CN103848888A

CN103848888A - 一种人补体C1q/TNFα相关蛋白-2（hCTRP2）的抗原肽及其抗体

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Publication number: CN103848888A
Application number: CN201310176122.1A
Authority: CN
Inventors: 李洪波; 吴东海; 胡兴
Original assignee: Huaihua University
Current assignee: Huaihua University
Priority date: 2012-12-04
Filing date: 2013-05-14
Publication date: 2014-06-11
Anticipated expiration: 2033-05-14
Also published as: CN103848888B

Abstract

本发明公开了一种人补体C1q/TNFα相关蛋白-2（hCTRP2）的抗原肽及其抗体，主要包括以下步骤：合成C1q/TNFα相关蛋白-2的N-端及C-端抗原肽各一段，将抗原肽分别与牛血清白蛋白（BSA）和钥孔血蓝蛋白（KLH）进行化学耦联；将KLH耦联的抗原肽免疫大白兔，制备抗血清；将BSA耦联的抗原肽包被酶联免疫吸附剂测定（ELISA）板，测定抗血清的效价；将效价最高的C-端抗原肽免疫所得抗血清用硫酸铵分级沉淀，初步纯化抗血清；制备与溴化氰活化树脂耦联的耦联BSA的C-端抗原肽亲合纯化层析柱，对经初步纯化的抗血清进行亲合纯化；以全长或球状人补体C1q/TNFα相关蛋白-2为检测对象，对纯化抗体的特异性进行分析，结果表明上述方法制备的抗体具有很高的灵敏度和特异性（如摘要附图所示）。

Description

一种人补体C1q/TNFα相关蛋白-2(hCTRP2)的抗原肽及其抗体

技术领域

本发明涉及应用化学合成法合成人补体C1q/TNFα相关蛋白-2的抗原肽，并利用该抗原肽免疫新西兰大白兔，通过制备抗血清、硫酸铵分级沉淀及亲合层析制备了高质量的抗体。具体来说涉及一种人补体C1q/TNFα相关蛋白-2的抗原肽、利用抗原肽制备的抗体及其抗体的制备方法。

背景技术

补体C1q/TNFα相关蛋白（C1q and tumor necrosis factor related protein，CTRP）是一类在结构和功能上与脂联素类似的分泌蛋白。CTRP在多种组织中有着广泛的表达，而脂联素仅在脂肪组织特异表达，CTRP由四个不同结构域组成：一个N-末端的信号肽、一个短的可变结构域、一个胶原结构域和一个与补体蛋白C1q同源的C-末端球形结构域。目前，已成功克隆了13种CTRP的cDNA序列。虽然CTRP在结构上具有相似性，但它们分别参与不同的生理过程，如代谢、炎症反应、宿主防御、凋亡、细胞分化、器官形成、自体免疫和冬眠等。CTRP蛋白都是以三聚体作为分泌的基本结构单元，也可以形成6聚体、12聚体、18聚体以及更高形式的多聚体等；CTRP3、CTRP5、CTRP6和CTRP10的三聚体通过二硫键进一步聚集成更有序的低聚物。CTRP除了形成同源低聚物，还可以作为异源低聚体分泌（如CTRP1/CTRP6、CTRP2/CTRP7和脂联素/CTRP2等）。

CTRP2的生物学功能及结构与脂联素最为相似。在C2C12肌管细胞中，CTRP2能够快速激活AMPK、ACC及p44/42 MAPK的磷酸化信号通路。全长CTRP2、CTRP2球状结构域（gCTRP2）或者原核表达的脂联素刺激C2C12肌管细胞16 h，可以观察到肝糖原的积累量上升了6-8倍，CTRP2也能够显著促进脂肪酸的氧化。Wong等认为，CTRP2可以作为一种潜在的胰岛素增敏剂。CTRP2在人、鼠、大鼠、牛、猪和斑马鱼等物种中都有非常高的保守性。

脂联素通过与脂联素膜受体相互作用并由脂联素受体来传递相关信号的，作为一种较脂联素具有更多功能的CTRP蛋白，其作用机理研究还不清楚。首先对与脂联素结构最为类似的CTRP2作用机理、表达分布和生理功能的探索将有助于研究其他CTRP作用机理和生理功能。然而，由于CTRP蛋白之间存在高度同源性，并且CTRP与其它蛋白如脂联素、TNF等蛋白之间也存在同源，找到CTRP2的特异抗原肽片段并制备高度特异性的相应抗体为深入开展CTRP2的作用机理及应用研究奠定坚实基础。

发明内容

基于此，本发明提供一种人补体C1q/TNFα相关蛋白-2的抗原肽、利用抗原肽制备的抗体及其抗体的制备方法，根据该方法可获得高质量的识别人CTRP2抗体。

解决上述问题的技术方案如下：

（1）抗原肽的合成：经NCBI数据库比对和抗原肽分析软件的分析结果，设计并合成了hCTRP2的N-端抗原肽₅₉DRGDSGEEGPP₆₉和C-端抗原肽₂₅₉IYADQDDPNE₂₆₉各一段，抗原肽分别与KLH和BSA进行化学耦联；

（2）免疫新西兰大白兔：将KLH耦联的C-端及N-端抗原肽2毫升（0.5-1.0 mg/ml）分别与等体积的弗氏完全佐剂混合到完全乳化，采用皮下注射的方式对新西兰雄性大白兔进行免疫，皮下注射部位主要集中于兔子的颈、脖及背部，共注射15-18个点左右（每个点注射100-200 μl乳化抗原）。每只兔子于免疫前从耳静脉取1-2毫升血液，37°C培养箱中温育30 min，再置4°C冰箱内过夜，3000 g离心15 min，取血清并加入终浓度为0.02%叠氮钠，置4°C冰箱中保存备用。初次免疫后的第3周，对各免疫的兔子进行再次免疫，再次免疫采用不完全弗氏佐与抗原肽充分完全乳化（每只兔子使用抗原肽0.5 mg）；间隔2周后进行第2次免疫加强免疫（每只兔子使用抗原肽 0.5 mg），第2次加强免疫的方法与第一次加强免疫完全相同，于第2次加强免疫的后的第10天，从免疫兔子的耳静脉采血1-2 ml。采血及制备抗血清的方法与免疫前采用的方法完全相同；

（3）抗血清效价的测定：将10 μg/ml BSA耦联的抗原肽包被96孔酶标板，采用间接ELISA的方法对抗血清的效价进行测定，方法如下：1）包被：用0.05 M pH 9.6碳酸盐包被缓冲液将抗原稀释至蛋白质浓度为10 μg/mL。每个反应孔中加0.1 mL，4℃孵育12 h。弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液（磷酸盐缓冲液加0.5% 吐温-20，PBST）洗3次，每次3-5 min（简称洗涤，下同）；2）封闭：每孔中加0.1 mL 5%的脱脂奶粉，4℃孵育12 h，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3 min。（同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔）；3）加一抗：加经一定比例稀释的抗体0.1 mL于上述已包被抗原的反应孔中，置4 ℃孵育12 h。然后用洗涤缓冲液洗3次，每次3-5 min（同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔）；4）加酶标二抗：于各反应孔中，加入稀释5,000倍的辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG酶标二抗0.1 mL。37 ℃孵育1 h，洗涤3次，最后一遍用PBS洗涤；5）加底物液显色：于各反应孔中加入0.1 mL新配制的显色液，放置于30 ℃恒温箱中反应30 min；6）终止反应：于各反应孔中加入4 M硫酸50 μl终止反应；7）结果判定：在ELISA检测仪上，于495 nm处，测定各孔的OD值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。计算公式：（待测样OD-空白OD）/（阴性对照OD-空白OD），两者比值大于2.1可判读为阳性；（4）抗血清的硫酸铵分级纯化：将血清效价高和背景值低的C-端抗原肽免疫所得的抗血清分别利用50%和33%的硫酸铵进行分级沉淀和透析处理，对抗血清按下述方法进行初步的分离纯化。纯化的方法：取效价最高的兔抗血清，加等体积的生理盐水，搅拌并逐滴加入与稀释血清等体积的饱和硫酸铵至终浓度为50%饱和度，4°C静置4 h，3000 g离心30 min，弃上清，以生理盐水溶解沉淀，再逐滴加饱和硫酸铵至饱和度为33%，4°C静置4 h。 3000 g离心30 min，弃上清，沉淀溶于生理盐水中。重复用33%饱和度的硫酸铵盐析分级纯化处理一次，将最后离心所得沉淀以20 mM PBS（磷酸盐缓冲液液，pH 7.4)溶解并于10 kD的透析袋中于20 mM PBS中透析去除硫酸铵；

（5）抗体的亲合纯化：将经溴化氰活化的树脂与耦联有BSA的hCTRP2的C-端抗原肽进行耦联并制备亲合纯化柱，利用10倍柱体积的20 mM PBS（pH 7.4)缓冲液对亲合纯化柱进行平衡处理。将经透析去除硫酸铵的抗血清加入到亲合纯化柱中，20倍柱床体积的20 mM PBS（pH 7.4)洗除非特异吸附在树脂上的抗体后，加入3倍亲合树脂柱体积的0.1 M甘氨酸-HCl缓冲液(pH 2.4)，流速1 ml/min，收集解吸附下来的成分，立即以1 M NaHCO₃中和。用20倍柱床体积的20 mM PBS（pH 7.4)缓冲液对纯化柱再平衡，加入3倍亲合树脂体积的0．05 M二乙胺 (pH 11) 缓冲液，流速1 ml/min，收集解吸附下来的成分，立即以1 M NaHCO₃中和。将上述分别利用酸、碱洗脱下来的含纯化抗体的溶液合并，于10 kDa的透析袋中于100倍体积的20 mM PBS中透析24小时，每8小时更换透析液一次。透析后的抗体利用截留分子量为10 kDa 的50 ml超滤管浓缩10倍。纯化前后的抗体用10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳分析；

（6）hCTRP2全长及球状区蛋白的表达载体构建：利用扩增hCTRP2全长基因的引物对5’-GCCTCGAGAAAAGAGACCCACTGCTTGGCGC-3’ 和5’-GCTCTAGATACCTCGTT GGGGTCATC-3’，扩增出hCTRP2的全长基因片段，利用扩增hCTRP2球状区基因引物对5’-GCGGATCCGTGGCAGTGACCAAGAGCTAC-3’和5’-GCCTCGAGTCAGATTAGG AAGCCCGTAAAG-3’扩增出C-端球状区基因片段；

（7）hCTRP2全长及球状区蛋白的表达：挑取数个BL21阳性克隆转化子，划线接种至含70 mg/L Amp（氨苄青霉素）的LB平板，37 ℃培养过夜，再挑取单菌落接种至20 mL含70 mg/L Amp的LB液体培养基中，37 ℃，250 rpm，摇床振荡培养至OD₆₀₀=0.6，加入IPTG至终浓度为1 mM，将摇床转速调至200 rpm，37 ℃诱导表达，诱导6 h，取1 mL菌液于1.5 mL EP管中，10,000 g，离心3 min，得菌体，PBS充分重悬菌体，10,000 g，离心3 min，得菌体，加入80 μl裂解缓冲溶液，裂解菌体，再加入20 μl SDS-PAGE 5×上样缓冲液，振荡混匀，沸水中加热裂解变性10 min，14,000 g，4 ℃离心10 min，取上层液，利用12% SDS-PAGE对菌体总蛋白进行电泳分离，电泳结束后利用考马斯亮蓝对凝胶进行染色（具体步骤参照精编分子生物学指南），确定hCTRP2全长及球状功能区蛋白的表达情况；

（8）抗体特异性分析：将制备好的hCTRP2全长及球状区蛋白表达菌经IPTG诱导后的菌体总蛋白样品点样到12%的SDS-PAGE胶中，对蛋白质进行电泳分离，在电泳结束后，将凝胶从玻璃板上轻轻剥离并转至转移缓冲液中，浸泡40-60 min；按转移凝胶的大小裁剪好滤纸和聚偏氟乙烯(PVDF)膜，滤纸各边应比PVDF膜长2 mm，PVDF膜的各边应比PAGE胶的各边长2 mm；将PVDF膜用100%甲醇浸泡30 s，将PVDF膜及滤纸一并浸入转移缓冲液中，平衡15 min；将胶、滤纸及PVDF膜取出，尽量避免污染滤纸和膜，按从下到上：滤纸-膜-胶-滤纸的顺序将其依次放好，尽量避免胶与膜之间产生气泡；打开半干转移仪，将滤纸-膜-胶-滤纸放入转移盘中，盖好电源盖子；接通电源，83 mm×75 mm大小的膜设定电流100 mA，电压15 V；实际设定中电压15 V不变，按60 mm² 设1 mA的初始电流，设定转膜时间为1 h；转移完毕后，将PVDF转移至含5%牛血清白蛋白的TBST中，4℃，封闭12 h；封闭结束后，加入稀释2万倍的抗体到PVDF膜中，4℃，孵育12 h，利用TBST洗膜3次，每次15分钟；将膜转至含有HRP标记的山羊抗兔IgG中，4℃，孵育12 h，利用TBST洗膜3次，每次15分钟；将膜置于一小盒中，加入适量的ECL发光液，反应2分钟，将膜置于暗盒中并于暗室下将X-光片压在膜上；将X-光片利用显影液进行显影和定影处理后，于空气中干燥并拍照分析。

在其中一些实施例中，步骤（1）所述的抗原肽序列为：

hCTRP2的N-端抗原肽是₅₉DRGDSGEEGPP₆₉

hCTRP2的C-端抗原肽是₂₅₉IYADQDDPNE₂₆₉。

根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于，步骤（5）所述的扩增hCTRP2全长及C-端球状区的引物分别如下：

扩增hCTRP2全长基因的引物对是：

上游引物5’-GCCTCGAGAAAAGAGACCCACTGCTTGGCGC-3’和下游引物 5’-GCTCTAGATAC CTCGTTGGGGTCATC-3’；

扩增hCTRP2球状区基因的引物对是：

上游引物5’-GCGGATCCGTGGCAGTGACCAAGAGCTAC-3’和下游引物5’-GCCTCGA GTCAGA TTAGGAAGCCCGTAAAG-3’。

根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于，步骤（6）所述的表达菌株为大肠杆菌BL21。根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于，以IPTG诱导可以表达hCTRP2全长和C-端球状区蛋白的大肠杆菌表达菌的菌体总蛋白为检测对象，利用Western blot对纯化的抗体的特异性进行分析，Western blot结果表明，通过上述方法制备的抗体具有很高的灵敏度和特异性。根据权利要求1-5任一项所述的生产方法制得的抗原肽、抗体、hCTRP2的全长及球状区蛋白。

本方法制备的抗体具有灵敏度高和特异性强的优点，抗体在经2万倍的释稀后仍能高效地检测到目标蛋白，但没有检测到目标蛋白外的非特异蛋白条带。利用本方法制备的hCTRP2的抗体完全能够满足检测hCTRP2蛋白的要求。

附图说明

图1是抗血清效价的测定图；图2是抗体纯化结果的SDS-PAGE分析图；图3是载体构建示意图；图4是hCTRP2全长及球状区蛋白的诱导表达结果分析图；图5是纯化抗体的Western blot 检测结果，此图也是抗体特异性验证的结果图。

具体实施方式

实施例1

本发明选用的大肠杆菌表达菌株 BL21、载体扩增菌株TOP10和表达载体pET32 均购自于美国Invritrogen公司。

所用培养基及主要试剂的配方如下：

1）LB液体培养基：NaCl 10 g，蛋白胨10 g，酵母提取物 5 g，蒸馏水1 L，高压灭菌，室温保存；

2）LB/Amp平板：NaCl 10 g，蛋白胨10 g，酵母提取物 5 g，蒸馏水1 L，琼脂粉15 g，高压灭菌后，冷却至70℃以下，加入0.7 mL浓度为100 mg/ml的氨苄青霉素（Ampicillin），充分混均后倒板，4℃避光保存；

3）50× TAE琼脂糖凝胶电泳缓冲液：Tris碱121 g，冰乙酸28.6 mL，0.5 mol/L EDTA （pH 8.0) 50 mL，加蒸馏水定容至500 mL，室温保存；

4）100 mg/mL氨苄青霉素保存液：氨苄青霉素1 g，加蒸馏水溶解并定容至10 mL，分装后于-20 ℃保存；

5）5×SDS-PAGE上样缓冲液：1 M Tris-HCl （pH 6.8) 1.25 mL，SDS 0.5 g，BPB 25 mg，甘油 2.5 mL，加去离子水溶解后定容至5 mL，分装（约500 μL每份）后于室温保存，使用每份加入25 μL β-巯基乙醇混匀；

6）5×SDS-PAGE电泳缓冲液：Tris 15.1 g，甘氨酸 94 g，SDS 5.0 g，加入约800 mL去离子水，充分搅拌溶解后定容至1 L，室温保存；

7）考马斯亮蓝R-250染色液：考马斯亮蓝R-250 0.25g，加入225 mL甲醇、46 mL的冰乙酸、225 mL去离子水并搅拌均匀，滤纸去除颗粒物质后，室温保存；

8）考马斯亮蓝脱色液：冰乙酸 50 mL，甲醇 150 mL，去离子水300 mL，充分混合后，室温保存；

9）PBS的配制：在800 mL蒸馏水中溶解8 g NaCL，0.2 g KCL，1.44 g 磷酸氢二钠和 0.24 g 磷酸二氢钾，用盐酸调节溶液的pH值至7.4，加水定容至1 L。

本实施例所述的一种人补体C1q/TNFα相关蛋白-2（hCTRP2）的抗原肽及其抗体的制备方法，主要包括以下步骤：

（1）抗原肽的合成：经NCBI数据库比对和抗原肽分析软件的分析结果，设计并合成了hCTRP2的N-端和C-端抗原肽各一段，合成的抗原肽序列如下：

SEQ ID NO:5：

hCTRP2的N-端抗原肽是₅₉DRGDSGEEGPP₆₉；

SEQ ID NO:6：

hCTRP2的C-端抗原肽是₂₅₉IYADQDDPNE₂₆₉。合成的抗原肽分别与KLH和BSA进行化学耦联；

（2）免疫新西兰大白兔：将KLH耦联的C-端及N－端抗原肽分别与弗氏完全佐剂混合到完全乳化，采用皮下注射的方式对新西兰雄性大白兔进行初次免疫，初次免疫使用的抗原肽质量在0.5-1.0 mg之间，皮下注射部位主要集中于兔子的劲、脖及背部，共注射15-18个点左右，于注射前从耳静脉取1-2毫升血液，37°C培养箱中温育30 min，再置4冰箱内过夜，3000 g离心15 min，取血清并加入终浓度为0.02%叠氮钠，置4冰箱中保存备用。初次免疫后的第2周，对各免疫的兔子进行加强免疫，加强免疫采用不完全弗氏佐与抗原充分完全乳化（每只兔子使用抗原0.5 mg）；间隔2周后进行第2次加强免疫（每只兔子使用抗原肽 0.5 mg），第2次加强免疫的方法与第一次加强免疫完全相同，于第2次加强免疫的后的第10天，从耳静脉采血1-2 ml。采血及制备抗血清的方法与免疫前采用的采血及抗血清制备的方法完全相同；

（3）抗血清效价的测定：将10 μg/ml BSA耦联的抗原肽包被96孔酶标板，采用间接ELISA对抗血清的效价进行测定，方法如下：1）包被：用0.05 M pH 9.6碳酸盐包被缓冲液将抗原稀释至蛋白质浓度为10 μg/mL。每个反应孔中加0.1 mL，4℃孵育12 h。弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液（PBST）洗3次，每次3-5 min（简称洗涤，下同）；2）封闭：每孔中加0.1 mL 5%的脱脂奶粉，4℃孵育12 h，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3 min。（同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔）；3）加一抗：加经一定比例稀释的抗体0.1 mL于上述已包被抗原的反应孔中，置4 ℃孵育12 h。然后用洗涤缓冲液洗3次，每次3-5 min（同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔）；4）加酶标二抗：于各反应孔中，加入稀释5,000倍的辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG酶标二抗0.1 mL。37 ℃孵育1 h，洗涤3次，最后一遍用PBS洗涤；5）加底物液显色：于各反应孔中加入0.1 mL新配制的显色液，放置于30 ℃恒温箱中反应30 min；6）终止反应：于各反应孔中加入4 M硫酸50 μl,终止反应；7）结果判定：于495 nm处，测定各孔的OD值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。计算公式：（待测样OD-空白OD）/（阴性对照OD-空白OD），两者比值大于2.1可判读为阳性。经ELISA检测结果表明，N-端抗原肽免疫兔子所得抗血清的效价高于320,000倍，但N-端抗原肽在稀释较低倍数时表现出了较高的背景值（如图1所示）；C-端抗原肽免疫兔子所得的抗血清的效价都高于1,280,000倍，且C-端抗原肽在稀释较低倍数时背景值也非常低（如图1所示）；ELISA结果表明，C-端抗原肽较N-端抗原肽具有更高的特异性和免疫原性，利用C-端抗原肽免疫兔子制备的抗血清具有更高的效价和特异性；

（4）抗血清的初步纯化：将血清效价高和背景值低的C-端抗原肽免疫所得的抗血清分别利用50%和33%的硫酸铵进行分级沉淀和透析处理，对抗血清进行初步的分离纯化；纯化的方法如下：取效价最高的兔抗血清，加等量生理盐水，搅拌并逐滴加入与稀释血清等量的饱和硫铵至终浓度为50%饱和度，4°C静置4 h，3000 g离心30 min，弃上清，以生理盐水溶解沉淀，再逐滴加饱和硫铵至饱和度为33%，4°C静置4 h。 3000 g离心30 min，弃上清，沉淀溶于生理盐水中。重复用33%饱和度的硫铵盐析处理，将最后离心所得沉淀以20 mM PBS（pH 7.4)溶解并于10kD的透析袋中于20 mM PBS中透析去除硫铵；

（5）抗体的亲合纯化：将经溴化氰活化的树脂与耦联有BSA的hCTRP2的C-端抗原肽进行耦联并制备亲合纯化柱，利用10倍柱体积的20 mM PBS（pH 7.4)缓冲液对亲合纯化柱进行平衡处理。将经透析去除硫铵的抗血清加入到亲合纯化柱中，20倍柱床体积的20 mM PBS（pH 7.4)洗除非特异吸附在树脂上的抗体后，加入3倍亲合树脂体积的0.1 M甘氨酸-HCl缓冲液(pH 2.4)，流速1 ml/min，收集解吸附下来的成分，立即以1 M NaHCO₃中和。用20倍柱床体积的20 mM PBS（pH 7.4)缓冲液对纯化柱再平衡，加入3倍亲合树脂体积的0．05 M二乙胺 (pH 11) 缓冲液，流速1 ml/min，收集解吸附下来的成分，立即以1 M NaHCO₃中和。将上述分别利用酸、碱洗脱下来的含纯化抗体的溶液合并，于10 kDa的透析袋中于100倍体积的20 mM PBS中透析24小时，每8小时更换透析液一次。透析后的抗体利用截留分子量为10 kDa 50 ml超滤管浓缩10倍。SDS-PAGE对纯化前后的抗体进行电泳分析，电泳结果表明，经硫铵分级沉淀后，可以除去抗体中的部分非免疫球蛋白成分，但仍有一些杂蛋白的存在，而在经亲合层析后，在SDS-PAGE结果中几乎检测不到分子量在50 kDa外的非免疫球蛋白成分（结果如图2所示）；

（6）hCTRP2全长及球状区蛋白的表达载体的构建：

利用扩增hCTRP2全长基因的引物对：

SEQ ID NO:1：

5’-GCCTC GAGAAAAGAGACCCACTGCTTGGCGC-3’ ；

和SEQ ID NO:2：

5’-GCTCTAGATACCTCGTTGGGGTCATC-3’。

扩增出hCTRP2的全长基因片段

利用扩增hCTRP2球状区基因的引物对：

SEQ ID NO:3：

5’-GCGGATCCGTGGCAGTGACCAAG AG CTAC-3’；

和SEQ ID NO:4：

5’-GCCTCGAGTCAGATTAGGAAGCCCGTAAAG-3’。

扩增出C-端球状区基因片段；

① 用BamHI和XhoI双酶切PCR产物经电泳后切胶回收目标片段，获得目的片断hCTRP2的全长及球状区DNA片段，反应体系如下（所用内切酶及缓冲液均购自大连TAKARA公司）：

PCR产物 15 μL

10×K 缓冲液 5 μL

XhoI 5 U

BamH

5 U

无菌水至50 μL

② 用BamHI和XhoI双酶切pET32，获得载体片断，反应体系如下（所用内切酶及缓冲液均购自大连TAKARA公司）：

质粒pET32 15 μL

10×K 缓冲液 5 μL

XhoI 5 U

BamH

5 U

无菌水至50 μL

③ 由①及②步后所得目的片断和载体片断，DNA凝胶收回试剂盒回收，该试剂盒购自大连TAKARA公司，具体操作按试剂盒说明书进行；表达载体的构建示意图见图3所示。

④ 回收得到的目的片断和载体用T4DNA连接酶（购自大连TAKARA公司）进行连接反应，反应体系如下：

质粒pET32 片段 1 μL

目的片段落 3 μL

10×缓冲液 1 μL

T4 DNA连接酶 0.5 μL

无菌水至10 μL

连接产物转化大肠杆菌TOP10菌株，涂布LB氨苄平板，挑取平板上生长的转化子，于LB氨苄液体培养基中扩大培养后提取质粒，对质粒进行酶切和测序验证，得重组表达载体pET32/hCTRP2和pET32/ghCTRP2。

将重组表达载体pET32/hCTRP2和pET32/ghCTRP2。分别热激转化大肠杆菌BL21感受态细胞，涂板，37℃ 恒温培养箱中培养12小时，于LB Amp抗性平板筛选得到重组载体的BL21转化子。

（7）hCTRP2全长及球状区蛋白的表达：挑取数个BL21转化子，划线接种至含70 mg/L Amp的LB平板，37 ℃培养过夜，再挑取单菌落接种至20 mL含70 mg/L Amp的LB液体培养基中，37 ℃，250 rpm，摇床振荡培养至OD₆₀₀=0.6；加入IPTG至终浓度为1 mM，将摇床转速调至200 rpm，37 ℃诱导表达，诱导6 h；取1 mL菌液于1.5 mL EP管中，10,000 g，离心3 min，得菌体；PBS充分重悬菌体，加入20 μl SDS-PAGE 5×上样缓冲液，振荡混匀，沸水中加热裂解变性10 min，14,000 g，4 ℃离心10 min，取上清液；利用12% SDS-PAGE对蛋白质进行电泳分离，电泳结束后，利考马斯亮蓝对凝胶进行染色（具体步骤参照精编分子生物学指南），确定hCTRP2全长及球状功能区蛋白的表达；hCTRP2蛋白理论分子量约为30 kDa，其N端融合了Trx片段，Trx的理论分子量约为20 kDa，hCTRP2与Trx融合蛋白的表达产物理论分子量大小约50 kDa（目标蛋白质的分子量在45-55 kDa之间），SDS-PAGE结果表明，IPTG诱导1小时，Trx-hCTRP2已经大量表达，当诱导表达的时间超过2小时，Trx-hCTRP2蛋白的表达不再显著增加（结果如图4左侧部分所示）。hCTRP2球状区蛋白的理论分子量约为15 kDa，其N端融合了Trx片段，Trx的理论分子量约为20 kDa，hCTRP2与Trx融合蛋白的表达产物理论分子量大小约35kDa，SDS-PAGE结果表明，IPTG诱导1小时，Trx-ghCTRP2开始大量表达（结果如图4右侧部分所示）。

（8）抗体特异性分析：将制备好的hCTRP2及ghCTRP2表达菌的经IPTG诱导的菌体总蛋白样品点样到12%的SDS-PAGE胶中，对蛋白质进行电泳分离，在电泳结束后，将凝胶从玻璃板上轻轻剥离并转至转移缓冲液中，浸泡40-60 min；按转移凝胶的大小裁剪好滤纸和PVDF膜，滤纸各边应比PVDF膜长2 mm，PVDF膜的各边应比PAGE胶的各边长2 mm；将PVDF膜用100%甲醇浸泡30 s，将PVDF膜及滤纸一并浸入转移缓冲液中，平衡15 min；将胶、滤纸及PVDF膜取出，尽量避免污染滤纸和膜，按从下到上：滤纸-膜-胶-滤纸的顺序将其依次放好，尽量避免胶与膜之间产生气泡；打开半干转移仪，将滤纸-膜-胶-滤纸放入转移盘中，盖好电源盖子；接通电源，83 mm×75 mm大小的膜设定电流100 mA，电压15 V；实际设定中电压15 V不变，按60 mm² 设1 mA的初始电流，设定转膜时间为1 h；转移完毕后，将PVDF膜转移至含5%牛血清白蛋白的TBST中，4℃，封闭12 h；封闭结束后，加入稀释2万倍的抗体到PVDF膜中，4℃，孵育12 h，利用TBST洗膜3次，每次15分钟；将膜转至含有HRP标记的山羊抗兔IgG中，4℃，孵育12 h，利用TBST洗膜3次，每次15分钟；将膜置于一小盒中，加入适量的ECL发光液，反应2分钟，将膜置于暗盒内并于暗室中将X-光片压在膜上；将X-光片进行显影和定影处理，X-光片于空气中干燥并拍照分析。WB结果都表明，仅在全长hCTRP2表达菌的菌体总蛋白的约50 kDa和球状hCTRP2表达菌的菌体总蛋白的约35 kDa处检测到了特异条带，说明制备的抗体具有很高的特异性和灵敏度（结果如图5所示）。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 怀化学院

<120> 一种人补体C1q/TNFα相关蛋白-2（hCTRP2）的抗原肽及其抗体

<130> 2013

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gcctcgagaa aagagaccca ctgcttggcg c 31

<210> 2

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gctctagata cctcgttggg gtcatc 26

<210> 3

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gcggatccgt ggcagtgacc aagagctac 29

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gcctcgagtc agattaggaa gcccgtaaag 30

<210> 5

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 5

Asp Arg Gly Asp Ser Gly Glu Glu Gly Pro Pro

1 5 10

<210> 6

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 6

Ile Tyr Ala Asp Gln Asp Asp Pro Asn Glu

1 5 10

Claims

1.一种人补体C1q/TNFα相关蛋白-2（hCTRP2）的抗原肽及其抗体，其特征在于，主要包括以下步骤：（1）抗原肽的合成：经NCBI数据库和抗原肽分析软件的分析结果，合成了hCTRP2的N-端抗原肽一段，其氨基酸序列是₅₉DRGDSGEEGPP₆₉和C-端抗原肽一段，其氨基酸序列是₂₅₉IYADQDDPNE₂₆₉，合成的抗原肽分别与KLH和BSA进行化学耦联；（2）将KLH耦联的C-端及N-端抗原肽分别与弗氏完全佐剂混合至完全乳化，将乳化的抗原免疫新西兰雄性大白兔，在初次免疫结束后的第3周对经免疫的兔子进行加强免疫，共进行2次加强免疫；于第2次加强免疫后的第2周取免疫大白兔耳静脉血，并制备血清；（3）将BSA耦联的C-端及N-端抗原肽分别包被96孔酶联免疫吸附剂测定（ELISA）板，测定抗血清的效价，将血清效价高和背景值低的C-端抗原肽免疫所得的抗血清分别利用50%和33%的硫酸铵进行分级沉淀和透析处理，对抗血清进行初步分离纯化；（4）将BSA耦联的C-端抗原肽与溴化氰活化的树脂再度耦联，制备亲合纯化层析柱，利用上述亲合纯化柱对经初步纯化的抗血清进行再次纯化；（5）利用扩增hCTRP2全长基因引物对5’-GCCTCGAGAAA AGAGACCCACTGCTTGGCGC-3’和5’-GCTCTAGATACCTCGTTGGGGTCATC-3’，扩增出hCTRP2的全长基因片段；利用扩增hCTRP2球状区基因的引物对5’-GCGGATCCGT GGCAGTGACCAAGAGCTAC-3’和5’-GCCTCGAGTCAGATTAGGAAGCCCGTAAAG-3’扩增出C-端球状区基因片段；（6）将表达载体pET32分别与hCTRP2的全长和球状区基因片段进行酶切、连接并转化大肠杆菌TOP10，重组质粒经测序分析，测序正确的质粒转化大肠杆菌表达菌BL21；（7）以经IPTG诱导可以表达hCTRP2全长和C-端球状功能区蛋白的大肠杆菌表达菌菌体总蛋白为检测对象，对纯化抗体的特异性进行分析，蛋白质印迹（Western blot）结果表明，通过上述方法制备的抗体具有很高的灵敏度和特异性。

2.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于，步骤（1）所述的抗原肽是hCTRP2的N-端抗原肽₅₉DRGDSGEEGPP₆₉和hCTRP2的C-端抗原肽₂₅₉IYADQDDPNE₂₆₉。

3.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于，步骤（5）所述的扩增hCTRP2全长及C-端球状区的引物分别是：扩增hCTRP2全长基因的引物对5’-GCCTCGAGAAAAGAGAC CCACTGCTTGGCGC-3’和5’-GCTCTAGATACCTCGTTGGGGTCATC-3’，扩增hCTRP2球状区基因的引物对5’-GCGGATCCGTGGCAGTGACCAAGAGCTAC-3’和5’-GCCTCGAGT CAGATTAGGAAGCC CGTAAAG-3’。

4.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于，步骤（6）所述的表达菌株为大肠杆菌BL21。

5.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于，以IPTG诱导可以表达hCTRP2全长和C-端球状区蛋白的大肠杆菌表达菌株的菌体总蛋白为检测对象，对纯化抗体的特异性进行分析，分析结果显示通过该方法制备的抗体具有很高的特异性和灵敏度。

6.根据权利要求1-5任一项所述的生产方法制得的抗原肽、抗体、hCTRP2的全长及球状区蛋白。