JP2008086313A - パーレカンドメインiスプライシング変異体の治療および診断への利用 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】試料中のパーレカンドメインI遺伝子のスプライシング変異体の検出および/または定量法であって、パーレカンドメインIのスプライシング変異体の増幅および検出において、配列5’CATCCAGCTCCCGTGTCTAC3’を有するプライマーと配列5’CTGAGGACATAGAGACCGTC3’を有するプライマーとを使用する。
【選択図】なし
Description
また、パーレカン(または関連する巨大分子)が、その他のアミロイド疾患のいずれかに苦しむ患者の組織および/またはアミロイド沈着に異なる形状で存在することも可能だろうか?
本発明は、これらの問いにいくつかの解答を提供し、そしてパーレカンがパーレカンのドメインI(通常、パーレカンの3つのGAG鎖を含む領域)内の「欠失」または「付加」スプライシングの結果、特有のスプライシング変異体型で存在するという新規のそして驚くべき発見に関連する。パーレカンドメインIの当該スプライシングは、普通、付加的なGAG鎖結合部位のコンセンサス配列(すなわちSer-GlyまたはSer-Gly-Asp)を含む、特有のアミノ酸配列を、産生する結果となり、正常パーレカンに見られる3つのGAG鎖の代わりに、4つまたはそれ以上のGAG鎖を有すると予測される新規パーレカン分子を生成する。パーレカンドメインIのスプライシングの結果生じた特有のペプチド領域に対して産生された2つの異なる抗ペプチドポリクローナル抗体により、アルツハイマー病脳で、パーレカンドメインI変異体の、神経原繊維変化(すなわち、「エクソン5欠失」抗体を用いて検出されたパーレカンドメインIエクソン5欠失変異体)またはアミロイド斑(すなわち、「パーレカンドメインI挿入」抗体を用いて検出されたパーレカンドメインI変異体エクソン4aおよび/またはパーレカンドメインI変異体エクソン3a)への免疫局在が立証された。ポリクローナル抗ペプチド抗体を利用した免疫位置測定研究により、発見されたパーレカンドメインIスプライシング変異体分子のあるもの(すなわちパーレカンドメインIエクソン5欠失)は、正常パーレカンのように基底膜には存在せず、そしてしたがって、パーレカンまたは「基底膜ヘパラン硫酸PG」とは明確に異なるものと見なすべきであることが示唆された。したがって、本発明で同定されたパーレカンドメインIスプライシング変異体は、正常パーレカンとは異なり、これらの1)ヌクレオチド配列、2)対応するアミノ酸配列、3)予測されるGAG鎖数、および4)特定の組織における分布には明確な相違がある。最近の研究により、ヘパラン硫酸GAGは主にアミロイド原繊維形成(Castilloら, Soc. Neurosc. Abst. 22:1172, 1996要旨)、および神経原繊維変化形成の誘導(Goedertら, Nature 383:550-553, 1996)に関与していることが示唆されたため、付加的なヘパラン硫酸GAG鎖を含む可能性があり、そしてアミロイド斑または神経原繊維変化と共に局在する、特有のパーレカンドメインIスプライシング変異体という本発明中の驚くべき発見は、さらにアルツハイマー病のアミロイド斑および神経原繊維変化の病因におけるそれらの重要性を示す。さらに、本発明で発見されたように、パーレカンドメインIスプライシング変異体が中枢神経系の外部の組織に存在することもまた、これらのスプライシング変異体が、全身の器官および組織に影響するその他のアミロイド疾患に関係していることを示す。
パーレカンはアミロイド疾患において、アミロイド疾患それぞれにおける原繊維性アミロイド沈着の形成、沈着、集積、および/または持続への寄与を含む、重要でそして疾患発生に関わる役割を果たすことが知られている。本発明は、新規に同定されたヒトパーレカンのドメインIスプライシング変異体の同定および利用に関連する。本発明に記載されている1つまたはすべてのスプライシング変異体は、アルツハイマー病およびその他のアミロイド疾患において、より重要でないとしても、同様の疾患発生に関わる役割を果たすと考えられる。本明細書に記載される本発明は、これらのパーレカンドメインIスプライシング変異体、およびアルツハイマー病およびその他のアミロイドーシスへの診断および治療干渉へのそれらの使用に関わる。
以下の図は、本発明の態様を例証するものであり、そして本発明の範囲を限定するためのものではない。
図2は、健常老人1人およびアルツハイマー病患者2人の海馬から単離した総RNAに対し、パーレカンドメインIに特異的なプライマー(FPerDIおよびRPerlDI)を用いて行ったRT-PCRの一例である。図2Aは、エチジウムブロミドで染色した2%アガロースゲル上で解析したRT-PCR産物である。標準は506および298塩基対に示されている。図2Bは、パーレカンドメインIからなるジゴキシゲニン標識cDNAをプローブとして用いたRT-PCR産物のサザンブロットである。
図14は、表2およびRT-PCRに使用したプライマーのリストである。
アミロイド疾患
「アミロイド疾患」は、いずれも組織中に「アミロイド」として知られる不溶性細胞外基質の顕著な、そして通常、正常な器官機能を損なうに足る量の集積を示す、臨床的および一般的に関連がないヒト疾患の一群からなる。Rokitanskiは1842年(Rokitansky, “Handbuch der pathologischen Anatomie", Vol. 3, Braumuller and Seidel, Vienna)、異なる患者由来の多くの組織でろう状および不定形の組織沈着を最初に観察した。しかし、1850年代にセルロースを示すのに用いられていた硫酸ヨウ素反応で陽性染色を示したことから、1854年に初めて、Virchow(Virchow, Arch. Path. Anat. 8:416, 1854)がこれらの沈着を、「糊様」を意味する「アミロイド」と名づけた。セルロースはアミロイドの構成要素ではないが、にもかかわらず、Virchowが観察した染色はおそらく、すべての型のアミロイド沈着に関連して現れるプロテオグリカン(PG)の存在によるものであろう。FriederichおよびKekuleが1859年にアミロイドにタンパク質の性質があることを発見した(FriedrichおよびKecule, Arch. Path. Anat. Physiol. 16:50, 1859)が、アミロイドという名称は残った。すべてのアミロイドが同じ染色および構造特性を有するという事実に基づき、何年もの間、アミロイド沈着には単一の病原機構が関与しており、そしてアミロイド沈着は単一の構成要素の一群からなると考えられると仮定されていた。現在の研究により、アミロイドは一様な沈着ではなく、そしてアミロイドはまったく関連がない、異なるタンパク質からなる可能性があることが明確に示されてきた(Glenner, N. England J. Med. 302:1283-1292. 1980)。
最も一般的な型のアミロイドーシスは、アルツハイマー病患者の脳で見られる。アルツハイマー病は、中年および老年の痴呆の最も一般的な原因であり、そして記憶、言語、視覚空間知覚および行動の進行性損傷により明らかになる(A Guide to the Understanding of Alzheimer's Disease and Related Disorders, Jorm監修, New York University Press,ニューヨーク1987)。アルツハイマー病の可能性がある疾患の診断は、臨床規準(通常、他の疾患の除外、記憶試験などによる)に基づき行うことが可能であるが、明確な診断には、通常、検死の際得られる脳組織中の特異的異常を組織学的に調べる必要がある。
プロテオグリカン(PG)は、すべての器官および組織で、細胞内ではさまざまな型の異なる細胞中、または細胞外ではさまざまな機能のため輸送された細胞外マトリックスに見られる複合巨大分子の一群である。プロテオグリカンは、直線タンパク質コア骨格からなり、ここに1つまたはそれ以上のグリコサミノグリカン(GAG)鎖が共有結合する(HascallおよびHascall, Cell Biology of the Extracellular Matrix中, Hay監修, ニューヨーク, Plenum Press, pp.39, 1981; Hassellら, Ann. Rev. Biochem. 55:539-567, 1986)。非常に陰性のGAG鎖は、1)ヘキソサミン(D-グルコサミンまたはD-ガラクトサミンのどちらか)、およびヘキスロン酸(D-グルクロン酸またはL-イズロン酸のどちらか)を含む反復二糖単位からなる(Muir, Am. J. Med. 47:673-690, 1969)。PGは伝統的に、主に存在するGAGの同定に従って命名され、そしていくつかの主なGAGが同定されてきた。これらはヒアルロン酸、ヘパラン硫酸、ヘパリン、コンドロイチン-4-硫酸、コンドロイチン-6-硫酸、デルマタン硫酸およびケラタン硫酸である。通常、GAG鎖およびタンパク質コア骨格間の結合は、キシロース−ガラクトース−ガラクトース結合領域からなり、キシロース分子がタンパク質コア上のセリン残基の水酸基に共有結合する(RodenおよびArmand, J. Biol. Chem. 241:65-70, 1966)。例外はヒアルロン酸の場合で、タンパク質構成要素を含まず、その代わりD-グルクロン酸およびD-グルコサミンからなる骨格を有する。ケラタン硫酸は、典型的なキシロース−セリン結合を持たないPGの1つである。ケラタン硫酸は、N-アセチルガラクトサミン残基のセリンまたはスレオニンへの結合(軟骨中)、またはN-アセチルグルコサミン残基のアスパラギン残基への直接結合(角膜中)を通してタンパク質と結合する(HascallおよびHascall, Cell Biology of the Extracellular Matrix中, Hay監修, ニューヨーク, Plenum Press, pp.39, 1981; Muir, Am. J. Med. 47:673-690, 1969)。
アミロイド研究で繰り返される大きな疑問は:なぜ関連がないタンパク質を含むすべてのアミロイドが、同様の特徴を持つアミロイド原繊維を形成する(すなわち、すべてが7-10 nmの原繊維からなり、そして顕著なベータひだ状シート二次構造を含む)のかである。すべてのアミロイドの疾患形成で、同様の役割を果たす可能性がある、共通の構成要素があるのだろうか?
ヘパラン硫酸PGは、アルツハイマー病アミロイドーシスと共に、他の型の中枢神経系および全身性アミロイドーシスの疾患形成においても主要な役割を果たしていると仮定された(SnowおよびWright, Neurobiol. Aging 10:481-497, 1989に総論)。ヘパラン硫酸PGだけが、アルツハイマー病脳の3つの主要な損傷(神経突起斑、神経原繊維変化および脳血管アミロイド沈着)すべて、およびアミロイド斑および親コンゴ血管障害双方のAβを含むアミロイド原繊維に特異的に、免疫局在していることが見出された(Snowら, Am. J. Path. 133:456-463, 1988; SnowおよびWright, Neurobiol. Aging 10:481-497, 1989; PerlmutterおよびChui, Brain Res. Bull. 24:677-686, 1990; Snowら, Am. J. Path.137:1253-1270, 1990; Suら, Neuroscience 51:801-813, 1992; Van Goolら, Dementia 4:308-314, 1993)。証拠の蓄積により、パーレカンがアルツハイマー病のAβを含むアミロイド沈着に存在する主要なヘパラン硫酸PGであり(Snowら, Am. J. Path. 133:456-463, 1988; SnowおよびWright, Neurobiol. Aging 10:481-497, 1989; Snowら, Am. J. Path.137:1253-1270, 1990; Snowら, Am. J. Path.144:337-347, 1994)、そしてAβ原繊維の形成、沈着、集積および持続に主要な役割を果たしている可能性があることが示唆された。パーレカンが原繊維および非原繊維型、どちらに存在するAβ沈着にも常に共局在していた(Snowら, Am. J. Path.144:337-347, 1994)のは、おそらく、パーレカンがAβ(Snowら, J. Neuropath. Exp. Neurol. 48:352, 1989要旨; Bueeら, Brain Res. 601:154-163, 1993; Bueeら, Brain Res. 627:199-204, 1993; Snowら, Arch. Biochem. Biophys. 320:84-95, 1995)およびベータ−アミロイド前駆体タンパク質(Narindrasorasakら, J. Biol. Chem. 266:12878-12883, 1991)と高い親和性で相互作用するためであろう。Aβの13-16残基は、パーレカン結合部位と同定された(Snowら, J. Neuropath. Exp. Neurol. 48:352, 1989要旨; Brundenら, J. Neurochem. 61:2147-2154, 1993; Snowら, Arch. Biochem. Biophys. 320:84-95, 1995)。この領域はヘパリン/ヘパラン硫酸結合コンセンサス配列(CardinおよびWeintraub, Arterioscl. 9:21-32, 1989)を含んでおり、そしてAβ上で、アルファ−セクレターゼ切断部位と見られる部位(Lys-16)に隣接している。ひとたび結合すると、パーレカンは、Aβおよび/またはベータ−アミロイド前駆体タンパク質の二次構造および/または凝集特性に影響を与えると考えられていた(Fraserら、J. Neurochem. 59:1531-1540, 1992)。パーレカンはまた、in vivoで沈着したとき、原繊維Aβアミロイドを安定化し(Snowら, Neuron 12:219-234, 1994; Snowら, Soc. Neurosc. Abst. 21:1292, 1995要旨)、そして最近in vitroで実証されたように、Aβをプロテアーゼによる分解から守る(Gupta-Banselら, J. Biol. Chem. 270:18666-18671, 1995)役割を果たしているようであった。上記の結果を組み合わせることにより、パーレカンは、アルツハイマー病におけるAβアミロイドーシス疾患形成において、いくつかの重要な段階に関係する重要な巨大分子である可能性があることが示唆された。
パーレカンは、ヒトでは467キロダルトンの分子量を有すると予測されるパーレカンコアタンパク質配列の、94エクソンからなる単一コピー遺伝子である(KallunkiおよびTryggvason, J. Cell Biol. 116:559-571, 1992; Murdochら, J. Biol. Chem. 267:8544-8557, 1992)。パーレカンのドメインIは、5つのエクソン(エクソン2から6)にコードされており、3つのヘパラン硫酸GAG結合部位(図1)を含むと仮定され、そして他の既知の配列には相同性を示さない、パーレカン特有のものである。
パーレカンは普通、すべての基底膜上に存在し(Dziadekら, EMBO J. 4, 905-912, 1985; Katoら, J. Cell. Biol. 106:2203-2210, 1988; Murdochら, J. Histochem. Cytochem. 42: 239-249, 1994)、そして内皮細胞(KinsellaおよびWight, Biochem. 27:2136-2144, 1988; SakuおよびFurthmayr, J. Biol. Chem. 264:3514-3523, 1989; Rescanら, Am. J. Path. 142:199-208, 1993)、平滑筋細胞(Nikkariら, Am. J. Path. 144:1348-1356, 1994)、繊維芽細胞(Murdochら, J. Histochem. Cytochem. 42:239-249,1994; Heremansら, J. Cell Biol. 109:3199-3211,1989)、上皮細胞(Morrisら, In Vitro Cell Dev. Biol. 30:120-128, 1994; Ohjiら, Invest. Opth. Vis. Sci. 35:479-485, 1994; Van Detら, Biochem. J. 307:759-768, 1995)、および滑膜細胞(Dodgeら, Lab. Invest 73:649-657, 1995)を含む異なる型の細胞により産生されることが知られている。パーレカンはまた、骨髄由来細胞(Grasselら, Mol. Cell Biochem. 145:61-68, 1995)でも合成され、そして転移性黒色腫(Cohenら, Cancer Res. 54:5771-5774, 1994)、ヒト乳房腫瘍(Guelsteinら, Int. J. Cancer 53: 269-277, 1993)および肝臓腫瘍(Kovalskyら, Acta Biomed. Ateneo Parmense 64:157-163, 1993)を含む癌性組織にも存在する。F9胚癌細胞(体壁内胚葉を形成する)およびP19胚癌細胞(コリン作動性神経を形成する)どちらにおいてもまた、分化すると、パーレカン発現および合成の顕著な上昇を示す(Chakravartiら, Dev. Dyn. 197:107-114, 1993; Sekiguchiら, J. Neurosc. Res. 38:670-686, 1994)。
パーレカンはまた、特異的ヘパラン硫酸PG(以前基底膜ヘパラン硫酸PGと称された)でもあり、特定のアミロイドタンパク質が関与しているかどうかに関係なく、すべてのアミロイド沈着に一般的な成分である。パーレカンは、一般的にアミロイドーシスの疾患形成に主要な役割を果たしていると考えられ、そしてさまざまな組織および異なる臨床背景において、アミロイドの形成、沈着、集積および/または持続に寄与する。しかし、特徴的な損傷(すなわち、アミロイド沈着および神経原繊維変化)および/またはアルツハイマー病および他のアミロイド障害の組織に存在するパーレカンまたは密接に関連する巨大分子が、正常のものと比べ改変、異常および/または相違を示しているかどうかは知られていない。RT-PCR技術およびクローニング方法論を使用することにより、本発明は、アルツハイマー病または老化脳由来の総RNAに存在し、そして中枢神経系外部にあるその他のヒトアルツハイマー病組織(腎臓、肝臓、脾臓、心臓およびすい臓)に存在する、特有のパーレカンドメインIスプライシング変異体を同定した。最初に同定されたパーレカンドメインI変異体は、エクソン5の欠失の結果生じたものであり、そしてパーレカンドメインI変異体エクソン5と称される(PerDI-v5)。エクソン5をスプライシングにより切り離した結果、169アミノ酸、分子量〜17-18キロダルトンと予測されるタンパク質をコードする、エクソン7に終止コドンを含む新たな読み枠ができる。エクソン6の始めから、エクソン7の一部までを含む72アミノ酸からなる新たな配列が生じる。この新規72アミノ酸配列内には、Ser-Gly-Asp(SGD)配列が、新たなGAG結合部位と示唆される。したがって、この最初のパーレカンスプライシング変異体は、4つのGAG結合部位を潜在的に含む、〜17-18キロダルトンのパーレカンコアタンパク質からなる。エクソン5の欠失に起因する特有配列の17アミノ酸を含むペプチドを利用して、ポリクローナル抗ペプチド抗体(「エクソン5欠失」抗体と称される)を産生した。アルツハイマー病脳部位を、この特有の抗体で免疫染色すると、パーレカンドメインI変異体エクソン5が、アルツハイマー病の主要な病理学的特徴の1つである神経原繊維に特異的に免疫局在することが示された。二番目に同定されたパーレカンドメインI変異体は、エクソン4、5および6の一部が欠失した結果であり、そしてパーレカンドメインI変異体エクソン4-6.5(PerDI-v4-6.5)と称される。この欠失は終止コドンを生じ、その結果、82アミノ酸、分子量〜8-9キロダルトンと予測されるタンパク質となる。三番目に同定されたパーレカンドメインI変異体は、エクソン4の開始部分近傍に新たな配列(すなわち、エクソン4a)を付加した結果であり、そしてパーレカンドメインI変異体エクソン4a(PerDI+v4a)と称される。11アミノ酸をコードするこの新規配列(33塩基対)は、他のタンパク質いずれとも既知の相同性を持たず、そして潜在的GAG結合部位として働く可能性がある、新たなSer-Gly対の存在を含む。四番目に同定されたパーレカンドメインI変異体は、エクソン3の後に新たな配列(すなわち、エクソン3a)を付加した結果であり、そしてパーレカンドメインI変異体エクソン3a(PerDI+v3a)と称される。この配列は26新規アミノ酸(75塩基対)をコードし、他のタンパク質いずれとも既知の相同性を持たず、そして潜在的GAG結合部位として働く可能性がある、新たなSer-Gly対の存在を含む。一部にパーレカンドメインI変異体エクソン4aエクソンおよびパーレカンドメインI変異体エクソン3a配列を含む、特有配列である19アミノ酸を含むペプチドを利用して、ポリクローナル抗ペプチド抗体(「パーレカンドメインI挿入」抗体と称される)を産生した。。アルツハイマー病脳部位を、この特有の「パーレカンドメインI挿入」抗体で免疫染色すると、パーレカンドメインI変異体エクソン3aおよび/またはパーレカンドメインI変異体エクソン4aが、神経原繊維変化を持たないニューロン、およびアミロイド斑(もう1つのアルツハイマー病の主要な病理学的特徴)に特異的に免疫局在することが示された。パーレカンは、特定のアミロイドタンパク質の関与に関係なく、すべてのアミロイド沈着に常に見られる構成要素であり、そしてアミロイドの形成、沈着、集積および/または持続に役割を果たすと仮定されるため、これらの新規に同定されたパーレカンスプライシング変異体は、アミロイドーシスの疾患形成において、より重要ではなくても、同様の役割を果たしていると思われる。本発明は、したがって、特有のパーレカンドメインIスプライシング変異体を同定し、そして、アルツハイマー病および他のアミロイド障害の診断および治療干渉のため、特定のパーレカンドメインIスプライシング変異体ペプチド、ヌクレオチド、抗体および分子生物学プローブの産生および利用を提供する。さらに、それぞれのアミロイドーシスに対し、潜在的治療化合物を効果的にスクリーニングする新規動物モデルが開示される。
ワシントン大学アルツハイマー病研究センター脳バンク(the University of Washington Alzheimer's Disease Research Center Brain Bank)より入手した、検死の際得られた痴呆でない成人(コントロール)10人およびアルツハイマー病10人の海馬試料から、以前記載されたように総RNAを単離し、そして-70℃で直ちに凍結した(Nochlinら, Acta Neuropath. 86:645-650, 1993)。表1(図13を参照されたい)に示されたように、アルツハイマー病症例の平均年齢(+/-平均の標準誤差)は86.4 +/- 3.1歳で、範囲は69-101歳であり、非アルツハイマー病症例の平均年齢は77.0 +/- 1.8歳で、範囲は67-86歳であった。平均死後遅延は、アルツハイマー病症例で5.1 +/- 0.6時間、非アルツハイマー病症例で6.7 +/- 0.9時間であり、そして2つの群間で、有意な差は見られなかった。アルツハイマー病症例の平均疾患期間は、11.3 +/- 1.4年だった。
アルツハイマー病患者または正常加齢コントロールの海馬由来の総RNAを解析することにより(表1;図13を参照されたい)、パーレカンドメインIの選択的スプライシング転写物が存在する可能性が示唆された。図2Aは、パーレカンドメインIに特異的なプライマー(FPerDIおよびRPerlDI)(表2;図14および図4Aを参照されたい)を使用して、正常加齢コントロール(C)1例およびアルツハイマー病(AD)患者2例の海馬由来の総RNAに行ったRT-PCR産物のエチジウムブロミド染色アガロースゲルを示している。コントロールおよびADレーンに見られる主要な503塩基対バンドは、パーレカンドメインIの期待される大きさであり、PCR条件を変えてもなくならない、より小さい、および大きいバンド(図2A)を伴っている。パーレカンドメインIに特異的なプローブ(Dig-366)を用いたサザンブロット解析(図2B)により、期待されたパーレカンの503塩基対が示された。さらに、少なくとも2つの小さいバンド(1つはパーレカンドメインIの503バンドのすぐ下、そしてもう1つは298塩基対の標準マーカーのすぐ下)もまた、パーレカンプローブにより認識され、アルツハイマー病およびコントロール海馬のどちらにも期待された大きさではないパーレカン転写物が存在する可能性が示唆された。より多くの正常加齢コントロールおよびアルツハイマー病患者海馬由来の総RNAを、同一の技術(上述)を用いてさらに解析することにより、時々、期待された503塩基対バンドの上により大きいバンドが観察された(未提示)。ヒトパーレカンmRNAは〜14キロ塩基であり、そして大きさが数100ヌクレオチドしか違わない潜在的転写物を認識しないであろうから、これらのパーレカン関連バンドに代表される全長mRNAは、ノーザン解析により区別されない可能性が高いことに注目することが重要である。
パーレカン関連RT-PCR産物は、パーレカンmRNAスプライシング変異体またはパーレカンドメインIと高い相同性を持つ遺伝子に由来している可能性があったため、これらの転写物をクローニングおよび配列決定により同定するための実験が開始され、そして設計された。増幅およびクローニングのため、プライマーを以下のように設計した(表2;図14):順行プライマー(FPerlDIE)は、ヒトパーレカンドメインI(Genbank寄託番号M85289)の5'端近くの領域に特異的であり、そしてEcoRI制限酵素部位を含み、逆行プライマー(RPerlDIE)は、ヒトパーレカンドメインIの3'端近くの領域に特異的であり、そしてXhoI制限酵素部位を含む。プールしたアルツハイマー病10人または正常加齢コントロール患者10人(表1;図13を参照されたい)の海馬試料に対し、RT-PCR(高厳密性ポリメラーゼを使用)を行い、そしておよそ500塩基対より小さいまたは大きいcDNA産物を、pBluescriptのEcoRIおよびXhoI部位にクローニングした。図3は、EcoRIおよびXhoIにより消化された、500塩基対のパーレカンドメインI(図3Eおよび3Fの矢印は、各図のレーン1の503塩基対にある正常パーレカンを示す)より小さいまたは大きい挿入物を有するプラスミドクローンの例を示す(エチジウムブロミド染色ゲル、図3A、CおよびE)。挿入物を含むすべてのプラスミドを、2つのプローブのうち1つを用いるサザンブロットにより解析した。使用した2つのプローブは;パーレカンドメインIおよびIIにハイブリダイズするDig-19J(図3D)、またはパーレカンドメインIの中央部分にハイブリダイズするDig-366(図3BおよびF)である。プールされたアルツハイマー病海馬RNA試料由来の61クローンのうち、18クローンがパーレカンドメインIまたはパーレカンドメインIおよびIIに特異的なプローブにハイブリダイズすることがわかった。プールされた正常加齢コントロール海馬RNA試料由来の48クローンのうち、18クローンがやはり、パーレカンドメインIまたはパーレカンドメインIおよびIIに特異的なプローブにハイブリダイズすることがわかった。図3に示されたプラスミドをいくつか配列決定すると、後述の4つの異なるパーレカンドメインIスプライシング変異体が存在することが立証された。例えば、図3AおよびBのレーン4に示されたバンドは、エクソン5が除去されたパーレカンドメインIスプライシング変異体(後述)を含むことがわかった。図3CおよびDのレーン1および6に示されたバンドは、エクソン4、5および6の一部が除去されたパーレカンドメインIスプライシング変異体(後述)を含むことがわかった。最後に、図3EおよびFのレーン4および6に示されたバンドは、エクソン3の後そしてエクソン4の開始部分に、異なる大きさの付加挿入物を含む(後述)ことがわかった。
プールされたアルツハイマー病海馬cDNAから配列決定されたクローンの1つは、エクソン5を失ったパーレカンドメインIスプライシング変異体からなることがわかった。この変異体は、エクソン5がパーレカンドメインIから欠失していることを表すため、PerDI-v5(パーレカンドメインI変異体エクソン5)と命名された。図4Aは、正常ヒトパーレカンドメインI(エクソン5を含む)と比較したこの変異体のエクソン構造を表している。図4Bでは、このクローンの核酸配列(SEQ ID NO: 1およびSEQ ID NO: 2)を正常ヒトパーレカンと比較している(Genbank寄託番号M85289のヌクレオチド番号系を使用)。最初の相違は、ヌクレオチド252のTからGへの変化で、その結果、チロシン(アミノ酸番号58)からアスパラギン酸への非保存的アミノ酸変化が起きている(図4C;SEQ ID NO: 3)。59塩基対のエクソン5(Cohenら, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:10404-10408, 1993)は、既知のスプライシング部位で正確に欠失していることがわかった。この予測されるパーレカンドメインI変異体の完全なアミノ酸配列を図4Cに示す(SEQ ID NO: 3)。図4Cに示された2つの黒いひし形に囲まれた配列は、我々が得たcDNAクローンの配列である。残りのパーレカン配列は、正常ヒトパーレカンから予測されるものである。エクソン5の欠失の結果、エクソン6以降の読み枠が変化した。新規アミノ酸配列(SEQ ID NO: 4)は、ヌクレオチド651に終止コドンがあると予測され、その結果は190アミノ酸(シグナルペプチド配列を除くと169アミノ酸)のタンパク質となる。スプライシング変異体PerDI-v5の新規アミノ酸配列は、アミノ酸番号142-144に、アミノ酸番号65-78の間に存在する3つのSer-Gly-Asp(SGD)配列と同一のSGD配列を含む(図4C;SEQ ID NO: 3)。SGD配列は、(各セリン残基上に)グリコサミノグリカン鎖を付加するためのコンセンサス配列であり、したがって、予測される169アミノ酸タンパク質(分子量〜17-18キロダルトン)は最大4つのGAG鎖が結合する小さなプロテオグリカンであろう。パーレカンドメインI変異体エクソン5中の新規アミノ酸配列(SEQ ID NO: 4)の相同性を、現在のゲノムおよびタンパク質データベースで検索したところ、30%を超えるアミノ酸同一性を持つマッチはないことが示された。このことにより、パーレカンドメインI変異体エクソン5中の新規アミノ酸配列(SEQ ID NO: 4)は特有であることが示された。
プールされたアルツハイマー病海馬cDNAから配列決定された3つのクローンは、エクソン4、5および6の一部を失ったパーレカンドメインIスプライシング変異体からなることがわかった。この変異体は、パーレカンドメインIからエクソン4、5および6のほぼ半分が欠失していることを表すため、PerDI-v4-6.5(パーレカンドメインI変異体エクソン4-6.5)と命名された。図5Aは、正常ヒトパーレカンドメインIと比較したこの変異体のエクソン構造を表している。図5Bでは、このクローンの核酸配列(SEQ ID NO: 6)を正常ヒトパーレカンと比較しており(Genbank寄託番号M85289のヌクレオチド番号系を使用)、236塩基対が除去されていることを示している。エクソン6のこの領域における正常パーレカン配列はコンセンサススプライシング部位のGT/AG原則(JacobおよびGallinaro, Nucleic Acid Res. 17:2159-2180, 1989)にのっとっていない。とはいえ、非コンセンサスmRNAスプライシング部位の例は、いくつか知られている(Jackson, Nucleic Acid Res. 19:3795-3798, 1991)。欠失により読み枠に変化が生じ、アミノ酸配列中に直ちに終止コドン(*)をコードする結果になっている(図5C中の*)(SEQ ID NO: 7)。この結果、3つのGAG結合部位を含む非常に小さな(82アミノ酸または分子量〜8-9キロダルトン)パーレカンドメインI様タンパク質が産生されると予測される。ヌクレオチド252でTからGへの変異があるため、アミノ酸58でも、チロシンからアスパラギン酸への変異がある(図5C;SEQ ID NO: 7)。
プールされた正常加齢海馬cDNAから配列決定されたクローンの1つは、エクソン4の開始部位近傍に33の新規ヌクレオチド(SEQ ID NO: 9)が挿入された、パーレカンドメインIスプライシング変異体からなることがわかった。この変異体は、新たな配列がエクソン4の開始部分に存在する(すなわち、エクソン4aと称される新たな配列)ことを表すため、PerDI+4a(パーレカンドメインI変異体エクソン4a)と命名された。図6Aは、正常ヒトパーレカンドメインIと比較したこの変異体のエクソン構造を表している。新規配列の挿入はエクソン4の開始から14塩基の部位で起きていた(図6B)。この挿入による読み枠の変化はなく、そしてしたがってこの変異体は残りの正常パーレカンをコードしているはずであり、転写物は、読み枠13,173 bp + 33 bp =13,206 bpの、およそ14,000塩基対である。33挿入ヌクレオチドは11新規アミノ酸(SEQ ID NO: 10)をコードし、そのうち5つは疎水性である(図6C)。やはりグリコサミノグリカン鎖結合部位となる可能性があるセリン−グリシン対も、当該新規配列中に存在している。この変異体および正常パーレカンの間には、ヌクレオチド164および252で、2つのヌクレオチド相違がある(図6B、6C)。ヌクレオチド164でのAからCへの変異はアミノ酸(アラニン)の変異にはつながらないが、ヌクレオチド252でのTからGへの変異は、チロシンからアスパラギン酸への非保存性アミノ酸変異となる(図6C)。パーレカンドメインI変異体エクソン4a中の新規11アミノ酸配列(SEQ ID NO: 10)の相同性を、現在のゲノムおよびタンパク質データベースで検索したところ、20%を超えるアミノ酸同一性を持つマッチはないことが示された。このことにより、パーレカンドメインI変異体エクソン4a中の新規11アミノ酸配列(SEQ ID NO: 10)は特有であることが示された。
プールされた正常加齢海馬cDNAから配列決定された2つのクローンは、エクソン3の後に75の新規ヌクレオチド(SEQ ID NO: 12)が挿入されたパーレカンドメインIスプライシング変異体からなることがわかった。この変異体は、新規配列がエクソン3の後に存在する(すなわち、エクソン3aと称される新規配列)ことを表すため、PerDI+3a(パーレカンドメインI変異体エクソン3a)と命名された。図7Aは、正常ヒトパーレカンドメインIと比較したこの変異体のエクソン構造を表している。新規配列の挿入は正確にエクソン3および4の間で起きていた(図7B)。この挿入による読み枠の変化はなく、そしてしたがってこの変異体は残りの正常パーレカンをコードしているはずであり、転写物は、読み枠13,173 bp + 75 bp =13,248 bpの、およそ14,000塩基対である。このパーレカンドメインI変異体は、変異体PerDI+4aと非常によく似ており、a) 75塩基対挿入物の最初の33塩基対(そしてしたがってコードされる11アミノ酸;SEQ ID NO: 10)は同一であり、そしてb)ヌクレオチド252でも、チロシンからアスパラギン酸への非保存性アミノ酸変異となるTからGへの変異がある(図7C)。新規挿入物は26アミノ酸(ちょうどスプライシング部位でバリンからグリシンへの変異がある)をコードし、そのうち13は疎水性である(図7C;SEQ ID NO: 13)。さらに、新規配列はまた、潜在的グリコサミノグリカン鎖結合部位であると示唆されるセリン−グリシン配列を含んでいる。パーレカンドメインI変異体エクソン3a中の新規26アミノ酸配列(SEQ ID NO: 13)の相同性を、現在のゲノムおよびタンパク質データベースで検索したところ、20%を超えるアミノ酸同一性を持つマッチはないことが示された。このことにより、パーレカンドメインI変異体エクソン3a中の新規26アミノ酸配列(SEQ ID NO: 13)は特有であることが示された(上述の例外がある)。
本発明に記載されるこれら4つのスプライシング変異体がアルツハイマー病患者の海馬から得られるRNA中に存在するのか、その後決定した。これらの研究のため、新規エクソン結合部位にまたがる特異的プライマーを設計し(表2-図14;図4A、5A、6Aおよび7A;およびSEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 14を参照されたい)、そして正常ヒトパーレカン配列へのプライマーの結合を最小にするRT-PCR反応条件を用いた。特異性を最大にするためのPCRパラメーターの最適化には、アニーリング温度および増幅サイクル数の変化が含まれる。使用したプライマー、産物の期待される大きさおよびPCRの条件は:パーレカンドメインI変異体エクソン5に対してはF2hPerDIおよびRhPerEX4/6(SEQ ID NO: 5)、260塩基対(56℃アニーリング、35サイクル);パーレカンドメインI変異体エクソン4-6.5に対してはFhEx3/6.5およびRPerlDI(SEQ ID NO: 8)、92塩基対(60℃アニーリング、35サイクル);パーレカンドメインI変異体エクソン4aに対してはFhEx178およびRPerlDI(SEQ ID NO: 11)、325塩基対(60℃アニーリング、35サイクル);パーレカンドメインI変異体エクソン3aに対してはFhEx181およびRPerlDI(SEQ ID NO: 14)、339塩基対(60℃アニーリング、35サイクル)であった。コントロールとして、逆転写酵素反応を酵素なしで行うこと(RNA調製中のゲノムDNAの引き続いて起こる増幅をチェックするため)、および試薬中のDNA混入をチェックするためテンプレートなしでPCRを行うことを含んだ。上述のコントロールはどちらも、常に陰性だった。図8に示すように、RT-PCRはアルツハイマー病患者10人(表1-図13を参照されたい)の海馬から単離した総RNAに対し、特異的パーレカンドメインIスプライシング変異体プライマー対を用いて行った。結果(図8)は、a)パーレカンドメインIエクソン5スプライシング変異体はAD患者10人中10人に存在し;b)パーレカンドメインIエクソンスプライシング4-6.5変異体はAD患者10人中10人に存在し;c)パーレカンドメインIエクソン+4a挿入変異体はAD患者10人中10人に存在し;そしてd)パーレカンドメインIエクソン+3a挿入変異体はAD患者10人中9人に存在することを示した。これらの結果は4つのスプライシング変異体がすべて、ほとんどすべてのアルツハイマー病患者の海馬由来RNAに存在していることを示している。
Zymed Laboratories(米国南サンフランシスコ)と契約し、パーレカンドメインI変異体エクソン5の特有なアミノ酸配列(SEQ ID NO: 4)を解析し、どの特異的領域がカスタムペプチド合成およびポリクローナル抗ペプチド抗体の生成に有用であるか決定した。KyteおよびDoolittle親水性モデル、および柔軟性、タンパク質表面可能性、両親媒性、および好ましい二次構造各指標のペプチド領域の決定を含む、異なるペプチド領域の免疫原性を決定するコンピューターアルゴリズムを使用した。最初の5つのカテゴリーに基づいた全体の評価により、考慮したそれぞれの特異的ペプチド領域に対する抗原性指標が得られた。主に、好ましい二次構造を取ることから、抗体産生のためにP-T-P-G-H-S-A-P-V-P-K-S-L-H-G-G-R(SEQ ID NO: 15)に対応する17アミノ酸部分を選択した。ペプチド合成、精製および部位特異的KLH結合、およびPolyQuikTM法を用いた迅速抗体サービスはZymed Laboratories(米国南サンフランシスコ)により行われた。部位特異的KLH結合のため以下のペプチドを合成し、そしてポリクローナル抗ペプチド抗体産生のためウサギに免疫した:(C)-P-T-P-G-H-S-A-P-V-P-K-S-L-H-G-G-R-COOH。システイン残基(C)は、単点部位特異的KLH結合に用いるよう割り当てられた。
パーレカンドメインI変異体エクソン5に存在する特有配列領域である17アミノ酸ペプチド(SEQ ID NO: 15)に対するポリクローナル抗ペプチド抗体(「エクソン5欠失」抗体として知られる)を、その後、このパーレカン変異体のアルツハイマー病患者脳における免疫位置決定に使用した。アルツハイマー病であることが確定された5症例の海馬または前頭皮質を含む脳組織部位を、ワシントン大学アルツハイマー病研究センターから入手し、そして利用した。パラフィン包埋物のそれぞれの塊から、6-8μmの連続切片を切り取り、そしてゼラチンコーティングしたプレート上においた。アミロイド含有斑および神経原繊維変化は、コンゴ−レッド染色(Puchtlerら、J. Histochem. Cytochem. 10:335-364, 1962)後、偏光下で観察して同定した。パーレカンドメインI変異体エクソン5の検出は、上述の「エクソン5欠失」抗体を1:300または1:500希釈で用いて行った。コントロールは、隣接する連続切片の過剰17アミノ酸ペプチド(やはりZymed Laboratoriesにより提供された)で前吸収した、同一の「エクソン5欠失」抗体での染色、および/または隣接する連続切片の「エクソン5欠失」抗体を作成するのに利用した同じウサギから得られた免疫前血清での染色からなった。組織部位の免疫染色は、ヘマトキシリン逆染色と共にアビジン−ビオチン複合体(Hsuら, J. Histochem. Cytochem. 29:577-580, 1981)を用いて行った。免疫細胞化学染色には、最も低いバックグラウンド染色で、最良の特異性を得るために、一次抗体を異なる希釈で試した。一次抗体の最適な希釈の結果のみが報告される。隠れた抗原部位を暴露するのを助けるため、免疫染色前に、「エクソン5欠失」抗体と共に組織部位を88%のギ酸で5分、前処理した(Kitamotoら, Lab. Invest. 57:230-236, 1987)。
Zymed Laboratories(米国南サンフランシスコ)と契約し、パーレカンドメインI変異体エクソン4aの特有なアミノ酸配列(SEQ ID NO: 13)もまた解析し、どの特異的領域がカスタムペプチド合成およびポリクローナル抗ペプチド抗体の生成に有用であるか決定した。KyteおよびDoolittle親水性モデル、および柔軟性、タンパク質表面可能性、両親媒性、および好ましい二次構造各指標のペプチド領域の決定を含む、異なるペプチド領域の免疫原性を決定するコンピューターアルゴリズムを使用した。最初の5つのカテゴリーに基づいた全体の評価により、考慮したそれぞれの特異的ペプチド領域に対する抗原性指標が得られた。主に、全体の評価が優れていることから、抗体産生のためにQ-P-L-G-R-P-P-V-A-G-M-M-V-S-E-P-D-E-E(SEQ ID NO: 16)に対応する19アミノ酸部分を選択した。抗体産生のため選択されたペプチド領域は、パーレカンドメインI変異体エクソン3a(SEQ ID NO: 10)に存在する(11アミノ酸の内)8アミノ酸、およびパーレカンドメインI変異体エクソン4aに特有な11アミノ酸からなることに注目されたい。したがって、この19アミノ酸領域に対して産生されたペプチド抗体は、パーレカンドメインI変異体4aおよび/またはパーレカンドメインI変異体3aに存在する配列を検出すると考えられる。ペプチド合成、精製および部位特異的KLH結合、およびPolyQuikTM法を用いた迅速抗体サービスはZymed Laboratories(米国南サンフランシスコ)により行われた。部位特異的KLH結合のため以下のペプチドを合成し、そしてポリクローナル抗ペプチド抗体産生のためウサギに免疫した:(C)-Q-P-L-G-R-P-P-V-A-G-M-M-V-S-E-P-D-E-E-COOH。システイン残基(C)は、単点部位特異的KLH結合に用いるよう割り当てられた。
パーレカンドメインI変異体エクソン3aおよび/またはパーレカンドメインI変異体エクソン4aに存在する19アミノ酸ペプチド(SEQ ID NO: 15)配列領域に対するポリクローナル抗ペプチド抗体(「パーレカンドメインI挿入」抗体として知られる)を、その後、これらのパーレカン「挿入」変異体のアルツハイマー病患者脳における免疫位置決定に使用した。アルツハイマー病であることが確定された5症例の海馬または前頭皮質を含む脳組織部位を、ワシントン大学アルツハイマー病研究センターから入手し、そして利用した。パラフィン包埋物のそれぞれの塊から、6-8μmの連続切片を切り取り、そしてゼラチンコーティングしたプレート上においた。アミロイド含有斑および神経原繊維変化は、コンゴ−レッド染色(Puchtlerら、J. Histochem. Cytochem. 10:335-364, 1962)後、偏光下で観察して同定した。さらに、Aβ含有沈着(アミロイド斑および脳血管アミロイド沈着に存在)をAβの残基17-24を認識するモノクローナル抗体(抗4G8として知られる;Senetek)を用いて検出した。パーレカンドメインI変異体エクソン4aおよび/またはパーレカンドメインI変異体エクソン3aの検出は、上述の「パーレカンドメインI挿入」抗体を1:250および1:350希釈で用いて行った。コントロールは、隣接する連続切片の過剰19アミノ酸ペプチド(やはりZymed Laboratoriesにより提供された)で前吸収した、同一の「パーレカンドメインI挿入」抗体での染色、および/または隣接する連続切片の「パーレカンドメインI挿入」抗体を作成するのに利用した同じウサギから得られた免疫前血清での染色からなった。組織部位の免疫染色は、ヘマトキシリン逆染色と共にアビジン−ビオチン複合体(Hsuら, J. Histochem. Cytochem. 29:577-580, 1981)を用いて行った。免疫細胞化学染色には、最も低いバックグラウンド染色で、最良の特異性を得るために、一次抗体を異なる希釈で試した。一次抗体の最適な希釈の結果のみが報告される。隠れた抗原部位を暴露するのを助けるため、免疫染色前に、「パーレカンドメインI挿入」抗体と共に組織部位を88%のギ酸で5分、前処理した(Kitamotoら, Lab. Invest. 57:230-236, 1987)。
脳(海馬、皮質)、脾臓、肝臓、腎臓、心臓および/またはすい臓を含むヒト組織を、ワシントン大学病理学部検死施設から得た。脳およびその他の組織は、アルツハイマー病と確定された80歳男性に由来した。総RNAを上述(実施例1中)のように単離し、そして1μgのRNA、200UのRNase H陰性逆転写酵素(Superscript II, Gibco-BRL)および150 ngの六量体プライマーを含む反応緩衝液中、1.5時間42℃という条件で、一本鎖cDNAを合成した。増幅は、a) Taqポリメラーゼ(Boehringer Mannheim)を用い、b)プライマーアニーリングは使用したプライマー対により決定される温度で行われ、そしてc)アニーリング時間は1分で、そしてサイクル数は30‐35の間であったことを除けば、上述(実施例1中)のように行った。特異性を最大にするためのPCRパラメーターの最適化には、アニーリング温度および増幅サイクル数の変化が含まれる。使用したプライマー対、産物の期待される大きさおよびPCRの条件は:パーレカンドメインI変異体エクソン5に対してはF2hPerDIおよびRhPerEX4/6、260塩基対(56℃アニーリング、35サイクル);パーレカンドメインI変異体エクソン4-6.5に対してはFhEx3/6.5およびRPerlDI、92塩基対(60℃アニーリング、35サイクル);パーレカンドメインI変異体エクソン4aに対してはFhEx178およびRPerlDI、325塩基対(60℃アニーリング、35サイクル);パーレカンドメインI変異体エクソン3aに対してはFhEx181およびRPerlDI、339塩基対(60℃アニーリング、35サイクル)であった。コントロールとして、逆転写酵素反応を酵素なしで行うこと(RNA調製中のゲノムDNAの引き続いて起こる増幅をチェックするため)、および試薬中のDNA混入をチェックするためテンプレートなしでPCRを行うことを含んだ。上述のコントロールはどちらも、常に陰性だった。RT-PCR産物は、エチジウムブロミド染色した2%または4%アガロースゲル上で解析した。
核酸
本発明の1つの側面のとおり、mRNA、DNA、cDNAと共に、類似体(analog)および生物学的に活性があり、そして診断上または治療上有用なその断片を含む、単離核酸分子が提供される。
好ましい宿主は細菌または真核宿主であり、in vivoまたはin situにおける細菌、酵母、昆虫、菌類、トリおよび哺乳動物細胞、または哺乳動物、昆虫、トリまたは酵母起源の宿主細胞が含まれる。哺乳動物細胞またはヒト、霊長類、ハムスター、ウサギ、げっ歯類、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ、ヤギ、イヌまたはネコ起源の組織が好ましいが、他の哺乳動物細胞いずれを使用してもよい。
本発明中に引用されるポリペプチドは、天然ポリペプチド、合成ポリペプチドまたは組換えポリペプチドでもよい。本明細書に引用されるすべてのパーレカンドメインIスプライシング変異体ポリペプチドの、断片、誘導体または類似体は、a) 1つまたはそれ以上のアミノ酸残基が保存性または非保存性アミノ酸残基により置換され、そしてこうした置換アミノ酸残基が遺伝暗号によりコードされるかもしれないまたはされないかもしれないもの、またはb) 1つまたはそれ以上のアミノ酸残基が置換基を含むもの、またはc)成熟ポリペプチドが他の化合物、例えばポリペプチドの半減期を増加させるために使用される化合物(例えばポリエチレングリコール)と融合しているもの、またはd)付加アミノ酸、例えばリーダーまたは分泌配列または成熟ポリペプチドまたはプロタンパク質配列の精製に使用される配列が成熟ポリペプチドに融合しているもの、でもよい。こうした断片、誘導体および類似体は本発明の範囲内にあると考えられる。
パーレカンドメインIスプライシング変異体抗体もまた、当業者に知られる方法を用いて、組織からパーレカンドメインIスプライシング変異体タンパク質を単離するのに用いてもよい。例には、限定されるわけではないが、アフィニティーカラムクロマトグラフィーおよび免疫沈降方法論の使用がある。組織からのパーレカンドメインIスプライシング変異体の単離により、前記パーレカンドメインIスプライシング変異体に結合するGAG鎖のさらなる構造決定が可能になるであろう。こうしたGAG鎖を単離し、そしてGAGの種類、GAG鎖の長さおよび大きさ、および特異的単糖、二糖、および多糖構造に従って性質決定することが可能である。こうした解析は、記載されるすべての参考文献も含めて本明細書に完全に援用される、HampsonおよびGallagher, Biochem. J. 221:697-705, 1984; Farach-Carsonら, Biotech. 7:482-493, 1989; GyoおよびConrad, Anal. Biochem. 176:96-104, 1989; DaColら, J. Chromatography 647:289-300, 1993; Hovinghら, Eur. J. Biochem. 211:771-779, 1993;に記載されるものを含む、当業者に知られる方法により行うことも可能である。
特定の配列に対応するポリペプチドに対して生成され、本発明のパーレカンドメインIスプライシング変異体を認識する抗体は、ポリペプチドを動物に直接注射するか、または好ましくはヒトでない動物にポリペプチドを投与するかして得ることが可能である。こうして得られた抗体は、その後、ポリペプチド自体に結合するであろう。こうした方法において、ポリペプチドの断片のみをコードする配列であっても、完全な天然ポリペプチドに結合する抗体を生成するのに使用することが可能である。こうした抗体は、その後、そのポリペプチドを発現する組織からポリペプチドを単離するのに使用してもよい。好ましい態様には、限定されるわけではないが、それぞれパーレカンドメインIエクソン5変異体、およびパーレカンドメインI変異体エクソン4aおよび/またはパーレカンドメインI変異体エクソン3aの存在および局在を検出するのに利用する「パーレカンエクソン5欠失」抗体および「パーレカンドメインI挿入」抗体などの、本明細書に記載される抗ペプチド抗体が含まれる。これら抗体の作成に利用する好ましいペプチドには、限定されるわけではないが、SEQ ID NO: 15およびSEQ ID NO: 16に記載されるペプチド配列が含まれる。これらの記載される配列を用いた抗ペプチド抗体の生成に関して、好ましい態様には、単点部位特異的KLH結合のためのSEQ ID NO: 15および/またはSEQ ID NO: 16のアミノ末端へのシステイン残基の付加が含まれる。
モノクローナル抗体には、抗原に特異的な抗体の、実質的に同種の集合が含まれ、集合には実質的に同様のエピトープ結合部位が含まれる。モノクローナル抗体の調製には、連続細胞株培養により産生される抗体を提供する技術のいずれを使用してもよい。例には、ハイブリドーマ技術(KohlerおよびMilstein, Nature 256:495-497, 1975)、トリオーマ技術、ヒトB細胞ハイブリドーマ技術(Kozborら, Immunology Today 4:72, 1983)およびヒトモノクローナル抗体を産生するためのEBVハイブリドーマ技術(Coleら, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy中, Alan R. Liss, Inc., pp.77-96, 1985)が含まれる。こうした抗体は、IgG、IgM、IgE、IgA、GILDを含む免疫グロブリンクラスおよびそれらのサブクラスのいずれであってもよい。
プライマーおよびまたは核酸の使用
本発明は、1つの側面において、試料中のパーレカンドメインI変異体遺伝子発現の解析を含む、アミロイドーシスの診断法を提供する。特定の態様において、本発明は、パーレカン遺伝子およびその一部の産物に関し試料を検定する方法を提供する。この方法は、試料中のメッセンジャーRNA(mRNA)からcDNAを作成し、パーレカン遺伝子またはその一部に対応する相補的DNA(cDNA)の一部を増幅し、そして増幅されたcDNAを検出することを含み、増幅されたcDNAがアミロイドーシスの診断および予後に使用されることが特徴である。アミロイド疾患には、限定されるわけではないが、アルツハイマー病およびダウン症候群に関連するアミロイド(特異的アミロイドはベータ−アミロイドタンパク質またはAβと称される)、慢性炎症、さまざまな形態の悪性疾患および家族性地中海熱に関連するアミロイド(特異的アミロイドはAAアミロイドまたは炎症関連関連アミロイドーシスと称される)、多発性骨髄腫およびその他のB細胞疾患に関連するアミロイド(特異的アミロイドはALアミロイドと称される)、II型糖尿病に関連するアミロイド(特異的アミロイドはアミリンまたは小島アミロイドと称される)、クロイツフェルト−ヤコブ病、ゲルストマン−ストラウスラー症候群、クールーおよび動物スクレイピーを含むプリオン疾患に関連するアミロイド(特異的アミロイドはPrPアミロイドと称される)、長期血液透析および手根管症候群に関連するアミロイド(特異的アミロイドはベータ2−ミクログロブリンアミロイドと称される)、老化心臓アミロイドおよび家族性アミロイド性多発神経障害に関連するアミロイド(特異的アミロイドはトランスチレチンまたはプレアルブミンと称される)、および甲状腺髄様癌などの内分泌腫瘍に関連するアミロイド(特異的アミロイドはプロカルシトニン変異体と称される)が含まれる。検定を行う試料は、好ましくは体内組織または体内液体である。試料は生検により得られた組織断片、または細針吸引された細胞でもよい。また別に、血液または尿または他の体内液体試料、例えば子宮切屑、または非侵入的に得られた試料、例えば痰、尿または便でもよい。
本発明の別の側面は、ヒト組織および/または生物学的液体中のそれぞれのパーレカンドメインIスプライシング変異体を特異的に検出するのに利用できる、ポリクローナルおよび/またはモノクローナルペプチド抗体を提供することである。好ましい態様において、パーレカンドメインIスプライシング変異体エクソン5(SEQ ID NO: 3)のペプチドの一部または断片、および/またはパーレカンドメインI変異体エクソン5中に含まれる特有の72アミノ酸ペプチド(図4CおよびSEQ ID NO: 4に示される)に対して作成された、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体は、ヒト組織および/または生物学的液体中のパーレカンドメインI変異体エクソン5を検出しそして定量するのに用いることが可能である。好ましい態様において、SEQ ID NO: 15のアミノ酸配列に対して作成されたポリクローナル抗体(すなわち、本明細書中では「パーレカンエクソン5欠失」抗体と称される)は、ヒト組織および/または生物学的液体中のパーレカンドメインI変異体エクソン5を検出するのに用いることが可能であり、そして診断および治療双方への適用を有するであろう(本明細書に記載)。ポリクローナルおよび/またはモノクローナルペプチド抗体は、ヒト組織および/または生物学的液体中のパーレカンドメインIスプライシング変異体エクソン4-6.5を特異的に検出するのに用いることも可能である。好ましい態様において、パーレカンドメインIスプライシング変異体エクソン4-6.5(SEQ ID NO: 6)のペプチドの一部またはアミノ酸配列領域断片、および/またはその一部に対して作成された、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体は、ヒト組織および/または生物学的液体中のパーレカンドメインI変異体エクソン4-6.5を検出しそして定量するのに用いることが可能である。ポリクローナルおよび/またはモノクローナルペプチド抗体はまた、ヒト組織および/または生物学的液体中のパーレカンドメインI変異体エクソン4aを特異的に検出するのに用いることも可能である。好ましい態様において、パーレカンドメインI変異体エクソン4a中に含まれる特有の11アミノ酸配列領域(図6CおよびSEQ ID NO: 10に示される)のペプチドの一部または断片に対して特異的に作成された、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体は、ヒト組織および/または生物学的液体中のパーレカンドメインI変異体エクソン4aを検出しそして定量するのに用いることが可能である。ポリクローナルおよび/またはモノクローナル抗ペプチド抗体はまた、ヒト組織および/または生物学的液体中のパーレカンドメインI変異体エクソン3aを特異的に検出するのに用いることも可能である。好ましい態様において、パーレカンドメインI変異体エクソン3a中に含まれる新規26アミノ酸ペプチド(図7CおよびSEQ ID NO: 13に示される)に対して作成された、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体は、ヒト組織および/または生物学的液体中のパーレカンドメインI変異体エクソン3aを検出しそして定量するのに用いることが可能である。別の好ましい態様において、パーレカンドメインI変異体エクソン4aおよび/またはパーレカンドメインI変異体エクソン3aを検出することが可能な、SEQ ID NO: 16のアミノ酸配列に対して作成されたポリクローナル抗体を、組織および/または生物学的液体中のこれらパーレカンドメインI「挿入」変異体の検出に利用する。
プライマーおよび/または核酸の使用
本発明の別の側面は、アンチセンス技術を使用した潜在的治療法を提供するこどである。アンチセンス技術は、遺伝子発現を三重らせん形成またはアンチセンスDNAまたはRNAにより調節するのに使用してもよい。どちらの方法もポリヌクレオチドのDNAまたはRNAへの結合に基づいている。例えば、本発明の成熟ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド配列の5'コード部分を使用して、およそ10から40塩基対長のアンチセンスRNAオリゴヌクレオチドを設計する。DNAオリゴヌクレオチドは、転写に関与する遺伝子領域(Leeら, Nucleic Acids Res. 6:3073, 1979; Cooneyら, Science 241:456, 1988; Dervanら, Science 251:1360, 1991)に相補的であるよう設計され、それにより、パーレカンドメインIスプライシング変異体の転写および産生を妨げる。アンチセンスRNAオリゴヌクレオチドはin vivoでmRNAとハイブリダイズし、そしてmRNA分子のパーレカンドメインIスプライシング変異体への翻訳を遮断する(Okano, J. Neurochem. 56:560, 1991)。上述のオリゴヌクレオチドはまた、当該アンチセンスRNAまたはDNAがin vivoで発現され、パーレカンドメインIスプライシング変異体の産生を阻害するように、細胞に届けてもよい。
本発明のさらに別の態様は、図4C(SEQ ID NO: 4)、図6C(SEQ ID NO: 10)、図7C(SEQ ID NO: 13)、図9(SEQ ID NO: 15)、および図10(SEQ ID NO: 16)に示されたパーレカンドメインIスプライシング変異体の新規配列に対して特異的なペプチドまたはその断片を使用することである。さらに、図5C(SEQ ID NO: 7)に示されたエクソン3からエクソン6.5の新規結合部に対して作成されたペプチドまたはその断片を使用してもよい。ペプチド配列または断片は、標準的技術を利用(すなわち、自動合成機を利用)して、合成してもよい。ペプチドは、多くの生物学的過程および疾患(上述のアミロイド疾患など)におけるパーレカンドメインIスプライシング変異体の相互作用に対する潜在的遮断治療薬として使用してもよい。好ましい態様において、1つまたはそれ以上のパーレカンドメインIスプライシング変異体中に含まれる新規配列に対して作成された特異的ペプチドは、既定の標的(すなわち、アミロイド沈着)とのこれら変異体の相互作用を遮断するのに用いてもよい。これらペプチドによる阻害は、既定の患者において観察される連続アミロイド形成、沈着、集積および/または持続を緩和する可能性がある。同様に、別の好ましい態様において、それぞれのパーレカンドメインIスプライシング変異体(上述)に対して作成された抗体は、既定の患者における連続アミロイド形成、沈着、集積および/または持続を崩壊させる潜在的遮断抗体として、ヒト患者に投与してもよい。
パーレカンドメインIスプライシング変異体関連病変を防ぎ、抑制しまたは治療する典型的な処方計画は、パーレカンドメインIスプライシング変異体ポリペプチドの有効量を、1または数日から最高1週間およびおよそ24か月の間の期間に渡り投与することを含むものなどである。
アルツハイマー病およびダウン症候群アミロイドーシスに対する注入モデル
それぞれのパーレカンドメインIスプライシング変異体を十分量産生し、アミロイドーシスの新規動物モデルの産生に利用することも可能である。この適用目的のため、パーレカンドメインIスプライシング変異体は、a)コアタンパク質および結合するGAG鎖両方を含むパーレカン変異体、b)パーレカンコアタンパク質のみ、またはc)パーレカンスプライシング変異体由来のパーレカンGAG鎖、または上記のすべての断片またはすべての組み合わせを指す可能性がある。例えば、新規アルツハイマー病アミロイドーシスモデルとして、パーレカンドメインIスプライシング変異体を、ベータ−アミロイドタンパク質(Aβ)と共に連続的に複数群のラットまたはマウスの海馬に注入してもよい。好ましい態様において、パーレカンドメインIスプライシング変異体(25μg)を50μgのAβ(1-40)または(1-42)を含む微量遠心管中で水に溶解する。本明細書に援用される、Snowら(Neuron 12:219-234, 1994)に記載された方法を用いて、パーレカンドメインIスプライシング変異体+Aβを連続的に1週間、複数群(通常10)の3か月齢SD(Sprague-Dawley)ラットの海馬に注入(当業者に知られる定位固定手術による)する。1週間注入した後、動物を屠殺し、そしてSnowら(Neuron 12:219-234, 1994)に記載されたように脳を除き、そしてパラフィン包埋ブロックまたは凍結切片から、全注入部位に渡るように6-8μmの連続切片を切り取る。その後、動物あたりのアミロイド沈着量をコンゴ−レッド染色(偏光下で視覚化)またはチオフラビンS蛍光により検出し、そしてSnowら(Neuron 12:219-234, 1994)に記載されるように、恣意的スコアリング法を用いた盲検により定量化する。本モデル中でパーレカンドメインIスプライシング変異体ペプチドおよび/またはタンパク質を使用することにより、in vivoの原繊維性Aβアミロイド沈着、集積および持続の迅速モデルとして使用することが可能である。さらに、本モデルは、原繊維性Aβアミロイド形成、沈着、集積および/または持続を標的とする潜在的治療薬を迅速にスクリーニングするのに用いてもよい。好ましい態様において、パーレカンドメインIスプライシング変異体+Aβ+治療化合物は、一群の動物の海馬に直接注入(上述のように)し、そしてパーレカンドメインIスプライシング変異体+Aβのみを注入された一群の動物との比較を行う。In vivoでアミロイド形成、沈着、集積および/または持続(コンゴ−レッドまたはチオフラビンS蛍光により測定)を減少させることがわかった化合物または薬剤はその後、潜在的治療的価値を有すると同定される。
それぞれのパーレカンドメインIスプライシング変異体を十分量産生し、AAアミロイドーシスの新規動物モデルの産生に利用することも可能である。例えば、パーレカンドメインIスプライシング変異体を、AAアミロイドタンパク質と共に、ラットまたはマウスの全身器官(すなわち、腎臓、肝臓、脾臓、肺または心臓)に連続的に注入、または尾静脈に毎日注射してもよい。好ましい態様において、パーレカンドメインIスプライシング変異体をAAアミロイドタンパク質を含む微量遠心管中で水に溶解する。Snowら(Neuron 12:219-234, 1994)に記載された方法を用いて、パーレカンドメインIスプライシング変異体+AAアミロイドを連続的に1週間、複数群(通常10)の成獣ラットまたはマウスの、選択した全身器官に注入(当業者に知られる定位固定手術による)する。また別に、AAアミロイドタンパク質+/-パーレカンドメインIスプライシング変異体を一群のマウスまたはラットの尾静脈内に毎日注射する。1週間の実験期間の後、動物を屠殺し、そして全身器官を除き、そして関心事の組織を含むパラフィン包埋ブロックまたは凍結切片から、6-8μmの連続切片を切り取る。その後、動物あたりのそれぞれの組織中のアミロイド沈着量をコンゴ−レッド染色(偏光下で視覚化)またはチオフラビンS蛍光により検出し、そしてSnowら(Neuron 12:219-234, 1994)に記載されるように、恣意的スコアリング法を用いた盲検により定量化した。本モデル中でパーレカンドメインIスプライシング変異体ペプチドおよび/またはタンパク質を使用することにより、in vivoの原繊維性AAアミロイド沈着、集積および持続の迅速モデルとして使用することが可能である。さらに、本モデルは、AAアミロイド形成、沈着、集積および/または持続を標的とする潜在的治療薬を迅速にスクリーニングするのに用いてもよい。好ましい態様において、パーレカンドメインIスプライシング変異体+AAアミロイド+治療化合物を、一群の動物に直接注入または注射(上述のように)し、そしてパーレカンドメインIスプライシング変異体+AAのみを注入または注射された一群の動物との比較を行う。In vivoでアミロイド形成、沈着、集積および/または持続(コンゴ−レッドまたはチオフラビンSスコアリングにより測定)を減少させることがわかった化合物または薬剤はその後、潜在的治療的価値を有すると同定される。
それぞれのパーレカンドメインIスプライシング変異体を十分量産生し、ALアミロイドーシスの新規動物モデルの産生に利用することも可能である。例えば、パーレカンドメインIスプライシング変異体を、ALアミロイドタンパク質と共に、ラットまたはマウスの全身器官(すなわち、腎臓、肝臓、脾臓、肺または心臓)に連続的に注入、または尾静脈に毎日注射してもよい。好ましい態様において、パーレカンドメインIスプライシング変異体をALアミロイドタンパク質を含む微量遠心管中で水に溶解する。Snowら(Neuron 12:219-234, 1994)に記載された方法を用いて、パーレカンドメインIスプライシング変異体+ALアミロイドを連続的に1週間、複数群(通常10)の成獣ラットまたはマウスの、選択された全身器官に注入(当業者に知られる定位固定手術による)する。また別に、ALアミロイドタンパク質+/-パーレカンドメインIスプライシング変異体を一群のラットまたはマウスの尾静脈内に毎日注射する。1週間の実験期間の後、動物を屠殺し、そして全身器官を除き、そして関心事の組織を含むパラフィン包埋ブロックまたは凍結切片から、6-8μmの連続切片を切り取る。その後、動物あたりのそれぞれの組織中のアミロイド沈着量をコンゴ−レッド染色(偏光下で視覚化)またはチオフラビンS蛍光により検出し、そしてSnowら(Neuron 12:219-234, 1994)に記載されるように、恣意的スコアリング法を用いた盲検により定量化する。本モデル中でパーレカンドメインIスプライシング変異体ペプチドおよび/またはタンパク質を使用することにより、in vivoの原繊維性ALアミロイド沈着、集積および持続の迅速モデルとして使用することが可能である。さらに、本モデルは、ALアミロイド形成、沈着、集積および/または持続を標的とする潜在的治療薬を迅速にスクリーニングするのに用いてもよい。好ましい態様において、パーレカンドメインIスプライシング変異体+ALアミロイド+治療化合物を、一群の動物に直接注入または注射(上述のように)し、そしてパーレカンドメインIスプライシング変異体+ALアミロイドのみを注入された一群の動物との比較を行う。In vivoでアミロイド形成、沈着、集積および/または持続(コンゴ−レッドまたはチオフラビンSスコアリングにより測定)を減少させることがわかった化合物または薬剤はその後、潜在的治療的価値を有すると同定される。
それぞれのパーレカンドメインIスプライシング変異体を十分量産生し、トランスチレチン/プレアルブミンアミロイドーシスの新規動物モデルの産生に利用することも可能である。例えば、パーレカンドメインIスプライシング変異体を、さまざまな正常または突然変異トランスチレチン/プレアルブミンタンパク質と共に、ラットまたはマウスの坐骨神経、脊髄神経節または自律神経節に連続的に注入または毎日注射してもよい。好ましい態様において、パーレカンドメインIスプライシング変異体を正常または突然変異トランスチレチン/プレアルブミンタンパク質を含む微量遠心管中で水に溶解する。Snowら(Neuron 12:219-234, 1994)に記載された方法を用いて、パーレカンドメインIスプライシング変異体+正常または突然変異トランスチレチン/プレアルブミンアミロイドを連続的に1週間、複数群(通常10)の成獣ラットまたはマウスの坐骨神経、脊髄神経節または自律神経節に注入(当業者に知られる定位固定手術による)する。また別に、正常または突然変異トランスチレチン/プレアルブミン+/-パーレカンドメインIスプライシング変異体を一群のマウスまたはラットの坐骨神経、脊髄神経節または自律神経節に毎日注射する。1週間の実験期間の後、動物を屠殺し、そして関係する組織を除き、そして関心事の組織を含むパラフィン包埋ブロックまたは凍結切片から、6-8μmの連続切片を切り取る。その後、動物あたりのそれぞれの組織中のアミロイド沈着量をコンゴ−レッド染色(偏光下で視覚化)またはチオフラビンS蛍光により検出し、そしてSnowら(Neuron 12:219-234, 1994)に記載されるように、恣意的スコアリング法を用いた盲検により定量化する。本モデル中でパーレカンドメインIスプライシング変異体ペプチドおよび/またはタンパク質を使用することにより、in vivoの原繊維性トランスチレチン/プレアルブミンアミロイド沈着、集積および持続の迅速モデルとして使用することが可能である。さらに、本モデルは、トランスチレチン/プレアルブミンアミロイド形成、沈着、集積および/または持続を標的とする潜在的治療薬を迅速にスクリーニングするのに用いてもよい。好ましい態様において、パーレカンドメインIスプライシング変異体+正常または突然変異トランスチレチン/プレアルブミン+治療化合物を、一群の動物に直接注入または注射(上述のように)し、そしてパーレカンドメインIスプライシング変異体+正常または突然変異トランスチレチン/プレアルブミンのみを注入または注射された一群の動物との比較を行う。In vivoでアミロイド形成、沈着、集積および/または持続(コンゴ−レッドまたはチオフラビンSスコアリングにより測定)を減少させることがわかった化合物または薬剤はその後、潜在的治療的価値を有すると同定される。
それぞれのパーレカンドメインIスプライシング変異体を十分量産生し、ベータ2−ミクログロブリンアミロイドーシスの新規動物モデルの産生に利用することも可能である。例えば、パーレカンドメインIスプライシング変異体を、ベータ2−ミクログロブリンと共に、ラットまたはマウスの血流(例えば、外頚静脈から上大静脈を通して)に連続的に注入、または腱または後肢(内側神経に隣接)に毎日注射してもよい。好ましい態様において、パーレカンドメインIスプライシング変異体をベータ2−ミクログロブリンを含む微量遠心管中で水に溶解する。Snowら(Neuron 12:219-234, 1994)に記載された方法を用いて、パーレカンドメインIスプライシング変異体+ベータ2−ミクログロブリンを連続的に1週間、複数群(通常10)の成獣ラットまたはマウスの血流に注入(当業者に知られる定位固定手術による)する。また別に、ベータ2−ミクログロブリン+/-パーレカンドメインIスプライシング変異体を一群のラットまたはマウスの腱または後肢に毎日注射する。1週間の実験期間の後、動物を屠殺し、そして関係する組織を除き、そして関心事の組織を含むパラフィン包埋ブロックまたは凍結切片から、6-8μmの連続切片を切り取る。動物あたりのそれぞれの組織中のアミロイド沈着量をコンゴ−レッド染色(偏光下で視覚化)またはチオフラビンS蛍光により検出し、そしてSnowら(Neuron 12:219-234, 1994)に記載されるように、恣意的スコアリング法を用いた盲検により定量化する。本モデル中でパーレカンドメインIスプライシング変異体ペプチドおよび/またはタンパク質を使用することにより、in vivoのベータ2−ミクログロブリンアミロイド沈着、集積および持続の迅速モデルとして使用することが可能である。さらに、本モデルは、ベータ2−ミクログロブリンアミロイド形成、沈着、集積および/または持続を標的とする潜在的治療薬を迅速にスクリーニングするのに用いてもよい。好ましい態様において、パーレカンドメインIスプライシング変異体+ベータ2−ミクログロブリン+治療化合物は、一群の動物に直接注入または注射(上述のように)し、そしてパーレカンドメインIスプライシング変異体+ベータ2−ミクログロブリンのみを注入または注射された一群の動物との比較を行う。In vivoでアミロイド形成、沈着、集積および/または持続(コンゴ−レッドまたはチオフラビンSスコアリングにより測定)を減少させることがわかった化合物または薬剤はその後、潜在的治療的価値を有すると同定される。
それぞれのパーレカンドメインIスプライシング変異体を十分量産生し、アミリン(小島アミロイド)アミロイドーシスの新規動物モデルの産生に利用することも可能である。例えば、パーレカンドメインIスプライシング変異体を、ヒトアミリンと共に、ラットまたはマウスのすい臓または血流に連続的に注入または毎日注射してもよい。好ましい態様において、パーレカンドメインIスプライシング変異体をアミリンを含む微量遠心管中で水に溶解する。Snowら(Neuron 12:219-234, 1994)に記載された方法を用いて、パーレカンドメインIスプライシング変異体+アミリンを連続的に1週間、複数群(通常10)の成獣ラットまたはマウスのすい臓または血流に注入(当業者に知られる定位固定手術による)または毎日注射する。1週間の実験期間の後、動物を屠殺し、そしてすい臓を除き、そしてすい臓を含むパラフィン包埋ブロックまたは凍結切片から、6-8μmの連続切片を切り取る。その後、動物あたりのすい臓のアミロイド沈着量をコンゴ−レッド染色(偏光下で視覚化)またはチオフラビンS蛍光により検出し、そしてSnowら(Neuron 12:219-234, 1994)に記載されるように、恣意的スコアリング法を用いた盲検により定量化する。本モデル中でパーレカンドメインIスプライシング変異体ペプチドおよび/またはタンパク質を使用することにより、in vivoのアミリン(小島アミロイド)アミロイド沈着、集積および持続の迅速モデルとして使用することが可能である。さらに、本モデルは、アミリン(小島アミロイド)形成、沈着、集積および/または持続を標的とする潜在的治療薬を迅速にスクリーニングするのに用いてもよい。好ましい態様において、パーレカンドメインIスプライシング変異体+アミリン+治療化合物は、一群の動物に直接注入または注射(上述のように)し、そしてパーレカンドメインIスプライシング変異体+アミリンのみを注入または注射された一群の動物との比較を行う。In vivoでアミロイド形成、沈着、集積および/または持続(コンゴ−レッドまたはチオフラビンSスコアリングにより測定)を減少させることがわかった化合物または薬剤はその後、潜在的治療的価値を有すると同定される。
それぞれのパーレカンドメインIスプライシング変異体を十分量産生し、II型(インシュリン非依存性)糖尿病患者のすい臓ランゲルハンス島だけでなく、甲状腺髄様癌などの内分泌腫瘍にカルシトニン変異体が見られる場合などの、内分泌アミロイドーシスの新規動物モデルの産生に利用することも可能である。例えば、パーレカンドメインIスプライシング変異体を、カルシトニンと共に、ラットまたはマウスの甲状腺またはすい臓に連続的に注入または毎日注射してもよい。好ましい態様において、パーレカンドメインIスプライシング変異体をカルシトニンを含む微量遠心管中で水に溶解する。Snowら(Neuron 12:219-234, 1994)に記載された方法を用いて、パーレカンドメインIスプライシング変異体+カルシトニンを連続的に1週間、複数群(通常10)の成獣ラットまたはマウスの甲状腺またはすい臓に注入(当業者に知られる定位固定手術による)または毎日注射する。1週間の実験期間の後、動物を屠殺し、そして甲状腺またはすい臓を除き、そして甲状腺またはすい臓を含むパラフィン包埋ブロックまたは凍結切片から、6-8μmの連続切片を切り取る。その後、動物あたりの甲状腺またはすい臓のアミロイド沈着量をコンゴ−レッド染色(偏光下で視覚化)またはチオフラビンS蛍光により検出し、そしてSnowら(Neuron 12:219-234, 1994)に記載されるように、恣意的スコアリング法を用いた盲検により定量化する。本モデル中でパーレカンドメインIスプライシング変異体ペプチドおよび/またはタンパク質を使用することにより、in vivoの内分泌アミロイド沈着、集積および持続の迅速モデルとして使用することが可能である。さらに、本モデルは、内分泌アミロイド形成、沈着、集積および/または持続を標的とする潜在的治療薬を迅速にスクリーニングするのに用いてもよい。好ましい態様において、パーレカンドメインIスプライシング変異体+カルシトニン+治療化合物は、一群の動物に直接注入または注射(上述のように)し、そしてパーレカンドメインIスプライシング変異体+カルシトニンのみを注入または注射された一群の動物との比較を行う。In vivoでアミロイド形成、沈着、集積および/または持続(コンゴ−レッドまたはチオフラビンSスコアリングにより測定)を減少させることがわかった化合物または薬剤はその後、潜在的治療的価値を有すると同定される。
それぞれのパーレカンドメインIスプライシング変異体を十分量産生し、プリオンタンパク質(PrP)アミロイドーシスの新規動物モデルの産生に利用することも可能である。例えば、パーレカンドメインIスプライシング変異体を、PrPタンパク質と共に、複数群のラットまたはマウスの海馬に連続的に注入してもよい。好ましい態様において、パーレカンドメインIスプライシング変異体をPrP27-30を含む微量遠心管中で水に溶解する。Snowら(Neuron 12:219-234, 1994)に記載された方法を用いて、パーレカンドメインIスプライシング変異体+PrPを連続的に1週間、複数群(通常10)の成獣ラットまたはマウスの海馬に注入(当業者に知られる定位固定手術による)する。1週間の実験期間の後、動物を屠殺し、そしてSnowら(Neuron 12:219-234, 1994)に記載されるように脳を除き、そしてパラフィン包埋ブロックまたは凍結切片から、全注入部位に渡る6-8μmの連続切片を切り取る。その後、動物あたりのアミロイド沈着量をコンゴ−レッド染色(偏光下で視覚化)またはチオフラビンS蛍光により検出し、そしてSnowら(Neuron 12:219-234, 1994)に記載されるように、恣意的スコアリング法を用いた盲検により定量化する。本モデル中でパーレカンドメインIスプライシング変異体ペプチドおよび/またはタンパク質を使用することにより、in vivoのPrPアミロイド沈着、集積および持続の迅速モデルとして使用することが可能である。さらに、本モデルは、PrPアミロイド形成、沈着、集積および/または持続を標的とする潜在的治療薬を迅速にスクリーニングするのに用いてもよい。好ましい態様において、パーレカンドメインIスプライシング変異体+PrP27-30+治療化合物を、一群の動物に直接海馬に注入(上述のように)し、そしてパーレカンドメインIスプライシング変異体+PrP27-30のみを注入または注射された一群の動物との比較を行う。In vivoでアミロイド形成、沈着、集積および/または持続(コンゴ−レッドまたはチオフラビンSスコアリングにより測定)を減少させることがわかった化合物または薬剤はその後、潜在的治療的価値を有すると同定される。
トランスジェニック動物、特にFukuchi, A. SnowおよびJ. Hassellにより1997年6月に提出され、そして本明細書中に完全に説明されるかのように援用される米国特許出願第08/870,987号に見られるトランスジェニックマウスを作成する手段および方法の開示に従い、本発明の別の側面は、多くの疾患および/または病変過程に関連する特定の表現型を産生する努力の中で、特定のパーレカンドメインIスプライシング変異体を過剰発現するまたはノックアウトされた新規トランスジェニック動物を産生することである。これら新規パーレカンドメインIスプライシング変異体トランスジェニック動物の産生のため、一般的に、プラスミドクローン(本明細書に記載)由来のスプライシング変異体cDNA配列を、正常ヒトパーレカンcDNA(上述の援用される参考文献に記載されるように、正しいプロモーターおよびエンハンサー領域を持つ発現ベクター中のものが入手可能)の正しい領域に連結させることが関与するであろう。パーレカンスプライシング変異体発現ベクターはその後、マウス卵または胚性幹細胞に挿入され、そして上述の援用される参考文献に記載されるような既知の、ルーチンの方法により、トランスジェニックマウスが産生されるであろう。これらトランスジェニックマウスを産生し、そしてこれらマウスを既定のアミロイドタンパク質またはその前駆体タンパク質を過剰発現するトランスジェニック動物と交配させることにより、既定のアミロイド疾患の表現型病変の多くまたはすべてを発現する子孫が産生されるであろう。アミロイド疾患の新規トランスジェニック動物モデルを産生し、アミロイドーシスの、およびこれら疾患に関連する臨床表現(上述の援用される参考文献に記載される)治療の、リード治療薬を同定する一助となるin vivoスクリーニングの道具として使用してもよい。パーレカンドメインIスプライシング変異体をうまく過剰発現したトランスフェクションされた細胞もまた、さまざまなin vitroおよびin vivo検定のためにパーレカンドメインIスプライシング変異体を使用したいという増大しつつある要求に答えるであろう、これらパーレカンドメインIスプライシング変異体を単離する新規手段として用いてもよい。
(2) 配列情報 SEQ ID NO:1:
(i) 配列の特性:
(A)長さ: 573 ヌクレオチド
(B)型: 核酸
(C)鎖の数: 一本鎖
(D)トポロジー: 直鎖状
(E)核酸番号はTRANSLATION OF GENBANK ACCESSION #M85289による
(ii)配列の種類:cDNA
(xi)配列: SEQ ID NO:1:
ATGGGGTGGC GGGCGCCGGG CGCGCTGCTG CTGGCGCTGC TGCTGCACGG 130
GCGGCTGCTG GCGGTGACCC ATGGGCTGAG GGCATACGAT GGCTTGTCTC 180
TGCCTGAGGA CACAGAGACC GTCACAGCAA GCCAAATGCG CTGGACACAT 230
TCGTACCTTT CTGATGATGA GGACATGCTG GCTGACAGCA TCTCAGGAGA 280
CGACCTGGGC AGTGGGGACC TGGGCAGCGG GGACTTCCAG ATGGTTTATT 330
TCCGAGCCCT GGTGAATTTC ACTCGCTCCA TCGAGTACAG CCCTCAGCTG 380
GAGGATGCAG GCTCCAGAGA GTTTCGAGAG GTGTCCGAGG CTGTGGTAGA 430
CACGGGAGCT GGATGGCTGG GTTTTTGTGG AGCTCGATGT GGGCTCCGAA 480
GGGAATGCGG ATGGTGCTCA GATTCAGGAG ATGCTGCTCA GGGTCATCTC 530
CAGCGGCTCT GTGGCCTCCT ACGTCACCTC TCCCCAGGGA TTCCAGTTCC 580
GACGCCTGGG CACAGTGCCC CAGTTCCCAA GAGCCTGCAC GGAGGCCGAG 630
TTTGCCTGCC ACAGCTACAA TGA 635
(2) 配列情報 SEQ ID NO:2:
(i) 配列の特性:
(A)長さ: 219 ヌクレオチド
(B)型: 核酸
(C)鎖の数: 一本鎖
(D)トポロジー: 直鎖状
(E)核酸番号はTRANSLATION OF GENBANK ACCESSION #M85289による
(ii)配列の種類: cDNA
(xi)配列: SEQ ID NO:2:
....GGAGCT GGATGGCTGG GTTTTTGTGG AGCTCGATGT GGGCTCCGAA 480
GGGAATGCGG ATGGTGCTCA GATTCAGGAG ATGCTGCTCA GGGTCATCTC 530
CAGCGGCTCT GTGGCCTCCT ACGTCACCTC TCCCCAGGGA TTCCAGTTCC 580
GACGCCTGGG CACAGTGCCC CAGTTCCCAA GAGCCTGCAC GGAGGCCGAG 630
TTTGCCTGCC ACAGCTACAA TGA 635
(2) 配列情報 SEQ ID NO:3:
(i) 配列の特性:
(A)長さ: 190 アミノ酸
(B)型: アミノ酸
(C)鎖の数:
(D)トポロジー: 直鎖状
(E)アミノ酸番号はTRANSLATION OF GENBANK ACCESSION #M85289による
(ii)配列の種類: タンパク質
((xi) 配列: SEQ ID NO:3:
Met Gly Trp Arg Ala Pro Gly Ala Leu Leu Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Gly Arg Leu Leu Ala Val Thr His Gly Leu Arg Ala Tyr Asp
20 25 30
Gly Leu Ser Leu Pro Glu Asp Thr Glu Thr Val Thr Ala Ser Gln
35 40 45
Met Arg Trp Thr His Ser Tyr Leu Ser Asp Asp Glu Asp Met Leu
50 55 60
Ala Asp Ser Ile Ser Gly Asp Asp Leu Gly Ser Gly Asp Leu Gly
65 70 75
Ser Gly Asp Phe Gln Met Val Tyr Phe Arg Ala Leu Val Asn Phe
80 85 90
Thr Arg Ser Ile Glu Tyr Ser Pro Gln Leu Glu Asp Ala Gly Ser
95 100 105
Arg Glu Phe Arg Glu Val Ser Glu Ala Val Val Asp Thr Gly Ala
110 115 120
Gly Trp Leu Gly Phe Cys Gly Ala Arg Cys Gly Leu Arg Arg Glu
125 130 135
Cys Gly Trp Cys Ser Asp Ser Gly Asp Ala Ala Gln Gly His Leu
140 145 150
Gln Arg Leu Cys Gly Leu Leu Arg His Leu Ser Pro Gly Ile Pro
155 160 165
Val Pro Thr Pro Gly His Ser Ala Pro Val Pro Lys Ser Leu His
170 175 180
Gly Gly Arg Val Cys Leu Pro Gln Leu Gln End
185 190
(2) 配列情報 SEQ ID NO:4:
(i) 配列の特性:
(A)長さ: 72アミノ酸
(B)型: アミノ酸
(C)鎖の数:
(D)トポロジー: 直鎖状
(E)アミノ酸番号はTRANSLATION OF GENBANK ACCESSION #M85289による
(ii)配列の種類: タンパク質
(xi)配列: SEQ ID NO:4:
Gly Ala Gly Trp Leu Gly Phe Cys Gly Ala Arg Cys Gly Leu Arg
123 128 133
Arg Glu Cys Gly Trp Cys Ser Asp Ser Gly Asp Ala Ala Gln Gly
138 143 148
His Leu Gln Arg Leu Cys Gly Leu Leu Arg His Leu Ser Pro Gly
153 158 163
Ile Pro Val Pro Thr Pro Gly His Ser Ala Pro Val Pro Lys Ser
168 173 178
Leu His Gly Gly Arg Val Cys Leu Pro Gln Leu Gln End
183 188
(2) 配列情報 SEQ ID NO:5:
(i) 配列の特性:
(A)長さ: 各々20ヌクレオチド
(B)型: 核酸
(C)鎖の数: 一本鎖
(D)トポロジー: 直鎖状
(ii)配列の種類: オリゴヌクレオチドプライマー
(xi)配列: SEQ ID NO:5:
RhPerEx4/6 5'CATCCAGCTCCCGTGTCTAC 3'
F2hPer1DI 5'CTGAGGACATAGAGACCGTC 3'
(2) 配列情報 SEQ ID NO:6:
(i) 配列の特性:
(A)長さ: 312 ヌクレオチド
(B)型: 核酸
(C)鎖の数: 一本鎖
(D)トポロジー: 直鎖状
(E)核酸番号はTRANSLATION OF GENBANK ACCESSION #M85289による
(ii)配列の種類: cDNA
(xi)配列: SEQ ID NO:6:
ATGGGGTGGC GGGCGCCGGG CGCGCTGCTG CTGGCGCTGC TGCTGCACGG 130
GCGGCTGCTG GCGGTGACCC ATGGGCTGAG GGCATACGAT GGCTTGTCTC 180
TGCCTGAGGA CATAGAGACC GTCACAGCAA GCCARATGCG CTGGACACAT 230
TCGTACCTTT CTGATGATGA GGACATGCTG GCTGACAGCA TCTCAGGAGA 280
CGACCTGGGC AGTGGGGACC TGGGCAGCGG GGACTTCCAG ATGGTTTAAG 330
GAGATGCTGC TCAGGGTTCA TCTCCAGCGG CTCTGTGGCC TCCTACGTCA 380
CCTCTCCCCA GG 392
(2) 配列情報 SEQ ID NO:7:
(i) 配列の特性:
(A)長さ: 82アミノ酸
(B)型: アミノ酸
(C)鎖の数:
(D)トポロジー: 直鎖状
(E)アミノ酸番号はTRANSLATION OF GENBANK ACCESSION #M85289による
(ii)配列の種類: タンパク質
(xi)配列: SEQ ID NO:7:
Met Gly Trp Arg Ala Pro Gly Ala Leu Leu Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Gly Arg Leu Leu Ala Val Thr His Gly Leu Arg Ala Tyr Asp
20 25 30
Gly Leu Ser Leu Pro Glu Asp Ile Glu Thr Val Thr Ala Ser Gln
35 40 45
Met Arg Trp Thr His Ser Tyr Leu Ser Asp Asp Glu Asp Met Leu
50 55 60
Ala Asp Ser Ile Ser Gly Asp Asp Leu Gly Ser Gly Asp Leu Gly
65 70 75
Ser Gly Asp Phe Gln Met Val End
80
(2) 配列情報 SEQ ID NO:8:
(i) 配列の特性:
(A)長さ: 各々22及び19ヌクレオチド
(B)型: 核酸
(C)鎖の数: 一本鎖
(D)トポロジー: 直鎖状
(ii)配列の種類: オリゴヌクレオチドプライマー
(xi)配列: SEQ ID NO:8:
FhEx3/6.5 5'CAGATGGTTTAAGGAGATGCTG 3'
RPer1DI 5'TGTGCCCAGGCGTCGGAAC 3'
(2) 配列情報 SEQ ID NO:9:
(i) 配列の特性:
(A)長さ: 33ヌクレオチド
(B)型: 核酸
(C)鎖の数: 一本鎖
(D)トポロジー: 直鎖状
(E)核酸番号はTRANSLATION OF GENBANK ACCESSION #M85289による
(ii)配列の種類: cDNA
(xi)配列: SEQ ID NO:9:
GGCTCAGGGC AGCCCCTGGG CCGCCCGCCC GTG 371
(2) 配列情報 SEQ ID NO:10:
(i) 配列の特性:
(A)長さ: 11アミノ酸
(B)型: アミノ酸
(C)鎖の数:
(D)トポロジー: 直鎖状
(E)アミノ酸番号はTRANSLATION OF GENBANK ACCESSION #M85289による
(ii)配列の種類: タンパク質
(xi)配列: SEQ ID NO:10:
Gly Ser Gly Gln Pro Leu Gly Arg Pro Pro Val
91 96
(2) 配列情報 SEQ ID NO:11:
(i) 配列の特性:
(A)長さ: 各々21及び19ヌクレオチド
(B)型: 核酸
(C)鎖の数: 一本鎖
(D)トポロジー: 直鎖状
(ii)配列の種類: オリゴヌクレオチドプライマー
(xi)配列: SEQ ID NO:11:
FhEx178 5'CGCCCGTGGCTGGTGAATTTC 3'
RPer1DI 5'TGTGCCCAGGCGTCGGAAC 3'
(2) 配列情報 SEQ ID NO:12:
(i) 配列の特性:
(A)長さ: 75ヌクレオチド
(B)型: 核酸
(C)鎖の数: 一本鎖
(D)トポロジー: 直鎖状
(E)核酸番号はTRANSLATION OF GENBANK ACCESSION #M85289による
(ii)配列の種類: cDNA
(xi)配列: SEQ ID NO:12:
GCTCAGGGCA GCCCCTGGGC CGCCCGCCCG TGGCTGGCAT GATGGTCTCG 374
GAGCCTGATG AGGAGTCCCC TCTCA 399
(2) 配列情報 SEQ ID NO:13:
(i) 配列の特性:
(A)長さ: 26アミノ酸
(B)型: アミノ酸
(C)鎖の数:
(D)トポロジー: 直鎖状
(E)アミノ酸番号はTRANSLATION OF GENBANK ACCESSION #M85289による
(ii)配列の種類: タンパク質
(xi)配列: SEQ ID NO:13:
Gly Ser Gly Gln Pro Leu Gly Arg Pro Pro Val Ala Gly Met Met
86 91 96
Val Ser Glu Pro Asp Glu Glu Ser Pro Leu Ile
101 106
(2) 配列情報 SEQ ID NO:14:
(i) 配列の特性:
(A)長さ: 各々22及び19ヌクレオチド
(B)型: 核酸
(C)鎖の数: 一本鎖
(D)トポロジー: 直鎖状
(ii)配列の種類: オリゴヌクレオチドプライマー
(xi)配列: SEQ ID NO:14:
FhEx181 5'GTCCCTCTCATTTATTTCCGA 3'
RPer1DI 5'TGTGCCCAGGCGTCGGAAC 3'
(2) 配列情報 SEQ ID NO:15
(i) 配列の特性:
(A)長さ: 17アミノ酸
(B)型: アミノ酸
(C)鎖の数: 一本鎖
(D)トポロジー: 直鎖状
(ii)配列の種類: タンパク質
(xi)配列: SEQ ID NO:15:
Pro Thr Pro Gly His Ser Ala Pro Val Pro Lys Ser Leu His Gly
Gly Arg
(2) 配列情報 SEQ ID NO:16:
(i) 配列の特性:
(A)長さ: 19アミノ酸
(B)型: アミノ酸
(C)鎖の数: 一本鎖
(D)トポロジー: 直鎖状
(ii)配列の種類: タンパク質
(xi)配列: SEQ ID NO:16:
Gln Pro Leu Gly Arg Pro Pro Val Ala Gly Met Met Val Ser Glu
Pro Asp Glu Glu
Claims (4)
- 試料中のメッセンジャーRNA(mRNA)から相補的DNA(cDNA)を作成し、
パーレカン遺伝子またはその一部に対応するcDNA部分を増幅し、そして
増幅されたcDNAを検出する
ことを含む、試料中のパーレカンドメインI遺伝子のスプライシング変異体の検出および/または定量法であって、パーレカンドメインIのスプライシング変異体の増幅および検出において、配列5' CATCCAGCTCCCGTGTCTAC 3'を有するプライマーと配列5' CTGAGGACATAGAGACCGTC 3'を有するプライマーとを使用する、前記方法。 - パーレカンドメインIのエクソン5欠失スプライシング変異体のレベルの上昇が、アルツハイマー病の存在、アルツハイマー病への感受性、またはアルツハイマー病の進行の指標である、アルツハイマー病またはアルツハイマー病への感受性を診断するために使用される、請求項1の方法。
- 宿主由来の試料中に、SEQ ID NO: 4のアミノ酸配列、アミノ酸22から開始するSEQ ID NO: 3のアミノ酸配列、およびSEQ ID NO: 3のアミノ酸配列、からなる群から選択されるパーレカンドメインIのスプライシング変異体が存在するかを解析することを含む、診断方法。
- a)SEQ ID NO: 4のアミノ酸配列、アミノ酸22から開始するSEQ ID NO: 3のアミノ酸配列、およびSEQ ID NO: 3のアミノ酸配列、からなる群から選択されるパーレカンドメインIのスプライシング変異体に対して特異的な抗体を、結合するに十分な時間、マイクロタイターウェルに結合させ、
b)ある量の生物学的液体を加え、
c)前記生物学的液体を、パーレカンドメインIのエクソン5欠失スプライシング変異体が、マイクロタイターウェル上の工程a)記載の抗体に結合させるために十分な時間、インキュベートさせ、
d)マイクロタイターウェルを洗浄して、すべての非結合試料を除き、
e)パーレカンドメインIのエクソン5欠失スプライシング変異体の工程a)に記載の抗体とは異なるエピトープに結合する第二の標識抗体を加え、そして前記工程a)に記載の抗体により結合されたパーレカンドメインIのエクソン5欠失スプライシング変異体に第二の標識抗体を結合させ、そして
f)結合成分を検出すること、
を含む、生物学的液体中のパーレカンドメインIのエクソン5欠失スプライシング変異体の検出および定量方法。
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