JP2010233542A - Rage遺伝子の2種類のスプライシングバリアントを区別して増幅可能なプライマーセット及びプローブ - Google Patents
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Abstract
【解決手段】mRAGE用フォワードプライマーと、mRAGE用リバースプライマーと、mRAGE検出用プローブと、esRAGE用フォワードプライマーと、esRAGE用リバースプライマーと、esRAGE検出用プローブとを組み合わせて使用することにより、mRAGEとesRAGEの成熟mRNAをPCRにより識別して検出・定量することができる。
【選択図】図6
Description
配列番号1の第1015番のグアニン(g)と第1016番のグアニン(g)とを少なくとも含む、塩基数15〜25の連続した部分配列からなるポリヌクレオチドであるmRAGE用フォワードプライマーと、
配列番号1の第1142番のグアニン(g)と第1143番のグアニン(g)とを少なくとも含む、塩基数15〜25の連続した部分配列の相補配列からなるポリヌクレオチドであるmRAGE用リバースプライマーと
を含むプライマーセット。
(2) 膜結合型の後期糖化反応生成物受容体ポリペプチド(mRAGE)の成熟mRNAを検出するためのキットであって、
(1)のプライマーセットと、
配列番号1の第1041番〜第1142番の領域内に含まれる、塩基数15〜25の連続した部分配列からなり、5’末端及び3’末端の一方に蛍光物質が結合され、他方に消光物質が結合されたポリヌクレオチド、又は該ポリヌクレオチドの一部分が等価なRNAに置換されたDNA/RNAキメラポリヌクレオチドであるmRAGE検出用プローブと
を含むキット。
(3) 内在性分泌型の後期糖化反応生成物受容体ポリペプチド(esRAGE)の成熟mRNAに対応するcDNAをポリメラーゼ連鎖反応により増幅するためのプライマーセットであって、
配列番号2の第1015番のグアニン(g)と第1016番のグアニン(g)とを少なくとも含み、かつ、第995番〜第1027番の領域内に含まれる、塩基数15〜25の連続した部分配列からなるポリヌクレオチドであるesRAGE用フォワードプライマーと、
配列番号2の第1097番のグアニン(g)と第1098番のグアニン(g)とを少なくとも含む、塩基数15〜25の連続した部分配列の相補配列からなるポリヌクレオチドであるesRAGE用リバースプライマーと
を含むプライマーセット。
(4) 内在性分泌型の後期糖化反応生成物受容体ポリペプチド(esRAGE)の成熟mRNAを検出するためのキットであって、
(3) のプライマーセットと、
配列番号2の第1011番〜第1070番の領域内に含まれる、塩基数15〜35の連続した部分配列の相補配列からなり、5’末端及び3’末端の一方に蛍光物質が結合され、他方に消光物質が結合されたポリヌクレオチド、又は該ポリヌクレオチドの一部分が等価なRNAに置換されたDNA/RNAキメラポリヌクレオチドであるesRAGE検出用プローブと
を含むキット。
(5) (2)のキットと、(4) のキットとが組み合わされた、膜結合型の後期糖化反応生成物受容体ポリペプチド(mRAGE)及び内在性分泌型の後期糖化反応生成物受容体ポリペプチド(esRAGE)の成熟mRNAを検出するためのキット。
(6) (2)のキット又は(5)のキットを用いて、膜結合型の後期糖化反応生成物受容体ポリペプチド(mRAGE)の成熟mRNAと、内在性分泌型の後期糖化反応生成物受容体ポリペプチド(esRAGE)の成熟mRNAとを含んでいる可能性のある試料中のmRAGEの成熟mRNAを検出する方法。
(7) (4)のキット又は(5)のキットを用いて、膜結合型の後期糖化反応生成物受容体ポリペプチド(mRAGE)の成熟mRNAと、内在性分泌型の後期糖化反応生成物受容体ポリペプチド(esRAGE)の成熟mRNAとを含んでいる可能性のある試料中のesRAGEの成熟mRNAを検出する方法。
(8) (5)のキットを用いて、膜結合型の後期糖化反応生成物受容体ポリペプチド(mRAGE)の成熟mRNAと、内在性分泌型の後期糖化反応生成物受容体ポリペプチド(esRAGE)の成熟mRNAとを含んでいる可能性のある試料中のesRAGE及びesRAGEの成熟mRNAを検出する方法。
配列番号1には、スプライシング後のmRAGEmRNAに対応するcDNAの塩基配列(Genbank Accession Number NM_001136)を示す。配列番号1の第847〜988番の領域がエクソン8、第989〜1015番の領域がエクソン9、第1016〜1142番の領域がエクソン10、第1143〜1414番の領域がエクソン11に相当する。
mRAGE検出用プローブとしては、配列番号1の第1041番〜第1142番の領域内に含まれる、塩基数15〜25の連続した部分配列からなり、5’末端及び3’末端の一方に蛍光物質が結合され、他方に消光物質が結合されたポリヌクレオチドが好ましく、配列番号1の第1076番〜第1105番の領域内に含まれる、塩基数15〜25の連続した部分配列からなり、5’末端及び3’末端の一方に蛍光物質が結合され、他方に消光物質が結合されたポリヌクレオチドがより好ましく、配列番号1の第1179番〜第1102番の領域内に含まれる、塩基数19〜21の連続した部分配列からなり、5’末端及び3’末端の一方に蛍光物質が結合され、他方に消光物質が結合されたポリヌクレオチドがより好ましい。具体的には、配列番号15で表される塩基配列からなり、5’末端及び3’末端の一方に蛍光物質が結合され、他方に消光物質が結合されたポリヌクレオチドが好ましい。
配列番号2には、スプライシング後のesRAGE mRNAに対応するcDNAの塩基配列(Genbank Accession Number AB061668)を示す。配列番号2の第847〜988番の領域がエクソン8、第989〜1015番の領域がエクソン9、第1016〜1097番の領域が付加エクソン9、第1098番から3’末端側の領域がエクソン11に相当する。なお、Genbank Accession Number AB061668ではエクソン11の3’末端側は記載されていないが、実際にはesRAGE cDNAは配列番号1の第1143〜1414番と同一配列のエクソン11を有する。
esRAGE検出用プローブとしては、特に、配列番号2の第1011番〜第1070番の領域内に含まれる、塩基数15〜35の連続した部分配列の相補配列からなり、5’末端及び3’末端の一方に蛍光物質が結合され、他方に消光物質が結合されたポリヌクレオチドが好ましく、配列番号2の第1011番〜第1050番の領域内に含まれる、塩基数15〜35の連続した部分配列の相補配列からなり、5’末端及び3’末端の一方に蛍光物質が結合され、他方に消光物質が結合されたポリヌクレオチドがより好ましく、配列番号2の第1014番〜第1043番の領域内に含まれる、塩基数27〜29の連続した部分配列の相補配列からなり、5’末端及び3’末端の一方に蛍光物質が結合され、他方に消光物質が結合されたポリヌクレオチドがより好ましい。具体的には、配列番号22で表される塩基配列からなり、5’末端及び3’末端の一方に蛍光物質が結合され、他方に消光物質が結合されたポリヌクレオチドが好ましい。
本発明のプライマーセットを用いることにより、mRAGE成熟mRNA又はcDNAと、esRAGE成熟mRNA又はcDNAとを含んでいる可能性のある被検試料から、一方のみを選択的に増幅することができる。また、両者を増幅した後に選択的に検出することもできる。
本発明によれば、mRAGEの発現量と、esRAGEの発現量とを区別して検出することが可能であるため、生体組織又は細胞中でのmRAGE量及びesRAGE量を高精度に評価することが可能となる。
膜型RAGE(mRAGE)と 分泌型RAGE(esRAGE)とを識別して検出することができるリアルタイムPCR用のプライマーセットおよびプローブの組み合わせを検討した。
mRAGEとesRAGEが共通して有するエクソン8のセンス鎖の部分配列となるようにフォワードプライマーを設計し、mRAGEとesRAGEが共通して有するエクソン11のアンチセンス鎖の部分配列となるようにリバースプライマーを設計した。プローブは、mRAGE、esRAGEのそれぞれに特有のエクソン・ジャンクションを含む領域のセンス鎖の部分配列となるように設計した。これらのプライマーセット、検出プローブの構成を図4に模式図を示す。
図13に、mRAGE cDNAプラスミド1x104コピーを含有する試料を鋳型とし、フォワードプライマーとしてRAGE 5’を、リバースプライマーとしてRAGE 3’を、プローブとしてmRAGE-FAM1を使用してリアルタイムPCRを行ったときの、サイクル数と蛍光強度の関係を示す。Ct値は29であった。
mRAGEとesRAGEが共通して有するエクソン8とエクソン9とのエクソン・ジャンクションを含む領域のセンス鎖の部分配列となるようにフォワードプライマーを設計し、mRAGEとesRAGEが共通して有するエクソン11のアンチセンス鎖の部分配列となるようにリバースプライマーを設計した。プローブは、mRAGE、esRAGEのそれぞれに特有のエクソンであるエクソン10、追加エクソン9のセンス鎖の部分配列となるように設計した。これらのプライマーセット、検出プローブの構成を図5に模式図を示す。
esRAGE cDNAプラスミドを1x102、104、106、108コピー含有する試料を鋳型として、上記フォワードプライマー、リバースプライマー、esRAGE用プローブを用いてリアルタイムPCRを行ったところ、コピー数の増加に応じてCt値が減少し、正常な検量線を作成することができた(図15、16)。
mRAGE増幅用フォワードプライマーは、mRAGEに特異的なエクソン9とエクソン10とのエクソン・ジャンクションを含む領域のセンス鎖の部分配列となるように設計した。mRAGE増幅用リバースプライマーは、mRAGEに特異的なエクソン10とエクソン11とのエクソン・ジャンクションを含む領域のアンチセンス鎖の部分配列となるように設計した。mRAGE検出用プローブは、mRAGEに特異的なエクソン10のセンス鎖の部分配列となるように設計した。
mRAGE cDNAプラスミドを1 x 102コピー、1 x 104コピー、または1 x 106コピー含有する試料を鋳型とし、上記mRAGE増幅用フォワードプライマー(mRAGE 5’J-1、mRAGE 5’J-2、またはmRAGE 5’J-3)、リバースプライマー(mRAGE 3’J)、プローブ(mRAGE-FAM2)を用いてリアルタイムPCRを行った。更に、1 x 105コピーのesRAGE cDNAプラスミドを共存させた試料を用いて同様にリアルタイムPCRを行った。増幅プロットを図21、23、25に、検量線を図22、24、26に示す。
結果を次表にまとめる
esRAGE cDNAプラスミドを1 x 104コピー、1 x 106または1 x 108コピー含有する試料を鋳型とし、上記esRAGE増幅用フォワードプライマー(esRAGE 5’J-1、esRAGE 5’J-2、esRAGE 5’J-3、またはesRAGE 5’J-4)、リバースプライマー(esRAGE 3’J-1、またはesRAGE 3’J-2)、プローブ(esRAGE-AS-Quasar)を用いてリアルタイムPCRを行った。更に、2 x 108コピーのmRAGE cDNAプラスミドを共存させた試料を用いて同様にリアルタイムPCRを行った。ただし、esRAGE増幅用フォワードプライマーとしてesRAGE 5’J-1を、リバースプライマーとしてesRAGE 3’J-1を用いた場合については、esRAGE cDNAプラスミドを1 x 102コピー、1 x 104コピー、または1 x 106コピー含有し、mRAGE cDNAプラスミドが含まれない試料を鋳型としてリアルタイムPCRを行った。増幅プロットを図27〜31、33、35、37に示す。増幅が進行した場合には検量線を作成した。作成された検量線を図32、34、36、38に示す。
結果を次表にまとめる
CMV(cytomegalovirus)プロモーターの制御下にEGFP(enhanced green fluorescence protein)とヒトRAGE遺伝子 (Genbank Accession No. D28769)のうち、エクソン8〜11およびそれらの間のイントロンを含む領域(ミニ遺伝子)を連結した構築物を含む発現プラスミド(pEGFP-RAGEmg)を調製した(図3)。当該発現プラスミドをエレクトロポーレーション法によりヒト微小血管内皮初代培養細胞(human microvascular endothelial cell, HMVEC)に導入した。HMVEC細胞を5%二酸化炭素存在下、37℃で48時間培養した。本試験では、図3に示す野生型ミニ遺伝子および、その付加エクソン(AE) 9領域に5種類の変異(変異1〜5)を導入したミニ遺伝子を用意し、それぞれをHMVECにトランスフェクションして、esRAGEの発現量、mRAGEの発現量をそれぞれ調べた。変異1〜5の導入箇所は図39の枠で囲った部分である。変異1〜5導入後の配列を図39の各枠内の下段に示す。1種類の変異について6回の試験を行った。何もトランスフェクションされていないHMVECをサンプル1〜6、野生型ミニ遺伝子をトランスフェクションしたHMVECをサンプル7〜12、変異1が導入されたミニ遺伝子をトランスフェクションしたHMVECをサンプル13〜18、変異2が導入されたミニ遺伝子をトランスフェクションしたHMVECをサンプル19〜24、変異3が導入されたミニ遺伝子をトランスフェクションしたHMVECをサンプル25〜30、変異4が導入されたミニ遺伝子をトランスフェクションしたHMVECをサンプル31〜36、変異5が導入されたミニ遺伝子をトランスフェクションしたHMVECをサンプル37〜42とした。
精製されたtotal RNAをAffinityScriptTM QPCR cDNA Synthesis Kit (Agilent Technologies社)を用い、キット添付のランダム・ヘキサマーをプライマーとして逆転写反応を行い、cDNAを合成した。逆転写反応の温度・時間は標準の条件である42℃、15分で行った。
配列番号4: プライマー
配列番号5: プローブ
配列番号6: プローブ
配列番号7: プライマー
配列番号8: プライマー
配列番号9: プローブ
配列番号10: プローブ
配列番号11: プライマー
配列番号12: プライマー
配列番号13: プライマー
配列番号14: プライマー
配列番号15: プローブ
配列番号16: プライマー
配列番号17: プライマー
配列番号18: プライマー
配列番号19: プライマー
配列番号20: プライマー
配列番号21: プライマー
配列番号22: プローブ
Claims (16)
- 膜結合型の後期糖化反応生成物受容体ポリペプチド(mRAGE)の成熟mRNAに対応するcDNAをポリメラーゼ連鎖反応により増幅するためのプライマーセットであって、
配列番号1の第1015番のグアニン(g)と第1016番のグアニン(g)とを少なくとも含む、塩基数15〜25の連続した部分配列からなるポリヌクレオチドであるmRAGE用フォワードプライマーと、
配列番号1の第1142番のグアニン(g)と第1143番のグアニン(g)とを少なくとも含む、塩基数15〜25の連続した部分配列の相補配列からなるポリヌクレオチドであるmRAGE用リバースプライマーと
を含むプライマーセット。 - mRAGE用フォワードプライマーが、配列番号1の第1006番〜第1035番の領域内に含まれる、塩基数15〜25の連続した部分配列からなるポリヌクレオチドであり、
mRAGE用リバースプライマーが、配列番号1の第1126番〜第1155番の領域内に含まれる、塩基数15〜25の連続した部分配列の相補配列からなるポリヌクレオチドである
請求項1のプライマーセット。 - mRAGE用フォワードプライマーが、配列番号11、12又は13で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドであり、
mRAGE用リバースプライマーが、配列番号14で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドである
請求項2のプライマーセット。 - 膜結合型の後期糖化反応生成物受容体ポリペプチド(mRAGE)の成熟mRNAを検出するためのキットであって、
請求項1〜3のいずれかのプライマーセットと、
配列番号1の第1041番〜第1142番の領域内に含まれる、塩基数15〜25の連続した部分配列からなり、5’末端及び3’末端の一方に蛍光物質が結合され、他方に消光物質が結合されたポリヌクレオチド、又は該ポリヌクレオチドの一部分が等価なRNAに置換されたDNA/RNAキメラポリヌクレオチドであるmRAGE検出用プローブと
を含むキット。 - mRAGE検出用プローブが、配列番号1の第1076番〜第1105番の領域内に含まれる、塩基数15〜25の連続した部分配列からなり、5’末端及び3’末端の一方に蛍光物質が結合され、他方に消光物質が結合されたポリヌクレオチド、又は該ポリヌクレオチドの一部分が等価なRNAに置換されたDNA/RNAキメラポリヌクレオチドである、請求項4のキット。
- mRAGE検出用プローブが、配列番号15で表される塩基配列からなり、5’末端及び3’末端の一方に蛍光物質が結合され、他方に消光物質が結合されたポリヌクレオチド、又は該ポリヌクレオチドの一部分が等価なRNAに置換されたDNA/RNAキメラポリヌクレオチドである、請求項5のキット。
- 内在性分泌型の後期糖化反応生成物受容体ポリペプチド(esRAGE)の成熟mRNAに対応するcDNAをポリメラーゼ連鎖反応により増幅するためのプライマーセットであって、
配列番号2の第1015番のグアニン(g)と第1016番のグアニン(g)とを少なくとも含み、かつ、第995番〜第1027番の領域内に含まれる、塩基数15〜25の連続した部分配列からなるポリヌクレオチドであるesRAGE用フォワードプライマーと、
配列番号2の第1097番のグアニン(g)と第1098番のグアニン(g)とを少なくとも含む、塩基数15〜25の連続した部分配列の相補配列からなるポリヌクレオチドであるesRAGE用リバースプライマーと
を含むプライマーセット。 - esRAGE用フォワードプライマーが、配列番号2の第1001番〜第1025番の領域内に含まれる、塩基数15〜25の連続した部分配列からなるポリヌクレオチドであり、
esRAGE用リバースプライマーが、配列番号2の第1081番〜第1115番の領域内に含まれる、塩基数15〜25の連続した部分配列の相補配列からなるポリヌクレオチドである、
請求項7のプライマーセット。 - esRAGE用フォワードプライマーが、配列番号18又は19で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドであり、
esRAGE用リバースプライマーが、配列番号20又は21で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドである
請求項8のプライマーセット。 - 内在性分泌型の後期糖化反応生成物受容体ポリペプチド(esRAGE)の成熟mRNAを検出するためのキットであって、
請求項7〜9のいずれかのプライマーセットと、
配列番号2の第1011番〜第1070番の領域内に含まれる、塩基数15〜35の連続した部分配列の相補配列からなり、5’末端及び3’末端の一方に蛍光物質が結合され、他方に消光物質が結合されたポリヌクレオチド、又は該ポリヌクレオチドの一部分が等価なRNAに置換されたDNA/RNAキメラポリヌクレオチドであるesRAGE検出用プローブと
を含むキット。 - esRAGE検出用プローブが、配列番号2の第1011番〜第1050番の領域内に含まれる、塩基数15〜35の連続した部分配列の相補配列からなり、5’末端及び3’末端の一方に蛍光物質が結合され、他方に消光物質が結合されたポリヌクレオチド、又は該ポリヌクレオチドの一部分が等価なRNAに置換されたDNA/RNAキメラポリヌクレオチドである、請求項10のキット。
- esRAGE検出用プローブが、配列番号22で表される塩基配列からなり、5’末端及び3’末端の一方に蛍光物質が結合され、他方に消光物質が結合されたポリヌクレオチド、又は該ポリヌクレオチドの一部分が等価なRNAに置換されたDNA/RNAキメラポリヌクレオチドである、請求項11のキット。
- 請求項4〜6のいずれかのキットと、請求項10〜12のいずれかのキットとが組み合わされた、膜結合型の後期糖化反応生成物受容体ポリペプチド(mRAGE)及び内在性分泌型の後期糖化反応生成物受容体ポリペプチド(esRAGE)の成熟mRNAを検出するためのキット。
- 請求項4〜6のいずれかのキット又は請求項13のキットを用いて、膜結合型の後期糖化反応生成物受容体ポリペプチド(mRAGE)の成熟mRNAと、内在性分泌型の後期糖化反応生成物受容体ポリペプチド(esRAGE)の成熟mRNAとを含んでいる可能性のある試料中のmRAGEの成熟mRNAを検出する方法。
- 請求項10〜12のいずれかのキット又は請求項13のキットを用いて、膜結合型の後期糖化反応生成物受容体ポリペプチド(mRAGE)の成熟mRNAと、内在性分泌型の後期糖化反応生成物受容体ポリペプチド(esRAGE)の成熟mRNAとを含んでいる可能性のある試料中のesRAGEの成熟mRNAを検出する方法。
- 請求項13のキットを用いて、膜結合型の後期糖化反応生成物受容体ポリペプチド(mRAGE)の成熟mRNAと、内在性分泌型の後期糖化反応生成物受容体ポリペプチド(esRAGE)の成熟mRNAとを含んでいる可能性のある試料中のesRAGE及びesRAGEの成熟mRNAを検出する方法。
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