DE19909156A1 - Testsystem zum Nachweis einer Spleißreaktion, sowie dessen Verwendung - Google Patents
Testsystem zum Nachweis einer Spleißreaktion, sowie dessen VerwendungInfo
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Abstract
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Testsystem, enthaltend DOLLAR A (a) eine oder mehrere, gleiche oder verschiedene immobilisierte Nukleinsäure/n mit mindestens einer spleißfähigen Nukleinsäure, DOLLAR A (b) mindestens ein gelfreies Nachweissystem zum Nachweis einer Spleißreaktion, gegebenenfalls DOLLAR A (g) mindestens eine Zusammensetzung, enthaltend Spleißkomponenten, und vorzugsweise DOLLAR A (h) geeignete Nachweissonden, und gegebenenfalls DOLLAR A (e) weitere Hilfsmittel.
Description
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Testsystem enthaltend
- a) eine oder mehrere, gleiche oder verschiedene immobilisierte Nukleinsäure/n mit mindestens einer spleißfähigen Nukleinsäure,
- b) mindestens ein gelfreies Nachweissystem zum Nachweis einer Spleißreaktion, gegebenenfalls
- c) mindestens eine Zusammensetzung enthaltend Spleißkomponenten, und vorzugsweise
- d) geeignete Nachweissonden, und gegebenenfalls
- e) weitere Hilfsmittel.
Die meisten für Proteine kodierenden Gene in Eukaryonten werden in ihrer Form im Genom
durch eine oder mehrere nicht für das Protein kodierende Sequenzen (Introns) unterbrochen.
Bei der Transkription der genomischen DNA in die Boten-RNA (messenger RNA = mRNA)
werden diese nicht-codierenden Bereiche (Introns) in das primäre Transkript übernommen. Um
eine korrekte Form der mRNA zu generieren, muß diese Vorläufer-mRNA (Prä-mRNA) pro
zessiert werden.
Die Prozessierung der Prä-mRNA geschieht durch Entfernen der Introns und Fusion der kodie
renden Bereiche (Exons). Erst dann kann ein ununterbrochen zu lesender Nukleotidstrang für
die Translation im Zytoplasma zur Verfügung gestellt werden. Die Bildung von mRNA in Eu
karyonten erfordert daher einen sogenannten Spleißprozess, in dem die nicht kodierenden
Genbereiche (Introns) aus dem primären Gentranskript entfernt werden.
Das Spleißen findet im Kern statt, bevor die mRNA aus dem Kern transportiert wird. Es wird
im allgemeinen in einem Zwei-Stufen-Mechanismus durchgeführt, in dem jeweils ein Transeste
rifizierungsschritt beteiligt ist (Moore, J.M. et al., (1993) Splicing of precursors to messenger
RNAs by the Spliceosome. In The RNA world, Edited by Gesteland R.F., Gesteland, J.F.,
Cold Spring Harbor Laboratory Press, 303-358). Der erste Schritt generiert ein freies 5'-Exon
und eine sogenannte Lariat-Struktur des Introns, welches immer noch mit dem 3'-Exon ver
bunden ist. Die Lariat-Struktur enthält eine verzweigte RNA, die durch eine Veresterung des
5'-Endes des Introns mit einer 2'-Hydroxyl-Gruppe einer Ribose in einem Adenosin, das ca. 20-
40 Nukleotide stromaufwärts des 3'-Endes des Introns gelegen ist, entsteht. Der zweite ka
talytische Schritt führt zu einer Ligation der Exons und der Freisetzung des Introns. Obwohl
keine Nukleotide während dieser Reaktionen eingebaut werden, ist eine Energiequelle, bei
spielsweise ATP, für diese Katalyse notwendig (Guthrie, C. (1991) Science, 253, 157).
An dem Vorgang des mRNA-Spleißens sind mehrere Faktoren beteiligt. Zwei Klassen von
Spleiß-Faktoren werden zur Zeit unterschieden. Die erste Klasse besteht aus vier in der Evolu
tion stark konservierten Protein-RNA-Partikeln (small nuclear ribonucleoprotein particles =
snRNPs): U1, U2, U4/U6 und U5, die entweder eine (U1, U2, U5) oder zwei (U4/U6) snRNA
Komponenten enthalten (Moore, J.M. et al., (1993) supra; Guthrie, (1991) supra; Green,
M. R. (1991). Annu. Rev. Cell Biol., 7, 559). Die zweite Klasse besteht aus bisher wenig cha
rakterisierten Proteinen, die nicht fest an die snRNPs gebunden sind und daher nicht-snRNP
Spleiß-Faktoren genannt werden (Lamm, G.M. & Lamond, A.J. (1993) Biochim. Biophys.
Acta, 1173, 247; Beggs, J.D. (1995), Yeast splicing factors and genetic strategies for their
analysis, In: Lamond, A.I. (ed) Pre-mRNA Processing Landes, R. G. Company, Texas, pp. 79-
95. Krämer, A. (1995), The biochemistry of pre-mRNA splicing. In: Lamond, A.I. (ed), Pre-
mRNA Processing. Landes, R.G. Company, Texas, pp. 35-64).
Die Zusammensetzung der snRNPs ist am besten in HeLa-Zellen untersucht (Will, C.L. et al.,
(1995) Nuclear pre-mRNA splicing. In: Eckstein, F. and Lilley, D.M.J. (eds). Nucleic Acids
and Molecular Biology. Springer Verlag, Berlin, pp. 342-372). Bei relativ geringen Salzkon
zentrationen, bei denen Kern-Extrakte aus HeLa-Zellen das Spleißen von Prä-mRNA in vitro
bewirken können, liegen die snRNPs in einem 12S U1 snRNP, einem 17S U2 snRNP und ei
nem 25S [U4/U6.U5] tri-snRNP Komplex vor. Bei höheren Salzkonzentrationen (ca. 350-450
mM) dissoziiert der tri-snRNP-Komplex in einen 20S U5- und einen 12S U4/U6-Partikel. Die
U4 und U6 RNAs liegen im U4/U6 snRNP über zwei intermolekulare Helices basengepaart
vor (Bringmann, P. et al. (1984) EMBO J., 3, 1357; Hashimoto, C. & Steitz, J.A. (1984)
Nucleic Acids Res., 12, 3283; Rinke, J. et al., (1985) J. Mol. Biol., 185, 721; Brow, D.A. &
Guthrie, C. (1988) Nature, 334, 213).
Die snRNPs bestehen aus zwei Gruppen von Proteinen. In allen snRNPs ist die Gruppe der
allgemeinen Proteine (B/B', D1, D2, D3, E, F und G) enthalten. Zusätzlich enthält jeder
snRNP spezifische Proteine, die nur in diesem enthalten sind. So enthält nach dem bisherigen
Stand der Forschung der U1 snRNP drei zusätzliche Proteine (70K, A und C) und der U2
snRNP elf weitere Proteine. Der 20S U5 snRNP trägt nach bisherigem Kenntnisstand neun
weitere Proteine mit einem Molekulargewicht von 15, 40, 52, 100, 102, 110, 116, 200 und 220
kDa, während der 12S U4/U6 snRNP zwei zusätzliche Proteine mit einem Molekulargewicht
von ca. 60 und 90 kDa enthält. Der 25S tri-snRNP [U4/U6.U5] enthält fünf zusätzliche Protei
ne mit einem Molekulargewicht von ca. 15.5, 20, 27, 61 und 63 kDa. (Behrens, S.E. & Lühr
mann, R. (1991) Genes Dev., 5, 1439; Utans, U. et al., (1992) Genes Dev., 6, 631; Lauber, J.
et al., (1996) EMBO J., 15, 4001; Will, C.L. et al. (1995), supra, Will, C.L. & Lührmann, R.
(1997) Curr. Opin. Cell Biol., 9, 320-328).
Die Zusammensetzung der Spleiß-Komponenten bei Saccharomyces cerevisiae sind noch nicht
im Detail untersucht. Biochemische und genetische Untersuchungen deuten jedoch darauf hin,
daß die Sequenzen sowohl der snRNAs als auch der snRNP-Proteine in der Evolution hoch
konserviert sind (Fabrizio, P. et al., (1994) Science, 264, 261; Lauber, J. et al., (1996), supra,
Neubauer, G. et al., (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 385; Krämer, A. (1995), supra;
Beggs, J. D. (1995); supra, Gottschalk, A. et al. (1998) RNA, 4, 374-393).
Um einen funktionellen Spleiß-Komplex (Spliceosom) zu bilden, werden die einzelnen Kom
ponenten (prä-mRNA, snRNPs und nicht-snRNP-Proteine) in einem stufenweisen Prozeß zu
sammengeführt. Dies wird nicht nur durch Interaktionen der prä-mRNA mit den Protein
haltigen Komponenten, sondern auch durch zahlreiche Wechselwirkungen zwischen den Pro
teinhaltigen Komponenten selbst erreicht (Moore, J.M. (1993) supra; Madhani, H.D. &
Guthrie, C. (1994) Annu. Rev. Genetics, 28, 1; Nilsen, T.W. (1994) Cell, 65, 115). Die Prä-
mRNA trägt in ihrer Sequenz spezifische Erkennungssequenzen für die unterschiedlichen
Spleißkomponenten. Zunächst bindet das U1 snRNP über diese Erkennungssequenzen an die
5'-Spleiß-Region des Introns der prä-mRNA. Gleichzeitig lagern sich eine noch nicht genau
bestimmte Anzahl verschiedener weiterer Faktoren (z. B. SF2/ASF, U2AF, SC35, SF1) an die
sen Komplex an und kooperieren mit den snRNAs in der weiteren Formierung des Prä-
Spliceosoms. Das U2 snRNP-Partikel interagiert mit der sogenannten Branch-Site im Intron-
Bereich (Krämer, A. & Utans, U. (1991) EMBO J., 10, 1503; Fu, X.D. & Maniatis, T. (1992)
Proc. Natl. Acad. Sci USA, 89, 1725; Krämer, A. (1992) Mol. Cell Biol., 12, 4545; Zamore,
P.D. et al. (1992) Nature, 355, 609; Eperon, J.C. et al. (1993) EMBO J., 12, 3607; Zuo, P.
(1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 3363; Hodges, P.E. & Beggs, J.D. (1994) Curr. Biol.
4, 264; Reed, R. (1996) Curr. Op. Gen. Dev., 6, 215). In einem letzten Schritt der Bildung
des Spliceosoms interagiert der [U4/U6.U5] tri-snRNP und eine Anzahl bisher nicht genauer
charakterisierter Proteine mit dem Prä-Spliceosom, um das reife Spliceosom zu bilden (Moore,
J.M. et al., (1993) supra).
Für den Vorgang des Spleißens werden verschiedene Wechselwirkungen zwischen Prä-mRNA,
snRNAs und sn-RNP gelöst und neue gebildet. So ist bekannt, daß vor oder während des er
sten katalytischen Schritts der Spleißreaktion in den interagierenden Strukturen von U4 und
U6 zwei Helices voneinander getrennt und durch neue Interaktionen Basenpaarungen zwischen
U2- und U6-RNAs gebildet werden (Datta, B. & Weiner, A.M. (1991) Nature, 352, 821;
Wu, J.A. & Manley, J.L. (1991) Nature, 352, 818; Madhani, H.D. & Guthrie, C. (1992) Cell,
71, 803; Sun, J.S. & Manley, J.L. (1995) Genes Dev., 9, 843. Gleichzeitig wird die Bindung
von U1 an die 5'-Spleißstelle gelöst und die prä-mRNA bindet sich an die Erkennungssequenz
ACAGAG der U6 snRNA (Fabrizio, P. & Abelson, J. (1990) Science, 250, 404; Sawa, H. &
Abelson, J. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 11269; Kandels-Lewis, S. & Séraphin, B.
(1993) Science, 262, 2035; Lesser, C.F. & Guthrie, C. (1993) Science, 262, 1982; Sontheimer,
E.J. & Steitz, J.A. (1993) Science, 262, 1989; . Das U5 snRNP interagiert über seinen kon
servierten Loop 1 mit Exon-Sequenzen, die nahe an den 5'- und 3'-Spleißstellen gelegen sind.
Dieser Vorgang scheint sequenziell abzulaufen, während der gesamte Spleiß-Prozess von Stufe
1 zu Stufe 2 fortschreitet (M. McKeown, (1992) Annu. Rev. Cell Dev. Biol., 8: 133-
155 Newman, A. & Norman, C. (1991) Cell, 65, 115; Wyatt, J.R. et al., (1992) Genes Dev., 6,
2542; Cortes, J.J. et al. (1993) EMBO J., 12, 5181; Sontheimer, E.J. & Steits, (1993) supra).
Nach der Beendigung der Spleiß-Reaktion wird die reife mRNA freigesetzt und das Spliceo
som dissoziiert (Moore, J.M. et al., (1993) supra).
Durch alternatives Spleißen können aus ein und demselben Primärtranskript verschiedene reife
mRNAs gebildet werden, die für verschiedene Proteine kodieren. Dieses alternative Spleißen
ist in vielen Fällen reguliert. So kann dieser Mechanismus z. B. dazu genutzt werden, von einem
nicht funktionellen zu einem funktionellen Protein umzuschalten (z. B. Transposase bei Droso
phila). Weiterhin ist bekannt, daß alternatives Spleißen gewebespezifisch durchgeführt wird. So
wird z. B. die Tyrosin-Kinase, die vom src-Proto-Oncogen codiert wird, in Nervenzellen durch
alternatives Spleißen in einer speziellen Form synthetisiert.
Fehlerhaft reguliertes oder ausgeführtes alternatives Spleißen kann zu verschiedenen Krank
heitsbildern führen. Bei Patienten, die an der Grave's Krankheit leiden, ist gezeigt worden, daß
durch fehlerhaftes Spleißen ein entscheidendes Enzym (Thyroperoxidase) in einer inaktiven
Form entsteht (Zanelli, E. (1990) Biochem. Biophys. Res. Comm., 170, 725). Untersuchungen
für die Krankheit Spinale Muskelatrophy weisen darauf hin, daß ein defektes Genprodukt des
Gens SMN (Survival of motor neurons) zu einer erheblichen Störung der Bildung der snRNPs
führt. Durch die Inhibierung des Spleißapparates der Muskelneuronen, kommt es zu einer Pa
ralyse der Nervenzellen und zu einem Abbau des Muskelgewebes (Fischer, U. et al., (1997),
Cell, 9: 1023-9; Liu, Q. et al. (1997), Cell, 90: 1013-21; Lefebvre, S. et al. (1997) Nat. Ge
net., 16, 265). Bei der Metastasierung von Krebszellen scheinen unter anderem bestimmte al
ternative Spleißvarianten von dem membranständigen Molekül CD44 eine entscheidende Rolle
zu spielen. Das CD44-Gen enthält mehrere Exons, von denen 10 nebeneinanderliegende Exons
in unterschiedlicher Anordnung bei der mRNA-Generierung aus der prä-mRNA gespleißt wer
den. Bei Ratten Karzinomazellen wurde nachgewiesen, daß metastasierende Varianten die
Exons 4 bis 7 oder 6 bis 7 tragen. Mit Hilfe von Antikörpern gegen den von Exon 6 kodierten
Teil des Proteins konnte die Metastasierung wirksam unterdrückt werden (Sherman, L., et al.,
(1996) Curr. Top. Microbiol. Immunol. 213: 249-269).
Fehlerhaftes Spleißen kann zu stark ausgeprägten Phänotypen des betroffenen Organismus
führen. So ist bekannt, daß eine Punktmutation in einem Intron des β-Globin zu einer β+-
Thalassaemie führen kann. Durch die Punktmutation entsteht ein falscher Spleißort, der zu
einem veränderten Leseraster und zu einer vorzeitigen Termination der Peptidkette führt
(Weatherall, D.J. & Clegg, J.B. (1982) Cell, 29, 7; Fukumaki, Y. et al. (1982) Cell, 28, 585).
Bei Arabidopsis thaliana Mutanten führt z. B. eine Punktmutation an der 5'-Spleißstelle des
Phytochrom B Gens zu einer fehlerhaften Expression des Gens. Durch diese Veränderung kann
ein Intron nicht entfernt werden, welches ein Stopcodon in seiner Sequenz enthält. Die Ent
wicklung der Pflanzen ist gestört, da das Gen an der Phytomorphogenese beteiligt ist (Bradley,
J.M. et al. (1995) Plant Mol. Biol, 27, 1133).
Bisher sind nur wenige Arbeiten bekannt geworden, in denen eine Beeinflussung von Spleiß
vorgängen in der Zelle beschrieben worden sind. So kann mit Hilfe von Antiseren oder mono
klonalen Antikörpern gegen Komponenten des Spleißapparates die Generierung von reifer
mRNA verhindert werden (Padgett, R.A. et al. (1983) Cell, 35, 10; Gattoni, R. et al. (1996)
Nucleic Acid Res., 24, 2535).
Das NS1-Protein, das durch das Genom des Influenza Virus codiert wird, kann ebenfalls durch
Bindung an die U6 snRNA in das Spleißen eingreifen. Das Protein bindet an die Nukleotide
27-46 und 83-101 der humanen U6 snRNA und verhindert so, daß U6 während des Ablaufs
des Spleißvorganges mit den Partnern U2 und U4 interagieren kann (Fortes, P. et al. (1994)
EMBO J., 13, 704; Qiu, Y. & Krug, R.M. (1995) J. Virol., 68, 2425. Darüberhinaus scheint
das NS1-Protein auch über Bindung an den poly-A-Schwanz der gebildeten mRNA einen Ex
port aus dem Kern zu verhindern (Fortes, P. et al. (1994), supra; Qiu, Y. & Krug, R.M.
(1994), supra). Ähnliche Wirkungen werden von einem Genprodukt des Herpes Simplex Virus
Typ 1 Genoms beschrieben. Das Protein ICP27 konnte in in vitro Experimenten das Spleißen
von einer Modell-RNA (β-Globin-Prä-mRNA) wirkungsvoll verhindern (Hardy, W.R. & San
dri-Goldin, R.M. (1994) J. Virol., 68, 7790). Außerdem scheinen Peptide, die aus der C-
terminalen Domäne der großen Untereinheit der RNA Polymerase II generiert wurden, eben
falls in die Spleiß-Vorgänge eingreifen zu können (Yurvey, A. et al. (1996) Proc. Natl. Acad.
Sci USA, 93, 6975; WO97/20031). Der Einbau von künstlichen Nukleotidanaloga (5-Fluor-,
5-Chlor- oder 5-Bromuridin) in die zu spleißende mRNA kann ebenfalls zu einer Inhibierung
des Spleißvorganges in vitro führen (Sierakowska, H. et al. (1989) J. Biol. Chem., 264, 19185;
Wu, X.P. & Dolnick, B. (1993) Mol. Pharmacol., 44, 22).
Eine Anzahl von weiteren Untersuchungen betrifft die Wirkung von Anti-Sense-
Oligonukleotiden auf das Spleißen. So scheint das Verhältnis von zwei unterschiedlichen
Spleißprodukten der c-erb-Onkogen-mRNA (c-erbA-alpha 1 und 2) der Ratte durch eine wei
tere mRNA, rev-ErbA-alpha, reguliert zu werden. Rev-ErbA-alpha ist eine natürlich vorkom
mende anti-Sense-RNA, die mit der c-erbA-alpha 2 mRNA aber nicht mit der c-erbA-alpha 1
mRNA paart. Das Spleißen der c-erbA-alpha prä-mRNA zur c-erbA-alpha 2 mRNA konnte
durch einen Überschuß an rev-ErbA-alpha mRNA-Konstrukten, die komplementär zur 3'-
Spleißstelle waren, wirkungsvoll inhibiert werden (Munroe, S.H. & Lazar, M. A., (1991) J.
Biol. Chem., 266(33), 22083). Weiterhin konnte gezeigt werden, daß durch Generierung von
anti-sense-RNA, die an die Intron-Sequenzen der zu spleißenden mRNA binden, ebenfalls
Spleißen inhibiert werden kann (Volloch, V. et al. (1991) Biochem. Biophys. Res. Comm., 179,
1600). Hodges und Crooke konnten zeigen, daß bei schwach erkannten Spleißstellen die Bin
dung von Oligonukleotiden ausreicht, um erfolgreich das Spleißen zu unterbinden. Werden
dagegen bevorzugt erkannte Spleißstellen in die Konstrukte eingebaut, werden Oligonukleoti
de benötigt, die zusätzliche eine Aktivierung der RNase H bedingen können (Hodges, D. &
Crooke S.T. (1995) Mol. Pharmacol., 48, 905). Eine genauere Analyse der für das Spleißen
benötigten Sequenzen der prä-mRNA zeigte, daß 19 Nukleotide stromaufwärts vom Branch-
Point Adenosin und 25 Nukleotide um die 3'- und 5'-Spleiß-Stelle geeignete Sequenzen zur
Generierung von Antisense RNAs sind (Dominski, Z. & Kole, R. (1994) Mol. Cell Biol., 14,
7445). Insbesondere für die Hemmung von Viren wurden Untersuchungen mit Antisense Mo
lekülen gemacht. Viren, die höhere Organismen befallen, tragen oft Intron-enthaltende Gene in
ihrem Genom. So konnte gezeigt werden, das Antisense Oligonukleotide gegen die 3'-
Spleißstelle des immediate early Prä-mRNA 4/5 Gens des Herpes simplex Virus in Vero-Zellen
die Replikation des Virus hemmen konnte (Iwatani, W. et al. (1996) Drug Delivery Syst., 11,
427).
Zur Untersuchung des Spleiß-Mechanismus wird im allgemeinen zunächst eine mRNA durch in
vitro Transkription hergestellt. Hierzu werden genetische Konstrukte aus Viren, z. B. Adeno
viren, oder zellulärer Strukturgene verwendet. Derartige mRNAs enthalten alle wichtigen
Strukturelemente, die für die Erkennung der mRNA durch das Spliceosom und den Ablauf des
Spleißens notwendig sind. Im allgemeinen wird die mRNA radioaktiv markiert, damit man
nach der Auftrennung auf einem denaturierenden Harnstoff-Polyacrylamidgel aufgrund der
charakteristischen Bandenmuster beurteilen kann, ob eine Spleißreaktion stattgefunden hat,
bzw. bei welchem Reaktionsschritt eine Störung stattgefunden hat. Derartige Testsysteme sind
jedoch sehr Zeit- und arbeitsaufwendig und daher nicht für das systematische Auffinden von
Substanzen, die das Spleißen modulieren können, geeignet.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es daher, ein Testsystem zu finden, mit dem auf ein
fache und effektive Art und Weise eine große Anzahl von Verbindungen aus chemischen oder
natürlichen Substanzbibliotheken auf ihre Wirkung beim Spleißen von Nukleinsäuren unter
sucht werden können (sog. High Through-Put Screening).
Es wurde nun überraschenderweise gefunden, daß ein Testsystem mit einem gelfreien Nach
weissystem zum Nachweis einer Spleißreaktion geeignet ist, die oben beschriebenen Nachteile
des gängigen Testsystems zu überwinden und somit für das High Through-Put Screening bei
spielsweise in einer Roboteranlage geeignet ist.
Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein Testsystem enthaltend
- a) eine oder mehrere, gleiche oder verschiedene immobilisierte Nukleinsäure/n mit minde stens einer spleißfähigen Nukleinsäure,
- b) mindestens ein gelfreies Nachweissystem zum Nachweis einer Spleißreaktion, gegebe nenfalls
- c) mindestens eine Zusammensetzung enthaltend Spleißkomponenten, und vorzugsweise
- d) geeignete Nachweissonden, und gegebenenfalls
- e) weitere Hilfsmittel.
Für die Bereitstellung eines gelfreien Testsystems für die Untersuchung von Spleißvorgängen
ist die zu untersuchende Nukleinsäure an einer Festphase zu immobilisieren. Die Immobilisie
rung der Nukleinsäure kann beispielsweise kovalent, durch die Einführung von bestimmten
Strukturelementen, beispielsweise Aptameren, in die zu spleißende Nukleinsäure und Verwen
dung von Bindungspartnern für diese Strukturelemente oder durch eine Hybridisierung erfol
gen.
Für das gelfreie Testsystem ist zudem vorteilhafterweise eine geeignete Sonde zu generieren,
die den Nachweis des erfolgten Spleißens bzw. des nicht erfolgten Spleißens ermöglicht. Diese
Sonde kann beispielsweise ein zur Hybridisierung an die zu untersuchende Nukleinsäure ver
wendetes Oligonukleotid oder ein Bindungspartner, der an in die zu untersuchende Nuklein
säure eingeführte Strukturelemente bindet, sein.
Das gelfreie Nachweissystem enthält daher vorzugsweise mindestens eine Sonde. Insbesondere
ist die Sonde eine zu der spleißfähigen Nukleinsäure komplementäre Nukleinsäure, eine die
spleißfähige Nukleinsäure-bindende niedermolekulare Verbindung und/oder ein die spleißfähige
Nukleinsäure-bindendes Peptid oder Protein.
In einer bevorzugten Ausführungsform enthält die spleißfähige Nukleinsäure mindestens zwei
Exons, die durch mindestens ein Intron getrennt sind.
Beispielsweise ist die komplementäre Nukleinsäure zu mindestens einem Intron, zu mindestens
einem Exon und/oder zu mindestens einer Übergangsstelle von einem Exon und einem Intron
und/oder zu der nach der Fusion der beiden Exons entstandenen Exon/Exon-Grenze komple
mentär. Die komplementäre Nukleinsäure dient hierbei als Sonde zum Nachweis einer Spleiß
reaktion.
So kann beispielsweise das während der Spleißreaktion freigesetzte Intron mittels des gelfreien
Nachweissystems nachgewiesen werden, woraus gefolgert werden kann, daß beide Teilschritte
der Spleißreaktion vollständig abgelaufen sind. Alternativ kann anhand eines geeigneten Nach
weissystems, beispielsweise einer zu einer Übergangsstelle von einem Exon und einem Intron
komplementären Nukleinsäure festgestellt werden, ob während des Spleißvorganges das Exon
von dem Intron gelöst worden ist, was einen Aufschluß darüber geben kann, ob die erste
Spleißreaktion am 5'-Ende des Introns und/oder die zweite Spleißreaktion am 3'-Ende des
Introns erfolgte. Andere Nachweisformen sind unten im Detail erläutert.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die Sonde eine niedermolekulare Verbin
dung, beispielsweise Theophyllin, Xanthin oder ein Aminoglycosid wie Tobramycin. Enthält
beispielsweise die spleißfähige Nukleinsäure oder eine zur spleißfähigen Nukleinsäure komple
mentäre Nukleinsäure des gelfreien Nachweissystems eine sog. Aptamer-Struktur, d. h. eine
Bindesequenz für derartige Bindungspartner (siehe z. B. Jenison, R.D. et al. (1994) Science
263, 1425-1429, Hamasaki, K. et al. (1998) Biochem. 37, 656-663 oder Kiga, D. et al.
(1998) Nucleic Acids Res., 26 (7), 1755-1760), so kann der Spleißvorgang besonders einfach
über den Bindungspartner nachgewiesen werden.
In einer anderen besonders bevorzugten Ausführungsform kann der Bindungspartner ein Nu
kleinsäure-Bindeprotein, insbesondere ein "Iron Responsive Element Binding Protein" (IBP)
sein, welches eine Erkennungssequenz für ein Nukleinsäure-Bindeprotein, insbesondere ein
"Iron Responsive Element" (IRE) erkennt. Der Nachweis eines gegebenenfalls erfolgten
Spleißvorganges erfolgt hierbei über das Nukleinsäure-Bindeprotein.
Die beschriebenen Wechselwirkungen zwischen Bindungspartner und Strukturelement in der
Nukleinsäure (niedermolekulare Verbindung und Aptamer, IBP und IRE, Oligonukleotid und
Sequenz in der Nukleinsäure) sind ebenfalls geeignet die zu untersuchende spleißfähige Nu
kleinsäure an einer Festphase zu immobilisieren. Hierzu muß der Bindungspartner in geeigneter
Weise an der Festphase verankert werden. Dabei kann beispielsweise der Bindungspartner ko
valent an die Festphase gebunden werden. Desweiteren eignen sich die Kopplung von Biotin an
die Nukleinsäure und die Verwendung von an der Festphase gebundenem (Strept-)Avidin für
eine Verankerung der Nukleinsäure. Diese Verankerung kann beispielsweise auch durch Ver
wendung von Antikörper/Antigen-Wechselwirkungen erreicht werden.
Im allgemeinen enthält die Sonde eine Markierung, beispielsweise eine radioaktive Markierung,
eine Markierung mit Fluoreszenzfarbstoffen, mit Biotin, mit Digoxigenin und/oder mit Anti
körpern. Vorzugsweise ist die Markierung an dem Liganden, beispielsweise an der komple
mentären Nukleinsäure, an der niedermolekularen Verbindung oder an dem Nukleinsäure-
Bindeprotein angebracht. Insbesondere mit Hilfe von Fluoreszenzfarbstoffen kann auf einfache
und in automatisierten Systemen schnelle Art und Weise festgestellt werden, ob beispielsweise
durch Entfernung des Bindungspartners der Sonde in der Nukleinsäure während des Spleiß
vorganges eine Spleißreaktion beispielsweise in Anwesenheit von mindestens einer zu untersu
chenden Substanz ungestört ablaufen kann.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die spleißfähige Nukleinsäure und die Son
den-bindende Nukleinsäure miteinander verbunden. Dies hat den Vorteil, daß die Spleißreakti
on direkt beispielsweise über die Freisetzung der Sonden-bindenden Nukleinsäure nachgewie
sen werden kann. Bei dieser Ausführungsform ist die Sonden-bindende Nukleinsäure vorzugs
weise eine Nukleinsäure, die eine niedermolekulare Verbindung, beispielsweise ein sogenanntes
Aptamer, und/oder ein Nukleinsäure-Bindeprotein binden kann. Da für die Bindung derartiger
Sonden im allgemeinen bestimmte Strukturelemente der Nukleinsäuren verantwortlich sind,
wird die Sonden-bindende Nukleinsäure bei den folgenden bevorzugten Konstrukten mit "SE"
für Strukturelement abgekürzt, wobei "3'-Region" einen Nukleinsäureabschnitt am 3'-Ende der
Nukleinsäure bedeutet:
Die Konstrukte zu 1. dienen hierbei insbesondere zum Nachweis, ob das Exon1 von der
Intronsequenz während des Spleißvorganges abgetrennt werden konnte. Das Konstrukt zu 2.
dient zum direkten Nachweis einer abgetrennten Intronsequenz. Die Konstrukte unter 3. die
nen zum Nachweis, ob das Exon2 erfolgreich von der Intronsequenz abgetrennt werden konn
te. Eine Kombination der Konstrukte gemäß 4. dient zum Nachweis der einzelnen Zwischen-
und Endprodukte während des Spleißvorganges. Exon1 steht im allgemeinen für ein 5' vom
Intron gelegenes Exon und Exon2 steht im allgemeinen für ein 3' vom Intron gelegenes Exon.
Die Konstrukte unter 5. enthalten verschiedene zusätzliche Erkennungssequenzen, die zum
einen verschiedene Nachweissysteme betreffen können und die zum anderen über deren Bin
dungspartner die Bindung der Nukleinsäure an eine feste Phase ermöglichen können. So kann
beispielsweise zum Immobilisieren in der 3'-Region eine Sonden-bindende Nukleinsäure ein
geführt werden, und gleichzeitig zum Nachweis des Spleißvorganges eine andere Sonden
bindende Nukleinsäure im Exon1 (siehe zu 5., erstes Konstrukt). Darüber hinaus können bei
spielsweise drei verschiedene Nukleinsäuren eingeführt werden, die zum einen zur Immobilisie
rung der gesamten Nukleinsäure und zum anderen zum Nachweis des entfernten Introns und
zum Nachweis der Verknüpfung von Exon1 an die restliche Nukleinsäure dient (siehe zu 5.,
zweites Konstrukt). Die Lokalisation der einzelnen unter 5. beispielhaft aufgeführten Sonden
bindenden Nukleinsäuren kann gemäß den oben beschriebenen Konstrukten unter 1.-4. variie
ren. Zudem ist die genaue Lokalisation der einzelnen Sonden-bindenden Nukleinsäuren varia
bel.
In einer weiteren Ausführungsform ist daher die Nukleinsäure, vorzugsweise die spleißfähige
Nukleinsäure, insbesondere eine Nukleinsäure gemäß einer der oben beschriebenen Ausfüh
rungsformen, direkt kovalent oder indirekt über ein Strukturelement und Bindungspartner zum
Strukturelement oder mittels Hybridisierung an eine feste Phase gebunden.
Die direkte kovalente Bindung kann beispielsweise über die 3'-terminale cis-diol-Gruppe des
Riboserückgrates der Nukleinsäure erfolgen. Beispielsweise kann eine RNA an Hydrazingrup
pen der festen Phase nach Perjodatoxidation der vicinalen 2', 3'-Hydroxylgruppen der 3'-
terminalen Ribose gebunden werden. Für eine indirekte Bindung eignen sich auch geeignete
Linker, wie beispielsweise Biotin- oder Dicarbonsäure-Linker. Die Bindung der Nukleinsäure
kann jedoch auch, wie oben bereits ausgeführt, über einen Bindungspartner, beispielsweise
über Theophyllin, Xanthin oder ein Aminoglycosid wie Tobramycin und/oder über ein Nuklein
säure-Bindeprotein, wie beispielswiese IBP, erfolgen.
Für die Immobilisierung einer Nukleinsäure an einen Träger-gebundenen Liganden eignet sich
beispielsweise im Falle von Theophyllin als Träger-gebundenen Bindungspartner das Theo
phyllin-Aptamer Th (Kd = 0,9 µM) (siehe z. B. Jenison, R.G. et al. (1994) supra) oder im Falle
von Tobramycin als Träger-gebundenen Bindungspartner die Minimalversion des Tobramycin-
Aptamers To (Kd = 0,2 µM) (Hamasaki, K. et al. (1998) supra). Die Sequenzen der beiden
Aptamere sind vorzugsweise:
Die feste Phase ist hierbei beispielsweise Keramik, Metall, insbesondere Edelmetall, Glas,
Kunststoff oder Polysaccharide, z. B. ein Agarosepolymer.
Sonden-bindende Nukleinsäuren, beispielsweise Aptamere, sind aber auch geeignet, um mar
kierte Sonden zu binden, wodurch z. B. die Aptamer-enthaltende Nukleinsäure nachgewiesen
und auch quantifiziert werden kann. Beispielsweise kann Tobramycin mit käuflichen, NHZ
reaktiven Fluoreszenz-Farbstoffen umgesetzt werden (Wang, Y. et al. (1996) Biochemistry 35,
12338 - 12346). Bei Theophyllin wird vorzugsweise ein 1-Aminoalkyl- oder 1-Thioalkyl-
Derivat des 3-Methylxanthins hergestellt, das an das Aptamer binden kann (Jenison, R.D. et
al. (1994), supra).
Gemäß der vorliegenden Erfindung ist die spleißfähige Nukleinsäure jede beliebige Nukleinsäu
re, die gespleißt werden kann, vorzugsweise eine RNA, beispielsweise in Form einer soge
nannten Prä-mRNA oder in Form einer DNA, die RNA-Abschnitte enthält. Für den Fall, daß
die RNA zusätzliche Sonden-bindende Sequenzen, wie oben bereits näher beschrieben, enthal
ten soll, ist es vorteilhaft, wenn diese auf beiden Exon-Seiten mindestens ca. 25 Nucleotide von
der jeweiligen Spleißstelle, auf der Intronseite mindestens ca. 17 Nucleotide vom Branchpoint
und/oder mindestens ca. 7 Nucleotide von der 5'-Spleißstelle entfernt sind. Hierdurch wird im
allgemeinen gewährleistet, daß die zusätzlichen Sonden-bindenden Sequenzen die Spleißreak
tionen nicht stören können.
Eine für das Spleißen im Humansystem geeignete spleißfähige Nukleinsäure ist beispielsweise
die MINX-Modell-prä-mRNA (MINIX = miniature wildtype substrate; Zillmann, M., Zapp,
M.L., Berget, S.M., (1988), Mol. Cell. Biol., 8: 814-21). In die MINX-kodierende DNA kann
vorzugsweise eine zum Nachweis oder zur Immobilisierung geeignete weitere Sonden
bindende Nukleinsäure, wie oben bereits beschrieben, eingeführt werden, wobei vorzugsweise
die Restriktionsenzymschnittstelle erhalten bleiben soll. Hierdurch kann man bei Bedarf in ei
nem weiteren Klonierungsschritt eine weitere gleiche oder verschiedene Sonden-bindende
Nukleinsäure für den Nachweis bzw. zur Immobilisierung einbauen, um dadurch die Fluores
zenzsignale verstärken oder die Bindung an die feste Phase festigen zu können.
Zur Immobilisierung von Prä-mRNA werden beispielsweise die Aptamere Th oder To am 3'-
Ende des Exon2 der Prä-mRNA eingefügt und der entsprechende Bindungspartner an der
Festphase kovalent gebunden. Die entsprechenden kodierenden Nukleinsäuresequenzen sind in
Fig. 1A und 1B dargestellt.
Hierbei wird beispielsweise die entsprechende Aptamersequenz als DNA-Oligonucleotid in die
BamHI-Schnittstelle der kodierenden Minx-DNA, d. h. zwischen Position 219 und 220 der
korrespondierenden Minx-prä-mRNA, inseriert.
Wie bereits oben erwähnt, können auch Sonden-bindende Nukleinsäuren in die Intron-Struktur
der prä-mRNA eingefügt werden, wobei diese durch das Spleißen freigesetzt und somit in der
beispielsweise immobilisierten mRNA fehlt. Derartige Konstrukte eignen sich daher zum
Nachweis einer Inhibierung des Spleißens im ersten Schritt, d. h. Öffnen der mRNA und La
riatbildung, oder im zweiten Schritt, d. h. Entfernung des Lariats. Im Falle einer Inhibierung
des Spleißprozesses würden die Sonden-bindenden Nukleinsäuren nicht aus der prä-mRNA
entfernt werden und könnten daher beispielsweise nach Immobilisierung der prä-mRNA nach
gewiesen werden. Beispiele geeigneter Nukleinsäurekonstrukte sind in Form ihrer kodierenden
Sequenzen in Fig. 2A und 2B dargestellt.
Hierzu wird beispielsweise die entsprechende Aptamersequenz als DNA-Oligonucleotid in die
PstI-Schnittstelle der kodierenden Minx-DNA, d. h. zwischen Position 88 und 89 der korre
spondierenden prä-mRNA, inseriert.
Wie bereits oben näher beschrieben, wird die Verbindung zwischen Exon1 und Intron im ersten
Spleißschritt durch das Spliceosom an der 5'-Spleißstelle des Introns geöffnet. Erst im zweiten
Spleißschritt erfolgt eine kovalente Verknüpfung von Exon1 und Exon2. Das Exon1 ist folg
lich während des ersten Schrittes der Spleißreaktion nicht mehr mit der mRNA verbunden und
somit aus der Spleißreaktion entfernbar. In Verbindung mit Konstrukten, die beispielsweise
eine Aptamerstruktur im Intron haben, kann daher eine Aussage darüber gemacht werden, ob
im ersten Spleißschritt beispielsweise eine Inhibierung stattgefunden hat. Werden beispielswei
se zwei verschiedenen Aptamere, die verschiedene Sonden erkennen, am 5'-Ende des Exon1
und im Intron der prä-mRNA eingebaut, so kann sowohl der erste Spleißschritt, wie auch der
zweite Spleißschritt in einem Testsystem verfolgt werden. Beispiele geeigneter Nukleinsäure
konstrukte sind in Form ihrer kodierenden Sequenzen in Fig. 3A und 3B dargestellt.
Hierzu wird beispielsweise die entsprechende Aptamersequenz als DNA-Oligonucleotid in die
EcoRI-Schnittstelle der kodierenden Minx-DNA, d. h. zwischen Position 9 und 10 der korre
spondierenden Minx-prä-mRNA, inseriert.
Für Untersuchungen im Hefesystem kann man beispielsweise von der prä-mRNA für U3 der
Hefe ausgehen (Mougin, A. et al., (1996), RNA, 2: 1079-93) und beispielsweise geeignete
Aptamere, wie z. B. die oben beschriebenen Theophyllin- oder Tobramycin-Aptamere, einbau
en. Beispiele geeigneter Nukleinsäurekonstrukte sind in Form ihrer kodierenden Sequenzen in
Fig. 4A bis 4C dargestellt.
Zur Herstellung des Nukleinsäurekonstruktes gemäß Fig. 4A wird beispielsweise ein geeigne
tes Aptamer als DNA-Oligonucleotid in die SacII-Schnittstelle der kodierenden U3-DNA, d. h.
zwischen Position 22 und 23 der prä-U3RNA, inseriert.
Zur Herstellung des Nucleinsäurekonstruktes gemäß Fig. 4B wird beispielsweise ein geeignetes
Aptamer als DNA-Oligonucleotid in die BstNI-Schnittstelle der kodierenden U3-DNA, d. h.
zwischen Position 105 und 106 der prä-U3RNA, inseriert.
Die Nukleinsäuresequenz gemäß Fig. 5A stellt ein Beispiel einer Nukleinsäuresequenz mit ei
nem "Iron Responsive Element" (IRE) dar, das für Untersuchungen im Humansystem geeignet
ist. Das IRE ist hierbei an dem 3'-Ende des Exon2 analog den oben beschriebenen Aptameren
eingefügt.
Für Untersuchungen im Hefesystem kann ein IRE-Element beispielsweise an dem 3'-Ende des
Exon2 der prä-U3RNA, wie in Fig. 5B dargestellt, eingefügt werden:
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher eine spleißfähige Nukleinsäure, wie oben beispielhaft dargestellt, sowie deren Verwendung zur Herstellung eines Testsystems.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher eine spleißfähige Nukleinsäure, wie oben beispielhaft dargestellt, sowie deren Verwendung zur Herstellung eines Testsystems.
Zur Durchführung der Untersuchungen der einzelnen Spleißreaktionen mit Hilfe eines erfin
dungsgemäßen Testsystems wird üblicherweise eine Zusammensetzung enthaltend die einzel
nen Spleißkomponenten, vorzugsweise "Small Nuclear Ribonucleoprotein Particles" snRNP)-
Komponenten und nicht-snRNP-Komponenten verwendet. Insbesondere enthalten die snRNP-
Komponenten U1-, U2-, U4-, U5- und/oder U6-Proteine. Insbesondere ist es bevorzugt, wenn
man entsprechende Zellextrakte, insbesondere eukaryotische Zellextrakte fiür die Untersuchun
gen verwendet. Beispielsweise können die Zellextrakte aus tierischen Zellen, insbesondere
Säugetierzellen, vor allem HeLa-Zellen, insbesondere aus Zellkernextrakten von HeLa-Zellen
oder Zellextrakte von Pilzen, insbesondere Hefen, nach dem Fachmann allgemein bekannten
Verfahren gewonnen werden (siehe Beispiele). Die Zellextrakte enthalten im allgemeinen alle
wichtigen Faktoren, um ein Spleißen in vitro durchführen zu können.
Zur Durchführung der Untersuchungen ist es essentiell, weitere Hilfsmittel, wie z. B. Pufferlö
sungen, Stabilisatoren und/oder Energieäquivalente, insbesondere ATP, einzusetzen.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich daher auch auf eine Verfahren zur Herstellung eines
Testsystems, bei dem mindestens eine spleißfähige und immobilisierte Nukleinsäure und minde
stens ein gelfreies Nachweissystem sowie gegebenenfalls mindestens eine Zusammensetzung
enthaltend Spleißkomponenten und gegebenenfalls weitere Hilfsmittel zusammengestellt wer
den. Bevorzugte Ausführungsformen der einzelnen Komponenten sind bereits oben näher be
schrieben worden.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zum Auffinden einer
wirksamen Substanz, wobei
- a) eine oder mehrere gleiche oder verschiedene immobilisierte Nukleinsäure/n mit mindestens einer spleißfähigen Nukleinsäuresequenz in Anwesenheit von mindestens einer zu untersu chenden Substanz und mindestens einer Zusammensetzung enthaltend Spleißkomponenten und gegebenenfalls weiteren Hilfsmitteln unter geeigneten Bedingungen inkubiert werden, und
- b) das sich gegebenenfalls gebildete Spleißprodukt mittels eines gelfreien Nachweissystems nachgewiesen wird.
Bevorzugte einzelne Komponenten des erfindungsgemäßen Verfahrens sind oben bereits näher
beschrieben.
Die wirksame Substanz kann hierbei eine pharmazeutisch wirksame Verbindung, ein Fungizid,
ein Herbizid, ein Pestizid und/oder ein Insektizid sein, vorzugsweise ist es ein Antibiotikum.
Die zu untersuchende Substanz ist im allgemeinen eine natürlich vorkommende, eine natürlich
vorkommende und chemisch modifizierte und/oder eine synthetische Substanz. Insbesondere
können mit den erfindungsgemäßen Verfahren besonders einfach und schnell sogenannte kom
binatorische Substanzbibliotheken durchsucht werden.
In der Beschreibungseinleitung wurde bereits darauf hingewiesen, daß verschiedene Erkran
kungen auf eine Störung des Spleißmechanismus zurückzuführen sind. Daher eignet sich die
vorliegende Erfindung auch zur Diagnose einer Erkrankung.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein Verfahren zur Diagnose ei
ner Erkrankung, wobei
- a) eine oder mehrere, gleiche oder verschiedene immobilisierte Nukleinsäure/n mit mindestens einer spleißfähigen Nukleinsäuresequenz in Anwesenheit von mindestens einer Zusammen setzung enthaltend Spleißkomponenten und gegebenenfalls weiteren Hilfsmitteln unter ge eigneten Bedingungen inkubiert werden, und
- b) daß sich gegebenenfalls gebildete Spleißprodukt mittels eines gelifeien Nachweissystems nachgewiesen wird.
Die zu diagnostizierenden Erkrankungen sind hierbei vorzugsweise Erbkrankheiten, Krebser
krankungen und/oder virale Erkrankungen, insbesondere Grave's Krankheit, spinale Muskela
trophie, β'-Thalassaemie, Krebserkrankungen in bezug auf das c-Erb-Onkogen, Hepatitis-C
Infektionen und/oder Herpes Simplex Virus Infektionen. Die Zusammensetzung enthaltend
Spleißkomponenten kann in diesem Fall beispielsweise eine behandelte oder unbehandelte Ge
webeprobe des Patienten sein.
Die folgenden Figuren und Beispiele sollen die Erfindung näher beschreiben, ohne sie zu be
schränken. Dargestellt sind die Konstrukte in DNA-Sequenzen. Die spleißfähigen RNAs kön
nen durch in vitro-Transkription, wie sie weiter unten beschrieben ist, generiert werden.
Fig. 1A zeigt die kodierende Nukleinsäuresequenz, in der an das 3'-Ende des Exon2 einer für
Minx codierenden prä-mRNA ein Th-Aptamer eingefügt wurde.
Fig. 1B zeigt die kodierende Nukleinsäuresequenz, in der an das 3'-Ende des Exon2 einer für
Minx codierenden prä-mRNA ein To-Aptamer eingefügt wurde.
Fig. 2A zeigt die kodierende Nukleinsäuresequenz, in der in das Intron einer für Minx codie
renden prä-mRNA ein Th-Aptamer eingefügt wurde.
Fig. 2B zeigt die kodierende Nukleinsäuresequenz, in der in das Intron einer für Minx codie
renden prä-mRNA ein To-Aptamer eingefügt wurde.
Fig. 3A zeigt die kodierende Nukleinsäuresequenz, in der an das 5'-Ende des Exon1 einer für
Minx codierenden prä-mRNA ein Th-Aptamer eingefügt wurde.
Fig. 3B zeigt die Sequenz einer RNA in der an das 5'-Ende des Exon1 einer für Minx codie
renden prä-mRNA ein Th-Aptamer eingefügt wurde.
Fig. 4A zeigt die kodierende Nukleinsäuresequenz, die für eine U3-prä-mRNA kodiert. Am 5'-
Ende des Exon1 ist eine Einfügestelle für ein Th- oder To-Aptamer gekennzeichnet.
Fig. 4B zeigt die kodierende Nukleinsäuresequenz, die für eine U3-prä-mRNA kodiert. Im
Intron ist eine Einfügestelle für ein Th- oder To-Aptamer gekennzeichnet.
Fig. 4C zeigt die kodierende Nukleinsäuresequenz, die für eine U3-prä-mRNA kodiert. Am 3'-
Ende des Exon2 ist eine Einfügestelle für ein Th- oder To-Aptamer gekennzeichnet.
Fig. 5A zeigt die kodierende Nukleinsäuresequenz, die für eine Minx-prä-mRNA kodiert. Am
3'-Ende des Exon2 ist ein die Sequenz für IRE eingefügt.
Fig. 5B zeigt die kodierende Nukleinsäuresequenz, die für eine der U3-prä-mRNA kodiert. Am
3'-Ende des Exon2 ist ein die Sequenz für IRE eingefügt.
Fig. 6 zeigt den zeitlichen Verlauf des Spleißens von MINX- und MINX-IRE-prä-mRNA
durch HeLa Kernextrakt.
In vitro transcribierte MINX (Spuren 1-5) und MINX-IRE (Spuren 6-10) prä-mRNAs
wurden mit HeLa Kernextrakt für den in der Abbildung angegebenen Zeitraum inku
biert. Anschließend wurden die Proben mittels Polyacrylamid/Harnstoff-
Gelektrophorese aufgetrennt und die 32P-markierte RNA mit Hilfe von Autoradio
graphie nachgewiesen. Mehrfache Banden bei der IRE enthaltenden RNA (Spuren 6-
10) sind durch unvollständige Denaturierung des IRE zu erklären.
Die zu spleißende mRNA besteht aus mindestens zwei Exons, die durch ein Intron getrennt
sind. Zusätzlich zu diesen Sequenzen sind Sequenzen enthalten, die geeignet sind, eine spezifi
sche Erkennung durch RNA-Bindeproteine oder niedermolekulare Verbindungen zu ermögli
chen. Über die Kopplung dieser Bindeproteine oder Verbindungen an eine Matrix wird die
mRNA selektiv an die Matrix gebunden. Alternativ erfolgt die Kopplung der mRNA auch ko
valent über 3'-OH-Gruppen der Ribose direkt an die Matrix.
Für das Herstellen von Kernextrakte aus Säugetierzellen werden Zellkulturen mit Hela-Zellen
herangezogen. Hierzu werden die Zellen durch Zentrifugation (1000 × g, 10 Min.) aus dem
Kulturmedium sedimentiert und mit Phosphatpuffer gewaschen. Anschließend wird das Zellse
diment in fünffachem Volumen Puffer A (10 mM HEPES, 1,5 mM MgCl2, 10 mM KCl, 0,5
mM DTT, pH 7,9, 4°C) aufgenommen und 10 Minuten inkubiert. Die Zellen werden erneut
sedimentiert und in zweifachem Volumen Puffer A aufgenommen. Diese Suspension wird mit
einem Dounce Homogenisator (Pistill B) aufgeschlossen (10faches. Auf und Abbewegen des
Pistills). Die Kerne werden durch Zentrifugation sedimentiert. Abschließend werden die Kerne
erneut in Puffer A aufgenommen und für 20 Minuten bei 25.000 × g zentrifugiert. Das Sedi
ment wird in 3 ml Puffer B (20 mM HEPES, 25% (v/v) Glycerin, 0,42 M NaCl, 1,5 mM
MgCl2, 0,2 mM EDTA, 0,5 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), 0,5 mM DTT, pH 7,9)
aufgenommen und erneut mit dem Dounce Homogenisator aufgeschlossen. Die entstehende
Suspension wird 30 Minuten auf einem Magnetrührer inkubiert und anschließend bei 25.000 ×
g für 30 Minuten zentrifugiert. Erneut schließt sich eine Zentrifugation bei 25.000 × g (30
Min.) an. Der klare Überstand wird gegen das 50fache Volumen Puffer C (20 mM HEPES,
20% (v/v) Glycerin, 0,1 M KCl, 0,2 mM EDTA, 0,5 mM PMSF, 0,5 mM DTT, pH 7,9) dialy
siert. Das Dialysat wird zentrifugiert (25.000 × g, 20 Min.) und der resultierende Überstand
kann als Kernextrakt in flüssigem Stickstoff gelagert werden (Dignam; J.D. et al. (1983)
Nucleic Acid Res., 11, 1475).
Zellextrakte aus Hefezellen werden auf sehr ähnliche Weise hergestellt. Hefezellen eines Pro
tease-defizienten Stammes (BJ926, EJ101 oder ähnliche Stämme) werden in der logarithmi
schen Wachstumsphase durch Zentrifugation (1500 × g, 5 Min., 4°C) sedimentiert. Die Zellen
werden in dem zwei- bis vierfachen Volumen eiskaltem Wasser resuspendiert und erneut bei
1.500 × g (5 Min, 4°C) zentrifugiert. Anschließend werden die Zellen in dem einfachen Volu
men Zymolyasepuffer (50 mM Tris HCL, 10 mM MgCl2, 1M Sorbitol, 30 mM DTT, pH 7,5)
aufgenommen und 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Zellen werden abzentrifu
giert (1.500 × g, 5 Min., 4°C), in dem dreifachen Volumen Zymolyasepuffer mit 2 mg (200 U)
Zymolyase 100 T aufgenommen und 40 Minuten bei 30°C auf einem Schüttler (50 RPM) inku
biert. Die entstandenen Sphäroblasten werden abzentrifugiert (1.500 × g, 5 Min., 4°C) und ein
mal in 2 ml eiskaltem Zymolyasepuffer gewaschen. Das Sediment wird mit zwei Volumen Ly
sepuffer (50 mM Tris HCl, 10 mM MgSO4, 1 mM EDTA, 10 mM Kalium Acetat, 1 mM DTT,
Protease Inhibitoren, 1 mM PMSF, pH 7,5) gewaschen und schließlich in einem Volumen Ly
sepuffer aufgenommen. Die Sphäroblasten werden anschließend in einem Dounce Homogeni
sator durch 15- bis 20maliges Auf- und Abbewegen des Pistills (Abstand 1-2 µm) lysiert. Das
Lysat wird mit dem gleichen Volumen Extraktionspuffer (Lysepuffer + 0,8 M Ammoniumsul
fat, 20% (v/v) Glycerin) versetzt und 15-30 Minuten auf einem Überkopfschüttler inkubiert
(4°C). Anschließend wird 90 Minuten bei 100.000 × g zentrifugiert. (4°C). Der Überstand wird
gegen das hundertfache Volumen Lagerungspuffer (20 mM Tris HCl, 0,1 mM EDTA, 10%
(v/v) Glycerin, 100 mM KCl, 1 mM DTT, Proteae Inhibitoren, 1 mM PMSF, pH 7,5) dialy
siert. Das Dialysat wird bei 10.000 × g abzentrifugiert (4°C) und der Überstand in flüssigem
Stickstoff gelagert (Dunn, B. & Wobbe, C. R. (1994) Preparation of protein extracts from
yeast, In: Ausubel, F.M., et al. (eds.) Current Protocols in Molecular Biology, 2°d Volume,
John Wiley and Sons, Inc., USA pp. 13.13.1-13.13.9).
Durch das Ausschneiden des Introns aus der RNA-Sequenz entsteht an der Grenze der beiden
nun verbundenen Exons eine Nukleotidsequenz, die in der ungespleißten prä-mRNA nicht vor
handen ist (Neosequenz). Diese Sequenz wird zur Generierung von komplementären Nukleo
tidsequenzen genutzt, die selektiv nur an diese Neosequenz binden. Durch kovalente Bindung
von Fluoreszensfarbstoffen, Biotin, Digoxigenin oder ähnlichen Molekülen bzw. durch radio
aktive Markierung, wird indirekt das durchgeführte Spleißen nachgewiesen. Die Auswertung
des Assays erfolgt in einem geeigneten Auswertegerät (ELISA-Reader, Fluoreszensmeßgerät
etc.).
Alle beschriebenen Versuche wurden nach Standardmethoden, wie sie in (Eperon, LC., and
Krainer, A.R. (1994) Splicing of mRNA precursors in mammalian cells. In RNA Processing,
vol. I-A Practical Approach (B.D. Hames and S.J. Higgins, eds.) Oxford: IRL Press, pp. 57-
101) beschrieben sind, durchgeführt.
Das in Fig. 5A beschriebene Konstrukt wurde von dem dafür kodierenden Plasmid mittels in
vitro Transkription in die korrespondierende mRNA umgeschrieben. Zur Kontrolle und späte
ren Vergleich wurde ebenfalls das entsprechende Konstrukt ohne die IRE-Sequenz in den Ex
perimenten eingesetzt.
Zuvor wurden die Konstrukte in den Vektor pGEM-3Zf (Pharmacia) einkloniert und in E. coli
vermehrt. Mit Hilfe von Standardtechnologien wurden die Plasmide gereinigt und auf die ge
wünschte Konzentration eingestellt. Vor dem Einsatz in der in vitro Transkription wurden die
Plasmide mit Hilfe von Restriktionsenzymen linearisiert.
Die Reaktion wurde unter folgenden Bedingungen durchgeführt:
5 µl 5 × Transkriptionspuffer (200 mM Tris-HCl pH 7.9, 30 mM MgCl2, 10 mM Spermidin, 50 mM NaCl)
1 µl BSA (1 mg/ml)
1 µl RNAsin
2,5 µl DTT (100 mM)
1 µl NTP's (ATP, GTP, CTP mit 2,5 mM und UTP mit 1,25 mM)
2 µl 32P-UTP (3000 Cl/mM)
2 µl MINX Plasmid linearisiert (1 mg/ml)
2,5 µl GpppG-Cap (1 mM)
2 µl SP6 Polymerase
ad 25 µl mit H2O.
5 µl 5 × Transkriptionspuffer (200 mM Tris-HCl pH 7.9, 30 mM MgCl2, 10 mM Spermidin, 50 mM NaCl)
1 µl BSA (1 mg/ml)
1 µl RNAsin
2,5 µl DTT (100 mM)
1 µl NTP's (ATP, GTP, CTP mit 2,5 mM und UTP mit 1,25 mM)
2 µl 32P-UTP (3000 Cl/mM)
2 µl MINX Plasmid linearisiert (1 mg/ml)
2,5 µl GpppG-Cap (1 mM)
2 µl SP6 Polymerase
ad 25 µl mit H2O.
Der Transkriptionsansatz wurde für 2 h bei 37°C inkubiert und anschließend über ein präpara
tives Gel nach Standardmethoden gereinigt. Zum Auffinden der markierten RNA wurde für 1
Minute ein Röntgenfilm aufgelegt und die Bande mittels eines Skalpells ausgeschnitten. Das
Gelfragment wurde zerschnitten und über Nacht bei 4°C mit Elutionspuffer (500 mM Na-
Acetat pH 5,1 mM EDTA pH 8, 2,5% Phenol/Chloroform) die RNA aus dem Gel extrahiert.
7 µl Kernextrakt von HeLa-Zellen ( = 35% v/v) wurden mit 3,25 mM MgCl2, 35 mM KCl, 2
mM ATP, 20 mM Phosphocreatine, 1U/µl RNAsin und 30.000-50.000 cpm MINX-prä
mRNA (Zillmann et al., 1988, Molecular and Cellular Biology, 8: 814) in einem Reaktionsvo
lumen von 20 µl für 0, 10, 20, 30 und 40 Minuten bei 30°C inkubiert. Zum Vergleich wurde
prä-mRNA eingesetzt, die das IRE nicht enthielt. Anschließend wurden die Reaktionen durch
Zugabe von 400 µl Proteinase K-Puffer (100 mM Tris-HCl, pH 7,5, 12,5, mM EDTA, 150
mM NaCl, 1% SDS, 0,1 mg Proteinase K) beendet. Die Proben wurden mit 400 µl Phe
nol/Chloroform extrahiert und die wässrige Phase mit 2,5 Volumina Ethanol und 1/10 Volu
men 3M Natriumacetat (pH 5,2) bei -20°C gefällt. Die RNA wurde abzentrifugiert und mit 70-
80% Ethanol gewaschen. Nach erneuter Zentrifugation wurde die RNA getrocknet.
Die getrocknete RNA wurde in 5 µl Probenpuffer (0,5 × TBE, 80% (v/v) Formamid, 0,1%
(w/v) Xylencyanol und 0,1% (w/v) Bromphenolblau) aufgenommen, für 10 Minuten bei 65°C
erhitzt, auf Eis abgekühlt und anschließend mittels eines 8%igen Polyacrylamidgels aufge
trennt. Die aufgetrennte RNA wurde mittels Autoradiographie nachgewiesen (siehe Fig. 6).
In den Spuren 1-5 der Fig. 6 ist der zeitliche Verlauf (0, 10, 20, 30, 40 Minuten) der
Spleißreaktion der MINX prä-mRNA ohne IRE am 3'-OH Ende gezeigt. Auf der Abbildung ist
zu erkennen, daß nach ca. 20 Minuten ein Großteil der Prä-mRNA in die reife mRNA
überführt worden ist. In den Spuren 6-10 ist das gleiche Experiment mit der durch IRE am 3'-
OH Ende modifizierten prä-mRNA gezeigt. Auch hier ist eine deutliche Spleißreaktion nach 20
Minuten Inkubationszeit zu erkennen.
Claims (39)
1. Testsystem enthaltend
- a) eine oder mehrere, gleiche oder verschiedene immobilisierte Nukleinsäure/n mit mindestens einer spleißfähigen Nukleinsäure,
- b) mindestens ein gelfreies Nachweissystem zum Nachweis einer Spleißreaktion, gegebenenfalls
- c) mindestens eine Zusammensetzung enthaltend Spleißkomponenten, und vorzugsweise
- d) geeignete Nachweissonden, und gegebenenfalls
- e) weitere Hilfsmittel.
2. Testsystem nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die spleißfähige Nukleinsäure
mindestens zwei Exons enthält, die durch mindestens ein Intron getrennt sind.
3. Testsystem nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das gelfreie
Nachweissystem mindestens eine Sonde enthält.
4. Testsystem nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Sonde eine zu der
spleißfähigen Nukleinsäure komplementäre Nukleinsäure, eine die spleißfähige Nukleinsäure-
bindende niedermolekulare Verbindung und/oder ein die spleißfähige Nukleinsäure-bindendes
Peptid oder Protein ist.
5. Testsystem nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die niedermolekulare Verbindung
ausgewählt ist aus Theophyllin, Xanthin oder
einem Aminoglycosid, vorzugsweise Tobramycin, und das Nukleinsäure-
bindende Peptid oder Protein ein "iron responsive element binding protein" (IBP) ist.
6. Testsystem nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die komplementäre Nukleinsäure
komplementär zu mindestens einem Intron, zu mindestens einem Exon und/oder zu mindestens
einer Übergangsstelle von einem Exon und einem Intron ist.
7. Testsystem nach einem der Ansprüche 3-6, dadurch gekennzeichnet, daß die spleißfähige
Nukleinsäure oder die komplementäre Nukleinsäure des gelfreien Nachweissystems eine
Erkennungssequenz für eine Nukleinsäure-bindende niedermolekulare Verbindung und/oder
für ein Nukleinsäure-bindendes Peptid oder Protein enthält.
8. Testsystem nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Erkennungssequenz für eine
Nukleinsäure-bindende niedermolekulare Verbindung eine Aptamersequenz ist.
9. Testsystem nach einem der Ansprüche 1-8, dadurch gekennzeichnet, daß das gelfreie
Nachweissystem eine Markierung enthält.
10. Testsystem nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Markierung eine radioaktive
Markierung, eine Markierung mit Fluoreszenzfarbstoffen, mit Biotin, mit Digoxigenin
und/oder mit Antikörper ist.
11. Testsystem nach einem der Ansprüche 3-8, dadurch gekennzeichnet, daß die spleißfähige
Nukleinsäure und die Sonden-bindende Nukleinsäuresequenz miteinander verbunden sind.
12. Testsystem nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens zwei verschiedene
Sonden-bindende Nukleinsäuresequenzen mit einer spleißfähigen Nukleinsäure verbunden
sind.
13. Testsystem nach einem der Ansprüche 1-12, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäure
direkt kovalent oder indirekt über ein Strukturelement und einen Bindungspartner zum
Strukturelement oder mittels Hybridisierung an eine feste Phase gebunden ist.
14. Testsystem nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die direkte kovalente Bindung
über die vicinalen 2',3'-Hydroxylgruppe des Riboserückgrades der Nukleinsäure erfolgt.
15. Testsystem nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß das Strukturelement ein Biotin-
oder Dicarbonsäure-Linker ist.
16. Testsystem nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß der Bindungspartner Theophyllin,
Xanthin oder einem Aminoglycosid, vorzugsweise Tobramycin, und/oder ein Nukleinsäure-
Bindeprotein, insbesondere IBP, ist.
17. Testsystem nach einem der Ansprüche 13-16, dadurch gekennzeichnet, daß die feste Phase
ausgewählt ist aus Keramik, Metall, insbesondere Edelmetall, Glas oder Kunststoff
18. Testsystem nach einem der Ansprüche 1-17, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eine
Nukleinsäure eine RNA ist.
19. Testsystem nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß die RNA von einer Nukleinsäure
abgeleitet ist, ausgewählt aus einer Sequenz der Formel
wobei (Th/To) eine Sequenz ausgewählt aus
bedeutet.
20. Testsystem nach einem der Ansprüche 1-19, dadurch gekennzeichnet, daß
Zusammensetzung gemäß Merkmal (c) "small nuclear ribonucleoprotein particles" (snRNP)-
Komponenten und nicht-snRNP-Komponenten enthalten.
21. Testsystem nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß die snRNP-Komponenten U1-,
U2-, U4-, U5- und/oder U6-Proteine enthalten.
22. Testsystem nach einem der Ansprüche 1-21, dadurch gekennzeichnet, daß
Zusammensetzung gemäß Merkmal (c) ein Zellextrakt, insbesondere ein eukaryotischer Zell-
oder Zellkernextrakt ist.
23. Testsystem nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß der Zellkernextrakt aus tierischen
Zellen, insbesondere Säugetierzellen, oder von Pilzen, insbesondere Hefen gewonnen ist.
24. Testsystem nach einem der Ansprüche 1-23, dadurch gekennzeichnet, daß die weiter
Hilfsmittel gemäß Merkmal (d) ausgewählt sind aus Pufferlösungen, Stabilisatoren und/oder
Energieäquivalenten, insbesondere ATP.
25. Verfahren zur Herstellung eines Testsystems gemäß einem der Ansprüche 1-24, dadurch
gekennzeichnet, daß mindestens eine spleißfähige Nukleinsäure gemäß Merkmal (a) und
mindestens ein gelfreies Nachweissystem gemäß Merkmal (b) sowie gegebenenfalls
mindestens eine Zusammensetzung enthaltend Splicekomponenten gemäß Merkmal (c) und
gegebenenfalls weitere Hilfsmitteln zusammengestellt werden.
26. Verfahren zum Auffinden einer wirksamen Substanz, dadurch gekennzeichnet, daß
- a) eine oder mehrere, gleiche oder verschiedene immobilisierte Nukleinsäure/n mit mindestens einer spleißfähigen Nukleinsäuresequenz in Anwesenheit von mindestens einer zu untersuchenden Substanz und mindestens einer Zusammensetzung enthaltend Splicekomponenten und gegebenenfalls weiteren Hilfsmitteln unter geeigneten Bedingungen inkubiert werden, und
- b) das sich gegebenenfalls gebildete Spleißprodukt mittels eines gelfreien Nachweissystems nachgewiesen wird.
27. Verfahren nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, daß die wirksame Substanz eine
pharmazeutisch wirksame Verbindung, ein Fungizid, ein Herbizid, ein Pestizid und/oder ein
Insektizid ist.
28. Verfahren nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, daß die pharmazeutisch wirksame
Substanz ein Antibiotikum ist.
29. Verfahren nach einem der Ansprüche 26-28, dadurch gekennzeichnet, daß die zu
untersuchende Substanz ausgewählt ist aus einer natürlich vorkommenden, natürlich
vorkommenden und chemisch modifizierten und/oder synthetischen Substanz.
30. Verfahren nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, daß die zu untersuchende Substanz in
Form einer kombinatorischen Substanzbibliothek eingesetzt wird.
31. Verfahren zur Diagnose einer Erkrankung, dadurch gekennzeichnet, daß
- a) eine oder mehrere, gleiche oder verschiedene immobilisierte Nukleinsäure/n mit mindestens einer spleißfähigen Nukleinsäuresequenz in Anwesenheit von mindestens einer Zusammensetzung enthaltend Splicekomponenten und gegebenenfalls weiteren Hilfsmitteln unter geeigneten Bedingungen inkubiert werden, und
- b) das sich gegebenenfalls gebildete Spleißprodukt mittels eines gelfreien Nachweissystems nachgewiesen wird.
32. Verfahren nach Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, daß die Erkrankung eine Erbkrankheit,
eine Krebserkrankung und/oder eine virale Erkrankung ist.
33. Verfahren nach Anspruch 31 oder 32, dadurch gekennzeichnet, daß die Erkrankung
ausgewählt ist aus Grave's Krankheit, spinale Muskelatrophy, β'-Thalassaemie,
Krebserkrankungen in bezug auf das c-erb-Onkogen, Hepatitis C Infektion und/oder Herpes
Simplex Virus Infektion.
34. Spleißfähige Nukleinsäuren ausgewählt aus einer RNA, die von einer Nukleinsäure abgeleitet
ist, ausgewählt aus einer Sequenz der Formel
wobei (Th/To) eine Sequenz ausgewählt aus
bedeutet.
35. Verwendung einer spleißfähigen Nukleinsäure gemäß Anspruch 34 zur Herstellung eines
Testsystems.
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Cited By (2)
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WO2001079537A2 (de) * | 2000-04-14 | 2001-10-25 | Aventis Research & Technologies Gmbh & Co Kg | Testsystem zum nachweis einer spleissreaktion, sowie dessen verwendung |
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Families Citing this family (2)
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2001079537A2 (de) * | 2000-04-14 | 2001-10-25 | Aventis Research & Technologies Gmbh & Co Kg | Testsystem zum nachweis einer spleissreaktion, sowie dessen verwendung |
WO2001079537A3 (de) * | 2000-04-14 | 2002-11-28 | Aventis Res & Tech Gmbh & Co | Testsystem zum nachweis einer spleissreaktion, sowie dessen verwendung |
EP1302543A1 (de) * | 2001-10-15 | 2003-04-16 | Bayer CropScience AG | Splicing als Target zum Identifizieren neuer Wirkstoffe |
WO2003033711A1 (de) * | 2001-10-15 | 2003-04-24 | Bayer Cropscience Ag | Splicing als target zum identifizieren neuer wirkstoffe |
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