CN101988124A - 巣式pcr法扩增egfr基因外显子19片段的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及分子生物学领域，公开了一种用巣式PCR法扩增中EGFR基因外显子19片段的方法。步骤包括：(1)第一轮PCR扩增，以血浆DNA或石蜡切片DNA为模板，扩增25～35个循环，所用的引物为：C19F和C19R；(2)第二轮PCR扩增，以步骤(1)的第一轮PCR扩增产物为模板，扩增25～35个循环，所用的引物为：19F和19R。经过上述方法扩增所得到的DNA片段可满足测序的要求；扩增的产物经过序列分析，判断突变情况。本发明通过第一轮扩增，提高了含有目的片段的模板DNA浓度，可提高EGFR基因外显子19的扩增效率。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，具体为巣式PCR法扩增DNA的技术，尤其是用巣式PCR法扩增中EGFR基因外显子19片段的方法。
背景技术
肿瘤，特别是恶性肿瘤对人类产生的危害日益增大，目前临床上对癌症尚无十分有效的治疗方案。这除了与肿瘤本身的特性有关外，肿瘤诊断学也存在一些不足之处，如肿瘤早期诊断效率低，确诊时已发展到晚期的概率高；另外癌组织活检也极大的增加了病人的痛苦；对于一些缺乏可靠诊断方法的实体瘤，就更不大可能取肿瘤组织进行化验，故急需寻找新型肿瘤标记物以客服实体肿瘤取材困难并指导个性化用药等问题。
循环DNA（circulating DNA）是指存在于血液（血浆或血清）、滑膜液、脑脊液等体液中的细胞外DNA。对其来源，现在还未有一致的定论，但越来越多的研究显示循环DNA来自肿瘤细胞。因此对血浆DNA作为一种新型的肿瘤临床标记物的研究备受关注。
表皮生长因子受体（EGFR）在细胞生理过程中发挥着重要作用。吉非替尼（Gefitinib）是表皮生长因子受体的特异性靶向药物，能够通过抑制EGFR激酶活化及阻断受体下游的信号转导，从而影响肿瘤细胞的生长，吉非替尼已被用于如肺癌、胃癌、乳腺癌等癌症的临床治疗中。2004年6月，美国科学家Lynch和Paez等人发现，并不是所有的病人对该药都达到预期的效果，研究发现该药对EGFR编码区基因突变型肿瘤的治疗有效率可高达80%以上，而对无突变的野生型肿瘤的治疗效果不尽如人意。于是推测在非小细胞癌中表皮生长因子受体EGFR酪氨酸激酶编码区基因突变是吉非替尼凑效的一个重要条件。可见对EGFR基因突变的检测，可以间接实现对一些癌症患者的个性化治疗，是临床治疗达到最优结果。
迄今为止，所发现的EGFR突变多发生于外显子19号和21号，其中外显子19为碱基缺失突变，外显子21为单位点突变。研究者本人前期在对血浆中EGFR基因两个常见突变热点片段进行常规PCR发现，以血浆DNA作模板，由于其中DNA含量少，因此比以血液或肿瘤组织基因组作模板的PCR扩增效率低，若随即进行二次PCR，更容易出现弥散现象，从而总结模板的质量较大程度地制约了PCR的扩增效率。为了能更好的解决这一弊端，本研究采用巢式PCR实现对血浆DNA中EGFR基因外显子19和21的扩增，提高了检测灵敏度和特异性。
发明内容
本发明旨在提供一种利用巣式PCR法扩增EGFR基因外显子19片段的方法。
本发明公开了一种方法，用巢式PCR法实现对血浆DNA、石蜡切片DNA等微量基因组样本中EGFR外显子19的扩增，便于后续突变的检测。
其技术方案为，用巢式PCR法扩增EGFR基因外显子19片段的方法，包括如下步骤：
（1）第一轮PCR扩增，以血浆DNA或石蜡切片DNA为模板，扩增25～35个循环，所用的引物为：
C19F：5'-TATCAGCCTTAGGTGCGG-3'，
C19R：5'-GGATGTGGAGATGAGCAGG-3'；
优选的，每种引物的浓度分别为0.1～1μM；
反应体系中包括：四种脱氧核苷酸，每一种浓度分别为100～400μM；
DNA聚合酶，浓度为；10～100U/ml；
血浆DNA或石蜡切片DNA，浓度为20～100ng/ml；
（2） 第二轮PCR扩增，以步骤（1）的第一轮PCR扩增产物为模板，扩增25～35个循环，所用的引物为：
19F：5'-AACGTCTTCCTTCTCTCTCTGTCA -3'，
19R： 5' -CCACACAGCAAAGCAGAAACT- 3'；
优选的，每种引物的浓度分别为0.1～1μM；
反应体系中包括：四种脱氧核苷酸，每一种浓度分别为100～400μM；
DNA聚合酶，浓度为；10～100U/ml；
第二轮PCR扩增的反应体系中，步骤（1）第一轮PCR扩增产物稀释10～25倍。
上述两轮PCR反应的条件和步骤为： A. 94～96℃预变性3～6min； B. 93～95℃变性20～60s，59～61℃退火20～60s，71～73℃延伸20～60s，25～35个循环；C. 然后71～73℃延伸3～6min。
PCR反应的条件和步骤优选为： A. 94～96℃预变性5min； B. 93～95℃变性30s，59～61℃退火30s，71～73℃延伸30s，25～35个循环；C. 然后71～73℃延伸3～6min。
本发明中EGFR基因外显子的待测模板来源包括血浆DNA或石蜡切片DNA。血浆DNA可用常规技术手段或商品化试剂盒 从外周血的血浆样本中提取。
经过上述方法扩增所得到的DNA片段可满足测序的要求；扩增的产物经过序列分析，判断突变情况。
本发明通过巢式PCR法，提供了一种扩增EGFR基因外显子19的巢式PCR方法；通过第一轮扩增，提高了含有目的片段的模板DNA浓度，以提高EGFR基因外显子19的扩增效率。同时此方法亦可用于其他微量基因组样本中对该片段的PCR扩增，提高检测的特异性。
附图说明
图1为本发明巢式PCR法扩增EGFR基因外显子19的示意图。
具体实施方式
（1）样本处理
取外周血5ml于EDTA抗凝管中，于1h之内，用5000rpm离心3min后取血浆， -80℃保存。
（2）血浆DNA提取
采用Genomic DNA Purification Kit （Ferments, K0512）完成血浆DNA的抽提，具体步骤如下：
A. 取200ul血浆，加入400ul裂解液混匀，65℃水浴20min；
B. 加入600ul三氯甲烷，颠倒试管混匀数次，10000rpm离心2min；
C. 取上清于另一洁净离心管中，加800ul新鲜配置的8×的沉淀液（precipitation solution），颠倒数次，室温放置2min后10000rpm离心2min；
D. 倒去上清，加入100ul 1.2M NaCl，振荡至小团块完全溶解；
E. 加入300ul无水冰乙醇，振荡混匀后，至-20℃放置过夜；
F. 10000rpm离心10min，弃去上清，室温放置10-15min，以确保无乙醇残留；向离心管中加入30ul灭菌的ddH2O（双蒸水），得到血浆DNA，其中DNA模板含量约为150ng/ml，-20℃保存备用。
（3）第一轮PCR扩增
C19F的序列为：5'-TATCAGCCTTAGGTGCGG-3'，
C19R的序列为：5'-GGATGTGGAGATGAGCAGG-3'；
反应体系以血浆DNA为模板，C19F和C19R为引物，采用2×PCR扩增MIX（上海捷瑞生物工程有限公司，GK8002），加入引物、血浆DNA和无菌水；
第一轮反应体系：
2×PCR扩增MIX 10ul
C19F（10μM） 0.5 ul
C19R（10μM） 0.5 ul
血浆DNA（150ng/ml） 5ul
无菌水 4ul
总反应体系20ul
总反应体系中，DNA聚合酶的浓度为50U/ml，每种脱氧核苷酸的浓度分别为200μM。
第一轮PCR扩增的条件和步骤为：A. 95℃预变性5min； B. 94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延30s，30个循环；C. 72℃延伸5min；得到第一轮PCR扩增产物。如图1所示。
（4） 第二轮PCR扩增
19F的序列为：5' -AACGTCTTCCTTCTCTCTCTGTCA -3'
19R的序列为 ： 5' -CCACACAGCAAAGCAGAAACT -3'
如图1所示，反应体系以第一轮PCR扩增产物为模板， 21F和21R为引物，采用2×PCR扩增MIX（上海捷瑞生物工程有限公司，GK8002），加入引物、第一轮PCR产物和无菌水；
第二轮反应体系：
2×PCR扩增MIX 10 ul
19F（10μM） 0.5 ul
19R（10μM） 0.5 ul
第一轮PCR扩增产物 1ul
无菌水 8 ul
总体系20ul
总反应体系中， DNA聚合酶的浓度为50U/ml，每种脱氧核苷酸的浓度为200μM。
第二轮PCR扩增的条件和步骤为：A. 95℃预变性5min；B. 94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延30s，30个循环；C. 72℃延伸5min；以等量灭菌水为模板进行阴性对照。
（5）电泳检测
配0.1%琼脂糖凝胶，取7ul步骤（4）所得到PCR产物与2ul 40%蔗糖溶液混匀后上样，130V电泳20min，紫外检测判断PCR结果。其中EGFR基因外显子19片段第二轮PCR产物片段大小为150bp。
（6）送样测序，分析结果
经电泳确认有目的条带后，取10ulPCR产物送至专业测序公司进行检测，以19F作为测序引物，查看测序峰图，判别突变情况。
Claims (4)
1.巣式PCR法扩增EGFR基因外显子19片段的方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）第一轮PCR扩增，以血浆DNA或石蜡切片DNA为模板，扩增25～35个循环，所用的引物为：
C19F：5'-TATCAGCCTTAGGTGCGG-3'，
C19R：5'-GGATGTGGAGATGAGCAGG-3'；
（2） 第二轮PCR扩增，以步骤（1）的第一轮PCR扩增产物为模板，扩增25～35个循环，所用的引物为：
19F：5'-AACGTCTTCCTTCTCTCTCTGTCA -3'，
19R： 5' -CCACACAGCAAAGCAGAAACT- 3'；
且上述步骤（1）和（2）中，两轮PCR扩增的反应条件和步骤为：A. 94～96℃预变性3～6min； B. 93～95℃变性20～40s，59～61℃退火20～40s，71～73℃延伸20～40s，25～35个循环；C. 然后71～73℃延伸3～6min。
2.权利要求1所述巣式PCR法扩增EGFR基因外显子19片段的方法，其特征在于，所述的PCR扩增的反应条件和步骤为：A. 94～96℃预变性5min； B. 93～95℃变性30s，59～61℃退火30s，71～73℃延伸30s，25～35个循环；C. 然后71～73℃延伸5min。
3.权利要求1所述巣式PCR法扩增EGFR基因外显子19片段的方法，其特征在于，步骤（1）中每种引物的浓度分别为0.1～1μM；血浆DNA或石蜡切片DNA的浓度为20～100ng/ml；
反应体系中还包括：
四种脱氧核苷酸，每一种浓度分别为100～400μM；
DNA聚合酶，浓度为；10～100U/ml。
4.权利要求1所述巣式PCR法扩增EGFR基因外显子19片段的方法，其特征在于，步骤（2）中每种引物的浓度分别为0.1～1μM；将步骤（1）第一轮PCR扩增产物稀释10～25倍；
反应体系中还包括：
四种脱氧核苷酸，每一种浓度分别为100～400μM；
DNA聚合酶，浓度为；10～100U/ml。
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