CN109825560A - 用于检测C1QTNF3基因219bp缺失可变剪接体的引物、试剂盒及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供用于检测C1QTNF3基因219bp缺失可变剪接体的引物、试剂盒及检测方法。所述用于检测C1QTNF3基因219bp缺失可变剪接体的引物序列如SEQ ID NO:1‑2所示。本发明利用特异性引物将C1QTNF3基因的219bp缺失可变剪接体从该基因的多种剪接形式中分离出来，对C1QTNF3基因219bp缺失可变剪接体的表达水平进行定量分析，准确、快速、方便，具有很强的实用性。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地说，涉及用于检测C1QTNF3基因219bp缺失可变剪接体的引物、试剂盒及检测方法。
背景技术
C1QTNF3(CORS26)又称CTRP3或cartducin，是2003年发现的脂肪因子。C1QTNF3的生理功能是可调节软骨细胞增殖及骨关节疾病；调节内分泌、糖脂代谢、线粒体生物合成、免疫、炎症反应、细胞凋亡、血管新生、血管钙化以及心室重塑等多种生理、病理过程；调节机体睾酮、脂肪因子的分泌。猪C1QTNF3基因在组织中广泛表达，但其多种可变剪接体的鉴别和分离进展相对缓慢，这在一定程度上阻碍了C1QTNF3基因生理功能的研究。因此利用分子生物学手段鉴别某一剪接体组织表达模式，进而对其生物学功能的阐明具有推动作用，意义重大。
C1QTNF3属于分泌蛋白家族，可分为4个结构域：N-末端信号肽、可变域、胶原重复序列及C-末端gC1q球型域。人和小鼠C1QTNF3的N-末端含疏水性的信号肽，无跨膜结构域，可能是非膜蛋白。C1QTNF3在人体细胞中主要以二聚体和多聚体形式存在，但与脂联素和其他家族成员之间不能形成异源二聚体或多聚体。
可变剪接体是影响蛋白质发挥功能的重要原因之一。目前在人类中已经发现两种C1QTNF3剪接异构体(C1QTNF3 transcript variant 1，C1QTNF3 transcript variant 2)。然而，在猪中仅发现一种C1QTNF3剪接异构体，而且检测繁琐、耗时长、准确率低，因此亟需开发新的检测技术手段，为深入探究剪接体的生物学功能奠定基础。
发明内容
本发明的目的是提供用于检测C1QTNF3基因219bp缺失可变剪接体的引物、试剂盒及检测方法。
发明人在对猪C1QTNF3基因克隆和功能研究的过程中发现该基因第1外显子缺失了219bp的片段，这种缺失符合GT-AG剪接模式，据此提供一种检测C1QTNF3基因219bp缺失可变剪接体的引物以及包含该引物的试剂盒及检测方法，可有效解决现有的检测方法程序繁琐、耗时长、准确率低的问题。
为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供用于检测C1QTNF3基因219bp缺失可变剪接体的引物，包括引物CX2-F和CX2-R，它们的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1-2所示。
第二方面，本发明提供含有所述引物CX2-F和CX2-R的试剂盒。
进一步地，所述试剂盒还包括用于扩增18S内参基因的引物18S-F和18S-R，它们的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:3-4所示。
第三方面，本发明提供所述引物CX2-F和CX2-R、或含有上述引物的试剂盒在检测C1QTNF3基因219bp缺失可变剪接体中的应用。
第四方面，本发明提供一种检测C1QTNF3基因219bp缺失可变剪接体的方法，包括以下步骤：
1)提取待测样本总RNA，反转录成cDNA；
2)以步骤1)的cDNA为模板，利用引物18S-F和18S-R qPCR扩增18S内参基因，同时利用引物CX2-F和CX2-R qPCR扩增C1QTNF3基因219bp缺失可变剪接体；
3)对步骤2)的qPCR实时监测结果进行扩增曲线和熔解曲线分析，采用2-△△CT相对定量方法计算C1QTNF3基因219bp缺失可变剪接体在不同组织中的表达量，用SPSS version20.0进行差异显著性检验并通过GraphPad Prism 5作图。
qPCR的反应体系为：2×SYBR Premix Ex Taq II 9～11μL，去RNA酶水7～8μL，10μM上游引物0.3～1μL，10μM下游引物0.3～1μL，cDNA模板0.5～2.0μL。
优选地，反应体系为：2×SYBR Premix Ex Taq II 10μL，去RNA酶水7.4μL，10μM上游引物0.3μL，10μM下游引物0.3μL，cDNA模板2.0μL。
qPCR的反应程序为：92～96℃预变性30s～6min；92～96℃变性5～12s，55～65℃退火25～35s，35～45个循环。
优选地，反应程序为：95℃预变性30s；95℃变性5s，59℃退火30s，45个循环。
其中，所述2×SYBR Premix Ex Taq II包括含DNA聚合酶的Ex Taq HS、dNTPs、氯化镁、SYBR Green I和PCR反应缓冲液。
引物18S-F和18S-R的扩增产物大小为119bp，引物CX2-F和CX2-R的扩增产物大小为74bp。
前述的方法，步骤3)中采用相对定量方法，以脾脏组织作为外参(设置外参是为消除不同批次试验误差)计算该剪接体在不同组织中的相对表达量 采用单因素方差分析比较C1QTNF3基因在不同组织中表达差异，结果以平均值±标准误表示，采用Duncan’s法进行多重比较，P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著，所有统计分析用SPSS version 20.0软件完成。
本发明中用于检测猪C1QTNF3基因219bp缺失可变剪接体的引物，是针对C1QTNF3基因mRNA水平部分第1外显子缺失219bp后的部分第1外显子和第2外显子连接处的序列(5′-TGGAGTCTCCACAAACTGGAGGACTG-3′，SEQ ID NO:5)，设计识别该可变剪接体的特异性引物CX2-R；在第1外显子上设计该可变剪接体的上游引物CX2-F。这样引物对CX2只能扩增有219bp缺失的剪接体，从而避开其他已知或未知C1QTNF3基因可变剪接体的干扰。
借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
本发明利用特异性引物将C1QTNF3基因的219bp缺失可变剪接体从该基因的多种剪接形式中分离出来，对C1QTNF3基因219bp缺失可变剪接体的表达水平进行定量分析，准确、快速、方便，具有很强的实用性。
附图说明
图1为本发明实施例1的技术流程示意图。
图2为本发明实施例1中C1QTNF3基因和18S内参基因的扩增曲线。
图3为本发明实施例1中C1QTNF3基因和18S内参基因的熔解曲线。
图4为本发明实施例1中猪C1QTNF3基因219bp缺失可变剪接体在不同组织中的相对定量表达情况。柱状图中，柱子的值为平均数±标准误；没有相同小写字母表示差异显著(P＜0.05)，没有相同大写字母表示差异极显著(P＜0.01)。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
实施例1检测C1QTNF3基因219bp缺失可变剪接体的方法
本实施例的技术流程示意图如图1所示，主要包括以下步骤：
1、组织样品的采集
1月龄马身猪3头，来自于山西省大同市种猪场。屠宰后，分别采集股二头肌(GJ)、腰大肌(YJ)、腹部皮下脂肪(PZ)、心脏(X)、肝脏(G)、脾脏(P)、肺脏(F)、肾脏(S)、胃(W)等，立即投入液氮中，随后置于-80℃冰箱保存备用。
2、组织RNA提取及cDNA合成
采用TaKaRa RNAiso Plus试剂盒提取各组织的总RNA，提取方法参照试剂盒说明书。总RNA的完整性通过琼脂糖凝胶电泳检测确定；总RNA浓度通过NanoDrop1000微量紫外分光光度计测定。
采用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa,Dalian,China)试剂盒将RNA反转录成cDNA。
3、引物设计
根据NCBI公布的猪C1QTNF3基因mRNA预测序列(GenBank Accession No.XM_005672408.3)设计可鉴别C1QTNF3基因219bp缺失可变剪接体的引物对CX2；根据NCBI公布的18S基因序列设计引物对18S。
引物对CX2为(SEQ ID NO:1-2)：
上游引物，CX2-F：5′-ACCTGCTGGCTTTGCTTT-3′；
下游引物，CX2-R：5′-TCCTCCAGTTTGTGGAGACT-3′；
引物对18S为(SEQ ID NO:3-4)：
上游引物，18S-F：5′-ATGCCAGAGTCTCGTTCGTTAT-3′；
下游引物，18S-R：5′-CGGACAGGATTGACAGATTGAT-3′。
用于检测猪C1QTNF3基因219bp缺失可变剪接体的引物，是针对C1QTNF3基因mRNA水平部分第1外显子缺失219bp后的部分第1外显子和第2外显子连接处的序列(5′-TGGAGTCTCCACAAACTGGAGGACTG-3′)，设计识别该可变剪接体的特异性引物CX2-R；在第1外显子上设计该可变剪接体的上游引物CX2-F。这样引物对CX2只能扩增有219bp缺失的剪接体，从而避开其他已知或未知C1QTNF3基因可变剪接体的干扰。
4、荧光定量PCR扩增
荧光定量PCR反应体系采用混合加样法，即根据每一个反应体系所需的各种组分的数量和1次反应所需的PCR反应的个数，算出各种反应组分的总量，加入到1个去RNA酶的1.5mL离心管中，充分混匀后瞬时离心，再分装到荧光定量PCR专用的8联管中，然后分别加入模板cDNA，再瞬时离心后进行荧光定量PCR扩增，整个操作过程尽量避光；荧光定量PCR反应体系见表1。反应程序为：95℃预变性30s；95℃变性5s，59℃退火30s，45个循环。
表1荧光定量PCR反应体系
5、荧光定量PCR数据分析
对荧光定量PCR结果进行C1QTNF3基因219bp缺失可变剪接体及内参基因18S的扩增曲线(图2)和熔解曲线(图3)分析。图2中各基因扩增曲线均呈“S”形且到达平台期，说明为有效扩增；图3中各基因熔解曲线峰值单一，说明扩增产物特异、无引物二聚体及其他非特异性扩增，可以进行后续结果的分析。
根据猪各组织的CT值，以脾脏组织作为外参(设置外参是为消除不同批次试验误差)，
6、组织表达谱制图
根据相对定量的计算结果，利用SPSS version 20.0软件进行差异显著性检验，并通过GraphPad Prism 5制作该剪接体的组织表达图谱，结果如图4所示。图中个体重复数为3，qPCR加样技术重复为3。
利用本发明提供的特异性引物可将C1QTNF3基因的219bp缺失可变剪接体从该基因的多种剪接形式中分离出来，对C1QTNF3基因219bp缺失可变剪接体的表达水平进行定量分析，准确、快速、方便，具有很强的实用性。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 山西农业大学
<120> 用于检测C1QTNF3基因219 bp缺失可变剪接体的引物、试剂盒及检测方法
<130> KHP191111128.5
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
acctgctggc tttgcttt 18
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tcctccagtt tgtggagact 20
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atgccagagt ctcgttcgtt at 22
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cggacaggat tgacagattg at 22
<210> 5
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tggagtctcc acaaactgga ggactg 26
Claims (8)
1.用于检测C1QTNF3基因219bp缺失可变剪接体的引物，其特征在于，包括引物CX2-F和CX2-R，它们的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1-2所示。
2.含有权利要求1所述引物的试剂盒。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括用于扩增18S内参基因的引物18S-F和18S-R，它们的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:3-4所示。
4.权利要求1所述引物、或权利要求2或3所述试剂盒在检测C1QTNF3基因219bp缺失可变剪接体中的应用。
5.一种检测C1QTNF3基因219bp缺失可变剪接体的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)提取待测样本总RNA，反转录成cDNA；
2)以步骤1)的cDNA为模板，利用引物18S-F和18S-R qPCR扩增18S内参基因，同时利用引物CX2-F和CX2-R qPCR扩增C1QTNF3基因219bp缺失可变剪接体；
3)对步骤2)的qPCR实时监测结果进行扩增曲线和熔解曲线分析，采用2-△△CT相对定量方法计算C1QTNF3基因219bp缺失可变剪接体在不同组织中的表达量，用SPSS version20.0进行差异显著性检验并通过GraphPad Prism5作图。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤2)中qPCR的反应体系为：2×SYBRPremix Ex Taq II9～11μL，去RNA酶水7～8μL，10μM上游引物0.3～1μL，10μM下游引物0.3～1μL，cDNA模板0.5～2.0μL；
优选地，反应体系为：2×SYBR Premix Ex Taq II10μL，去RNA酶水7.4μL，10μM上游引物0.3μL，10μM下游引物0.3μL，cDNA模板2.0μL。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤2)中qPCR的反应程序为：92～96℃预变性30s～6min；92～96℃变性5～12s，55～65℃退火25～35s，35～45个循环；
优选地，反应程序为：95℃预变性30s；95℃变性5s，59℃退火30s，45个循环。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤2)中所述2×SYBR Premix Ex Taq II包括含DNA聚合酶的Ex Taq HS、dNTPs、氯化镁、SYBR Green I和PCR反应缓冲液。
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