A (zh)
WO (3) WO2003008642A2 (zh)

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1810989B (zh) * 2005-08-31 2012-07-04 中国科学院广州生物医药与健康研究院 一种等温反应检测具序列特异性的dna和rna的方法
CN103667252A (zh) * 2012-09-10 2014-03-26 思洛生物技术股份有限公司 一种核酸扩增方法
WO2015103741A1 (en) * 2014-01-08 2015-07-16 Pioneer Overseas Corporation Efficient gene cloning method and uses thereof
CN106093415A (zh) * 2016-04-29 2016-11-09 浙江大学 一种蛋白实时定量检测方法
CN107012205A (zh) * 2010-08-17 2017-08-04 凯杰有限公司 使用切口酶的解旋酶依赖性等温扩增
CN114207149A (zh) * 2019-05-29 2022-03-18 X基因组股份有限公司 根据突现的测序
CN114317685A (zh) * 2022-01-05 2022-04-12 苏州贝康医疗器械有限公司 用于检测mRNA可变剪切变异的试剂盒、建库方法和测序方法

Families Citing this family (53)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2004535814A (ja) * 2001-07-15 2004-12-02 ケック グラデュエイト インスティテュート ニック形成エンドヌクレアーゼを使用する指数関数的核酸増幅
US20110151438A9 (en) * 2001-11-19 2011-06-23 Affymetrix, Inc. Methods of Analysis of Methylation
US20050164193A1 (en) * 2002-03-25 2005-07-28 Epigenomics Ag Method for the analysis of methylation patterns within nucleic acids by means of mass spectrometry
CN1774511B (zh) 2002-11-27 2013-08-21 斯昆诺有限公司 用于序列变异检测和发现的基于断裂的方法和系统
US9487823B2 (en) 2002-12-20 2016-11-08 Qiagen Gmbh Nucleic acid amplification
EP1618216A2 (en) * 2003-04-25 2006-01-25 Sequenom, Inc. Fragmentation-based methods and systems for de novo sequencing
WO2004111266A1 (en) 2003-06-17 2004-12-23 Human Genetic Signatures Pty Ltd Methods for genome amplification
JP4714148B2 (ja) 2003-09-04 2011-06-29 ヒューマン ジェネティック シグネチャーズ ピーティーワイ リミテッド 核酸検出アッセイ
US9394565B2 (en) * 2003-09-05 2016-07-19 Agena Bioscience, Inc. Allele-specific sequence variation analysis
US7314714B2 (en) * 2003-12-19 2008-01-01 Affymetrix, Inc. Method of oligonucleotide synthesis
EP1727911B1 (en) 2004-03-26 2013-01-23 Sequenom, Inc. Base specific cleavage of methylation-specific amplification products in combination with mass analysis
US7608394B2 (en) * 2004-03-26 2009-10-27 Sequenom, Inc. Methods and compositions for phenotype identification based on nucleic acid methylation
US8168777B2 (en) 2004-04-29 2012-05-01 Human Genetic Signatures Pty. Ltd. Bisulphite reagent treatment of nucleic acid
JP2007274902A (ja) * 2004-07-09 2007-10-25 Genofunction Inc ｓｉＲＮＡ発現ベクターライブラリー作製方法
DK1794173T3 (da) 2004-09-10 2010-10-25 Human Genetic Signatures Pty Amplifikationsblokker indeholdende interkalaterende nukleinsyrer (INA) indeholdende interkalaterende pseudonukleotider (IPN)
JP5116481B2 (ja) 2004-12-03 2013-01-09 ヒューマン ジェネティック シグネチャーズ ピーティーワイ リミテッド シトシンの化学修飾により微生物核酸を簡素化するための方法
WO2006078042A1 (ja) * 2005-01-20 2006-07-27 Kurume University 小分子ｒｎａの検出方法および小分子ｒｎａ検出用試薬
WO2006088911A2 (en) * 2005-02-15 2006-08-24 Anteon Corporation Sequence-specific detection of nucleotide sequences
US8309303B2 (en) 2005-04-01 2012-11-13 Qiagen Gmbh Reverse transcription and amplification of RNA with simultaneous degradation of DNA
JP2008541705A (ja) * 2005-05-26 2008-11-27 ヒューマン ジェネティック シグネチャーズ ピーティーワイ リミテッド 非標準塩基を含むプライマーを使用する等温鎖置換増幅
US20060292585A1 (en) * 2005-06-24 2006-12-28 Affymetrix, Inc. Analysis of methylation using nucleic acid arrays
EP1762627A1 (de) 2005-09-09 2007-03-14 Qiagen GmbH Verfahren zur Aktivierung einer Nukleinsäure für eine Polymerase-Reaktion
WO2007030882A1 (en) 2005-09-14 2007-03-22 Human Genetic Signatures Pty Ltd Assay for a health state
JP4822801B2 (ja) 2005-10-24 2011-11-24 西川ゴム工業株式会社 変異型エンドヌクレアーゼ
US7820385B2 (en) * 2006-03-22 2010-10-26 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services, Centers For Disease Control And Prevention Method for retaining methylation pattern in globally amplified DNA
US7901882B2 (en) * 2006-03-31 2011-03-08 Affymetrix, Inc. Analysis of methylation using nucleic acid arrays
JP4918409B2 (ja) 2006-07-26 2012-04-18 西川ゴム工業株式会社 核酸配列の増幅方法
WO2008091913A2 (en) * 2007-01-23 2008-07-31 Sequenom, Inc. Method for accurate assessment of dna quality after bisulfite treatment
US9689031B2 (en) 2007-07-14 2017-06-27 Ionian Technologies, Inc. Nicking and extension amplification reaction for the exponential amplification of nucleic acids
US8143006B2 (en) 2007-08-03 2012-03-27 Igor Kutyavin Accelerated cascade amplification (ACA) of nucleic acids comprising strand and sequence specific DNA nicking
CN101918595A (zh) 2007-11-27 2010-12-15 人类遗传标记控股有限公司 用于扩增和复制亚硫酸氢盐修饰的核酸的酶
EP2271772B1 (en) * 2008-03-11 2014-07-16 Sequenom, Inc. Nucleic acid-based tests for prenatal gender determination
AU2009283194B2 (en) 2008-08-22 2014-10-16 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for targeted single-stranded cleavage and targeted integration
US8962247B2 (en) * 2008-09-16 2015-02-24 Sequenom, Inc. Processes and compositions for methylation-based enrichment of fetal nucleic acid from a maternal sample useful for non invasive prenatal diagnoses
US8476013B2 (en) * 2008-09-16 2013-07-02 Sequenom, Inc. Processes and compositions for methylation-based acid enrichment of fetal nucleic acid from a maternal sample useful for non-invasive prenatal diagnoses
EP2401388A4 (en) 2009-02-23 2012-12-05 Univ Georgetown SEQUENCE-SPECIFIC DETECTION OF NUCLEOTIDE SEQUENCES
JP2013511991A (ja) * 2009-11-25 2013-04-11 クアンタライフ， インコーポレイテッド 遺伝子材料を検出する方法および組成物
DK2516680T3 (en) 2009-12-22 2016-05-02 Sequenom Inc Method and kits to identify aneuploidy
EP3483285B1 (en) 2011-02-09 2021-07-14 Bio-Rad Laboratories, Inc. Analysis of nucleic acids
EP2702168B1 (en) 2011-04-29 2018-01-17 Sequenom, Inc. Quantification of a minority nucleic acid species
KR101912488B1 (ko) 2011-09-07 2018-10-26 휴먼 제네틱 시그너처스 피티와이 엘티디 분자 검출 분석법
US9352312B2 (en) 2011-09-23 2016-05-31 Alere Switzerland Gmbh System and apparatus for reactions
EP3757210B1 (en) 2012-03-02 2022-08-24 Sequenom, Inc. Methods for enriching cancer nucleic acid from a biological sample
US9920361B2 (en) 2012-05-21 2018-03-20 Sequenom, Inc. Methods and compositions for analyzing nucleic acid
CA2878979C (en) 2012-07-13 2021-09-14 Sequenom, Inc. Processes and compositions for methylation-based enrichment of fetal nucleic acid from a maternal sample useful for non-invasive prenatal diagnoses
EP2971100A1 (en) 2013-03-13 2016-01-20 Sequenom, Inc. Primers for dna methylation analysis
WO2015138774A1 (en) 2014-03-13 2015-09-17 Sequenom, Inc. Methods and processes for non-invasive assessment of genetic variations
KR101738596B1 (ko) * 2014-05-28 2017-05-22 (주)진매트릭스 유전자 표적부위 염기서열분석방법 및 그 분석용 조성물
EP4368728A2 (en) 2015-07-17 2024-05-15 Nanostring Technologies, Inc Simultaneous quantification of gene expression in a user-defined region of a cross-sectioned tissue
US20190249248A1 (en) 2018-02-12 2019-08-15 Nanostring Technologies, Inc. Biomolecular probes and methods of detecting gene and protein expression
WO2020037281A1 (en) * 2018-08-17 2020-02-20 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Dna amplification method for probe generation
JP2023517139A (ja) * 2019-12-30 2023-04-21 源點生物科技股▲フン▼有限公司 酵素を使用して核酸配列を調製するための装置および方法
CN114929723A (zh) * 2019-12-30 2022-08-19 源点生物科技股份有限公司 使用酶制备核酸序列的方法

Family Cites Families (56)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5712214A (en) 1983-11-10 1998-01-27 Exxon Research & Engineering Company Regeneration of aromatization catalysts
US5011769A (en) 1985-12-05 1991-04-30 Meiogenics U.S. Limited Partnership Methods for detecting nucleic acid sequences
US4935357A (en) 1986-02-05 1990-06-19 New England Biolabs, Inc. Universal restriction endonuclease
AU8997991A (en) 1991-01-31 1992-08-06 Becton Dickinson & Company Exonuclease mediated strand displacement amplification
US5455166A (en) * 1991-01-31 1995-10-03 Becton, Dickinson And Company Strand displacement amplification
CA2101119A1 (en) 1992-08-17 1994-02-18 George T. Walker Exonuclease decontamination method
US5470723A (en) 1993-05-05 1995-11-28 Becton, Dickinson And Company Detection of mycobacteria by multiplex nucleic acid amplification
US5422252A (en) 1993-06-04 1995-06-06 Becton, Dickinson And Company Simultaneous amplification of multiple targets
FR2708288B1 (fr) 1993-07-26 1995-09-01 Bio Merieux Procédé d'amplification d'acides nucléiques par transcription utilisant le déplacement, réactifs et nécessaire pour la mise en Óoeuvre de ce procédé.
US5523204A (en) 1993-12-10 1996-06-04 Becton Dickinson And Company Detection of nucleic acids in cells by strand displacement amplification
CA2185239C (en) 1994-03-16 2002-12-17 Nanibhushan Dattagupta Isothermal strand displacement nucleic acid amplification
US5547861A (en) 1994-04-18 1996-08-20 Becton, Dickinson And Company Detection of nucleic acid amplification
US5648211A (en) 1994-04-18 1997-07-15 Becton, Dickinson And Company Strand displacement amplification using thermophilic enzymes
US5631147A (en) 1995-09-21 1997-05-20 Becton, Dickinson And Company Detection of nucleic acids in cells by thermophilic strand displacement amplification
EP0796347A2 (en) 1995-09-21 1997-09-24 Becton, Dickinson and Company Detection of nucleic acids in cells by thermophilic strand displacement amplification
US5916779A (en) 1995-09-21 1999-06-29 Becton, Dickinson And Company Strand displacement amplification of RNA targets
US6190865B1 (en) * 1995-09-27 2001-02-20 Epicentre Technologies Corporation Method for characterizing nucleic acid molecules
US6238884B1 (en) 1995-12-07 2001-05-29 Diversa Corporation End selection in directed evolution
US6218119B1 (en) * 1996-01-16 2001-04-17 Keygene, N. V. Amplification of simple sequence repeats
AU723678B2 (en) 1996-03-18 2000-08-31 Molecular Biology Resources, Inc. Target nucleic acid sequence amplification
US5811269A (en) 1996-04-30 1998-09-22 Becton, Dickinson And Company Detection of mycobacteria by multiplex nucleic acid amplification
US6617434B1 (en) 1996-05-31 2003-09-09 North Shore Long Island Jewish Research Institute Identificiaton of differentially methylated and mutated nucleic acids
US5786146A (en) 1996-06-03 1998-07-28 The Johns Hopkins University School Of Medicine Method of detection of methylated nucleic acid using agents which modify unmethylated cytosine and distinguishing modified methylated and non-methylated nucleic acids
WO1998000566A1 (en) 1996-06-28 1998-01-08 University Of Massachusetts Sequence-specific methylation of ribonucleic acid
US5866336A (en) * 1996-07-16 1999-02-02 Oncor, Inc. Nucleic acid amplification oligonucleotides with molecular energy transfer labels and methods based thereon
AU2849197A (en) 1996-07-17 1998-01-29 Becton Dickinson & Company Thermophilic strand displacement amplifications using AvaI
US5702926A (en) 1996-08-22 1997-12-30 Becton, Dickinson And Company Nicking of DNA using boronated nucleotides
US5846726A (en) 1997-05-13 1998-12-08 Becton, Dickinson And Company Detection of nucleic acids by fluorescence quenching
US5928869A (en) 1997-05-30 1999-07-27 Becton, Dickinson And Company Detection of nucleic acids by fluorescence quenching
US5985569A (en) 1997-09-26 1999-11-16 Becton, Dickinson And Company Primers for amplification of a genus specific sequence of the mycobacterium 16S rRNA gene
US6096501A (en) 1997-11-04 2000-08-01 Becton Dickinson And Company Assay for Chlamydia trachomatis by amplification and detection of Chlamydia trachomatis crytpic plasmid
US5962273A (en) 1997-11-04 1999-10-05 Becton Dickinson And Company Detection of Neisseria gonorrhoeae by amplification and detection of its nucleic acid
US5837469A (en) 1997-11-04 1998-11-17 Becton Dickinson And Company Assay for chlamydia trachomatis by amplification and detection of chlamydia trachomatis nucleic acid
US5928908A (en) 1997-11-10 1999-07-27 Brookhaven Science Associates Method for introducing unidirectional nested deletions
US6004754A (en) 1998-01-21 1999-12-21 Becton Dickinson And Company DNA sequence, related probes and primers for the detection of Streptococcus agalactiae
EP1051517A2 (en) 1998-01-27 2000-11-15 Clinical Micro Sensors, Inc. Amplification of nucleic acids with electronic detection
GB9806253D0 (en) 1998-03-25 1998-05-20 Tepnel Medical Ltd Amplification of nucleic acids
US5976805A (en) 1998-04-27 1999-11-02 Becton Dickinson And Company Neisseria gonorrhoeae specific DNA fragment--GC3
AU763890B2 (en) 1998-09-15 2003-07-31 Yale University Artificial long terminal repeat vectors
US6235502B1 (en) 1998-09-18 2001-05-22 Molecular Staging Inc. Methods for selectively isolating DNA using rolling circle amplification
US6221592B1 (en) 1998-10-20 2001-04-24 Wisconsin Alumi Research Foundation Computer-based methods and systems for sequencing of individual nucleic acid molecules
WO2000028084A1 (en) 1998-11-06 2000-05-18 Molecular Biology Resources, Inc. Isothermal nucleic acid amplification methods
DE19853398C1 (de) 1998-11-19 2000-03-16 Epigenomics Gmbh Verfahren zur Identifikation von Cytosin-Methylierungsmustern in genomischer DNA
WO2000031300A2 (en) 1998-11-24 2000-06-02 The Johns Hopkins University Genotyping by mass spectrometric analysis of short dna fragments
US6531302B1 (en) 1999-04-12 2003-03-11 Nanogen/Becton Dickinson Partnership Anchored strand displacement amplification on an electronically addressable microchip
US6238868B1 (en) 1999-04-12 2001-05-29 Nanogen/Becton Dickinson Partnership Multiplex amplification and separation of nucleic acid sequences using ligation-dependant strand displacement amplification and bioelectronic chip technology
JP2002541475A (ja) 1999-04-12 2002-12-03 ナノゲン／ベクトン・ディッキンソン・パートナーシップ 鎖置換増幅およびバイオエレクトロニック・マイクロチップ技術を用いる核酸配列の増幅および分離
WO2000061803A1 (en) 1999-04-13 2000-10-19 Nanogen, Inc. Magnetic bead-based array for genetic detection
DK1923471T3 (da) 1999-04-20 2013-04-02 Illumina Inc Detektion af nukleinsyrereaktioner på bead-arrays
US6316200B1 (en) 2000-06-08 2001-11-13 Becton, Dickinson And Company Probes and methods for detection of nucleic acids
WO2001090419A2 (en) 2000-05-23 2001-11-29 Variagenics, Inc. Methods for genetic analysis of dna to detect sequence variances
US6191267B1 (en) * 2000-06-02 2001-02-20 New England Biolabs, Inc. Cloning and producing the N.BstNBI nicking endonuclease
DE10029914A1 (de) 2000-06-19 2002-01-03 Epigenomics Ag Verfahren zur hochparallelen Analyse von Polymorphismen
US6258546B1 (en) 2000-06-23 2001-07-10 Becton, Dickinson And Company Detection of nucleic acid amplification
AU3922802A (en) * 2000-10-02 2002-05-27 Keck Graduate Inst Methods for identifying nucleotides at defined positions in target nucleic acidsusing fluorescence polarization
WO2003008624A2 (en) * 2001-07-15 2003-01-30 Keck Graduate Institute Nucleic acid amplification using nicking agents

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1810989B (zh) * 2005-08-31 2012-07-04 中国科学院广州生物医药与健康研究院 一种等温反应检测具序列特异性的dna和rna的方法
CN107012205A (zh) * 2010-08-17 2017-08-04 凯杰有限公司 使用切口酶的解旋酶依赖性等温扩增
CN103667252A (zh) * 2012-09-10 2014-03-26 思洛生物技术股份有限公司 一种核酸扩增方法
WO2015103741A1 (en) * 2014-01-08 2015-07-16 Pioneer Overseas Corporation Efficient gene cloning method and uses thereof
CN106093415A (zh) * 2016-04-29 2016-11-09 浙江大学 一种蛋白实时定量检测方法
CN106093415B (zh) * 2016-04-29 2017-12-19 浙江大学 一种蛋白实时定量检测方法
CN114207149A (zh) * 2019-05-29 2022-03-18 X基因组股份有限公司 根据突现的测序
CN114317685A (zh) * 2022-01-05 2022-04-12 苏州贝康医疗器械有限公司 用于检测mRNA可变剪切变异的试剂盒、建库方法和测序方法
CN114317685B (zh) * 2022-01-05 2023-10-20 苏州贝康医疗器械有限公司 用于检测mRNA可变剪切变异的试剂盒、建库方法和测序方法

Also Published As

Publication number Publication date
MXPA04000432A (es) 2004-10-27
KR20040036900A (ko) 2004-05-03
WO2003008642A3 (en) 2003-07-31
EP1409732A2 (en) 2004-04-21
WO2003008642A2 (en) 2003-01-30
JP2004535815A (ja) 2004-12-02
US6884586B2 (en) 2005-04-26
BR0211155A (pt) 2005-02-01
CA2492007A1 (en) 2003-01-30
AU2002367466A1 (en) 2003-10-08
WO2003080645A2 (en) 2003-10-02
US20030152952A1 (en) 2003-08-14
WO2003008623A3 (en) 2003-05-01
AU2002318253A1 (en) 2003-03-03
WO2003008623A2 (en) 2003-01-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN1656233A (zh) 利用切割剂扩增核酸片段
CN1159452C (zh) 利用非荧光标记检测配体对结合的方法和组合物
CN1273609A (zh) 检测或量化核酸物类的方法和组合物
CN1250485A (zh) 检测或定量测定核酸种类的方法和组合物
CN1118581C (zh) 对dna的特性分析
CN1154733C (zh) 改进的热稳定dna聚合酶
CN1151374C (zh) 用于分子生物学分析和诊断的自我可寻址自我装配的微电子学系统及装置
CN1950519A (zh) 聚合酶群落荧光原位测序珠子
CN1289690C (zh) Rna序列扩增的方法和组合物
CN1136330A (zh) 有效进行核酸测序的方法和组合物
CN1270598A (zh) 用于质谱分析核酸的方法和组合物
CN1250483A (zh) 与质量标记连接的杂文探针
CN1040220A (zh) 一种扩增核苷酸顺序的方法
CN1764729A (zh) 使用嵌入核酸检测核酸中甲基化改变的分析
CN1668923A (zh) 带有标准探针的dna微阵列以及包含该阵列的试剂盒
CN1325458A (zh) 核酸扩增和测序方法
CN1191575A (zh) 使用可裂解引物寡核苷酸大小测定
CN1373813A (zh) 模板捕获与归一化亚微升反应的方法和装置
CN1690218A (zh) Pcr扩增反应装置、以及利用该装置的pcr扩增反应方法
CN1791682A (zh) 通过杂交进行的随机阵列dna分析
CN1806051A (zh) 通过(例如)t细胞受体v/d/j基因中的重复鉴定克隆性细胞
CN1592792A (zh) 检测核酸的材料和方法
CN1219972A (zh) 短串联重复基因座的多重扩增
CN1774511A (zh) 用于序列变异检测和发现的基于断裂的方法和系统
CN1290306A (zh) 大处理量试验系统

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication