CN114317685B - 用于检测mRNA可变剪切变异的试剂盒、建库方法和测序方法 - Google Patents
用于检测mRNA可变剪切变异的试剂盒、建库方法和测序方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及用于检测mRNA可变剪切变异的试剂盒、建库方法和测序方法，试剂盒包括用于扩增靶基因目的片段的特异性上游引物和特异性下游引物，目的片段包含mRNA可变剪切变异片段，特异性上游引物的3’端互补配对于mRNA可变剪切变异片段相邻的第一外显子区域，特异性下游引物的3’端互补配对于mRNA可变剪切变异片段相邻的第二外显子区域，以使得目的片段的起始位置位于第一外显子区域内，目的片段的终止位置位于第二外显子区域内。本发明的试剂盒通过设计靶基因目的片段的引物对待测样本cDNA一步扩增、建库，并对扩增产物进行上机测序，能够获取靶基因发生mRNA可变剪切变异形成的异常转录本序列信息以及异常转录本比例，提高了mRNA可变剪切变异的检测效率。
Description
技术领域
本发明涉及基因检测技术领域，具体而言，涉及一种用于检测mRNA可变剪切变异的试剂盒、建库方法和测序方法。
背景技术
mRNA可变剪切是指基因转录生成的前体mRNA通过不同的剪切方式产生不同的mRNA剪切异构体的过程，不同的剪切方式使得同一个基因可以产生多个不同的成熟mRNA，进而表达出不同的蛋白质，因而mRNA可变剪切该过程是真核生物基因表达调控的重要方式。
在真核生物中，通过剪切体识别基因剪切位点如GU-AG，高效精准的切除内含子，将外显子连在一起形成前体mRNA，基因剪切位点的变异可能会导致基因的功能紊乱和潜在疾病。在临床诊断实验中，剪切位点的变异占所有致病变异的10％。除剪切位点的变异对剪切有影响外，HGMD数据库中记录的大约25％的错义和无义变异也可能对剪切有影响。由于mRNA可变剪切机制的复杂性，现有的生物信息学技术还不能根据基因发生的可变剪切变异准确预测相应的剪切效应，也无法获取可变剪切变异形成的异常转录本信息。
目前用于检测mRNA可变剪切变异的方法主要包括转录组测序(RNA-Seq)，实时荧光定量PCR(qPCR)以及minigene体外检测。
转录组测序(RNA-Seq)是指利用第二代高通量测序技术进行cDNA测序，全面快速地获取某一物种特定器官或组织在某一状态下的几乎所有转录本，虽然能够获取可变剪切变异形成的异常转录本信息，但操作流程复杂，检测周期长，对表达水平极低的靶基因，很难检测到可变剪切变异形成的异常转录本信息。
实时荧光定量PCR(qPCR)通过在未发生无义介导的mRNA降解(nonsense-mediatedmRNA decay，NMD)的mRNA序列上设计引物，对待测样本和对照样本进行定量验证，可以判断出可变剪切变异形成的异常转录本是否会发生降解，但无法获取异常转录本的具体序列信息。
minigene体外检测是从患者基因组DNA中扩增包含变异序列和侧翼内含子序列的基因组片段，并克隆到基因载体中，将基因载体瞬时转染到细胞中，提取培养的细胞中的RNA，通过RT-PCR和sanger测序比较野生型和突变型样本中的转录本剪切模式，常被用于血液中表达水平极低或者不表达的基因可变的检测，但是该技术操作复杂，时间成本及经济成本高，检测出的异常转录本的表达水平无法反映目的基因的真实表达水平。
如何准确获取mRNA可变剪切变异导致的异常转录本信息是检测mRNA可变剪切变异的难点。
发明内容
为了解决上述问题，本发明的第一目的在于提供一种用于检测mRNA可变剪切变异的试剂盒，试剂盒包括用于扩增靶基因目的片段的特异性上游引物和特异性下游引物，目的片段包含mRNA可变剪切变异片段，特异性上游引物的3’端互补配对于mRNA可变剪切变异片段相邻的第一外显子区域，特异性下游引物的3’端互补配对于mRNA可变剪切变异片段相邻的第二外显子区域，以使得目的片段的起始位置位于第一外显子区域内，目的片段的终止位置位于第二外显子区域内。
本发明的试剂盒在靶基因含有mRNA可变剪切变异片段两端的外显子区域设计引物，并对待测样本的cDNA一步扩增、建库，直接对扩增产物进行上机测序，能够获取靶基因发生可变剪切变异形成的异常转录本序列信息以及异常转录本比例，操作简单，检测周期短，并且检测出的异常转录本的表达水平可以反映靶基因的真实表达水平。
本发明的一种实现方式中，特异性上游引物或者特异性下游引物的5’端连接有测序接头序列。
本发明的一种实现方式中，测序接头序列包括通用引物序列和标签序列，标签序列连接于特异性引物的5’端，通用引物连接于标签序列的5’端。
本发明的一种实现方式中，目的片段和第一外显子区域互补的长度以及和第二外显子区域互补的长度之和为100bp～350bp。
本发明的一种实现方式中，mRNA可变剪切变异包括单核苷酸变异和插入缺失变异中的至少一种。
本发明的一种实现方式中，靶基因包括CDH23基因、WAS基因和ERCC8基因中的至少一种。
本发明的一种实现方式中，用于扩增CDH23基因的特异性上游引物包括SEQ IDNO.1所示序列，用于扩增CDH23基因的特异性下游引物包括如SEQ ID NO.2所示序列；
SEQ ID NO.1：TGGATGTCAACGACAACGTGC，
SEQ ID NO.2：ATCCCTCGTACAGGCTGATGTC；和/或
用于扩增WAS基因的特异性上游引物包括如SEQ ID NO.3所示序列，用于扩增WAS基因的特异性下游引物包括如SEQ ID NO.4所示序列；
SEQ ID NO.3：GCTTTTGGATCAAATCCGGCA，
SEQ ID NO.4：GAGTGGATGGCTCTGCTTCT；和/或
用于扩增ERCC8基因的特异性上游引物包括如SEQ ID NO.5所示序列，用于扩增ERCC8基因的特异性下游引物包括如SEQ ID NO.6所示序列；
SEQ ID NO.5：TCACACCATCTGAACCACCTG，
SEQ ID NO.6：GGACACGATATGCTGGGGTT。
本发明的一种实现方式中，试剂盒还包括RNA提取试剂，RNA逆转录试剂、PCR扩增试剂和扩增产物纯化试剂中的至少一种。
本发明的一种实现方式中，RNA逆转录试剂包括逆转录酶、逆转录引物、RNA酶抑制剂中的至少一中；
PCR扩增试剂包括扩增酶、扩增缓冲液以及无核酸酶水中的至少一种。
本发明的第二目的在于提供一种用于检测mRNA可变剪切变异的建库方法，方法包括：
获取待测样本的cDNA，采用上述试剂盒，对待测样本的cDNA进行扩增以获得待测样本靶基因目的片段的转录本测序文库。
本发明的第三目的在于提供一种用于检测mRNA可变剪切变异的方法，包括：对采用上述建库方法构建的待测样本靶基因目的片段的转录本测序文库进行上机测序，以获取待测样本靶基因发生mRNA可变剪切变异形成的异常转录本信息。
本发明的一种实现方式中，异常转录本信息包括异常转录本序列信息以及异常转录本比例中的至少一种。
本发明公开的用于检测mRNA可变剪切变异的试剂盒，在靶基因含有mRNA可变剪切变异片段两端的外显子区域设计引物，并对扩增待测样本的cDNA一步扩增、建库，并直接对扩增产物进行上机测序，能够获取靶基因发生可变剪切变异形成的异常转录本序列信息以及异常转录本比例，操作简单，检测周期短，并且检测出的异常转录本的表达水平可以反映靶基因的真实表达水平。
附图说明
图1为本发明实施例1先证者样本的转录本NGS结果示意图；
图2为本发明实施例2先证者样本的转录本NGS结果示意图；
图3为本发明实施例3先证者样本的转录本NGS结果示意图。
具体实施方式
现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。
因此，旨在本发明覆盖落入所附权利要求的范围及其等同范围中的此类修改和变化。本发明的其它对象、特征和方面公开于以下详细描述中或从中是显而易见的。本领域普通技术人员应理解本讨论仅是示例性实施方式的描述，而非意在限制本发明更广阔的方面。
如本文，术语“引物”指寡核苷酸，无论其是在经纯化的限制性消化物中天然存在或是合成产生的，寡核苷酸当置于诱导与核酸链互补的引物延伸产物合成的条件下时(例如，存在核苷酸和诱导剂诸如DNA聚合酶和在合适的温度和pH下)，寡核苷酸能够作为合成的起始点而起作用。引物优选是单链的，以用于扩增的最大效率，但可选地也可以是双链的。如果是双链的，则在用于制备延伸产物前，首先将引物处理以分开其链。优选地，引物是寡脱氧核糖核苷酸。引物应足够长，以在诱导剂存在的情况下引发延伸产物的合成。引物的精确长度将取决于许多因素，包括温度、引物来源和方法的使用。例如，在一些实施方案中，引物范围为10-100或更多个核苷酸(例如10-300、15-250、15-200、15-150、15-100、15-90、20-80、20-70、20-60、20-50个核苷酸等)。
目前用于检测mRNA可变剪切变异的方法主要包括转录组测序(RNA-Seq)，实时荧光定量PCR(qPCR)以及minigene体外检测。转录组测序(RNA-Seq)能够获取某一物种特定器官或组织在某一状态下的几乎所有转录本，虽然能够获取异常转录本信息，但操作流程复杂，检测周期长，对表达水平极低的靶基因，很难检测到可变剪切变异形成的异常转录本信息。实时荧光定量PCR(qPCR)判断出可变剪切变异形成的异常转录本是否会发生降解，但无法获取异常转录本的具体序列信息。minigene体外检测常被用于血液中表达水平极低或者不表达的基因可变的检测，该技术操作复杂，时间成本及经济成本高，检测出的异常转录本的表达水平无法反映目的基因的真实表达水平。
为了至少部分解决上述技术问题的至少一个，本发明的第一方面提供了一种用于检测mRNA可变剪切变异的试剂盒，包括用于扩增靶基因目的片段的特异性上游引物和特异性下游引物，目的片段包含mRNA可变剪切变异片段，特异性上游引物的3’端互补配对于mRNA可变剪切变异片段相邻的第一外显子区域，特异性下游引物的3’端互补配对于mRNA可变剪切变异片段相邻的第二外显子区域，以使得目的片段的起始位置位于第一外显子区域内，目的片段的终止位置位于第二外显子区域内。其中第一外显子区域和第二外显子区域均为单个外显子区域，mRNA可变剪切变异片段在靶基因上可能仅位于内含子区，此时，第一外显子区域和第二外显子区域可以为两个相邻的外显子区域，mRNA可变剪切变异片段位于外显子区域附近的内含子上或者内含子附近的外显子区域内，第一外显子区域和第二外显子区域可以为间隔有外显子区域的两个外显子区域。
本发明的试剂盒在靶基因含有mRNA可变剪切变异片段两端的外显子区域设计引物，并对待测样本的cDNA一步扩增、建库，直接对扩增产物进行上机测序，能够获取靶基因发生可变剪切变异形成的异常转录本序列信息以及异常转录本比例，操作简单，检测周期短，并且检测出的异常转录本的表达水平可以反映靶基因的真实表达水平，进而可以获取靶基因mRNA可变剪切变异的真实表达水平。
在一些实施方案中，特异性引物连接有测序接头序列，测序接头序列位于特异性上游引物的5’端，以实现同步完成靶基因目标片段的扩增和文库构建，从而简化整个可变剪切变异的检测流程，提高获取可变剪切变异形成的异常转录本信息的效率。
在一些实施方案中，目的片段和第一外显子区域互补的长度以及和第二外显子区域互补的长度之和为100bp～350bp，也即目标片段的转录本长度为100bp～350bp，以保证mRNA可变剪切变异的检出。
在一些实施方案中，测序接头序列测序接头序列包括第一测序接头序列和第二测序接头序列，第一测序接头序列包括通用上游引物序列，通用上游引物序列和特异性上游引物的5’端相连接、第二测序接头序列包括通用下游引物序列，通用下游引物序列和特异性下游引物的5’端相连接，以实现在扩增的同时完成测序文库的构建。
在一些实施方案中，第一测序接头序列或第二测序接头序列还包括标签序列，标签序列用于作为不同样本的身份表征，标签序列连接于特异性引物的5’端，通用上游引物序列或者通用下游引物序列和标签序列的5’端相连接。
在一些实施方案中，测序接头序列包括但不限于适用于赛默飞、Illumina、华大、Proton测序平台的接头序列。
在一些具体实施方案中，Proton平台的测序接头序列包括：5'—CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGNNNNNNNNNNGAT–3'和3'—CGCACAGAGGCTGAGTCNNNNNNNNNNCTA-5'。
在一些实施方案中，mRNA可变剪切变异包括单核苷酸变异和插入缺失变异中的至少一种，也就是说，mRNA可变剪切变异可以由单核苷酸变异引起，也可以由插入缺失变异引起，或者由两种变异同时存在引起，通过设计靶基因目的片段的扩增引物，对待测样本的cDNA进行扩增，能够获得mRNA可变剪切变异形成的异常转录本的序列信息以及异常转录本比例。
在一些实施方案中，靶基因包括CDH23基因、WAS基因和ERCC8基因中的至少一种，通过对CDH23基因、WAS基因或ERCC8基因上含有mRNA可变剪切变异的目的片段进行扩增，能够获取CDH23基因、WAS基因或ERCC8基因发生mRNA可变剪切变异形成的异常转录本序列信息以及异常转录本比例。
在一些实施方案中，用于扩增CDH23基因的特异性上游引物包括SEQ ID NO.1所示序列，用于扩增CDH23基因的特异性下游引物包括如SEQ ID NO.2所示序列；
SEQ ID NO.1：TGGATGTCAACGACAACGTGC，
SEQ ID NO.2：ATCCCTCGTACAGGCTGATGTC；和/或
用于扩增WAS基因的特异性上游引物包括如SEQ ID NO.3所示序列，用于扩增WAS基因的特异性下游引物包括如SEQ ID NO.4所示序列；
SEQ ID NO.3：GCTTTTGGATCAAATCCGGCA，
SEQ ID NO.4：GAGTGGATGGCTCTGCTTCT；和/或
用于扩增ERCC8基因的特异性上游引物包括如SEQ ID NO.5所示序列，用于扩增ERCC8基因的特异性下游引物包括如SEQ ID NO.6所示序列；
SEQ ID NO.5：TCACACCATCTGAACCACCTG，
SEQ ID NO.6：GGACACGATATGCTGGGGTT。
在一些实施方案中，试剂盒还包括RNA提取试剂，RNA逆转录试剂、PCR扩增试剂和扩增产物纯化试剂中的至少一种。
在一些具体实施方案中，RNA逆转录试剂包括逆转录酶、逆转录引物、RNA酶抑制剂中的至少一中，以实现对RNA的逆转录。
在一些具体实施方案中，PCR扩增试剂包括扩增酶、扩增缓冲液以及无核酸酶水中的至少一种，以实现获取含有异常转录本序列信息的扩增片段。
在一些具体实施方案中，扩增产物纯化试剂包括磁珠分离试剂，磁珠分离试剂能够利用磁珠对DNA的可逆吸附进一步将PCR扩增产物与引物、核苷酸、蛋白、酶等其他物质分离，提高PCR扩增产物即目的片段的测序文库的纯度。
本发明的第二目的在于提供一种用于检测mRNA可变剪切变异的建库方法，方法包括：
获取待测样本的cDNA，采用上述试剂盒，对待测样本的cDNA进行扩增以获得待测样本靶基因目的片段的转录本测序文库。
具体地，采用上述试剂盒能够对待测样本的cDNA进行扩增，并同步实现目的片段的转录本测序文库的构建，简化了目的片段转录本测序文库构建流程，提高了待测样本中mRNA可变剪切变异的检测效率，并且能够获得异常转录本的具体序列信息以及异常转录本的比例，减少了分析可变剪切变异形成的异常转录本的数据量，提高了测序数据的利用率。
本发明的第三目的在于提供一种用于检测mRNA可变剪切变异的方法，包括：对采用上述建库方法构建的待测样本靶基因目的片段的转录本测序文库进行上机测序，以获取待测样本靶基因发生mRNA可变剪切变异形成的异常转录本信息。
具体地，采用上述建库方法进行上机测序，可以实现只需0.5M的数据量即可分析可变剪切变异形成的异常转录本信息，并且分析结果能够反映可变剪切变异形成的异常转录本的真实表达水平，对于低表达水平的异常转录本也能检出。
在一些实施方案中，异常转录本信息包括异常转录本序列信息以及异常转录本比例中的至少一种。
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。
实施例1CDH23基因mRNA可变剪切变异的检测
1.待测样本的变异信息
待测样本包括先证者，先证者父亲的血液样本，该血液样本为新鲜血液样本或者含RNA保护液的血液样本，先证者和先证者父亲血液样本的CDH23基因变异信息见表1，该变异信息为sanger测序结果。
表1
2.RNA提取：待测样本RNA采用TIANGEN RNA prep pure血液总RNA提取试剂盒进行RNA抽提，采用Qubit 3.0荧光计检测所提取核酸浓度，Nanodrop检测核酸的纯度。
以含RNA保护液的血液样本为例提取RNA，其步骤包括：
1)、取1mL血液于1.5mL EP管中,6600rpm(～4000g)，4度离心10min，弃上清；
2)、加入1mL RNase-free H2O吹打，使沉淀溶解，6600rpm(～4000g)，4度离心10min，弃上清；
3)、加入240μL悬浮液RSB，移液枪吹打使沉淀溶解；
4)、加入200μL裂解液RL，20μL蛋白酶K，振荡混匀，55度裂解10min，期间混匀数次；
5)、移入CS柱中，12000rpm(～13400g)，4度，离心3min，转移上清至新的1.5mL管中；
6)、加入220μL无水乙醇，混匀，转入CR2，12000rpm，离心15～30秒，弃废液；
7)、向CR2中加350μL RW1，12000rpm，离心15～30秒，弃废液；
8)、向CR2中央加80μL DNaseI工作液，室温静止15min；向CR2中加350μL RW1，12000rpm，离心15～30秒，弃废液；
9)、Add 500μL含乙醇的RW，室温静止2min，12000rpm，2min,弃废液；
10)、重复上一步；
11)、空离2min，室温晾干3min，加30μL RNase-free H20室温洗脱2min，12000rpm离心2min收集洗脱液。
3.cDNA合成：按照表2配制反转录体系，将配置好的反应体系涡旋混匀，短暂离心，将离心后的反应体系放入PCR仪，PCR仪设置程序如表3。
表2
表3
| 步骤 | 温度 | 时间 |
| 1 | 42℃ | 60min |
| 2 | 70℃ | 5min |
| 3 | 4℃ | Hold |
3.PCR扩增
采用Vazyme Phanta Super-Fidelity DNA Polymerase，特异性引物信息见表4，测序接头序列包括：5'—CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGNNNNNNNNNNGAT–3'和3'—CGCACAGAGGCTGAGTCNNNNNNNNNNCTA-5'。按照表5配制PCR体系，将配置好的反应体系涡旋混匀，短暂离心，将离心后的反应体系放入PCR仪，PCR仪设置程序如表6。
表4
表5
表6
4.PCR产物琼脂糖凝胶电泳
吸取3μL PCR产物，进行2％琼脂糖凝胶电泳。
5.PCR产物纯化
将PCR产物体系用无核酸酶水补足体积到30μL，按照1.2×体积加入AMPure XP磁珠36μL。
涡旋混匀，室温放置5分钟，短暂离心后，放置到磁力架上，等液体清亮，去上清，用200μL的80％酒精清洗，重复一次，室温干燥磁珠，用15μL Low TE进行磁珠重悬，洗脱文库。
7.浓度测定
吸取1μL进行Qubit浓度测定。
8.上机测序
根据测序接头序列选择Proton测序平台进行上机测序。
9.数据分析
将上机获得测序数据与参考基因组进行数据分析和对比，得到可变剪切变异形成的转录本序列和比例。CDH23基因可变剪切NGS检测结果如图1所示，根据图1可以得到待测样本的异常转录本的信息如表7所示。
表7
根据表3可知，对先证者父亲和先证者产物的mRNA目标区域进行捕获建库，在IonProton平台进行高通量测序，先证者父亲和先证者PCR产物分别得到1.6M与1.8M测序Reads，对测序结果进行分析，发现先证者父亲及先证者的样本中存在2个其他转录本，如图1所示，各转录本Reads数和不同转录本占比的统计结果如表9所示。
10.性能检测
本实施例能检测单核苷酸变异导致的mRNA可变剪切，准确获取一个样本中存在的多种异常转录本序列信息和比例，对于转录本比例在3.46％的低表达水平的异常转录本也能检出。
实施例2 WAS基因mRNA可变剪切变异的检测
1.待测样本的变异信息
待验证样本包括先证者、先证者母亲的血液样本，先证者和先证者母亲的WAS基因变异信息见表8。
表8
| 样本 | 基因变异信息 |
| 先证者 | NM_000377.2,c.1339-12T>A，het |
| 先证者母亲 | NM_000377.2,c.1339-12T>A，het |
2.RNA提取
采用TIANGEN RNAprep pure血液总RNA提取试剂盒对待测样本RNA进行抽提，采用Qubit 3.0荧光计检测所提取核酸浓度，Nanodrop检测核酸的纯度，待测样本的RNA提取步骤参照实施例1。
3.PCR扩增
采用Vazyme Phanta Super-Fidelity DNA Polymerase，特异性引物信息见表9，测序接头序列包括：5'—CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGNNNNNNNNNNGAT–3'和3'—CGCACAGAGGCTGAGTCNNNNNNNNNNCTA-5'。
表9
4.PCR产物琼脂糖凝胶电泳
吸取3μL PCR产物，进行2％琼脂糖凝胶电泳。
5.PCR产物纯化
将PCR产物体系用无核酸酶水补足体积到30μL，按照1.2×体积加入AMPure XP磁珠36μL。
涡旋混匀，室温放置5分钟，短暂离心后，放置到磁力架上，等液体清亮，去上清，用200μL的80％酒精清洗，重复一次，室温干燥磁珠，用15μL Low TE进行磁珠重悬，洗脱文库。
7.浓度测定
吸取1μL进行Qubit浓度测定。
8.上机测序
根据测序接头序列选择Proton测序平台进行上机测序。
9.数据分析
将上机获得测序数据与参考基因组进行数据分析和对比，得到可变剪切变异形成的转录本序列和比例，WAS基因mRNA可变剪切变异检测NGS结果如图2所示，根据图2可以得到待测样本的异常转录本的信息如表9所示。
表9
先证者和先证者母亲产物进行mRNA的目的区域捕获建库，在Ion Proton平台进行高通量测序，先证者和先证者母亲PCR产物分别得到0.9M与0.7M测序Reads。对测序结果进行分析，发现先证者及先证者母亲的样本中存在其他转录本，先证者和先证者母亲的转录产物中分析到1个异常转录本，如图2所示，各转录本Reads数和不同转录本占比的统计结果如表9所示。
10.性能检测
本实施例能检测WAS基因发生单核苷酸变异导致的mRNA可变剪切，能准确检测样本中WAS基因的mRNA可变剪切变异导致的异常转录本序列信息和比例，并且对变异分析使用的数据量要求较低，仅需0.7M测序数据就能完成不同转录本序列信息和比例的分析。
实施例3ERCC8基因mRNA可变剪切变异的检测
1.待测样本的变异信息
待测样本包括先证者，先证者母亲的血液样本，该血液样本为新鲜血液样本或者含RNA保护液的血液样本，先证者和先证者母亲血液样本的ERCC8NM_000082.3:c.173+5delG，基因变异信息见表1，该变异信息为sanger测序结果。
表10
| 待测样本 | 基因变异信息 |
| 先证者 | NM_000082.3:c.173+5delG，het |
| 先证者母亲 | NM_000082.3:c.173+5delG，het |
2.RNA提取
待测样本RNA采用TIANGEN RNA prep pure血液总RNA提取试剂盒进行RNA抽提，采用Qubit 3.0荧光计检测所提取核酸浓度，Nanodrop检测核酸的纯度。
以含RNA保护液的血液样本为例提取RNA，其步骤包括：
1)、取1mL血液于1.5mL EP管中,6600rpm(～4000g)，4度离心10min，弃上清；
2)、加入1mL RNase-free H2O吹打，使沉淀溶解，6600rpm(～4000g)，4度离心10min，弃上清；
3)、加入240μL悬浮液RSB，移液枪吹打使沉淀溶解；
4)、加入200μL裂解液RL，20μL蛋白酶K，振荡混匀，55度裂解10min，期间混匀数次；
5)、移入CS柱中，12000rpm(～13400g)，4度，离心3min，转移上清至新的1.5mL管中；
6)、加入220μL无水乙醇，混匀，转入CR2，12000rpm，离心15～30秒，弃废液；
7)、向CR2中加350μL RW1，12000rpm，离心15～30秒，弃废液；
8)、向CR2中央加80μL DNaseI工作液，室温静止15min；向CR2中加350μL RW1，12000rpm，离心15～30秒，弃废液；
9)、Add 500μL含乙醇的RW，室温静止2min，12000rpm，2min,弃废液；
10)、重复上一步；
11)、空离2min，室温晾干3min，加30μL RNase-free H20室温洗脱2min，12000rpm离心2min收集洗脱液。
3.cDNA合成
按照表2配制反转录体系，将配置好的反应体系涡旋混匀，短暂离心，将离心后的反应体系放入PCR仪，PCR仪设置程序如表3。
表11
表12
| 步骤 | 温度 | 时间 |
| 1 | 42℃ | 60min |
| 2 | 70℃ | 5min |
| 3 | 4℃ | Hold |
4.PCR扩增
采用Vazyme Phanta Super-Fidelity DNAPolymerase，特异性引物信息见表4，测序接头序列包括：5'—CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGNNNNNNNNNNGAT–3'和3'—CGCACAGAGGCTGAGTCNNNNNNNNNNCTA-5'。按照表5配制PCR体系，将配置好的反应体系涡旋混匀，短暂离心，将离心后的反应体系放入PCR仪，PCR仪设置程序如表6。
表4
表5
表6
5.PCR产物琼脂糖凝胶电泳
吸取3μL PCR产物，进行2％琼脂糖凝胶电泳。
6.PCR产物纯化
将PCR产物体系用无核酸酶水补足体积到30μL，按照1.2×体积加入AMPure XP磁珠36μL。
涡旋混匀，室温放置5分钟，短暂离心后，放置到磁力架上，等液体清亮，去上清，用200μL的80％酒精清洗，重复一次，室温干燥磁珠，用15μL Low TE进行磁珠重悬，洗脱文库。
7.浓度测定
吸取1μL进行Qubit浓度测定。
8.上机测序
根据测序接头序列选择Proton测序平台进行上机测序。
9.数据分析
将上机获得测序数据与参考基因组进行数据分析和对比，得到可变剪切变异形成的转录本序列和比例。ERCC8基因可变剪切NGS检测结果如图3所示，根据图3可以得到待测样本的异常转录本的信息如表13所示。
表13
具体地，对先证者母亲和先证者产物的mRNA目标区域进行捕获建库，在IonProton平台进行高通量测序，先证者母亲和先证者PCR产物分别得到3.2M与2.6M测序Reads，对测序结果进行分析，发现先证者母亲及先证者的样本中存在1个缺失2号外显子的异常转录本，即外显子1和外显子3直接相连的异常转录本，和一个正常转录本，即外显子1、外显子2、外显子3依次相连的正常转录本，其中，插入缺失变异导致了转录本中2号外显子跳跃，形成了一种缺失2号外显子的异常转录本，如图3所示，各转录本Reads数和不同转录本占比的统计结果如表13所示。
10.性能检测
本实施例能检测ERCC8基因发生插入缺失变异导致的mRNA可变剪切，能准确检测样本中ERCC8基因发生插入缺失变异后形成的不同转录本序列信息和比例。
综上，本发明通过PCR扩增一步就可以对目的片段进行捕获、建库，对捕获后的目的片段进行高通量测序，0.5M的数据量即可用于可变剪切变异形成的异常转录本的分析，并且整个检测过程耗时短，成本低，具有高特异性和灵敏性的特点，不仅能对检测出的转录本进行定性分析，还能定量出各转录本所占比例，快速高效完成变异位点的转录水平变化检测，可检测剪切变异，深度内含子变异或者临床意义不明的各种变异对应的转录水平异常。
以上实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (7)
1.一种试剂盒在制备用于检测mRNA可变剪切变异的产品中的应用，其特征在于，所述试剂盒包括用于扩增靶基因目的片段的特异性上游引物和特异性下游引物，所述目的片段包含mRNA可变剪切变异片段，所述特异性上游引物的3’端互补配对于所述mRNA可变剪切变异片段相邻的第一外显子区域，所述特异性下游引物的3’端互补配对于所述mRNA可变剪切变异片段相邻的第二外显子区域，以使得所述目的片段的起始位置位于所述第一外显子区域内，所述目的片段的终止位置位于所述第二外显子区域内；
所述靶基因包括CDH23基因和WAS基因；用于扩增CDH23基因的特异性上游引物包括SEQID NO.1所示序列，用于扩增CDH23基因的特异性下游引物包括如SEQ ID NO.2所示序列；用于扩增WAS基因的特异性上游引物包括如SEQ ID NO.3所示序列，用于扩增WAS基因的特异性下游引物包括如SEQ ID NO.4所示序列。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述特异性上游引物和/或特异性下游引物连接有测序接头序列，所述测序接头序列和所述特异性上游引物和/或特异性下游引物的5’端相连接。
3.根据权利要求1-2任一项所述的应用，其特征在于，所述试剂盒还包括RNA提取试剂、RNA逆转录试剂、PCR扩增试剂和扩增产物纯化试剂中的至少一种。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述RNA逆转录试剂包括逆转录酶、逆转录引物、RNA酶抑制剂中的至少一中；
所述PCR扩增试剂包括扩增酶、扩增缓冲液以及无核酸酶水中的至少一种。
5.一种用于检测mRNA可变剪切变异的建库方法，其特征在于，所述方法包括：
获取待测样本的cDNA，采用权利要求1-4任一项中所述的试剂盒，对待测样本的cDNA进行扩增以获得待测样本靶基因目的片段的转录本测序文库。
6.一种非疾病诊断和治疗目的的用于检测mRNA可变剪切变异的方法，其特征在于，包括：对采用如权利要求5所述的建库方法构建的测序文库进行上机测序，以获取待测样本靶基因发生mRNA可变剪切变异形成的异常转录本信息。
7.根据权利要求6所述的用于检测mRNA可变剪切变异的方法，其特征在于，所述异常转录本信息包括异常转录本序列信息以及异常转录本比例中的至少一种。
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| PB01 | Publication | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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