DE60032634T2

DE60032634T2 - Verfahren zur isolierung von rns aus fixierten paraffin-eingebetteten gewebeproben

Info

Publication number: DE60032634T2
Application number: DE60032634T
Authority: DE
Inventors: Kathleen Altadena DANENBERG; Peter Altadena DANENBERG; Steven Arcadia SWENSON
Original assignee: University of Southern California USC
Current assignee: University of Southern California USC
Priority date: 1999-12-20
Filing date: 2000-10-31
Publication date: 2007-10-04
Anticipated expiration: 2020-11-01
Also published as: EA200501772A1; ATE349518T1; ATE523590T1; US20020009794A1; NO330802B1; CN1891836A; EP1743939A3; US20010029018A1; ES2373149T3; US20060199197A1; EP2363477A3; DE60032634D1; EP1743939B1; EA008832B1; US20090035761A1; TWI277652B; HK1055446A1; EP1242594A1; CA2394618A1; MXPA02006145A

Description

REGIERUNGSUNTERSTÜTZUNG
Die Regierung hat gemäß der Förderungsnummer R01 CA 71716 des National Cancer Institute der National Institutes of Health bestimmte Rechte an dieser Erfindung.
GEBIET DER ERFINDUNG
Diese Erfindung betrifft das Gebiet der Reinigung von RNA, DNA und Proteinen aus biologischen Gewebeproben.
HINTERGRUND
Die Bestimmung von Genexpressionsspiegeln in Geweben ist von großer Wichtigkeit für das genaue Diagnostizieren einer menschlichen Krankheit und wird in steigendem Maße verwendet, um den Behandlungsverlauf bei einem Patienten zu bestimmen. Pharmakogenomische Verfahren können Patienten identifizieren, die wahrscheinlich auf einen bestimmten Arzneistoff antworten, und können neuen therapeutischen Ansätzen den Weg weisen.
Zum Beispiel ist Thymidylatsynthase (TS) ein integrales Enzym in der DNA-Biosynthese, wo es die reduktive Methylierung von Desoxyuridinmonophosphat (dUMP) in Desoxythymidinmonophosphat (dTMP) katalysiert, und sie liefert den einzigen Weg für die de novo-Synthese von Pyrimidin-Nucleotiden innerhalb der Zelle (Johnston et al., 1995). Thymidylatsynthase ist ein Ziel für chemotherapeutische Arzneistoffe, am häufigsten das anti-Folat-Mittel 5-Fluoruracil (5-FU). Als das wirksamste einzelne Mittel für die Behandlung von Colon-, Kopf- und Nacken- und Brust-Krebsarten ist die Hauptwirkung von 5-FU, die TS-Aktivität zu inhibieren, was in der Erschöpfung der intrazellulären Thyminspiegel resultiert und in der Folge zum Zelltod führt.
Von einer beträchtlichen Variation in der TS-Expression unter klinischen Tumor-Proben von sowohl primären Tumoren (Johnston et al., 1995; Lenz et al., 1995) als auch Metastasen (Farrugia et al., 1997; Leichmann et al., 1997) ist berichtet worden. Im colorectalen Krebs ist zum Beispiel das Verhältnis der TS-Expression im Tumorgewebe im Vergleich zum normalen gastrointestinalen mucosalen Gewebe im Bereich von 2 bis 10 gewesen (Ardalan und Zang, 1996).
Von der Thymidylatsynthase ist auch bekannt, dass sie eine klinische Wichtigkeit in der Entwicklung einer Tumorresistenz hat, was durch Untersuchungen gezeigt wurde, die eine akute Induktion von TS-Protein und eine Erhöhung der TS-Enzymspiegel in neoplastischen Zellen nach einem Aussetzen gegenüber 5-FU gezeigt haben (Spears et al. 1982; Swain et al. 1989). Die Fähigkeit eines Tumors, TS als Antwort auf cytotoxische Mittel wie 5-FU akut zu überexprimieren, kann eine Rolle in der Entwicklung einer Fluoruracil-Resistenz spielen. Vorherige Untersuchungen haben gezeigt, dass die Spiegel des TS-Proteins direkt mit der Wirksamkeit einer 5-FU-Therapie korrelieren und dass es eine direkte Korrelation zwischen Protein und RNA-Expression gibt (Jackman et al., 1985) und dass die TS-Expression ein starker prognostischer Marker bei colorectalem und Brustkrebs ist (Jackman et al., 1985; Horikoshi et al., 1992).
In einer fortgeschrittenen metastatischen Krankheit ist gezeigt worden, dass sowohl hohe TS-mRNA, quantifiziert durch RT-PCR, als auch eine hohe TS-Proteinexpression eine schwache Antwort auf eine Fluorpyrimidin-basierte Therapie für colorectale (Johnston et al., 1995, Farrugia et al., 1997, Leichmann et al., 1997), Magen- (Lenz et al., 1995, Alexander et al., 1995) und Kopf- und Nacken- (Johnston et al., 1997) Krebsarten voraussagen. Ein beträchtliches Überlappen zwischen Antwortenden und Nicht-Antwortenden war in der niedrigen TS-Kategorie vorhanden, aber Patienten mit TS-Spiegeln über dem Durchschnitt waren vorwiegend Nicht-Antwortende. Der vorhersagende Wert einer TS-Überexpression kann weiter verstärkt werden, wenn er mit anderen molekularen Charakteristika wie den Spiegeln der Dihydropyrimidindehydrogenase (DPD)- und der Thymidinphosphorylase (TP)-Expression, dem replication error positive (RER+)-Status (Kitchens und Berger 1997) und dem p53-Status (Lenz et al., 1997) kombiniert wird. Untersuchungen bis jetzt, die die Expression von TS in menschlichen Tumoren bewertet haben, legen nahe, dass die Fähigkeit, eine Antwort und ein Ergebnis basierend auf der TS-Expression in menschlichen Tumoren vorherzusagen, in der Zukunft die Möglichkeit bereitstellen kann, Patienten auszuwählen, die höchstwahrscheinlich von einer TS-gelenkten Therapie profitieren.
Bis jetzt sind quantitative Gewebe-Genexpressions-Untersuchungen, einschließlich jener der TS-Expression, auf die reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktions-(RT-PCR) Amplifizierung von RNA von gefrorenem Gewebe limitiert gewesen. Die meisten pathologischen Proben sind jedoch nicht als gefrorene Gewebe präpariert, sondern sind routinemäßig Formalin-fixiert und Paraffineingebettet (FFPE), um eine histologische Analyse und eine Archiv-Lagerung zu ermöglichen. Genexpressionsspiegel können in solchen fixierten und eingebetteten Proben durch Verwendung von immunhistochemischer Färbung semi-quantitativ und indirekt überwacht werden, um die Protein-Expressionsspiegel zu überwachen. Da Paraffin-eingebettete Proben weitreichend erhältlich sind, werden schnelle und verlässliche Verfahren für die Isolierung von Nucleinsäuren, insbesondere RNA, von solchen Proben benötigt.
Eine Anzahl von Techniken existiert für die Reinigung von RNA von biologischen Proben, aber keine ist für die Isolierung von RNA von FFPE-Proben verlässlich. Zum Beispiel beschreibt Chomczynski (US-Pat. Nr. 5,346,994) ein Verfahren für das Reinigen von RNA von Geweben basierend auf einer Flüssigphasen-Auftrennung unter Verwendung von Phenol und Guanidinisothiocyanat. Eine biologische Probe wird in einer wässrigen Lösung von Phenol und Guanidinisothiocyanat homogenisiert und das Homogenat danach mit Chloroform gemischt. Nach einer Zentrifugation trennt sich das Homogenat in eine organische Phase, eine Zwischenphase und eine wässrige Phase auf. Proteine werden in der organischen Phase, DNA in der Zwischenphase und RNA in der wässrigen Phase abgeschieden. RNA kann aus der wässrigen Phase präzipitiert werden. Dieses Verfahren liefert keine verlässliche Isolierung von RNA aus Formalinfixierten, Paraffin-eingebetteten Gewebeproben.
Andere bekannte Techniken für das Isolieren von RNA nutzen typischerweise entweder Guanidin-Salze oder eine Phenolextraktion, wie zum Beispiel in Sambrook, J. et al., (1989) auf S. 7.3-7.24 und in Ausubel, F. M. et al., (1994) auf S. 4.0.3-4.4.7. beschrieben. Jedoch liefert keines der bekannten Verfahren liefern reproduzierbare quantitative Ergebnisse in der Isolierung von RNA aus Paraffin-eingebetteten Gewebeproben.
Techniken für die Isolierung von RNA aus Paraffin-eingebetteten Geweben werden besonders für die Untersuchung der Genexpression in Tumorgeweben benötigt. Die Expressionsspiegel von bestimmten Rezeptoren oder Enzymen können auf die Wahrscheinlichkeit eines Erfolgs einer bestimmten Behandlung hinweisen.
Wirkliche quantitative TS-Genexpressions-Untersuchungen sind auf die RT-PCR von gefrorenem Gewebe beschränkt gewesen, wohingegen ein semi-quantitatives Überwachen der TS-Proteinexpression in archiviertem pathologischem Material, das auf Glas-Objektträgern fixiert ist, durch immunhistochemische Färbung verfügbar gewesen ist. Aufgrund der Limitierungen im Isolieren von RNA von archiviertem pathologischem Material waren quantitative Techniken für das Messen von Genexpressionsspiegeln von solchen Proben vordem nicht verfügbar.
ZUSAMMENFASSUNG
Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung ist es, ein verlässliches Verfahren für die Isolierung von RNA, DNA oder Proteinen von Proben von biologischen Geweben bereitzustellen. Die Erfindung liefert auch einfache, effiziente und reproduzierbare Verfahren für die Isolierung von RNA, DNA oder Proteinen von Gewebe, das in Paraffin eingebettet gewesen ist.
Die Erfindung liefert Verfahren des Reinigens von RNA aus einer biologischen Gewebeprobe durch Erhitzen der Probe für etwa 5 bis etwa 120 Minuten bei einer Temperatur zwischen etwa 50 und etwa 100°C in einer Lösung einer wirksamen Konzentration eines chaotropen Mittels. In einer Ausführungsform ist das chaotrope Mittel eine Guanidinium-Verbindung. Die RNA wird dann aus der Lösung gewonnen. Zum Beispiel kann die RNA-Gewinnung durch eine Chloroform-Extraktion erreicht werden.
In einem Verfahren der Erfindung wird RNA aus einer archivierten pathologischen Probe isoliert. In einer Ausführungsform wird eine Paraffineingebettete Probe zuerst entparaffinisiert. Ein beispielhaftes Entparaftinisierungsverfahren involviert das Waschen der paraffinisierten Probe mit einem organischen Lösungsmitteln, vorzugsweise Xylol. Die entparaffinisierten Proben können mit einer wässrigen Lösung eines niedrigeren Alkohols rehydratisiert werden. Geeignete niedrigere Alkohole schließen Methanol, Ethanol, Propanole und Butanole ein. In einer Ausführungsform werden die entparaffinisierten Proben mit aufeinanderfolgenden Waschschritten mit niedrigeren alkoholischen Lösungen von sinkender Konzentration rehydratisiert. In einer anderen Ausführungsform wird die Probe gleichzeitig entparaffinisiert und rehydratisiert.
Die entparaffinisierten Proben können unter Verwendung von mechanischen, von Ultraschall- oder anderen Mitteln der Homogenisierung homogenisiert werden. In einer Ausführungsform werden die rehydratisierten Proben in einer Lösung, die ein chaotropes Mittel wie Guanidiniumthiocyanat (auch als Guanidiniumisothiocyanat verkauft) umfasst, homogenisiert.
Die homogenisierten Proben werden auf eine Temperatur im Bereich von etwa 50 bis etwa 100°C in einer chaotropen Lösung, umfassend eine wirksame Menge eines chaotropen Mittels, erhitzt. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das chaotrope Mittel eine Guanidinium-Verbindung. Ein bevorzugtes chaotropes Mittel ist Guanidiniumthiocyanat.
Die RNA wird dann aus der Lösung durch zum Beispiel Phenol-Chloroform-Extraktion, Ionenaustausch-Chromatographie oder Größenausschluss-Chromatographie gewonnen.
Die RNA kann dann unter Verwendung der Techniken der Extraktion, Elektrophorese, Chromatographie, Präzipitation oder von anderen geeigneten Techniken weiter gereinigt werden.
Die durch die Verfahren der Erfindung isolierte RNA ist geeignet für eine Zahl von Anwendungen in der Molekularbiologie, einschließlich der reversen Transkription mit zufälligen Primern, um cDNA-Genbanken zu liefern.
Die gereinigte RNA kann verwendet werden, um den Spiegel der Genexpression in einer Formalin-fixierten, Paraffin-eingebetteten Gewebeprobe durch reverse Transkriptions-Polymerase-Kettenreaktions-(RT-PCR) Amplifikation zu bestimmen. Unter Verwendung von geeigneten PCR-Primern können die Expressionsspiegel von jeder Boten-RNA durch die Verfahren der Erfindung bestimmt werden. Die quantitative RT-PCR-Technik ermöglicht den Vergleich von Proteinexpressionsspiegeln in einer Paraffin-eingebetteten (durch Immunhistochemie) mit den Genexpressionsspiegeln (unter Verwendung der RT-PCR) in derselben Probe.
Die Verfahren der Erfindung sind in einem weiten Bereich von Gewebe- und Tumortypen und Zielgenen anwendbar und können so für die Bewertung einer Behandlung und als ein diagnostisches Mittel in einer Reihe von Krebsarten einschließlich Brust-, Kopf- und Nacken-, Ösophagus-, colorectalem und anderen Krebsarten verwendet werden. Ein besonders bevorzugtes Gen für die Verfahren der Erfindung ist das Thymidylatsynthase-Gen. Die Verfahren der Erfindung erreichten eine reproduzierbare Quantifizierung der TS-Genexpression in FFPE-Geweben, vergleichbar mit jenen, die von gefrorenen Geweben stammten.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1 zeigt den Spiegel der β-Actin- und TS-Expression bei verschiedenen Erhitzungszeiten. Diese Daten zeigen, dass es ohne den Erhitzungsschritt einen minimalen Ertrag an RNA gibt, der aus dem Paraffin extrahiert wird.
2 zeigt den Spiegel der β-Action-Expression in normalem (N) oder tumorösem (T) Gewebe von Patienten mit colorectalem Krebs, bestimmt durch quantitative PCR aus RNA, die bei 95°C für null bis 40 Minuten extrahiert wurde. Diese Daten legen 30 min als einen optimalen Erhitzungszeitraum nahe.
3 zeigt die Wirkung sowohl von Temperatur als auch Zeit auf den Ertrag der β-Actin-RNA und auf die Isolierung von DNA. Diese Daten zeigen, dass sich die RNA bei längeren Erhitzungszeiträumen (zwischen 60 und 120 min) einer Degradierung unterzieht, während es einen Anstieg der kontaminierenden DNA gibt, die zum Erzeugen eines DNA-PCR-Signals in der Lage ist. Die Säulen repräsentieren Werte von Experimenten in dreifacher Ausführung, die zu den verschiedenen angezeigten Zeiten und Temperaturen durchgeführt wurden.
4 zeigt die Wirkung von verschiedenen Erhitzungslösungen auf den Ertrag der isolierten RNA. Diese Daten zeigen, dass das chaotrope Mittel in der Lösung, in diesem Fall Guanidiniumisothiocyanat (GITC), der wesentliche Bestandteil der RNA-Extraktionslösung ist, ohne den der Ertrag der extrahierten RNA mindestens 10-fach niedriger ist.
5 zeigt einen Vergleich der relativen TS-Genexpression von Paraffineingebetteten (weiße Säulen) und gefrorenen Zellpellets (schwarze Säulen) von sechs Zelllinien. Diese Daten zeigen, dass die Analyse von Paraffin-extrahierter RNA verlässlich die Genexpressions-Werte in frisch-gefrorenem Gewebe reflektiert.
6 zeigt einen Vergleich der TS-Genexpressionsspiegel in normalen oder tumorösen Colon- und tumorösen Ösophagus-Geweben, die entweder Formalinfixiert und Paraffin-eingebettet oder gefroren waren.
7 zeigt die TS/β-Actin-Verhältnisse, die in Paraffin-Schnitten von Patienten bestimmt wurden, deren Antwort auf 5-FU/LU vorher mit der TS-Genexpression verknüpft wurde.
8 zeigt die Expressionsspiegel von vier Malignitäts-Markergenen (TS; Thymidinphosphorylase (TP); Cyclooxygenase-2 (COX-2); und vaskulärem endothelialem Wachstumsfaktor (VEGF)) in FFPE-Proben eines primären Colonkrebsgeschwürs und einer Lebermetastase, die ein Jahr später in demselben Patienten wiederkehrte. Diese Daten zeigen, dass, wie erwartet werden könnte, drei der vier Malignitäts-Marker im metastatischen Tumorgewebe erhöht sind.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
Die Verfahren der vorliegenden Erfindung involvieren die Reinigung von RNA aus biologischen Proben. In einer Ausführungsform sind die Proben Paraffin-eingebettete Gewebeproben, und das Verfahren involviert eine Entparaffinisierung der eingebetteten Proben, eine Homogenisierung des entparaffinisierten Gewebes und ein Erhitzen des homogenisierten Gewebes bei einer Temperatur im Bereich von etwa 50 bis etwa 100°C für einen Zeitraum von zwischen etwa 5 Minuten bis etwa 120 Minuten in einer chaotropen Lösung, enthaltend eine wirksame Menge einer Guanidinium-Verbindung. Dieser Erhitzungsschritt erhöht die Menge der cDNA, die von der Probe amplifiziert wird, um bis zu 1000-fach gegenüber Proben, die nicht erhitzt werden.
Während gefrorenes Tumorgewebe nicht weitverbreitet erhältlich ist, werden Paraffinblöcke routinemäßig von jedem Typ von Tumor nach einer Operation hergestellt, was retrospektive Untersuchungen im großen Rahmen der TS-Expression und der Chemotherapie-Antwort, die durchgeführt werden soll, ermöglicht.
Darüber hinaus kann die Technik auf jeden eines weiten Bereichs von Tumortypen und auf einen unbeschränkten Bereich von Zielgenen angewendet werden. Dies hat Auswirkungen für die zukünftige Herstellung von individuellen Tumor-„Genexpressions-Profilen", wodurch Expressionsspiegel in individuellen Patientenproben für einen Bereich von Genen bestimmt werden könnten, von denen bekannt ist, dass sie den klinischen Erfolg und die Antwort auf verschiedene chemotherapeutische Mittel beeinflussen. Automatisierte Echtzeit-PCR einer FFPE-Probe ermöglicht das Ausrichten einer Behandlung auf individuelle Tumore.
Gewebeproben
RNA kann aus jeder biologischen Probe unter Verwendung der Verfahren der Erfindung isoliert werden. Biologische Proben sind oft mit einem Fixierungsmittel fixiert. Aldehyd-Fixierungsmittel wie Formalin (Formaldehyd) und Glutaraldehyd werden typischerweise verwendet. Gewebeproben, die unter Verwendung anderer Fixierungstechniken wie der Alkoholimmersion (Battifora und Kopinski, J. Histochem. Cytochem. (1986) 34: 1095) fixiert werden, sind auch geeignet. Die verwendeten Proben sind auch in Paraffin eingebettet. RNA kann von jeder Paraffin-eingebetteten biologischen Gewebeprobe durch die Verfahren der Erfindung isoliert werden. In einer Ausführungsform sind die Proben sowohl Formalin-fixiert als auch Paraffineingebettet.
Entparaffinisieren von Proben
Die Entparaffinisierung entfernt den Großteil des Paraffins von der Paraffin-eingebetteten Probe. Eine Zahl von Techniken für die Entparaffinisierung ist bekannt, und jede geeignete Technik kann mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Das bevorzugte Verfahren der Erfindung nutzt das Waschen mit einem organischen Lösungsmittel, um das Paraffin aufzulösen. Solche Lösungsmittel sind in der Lage, Paraffin wirksam aus der Gewebeprobe zu entfernen, ohne die RNA-Isolierung schädlich zu beeinflussen. Geeignete Lösungsmittel können ausgewählt werden aus Lösungsmitteln wie Benzol, Toluol, Ethylbenzol, Xylolen und Gemischen davon. Ein Xylol ist das bevorzugte Lösungsmittel für die Verwendung in den Verfahren der Erfindung. Die Lösungsmittel alleine oder in Kombination in den Verfahren der Erfindung sind vorzugsweise von hoher Reinheit, normalerweise mehr als 99%.
Paraffin wird typischerweise durch Waschen mit einem organischen Lösungsmittel unter kräftigem Mischen, gefolgt von einer Zentrifugation entfernt. Die Proben werden bei einer Geschwindigkeit zentrifugiert, die ausreichend ist, um zu bewirken, dass das Gewebe in dem Röhrchen pelletiert, normalerweise bei etwa 10000 bis etwa 20000 × g. Nach der Zentrifugation wird der organische Lösungsmittelüberstand verworfen. Ein Histologe wird erkennen, dass das Volumen des verwendeten organischen Lösungsmittels und die Zahl der nötigen Waschschritte von der Größe der Probe und der Menge des Paraffins, das entfernt werden soll, abhängen werden. Je mehr Paraffin entfernt werden soll, desto mehr Waschschritte, die nötig sein werden. Typischerweise wird eine Probe zwischen ein- und etwa zehnmal und vorzugsweise zwischen etwa zwei- und etwa viermal gewaschen werden. Ein typisches Volumen eines organischen Lösungsmittels ist etwa 500 μl für eine 10 μm-Gewebeprobe.
Andere Verfahren für eine Entparaffinisierung, die einem Fachmann bekannt sind, können auch im Verfahren der Erfindung verwendet werden. Solche Verfahren schließen das direkte Schmelzen ein (Banerjee et al., 1995).
Die Proben werden vorzugsweise nach der Entparaffinisierung rehydratisiert. Das bevorzugte Verfahren für die Rehydratisierung ist ein schrittweises Waschen mit wässrigen Lösungen aus niedrigeren Alkoholen von absteigender Konzentration. Ethanol ist ein bevorzugter niedrigerer Alkohol für die Rehydratisierung. Andere Alkohole können auch für die Verwendung bei der Erfindung geeignet sein, einschließlich Methanol, Isopropanol und andere ähnliche Alkohole im C1-C5-Bereich. Die Probe wird alternativ kräftig mit alkoholischen Lösungen gemischt und zentrifugiert. In einer bevorzugten Ausführungsform wird der Konzentrationsbereich des Alkohols schrittweise von etwa 100% bis etwa 70% in Wasser über drei bis fünf ansteigende Schritte gesenkt, wobei die Änderung in der Lösungskonzentration bei jedem Schritt normalerweise weniger als etwa 10% (d.h. die Folge: 100%, 95%, 90%, 80%, 70%) ist. In einer anderen Ausführungsform werden die Entparaffinisierung und die Rehydratisierung gleichzeitig unter Verwendung eines Reagenzes wie EZ-DEWAX (BioGenex, San Ramon, KA) ausgeführt.
Homogenisierung
Die entparaffinisierten, rehydratisierten Proben können durch jede mechanische, Ultraschall- oder andere geeignete Standardtechnik homogenisiert werden. Die Gewebehomogenisierung wird vorzugsweise mit einem mechanischen Gewebehomogenisator gemäß Standardvorgehensweisen ausgeführt. Eine Zahl von kommerziell erhältlichen Homogenisatoren ist für die Verwendung mit der Erfindung geeignet, einschließlich: Ultra-Turrax-Homogenisator (IKA-Works, Inc., Wilmington, NC); Tissumizer (Tekmar-Dohrmann, Cincinnati, OH); und Polytron (Brinkmann, Westbury, NY).
In einer Ausführungsform wird die Probe in der Anwesenheit eines chaotropen Mittels homogenisiert. Chaotrope Mittel werden so ausgewählt, dass eine wirksame Konzentration von RNA aus einer Paraffin-eingebetteten Probe in einer Menge von mehr als etwa zehnfach von jener, die in der Abwesenheit eines chaotropen Mittels isoliert wird, gereinigt wird. Chaotrope Mittel schließen ein: Guanidinium-Verbindungen, Harnstoff, Formamid, Kaliumiodiod, Kaliumthiocyanat und ähnliche Verbindungen. Das bevorzugte chaotrope Mittel für die Verfahren der Erfindung ist eine Guanidinium-Verbindung wie Guanidinium-Isothiocyanat (auch als Guanidiniumthiocyanat verkauft) und Guanidinium-Hydrochlorid. Viele anionische Gegenionen sind nützlich, und ein Fachmann kann viele Guanidinium-Salze mit solchen geeigneten Anionen herstellen. Die in der Erfindung verwendete Guanidinium-Lösung hat im Allgemeinen eine Konzentration im Bereich von etwa 1 bis etwa 5 M, mit einem bevorzugten Wert von etwa 4 M. Wenn die RNA schon in Lösung ist, kann die Guanidinium-Lösung von höherer Konzentration sein, so dass die Endkonzentration, die in der Probe erreicht wird, in dem Bereich von etwa 1 bis etwa 5 M ist. Die Guanidinium-Lösung wird vorzugweise auch mit einem geeigneten biochemischen Puffer wie Tris-Cl auf einen pH-Wert von etwa 3 bis etwa 6, mehr bevorzugt etwa 4 gepuffert. Die chaotrope Lösung kann auch reduzierende Mittel wie Dithiothreit (DTT) und β-Mercaptoethanol (BME) enthalten. Die chaotrope Lösung kann auch RNAse-Inhibitoren enthalten.
Erhitzen
Die Proben werden in der chaotropen Lösung bei einer Temperatur von etwa 60°C bis etwa 100°C für etwa 5 Minuten bis etwa 2 Stunden erhitzt. Alternativ werden die Proben in der chaotropen Lösung bei einer Temperatur von etwa 50°C bis etwa 100°C für etwa 5 Minuten bis etwa 2 Stunden erhitzt. Die Erhitzungszeiten werden typischerweise so gewählt, dass die Menge der gereinigten RNA mindestens etwa 100-fach höher und mehr bevorzugt etwa 1000-fach höher als für unbehandelte Proben ist. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Probe für etwa 20 Minuten bei einer Temperatur von etwa 75 bis etwa 100°C erhitzt. Bevorzugter wird die Probe für 30 bis 60 Minuten bei etwa 95°C erhitzt.
RNA-Gewinnung
Die RNA kann aus der chaotropen Lösung nach dem Erhitzen durch jede geeignete Technik gewonnen werden, die in der Isolierung der RNA von mindestens einem Bestandteil der chaotropen Lösung resultiert. Die RNA kann von der chaotropen Lösung durch Extraktion mit einem organischen Lösungsmittel, Chloroform-Extraktion, Phenol-Chloroform-Extraktion, Präzipitation mit Ethanol, Isopropanol oder jedem anderen niedrigeren Alkohol, durch Chromatographie einschließlich Ionenaustausch-Chromatographie, Größenausschluss-Chromatographie, Kieselsäuregel-Chromatographie und Umkehrphasen-Chromatographie oder durch elektrophoretische Verfahren einschließlich Polyacrylamid-Gelelektrophorese und Agarose-Gelelektrophorese gewonnen werden, was für einen Fachmann offensichtlich sein wird. Die RNA wird vorzugsweise aus der chaotropen Lösung unter Verwendung der Phenol-Chloroform-Extraktion gewonnen.
Nach der RNA-Gewinnung kann die RNA optionell weiter gereinigt werden. Eine weitere Reinigung resultiert in RNA, die im Wesentlichen frei ist von kontaminierender/n DNA oder Proteinen. Eine weitere Reinigung kann durch jede der vorher erwähnten Techniken für die RNA-Gewinnung erreicht werden. Die RNA wird vorzugsweise durch Präzipitation unter Verwendung eines niedrigeren Alkohols, besonders mit Ethanol oder mit Isopropanol gereinigt. Die Präzipitation wird vorzugsweise in der Anwesenheit eines Trägers wie Glycogen ausgeführt, der die Präzipitation ermöglicht.
DNA- und Protein-Gewinnung
Die Verfahren der Erfindung können auch verwendet werden, um DNA oder Protein aus der Gewebeprobe zu reinigen. Nach dem Mischen einer Probe mit einem organischen Lösungsmittel wie Chloroform und nachfolgender Zentrifugation hat die Lösung drei Phasen, eine untere organische Phase, eine Zwischenphase und eine obere wässrige Phase. Mit einem geeigneten chaotropen Mittel, insbesondere mit einer Guanidinium-Verbindung, werden sich die biologischen Bestandteile der Probe in die drei Phasen auftrennen. Die obere wässrige Phase wird RNA enthalten, während die Zwischenphase DNA enthalten wird, und die organische Phase wird Proteine enthalten. Ein Fachmann wird erkennen, dass die Verfahren der Erfindung für das Gewinnen sowohl der DNA- als auch der Proteinphasen sowie jener, die die RNA enthält, geeignet sind. Die DNA-Gewinnung wird durch die Verfahren der Erfindung verstärkt.
Gereinigte RNA
Die durch die Verfahren der Erfindung gereinigte RNA ist für eine Vielzahl von Zwecken und Molekularbiologie-Vorgehensweisen geeignet, einschließlich aber nicht limitiert auf: reverse Transkription in cDNA; Produzieren von radioaktiv, fluoreszent oder anderweitig markierter cDNA für eine Analyse auf Genchips, Oligonucleotid-Mikroarrays und dergleichen; Elektrophorese durch Acrylamid- oder Agarose-Gelelektrophorese; Reinigung durch Chromatographie (z.B. Ionenaustausch-, Kieselsäuregel-, Umkehrphasen- oder Größenausschluss-Chromatographie); Hybridisierung mit Nucleinsäure-Sonden; und Fragmentierung durch mechanische, Ultraschall- oder andere Mittel.
BEISPIELE
Materialien und Verfahren
Diese Materialien und Verfahren sind für die folgenden Beispiele gemeinsam. Probenherstellung. Die Charakteristika der menschlichen Zelllinien SK1, H157, A431, HT29, HCC298 und HH30 sind vor kurzem beschrieben worden. Die Zellen wurden von ihrer einzelligen Schicht durch Trypsinieren entfernt und durch Zentrifugation bei 3000 UpM für 5 Minuten pelletiert. Die Zellpellets wurden entweder bei -70°C eingefroren oder in Formalin für 24h fixiert, dann in Paraffin eingebettet.
Repräsentative Schnitte von Tumorgewebe wurden zum Zeitpunkt der Operation erhalten, in Formalin fixiert und durch Vorgehensweisen, die den meisten klinischen Pathologielabors gemeinsam sind, in Paraffin eingebettet. Querschnitte von Gewebe (5 μm) wurden unter Verwendung eines Mikrotoms geschnitten.
RNA-Isolierung. Die RNA wurde aus Paraffin-eingebettetem Gewebe wie folgt isoliert. Ein einzelner 5 μm-Schnitt von paraffinisiertem Gewebe wurde in ein Eppendorf-Röhrchen platziert und durch zwei 15 Minuten-Waschschritte mit Xylol entparaffinisiert. Das Gewebe wurde durch aufeinanderfolgende 15 Minuten-Waschschritte mit Alkoholabstufungen (100%, 95%, 80% und 70%) rehydratisiert. Das resultierende Pellet wurde in 4 M Guanidinisothiocyanat mit 0,5% Sarcosin und 20 mM Dithiothreit (DTT) suspendiert. Die Suspension wurde homogenisiert und dann von etwa 50 bis etwa 95°C für 0 bis 60 Minuten erhitzt; ein Null-Erhitzungszeitpunkt wurde als eine Kontrolle für jede Probe eingeschlossen. Natriumacetat (pH 4,0) wurde auf 0,2 M zugefügt, und die Lösung wurde mit Phenol/Chloroform extrahiert und mit Isopropanol und 10 mg Glycogen präzipitiert. Nach der Zentrifugation (13000 UpM, 4°C, 15 min) wurde das RNA-Pellet zweimal mit 1 ml 75% Ethanol gewaschen, dann in RNAse freiem Wasser resuspendiert.
Reverse Transkription (RT). Nach dem Erhitzen wurde die Gesamt-RNA unter Verwendung von zufälligen Hexameren zu cDNA konvertiert. Die RT-Bedingungen waren, wie sie früher für gefrorenes Gewebe beschrieben worden sind (Horikoshi et al., 1992). Kontrollen, bei denen die reverse Transkriptase unterlassen wurde (No-RT), wurden für jede Probe hergestellt.
Echtzeit-PCR-Quantifizierung der TS- und β-Actin-Genexpression unter Verwendung der Perkin Elmer-Cetus 7700-PCR-Maschine (Tagman). Die Quantifizierung der mRNA-Spiegel wurde unter Verwendung der Echtzeit-PCR basierend auf einem Fluoreszenznachweis-Verfahren durchgeführt, wie früher beschrieben (Heid et al., 1996; Eads et al., 1999). Die cDNA wurde hergestellt, wie oben beschrieben. Die cDNA von Interesse und die Bezugs-cDNA wurden getrennt unter Verwendung einer Sonde mit einem 5'-Fluoreszenzreporterfarbstoff (6FAM) und einem 3'-Dämpfungsfarbstoff (TAMRA) amplifiziert. Die 5'-Exonucleaseaktivität der TAQ-Polymerase spaltet die Sonde und setzt das Reportermolekül frei, dessen Fluoreszenz durch das ABI Prism Sequence Detection System (Tagman) nachgewiesen wird. Nach dem Überschreiten eines Fluoreszenznachweis-Grenzwerts resultiert die PCR-Amplifizierung in einem Fluoreszenzsignal, das zu der Menge des erzeugten PCR-Produkts proportional ist. Die anfängliche Matrizenkonzentration wurde aus der Zyklusnummer, bei der das Fluoreszenzsignal einen Grenzwert in der exponentiellen Phase der PCR-Reaktion überschritt, bestimmt. Die relative Genexpression wurde basierend auf den Grenzwert-Zyklen des Gens von Interesse und des Bezugsgens bestimmt. Die Verwendung eines Bezugsgens vermeidet die Notwendigkeit, die RNA direkt zu quantifizieren, was eine Hauptfehlerquelle sein könnte.
Die Primer- und Sondensequenzen waren wie folgt: TS: SEQ ID NO: 1: GGC CTC GGT GTG CCT TT; SEQ ID NO2: AAC ATC GCC AGC TAC GCC CTG C; SEQ ID NO:3: GAT GTG CGC AAT CAT GTA CGT. β-Actin: SEQ ID NO:4: TGA GCG CGG CTA CAG CTT; SEQ ID NO:5: ACC ACC ACG GCC GAG CGG; SEQ ID NO:6: TCC TTA ATG TCA CGC ACG ATT T. Für die Echtzeit-PCR-Experimente wurden, wie oben diskutiert, die Reporter-Oligonucleotide (SEQ ID NOS: 2 und 5) 5' mit 6FAM markiert und wurden 3' mit TAMRA markiert.
Für jede PCR wurde eine Kontrolle „ohne reverse Transkriptase" (NRT oder No-RT) eingeschlossen. Der Zweck dieser Reaktion war es, jegliche Hintergrund-Amplifikation zu korrigieren, die von einer genomischen Rest-DNA-Kontamination stammt. Daher wird jeder Gesamtwert für TS und β-Actin als der RT-Wert minus dem NRT-Wert (RT-NRT) berechnet.
Statistische Analyse. Ein nicht-parametrischer Vergleich des Bedürftigkeitstests wurde durchgeführt, um zu bestimmen, ob Unterschiede in den TS-Spiegeln zwischen gefrorenen Gewebe- und FFPE-Proben desselben Tumors signifikant oder nicht signifikant waren.
BEISPIEL 1
Allgemeine RNA-Isolierungs-Vorgehensweise
RNA wurde aus Paraffin-eingebettetem Gewebe durch die folgende allgemeine Vorgehensweise extrahiert.
A. Entparaffinisierung und Hydratisierung der Schnitte:

(1) Ein Teil eines ungefähr 10 μM-Schnitts wird in ein 1,5 ml-Plastik-Zentrifugenröhrchen platziert.
(2) 600 μl Xylol werden zugefügt, und das Gemisch wird kräftig für etwa 10 Minuten bei Zimmertemperatur (ungefähr 20 bis 25°C) geschüttelt.
(3) Die Probe wird für etwa 7 Minuten bei Zimmertemperatur bei der Höchstgeschwindigkeit der Tischzentrifuge (etwa 10-20000 × g) zentrifugiert.
(4) Die Schritte 2 und 3 werden wiederholt, bis der Hauptteil des Paraffins aufgelöst worden ist. Zwei oder mehrere Male werden normalerweise in Abhängigkeit von der Menge des Paraffins, das in dem ursprünglichen Probenteil eingeschlossen ist, benötigt.
(5) Die Xylol-Lösung wird durch kräftiges Schütteln mit einem niedrigeren Alkohol, vorzugsweise mit 100% Ethanol (etwa 600 μl) für etwa 3 Minuten entfernt.
(6) Das Röhrchen wird für etwa 7 Minuten wie im Schritt (3) zentrifugiert.
Der Überstand wird abgeschüttet und verworfen. Das Pellet wird weiß.
(7) Die Schritte 5 und 6 werden mit sukzessiv verdünnteren Ethanol-Lösungen wiederholt: zuerst mit etwa 95% Ethanol, dann mit etwa 80% und schließlich mit etwa 70% Ethanol.
(8) Die Probe wird für 7 Minuten bei Zimmertemperatur wie im Schritt (3) zentrifugiert. Der Überstand wird verworfen, und das Pellet wird bei Zimmertemperatur für etwa 5 Minuten trocknen gelassen.

B. RNA-Isolierung mit Phenol-Chloroform

(1) 400 μl Guanidinisothiocyanat-Lösung einschließlich 0,5% Sarcosin und 8 μl 1 M Dithiothreit werden zugefügt.
(2) Die Probe wird dann mit einem Gewebehomogenisator (Ultra-Turrax, IKA-Works, Inc., Wilmington, NC) für etwa 2 bis 3 Minuten homogenisiert, während die Geschwindigkeit schrittweise von niedriger Geschwindigkeit (Geschwindigkeit 1) zu hoher Geschwindigkeit (Geschwindigkeit 5) erhöht wurde.
(3) Die Probe wird dann bei etwa 95°C für etwa 5-20 Minuten erhitzt. Es wird bevorzugt, den Deckel des Röhrchens, das die Probe enthält, vor dem Erhitzen mit einer feinen Gauge-Nadel einzustechen. Alternativ kann der Deckel mit einer Plastikklammer oder mit einer Labor-Folie befestigt werden.
(4) Die Probe wird dann mit 50 μl 2 M Natriumacetat bei pH 4,0 und 600 μl Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (10:1,93:0,036) extrahiert, das frisch durch Mischen von 18 ml Phenol mit 3,6 ml einer 1:49 Isoamylalkohol:Chloroform-Lösung hergestellt wurde. Die Lösung wird für etwa 10 Sekunden kräftig geschüttelt, dann für etwa 15 Minuten auf Eis abgekühlt.
(5) Die Lösung wird für etwa 7 Minuten bei Höchstgeschwindigkeit zentrifugiert. Die obere (wässrige) Phase wird in ein neues Röhrchen transferiert.
(6) Die RNA wird mit etwa 10 μl Glycogen und mit 400 μl Isopropanol für 30 Minuten bei -20°C präzipitiert.
(7) Die RNA wird durch Zentrifugation für etwa 7 Minuten in einer Tischzentrifuge bei Höchstgeschwindigkeit pelletiert; der Überstand wird abgeschüttet und verworfen; und das Pellet mit ungefähr 500 μl etwa 70 bis 75% Ethanol gewaschen.
(8) Die Probe wird wieder für 7 Minuten bei Höchstgeschwindigkeit zentrifugiert. Der Überstand wird abgeschüttet und das Pellet luftgetrocknet. Das Pellet wird dann in einem geeigneten Puffer für weitere Experimente gelöst (z.B. 50 μl 5 mM Tris-Chlorid, pH 8,0).

BEISPIEL 2
Erhitzungszeit
Dieses Beispiel illustriert die Wirkung der Erhitzungszeit auf den Ertrag der RNA.
Wie in 1 illustriert, erhöhte das Erhitzen der chaotropen Lösung bei 95°C vor der Präzipitation und reversen Transkription signifikant die Effizienz des Nachweises der TS- und β-Actin-Ziele. Wenn kein Erhitzungsschritt eingeschlossen wurde, konnten weder TS noch β-Actin nachgewiesen werden (0 min-Zeitpunkt). Nach 20 Minuten bei 95°C waren beide Transkripte nachweisbar; ein weiterer Anstieg der Erhitzungszeit auf 60 Minuten resultierte in einem 3-fachen Anstieg in der Empfindlichkeit des Nachweises für TS und einem 4,5-fachen Anstieg für β-Actin. (NRT = Kontrolle ohne reverse Transkriptase, RT-NRT = gesamter relativer Genexpressionsspiegel, d.h. reverse Transkriptase minus keine reverse Transkriptase).
2 illustriert die Menge der RNA-Expression des β-Actin-Gens in normalem (N) und tumorösem (T) Gewebe. Die Proben wurden bei 95°C für Zeitspannen im Bereich von Null bis 40 Minuten erhitzt. Ein bevorzugter Erhitzungszeitraum von etwa 30 Minuten wird für die meisten Proben beobachtet.
3 zeigt, dass bei längeren Erhitzungszeiten als etwa 60 min die Menge der extrahierten RNA anfängt zu sinken, was eine Hitzedegradierung der RNA nahelegt, während die Menge der extrahierten DNA zu steigen beginnt. Dies ist unerwünscht, da die Anwesenheit von DNA in manchen Fällen ein falsches PCR-Signal geben kann.
BEISPIEL 3
Erhitzungslösungen
Dieses Beispiel illustriert, dass das Erhitzen der RNA-Lösung in der Anwesenheit eines chaotropen Mittels wichtig ist für das Erhalten von hohen Erträgen von RNA. Dies war ein RT-PCR-Experiment unter Verwendung des Nachweises der β-Actin-Genexpression als ein Maß der relativen Mengen der isolierten RNA in verschiedenen Lösungen.
Klinische Proben von Ösophaguskrebs-FFPE-Gewebeproben wurden gemäß den oben beschriebenen Verfahren behandelt, mit der Ausnahme, dass das anfängliche Pellet, das nach der Entparaffinisierung erhalten wurde, gelöst oder in entweder 4 M Guanidiniumisothiocyanat (GITC), 4 M Guanidiniumisothiocyanat + 100 μM β-Mercaptoethanol (GITC + BME), 4 M Guanidiniumisothiocyanat + 20 μM Dithiothreit (GITC + DTT) oder in Tris-Cl-Puffer (10 mM pH 7,5) oder Tris-Cl-Puffer + 20 μM DTT (Tris/Cl + DTT) suspendiert wurde. Die Proben wurden dann auf 95°C für 30 Minuten erhitzt oder nicht erhitzt (0 min, 95°C). Die Tris/Cl-Proben wurden dann mit 4 M Guanidiniumisothiocyanat behandelt. Die RNA-Spiegel wurden durch RT-PCR und Echtzeit-PCR-Nachweis von β-Actin bestimmt. Wie in 4 gezeigt, war die Anwesenheit des chaotropen Mittels Guanidiniumisothiocyanat beim Erhitzen für das Gewinnen von RNA mit hohem Ertrag wichtig. Die Anwesenheit eines reduzierenden Mittels wie DTT oder BME ist nicht wesentlich für eine RNA-Gewinnung mit hohem Ertrag. Die 4 M Guanidiniumisothiocyanat-Lösung enthält 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 25 mM EDTA und 0,5% Sarcosin.
BEISPIEL 4
Vergleich der Genexpressions-Werte, die in FFPE und gefrorenem Gewebe von denselben Quellen bestimmt wurden
Dieses Beispiel zeigt, dass die Verfahren der vorliegenden Erfindung Werte der Genexpressionen von Formalin-fixierten, Paraffin-eingebetteten Proben liefern, die äquivalent zu jenen sind, die von gefrorenem Gewebe erhalten wurden.
Proben von sechs Zelllinien wurden FFPE-behandelt und eine TS-Quantifizierung wurde unter Verwendung der Verfahren der Erfindung (einschließlich Erhitzen bei 95°C für 30 Minuten) durchgeführt. Die resultierenden relativen TS-Werte (5) wurden mit jenen verglichen, die von gefrorenen Zellpellets unter Verwendung von bekannten Verfahren erhalten wurden. Die relativen TS-Expressionsspiegel waren 3,0-19,5 (Durchschnitt = 8,5) in gefrorenen Zellen gegenüber 3,0-25,0 (Durchschnitt = 9,0) in FFPE-Proben. Die statistische Analyse des Unterschieds zwischen den zwei Durchschnitten offenbarte einen p-Wert von 0,726, was darauf hinweist, dass es keinen signifikanten Unterschied in den TS-Werten, die von gefrorenen Zellpellets unter Verwendung der ursprünglichen RT-PCR-Verfahren erhalten wurden, und jenen, die von FFPE-Zellpellets unter Verwendung der Verfahren der Erfindung erhalten wurden, gibt.
Die RNA-Expressionsspiegel in den Proben von tumorösen Geweben und von normalen (nicht tumorösen) Geweben waren auch äquivalent, unabhängig davon, ob die Proben Formalin-fixiert und Paraffin-eingebettet oder gefroren waren. Fünf normale und 6 Tumor-Colongewebe und 4 Ösophagus-Tumorgewebe wurden hinsichtlich der relativen TS-Genexpression in passendem Paraffin- und gefrorenem Gewebe (FT) wie oben verglichen. Die Ergebnisse sind in 6 illustriert. Es wurde kein signifikanter Unterschied zwischen den Spiegeln von TS, die in gefrorenen Gewebeproben gefunden wurden, und den TS-Werten, die in FFPE-Proben desselben Gewebes gefunden wurden, gefunden. Die traf für sowohl Colon- als auch Ösophagus-Gewebetypen zu (durchschnittliche FT-Proben Colon = 3,46, durchschnittliche FFPE-Proben Colon = 3,06, p = 0,395; durchschnittliche FT-Proben Ösophagus = 13,9, durchschnittliche FFPE-Proben Ösophagus = 15,93, p = 0,21).
BEISPIEL 5
Vergleich der TS-Spiegel in antwortenden und nicht-antwortenden Tumorgeweben
Eine Korrelation der TS-Spiegel in gefrorenen Gewebe- und passenden FFPE-Proben mit einer Antwort auf 5-FU/Leucovorin (LV) in einem Stadium IV-Colonkrebs. Frühere Berichte, die auf RT-PCR-Daten basieren, die von gefrorenem Gewebe stammen, fanden, dass hohe Spiegel von TS in Tumoren (relative Genexpression > 4,0) hinweisend auf eine schwache Antwort auf eine TS-Behandlung waren. Antwortende Tumoren konnten charakterisiert werden, dass sie niedrigere Spiegel von TS exprimieren. Die TS/β-Actin-Verhältnisse wurden in Paraffin-Schnitten von 17 Patienten bestimmt, deren Antwort auf 5-FU/LV vorher mit der TS-Genexpression durch die Analyse von gefrorenen Gewebeproben verknüpft worden war (7). Von den 17 war von 6 bekannt, dass sie auf TS ansprechend sind, und von 11 war bekannt, dass sie schwach Antwortende auf eine TS-Behandlung gewesen sind. Es wurde gefunden, dass die TS-Ergebnisse mit dem passenden Paraffin-Gewebe auch die Antwort auf diese Therapie vorhergesagt haben würde (durchschnittliche Antwortende FT = 2,87, durchschnittliche Antwortende FFPE = 2,37, p = 0,641: durchschnittliche nicht Antwortende FT = 7,66, durchschnittliche nicht Antwortende FFPE = 7,84, p = 0,537).
Es gab keinen signifikanten Unterschied zwischen den TS-Spiegeln, die von gefrorenem Gewebe stammten, und jenen, die von passenden FFPE-Geweben stammten.
BEISPIEL 6
TS-Genexpressionsspiegel in primärem Colonkrebs und einer Lebermetastase
Dieses Beispiel zeigt eine Analyse der Expression von TS und anderen Genen in einem primären Colontumor und in einer wiederkehrenden Lebermetastase von demselben Patienten.
8 zeigt die Expressionsspiegel von vier Genen: TS; TP; Cyclooxygenase-2 (COX-2); und vaskulärem endothelialem Wachstumsfaktor (VEGF) in FFPE-Proben eines primären Colonkrebsgeschwürs und einer Lebermetastase (met) von demselben Patienten, die ein Jahr später wiederkehrte. Die Ergebnisse legen nahe, dass, während der primäre Tumor empfindlich auf die 5-FU-Therapie war (TS = 2,32), die Metastase refraktär sein wird (TS Met 11,58). Die COX-2- und VEGF-Expressionsspiegel korrelieren mit den veröffentlichten Hinweisen, dass ihre Expression in einer aggressiven Krankheit erhöht und coreguliert ist. (Cox-2 primär = 1,35; COX-2 Met = 5,4; VEGF primär = 5,02; VEGF Met = 14,4.) Die RNA wurde, wie beschrieben, von einem 5 μM FFPE-Schnitt des primären Colonkrebsgeschwürs und von einem FFPE-Schnitt der Lebermetastase isoliert. Die relative TS-Genexpression in dem antwortenden primären Tumor war 2,32 im Vergleich zu 11,58 in der metastatischen Krankheit (8). Dieser 5-fache Anstieg in der TS-Expression, bestimmt durch die hier berichteten RT-PCR- Verfahren, weist darauf hin, dass die sekundäre Krankheit nicht auf 5-FU antworten wird und legt nahe, dass eine alternative Therapie wie CPT-11 geeignet sein kann.
BEZUGNAHMEN

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Claims

Verfahren zur Gewinnung von RNA aus einer fixierten, in Paraffin eingebetteten biologischen Gewebeprobe, umfassend: Entparaffinisierung der Probe; Erhitzen der Probe in einer chaotropen Lösung, die eine wirksame Konzentration einer Guanidiniumverbindung umfasst, auf eine Temperatur im Bereich von 50 bis 100°C für eine Zeitspanne von 5 bis 120 Minuten; und Gewinnen der RNA aus der chaotropen Lösung unter Verwendung einer Gewinnungstechnik ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Extraktion, Elektrophorese, Chromatographie, Präzipitation und Kombinationen dieser.
Verfahren nach Anspruch 1, weiter umfassend die Rehydratisierung der Probe vor dem Erhitzen.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, weiter umfassend die Homogenisierung der Probe vor dem Erhitzen.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die RNA durch Extraktion aus der chaotropen Lösung mittels eines wasserunlöslichen, organischen Lösungsmittels gewonnen wird.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei das wasserunlösliche organische Lösungsmittel im Wesentlichen aus Chloroform besteht.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, weiter umfassend die Reinigung der RNA.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei die RNA durch Ethanolpräzipitation gereinigt wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Zeitspanne 10 bis 60 Minuten beträgt.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei die Zeitspanne 30 bis 60 Minuten beträgt.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Temperatur im Bereich von 75 bis 100°C liegt.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Temperatur im Bereich von 85 bis 100°C liegt.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Guanidiniumverbindung ausgewählt wird aus Guanidiniumhydrochlorid und Guanidiniumisothiocyanat.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei das Guanidiniumisothiocyanat in einer Konzentration von 2 bis 5 M vorliegt.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei das Guanidiniumisothiocyanat in einer Konzentration von etwa 4 M vorliegt.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die chaotrope Lösung einen pH-Wert von 3 bis 6 aufweist.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei die chaotrope Lösung einen pH-Wert von etwa 4 aufweist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die chaotrope Lösung des weiteren ein Reduktionsmittel umfasst.
Verfahren nach Anspruch 17, wobei das Reduktionsmittel ausgewählt wird aus β-Mercaptoethanol und Dithiothreit.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die RNA dazu verwendet wird, die Höhe der Expression eines Gens zu bestimmen.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die RNA zusätzlich einem Arbeitsschritt unterworfen wird, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus reverser Transkription, reverser Transkription und Polymerasekettenreaktion, Elektrophorese, Chromatographie, Hybridisierung mit einer Nucleinsäuresonde und Fragmentierung.
Verfahren nach Anspruch 20, wobei die RNA einer reversen Transkription unterworfen wird und die dadurch entstandene cDNA markiert wird.
Verfahren nach Anspruch 21, wobei die markierte cDNA in einer Genchip- oder Mikroarray-Analyse eingesetzt wird.
Verfahren zur quantitativen Bestimmung der Genexpression von Zielgenen durch ein Verfahren, wie in einem der vorhergehenden Ansprüche beansprucht, des weiteren umfassend: Umwandlung der gereinigten RNA in cDNA durch eine reverse Transkriptions-Reaktion; Durchführung einer PCR-Reaktion mit der cDNA in einer Lösung für die Polymerasekettenreaktion, die eine Oligonucleotidsonde, welche zur Amplifikation von mindestens einer spezifizierten Sequenz geeignet ist, eine Polymerase und ein Fluorochrom umfasst; Messung der Veränderung der Fluoreszenzintensität, welche als Ergebnis der PCR-Reaktion auftritt; und Bestimmung der Menge einer Nucleinsäure, welche eine spezifizierte Sequenz aufweist und in der Probe anwesend ist, auf der Basis der Änderung der Fluoreszenzintentität.