CN114751976A - 一种用于制备鸡tfpi2多克隆抗体的多肽、人工抗原、多克隆抗体及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于多肽及免疫球蛋白领域，具体涉及一种用于制备鸡TFPI2多克隆抗体的多肽、人工抗原、多克隆抗体及应用。该多肽的氨基酸序列如SEQ NO.1或SEQ NO.2所示。本发明中，首次通过克隆出CDS区序列，挑选出两段氨基酸序列，利用该多肽可制备人工抗原，进而可通过动物免疫制备能特异性的识别鸡TFPI2蛋白的抗体。

Description

一种用于制备鸡TFPI2多克隆抗体的多肽、人工抗原、多克隆 抗体及应用
技术领域
本发明属于多肽及免疫球蛋白领域，具体涉及一种用于制备鸡TFPI2多克隆抗体的多肽、人工抗原、多克隆抗体及应用。
背景技术
组织因子途径抑制剂-2(Tissue factor path way inhibitor-2，TFPI2)最初是从人胎盘组织中分离出来的30-36kDa糖蛋白。TFPI2与基质相关丝氨酸蛋白酶抑制物，是Kunitz家族丝氨酸蛋白酶抑制剂，具有三个串联排列的Kunitz型抑制剂结构域(KD1，KD2和KD3)组成，人TFPI2位于7号染色体(7q22)，基因全长约8164bp，由5个外显子和4个内含子组成，每个Kunitz型结构域由单个外显子编码。编码213个氨基酸，其中包括一个22个氨基酸组成的信号肽。随后分别在鼠(chr6，230aa)、牛(chr4，234aa)和斑马鱼(chr19，233aa)等物种中氨基酸序列也被确定。我们发现在鸡上TFPI2位于2号染色体，由5个外显子和4个内含子组成。在人、大鼠和牛中，TFPI2通过KD1抑制多种丝氨酸蛋白酶参与的凝血和纤溶过程。TFPI2已被报道存在于各种体液中，如妊娠晚期产妇血清、卵巢卵泡液和男性精浆中，该基因还广泛表达于胎盘、心脏、肝脏、肾脏和胰腺等部位。
目前，在鸡上未见到有关TFPI2合成肽制备抗体的相关报道，以及TFPI2多克隆抗体的应用研究。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于制备鸡TFPI2多克隆抗体的多肽，可用于制备特异性好的鸡TFPI2多克隆抗体。
本发明的第二个目的在于提供一种人工抗原。
本发明的第三个目的在于提供一种鸡TFPI2多克隆抗体。
本发明的第四个目的在于提供鸡TFPI2多克隆抗体的应用。
为了实现以上目的，本发明的用于制备鸡TFPI2多克隆抗体的多肽的技术方案是：
一种用于制备鸡TFPI2多克隆抗体的多肽，所述多肽的氨基酸序列如SEQ NO.1或SEQ NO.2所示。
本发明的用于制备鸡TFPI2多克隆抗体的多肽，首次通过克隆出CDS区序列，挑选出两段氨基酸序列，利用该多肽可制备人工抗原，进而可通过动物免疫制备能特异性的识别鸡TFPI2蛋白的抗体。
本发明的人工抗原的技术方案是：
一种人工抗原，由上述多肽和载体蛋白偶联得到。
本发明的人工抗原，由上述合成肽和载体蛋白偶联得到，具有良好的免疫原性，可利用该抗原制备特异性好、效价高的多克隆抗体。
优选的，所述载体蛋白为钥孔血蓝蛋白(KLH)。
本发明的多克隆抗体的技术方案是：
一种鸡TFPI2多克隆抗体，由上述人工抗原免疫动物获得。
可将上述人工抗原注入新西兰大白兔体内，并最终制备出TFPI2多克隆抗体。该抗体可以特异性识别卵巢颗粒细胞(Granulosa Cells，GCs)及卵巢组织中TFPI2蛋白，可以为进一步开展TFPI2在鸡繁殖功能的研究奠定基础。
上述鸡TFPI2多克隆抗体在检测鸡TFPI2蛋白方面的应用。
优选的，可以利用上述鸡TFPI2多克隆抗体确定鸡TFPI2蛋白在鸡体内表达及分布定位。
附图说明
图1为鸡TFPI2基因CDS区在三个品种蛋鸡卵巢中PCR产物；M：DL2000 DNA Marker，1：海兰褐蛋鸡，2：固始蛋鸡，3：豫粉一号H系蛋鸡；
图2为鸡TFPI2基因核苷酸和蛋白序列(TFPI2基因CDS序列全长)；
图3为TFPI2蛋白亲/疏水性分析；
图4为TFPI2蛋白信号肽分析；
图5为TFPI2蛋白跨膜结构域分析；
图6为鸡TFPI2蛋白二级结构预测；e：红色线-延伸链，h：蓝色线-α-螺旋，c：紫色线-无规则卷曲；
图7为TFPI2蛋白三级结构预测；
图8为鸡TFPI2进化树分析图；采用MEGA 7.0邻接法(NJ)构建进化树；
图9为质谱(MS)鉴定多肽合成；
图10为高效液相色谱仪(HPLC)鉴定多肽合成；
图11为ELISA法抗原免疫血清灵敏性检测；
图12为抗体纯化后WB验证；OE：过表达，C：对照，Ovary：卵巢；
图13为TFPI2在鸡卵巢颗粒细胞免疫荧光定位结果；
图14为TFPI2在鸡卵巢免疫组化结果；初始卵泡(Primordial Follicles，PF)，基质(Stroma)。
具体实施方式
前期我们通过对针对自然群体的预产期(15W)、产蛋前期(20W)、产蛋高峰期(30W)、产蛋后期(68W)海兰褐蛋鸡卵巢组织RNA-seq数据，挖掘出与繁殖密切相关基因TFPI2，发现在其卵巢组织高表达，而且特异性表达于卵巢颗粒细胞。与NCBI数据库比对发现此基因属于预测基因，截至目前尚未有关于TFPI2在鸡上的报道。
为进一步揭示鸡TFPI2在鸡体内表达及分布定位，本发明根据扩出的CDS区所对应的氨基酸序列设计出两段多肽，通过使用合成肽并偶联血蓝蛋白(KLH)成功制备了TFPI2多克隆抗体，该抗体能特异性的识别鸡TFPI2蛋白，为我们进一步开展TFPI2在鸡繁殖功能的研究奠定了基础。
下面结合具体实施例对本发明的实施过程进行详细说明。
实施例1鸡TFPI2基因克隆及序列分析：
1.1海兰褐蛋鸡卵巢组织总RNA的提取
①分别取40mg冷冻保存组织于研钵中，加入液氮将组织充分研磨至粉末；
②将研磨好的样品加入已装有1mL Trizol试剂的离心管中，振荡混匀，冰上放置5-10min，使得核酸与蛋白完全分离；
③加入0.2mL氯仿，振荡15s或上下颠倒摇晃1min，冰上放置10min，在4℃离心机12000×g离心15min；
④离心完成的溶液分为三层，上层为水相层，中间为白色杂质层，下层为粉红色有机层；悬空吸取上层水相层转移至干净的离心管中，分别加入500μL异丙醇，-80℃放置30min；
⑤12000×g 4℃离心10min，弃上清；
⑥加入1mL质量百分比为75％乙醇洗涤沉淀，轻柔上下颠倒，使白色沉淀悬浮；7500×g 4℃离心5min，弃上清；
⑦重复操作⑥；
⑧晾干，加入RNase-freeH2O(20-30μl)。
1.2cDNA的合成
根据试剂盒(诺唯赞)要求进行反转录见表1和表2。
表1.基因组DNA去除
Figure BDA0003240318950000031
Figure BDA0003240318950000041
注：移液枪吹打混匀。42℃2min
表2.逆转录反应体系
样品(sample) 体积(volume)
5×HiScript III qRT SuperMix 4μl
第一步反应液 16μl
注：37℃，15min；85℃，5s。
1.3TFPI2基因CDS序列的扩增
根据NCBI数据库预测TFPI2基因CDS区设计引物，以上一步获得的卵巢cDNA为模板，用Oligo7设计并合成有Hind III和EcoR I酶切位点的引物，使用高保真酶进行PCR扩增，纯化回收，纯化回收后的片段和pcDNA3.1-EGFP质粒DNA双酶切，载体和TFPI2基因的连接，连接载体的转化，阳性克隆鉴定，鉴定序列正确的质粒进行摇菌，并将提取的质粒DNA于-20℃保存备用。
表3.TFPI2基因序列克隆引物信息表
Figure BDA0003240318950000042
注：下划线斜体表示保护碱基，加粗表示酶切位点。
目的序列PCR体系及程序如表4
表4.PCR反应体系
Figure BDA0003240318950000043
A尾添加：添加16.5μl 2xRapid Taq Master Mix；72℃，10min。
1.4胶回收根据Omega试剂盒说明书进行，步骤如下：
①通过琼脂糖凝胶电泳跑出产物条带，确定目的条带，并在切胶仪上裁出相应片段，放入1.5ml的EP管中，并进行称重。
②按照每1g凝胶加入1ml Binding Buffer，55℃-65℃水浴至凝胶完全溶解。
③将DNA凝胶混合液移至套在2ml收集管的HiBind DNA柱子中，10,000xg离心1min，弃去滤液。
④加入300ul Binding Buffer，10,000xg离心1min，弃滤液。
⑤加入700ul SPW Wash Buffer，10,000xg离心1min，弃滤液。
⑥重复步骤5。
⑦弃去滤液，13,000xg离心空柱2min。
⑧把柱子装在干净的1.5ml EP中，加入30ul Elution Buffer，室温静置2min。≥13，000xg离心2min洗脱出DNA。
1.5目的基因与pMD18-T载体连接
将上一步纯化回收的目的片段加A尾后，用T4连接酶连接pMD18T载体。具体连接体系见表5。
表5.目的基因与pMD18T载体连接体系
Figure BDA0003240318950000051
1.6阳性菌的挑选测序
挑选单一阳性单克隆菌，使用PCR的方法确认插入片段的长度后，接种于LB液体(含青链霉素)培养基中，37℃、180rpm/min振荡培养16h，抽取200μl菌液送尚亚生物公司进行测序鉴定。
1.7双酶切
将测序正确的目的序列及空载体进行酶切，根据所选Hind III和EcoR I两种酶的说明书进行酶切反应。反应体系见表6。
表6.双酶切反应体系
Figure BDA0003240318950000052
Figure BDA0003240318950000061
混合均匀后置于37℃恒温培养箱过夜。通过琼脂糖凝胶电泳DNA条带的大小检测酶切产物，确定酶切产物的正确性。
1.8TFPI2 CDS序列与pcDNA3.1-EGFP质粒的连接
将上一步回收的pcDNA3.1-EGFP和TFPI2目的片段产物用T4连接酶连接起来，严格按照连接酶说明书进行操作。具体步骤见表7。
表7.目的序列与pcDNA3.1-EGFP载体连接体系
Figure BDA0003240318950000062
反应条件及程序：16℃12h，然后进行转化试验。
1.9转化
①取50μL感受态细胞于1.5mL灭菌EP中，加入10μL连接产物，混匀后冰浴30min；
②42℃水浴中热激90s，快速转移到冰浴中3min；
③向EP管中加入800μl无双抗的LB液体培养基，置于37℃摇床上，180r/min培养1h；
④3,000r/min室温离心3min，弃去上清，剩余的重悬后，加到含20mg/ml氨苄青霉素的LB琼脂培养基上，划线；
⑤将平板倒置平板37℃温度下，培养过夜。
1.10阳性菌的挑选测序
阳性菌的挑选测序参考1.6。
1.11质粒的提取
将测序正确的含有目的质粒经摇菌后提取，具体步骤参考天根生化试剂盒说明书进行操作如下：
(1)柱平衡：向吸附柱CP3中加入600μl的平衡液BL，12,000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液。
(2)取15ml过夜培养的菌液，加入离心管中，12,000rpm离心1min，倒掉上清。
(3)向留有菌体沉淀的离心管中加入250μl溶液P1，涡旋振荡后加入250μl溶液P2，上下翻转6-8次。
(4)向离心管中加入600μl溶液P3，上下翻转6-8次，12,000rpm离心10min。
(5)收集的上清液到CP3中，12,000rpm离心1min。
(6)向吸附柱CP3中加入600μl漂洗液PW，12,000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液。
(7)重复操作步骤6。
(8)将吸附柱CP3放入收集管中,13,000rpm离心2min。
(9)将吸附柱CP3置于一个干净的EP管中，加入80μl ddH2O，室温静置2min，12,000rpm离心2min将质粒溶液收集到EP中，放入-20℃备用。
1.12序列分析
鸡TFPI2核酸和氨基酸序列分析用NCBI在线BLAST，TFPI2蛋白理化参数用ProtParm在线软件分析，信号肽用SignalP 4.1在线软件进行预测，TFPI2蛋白的二级结构和三级结构用在线软件SPOMA和Phyre 2预测，Mega7.0进行TFPI2基因进化树的构建。
结果：在NCBI数据库中发现TFPI2基因预测有两个转录本且差异只在于第五个外显子上有无三个碱基的区别；而后我们在海兰褐蛋鸡、固始蛋鸡和豫粉一号H系蛋鸡卵巢中克隆发现TFPI2基因的CDS区均只符合transcript variant X1，长度为720bp，蛋白序列包含240个氨基酸(见图1和图2)。
蛋白理化性质分析结果表明，鸡TFPI2蛋白的分子质量为26967.02，理论等电点PI＝9.14，为碱性蛋白。该蛋白共有240个氨基酸，其中(Asp+Glu)负电荷总数为21，正电荷残基(Arg+Lys)总数为37，分子式为C1171H1840N342O343S24，原子总数3720，编码氨基酸不稳定指数为49.04，脂肪族指数为58.41％，平均吸水性为-0.623，表明该蛋白质为不稳定蛋白且流动性较好(见表8)。
表8TFPI2蛋白理化性质分析
Figure BDA0003240318950000071
Figure BDA0003240318950000081
图3所示该氨基酸大部分为负值，平均亲水性为-0.8645，表明该蛋白为亲水性蛋白。经SignalP 5.0信号肽预测和TMHMM预测跨膜结构域，结果见图4和图5，表明鸡TFPI2的N端有信号肽且属于非跨膜蛋白。
如图6所示使用SPOMA在线软件预测鸡TFPI2蛋白的二级结构，结果发现无规则卷曲(Random coil,Cc)由130个氨基酸组成占整个二级结构的54.39％，是TFPI2蛋白二级结构的主要构成部分，α螺旋(Alpha helix,Hh)由55个氨基酸组成，占整个二级结构的23.01％，延伸链(Extended strand,Ee)由39个氨基酸组成，占整个二级结构的16.32％，B转角(Beta turn,Tt)由15个氨基酸组成占整个二级结构的6.28％。利用Phyre 2在线软件预测TFPI2蛋白三级结构发现，无规则卷曲为TFPI2蛋白结构的主要组成(图7)，与二级结构预测结果基本一致。如图8所示进化分析发现，其与火鸡关系最近，其次是鹦鹉。
实施例2鸡TFPI2多克隆抗体的制备
2.1多肽抗原的合成
(1)免疫原序列分析
根据已扩增出来的CDS序列，使用DNAstar软件选取亲水性，抗原性以及二级结构等多方面参数的分析，选择出2段综合参数较高的多肽序列作为备选多肽抗原序列见表9。
表9.多肽抗原序列信息
Figure BDA0003240318950000082
Figure BDA0003240318950000091
(2)树脂合成
取一定量2Cl树脂加入反应器中，再按照树脂：Fmoc-Arg(Pbf)-OH：DIEA＝1:1:2的比例加入氨基酸和碱，用DCM做溶剂反应3小时，然后用色谱级甲醇封端30min。
(3)序列合成
利用有机化学固相合成法(Fmoc保护的氨基酸，固相载体-树脂)，将相应规格的树脂，投放至干净反应器中，加入2倍量体积DMF(DCM)溶胀60min，弃掉DMF(DCM)，加入三倍量体积的20％哌啶溶液反应30min，而后弃掉20％哌啶溶液，用DMF清洗5次，取少量树脂在检测管内，滴入茚三酮溶液(A,B,C液)各两滴，110℃加热3分钟，树脂显阳性为Fmoc已脱除，按摩尔比3倍AA(表9)：6倍NMM：2.85倍HBTU(HATU)的顺序投放到反应器中，加入DMF。取少量树脂在检测管内，滴入茚三酮溶液(A,B,C液)各两滴，110℃加热3分钟，树脂显阴性，为反应完全。多肽序列全部组装完成后，用DMF*3，MeOH*2，DCM*2，MeOH*3清洗树脂后，放入干燥器过夜抽干。抽干的树脂按每克8-10ml加入切割液，放置摇床反应2h，而后用砂芯过滤，得到滤液，加入冰乙醚，使粗品析出，放入离心机沉淀，用乙醚重复清洗三次，纯化后得到多肽。
(3)用质谱(MS)分析和高效液相色谱仪(HPLC)检测合成的多肽如下图9和图10所示，表明多肽合成成功。
2.2KLH的活化及偶联
①KLH溶解：按表10比例将KLH复溶在已除气纯水中。
表10.反应体系
Figure BDA0003240318950000092
②加SMCC：按表11比例称取Sulfo-SMCC，加入KLH溶液。
表11.反应体系
Figure BDA0003240318950000093
③反应：KLH-Sulfo-SMCC溶液在室温缓慢搅拌60分钟。
④脱盐：KLH-Sulfo-SMCC溶液用脱盐柱去除游离的Sulfo-SMCC。脱盐柱用3个柱体积的交联缓冲液平衡，上样。待KLH-SMCC溶液进入胶床后，用交联缓冲液洗脱。通过测定280nm的光吸收值收集KLH-SMCC所在的蛋白峰液并收集此峰液。
⑤称取KLH-SMCC活化后的质量及所需多肽(多肽与KLH的重量比为1:1)。将多肽溶于除菌除气纯水中，而后将KLH-SMCC与多肽混合，4℃静音混合仪过夜。
⑥称取L-半胱氨钠.HCL(即L-半胱氨酸盐酸盐，用于封闭KLH上没有与多肽结合的位点)，半胱氨钠.HCL与KLH的重量比为2:1，4℃轻摇反应2小时。转移至透析袋，0.01Mpbs透析三次。收集透析袋中所有溶液，用少量PBS洗涤，收集。
⑦分装：按300μg进行分装，做好标记，放入样品盒。保存于-80℃冰箱。
2.3免疫前准备
根据免疫计划，多肽-KLH抗原，根据免疫类型准备好福氏佐剂，基础免疫使用完全福氏佐剂，加强免疫使用不完全福氏佐剂。将全部抗原吸入一支乳化用注射器，另一支注射器吸入与抗原液等体积的佐剂，用双联针头将两只注射器连接起来，用力将抗原液快速推入佐剂内(不能先将佐剂推入抗原液内)，然后反复推拉双联注射器，不低于300次。直至乳化完成。
2.4动物免疫及抗体纯化
如下表12按照实验计划免疫动物(包括基础免疫和加强免疫)。
免疫方法：
①将兔子从笼子中抓出放在操作台上，待其安静后再行抓取或进行其他操作；
②用弯头手术剪在背部左侧从前到后剪毛，宽度1-2cm。用75％酒精棉球消毒剪毛处皮肤。
③开始免疫，皮下注射8-10个部位，每个部位0.1ml抗原。
④特定天数检测后，收集腹水与protein G进行混合后装入层析柱，采用甘氨酸缓冲液(pH3.0)作为洗脱液，收集洗脱液，得到抗体。具体免疫天数及内容见表12。
表12.免疫内容
Figure BDA0003240318950000101
Figure BDA0003240318950000111
2.5ELISA测定抗体效价
①在96孔板中每孔加入100μl包被液稀释纯化的蛋白抗原，4℃过夜包被；
②弃去后，洗涤3次静置30s后弃去，拍干。
③将多克隆抗体按照不同稀释比1：2的连续梯度进行稀释，每孔加入100μl，37℃孵育2h。
④弃去后，洗涤3次静置30s后弃去，拍干。
⑤每孔加入100μl稀释的二抗，避光，37℃孵育2h。
⑥弃去后，洗涤3次静置30s后弃去，拍干。
⑦每孔中加入100μl底物液，避光，37℃孵育20min；
⑧每孔分别加入50μL终止液；而后用450nm波长测量吸光度。
最终结果：如图11所示，多克隆抗体在1:12800时效价仍然较高，可以满足后面实验需要。
2.6Western blotting检测多抗的特异性
(1)卵巢颗粒细胞的培养
①取30W健康的海兰褐蛋鸡5只，颈骨错位致死后，浸泡在提前准备好的新洁尔灭的消毒液(0.1％)中，浸泡大约两分钟，用无菌脱脂棉吸干消毒液，并用高压好的纱布包裹带进细胞间，用无菌的剪刀打开腹腔取出所有卵泡，并分装于含有5％青链霉素的PBS溶液中，标记好等级前和等级卵泡，放进生物安全柜中，用无菌的镊子和剪刀打开卵泡，并挤出卵黄放到含有3％青链霉素的PBS溶液中用无菌镊子甩出颗粒层。
②分别收集等级前颗粒层和等级颗粒层于1.5mlEP管中，用剪刀剪碎后收集到15ml管中，用无EDTA胰酶放入37℃，5％CO2培养箱中进行消化，消化10min。颗粒层消化好后加入10％FBS的DMEM高糖培养基终止消化，1500rpm离心5min，弃上清，加入PBS吹打洗涤，1500rpm离心5min，弃上清，加入10％FBS的DMEM高糖培养基重悬细胞，进行铺板培养。
③培养至细胞贴壁75％左右时进行后续实验。
(2)过表达载体的转染
将GCs种植于12孔板中培养，每组6个重复。当细胞在显微镜下观察，密度为70％左右即可进行转染试验，具体操作如下：
①使用1mL DMEM高糖培养基(无血清和双抗)对GCs进行饥饿处理30min。
②以脂质体TFPI2-pCDNA3.1-EGFP(μg)＝1:2比例，加入含有150μL Opti-DMEM的1.5mL EP管中，室温下静置5min，并加入1.6μL
Figure BDA0003240318950000121
LTX Reagent，混匀后，室温下静置25min；pCDNA3.1-EGFP(1000ng)质粒操作如上同。
(3)Western blotting试验步骤：
①蛋白提取
将组织块用PBS清洗后置于匀浆器中(细胞用PBS清洗)。加入蛋白提取试剂，冰浴后彻底匀浆。4℃，12000rpm离心5min，收集上清，即为总蛋白溶液。
②蛋白浓度检测
根据BCA试剂盒说明书检测蛋白浓度。
③总蛋白溶液变性
每个样品总蛋白溶液(25μg)加入5x loading buffer，涡旋混匀，98度加热10min。
a.细胞样品：离心，涡旋混匀后再离心，继续往后实验，如果不立即电泳，则放在-80度保存，使用前完全解冻后，涡旋混匀，离心后再点样。
b.组织样品：离心，将上清转移到一个新的EP管中，混匀后再离心，继续往后实验，如果不立即电泳，则放在-80度保存，使用前完全解冻后，涡旋混匀，离心后再点样。
④制胶
根据雅酶制胶试剂盒说明书进行，配制12.5％的电泳胶。
⑤电泳
将配置好的胶块放进SDS溶液中，轻轻拔出梳子，点入样品后，浓缩胶电压为80V，分离胶电压为120V，待条带到达玻璃板底部时结束电泳。
⑥转膜
PVDF膜置于甲醇中活化2min，将夹子的黑色面放入装有转移液的玻璃平皿中，从下到上依次放入海绵垫，滤纸，分离胶，PVDF膜，滤纸，海绵垫，排净气泡，设定电流为250mA，冰浴中转膜1.5h。
⑦封闭
将转好的PVDF膜放入适量5％脱脂奶粉中，于脱色摇床上封闭2h。
⑧一抗孵育和二抗孵育
将封闭好的PVDF膜取出，放入TBST溶液中洗3次/5min；然后PVDF膜装入杂交袋中，分别加入用一抗稀释液稀释好的TFPI2抗体(以多肽A制备的多克隆抗体、以多肽B制备的多克隆抗体)4℃孵育过夜。将孵育过夜的PVDF膜放入TBST溶液中洗3次/5min；加入HRP-Goatanti Rabbit单克隆抗体(Elabscience)。
⑨发光检测
将PVDF膜放入TBST溶液中洗3次，每次5min，根据雅酶ECL强显色试剂盒，配制1：1的溶液A和溶液B，滴加在PVDF膜上显影。用Odyssey FC近红外蛋白仪处理系统分析目标带的光密度值。
结果：如图12所示通过Western blotting检测了TFPI2多克隆抗体的特异性，该抗体能识别TFPI2蛋白(<35kDa)。在过表达(Over expression,OE)泳道，对照(Control,C)泳道和卵巢(Ovary)泳道分别检测到了TFPI2的表达，且OE泳道条带显著高于C泳道。
实验例TFPI2多克隆抗体的初步应用
实验例1
TFPI2在鸡卵巢颗粒细胞免疫荧光定位
(1)24孔板中细胞生长密度达到80％以上时，用PBS清洗细胞3次/5min。
(2)每孔加200μL预冷的4％多聚甲醛，室温固定20min。
(3)加入适量PBS，室温下PBS清洗三次，5min/次。
(4)弃去PBS，每孔加入500μL 1％Triton破膜液，室温下破膜20min。吸干破膜液，室温下用PBS洗三次，5min/次。
(5)4％BSA封闭1h，200μL/孔，室温下封闭30min。
(6)弃去封闭液，加入200μL TFPI2抗体(以多肽A制备的多克隆抗体，稀释比：1:50)4℃孵育过夜，
(7)PBS清洗3次/3min，然后每孔加入1:50FITC，室温下避光孵育2h，用PBS洗3次/5min。
(8)加入1μg/ml DAPI，孵育5min,用PBS洗3次，5min/次。
(9)镜检。
结果：采样免疫荧光(IF)的方法，在颗粒细胞进行了验证，如图13所示，表明TFPI2蛋白主要定位于培养的GCs的胞浆中。
实验例2TFPI2蛋白在性成熟蛋鸡卵巢中的分布定位
(1)将在石蜡中固定好的组织进行切片，依次将切片放入二甲苯进行脱蜡，并将切片放入一系列乙醇溶液中再水化。
(2)组织切片在柠檬酸抗原修复缓冲液(PH6.0)的修复盒中进行抗原修复，后将玻片洗涤3次/5min。
(3)切片放入3％双氧水溶液，室温避光孵育25min后洗涤3次/5min。
(4)滴加3％BSA覆盖组织，室温封闭30min。
(5)在切片上滴加一抗(以多肽A制备的多克隆抗体，稀释比为1:500)，4℃孵育过夜。
(6)阴性对照采用抗原阻断，将TFPI2抗原和抗体结合后滴加在玻片上。
(7)滴加二抗(HRP标记)覆盖组织，室温孵育50min。
(8)在圈内滴加新鲜配制的DAB显色液。
(9)苏木素复染3min左右，水洗。
(10)将切片依次放入一系列乙醇溶液中脱水透明，然后中性树胶封片。
(11)显微镜镜检。
结果：如图14所示，TFPI2蛋白在鸡卵巢中表达于初始卵泡(PF)和基质(Stroma)中。
<110> 河南农业大学
<120> 一种用于制备鸡TFPI2多克隆抗体的多肽、人工抗原、多克隆抗体及应用
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<221> 多肽A
<400> 1
Cys Ala Ala Leu Ala Pro Arg Gly Leu Thr Glu Lys Gln Arg
1 5 10
<210> 2
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<221> 多肽B
<400> 2
Tyr Gly Asn Gly Asn Asn Phe Lys Asp Leu Gln Ser Cys
1 5 10

Claims (6)

1.一种用于制备鸡TFPI2多克隆抗体的多肽，其特征在于：所述多肽的氨基酸序列如SEQ NO.1或SEQ NO.2所示。
2.一种人工抗原，其特征在于，由权利要求1所述的多肽和载体蛋白偶联得到。
3.如权利要求2所述的人工抗原，其特征在于，所述载体蛋白为钥孔血蓝蛋白。
4.一种鸡TFPI2多克隆抗体，其特征在于，由权利要求2或3所述的人工抗原免疫动物获得。
5.一种如权利要求4所述的鸡TFPI2多克隆抗体在检测鸡TFPI2蛋白方面的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，确定鸡TFPI2蛋白在鸡体内表达及分布定位。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117050172A (zh) * 2023-08-18 2023-11-14 河南农业大学 一种鸡agrp多克隆抗体及其制备方法和应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2000128803A (ja) * 1998-10-19 2000-05-09 Shionogi & Co Ltd ティッシュ・ファクター・パスウェイ・インヒビター−２抗体
JP2013061321A (ja) * 2011-08-19 2013-04-04 Yokohama City Univ 組織因子経路阻害因子２（ｔｆｐｉ２）測定による卵巣明細胞腺癌の検査方法および検査薬
US20170322218A1 (en) * 2014-11-27 2017-11-09 Public University Corporation Yokohama City University Method and reagent for detecting ovarian clear cell adenocarcinoma
CN110194797A (zh) * 2019-06-12 2019-09-03 江苏省家禽科学研究所 一种鸡mlp蛋白多克隆抗体及其制备方法与应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2000128803A (ja) * 1998-10-19 2000-05-09 Shionogi & Co Ltd ティッシュ・ファクター・パスウェイ・インヒビター−２抗体
JP2013061321A (ja) * 2011-08-19 2013-04-04 Yokohama City Univ 組織因子経路阻害因子２（ｔｆｐｉ２）測定による卵巣明細胞腺癌の検査方法および検査薬
US20170322218A1 (en) * 2014-11-27 2017-11-09 Public University Corporation Yokohama City University Method and reagent for detecting ovarian clear cell adenocarcinoma
CN110194797A (zh) * 2019-06-12 2019-09-03 江苏省家禽科学研究所 一种鸡mlp蛋白多克隆抗体及其制备方法与应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MATEUSZ B UZALA ET AL: "A Pilot Study of Tissue Factor-Tissue Factor Pathway Inhibitor Axis and Other Selected Coagulation Parameters in Broiler Chickens Administered in Ovo with Selected Prebiotics", 《FOLIA BIOLOGICA(KRAKÓW)》 *
李冲: "鸡卵巢颗粒细胞中TFPI2基因的表达调控及功能研究", 《万方数据》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117050172A (zh) * 2023-08-18 2023-11-14 河南农业大学 一种鸡agrp多克隆抗体及其制备方法和应用

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