CN113862372A - 定量检测abi1-tsv-11的pcr方法及其所用引物 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了定量检测ABI1‑TSV‑11的PCR方法及其所用引物。具体地公开了用于检测ABI1‑TSV‑11的巢式PCR引物组及其应用。本发明基于已有的18种ABI1基因TSVs的分子结构以及ABI1‑TSV‑11的分子结构特异性，设计了相关的引物和PCR反应条件，建立了一套快速、有效、稳定和精准的ABI1‑TSV‑11巢式PCR定量检测技术，该技术具有特异性好、灵敏度高的特点，可以有效避免假阳性扩增，并突破了在核酸水平无法特异性检测ABI1‑TSV‑11的瓶颈，作为一种全新的分子生物学技术在结直肠癌癌源基因ABI1转录变异体检测方面具有潜在的应用价值。

Description

定量检测ABI1-TSV-11的PCR方法及其所用引物
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及定量检测ABI1-TSV-11的PCR方法及其所用引物。
背景技术
结直肠癌（Colorectal Cancer，CRC）又称为“大肠癌”，是指大肠上皮来源的癌症，包括结肠癌与直肠癌。结直肠癌是最常见的消化道肿瘤，其与遗传因素、人口老龄化、不良饮食习惯、肥胖、缺乏锻炼、吸烟等密切相关，在消化道肿瘤中的发病率仅次于胃癌。CRC具有起病隐匿、病程长、早期诊断预后好的特点，因此，早期诊断和筛查能够降低结直肠癌的发病率和死亡率。目前结直肠癌筛查方法包括：粪便潜血检测、粪便DNA检测、乙状结肠镜检查、结肠镜检查、影像学检查及血液检测等。随着分子生物学技术的不断进步，结直肠癌检测方法均有一定的进展，但在应用于临床检测的实际应用中仍存在如假阳性等各方面的局限性，因此应该拓宽该领域的研究，积极寻找一种能解决实际应用问题的新技术。
Abelson相互作用蛋白1（Abelson interactor 1，ABI1）是一种接头蛋白，可与多种蛋白质发生相互作用形成蛋白复合体，参与包括结直肠癌（CRC）在内的、多种恶性肿瘤的转移过程。CRC包括左半结肠癌（Left-sided Colon Cancer，LsCC）和右半结肠癌（Right-sided Colon Cancer，RsCC），两者在分子特征、转移行为、预后转归方面都存在较大差异。ABI1的过表达和/或磷酸化与CRC的转移和进展有关。人类基因组中94%以上的基因在转录后，可剪切拼接为多个转录变异体（Transcript Variant，TSV）。研究表明，基因TSV的表达差异在CRC转移中发挥着至关重要的作用。ABI1基因在转录后至少可以剪切拼接出18个（NCBI主数据）TSVs，它们在CRC转移和进展中的作用尚不清楚。张钰等前期在筛选出与LsCC转移和进展密切相关的Abelson相互作用蛋白1转录变异体11（ABI1 Transcript Variant11，ABI1-TSV-11）的基础上，对其在LsCC转移中的作用及潜在分子机制进行了深入的研究，利用TCGA和TSVdb转录组数据库以及体内外实验证明了ABI1转录变异体11（ABI1-TSV-11）具有促进结直肠癌转移和进展的作用，并且ABI1-TSV-11是一个评估左半结直肠癌预后的独立影响因子，能够更加精准的对结直肠癌转移和预后进行评估（Zhang Y, Zhong Z, LiM, Chen J, Lin T, Sun J, Wang D, Mu Q, Su H, Wu N, Liu A, Yu Y, Zhang M, LiuY, Guo J, Yu W. The roles and prognostic significance of ABI1-TSV-11expression in patients with left-sided colorectal cancer. Sci Rep. 2021 May24;11(1):10734. doi: 10.1038/s41598-021-90220-8. PMID: 34031495; PMCID:PMC8144562）。人ABI1-TSV-11的氨基酸序列为Genbank Acession Number: NP_001171595.1。ABI1（Genbank Acession Number：Gene ID: 10006）基因由14个外显子（其中第11个外显子又包括11.1和11.2两部分）和14个内含子组成。人ABI1-TSV-11的mRNA序列Genbank号为：NM_001178124.2，是ABI1的第十一个转录拼接变异体，缺失了外显子2、5、6、10、11.1、11.2和12。
目前临床上尚缺乏在核酸水平的快速有效和精准的ABI1-TSV-11定量检测方法，国内外也尚未见应用巢式PCR两步法定量检测结肠癌癌源基因ABI1的11号转录变异体ABI1-TSV-11的报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何建立快速、有效和/或精准的ABI1-TSV-11巢式PCR（Nested PCR）定量检测方法。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了用于检测ABI1-TSV-11的PCR引物组合物，所述PCR为巢式PCR，所述引物组合物由内引物和外引物组成，所述外引物由引物ABI1-F和引物ABI1-R组成，所述内引物由引物TSV11-F和引物TSV11-R组成，所述引物ABI1-F是核苷酸序列是SEQ ID No.1的单链DNA；所述引物ABI1-R是核苷酸序列是SEQ ID No.2的单链DNA；所述引物TSV11-F是核苷酸序列是SEQ ID No.3的单链DNA；所述引物TSV11-R是核苷酸序列是SEQ ID No.4的单链DNA。
上述PCR引物组合物中，所述PCR可为巢式PCR。所述引物ABI1-F和所述引物ABI1-R用于第一轮PCR扩增，为巢式PCR的外引物；所述引物TSV11-F和引物TSV11-R用于第二轮PCR扩增，为巢式PCR的内引物。
上述PCR引物组合物中，所述内引物和所述外引物均可独立包装。所述内引物中，所述引物ABI1-F和所述引物ABI1-R的摩尔比可为1:1；所述外引物中，所述引物TSV11-F和所述引物TSV11-R的摩尔比可为1:1。
本发明还提供了所述PCR引物组合物的下述任一种应用：
A1）所述PCR引物组合物在检测ABI1-TSV-11中的应用；
A2）所述PCR引物组合物在制备用于检测ABI1-TSV-11的产品中的应用；
A3）所述PCR引物组合物在制备用于诊断或辅助诊断结直肠癌的产品中的应用；
A4）所述PCR引物组合物在制备用于结直肠癌的预后评估或疗效观察的产品中的应用；
A5）所述PCR引物组合物在制备用于结直肠癌早期诊断的产品中的应用；
A6）所述PCR引物组合物在制备用于结直肠癌筛查的产品中的应用；
A7）所述PCR引物组合物在制备用于鉴别左半结肠癌与右半结肠癌的产品中的应用。
其中，A6）所述用于结直肠癌筛查的产品可为用于结直肠癌早期筛查的产品。
上述应用中，所述产品可为试剂或试剂盒。
上述应用中，所述结直肠癌可为左半结肠癌。
本发明还提供了PCR检测ABI1-TSV-11的方法，所述方法包括如下步骤：
B1）提取待测样品RNA，将所述RNA反转录得到cDNA；
B2）以所述cDNA为模板，利用所述引物ABI1-F和引物ABI1-R进行第一轮PCR扩增反应，得到第一轮PCR扩增反应产物；
B3）以所述第一轮PCR扩增反应产物为模板，利用所述引物TSV11-F和引物TSV11-R进行第二轮PCR扩增反应，得到第二轮PCR扩增反应产物；
B4）根据所述第二轮PCR扩增反应产物确定待测样品是否含有ABI1-TSV-11。
进一步地，B4）所述根据第二轮PCR扩增反应产物确定待测样品是否含有ABI1-TSV-11的方法包括下述任一种：
（1）根据第二轮PCR扩增反应产物中是否含有一个大小为367 bp的DNA片段，确定待测样品是否含有ABI1-TSV-11：如果含有一个大小为367 bp的DNA片段，所述待测样品中含有ABI1-TSV-11；如果不含有一个大小为367 bp的DNA片段，所述待测样品中不含有ABI1-TSV-11。
（2）根据第二轮PCR扩增反应产物的扩增曲线和溶解曲线确定待测样品是否含有ABI1-TSV-11：如果扩增曲线为S型曲线确定待测样品中含有ABI1-TSV-11；如果扩增曲线不为S型曲线，确定待测样品中不含有ABI1-TSV-11；如果溶解曲线为单峰型曲线确定待测样品中含有ABI1-TSV-11；如果溶解曲线不为单峰型曲线或无峰，确定待测样品中有非特异性扩增产物出现或不含有ABI1-TSV-11。
（3）根据第二轮PCR扩增反应产物的Ct值确定待测样品是否含有ABI1-TSV-11：如果Ct值≤35确定待测样品中含有ABI1-TSV-11；如果Ct值>35，确定待测样品中不含有ABI1-TSV-11。
上述方法中，所述方法还包括以GAPDH作为内参基因进行巢式PCR定量检测的步骤，所述方法包括以所述cDNA为模板，利用引物GAPDH-548-F和引物GAPDH-548-R进行第一轮PCR扩增反应，得到名称为GAPDH第一轮PCR产物的第一轮PCR扩增反应产物，以所述GAPDH第一轮PCR产物为模板，利用引物GAPDH-215-F和引物GAPDH-215-R进行第二轮PCR扩增反应，得到名称为GAPDH第二轮PCR产物的第二轮PCR扩增反应产物；所述引物GAPDH-548-F是核苷酸序列为SEQ ID No.5的单链DNA；所述引物GAPDH-548-R是核苷酸序列为SEQ ID No.6的单链DNA；所述引物GAPDH-215-F是核苷酸序列为SEQ ID No.7的单链DNA；所述引物GAPDH-215-R是核苷酸序列为SEQ ID No.8的单链DNA。
其中，引物GAPDH-548-F和引物GAPDH-548-R为外引物，用于第一轮PCR扩增反应；引物GAPDH-215-F和引物GAPDH-215-R为内引物，用于第二轮PCR扩增反应。
进一步地，根据第二轮PCR扩增反应产物确定待测样品中ABI1-TSV-11的相对表达量和两样品间的相对差异表达量的方法包括下述任一种：
（1）根据第二轮PCR扩增产物的Ct值确定样品中ABI1-TSV-11的相对表达量：样品中ABI1-TSV-11的相对表达量=2ΔCT(ΔCt=CtABI1-TSV-11-CtGAPDH)。
（2） 根据第二轮PCR扩增产物的Ct值确定两样品间ABI1-TSV-11的相对表达量：两样品间的相对差异表达量=2-ΔΔCT （ΔΔCT=ΔCT样本1-ΔCT样本2）。
上述方法中，所述方法还包括以人工构建的、含有ABI1-TSV-11全长编码序列（Coding sequence，CDS，GenBank Accession Number: NM_001178124.2）cDNA的质粒DNA作为模板，进行巢式PCR绝对定量检测的步骤，所述方法包括以所述ABI1-TSV-11 全长CDScDNA为模板，利用所述引物ABI1-F和引物ABI1-R进行第一轮PCR扩增反应，得到第一轮PCR扩增反应产物（扩增片段长度为697 bp）；以所述第一轮PCR扩增反应产物为标准品模板(精确定量后，确定起始拷贝数是5.236×1012 copies/ml,然后进行递次10倍梯度稀释）,利用所述引物TSV11-F和引物TSV11-R进行第二轮PCR扩增反应，得到第二轮PCR扩增反应产物；根据所述第二轮PCR扩增反应产物的Ct值，构建标准曲线，确定待测样品中ABI1-TSV-11的绝对含量。
上述方法中，所述待测样品可为细胞或组织。
进一步地，在本发明的一个实施例中，
第一轮PCR扩增反应体系为：PrimeSTAR Max Premix（2×）25 μl，引物ABI1-F和引物ABI1-R 各1 μl，cDNA 200 ng，用无菌水补足至50 μl。该PCR反应体系中，引物ABI1-F和引物ABI1-R的浓度均为0.2 μM。
第一轮PCR扩增反应程序为：98 ℃ 10 sec，60 ℃ 15 sec，72 ℃ 30 sec ；20个循环。
第二轮PCR扩增反应体系为：TB Green Fast qPCR Mix（2×）25 μl，引物TSV11-F和引物TSV11-R各1 μl，cDNA模板（即第一轮PCR扩增反应产物）100 ng，用无菌水补足至20μl。该PCR反应体系中，引物TSV11-F和引物TSV11-R的浓度均为0.5 μM。
第二轮PCR扩增反应程序为：先95 ℃ 30 sec，然后95 ℃ 5 sec，再60 ℃ 10sec； 40个循环，最后是溶解曲线生成。
本发明还提供了用于检测ABI1-TSV-11的试剂或试剂盒，所述试剂或试剂盒包括所述PCR引物组合物。
进一步地，所述试剂盒还包括所述引物GAPDH-548-F、引物GAPDH-548-R、引物GAPDH-215-F和引物GAPDH-215-R。
进一步地，所述试剂盒还包括PCR扩增所需要的Taq DNA聚合酶、dNTP、PCR缓冲液、Mg2+中的一种或多种。
本发明还提供了本文中任一所述的方法，和/或，所述试剂或试剂盒在ABI1-TSV-11检测中的应用。
上述应用和方法的目的可以是疾病诊断目的、疾病预后目的和/或疾病治疗目的，它们的目的也可以是非疾病诊断目的、非疾病预后目的和非疾病治疗目的；它们的直接目的可以是获取疾病诊断结果、疾病预后结果和/或疾病治疗结果的中间结果的信息，它们的直接目的可以是非疾病诊断目的、非疾病预后目的和/或非疾病治疗目的。
本发明采用巢式PCR两步法定量检测结肠癌癌源基因ABI1的11号转录变异体ABI1-TSV-11。首先利用ABI1基因的18种TSVs分子的核酸序列保守区（Exon 3 和 Exon 13）设计ABI1-TSV特异性通用引物ABI1-F及引物ABI1-R，采用高保真DNA聚合酶进行ABI1基因所有转录本的均一性PCR扩增，第一轮PCR高保真扩增中，所有的转录变异体均会被扩增，根据转录变异体之间的序列差异，扩增产物大小在520-1057 bp之间。其次，以第一轮高保真均一性的PCR产物为模板，使用基于ABI1基因第11号转录变异体（ABI1-TSV-11）的Exon-Exon junction PCR特异性引物TSV11-F和引物TSV11-R，进行第二轮ABI1-TSV-11特异性实时定量PCR扩增。最后，将第二轮PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，根据第二轮PCR扩增反应产物确定待测样品是否含有ABI1-TSV-11。
进一步地，为对ABI1-TSV-11的表达量进行相对定量分析，本发明将GAPDH作为内参基因，进行相对定量分析。首先利用GAPDH保守区设计第一轮PCR扩增反应的外引物（引物GAPDH-548-F和引物GAPDH-548-R），进行第一轮PCR扩增，扩增产物大小为548 bp。其次，以第一轮高保真均一性的PCR产物为模板，使用第二轮PCR扩增反应的内引物（引物GAPDH-215-F和引物GAPDH-215-R）进行第二轮实时定量PCR扩增，产物长度215 bp。
进一步地，为对ABI1-TSV-11的表达量进行绝对定量分析，本发明以含有ABI1-TSV-11全长CDS序列的DNA质粒作为模板，进行绝对定量分析。首先以所述引物ABI1-F和引物ABI1-R进行第一轮PCR扩增反应，得到第一轮PCR扩增反应产物（扩增片段长度为697bp）。其次，以所述第一轮PCR扩增反应产物为标准品模板(精确定量后，确定起始拷贝数是5.236×1012 copies/ml,然后进行递次10倍梯度稀释）,利用所述引物TSV11-F和引物TSV11-R进行第二轮PCR扩增反应，得到第二轮PCR扩增反应产物的Ct值；根据所述第二轮PCR扩增反应产物的Ct值，构建标准曲线，确定待测样品中ABI1-TSV-11的绝对含量。
本申请中，所述ABI1-TSV-11为Abelson相互作用蛋白1转录变异体11（ABI1Transcript Variant 11），具体可为人ABI1-TSV-11。
本发明基于ABI1基因已有的18种TSVs的成熟mRNA分子结构以及ABI1-TSV-11的分子结构特异性，设计了相关的引物和PCR反应条件，经过广泛而深入的探索研究，建立了一套以总RNA为起始材料的、快速（去除基因组DNA 5分钟、逆转录反应20分钟、第一轮PCR反应75分钟、第一轮PCR产物纯化10分钟和第二轮PCR 65分钟，总计耗时175分钟约3小时）、有效而稳定（无细胞体系、细胞体系和组织体系的检测结果一致，反应条件一致）和精准的ABI1-TSV-11巢式PCR（Nested PCR）定量检测方法，该方法具有特异性好（PCR产物的一代测序结果证明该方法能够特异性地扩增出ABI1-TSV-11的专一性DNA片段）、灵敏度高（通过一个完整的RT-nested PCR反应，能在100 ng总RNA起始材料中检测出40 fg ，即1.0472×105拷贝数的ABI1-TSV-11分子）的特点，可以有效避免假阳性扩增，并突破了在核酸水平无法特异性检测ABI1-TSV-11的瓶颈，可用于结直肠癌癌源基因ABI1转录变异体检测。
附图说明
图1为第一轮PCR扩增反应产物的电泳图。图中，1-12分别表示：1. SW480细胞使用ABI1-F和ABI1-R引物对进行第一轮PCR的扩增产物(20个循环);2. SW480细胞使用ABI1-F和ABI1-R引物对进行第一轮PCR的扩增产物(25个循环)；3. SW480细胞使用ABI1-F和ABI1-R引物对进行第一轮PCR的扩增产物(30个循环); 4. SW480细胞使用GAPDH外引物进行第一轮PCR的扩增产物(20个循环); 5. SW480细胞使用GAPDH外引物进行第一轮PCR的扩增产物(25个循环); 6. SW480细胞使用GAPDH外引物进行第一轮PCR的扩增产物(30个循环); 7.LoVo细胞使用ABI1-F和ABI1-R引物对进行第一轮PCR的扩增产物(20个循环);8. LoVo细胞使用ABI1-F和ABI1-R引物对进行第一轮PCR的扩增产物(25个循环)；9. LoVo细胞使用ABI1-F和ABI1-R引物对进行第一轮PCR的扩增产物(30个循环); 10. LoVo细胞使用GAPDH外引物进行第一轮PCR的扩增产物(20个循环); 11. LoVo细胞使用GAPDH外引物进行第一轮PCR的扩增产物(25个循环); 12. LoVo细胞使用GAPDH外引物进行第一轮PCR的扩增产物(30个循环)。
图2为第二轮PCR扩增反应产物的电泳图。图中，1-4分别表示：1. SW480细胞使用TSV11-F和TSV11-R引物对进行第二轮PCR的扩增产物；2. LoVo细胞使用TSV11-F和TSV11-R引物对进行第二轮PCR的扩增产物；3. SW480细胞使用GAPDH内引物进行第二轮PCR的扩增产物；4. LoVo细胞使用GAPDH内引物进行第二轮PCR的扩增产物。
图3为第二轮PCR扩增反应的扩增曲线图。其中图3中A为ABI1-TSV-11的扩增曲线，图3中B为GAPDH的扩增曲线。
图4为第二轮PCR扩增反应的溶解曲线图。其中图4中A为ABI1-TSV-11的溶解曲线，图4中B为GAPDH的溶解曲线。
图5为扩增产物测序图。其中图5中A为ABI1-TSV-11的测序结果，PCR扩增产物为特异性的ABI1-TSV-11片段；图5中B为GAPDH的测序结果，PCR扩增产物为特异性的GAPDH片段。
图6为第二轮PCR扩增反应产物的电泳图。图6中A为组织标本T1、N1、T2、N2使用TSV11-F和TSV11-R引物对进行第二轮PCR的ABI1-TSV-11扩增产物；图6中B为组织标本T1、N1、T2、N2使用GAPDH内引物进行第二轮PCR的GAPDH扩增产物。
图7为组织标本T1、N1、T2、N2执行ABI1-TSV-11和GAPDH检测第二轮PCR的扩增曲线和溶解曲线图。其中图7中A和B分别为ABI1-TSV-11的扩增曲线和溶解曲线图；图7中C和D分别为GAPDH的扩增曲线和溶解曲线图。
图8为ABI1-TSV-11相对定量图，利用转染空载体（Empty Vector,EV）和ABI1-TSV-11质粒的SW480和LoVo细胞模型进行特异性RT-nested PCR检测，相对定量结果显示ABI1-TSV-11过表达，结果与Western Blot检测一致（Zhang Y, Zhong Z, Li M, Chen J, LinT, Sun J, Wang D, Mu Q, Su H, Wu N, Liu A, Yu Y, Zhang M, Liu Y, Guo J, Yu W.The roles and prognostic significance of ABI1-TSV-11 expression in patientswith left-sided colorectal cancer. Sci Rep. 2021 May 24;11(1):10734）。
图9为ABI1-TSV-11绝对定量图，其中图9中A为PCR扩增产物的电泳图（1-10分别代表以40 ug到40 fg的标准品（十倍递减稀释）为起始模板量扩增的PCR产物；图9中B为PCR扩增曲线图；图9中C为ABI1-TSV-11绝对定量的标准曲线图（起始模板量为4 ug到400 fg）；图9中D为PCR溶解曲线图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、巢式PCR引物的设计与合成
1、ABI1-TSV-11巢式PCR检测引物的设计与合成
Abelson相互作用蛋白1（Abelson interactor 1，ABI1）基因ABI1在转录后可以剪切拼接出18个转录变异体（ABI1-TSV-1 mRNA、ABI1-TSV-2 mRNA、ABI1-TSV-3 mRNA、ABI1-TSV-4 mRNA、ABI1-TSV-5 mRNA、ABI1-TSV-6 mRNA、ABI1-TSV-7 mRNA、ABI1-TSV-8 mRNA、ABI1-TSV-9 mRNA、ABI1-TSV-10 mRNA、ABI1-TSV-11 mRNA、ABI1-TSV-12 mRNA、ABI1-TSV-13 mRNA、ABI1-TSV-14 mRNA、ABI1-TSV-15 mRNA、ABI1-TSV-16 mRNA、ABI1-TSV-17 mRNA和ABI1-TSV-18 mRNA）。利用NCBI已发表的ABI1基因的18种TSVs分子的mRNA核酸序列保守区（Exon 3 和 Exon 13）设计第一轮巢式PCR外引物为：ABI1-TSVs（Abelson相互作用蛋白1转录变异体）通用引物（外引物）：引物ABI1-F（对应于Exon 3）及引物ABI1-R（对应于Exon13）。
以ABI1-TSV-11的Exon-Exon junction(Exon-Exon Junction 7-4 Plus Exon-Exon Junction 13-9)区域为模板，设计第二轮巢式PCR内引物即ABI1-TSV-11特异性引物为：引物TSV11-F（对应于Exon 5和Exon 6跳读的位置）和引物TSV11-R（对应于Exon 10、Exon 11.1、Exon 11.2和Exon 12跳读的位置）。
上述设计的4条引物（引物ABI1-F、引物ABI1-R、引物TSV11-F和引物TSV11-R）为用于检测ABI1-TSV-11的巢式PCR引物组合物，其中，引物ABI1-F的核苷酸序列是SEQ IDNo.1；引物ABI1-R的核苷酸序列是SEQ ID No.2；引物TSV11-F的核苷酸序列是SEQ IDNo.3；引物TSV11-R的核苷酸序列是SEQ ID No.4。
2、内参基因GAPDH巢式PCR检测引物的设计与合成
为对ABI1-TSV-11的表达量进行相对定量分析，本发明将GAPDH作为内参基因(mRNA Genbank Accession Number: NM_002046.7)，进行相对定量分析。首先利用GAPDH保守区设计第一轮巢式PCR外引物为：GAPDH通用引物：引物GAPDH-548-F（对应于75-94bp）和引物GAPDH-548-R（对应于622-603bp）。利用引物GAPDH-548-F和引物GAPDH-548-R进行第一轮PCR扩增的产物大小为548 bp。其次，以第一轮高保真均一性的PCR产物为模板，设计第二轮巢式PCR内引物：引物GAPDH-215-F（对应于59-78bp）和引物GAPDH-215-R（对应于273-254bp），第二轮实时定量PCR扩增的产物长度215 bp。
上述设计的4条引物（引物GAPDH-548-F、引物GAPDH-548-R、引物GAPDH-215-F和引物GAPDH-215-R）为内参基因GAPDH检测的巢式PCR引物组合物，其中，引物GAPDH-548-F的核苷酸序列是SEQ ID No.5；引物GAPDH-548-R的核苷酸序列是SEQ ID No.6；引物GAPDH-215-F的核苷酸序列是SEQ ID No.7；引物GAPDH-215-R的核苷酸序列是SEQ ID No.8。
实施例2、ABI1-TSV-11巢式PCR检测方法
本实施例利用已建立的ABI1-TSV-11过表达细胞系（SW480和LoVo）以及4对结直肠癌（Colorectal Cancer，CRC）临床组织样本（包括癌和癌旁组织）作为待测样品，进行巢式PCR（Nested-PCR）相对定量的检测实验，以确认这一检测技术在实验研究和临床研究中的应用价值。
1、待测样品：
（1）细胞样品：ABI1-TSV-11过表达细胞系（SW480和LoVo）记载于如下文献中：Zhang Y, Zhong Z, Li M, Chen J, Lin T, Sun J, Wang D, Mu Q, Su H, Wu N, LiuA, Yu Y, Zhang M, Liu Y, Guo J, Yu W. The roles and prognostic significanceof ABI1-TSV-11 expression in patients with left-sided colorectal cancer. SciRep. 2021 May 24;11(1):10734. doi: 10.1038/s41598-021-90220-8. PMID:34031495; PMCID: PMC8144562.
（2）组织样品：4对CRC临床组织样本（1N，1T，2N，2T，3N，3T,4N和4T）为北京大学人民医院的临床标本，已通过医院伦理委员会批准。
2、待测样品RNA的提取及反转录为cDNA：
采用Trizol试剂（Invitrogen）分别从细胞样品和组织样品中提取总RNA，使用PrimeScript™RT reagent Kit with gDNA Eraser（TaKaRa公司，货号RR047A）逆转录试剂盒，除去基因组DNA进行逆转录反应，分别获得细胞样品和组织样品的cDNA。
步骤1：去除基因组DNA的反应体系如表1所示：
表1 去除基因组DNA的反应体系
试剂 使用量
5 × gDNA Eraser buffer 2 μl
gDNA Eraser 1 μl
总RNA 1 μg
灭菌水 补足至10 μl
去除基因组DNA的反应条件为：42 ℃ 2 min。4℃冷却。
步骤2：反转录反应体系如表2所示：
表2 反转录反应体系
试剂 使用量
步骤1的反应液 10 μl
PrimeScript RT Enzyme Mix 1 1 μl
RT Primer Mix (Oligo dT) 1 μg
5 × PrimeScript Buffer 2 4 μl
灭菌水 4 μl
反转录反应条件为：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 sec。4℃冷却。
3、巢式PCR检测
3.1第一轮PCR扩增反应
3.1.1利用引物ABI1-F和引物ABI1-R进行第一轮PCR扩增反应
分别以上述细胞样品和组织样品的cDNA为模板，利用引物ABI1-F和引物ABI1-R进行第一轮PCR扩增反应，试剂盒使用PrimeSTAR® Max DNA Polymerase（TaKaRa公司，货号R045A），得到ABI1-TSV-11的第一轮PCR扩增反应产物。
50 μl 的PCR反应体系如下：PrimeSTAR Max Premix（2×）25 μl，引物ABI1-F和引物ABI1-R 各1 μl，cDNA 200 ng，用无菌水补足至50 μl。该PCR反应体系中，引物ABI1-F和引物ABI1-R的浓度均为0.2 μM。
第一轮PCR扩增反应程序为：分别进行20个循环（20 cycles）、25个循环（25cycles）和30个循环（30 cycles），每个循环均为：先98 ℃ 10 sec，然后60 ℃ 15 sec，再72 ℃ 30 sec。
3.1.2利用引物GAPDH-548-F和引物GAPDH-548-R进行第一轮PCR扩增反应
参照3.1.1，除将3.1.1中的引物ABI1-F和引物ABI1-R替换为引物GAPDH-548-F和引物GAPDH-548-R外，其它均与3.1.1相同，得到GAPDH的第一轮PCR扩增反应产物。
3.1.3第一轮PCR扩增反应产物检测
1%琼脂糖凝胶电泳检测第一轮PCR扩增反应产物，结果如图1所示，第一轮PCR扩增是采用高保真DNA聚合酶进行ABI1基因所有转录本的均一性PCR扩增，本轮扩增中，所有的转录变异体均会被扩增，根据转录变异体之间的序列差异，扩增产物大小分别是520-1057bp之间和548 bp（GAPDH）。图1中，ABI1-TSVs第一轮扩增产物如1-3泳道（SW480细胞）和7-9泳道（Lovo细胞）所示，4-6泳道（SW480细胞）和10-12泳道（LoVo细胞）。
3.2第二轮PCR扩增反应
3.2.1利用引物TSV11-F和引物TSV11-R进行第二轮PCR扩增反应
以第一轮PCR扩增反应产物为模板，利用引物TSV11-F和引物TSV11-R进行第二轮PCR扩增反应，试剂盒使用TB Green®Fast qPCR Mix（TaKaRa公司，货号RR430A），得到ABI1-TSV-11的第二轮PCR扩增反应产物。
20 μl的PCR反应体系如下：TB Green Fast qPCR Mix（2×）25 μl，引物TSV11-F和引物TSV11-R各1 μl，cDNA模板（即第一轮PCR扩增反应产物）100 ng，用无菌水补足至20 μl。该PCR反应体系中，引物TSV11-F和引物TSV11-R的浓度均为0.5 μM。
第二轮PCR扩增反应程序为：先95 ℃ 30 sec，然后95 ℃ 5 sec，再56 ℃ 10sec；20个循环。
3.2.2利用引物GAPDH-215-F和引物GAPDH-215-R进行第二轮PCR扩增反应
参照3.2.1，除将3.2.1中的引物TSV11-F和引物TSV11-R替换为引物GAPDH-215-F和引物GAPDH-215-R外，其它均与3.2.1相同，得到GAPDH的第二轮PCR扩增反应产物。
3.2.3 第二轮（巢式）PCR扩增反应产物检测
1%琼脂糖凝胶电泳检测第二轮PCR扩增反应产物，电泳结果如图2（细胞样本）和图6（组织样本）所示，扩增曲线如图3（细胞样本）和图7（组织样本）所示，溶解曲线如图4（细胞样本）和图7（组织样本）所示，第二轮PCR扩增溶解曲线出现单峰（图4和图7），测序结果显示扩增产物为ABI1-TSV-11和GAPDH片段（图5），这说明设计的引物扩增产物特异性好。
可根据第二轮PCR扩增反应产物中是否含有一个大小为367 bp的DNA片段，确定待测样品是否含有ABI1-TSV-11：如果含有一个大小为367 bp的DNA片段，所述待测样品中含有ABI1-TSV-11；如果不含有一个大小为367 bp的DNA片段，所述待测样品中不含有ABI1-TSV-11。
可根据第二轮PCR扩增反应产物的扩增曲线和溶解曲线确定待测样品是否含有ABI1-TSV-11：如果扩增曲线为S型曲线确定待测样品中含有ABI1-TSV-11；如果扩增曲线不为S型曲线，确定待测样品中不含有ABI1-TSV-11；如果溶解曲线为单峰型曲线确定待测样品中含有ABI1-TSV-11；如果溶解曲线不为单峰型曲线或无峰，确定待测样品中有非特异性扩增产物出现或不含有ABI1-TSV-11。
可根据第二轮PCR扩增反应产物的Ct值确定待测样品是否含有ABI1-TSV-11：如果Ct值≤35确定待测样品中含有ABI1-TSV-11；如果Ct值>35，确定待测样品中不含有ABI1-TSV-11。
可根据第二轮PCR扩增产物的Ct值确定样品中ABI1-TSV-11的相对表达量：样品中ABI1-TSV-11的相对表达量=2ΔCT(ΔCt=CtABI1-TSV-11-CtGAPDH); 根据第二轮PCR扩增产物的Ct值确定两样品间ABI1-TSV-11的相对表达量：两样品间的相对差异表达量=2-ΔΔCT （ΔΔCT=ΔCT样本1-ΔCT样本2）。使用已构建的ABI1-TSV-11过表达SW480和LoVo细胞模型（Western Blot鉴定）进行ABI1-TSV-11 RT-Nested PCR检测，经相对定量后结果与张钰文献完全一致，结果如图8所示。
使用细胞（SW480、SW620和LoVo）以及临床组织标本（T1-4,N1-4共4对）的测序数据进行验证：细胞(3/3)100%吻合，组织对（3/4）75% 吻合，如果按照检测的数量来计算的话，（9/11）81.8% 验证一致，展现了该方法有较好的临床应用价值。
以人工构建的、含有ABI1-TSV-11全长编码序列（Coding sequence，CDS，GenBankAccession Number: NM_001178124.2）cDNA的质粒DNA作为模板，进行巢式PCR绝对定量检测的步骤包括以所述ABI1-TSV-11 全长CDS cDNA为模板，利用所述引物ABI1-F和引物ABI1-R进行第一轮PCR扩增反应，得到第一轮PCR扩增反应产物（扩增片段长度为697 bp）；以所述第一轮PCR扩增反应产物为标准品模板(精确定量后，确定起始拷贝数是5.236×1012copies/ml,然后进行递次10倍梯度稀释）,利用所述引物TSV11-F和引物TSV11-R进行第二轮PCR扩增反应，得到第二轮PCR扩增反应产物；根据所述第二轮PCR扩增反应产物的Ct值，构建标准曲线，确定待测样品中ABI1-TSV-11的绝对含量。
在以细胞或组织总RNA反转的cDNA为模板执行ABI1-TSV-11检测时，可以同步利用含ABI1-TSV-11 cDNA质粒作为标准品进行定量分析，如图9所示，构建了用于绝对定量的标准曲线，同时检测灵敏度达到了40 fg。
本研究从设计和执行过程中还涉及了以下诸多前期探索性和优化性的工作内容：NCBI目前 公布的ABI1-TSVs共有18种，还有4种计算机预测的、未经验证的序列。由于序列的高度同源性，常规的引物设计手段仅限于第一轮PCR中泛TSVs的扩增，而现有序列的比对结果发现专属于ABI1-TSV-11的特异性序列是Exon7–Exon4 Junction和Exon13–Exon9Junction的并存,只能使用这两处序列作为引物进行ABI1-TSV-11的特异性扩增,就需要优化下列条件：1）执行巢式PCR而非常规PCR检测模式；2）在RNA提取后对基因组DNA进行清除；3）使用Oligo dT、而非随机六聚体引物或二者合并作为反转录引物，从细胞或组织总RNA合成cDNA；4）第一轮执行高保真酶催化的PCR而非普通Taq酶催化的PCR；5）第一轮高保真酶催化的PCR循环数为15-20而不是更多；6）对第一轮PCR产物进行纯化（清除200bp一下片段）；7）同步选择ACTB和GAPDH执行同样的nested-PCR流程，确定GAPDH更适合作为内参执行相对定量分析。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
序列表
<110> 北京大学人民医院
<120> 定量检测ABI1-TSV-11的PCR方法及其所用引物
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 1
gcctctcagc ttcggagaat g 21
<210> 2
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 2
tatactgaac tactgcagcc tcctcat 27
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 3
atggtgtcaa gcatggaaat aac 23
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 4
gactatcagc aactggtcca a 21
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 5
ccatggggaa ggtgaaggtc 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 6
agtgatggca tggactgtgg 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 7
ccacatcgct cagacaccat 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 8
ttcccgttct cagccttgac 20

Claims (10)

1.用于检测ABI1-TSV-11的PCR引物组合物，其特征在于，所述PCR为巢式PCR，所述引物组合物由内引物和外引物组成，所述外引物由引物ABI1-F和引物ABI1-R组成，所述内引物由引物TSV11-F和引物TSV11-R组成，所述引物ABI1-F是核苷酸序列是SEQ ID No.1的单链DNA；所述引物ABI1-R是核苷酸序列是SEQ ID No.2的单链DNA；所述引物TSV11-F是核苷酸序列是SEQ ID No.3的单链DNA；所述引物TSV11-R是核苷酸序列是SEQ ID No.4的单链DNA。
2.权利要求1所述的PCR引物组合物的下述任一种应用：
A1）权利要求1所述的PCR引物组合物在检测ABI1-TSV-11中的应用；
A2）权利要求1所述的PCR引物组合物在制备用于检测ABI1-TSV-11的产品中的应用；
A3）权利要求1所述的PCR引物组合物在制备用于诊断或辅助诊断结直肠癌的产品中的应用；
A4）权利要求1所述的PCR引物组合物在制备用于结直肠癌的预后评估或疗效观察的产品中的应用；
A5）权利要求1所述的PCR引物组合物在制备用于结直肠癌早期诊断的产品中的应用；
A6）权利要求1所述的PCR引物组合物在制备用于结直肠癌筛查的产品中的应用；
A7）权利要求1所述的PCR引物组合物在制备用于鉴别左半结肠癌与右半结肠癌的产品中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述产品为试剂或试剂盒。
4.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于，所述结直肠癌为左半结肠癌。
5.PCR检测ABI1-TSV-11的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
B1）提取待测样品RNA，将所述RNA反转录得到cDNA；
B2）以所述cDNA为模板，利用权利要求1中所述的引物ABI1-F和引物ABI1-R进行第一轮PCR扩增反应，得到第一轮PCR扩增反应产物；
B3）以所述第一轮PCR扩增反应产物为模板，利用权利要求1中所述的引物TSV11-F和引物TSV11-R进行第二轮PCR扩增反应，得到第二轮PCR扩增反应产物；
B4）根据所述第二轮PCR扩增反应产物确定待测样品是否含有ABI1-TSV-11。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法还包括以GAPDH作为内参基因进行巢式PCR定量检测的步骤，所述方法包括以所述cDNA为模板，利用引物GAPDH-548-F和引物GAPDH-548-R进行第一轮PCR扩增反应，得到名称为GAPDH第一轮PCR产物的第一轮PCR扩增反应产物，以所述GAPDH第一轮PCR产物为模板，利用引物GAPDH-215-F和引物GAPDH-215-R进行第二轮PCR扩增反应，得到名称为GAPDH第二轮PCR产物的第二轮PCR扩增反应产物；所述引物GAPDH-548-F是核苷酸序列为SEQ ID No.5的单链DNA；所述引物GAPDH-548-R是核苷酸序列为SEQ ID No.6的单链DNA；所述引物GAPDH-215-F是核苷酸序列为SEQ ID No.7的单链DNA；所述引物GAPDH-215-R是核苷酸序列为SEQ ID No.8的单链DNA。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述待测样品为细胞或组织。
8.用于检测ABI1-TSV-11的试剂或试剂盒，其特征在于，所述试剂或试剂盒包括权利要求1所述的PCR引物组合物。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括权利要求6中所述的引物GAPDH-548-F、引物GAPDH-548-R、引物GAPDH-215-F和引物GAPDH-215-R。
10.权利要求5-7中任一所述的方法，和/或，权利要求8所述的试剂或试剂盒，和/或，权利要求9所述的试剂盒在ABI1-TSV-11检测中的应用。
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