CN106699899B - 用于获得Nrf1D蛋白抗体的免疫原、Nrf1D蛋白抗体及Elisa检测试剂盒 - Google Patents
用于获得Nrf1D蛋白抗体的免疫原、Nrf1D蛋白抗体及Elisa检测试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供用于获得Nrf1D蛋白抗体的免疫原、Nrf1D蛋白抗体及Elisa检测试剂盒，所述免疫原为先合成氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的多肽，以Sulfo‑SMCC为偶联剂，将所述多肽与玥孔戚血蓝蛋白偶联得到；所述抗体以所述免疫原为抗原，将所述抗原用弗氏完全佐剂乳化后免疫新西兰白兔，取免疫后的新西兰白兔血进行离心，收集离心后的上清液获得；所述Elisa检测试剂盒组分包括酶标板、包被液、封闭液、酶标二抗、TMB显色液、终止液、检测抗原和所述Nrf1D蛋白抗体，所述检测抗原为合成氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的多肽，以戊二醛为偶联剂，将所述多肽与牛血清白蛋白偶联获得。
Description
技术领域
本发明属于抗体技术领域，具体涉及用于获得Nrf1D蛋白抗体的免疫原、Nrf1D蛋白抗体及Elisa检测试剂盒。
背景技术
CNC-bZIP是bZIP转录因子的一个亚家族，该亚家族以一个大约40个氨基酸同源域为其特征，该区域与N末端的碱性亮氨酸拉链区域紧邻。从进化角度来看，具有这个同源域的蛋白在秀丽隐杆线虫(Skn1)、黑腹果蝇(cap‘n’collar)、鸡(ECH)[63]、小鼠(Bach)和人的发育过程中，都有广泛的参与。在人体内，目前已知的三个成员(NF-E2、TCF11/LCR-F1/Nrf1和Nrf2)以及它们在鼠科动物体内的同源蛋白都已在证明导致β球蛋白基因位点的谱系特异性表达机制的过程中被分离并鉴定。然而，只有NF-E2才有细胞类型的特异性，Nrf1和Nrf2均没有。相应敲除小鼠的数据和之前的研究(Nrf1结合位点在红色的胆色素原脱氨酶基因、血红素加氧酶1(HO1)基因和NAD(P)H:醌氧化还原酶的表达中起着重要的作用)均表明，这些因子广泛的参与哺乳动物的基因调控。研究发现：启动子元件和转录因子参与小鼠肥大细胞系CPII(用IgE+抗原(Ag)刺激)和小鼠胎儿树突状细胞系DC18(用IgG+Ag刺激)对TNFα的感应。在肥大细胞中，IgE+Ag响应元件被映射到一个与转录因子AP1和NF-ATP1和NF-AT(延伸的κ3/AP1+位点ATGAGCTCATGGGTTTCTCCACCACCAA；黑体部分是AP1和NF-AT位点)相互作用的28bp寡核苷酸上。在小鼠树突状细胞系DC18中，做相应的分析，发现了一个类似的位点(GAGCTCATGGGTTTCTCCACCAA，延伸的κ3/AP1-位点)，这个位点的5′2nt(AT)更短，因此该位点删除了AP1结合位点。在该细胞系中，可以观察到结合这个探针的Nrf1，而在肥大细胞中，使用凝胶转移分析法观察不到任何转录因子与该探针的相互作用。这种差异在功能上受到报告基因载体的5’启动子缺失的支持，该启动子被证明是完整AP1位点的诱导所必需的，但这仅限于肥大细胞而对树突状细胞无效。研究发现，收到IgE+Ag刺激后，在肥大细胞TNFα启动子的AP1复合体中，发现了与几种经典的AP1转录因子(c-jun、junD、fosB和ATF2)结合在一起的Nrf1或与其紧密相关的因子。使用PCR检测/克隆技术，在该细胞系中，已鉴定出Nrf1的六种剪接突变体。其中有几种删除了之前假定的起始和终止密码子；有些剪接突变体，例如Nrf1D，包含一个在bZIP区域发生改变的C末端，这导致了终止子的缺失。这个被改变的亮氨酸拉链区的表达干扰了TNFα对转录过程的诱导作用，这表明，该剪接变体确实能与活化的AP1/NF-AT复合物相互作用。但是目前面临最大的问题是尚未有合适的试剂能检测Nrf1D蛋白的表达情况。
发明内容
针对现有技术存在的上述不足，本发明要解决的技术问题是：针对现有技术中没有能够检测Nrf1D蛋白表达情况的抗体和相关检测试剂盒，而提供用于获得Nrf1D蛋白抗体的免疫原、Nrf1D蛋白抗体及Elisa检测试剂盒。
为了解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：用于获得Nrf1D蛋白抗体的免疫原，合成氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的多肽，以Sulfo-SMCC为偶联剂，将所述多肽与玥孔戚血蓝蛋白偶联，得到所述用于获得Nrf1D蛋白抗体的免疫原。
进一步，以所述免疫原为抗原，将所述抗原用弗氏完全佐剂乳化后免疫新西兰白兔，取免疫后的新西兰白兔血进行离心，收集离心后的上清液，获得Nrf1D蛋白粗抗体。
进一步，将所述抗原用弗氏完全佐剂乳化后分别于第1天、第15天、第29天、第43天和第53天免疫新西兰白兔，获得Nrf1D蛋白粗抗体。
作为优化，将所述抗原用弗氏完全佐剂乳化后颈背部皮下注射免疫新西兰白兔，每只新西兰白兔至少颈背部皮下注射8点进行免疫。
作为优化，对所述Nrf1D蛋白粗抗体进行纯化，获得所述Nrf1D蛋白抗体；所述纯化包括如下步骤：将氨基酸序列如SEQ ID NO.1的多肽连接到活化的SulfolinkResin上，制备抗原亲和柱，用PBS缓冲液对所述抗原亲和柱进行平衡，将过滤后的Nrf1D蛋白粗抗体过平衡处理后的抗原亲和柱，而后用PBS缓冲液再次进行柱平衡，最后用抗体洗脱液对抗原亲和柱进行洗脱，对洗脱液于280nm处进行吸光度检测，合并收集吸光度大于1.0的洗脱液并以PBS缓冲液为透析液进行透析，获得所述Nrf1D蛋白抗体；其中，所述抗体洗脱液为pH2.7、浓度为0.075g/mL的甘氨酸水溶液。
用于检测Nrf1D蛋白的Elisa检测试剂盒，其组分包括酶标板、包被液、封闭液、酶标二抗、TMB显色液和终止液，其组分还包括检测抗原和所述Nrf1D蛋白抗体；其中，所述检测抗原采用如下方法获得：合成氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的多肽，以戊二醛为偶联剂，将所述多肽与牛血清白蛋白偶联，获得所述检测抗原。
作为优化，所述包被液为碳酸钠和碳酸氢钠的混合水溶液，所述包被液的pH为9.6。
作为优化，所述封闭液由脱脂奶粉溶解于PBS缓冲液中获得。
作为优化，所述终止液为2mol/L的硫酸水溶液。
作为优化，所述酶标二抗为酶标羊抗兔二抗。
相比现有技术，本发明具有如下有益效果：
1、本发明选择Nrf1D的C端氨基酸序列合成多肽作为抗原，并以该抗原免疫兔获得本发明抗体，本发明获得的抗体能够特异性识别Nrf1D蛋白，氨基酸序列经过NCBI blast验证也仅只一致于该蛋白。
2、本发明还提供了一种用于检测Nrf1D蛋白的Elisa检测试剂盒，该试剂盒对Nrf1D蛋白具有特异性识别能力，能够检测样品中Nrf1D蛋白的表达情况。
3、本发明还经过蛋白western blotting实验对抗体进行验证，结果显示本发明Nrf1D蛋白抗体的特异性以及灵敏性都极高。
4、本发明抗体可以用来诊断、预防和/或治疗个体，如：人患者体内一种或多种与Nrf1、Nrf1D相关病症；以及可以用于调节有Nrf1D介导的抗氧化、抗炎症、蛋白酶体功能和调控糖脂代谢平衡反应中的用途。
附图说明
图1为Nrf1D蛋白抗体的westernblotting试验实验组检测图。
图2为Nrf1D蛋白抗体的westernblotting试验对照组检测图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。本实施案例在以本发明技术为前提下进行实施，现给出详细的实施方式和具体的操作过程来说明本发明具有创造性，但本发明的保护范围不限于以下的实施例。
一、实验材料
1、主要试剂:
Sulfo-SMCC、KLH、SulfolinkResin为美国Pierce公司产品，福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂为美国Sigma公司。
NaCl、KCl、Na2HPO4·12H2O、KH2PO4、Tris、Glycine、EDTA、TMB、DMSO、戊二醛等为国产分析纯试剂。
2、耗材：
透析袋为美国Viskase公司产品，截留分子量14kD。
P-10柱为美国BioRad公司产品。
3、仪器：
磁力搅拌器(上海梅颖浦)，旋转混合器(上海强运)，紫外/可见光分光光度计(上海奥普勒)，高速离心机(日立)
4、溶液配置：
1、PBS(磷酸缓冲盐)液：
①PBS贮存液(10×)配法：
NaCl 8.5g
KCl 0.2g
Na2HPO4·12H2O 2.85g(或Na2HPO4·2H2O 1.13g)
KH2PO40.27g
溶于100mL去离子水中，调节PH值至7.2。
②PBS使用液配法(1×)：
取PBS贮存液50mL加去离子水450mL混匀即可，置室温或4℃保存备用。
2、抗原包被液(CBS，1×)：
称取Na2CO31.59g，NaHCO32.93g，去离子水950mL，调节pH值至9.6，加去离子水定容至1000mL，4℃保存。
3、封闭液：
称取5g脱脂奶粉，溶解于100mL PBS缓冲液(上述PBS使用液)中，混匀，4℃保存备用(4℃保存不宜超过3天)。
4、TMB显色液：
①TMB贮存液：称取TMB粉末，用DMSO配成1.5mg/ml的贮存液，-20℃分装保存。
②NaAc缓冲液：配制200mM的NaAc溶液，用HAc调节pH值至5.3。
③H2O2溶液：配制质量浓度为0.03％的H2O2溶液。
④使用时按照TMB贮存液:NaAc缓冲液:H2O2溶液体积比为1:4:5的比例配制显色液，现配现用。
5、终止液(2M硫酸)
将100mL浓硫酸缓慢加入900mL水中(注意：必须往水中滴加浓硫酸)，室温保存备用。
6、抗体洗脱液：
称取7.5g甘氨酸，溶于100mL去离子水，用浓盐酸调节pH值到2.7；4度保存备用。
二、方法及步骤：
1.免疫流程：
1.1合成多肽：
NCBI检索小鼠Nrf1D完整的氨基酸序列，根据氨基酸序列选取合适的序列合成多肽片段如SEQ ID NO.1所示(CSQPVQPGLLEDSPGGGSEGQRQDSQVVGSRTT-NH2)。
1.2抗原：
将合成的多肽与KLH偶联(偶联剂为Sulfo-SMCC)作为免疫抗原，多肽与BSA偶联(偶联剂为戊二醛)作为检测抗原
1.3用PBS(上述PBS使用液)将免疫抗原分别稀释为1mg/mL，分装冻存于-20度冰箱。
1.4第1天，每种抗原取1mL抗原加入1mL福氏完全佐剂，乳化(检验乳化程度：将一滴乳化抗原液滴入生理盐水中，若不散开，表明已达到要求)，颈背部皮下多点(至少8点)注射，每种抗原免疫2只新西兰白兔。
1.5第15天，每种抗原取1mL抗原加入1mL福氏不完全佐剂，乳化(检验乳化程度：将一滴乳化抗原液滴入生理盐水中，若不散开，表明已达到要求)，颈背部皮下多点(至少8点)注射，每种抗原免疫2只新西兰白兔。
1.6第29天，每种抗原取1mL抗原加入1mL福氏不完全佐剂，乳化(检验乳化程度：将一滴乳化抗原液滴入生理盐水中，若不散开，表明已达到要求)，颈背部皮下多点(至少8点)注射，每种抗原免疫2只新西兰白兔。
1.7第43天，每种抗原取1mL抗原加入1mL福氏不完全佐剂，乳化(检验乳化程度：将一滴乳化抗原液滴入生理盐水中，若不散开，表明已达到要求)，颈背部皮下多点(至少8点)注射，每种抗原免疫2只新西兰白兔。
1.8第53天，颈动脉取血，将兔子处死。
1.9兔血在4度放置过夜，离心(4度，10000rpm)30分钟，收集上清液。
2.抗体纯化流程：
2.1多肽(上述SEQ ID NO.1所示氨基酸片段的多肽)连接到活化的SulfolinkResin上，制备抗原亲和柱，1mL SulfolinkResin偶联1mg多肽。
2.2亲和柱用10倍柱体积PBS(上述PBS使用液)平衡，流尽溶液；将上述步骤1离心后收集的上清液兔血清经0.45μm滤膜过滤。
2.3将过滤后的兔血清过处理好的抗原亲和柱，流尽溶液，收集流穿。
2.4用10倍柱体积PBS(上述PBS使用液)平衡，流尽溶液。
2.5加入5mL抗体洗脱液，分管收集洗脱液，每管1mL。
2.6收集的洗脱液检测280nm处的吸光度，吸光度大于1.0的组分合并，对PBS(上述PBS使用液)透析。
2.7透析后的抗体鉴定(紫外吸收法检测蛋白浓度，Elisa确定抗体效价)。
3.Elisa流程：
3.1包被：将包被抗原(如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的多肽与BSA偶联(偶联剂为戊二醛)得到的抗原)用CBS稀释为1μg/mL，加入酶标板中，每孔100μL，4℃过夜。
3.2封闭：将包被液弃去，每孔加入200μL封闭液(质量浓度为5％脱脂奶粉)，37℃放置1.5小时。
3.3加入样本：弃去封闭液，加入样品(兔血清对照品或者步骤2纯化后的抗体样品)，每孔100μL加入酶标板，37℃放置1小时。
3.4洗涤：用自来水冲洗10次，拍干。
3.5加入二抗：酶标羊抗兔用封闭液稀释至工作浓度(二抗与封闭液体积比1：2000)，每孔100ul加入酶标板，37℃放置30分钟。
3.6洗涤：用自来水冲洗10次，拍干。
3.7加入TMB显色底物：每孔100μL加入酶标板，37℃放置15分钟。
3.8加入终止液：每孔加入2M H2SO450μL。
3.9读数：将终止反应后的溶液用酶标仪OD450nm检测读数。结果如下表1所示，下表1中R1抗体和R2抗体为分别采用两只不同的兔子注射抗原得到的抗体，横坐标1250、2500、5000……80000为抗体与水的稀释体积比。
表1 Elisa检测结果
Elisa结果
从表1试验数据中可以看出本发明方法分离得到的抗体具有很好的特异性及灵敏性。
4.western blotting流程
①制备SDS-PAGE(聚丙烯酰胺)凝胶：
1)实验前，准备好实验所需的各种仪器(10μL/100μL/1mL/5mL移液器、100mL烧杯两个、1.5mm玻璃板、做胶的相关仪器)及试剂(质量浓度30％聚丙烯酰胺、ddH2O、1.5或1.0MTris、质量浓度10％SDS、质量浓度10％APS及TEMED等)。
2)将实验所要用到的1.0mm玻璃板洗净烘干后，固定于做胶的架子上。
3)根据蛋白的相对分子量制备10％浓度的分离胶(下层胶)及5％的浓缩胶(上层胶)，胶的配方依次如下(以1.5mm玻璃板为例)：
表2质量浓度10％的下层胶配方
表3质量浓度5％的上层胶配方
注：a.下层分离胶加好后，立刻用1mL甲醇液封，使分离胶上表面是与玻璃板边缘平行。室内温度不同，胶凝固时间不同，至分离胶与甲醇液面结合处呈现出明显的直线时，倒去甲醇，用滤纸吸干残留的甲醇，再加入上层浓缩胶，插入对应的梳子，放置于室温待其凝固后方可移动。b.做好上层浓缩胶后，要尽快擦上梳子，以免胶提前凝固。
②准备样品
从-20℃冰箱取出提取好的蛋白样品(实验组为Nrf1D蛋白，Nrf1D蛋白包含SEQ IDNO.1所示氨基酸序列；对照组为细胞超表达对照组Nrf1蛋白)，取50μL蛋白样至无菌的1.5mL离心管内，再向其中加入3×Loading Buffer 25μL，在管盖上标记好样品名称。在水浴锅中煮沸3min，瞬时离心使管壁及管盖上的液珠回落至管底，以保证蛋白浓度，备用。
③Runing Buffer(现配现用)
称取Glycine 14.4g，
base 3.03g，SDS 1g，加ddH2O至1L，在磁力搅拌器上充分搅拌至完全溶解。
④SDS-PAGE电泳
1)点样：把配好的凝胶放入电泳槽之中，加入配好的电泳缓冲液(RuningBuffer)，观察夹薄板的槽子液面会不会漏，调整好之后拔掉梳子，加入40μg的步骤②处理好的蛋白样品，在蛋白样品两侧可以加入不同体积的蛋白marker，区分上样顺序。
2)电泳：初始电压为50V，30min。使蛋白样品压的较平，之后换成100V，到溴酚蓝跑出去即可停止。
3)转膜：小心的撬开薄板，切去多余的凝胶，做好标记用直尺测量长度和宽度，剪出相应的PVDF膜，把凝胶小心的泡到转膜缓冲液之中，将剪好的PVDF膜泡到甲醇之中激活30s，然后泡到电泳缓冲液之中。将转膜夹板正极放到下面，从下面到上面依次放置白色海绵、3层滤纸、凝胶、PVDF膜、3层滤纸、黑色海绵。其中凝胶与PVDF之间不能有气泡。按照如上放置之后把转膜夹黑色面朝向转膜槽的黑色面，放好之后，加入电泳缓冲液，可以放一块冰袋进去。准备工作结束后把电泳槽放入适当的容器之中，周围放入碎冰已达到低温的效果，200mA，120min转膜。
4)封闭：转膜结束之后把膜做相应的标记，用TBST慢速的洗膜5min，弃去TBST加入事先配好的5％的脱脂奶粉，室温封闭1h。
5)孵一抗：孵育一抗之前，用TBST冲洗膜2次去除奶粉，加入用一抗稀释液配制的抗体(1:1500)，4℃过夜，所述抗体为上述步骤2纯化好的Nrf1D抗体。
6)洗膜：拿出装膜的盒子，在常温摇床上摇15min，之后收集相应的抗体，用TBST洗膜10min/次，共3次。
7)孵二抗：根据一抗的来源选择相应的二抗，37℃孵育1h。
8)洗膜：用TBST洗膜10min/次，共3次。
9)ECL显影：ECLA试剂与ECL B试剂按照(1:1)配制(最好避光配制)，将膜放到较平的容器里加入ECL工作液，在凝胶成像仪中显色。
Western blotting结果如图1(实验组)和图2(对照组)所示，可以看出本发明该抗体能够特异性识别Nrf1D蛋白，而不识别Nrf1蛋白(阴性对照)，且灵敏性特别好。
五、样品保存
根据使用需要将纯化后的Nrf1D抗体分装后保存于-20度以下，如需长期保存最好放置于-80度，避免反复冻融。
本发明的上述实施例仅仅是为说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其他不同形式的变化和变动。这里无法对所有的实施方式予以穷举。凡是属于本发明的技术方案所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。
序列1：SEQ ID NO.1免疫原的氨基酸序列，长33个氨基酸
CysSerGlnProValGlnProGlyLeuLeuGluAspSerProGlyGlyGlySerGluGlyGlnArgGlnAspSerGlnValValGlySerArgThrThr。
SEQUENCE LISTING
<110> 重庆大学；
<120> 用于获得Nrf1D蛋白抗体的免疫原、Nrf1D蛋白抗体及Elisa检测试剂盒
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
CysSerGlnProValGlnProGlyLeuLeu GluAspSerProGlyGlyGlySerGluGlyGlnArgGlnAspSerGlnValValGlySer ArgThrThr 33
Claims (8)
1.用于获得Nrf1D蛋白抗体的免疫原，其特征在于，合成氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的多肽，以Sulfo-SMCC为偶联剂，将所述多肽与玥孔戚血蓝蛋白偶联，得到所述用于获得Nrf1D蛋白抗体的免疫原。
2.Nrf1D蛋白抗体，其特征在于，以权利要求1所述免疫原为抗原，将所述抗原用弗氏完全佐剂乳化后分别于第1天、第15天、第29天、第43天和第53天颈背部皮下注射免疫新西兰白兔，每只新西兰白兔至少颈背部皮下注射8点进行免疫，取免疫后的新西兰白兔血进行离心，收集离心后的上清液，获得Nrf1D蛋白粗抗体。
3.根据权利要求2所述Nrf1D蛋白抗体，其特征在于，对所述Nrf1D蛋白粗抗体进行纯化，获得所述Nrf1D蛋白抗体；所述纯化包括如下步骤：将氨基酸序列如SEQ ID NO.1的多肽连接到活化的Sulfolink Resin上，制备抗原亲和柱，用PBS缓冲液对所述抗原亲和柱进行平衡，将过滤后的Nrf1D蛋白粗抗体过平衡处理后的抗原亲和柱，而后用PBS缓冲液再次进行柱平衡，最后用抗体洗脱液对抗原亲和柱进行洗脱，对洗脱液于280nm处进行吸光度检测，合并收集吸光度大于1.0的洗脱液并以PBS缓冲液为透析液进行透析，获得所述Nrf1D蛋白抗体；其中，所述抗体洗脱液为pH2.7、浓度为0.075g/mL的甘氨酸水溶液。
4.用于检测Nrf1D蛋白的Elisa检测试剂盒，其组分包括酶标板、包被液、封闭液、酶标二抗、TMB显色液和终止液，其特征在于，其组分还包括检测抗原和权利要求2~3任一所述Nrf1D蛋白抗体；其中，所述检测抗原采用如下方法获得：合成氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的多肽，以戊二醛为偶联剂，将所述多肽与牛血清白蛋白偶联，获得所述检测抗原。
5.根据权利要求4所述Elisa检测试剂盒，其特征在于，所述包被液为碳酸钠和碳酸氢钠的混合水溶液，所述包被液的pH为9.6。
6.根据权利要求4所述Elisa检测试剂盒，其特征在于，所述封闭液由脱脂奶粉溶解于PBS缓冲液中获得。
7.根据权利要求4所述Elisa检测试剂盒，其特征在于，所述终止液为2mol/L的硫酸水溶液。
8.根据权利要求4所述Elisa检测试剂盒，其特征在于，所述酶标二抗为酶标羊抗兔二抗。
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