CN106636005B - 杂交瘤细胞株xa272-919、抗体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及杂交瘤细胞株XA272‑919、抗体及其应用。所涉及的杂交瘤细胞株,的保藏编号为CCTCC NO:C2016111。所涉及的抗体为本发明的杂交瘤细胞株分泌的抗体。所涉及的应用为本发明的抗体用于检测人CTRP9的应用以及本发明的抗体用于制备人CTRP9检测试剂盒的应用。
Description
技术领域
本发明涉及杂交瘤细胞株、抗体及其应用,具体涉及用于检测人CTRP9的杂交瘤细胞株、抗体及其应用。
背景技术
C1q and tumor necrosis factor related protein 9(CTRP9)是主要由脂肪细胞分泌的脂肪细胞因子,作用于肌肉和肝脏,调节全身葡萄糖和脂质代谢等。在肾脏、小肠、肺脏及成纤维细胞等器官、组织细胞中也有所表达。
CTRP9由分泌信号肽、短N端可变区域、胶原区域及C端球状结构域构成,成熟蛋白不含其N端信号肽(19个氨基酸残基)。C端球状结构域与C1q结构类似,与脂联素高度相似,可以与其他蛋白或者受体相互作用,因此被认为是其功能结构域。
CTRP9是具有诸多生理功能的新型脂肪因子,具有降低血糖、舒张血管及心肌保护等诸多生理作用。骨骼肌细胞中,CTRP9可以长期激活AMPK通路,增加线粒体的含量和上调脂肪酸氧化相关基因的表达,从而降低了脂肪组织的形成。在股动脉损伤模型中,CTRP9过量表达可以激活cAMP/PKA/ERK通路,抑制血管平滑肌细胞增殖和迁移,大幅度降低新生内膜的形成。人脐静脉内皮细胞和新分离血管环中,重组CTRP9蛋白可以通过AMPK/eNOS通路提高一氧化氮产量使血管扩张。同时,CTRP9具有显著的缺血心肌及血管保护作用,尤其是在心肌及血管组织表达分泌量是脂联素的100倍以上,而心肌缺血损伤时其心肌分泌及血浆含量均显著降低,具有很高的特异性,CTRPs是潜在的肥胖相关心脏病病情评估的生物标记物及干预靶点,有望在治疗代谢综合征和心力衰竭等方面发挥重要作用。
目前用于人CTRP9定量检测的方法只有ELISA法,较为可靠的产品只有BioVendor的产品,但是也存在偏差较高、价格昂贵、操作时间长、不利于大规模检测人CTRP9含量等缺点。
发明内容
针对现有技术的缺陷或不足,本发明提供了一种用于产生抗人CTRP9单克隆抗体的杂交瘤细胞株XA272-919,该杂交瘤细胞株保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏编号:CCTCC NO:C2016111,地址:武汉市武昌珞珈山武汉大学,保藏时间:2016年6月16日。
本发明的杂交瘤细胞株产生的抗体的序列为:重链可变区:QVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTTYNIHWVKQTPGQGLEWIGAIYPGKGDTSYSPNFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARGGNAMDYWGQGTSVTVSS;CDR1序列:TYNIH;CDR2序列:AIYPGKGDTSYSPNFKGKAT;CDR3序列:GGNAMDY;轻链可变区:DIVMSQSPSSLAVSVGEKVTMSCKSSRTLLYSSNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVKAEDLAVYYCLQYYSYVTFGAGTKLELK;CDR1序列:KSSRTLLYSSNQKNYLA;CDR2序列:WASTRES;CDR3序列:LQYYSYVT。
本发明杂交瘤细胞株分泌产生的抗人CTRP9单克隆抗体。
本发明抗体用于检测人CTRP9的应用。
本发明抗体用于制备人CTRP9检测试剂盒的应用。
本发明还提供了人CTRP9检测试剂盒。所提供的人CTRP9检测试剂盒包括上述抗体。
本发明的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还包括:样品稀释液、底物稀释液、底物、洗涤液、标准品和非离子活性剂。
附图说明
图1为重组人CTRP9蛋白的电泳图,1、Marker;2、破碎上清;3、镍柱流穿液;4、500mM咪唑洗脱液;5、重组人CTRP9蛋白。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明做进一步的阐述。实施例是对本发明进行详细说明,但本发明并不受这些的任何限定。
以下实施例中使用的辣根过氧化物酶(HRP)购自上海生工生物工程技术服务有限公司;基因序列优化、合成克隆由北京奥科鼎盛生物科技有限公司完成;抗体测序由北京安必奇生物科技有限公司完成;Ni-NTA纯化柱购自GE公司;内毒素去除柱购自赛默飞世尔(中国)有限公司;DMEM高塘培养基、胎牛血清为Hycolon公司产品。
实施例1:本发明杂交瘤细胞株的制备
根据人CTRP9序列(GenBank ACCESSION NM_030945)开放阅读框序列,进行针对大肠杆菌偏好性进行密码子优化,人CTRP9全基因合成(序列为:ATGCAGGATACCTGCAGACAGGGTCACCCAGGTATTCCAGGTAACCCTGGTCATAATGGTCTGCCAGGTAGAGATGGTCGTGATGGTGCCAAAGGTGACAAAGGTGATGCTGGAGAGCCAGGTAGACCAGGTTCACCTGGTAAGGATGGAACCTCTGGTGAGAAGGGAGAACGTGGTGCCGACGGTAAAGTGGAAGCCAAGGGTATCAAGGGTGACCAGGGTTCTCGTGGTTCTCCAGGTAAACACGGTCCTAAAGGTTTGGCCGGTCCTATGGGAGAAAAGGGTCTGAGAGGTGAGACTGGTCCACAGGGACAGAAAGGTAACAAGGGTGACGTTGGTCCTACTGGTCCTGAGGGTCCTCGTGGTAATATTGGTCCACTGGGTCCTACCGGTCTGCCAGGTCCAATGGGTCCAATTGGTAAGCCAGGTCCAAAGGGTGAAGCTGGTCCTACCGGACCACAGGGAGAACCAGGTGTGCGTGGTATTAGAGGTTGGAAGGGTGATCGTGGAGAGAAGGGTAAAATCGGTGAGACCCTGGTGCTGCCAAAATCTGCCTTTACCGTTGGTCTGACCGTGCTGTCTAAGTTTCCTTCTTCTGATATGCCAATTAAATTTGACAAAATTCTGTACAACGAGTTCAACCATTATGACACTGCCGCCGGTAAGTTCACCTGCCATATCGCCGGTGTTTACTACTTTACCTATCATATTACCGTGTTCTCTCGTAACGTTCAGGTGTCTCTGGTGAAGAACGGTGTGAAGATCCTGCACACCAAGGACGCCTACATGTCTTCTGAGGACCAGGCTTCTGGTGGTATCGTGCTGCAGCTGAAACTGGGTGATGAGGTGTGGCTGCAGGTTACTGGTGGTGAACGTTTCAACGGTCTGTTTGCCGACGAAGATGACGACACCACCTTCACTGGATTCCTGCTGTTCTCATCTCCTTAA),将合成的基因连接于pET30a(+),采用IPTG(终浓度1mM)进行25℃,200rpm过夜诱导表达,4000g离心收获菌体。超声破碎后,12000g离心取上清。上清经过镍柱亲和纯化,采用咪唑浓度梯度洗脱后,通过透析更换为PBS缓冲液,采用Millipore Utral-15浓缩,除去内毒素后,即为重组人CTRP9蛋白(参见图1)。
选取6-8周龄Balb/C雌性小鼠,前述CTRP9蛋白作为抗原,为获得高亲和力抗体,采用小剂量(约1μg)、长时程,多次免疫的方法,选择免疫10天后,采用间接ELISA方法检测血清效价(包被抗原为酶切并纯化的蛋白),效价达到1∶5万以上准备融合。
取经加强免疫的小鼠脾脏,研磨破碎,过滤洗涤之后,制成细胞悬液并计数;骨髓瘤SP2/0细胞生长至对数期,离心收集并洗涤,与脾细胞按1∶10或1∶5的比例混合,室温下采用PEG进行促融合,将融合后的细胞悬液加入含有饲养细胞的96孔板,置37℃,5%CO2,相对饱和湿度培养箱中培养。在融合24小时后,依次采用5×HAT选择培养液、1×HAT/HT选择培养液和1×HT培养液进行融合骨髓瘤细胞筛选。采用间接ELISA方法阳性克隆(包被抗原为酶切并纯化的蛋白)并进行连续克隆化。最终筛选得到能够稳定分泌抗CTRP9单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为XA272-907和XA272-919,均保藏于中国典型培养物保藏中心,地址:武汉市武昌珞珈山武汉大学,保藏编号分别为:CCTCC NO:C2016110和CCTCC NO:C2016111。
实施例2:人CTRP9单克隆抗体XA272-919的制备
编号为CCTCC NO:C2016111的杂交瘤细胞以106个/只的量,腹腔注射预先致敏8-10周龄BABL/C雌性小鼠,7-10天后,采集小鼠腹水,用间接ELISA方法检测单抗的效价。
腹水4℃、12000rpm离心15min,与2倍体积的醋酸缓冲液(0.06M,pH4.8)混合,逐滴加入正辛酸,室温搅拌30min,4℃静置其充分沉淀。
离心后取上清过滤,加入1/10体积的磷酸盐缓冲液(0.1M,pH7.4),并用2M NaOH调节pH至7.4。
采用硫酸铵沉淀将抗体沉淀,离心后取沉淀,用含有0.2mM EDTA磷酸盐缓冲液溶解,并透析过夜。
采用离子交换层析进行纯化,所用缓冲液:平衡缓冲液为20mM pH7.5的Tris-HCl缓冲液、洗脱缓冲液为含1.0M NaCl的20mM pH7.5的Tris-HCl缓冲液。NaCl浓度梯度洗脱结合的抗体蛋白,检测A280,收集洗脱的抗体蛋白。
抗体的测序由北京安必奇生物科技有限公司完成,其步骤为:杂交瘤细胞采用RPMI 1640加20%血清培养24h,离心,弃去上清,采用TriZol重悬细胞,106个细胞/mL。提取DNA后,采用RT-PCR扩增重链和轻链基因,克隆至T载体后进行DNA测序。该抗体命名为:单克隆抗体XA272-919,抗体序列为:重链可变区:QVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTTYNIHWVKQTPGQGLEWIGAIYPGKGDTSYSPNFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARGGNAMDYWGQGTSVTVSS;CDR1序列:TYNIH;CDR2序列:AIYPGKGDTSYSPNFKGKAT;CDR3序列:GGNAMDY;轻链可变区:DIVMSQSPSSLAVSVGEKVTMSCKSSRTLLYSSNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVKAEDLAVYYCLQYYSYVTFGAGTKLELK;CDR1序列:KSSRTLLYSSNQKNYLA;CDR2序列:WASTRES;CDR3序列:LQYYSYVT。
实施例3:人CTRP9单克隆抗体XA272-907的制备
保藏号为:CCTCC NO:C2016110(保藏地址:武汉市武昌珞珈山武汉大学,保藏时间:2016年6月16日)杂交瘤细胞以106个/只的量,腹腔注射预先致敏8-10周龄BABL/C雌性小鼠,7-10天后,采集小鼠腹水,用间接ELISA方法检测单抗的效价。腹水4℃、12000rpm离心15min,与2倍体积的醋酸缓冲液(0.06M,pH4.8)混合,逐滴加入正辛酸,室温搅拌30min,4℃静置其充分沉淀。离心后取上清过滤,加入1/10体积的磷酸盐缓冲液(0.1M,pH7.4),并用2MNaOH调节pH至7.4。采用硫酸铵沉淀将抗体沉淀,离心后取沉淀,用含有0.2mM EDTA磷酸盐缓冲液溶解,并透析过夜。采用离子交换层析进行纯化,所用缓冲液:平衡缓冲液为20mMpH7.5的Tris-HCl缓冲液、洗脱缓冲液为含1.0M NaCl的20mM pH7.5的Tris-HCl缓冲液。NaCl浓度梯度洗脱结合的抗体蛋白,检测A280,收集洗脱的抗体蛋白。抗体的测序由北京安必奇生物科技有限公司完成,其步骤大致为:杂交瘤细胞采用RPMI 1640加20%血清培养24h,离心,弃去上清,采用TriZol重悬细胞,106个细胞/mL。提取DNA后,采用RT-PCR扩增重链和轻链基因,克隆至T载体后进行DNA测序。该抗体命名为:抗体XA272-907,该抗体的序列为:重链可变区:
DVQLQESGPDLVKPSQSLSLTCTVTGYSITSNFSWHWIRQFPGNKLEWMGYIHYSGGTNYNPSLKSRISITRDTSKNQFFLQLNSVTTEDTATYYCACFDYWGQGTSLTVSS;CDR1序列:NFSWH;CDR2序列:
YIHYSGGTNYNPSLKSRIS;CDR3序列:FDY;轻链可变区:
DVLMTQTPLSLPVILGAQASISCRSSQTIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPFTFGSGTKLEIK;CDR1序列:RSSQTIVHSNGNTYLE;CDR2序列:KVSNRFS;CDR3序列:FQGSHVPFT。
实施例4:人CTRP9ELISA试剂盒
试剂盒组成:人CTRP9单克隆抗体XA272-919包被的酶标板,标准品(纯化的CTRP9蛋白,冻干粉),检测抗体:抗体XA272-907,酶标亲和素HRP-链霉素,样品稀释液,TMB酶底物显色液,洗涤液及反应终止液。TMB酶底物显色液:0.03%过硼酸钠,用之前10min加入TMB盐酸盐,终浓度0.01%;反应终止液:1mol/L硫酸溶液;样品稀释液:含0.1%BSA及0.1%Tween-20的PBS缓冲液;洗涤液:含有0.1%Tween-20的PBS缓冲液。
(1)酶标板包被:
(1.1)杂交瘤细胞株XA272-919所产生单克隆抗体XA272-919作包被用抗体,用50mM、pH9.6碳酸盐缓冲液稀释至2μg/mL加至96孔板,100μL/孔,4℃包被过夜;
(1.2)洗涤:用300μL含0.1%吐温的磷酸盐缓冲液洗板3次,甩干;
(1.3)干燥保存:存于加干燥剂的密封袋中,4℃保存备用。
(2)检测抗体酶标
辣根过氧化物酶(HRP)5mg/1mL加入0.2mL 0.1M过碘酸钠,室温下避光搅拌20min。将上述溶液对1mM pH4.4醋酸钠缓冲液4℃透析过夜。20μL 0.2M pH9.5碳酸盐缓冲液调节pH到9.0-9.5加入10mg抗体XA272-907(由杂交瘤细胞株XA272-907产生),室温避光轻轻搅拌2h。加0.1mL硼氢化钠溶液(4mg/mL),混匀静置2小时,4℃透析过夜。逐滴加入等体积饱和硫酸铵溶液4℃静置1小时,离心30min,弃去上清。沉淀物少量0.15M pH7.4的磷酸盐缓冲液并透析,上清即为酶标抗体XA272907-HRP
(3)样品加入:将标准品(待测样本)加入包被孔内,室温振荡反应1h。
(4)酶联反应:洗涤4次后加入辣根过氧化物酶标记的单克隆抗体XA272907-HRP100μl/孔,反应1h。
(5)显色反应:洗涤4次后再加入底物液(含0.03%过硼酸钠和0.01%盐酸TMB)100μl,振荡显色10分钟。
(6)终止反应:以1mol/L硫酸终止反应。
(7)拟合曲线与读值:在酶标仪上读波长为405nm的OD值得出标准曲线和浓度。
利用标准品测定本试剂盒相关指标:
1.线性范围:该试剂盒检测CTRP9含量的线性范围为8.0pg/ml~15ng/ml。
2.回收率:采用1ng/ml,10ng/ml,15ng/ml的CTRP9溶液(溶剂为样品稀释液),测的平均回收率为98.87%(n=9)。
3.批内差异:平均为4%。
4.批间差异:平均为8%。
实施例5:用本发明试剂盒检测急性心肌梗死患者及正常对照组血清中CTRP9含量
采用本发明所述试剂盒,检测50例正常人和50例急性心肌梗死患者血清中CTRP9含量,其结果如表1所示。
表1血清中CTRP9的检测结果(x±s,ng/ml)
血清中CTRP9含量 | 正常组 | 急性心肌梗死患者 |
ng/mL | 7.04±1.56 | 3.04±2.31 |
P<0.001 |
急性心肌梗死患者血清中CTRP9含量明显低于正常人,差异显著(p<0.01)。以上结果表明,利用本发明试剂盒能定量检测出体液标本中CTRP9的含量,对临床检测具有较高的敏感性和特异性,对诊断该病具有重要参考价值,为及早防治该病提供了一个有效途径。
Claims (6)
1.抗人CTRP9单克隆抗体,其特征在于,该抗体的序列为:重链可变区如SEQ.ID.NO.1所示,轻链可变区如SEQ.ID.NO.2所示。
2.分泌产生权利要求1所述抗体的杂交瘤细胞株,该杂交瘤细胞株的保藏编号为CCTCCNO:C2016111。
3.权利要求1所述抗体用于制备人CTRP9检测试剂的应用。
4.权利要求1所述抗体用于制备人CTRP9检测试剂盒的应用。
5.一种人CTRP9检测试剂盒,其特征在于,该试剂盒包括权利要求1所述抗体。
6.权利要求5所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还包括:样品稀释液、底物稀释液、底物、洗涤液、标准品和非离子活性剂。
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CTRP9 Protein Protects against Myocardial Injury following Ischemia-Reperfusion through AMP-activated Protein Kinase (AMPK)-dependent Mechanism;Takahiro Kambara et al.;《THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY》;20120601;第287卷(第23期);第18965–18973页 * |
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CN106636005A (zh) | 2017-05-10 |
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