KR20070109347A

KR20070109347A - 인간 ｃｔｒｐ1을 특이적으로 인식하는 단일클론 항체 및이를 생산하는 하이브리도마 세포

Info

Publication number: KR20070109347A
Application number: KR1020060042197A
Authority: KR
Inventors: 영 양; 김근영
Original assignee: 숙명여자대학교산학협력단
Priority date: 2006-05-11
Filing date: 2006-05-11
Publication date: 2007-11-15
Also published as: KR100803175B1

Abstract

본 발명은 인간 CTRP1(C1q-TNF Related Protein-1)에 결합하는 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마 및 그에 의해 생산되는 단일클론 항체에 관한 것이다.

상기 하이브리도마가 분비하는 단일클론 항체는 인간 CTRP1을 특이적으로 인지하며 이 단백질을 면역 침강시키는 능력을 지니고 있다.

본 발명에 의해 인간 CTRP1에 대한 단일클론 항체가 제공되므로, 이 항체를 이용하여 간편하고 경제적으로 CTRP1단백질을 검출할 수 있을 뿐만 아니라 비만 또는 당뇨의 진단 및 예방·치료 등에 널리 활용될 수 있을 것이다.

비만, 당뇨, 하이브리도마, 항체, 단일클론, CTRP1

Description

인간 ＣＴＲＰ1을 특이적으로 인식하는 단일클론 항체 및 이를 생산하는 하이브리도마 세포{Hybridomas producing Monoclonal Antibodies against human CTRP1 and the Monoclonal Antibodies produced by the Hybridomas}

도 1는 재조합 인간 CTRP1단백질을 분리·정제한 것을 보여주는 전기영동 사진이다.

도 2는 대장균 형질 전환체로부터 생산한 인간 CTRP1 재조합 단백질을 항원으로 주사한 후 얻어진 mouse 혈청을 취하여 인간 CTRP1 항원에 대하여 반응하는 정도를 검사한 ELISA 결과를 보여주는 사진이다.

도 3는 293 세포주에서 발현한 생쥐와 인간의 CTRP1을 가지고 웨스턴 블랏팅(Western blotting)한 결과를 보여주는 전기영동 사진이다.

도 4는 293세포주에서 발현한 생쥐와 인간의 CTRP1들에 항체를 혼합하고 두 시간동안 결합시킨 후에 항생쥐항체가 붙은 agarose로 면역침강법을 수행하고 SDS-PAGE에 분리한 후에 CTRP1-E21H7 항체로 웨스텃블랏팅을 수행한 결과를 보여주는 주는 전기영동 사진이다.

도 5는 E21H7 clone 의 isotype을 결정한 결과를 나타내는 사진이다.

지방세포(adipocyte)는 일반적으로 중성지방(triglyceride)의 저장 장소로 알려져 왔으나 최근의 연구에 의하면 지방세포에서 많은 종류의 생리학적 활성 요소들이 분비되고 있음이 밝혀졌다. 지방세포에 의해 분비되는 생리활성 물질의 한 예로서, adiponectin, tumor necrosis factor-α(TNF-α), resistin, leptin 등과 같은 adipokine 류가 있다. 이들은 면역반응과 물질대사의 항상성 유지를 비롯한 여러 가지 생물학적 현상의 조절에 관여하는 것으로 알려져 있다. 이중 adiponectin은 아미노 말단에 collagenous domain을 갖고 있으며 complement factor인 C1q와 유사성을 지닌 globrlar domain을 포함하고 있다. adiponectin을 생취에 투여하면 인슐린 저항성이 감소되고 체중의 감소를 유발한다. 한편, white adipose tissue에서 adiponectin의 transcript level은 정상의 생쥐보다 ob/ob 생쥐에서 더 낮게 나타났다. 또한 혈장 내의 adiponectin level은 마른 사람에서 보다 비만인 사람에게서 더 낮게 나타났다.

따라서 근육에서 유리지방산의 연소를 촉진하여 혈액 내의 유리 지방산의 농 도를 감소시키고 간에서 인슐린의 작용을 증가시키는 역할을 조절하는 adiponectin의 기작의 연구는 학문적으로 매우 중요한 일이며 비만 및 성인형 당뇨병의 진단, 예방 및 치료제 개발의 중요한 초석이 될 수 있다.

본 발명자들은 비만 및 당뇨병 치료제 개발에 중요한 매체로 부각되는 adiponectin의 family의 하나인 인간 CTRP1의 기전연구에 이용하기 항체를 제작함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명은 인간 CTRP1에 결합하는 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포 및 그의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 인간 CTRP1 특이적인 단일클론 항체 및 이를 이용한 인간 CTRP1의 정성·정량 분석방법, 이를 이용한 인간의 비만 또는 당뇨병 연구·진단방법을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.

전술한 목적을 달성하기 위한 본 발명은, 인간 CTRP1에 결합하는 생쥐 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포 E21H7(기탁번호 KCTC 10944BP)에 관한 것이다.

본 발명의 상기 하이브리도마 세포 E21H7는, (A) 인간 CTRP1의 융합단백질을 사용하여 생쥐를 면역화하는 단계; (B) 상기 면역화된 생쥐의 비장 세포를 마이엘로마 세포와 융합하여 배양하는 단계; 및 (C) 상기 융합된 하이브리도마 세포에서 인간 CTRP1에 특이적인 단일 클론항체를 생산하는 하이브리도마 세포를 선별하는 단계;를 포함하는 과정에 의해 제작될 수 있다.

또한 본 발명은, 상기 하이브리도마 세포 E21H7에 의해 만들어지는 인간 CTRP1 특이적인 IgG2a형 단일클론 항체 및 이를 이용한 인간 CTRP1의 정성·정량 분석방법에 관한 것이다. 본 발명에 의한 상기 항체를 이용하여 인간 CTRP1의 기능을 정확하고 재현성 있게 추적하게 함으로서 CTRP1이 관련된 비만 또는 당뇨 치료 연구 및 진단을 편리하고 경제적으로 할 수 있다.

"융합단백질"은 추후 단백질 정제의 편의를 위하여 N-말단에 His를 부착하고 있는 재조합 인간 CTRP1를 의미한다. 따라서 본 발명에서 "융합단백질"이라 표현하였지만, 그것이 반드시 His가 부착된 것을 의미하는 것이 아니며, 단백질 정제의 불편함을 감수한다면 융합단백질을 사용하지 않을 수도 있다. 그러므로 본 발명에서 "인간 CTRP1 융합단백질"이란 용어는 "인간 CTRP1 단백질" 또는 "정제의 편의를 위한 사슬이 N-말단 또는 C-말단에 부가된 인간 CTRP1 단백질"의 약칭으로 정의된다.

이하 인간 CTRP1에 결합하는 생쥐 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포의 제작을 중심으로 본 발명을 설명한다.

(1) 인간 CTRP1의 클로닝

인간 CTRP1을 인식하는 단일항체 클론을 제조하기 위하여 먼저 인간 CTRP1 단백질을 제조하였다.

인간 지방조직 cDNA를 주형으로 하여 중합효소 연쇄반응(PCR)으로 인간 CTRP1 유전자를 증폭하였다. 이를 N-말단에 His가 부착되어 있는 pET28a에 클로닝 하여 pET28a-hCTRP1 벡터를 제작한 후 E. coli BL21(DE3) 균주에 형질 도입한 후 IPTG를 사용하여 재조합 CTRP1의 강제 과발현을 유도하였다. 과발현된 균주를 분쇄한 후 Q-sepharose 컬럼을 이용하여 재조합 인간 CTRP1를 수득하였다. 그리고 SDS-PAGE에 전기영동한 후에 코마시블루로 염색하여 정제된 밴드를 확인하였다.

(2) 인간 CTRP1에 대한 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포의 제작

하이브리도마 세포주의 개발에 필요한 면역화 된 생쥐를 얻기 위하여, 상기 수득한 재조합 인간 CTRP1와 면역보조항원의 혼합액을 3회에 걸쳐 생쥐의 근육에 주사하였다. 면역원을 마지막 주사한 3일 후에 얻은 마우스의 비장세포를 분리하여 마이엘로마(myeloma) 세포 (NS-1)와 혼합한 후 배양하여 하이브리도마 세포군을 증식시켰다.

CRTP1 항원에 대한 항체반응을 엘리자 해독기(ELISA Reader)로 흡광도를 측정하여 CRTP1에 높은 결합력을 갖는 항체를 분비하는 하이브리도마 세포주를 선별하고, 본 세포주가 단일클론이 되도록 제한 희석 (limiting dilution)하여 하이브 리도마 세포주를 선별하였다.

선별된 단일클론 항체 생산 하이브리도마를 hCRTP1-E21H7라 명명하고 이를 한국생명공학연구원 유전자은행에 기탁하여 수탁번호 KCTC 10944BP를 부여받았다. 이 하이브리도마가 생산하는 항체는 IgG2a 타입인 것으로 확인되었다.

인간 CRTP1에 특이적으로 반응하는 단일클론 항체는 엘리자 분석 방법 이외에도 CRTP1에 대한 웨스턴 블랏팅 방법 및 면역침강 방법을 사용하여 항원과의 반응성을 확인하였다.

이하, 실시예에 의하여 본 발명을 상세히 설명한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것으로, 본 발명의 기술적 사상의 내용이나 범위가 실시예에 의해 한정되거나 변경되는 것은 아니다.

<실시예 1> 인간 CRTP1의 cDNA 발현벡터 제조 및 단백질 발현

(1) 발현벡터의 제작

NCBI 의 BLAST 프로그램을 통하여 C1q globular domain을 갖는 CTRP family중 CTRP1의 서열을 찾을 수 있었다(AF329840). 인간 CTRP1의 유전자 염기서열을 참조하여 EcoRI 인식부위가 삽입된 정방향 프라이머(서열1; cggaattcatgggctcccgtggacag) 및 XhoI 인식부위가 삽입된 역방향 프라이머(서열2; ccctcgagctagggctcggtggcgtg)를 정하고, 인간 지방조직 cDNA를 주형으로 하여 94℃에서 1분, 55℃에서 1분, 72℃에서 1분 씩 30회 증폭의 반응 조건으로 pfu 중합효소를 이용한 중합효소 연쇄반응(PCR)을 실행하여 인간 CTRP1 유전자의 완전한 인식부위를 증폭하였다.

EcoR1 및 XhoI 제한효소를 사용하여 상기에서 증폭된 cDNA를 절단하고, pBluescript KS 플라스미드(Clontech, CA, USA)에 삽입한 후에 염기서열을 분석하여 유전자가 온전하게 삽입되었는지 확인하였다. 정확한 삽입이 확인된 플라스미드를 EcoRI과 XhoI의 제한효소로 절단 후에 pET28a 플라스미드(Novagen, Inc)에 삽입하여 hCTRP1단백질의 N-말단에 His가 부착된 pET28a-hCTRP1 벡터를 제조하였다.

(2) hCRTP1의 재조합 단백질 발현

재조합 인간 CTRP1의 유전자를 발현시키기 위하여 벡터 pET28a-hCTRP1을 E. coli BL21(DE3)균주에 Heat shock 방법으로 형질 전환 시킨 후 카나마이신 고체배지에 도말하여 37℃ 배양기에서 24시간 동안 배양하여 pET28a-hCTRP1이 형질전환된 단일 클론을 선별하였다.

선별된 단일 클론 균주를 5ml의 멸균된 LB-카나마이신 배양 용액(1% NaCl, 0.5% yeast extract, 1% trypton, 50 ug/ml kanamycin)에 접종하여 24시간 동안 진탕 배양기에서 배양한 후 다시 250ml의 LB-카나마이신 배양용액에서 접종하여 대용량으로 배양하였다. OD 600 값이 0.6-1.0이 되면 pET28a벡터 내 T7promoter를 촉 진시켜주는 isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranoside를 1mM의 농도로 첨가하여 약 3시간 동안 추가로 배양하여 N-말단에 His를 부착하고 있는 재조합 인간 CTRP1의 강제 과발현이 유도되는 균주를 증식하였다.

증식된 균주를 초음파 분쇄 후 원심분리하여 inclusion body를 분리한 다음 guanidine buffer(50 mM Tris pH 8.0, 7 M guanidine)로 Denatured recombinant 인간 CTRP1을 얻었다. 단백질 refolding을 위하여 ro-Matrix protein refolding guide(PIERCE, Rockford, IL)에 따라 refolding buffer(55 mM Tris, 21 mM Nacl, 0.88 mM KCl, 1 mM DETA, 0.55 M Guanidine, 0.44 M L-Arginine, 2 mM GSH, 0.2 mM GSSG, pH8.2)를 이용하여 24시간 동안 refoling 시킨 후 농축하였다.

농축된 단백질 용액을 Q-sepharose 컬럼[파마시아, 미국]에 로딩하였다. 이어서 Washing buffer(20 mM Tris, pH 8.0, 50m NaCl) 20 volumne 이상으로 세척한 다음 elution buffer(0.5 M NaCl)를 사용하여 재조합 인간 CTRP1 단백질을 분리 분획하였다.

정제된 재조합 인간 CTRP1 용액을 활성화된 투석막에 넣고 500 ㎖의 TBS(25 mM Tris-HCl pH 8.0)를 이용하여 4℃에서 4시간 간격으로 3회 이상 투석시킨 후 Micro BCA Protein Assay Reagent Kit(PIERCE)를 사용하여 단백질의 농도를 측정한 후 Triton x-114 추출 방법을 이용하여 endotoxin을 제거하였다. 수득된 재조합 인간 CTRP1 용액은 100 ㎕씩 분획하여 -70℃에 냉동 보관하고 필요 시마다 사용하였다.

도 1에 His와 융합된 상태의 hCTRP1 단백질의 정제 전·후의 전기영동 사진 을 나타내었다. 도에서 pET28a-hCTRP1는 형질전환된 대장균을 초음파 분쇄한 상태이며, Purified-hCTRP1은 분리·정제된 재조합 인간 CTRP1단백질을 나타낸다.

<실시예 2> hCTRP1에 대한 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마의 제작 및 단일클론 항체의 생산

(1) 생쥐의 항원 면역화 및 비장세포의 분리

하이브리도마 세포주의 개발에 필요한 면역화 된 생쥐를 얻기 위하여, 50 ㎍의 재조합 인간 CTRP1 융합단백질과 동량의 면역보조항원(Freund's adjuvant)을 혼합하여 4-6 주된 Balb/c 마우스의 근육 내에 주사하였다. 2 주 후에 25㎍씩의 CTRP1 융합단백질과 동량의 면역보조항원 혼합물을 마우스의 근육 내로 부스터(booster)주사하고 4~5 일 경과 후에 생쥐 안구정맥에서 소량의 피를 뽑아내어 역가를 다음과 같이 확인하였다. 두 마리의 생쥐로부터 얻은 혈청을 1000배 와 5000배 희석하여 ELISA를 수행하여 그 결과를 도 2에 나타내었다. ELISA를 수행하여 5분 내에 칼라반응에 의한 흡광도가 0.5 이상이면 면역화가 충분히 된 것으로 확인하였다. 최종적으로 세포융합 실험 3일 전에 25㎍씩의 CTRP1 융합단백질과 동량의 면역보조항원 혼합물을 근육 내에 주사하였다.

면역화 된 생쥐를 에테르로 마취한 후 몸통의 좌측에 위치한 비장(spleen)을 적출하고 주사기로 DMEM media를 주입하여 비장세포 현탁액을 만들었다. 현탁액을 원심분리하여 세포층을 회수한 다음 적혈구 분해액(Red blood cell lysis buffer; PROMEGA)를 가하여 적혈구를 파괴함으로써 순수한 비장세포를 분리하였다.

(2) 세포융합에 의한 하이브리도마의 제조

이 모세포는 10% FBS를 함유하는 DMEM 배지에서 최대밀도 5×10⁵/㎖ 정도로 유지시킨 골수종 세포(myeloma cell) NS-1을 모(parent)세포로 하여 하이브리도마 세포의 제조를 위한 세포융합을 수행하였다.

실시예 2의 (1)에서 얻은 생쥐의 비장세포 10⁷개와 NS-1 세포 10⁶개를 50 ml의 시험관에 혼합·현탁한 다음 원심분리하여 세포를 침전시켰다. 원심분리된 침전물을 손가락으로 가볍게 두드려서 분산시키고, 한스완충액(HBSS)에 들어있는 45 % 폴리에틸렌 글라이콜(polyethylene glycol, PEG) 1 ㎖를 1 분간에 걸쳐 넣고, 37 ℃에서 1 분간 유지시킨 후, 배양배지(DMEM) 1 ㎖을 1분간 4회 가하였다. 그 후 배양배지(DMEM) 10 ㎖을 1 분간 걸쳐 첨가하고, 37℃의 물에서 5분간 방치한 후 50 ㎖로 맞추어 다시 원심분리하였다. 세포 침전물을 분리배지(HAT 배지)에 1~2×10⁵/㎖ 정도로 재현탁시키고, 96 웰(well) 마이크로타이터 플레이트에 0.1 ㎖씩 분주한 후 37 ℃ humidified 이산화탄소 배양기에서 배양하였다.

(3) 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포의 선별

상기 (2)에서 제조된 하이브리도마 세포군 중에서 CTRP1 항원에만 특이적으로 반응하는 하이브리도마 세포를 선별하기 위하여 대장균에서 발현된 인간 CTRP1을 항원으로 이용한 엘리자 분석방법을 통하여 스크리닝 하였다.

마이크로타이터 플레이트에 CTRP1을 한 웰당 각각 50 ㎕ (2 ug/㎖)씩 가하여 플레이트 표면에 부착시키고, 반응하지 않은 항원은 세척하여 제거하였다. 하이브리도마 세포의 배양액을 각각 웰에 50 ㎕씩을 가하여 1 시간 동안 반응시킨 후 인산 완충용액-트윈 20(TBST) 용액으로 충분히 세척하여 반응하지 않은 배양액을 제거하였다. 여기에 염소 항-마우스 IgG-호스래디쉬 퍼옥시다제(goat anti-mouse IgG-HRP)를 가하여 1 시간 동안 실온에서 반응시킨 다음, TBST 용액으로 충분히 세척하였다. 이어서 퍼옥시다제의 기질용액(OPD)을 가하여 반응시키고, 그 반응정도는 엘리자 해독기(ELISA Reader)로 450 nm에서 흡광도를 측정하여 인간 CTRP1 항원에 특이적으로 높은 결합력을 갖는 항체를 분비하는 하이브리도마 세포주들을 반복하여 선별하였다.

반복 선별을 통해 얻은 하이브리도마 세포주를 제한 희석(limiting dilution)하여 단일클론 항체를 생성하는 하이브리도마 세포주 1개의 클론을 최종적으로 얻었다. 최종 선별된 단일클론 항체 생산 하이브리도마를 hCRTP1-E21H7라 명명하고 이를 한국생명공학연구원 유전자은행에 기탁하여 수탁번호 KCTC 10944BP를 부여받았다.

이 하이브리도마가 생산하는 항체가 인간의 CTRP1에 선별적으로 결합하는지 확인하기 위하여 293 세포주에서 발현한 생쥐와 인간의 CTRP1을 가지고 웨스텃블랏팅을 수행하였다. 자세하게는 인간 CTRP1을 클로닝한 pCDNA3.1 flag hCTRP1과 생쥐의 CTRP1을 클로닝 한 pCDNA3.1 flag mCTRP1벡터를 이용하여 각각을 강제 과발현시킨 293T 세포주의 전체 lysate를 SDS-PAGE로 전기영동에 의해 분리하고 이를 hCTRP1에 대한 단일항체클론 E21H7의 배양액을 이용하여 웨스턴 블랏팅(Western blotting)을 수행하여 그 결과를 도 3에 나타내었다. 그 결과 인간의 CTRP1에만 특이적으로 결합함을 확인하였다. 그리고 이 항체가 면역침강법에 사용할 수 있는 항체인지를 확인하기 위하여 293 세포주에서 발현한 생쥐와 인간의 CTRP1들에 항체를 혼합하고 두 시간동안 결합시킨 후에 항생쥐항체가 붙은 agarose로 면역침강법을 수행하고 SDS-PAGE에 분리한후에 CTRP1-E21H7 항체로 웨스텃블랏팅을 수행하여 그 결과를 도 4에 나타내었다. 그 결과 인간의 CTRP1을 특이적으로 면역침강 시킨다는 것을 확인하였다. CTRP1-E21H7 항체의 isotype을 결정하기 위하여 BD Bioscience에서 구입한 isotype 결정킷트로 CTRP1-E21H7의 isotype을 결정하여 도 5에 나타내었다. 그 결과 IgG2a로 판명되었으며, light chain은 kappa임이 결정되었다.

(4) 단일클론 항체의 대량 생산

위 (3)에서 얻은 하이브리도마로부터 단일클론성 항체를 대량 생산하였다.

먼저 0.5 ㎖의 불완전 보조항원(Incomplete Freund Adjuvant)을 실험쥐(Balb/c)의 복강 내로 주사하였다. 1 주일 경과 후 상기 하이브리도마 세포 2×10⁶개를 실험쥐의 복강 내에 주사하고, 7~10일 후 복강이 부풀어 오른 실험쥐에서 복수액을 채취하였다.

복수액을 10,000 rpm에서 원심분리하여 고농도의 하이브리도마 세포액을 얻었다. 상층액을 친화성 칼럼(Protein A&G agarose column; Pharmacia, USA)을 이 용하여 단일클론 항체를 분리·정제하였다. 정제하지 않은 상층액은 -70℃에서 보관하면서 필요할 때 마다 분리·정제하여 단일클론 항체를 얻었다.

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인간 CTRP1 재조합 단백질의 생산은 이들과 결합하는 단일클론 항체를 생산하기 위한 융합세포주를 제조하는데 유용하게 사용할 수 있으며, 얻어진 항체는 지방세포에서 발현되는 CTRP1의 측정에 사용될 수 있다. 특히 얻어진 항체는 사람의 CTRP1의 면역침강이나 웨스턴블랏에 사용할 수 있어 지방세포에 관여하는 CTRP1의 세포내 기능분석 연구 및 비만 및 당뇨 진단에 사용될 수 있다.

<110> The Industry & Academic Cooperation in Sookmyung Women's University <120> Hybridomas producing Monoclonal Antibodies against human CTRP1 and the Monoclonal Antibodies produced by the Hybridomas <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 cggaattcat gggctcccgt ggacag 26 <210> 2 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 ccctcgagct agggctcggt ggcgtg 26

Claims

인간 CTRP1에 결합하는 생쥐 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포 E21H7(KCTC 10944BP).
(A) 인간 CTRP1의 융합단백질을 사용하여 생쥐를 면역화하는 단계;

(B) 상기 면역화된 생쥐의 비장 세포를 마이엘로마 세포와 융합하여 배양하는 단계;

(C) 상기 융합된 하이브리도마 세포에서 인간 CTRP1에 특이적인 단일 클론항체를 생산하는 하이브리도마 세포를 선별하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 제 1 항에 의한 하이브리도마 세포 E21H7의 제조방법.
제 1 항에 의한 하이브리도마 세포 E21H7에 의해 만들어지는 인간 CTRP1 특이적인 IgG2a형 단일클론 항체.
제 3 항에 의한 단일클론 항체를 이용한 인간 CTRP1의 정성·정량 분석방법.
제 4 항에 있어서,

상기 인간 CTRP1은 인간 지방세포(adipocyte)에서 유래된 것을 특징으로 하는 인간 CTRP1의 정성·정량 분석방법.