KR100723328B1 - 고정되고 파라핀 포매된 조직 표본으로부터 ｒｎａ를 분리하는 방법 - Google Patents

Abstract

본 명세서에서는 포르말린 고정되고 파라핀 포매된 조직 샘플로부터 신속 정확하고 간단하게 RNA를 분리하는 방법에 대해 개시한다. 상기 조직 샘플은 종양 조직이거나 기타 병리 조직일 수 있다.

Description

고정되고 파라핀 포매된 조직 표본으로부터 ＲＮＡ를 분리하는 방법{METHOD FOR ISOLATION OF RNA FROM FIXED PARAFFIN-EMBEDDED TISSUE SPECIMENS}

정부 지원

정부는 국립보건원 국립 암 연구소로부터의 보조금 번호 R01 CA 71716에 의거 본 발명의 특정 권리를 소유한다.

본 발명은 생물학적 조직 샘플로부터 RNA, DNA 및 단백질을 정제하는 분야에 관한 것이다.

조직 내의 유전자 발현 수준을 측정하는 것은 인간의 질병을 정확히 진단하는 데 있어서 매우 중요하며 환자의 치료 방침을 결정하는 데 점점 더 많이 이용되고 있다. 약물유전학적 방법을 이용하면 특정 약물에 반응할 가능성이 있는 환자를 동정할 수 있어 새로운 치료 방법의 개발이 가능하게 된다.

예를 들어, 티미딜레이트 신타제(TS)는 DNA 생합성에 있어서 필수 효소이며, 이 효소는 데옥시우리딘 모노포스페이트(dUMP)의 데옥시티미딘 모노포스페이트(dTMP)로의 환원적 메틸화를 촉진하고, 세포 내의 피리미딘 뉴클레오타이드의 신규 합성을 위한 유일한 경로를 제공한다(Johnston 등, 1995). 티미딜레이트 신타제는 화학요법 약물, 가장 일반적으로는 항엽산제 5-플루오로우라실(5-FU)의 표적이다. 5-FU는 결장암, 두경부암 및 유방암의 치료를 위한 가장 효과적인 단일 제제로서 그 주요 작용은 TS 활성을 억제하여 세포 내 티미딘 농도를 고갈시키고 그 결과 세포를 사멸시키는 것이다.

일차성 종양(primary tumor)(Johnston 등, 1995; Lenz 등, 1995)과 전이(Farrugia 등, 1997; Leichmann 등, 1997) 둘 다로부터 얻은 임상적 종양 표본들에서 TS 발현에 상당한 변화가 있음이 보고되어 있다. 예를 들어, 결장직장암에서는 정상 위장 점막 조직에 대한 종양 조직에서의 TS 발현비가 2∼10배에 달하였다(Ardalan 및 Zang, 1996).

티미딜레이트 신타제는 또한 종양 내성의 개발에 있어서 임상적 중요성을 지니는 것으로 알려져 있으며, 이는 5-FU에 노출된 후 신생물 세포 내의 TS 단백질의 급격한 유도와 TS 효소 농도의 증가를 보여주는 실험에 의해 입증되었다(Spears 등, 1982; Swain 등, 1989). 종양이 5-FU와 같은 세포독성 물질에 반응하여 TS를 급격히 과발현시키는 능력은 플루오로우라실 내성의 개발에 활용될 수 있다. 기존의 연구에서는 TS 단백질의 농도와 5-FU 요법의 유효성 간에 직접적인 상관성이 있고, 단백질과 RNA 발현 간에 직접적인 상관성이 있으며(Jackman 등, 1985), TS 발현은 결장직장암과 유방암에 있어서 효과적인 진단 마커(Jackman 등, 1985; Horikoshi 등, 1992)라는 사실을 입증하였다.

진전된 전이 질환에서, RT-PCR로 정량 시 관찰되는 고도의 TS mRNA 발현과 고도의 TS 단백질 발현은, 결장직장암(Johnston 등, 1995, Farrugia 등, 1997, Leichman 등, 1997), 위암(Lens 등, 1995, Alexander 등, 1995) 및 두경부암(Johnston 등, 1997)에 대한 플루오로피리미딘 기초 요법에 대한 낮은 반응성을 예보하는 것으로 나타났다. 저 TS 부류에서는 종종 반응자와 비반응자 사이에 상당한 중첩이 있었지만, TS 농도가 중간 이상인 환자들은 주로 비반응자였다. TS 과발현의 예상값은 다른 분자적 특성, 예를 들어 디히드로피리미딘 데히드로게나제(DPD) 및 티미딘 포스포릴라제(TP) 발현, 복제 오류 양성(REP+) 상태(Kithchens 및 Berger 1997) 및 p53 상태(Lenz 등, 1997)와 조합한다면 추가로 증대시킬 수 있다. 인간 종양에서 TS의 발현을 평가한 지금까지의 연구는 인간 종양의 TS 발현에 기초하여 반응 및 결과를 예측하는 능력이 후에 TS 지정 요법으로부터 가장 많이 이익을 얻을 것으로 예상되는 환자를 선택할 기회를 제공할 수 있음을 시사한다.

지금까지, TS 발현 연구를 비롯하여 정량적 조직 유전자 발현 연구는 동결 조직으로부터 얻은 RNA의 역전사 폴리머라제 연쇄 반응(RT-PCR) 증폭에 국한되었다. 그러나, 대부분의 병리학적 샘플은 동결 조직으로서 준비되는 것이 아니라, 통상 포르말린 고정 및 파라핀 포매(FFPE)를 통해 조직학적 분석 및 기록 보관을 실시한다. 유전자 발현 수준은 단백질 발현 수준을 모니터링하기 위한 면역조직화학적 염색법을 이용하여 그러한 고정 및 포매된 샘플에서 반정량적이고 간접적으로 모니터링할 수 있다. 파라핀 포매된 샘플은 널리 입수가 용이하기 때문에, 그러한 샘플로부터 핵산, 특히 RNA를 신속하고 정확하게 분리하는 방법이 요구된다.

생물학적 샘플로부터 RNA를 정제하기 위한 다수의 기법이 존재하지만, FFPE 샘플로부터 RNA를 분리하는 신뢰할 만한 방법은 없는 실정이다. 예를 들어, Chomczynski(미국 특허 제5,346,994호)는 페놀과 구아니딘 이소티오시아네이트를 이용한 액상 분리를 기초로 조직으로부터 RNA를 정제하는 방법에 대해 개시하였다. 생물학적 샘플을 페놀과 구아니딘 이소티오시아네이트의 수용액에서 균질화한 후 균질물을 클로로포름과 혼합한다. 이를 원심분리하면, 균질물은 유기층, 중간층 및 수성층으로 분리된다. 단백질은 유기층에, DNA는 중간층에, RNA는 수성층에 격리된다. 수성층으로부터 RNA를 침전시킬 수 있다. 이 방법은 포르말린 고정되고 파라핀 포매된 조직 샘플로부터 RNA를 분리하는 데 있어서는 신뢰할 수 있는 방법이 아니다.

기타 공지된 RNA 분리 기법은 통상 구아니딘 염 또는 페놀 추출을 이용하며, 이에 대해서는, 예를 들어 Sambrook, J. 등의 문헌(1989), pp. 7.3-7.24와 Ausubel, F.M. 등의 문헌(1994), pp. 4.0.3-4.4.7에 기술되어 있다. 그러나, 공지된 어떠한 방법도 파라핀 포매된 조직 샘플로부터 RNA를 분리하는 데 있어서 재현성 있는 정량적 결과를 제공하지 못한다.

파라핀 포매된 조직으로부터 RNA를 분리하는 기법은 종양 조직 내의 유전자 발현을 연구하는 데 있어서 특히 필요하다. 특정 수용체 또는 효소의 발현 수준은 특정 치료의 성공 가능성의 지표가 될 수 있다.

진정한 정량적 TS 유전자 발현 연구는 동결 조직으로부터의 RT-PCR에 국한되어 있지만, 유리 슬라이드 상에 고정시킨 기록 보관용 병리학적 물질에서 TS 단백질 발현을 반정량적으로 모니터링하는 것이 면역조직화학적 염색법을 통해 유용하게 되었다. 기록 보관용 병리학적 물질로부터 RNA를 분리하는 데 있어서의 제약으로 인해, 그러한 샘플로부터 유전자 발현 수준을 측정하기 위한 유용한 정량법은 현재까지 없는 상태이다.

개요

본 발명의 한 측면은 생물학적 조직 샘플로부터 RNA, DNA 또는 단백질을 분리하기 위한 신뢰할 수 있는 방법을 제공하는 것이다. 본 발명은 또한 파라핀에 포매된 조직으로부터 RNA, DNA 또는 단백질을 분리하기 위한 간단하고 효율적이며 재현성 있는 방법을 제공한다.

본 발명은 유효 농도의 카오트로픽 물질(chaotropic agent)의 용액 중에서 약 50℃ ∼ 약 100℃의 온도에서 약 5분 ∼ 약 120분 동안 샘플을 가열하여 생물학적 조직 샘플로부터 RNA를 정제하는 방법을 제공한다. 한 구체예에서, 카오트로픽 물질은 구아니디늄 화합물이다. 그 후 상기 용액으로부터 RNA를 회수한다. 예를 들어, RNA 회수는 클로로포름 추출로 수행할 수 있다.

본 발명의 방법에서는, RNA를 기록 보관용 병리학적 샘플로부터 분리한다. 한 구체예에서, 파라핀 포매된 샘플에서 먼저 파라핀을 제거한다. 대표적인 파라핀 제거법은 파라핀 포매된 샘플을 유기 용매, 바람직하게는 자일렌으로 세척하는 것을 포함한다. 파라핀이 제거된 샘플은 저급 알코올 수용액으로 재수화시킬 수 있다. 적절한 저급 알코올로는 메탄올, 에탄올, 프로판올 및 부탄올을 들 수 있다. 한 구체예에서는, 파라핀이 제거된 샘플은, 농도를 감소시키면서 보다 저급의 알코올 용액으로 연속 세척하여 재수화시킨다. 또 다른 구체예에서는, 샘플의 파라핀 제거와 재수화를 동시에 실시한다.

파라핀이 제거된 샘플은 기계, 음파 또는 기타 균질화 수단을 이용하여 균질화시킬 수 있다. 한 구체예에서, 재수화된 샘플은 카오트로픽 물질, 예를 들어 구아니디늄 티오시아네이트(구아니디늄 이소티오시아네이트로도 시판됨)를 포함하는 용액 중에서 균질화한다.

균질화된 샘플을 유효량의 카오트로픽 물질을 함유하는 카오트로픽 용액 중에서 약 50℃ ∼ 약 100℃의 온도로 가열한다. 한 구체예에서, 카오트로픽 물질은 구아니디늄 화합물이다. 바람직한 카오트로픽 물질은 구아니디늄 티오시아네이트이다.

그 후, 예를 들어 페놀 클로로포름 추출, 이온 교환 크로마토그래피 또는 크기 배제 크로마토그래피를 이용하여 용액으로부터 RNA를 회수한다.

그 후 추출, 전기영동, 크로마토그래피, 침전 또는 기타 적절한 기법을 이용하여 RNA를 추가로 정제할 수 있다.

본 발명의 방법에 의해 분리된 RNA는 랜덤(random) 프라이머를 이용하여 역전사시켜 cDNA 라이브러리를 제공하는 것을 비롯하여 분자생물학에 있어서 수많은 용도에 적합하다.

정제된 RNA는 역전사 폴리머라제 연쇄 반응(RT-PCR) 증폭에 의해 포르말린 고정되고 파라핀 포매된 조직 샘플에서의 유전자 발현 수준을 측정하는 데 이용될 수 있다. 적절한 PCR 프라이머를 이용하여, 본 발명의 방법으로 임의의 메신저 RNA의 발현 수준을 측정할 수 있다. 정량적 RT-PCR 기법을 이용하면 파라핀 포매된 샘플 내의 단백질 발현 수준(면역조직화학법 이용)과 동일한 샘플 내의 유전자 발현 수준(RT-PCR 이용)의 비교가 가능하다.

본 발명의 방법은 광범위한 유형의 조직과 종양 및 표적 유전자에 적용할 수 있으며, 따라서 유방암, 두경부암, 식도암, 결장직장암 등을 비롯한 다양한 암의 치료 평가 및 진단 도구로서 이용될 수 있다. 본 발명의 방법에 특히 바람직한 유전자는 티미딜레이트 신타제 유전자이다. 본 발명의 방법은 동결 조직에서 도출되는 것과 유사한 정도로 FFPE 조직에서 TS 유전자 발현의 재현성 있는 정량을 달성하였다.

도 1은 다양한 가열 시간에서의 β-액틴과 TS 발현 수준을 나타낸 것이다. 이 데이터는 가열 단계가 없으면 파라핀으로부터 최소한의 수율로 RNA가 추출됨을 보여준다.

도 2는 95℃에서 0∼40분 동안 추출된 RNA로부터 정량적 PCR에 의해 측정한, 정상(N) 조직 또는 결장직장암 환자 유래의 종양(T) 조직 내의 β-액틴의 발현 수준을 나타낸 것이다. 이 데이터는 최적 가열 시간이 30분임을 제시한다.

도 3은 온도 및 시간이 β-액틴 RNA의 수율과 DNA의 분리에 미치는 영향을 나타낸 것이다. 이 데이터는 가열 시간이 길어지면(60∼120분) RNA가 분해되며, DNA PCR 시그널을 생성할 수 있는 오염 DNA가 증가된다는 것을 보여준다. 막대는 표시된 다양한 시간과 온도에서 수행된 3중 실험의 값을 나타낸다.

도 4는 각종 가열 용액이 분리된 RNA의 수율에 미치는 영향을 나타낸 것이다. 이 데이터는 용액 중의 카오트로픽 물질[이 경우 구아니디늄 이소티오시아네이트(GITC)]은 RNA 추출 용액의 필수 성분이며, 이것이 없으면 RNA 추출 수율이 적어도 10배는 낮아진다는 것을 보여준다.

도 5는 6 가지의 세포주로부터 얻은 파라핀 포매된 세포 펠릿(흰 막대)과 동결 세포 펠릿(검은 막대)으로부터의 상대적 TS 유전자 발현을 비교한 것이다. 이 데이터는 파라핀 추출된 RNA의 분석이 신선한 동결 조직에서의 유전자 발현값을 신뢰성 있게 반영한다는 것을 보여준다.

도 6은 포르말린 고정 및 파라핀 포매되거나 동결된, 정상 조직 또는 종양 직장 및 종양 식도 조직에서의 TS 유전자 발현 수준을 비교한 것이다.

도 7은 이미 5-FU/LV에 대한 반응이 TS 유전자 발현과 연관이 있었던 환자로부터의 파라핀 절편에서 측정한 TS/β-액틴 비를 나타낸 것이다.

도 8은 동일한 환자의 일차성 결장암 및 1년 후 재발된 간 전이의 FFPE 샘플에서의 4종의 악성 종양 마커 유전자[TS; 티미딘 포스포릴라제(TP); 시클로옥시게나제-2(COX-2); 및 혈관 내피 성장 인자(VEGF)]의 발현 수준을 나타낸 것이다. 이 데이터는 예상했던 바와 같이 4종의 악성 종양 마커 중 3종이 전이 종양 조직에서 증가하였음을 보여준다.
상세한 설명

본 발명의 방법은 생물학적 샘플로부터 RNA를 정제하는 것에 관한 것이다. 한 구체예에서, 샘플은 파라핀 포매된 조직 샘플이며, 상기 방법은 포매된 샘플로부터 파라핀을 제거하는 단계, 파라핀이 제거된 조직의 균질화 단계 및 유효량의 구아니디늄 화합물을 포함하는 카오트로픽 용액 중에서 약 50℃ ∼ 약 100℃의 온도에서 약 5분 ∼ 약 120분 동안 균질화된 조직을 가열하는 단계를 포함한다. 상기 가열 단계는 표본으로부터 증폭된 cDNA의 양을 가열하지 않은 샘플에 비해 1000배까지 증가시킨다.

삭제

동결 종양 조직은 폭넓게 입수가 용이하지 않지만, 파라핀 블록은 수술 후 모든 유형의 종양으로부터 일상적으로 제조되므로, 이를 이용하여 TS 발현의 대규모 회귀적 관찰과 화학요법 반응을 수행할 수 있다.

뿐만 아니라, 이 기법은 다양한 범위의 종양 유형과 비제한적인 범위의 표적 유전자에 적용이 가능하다. 이는 임상적 결과와 다양한 화학요법제에 대한 반응에 영향을 준다고 알려진 다양한 유전자에 대해 환자 개개인의 샘플에서 그 발현 수준을 측정하는 데 사용되는, 개개 종양의 "유전자 발현 프로파일"의 후속 제작에 사용될 수 있음을 암시한다. FFPE 샘플로부터의 자동화된 실시간 PCR은 개개의 종양에 대한 치료의 표적화를 가능하게 한다.

조직 샘플

RNA는 본 발명의 방법을 이용하여 임의의 생물학적 샘플로부터 분리할 수 있다. 생물학적 샘플은 종종 고정제로 고정한다. 포르말린(포름알데히드) 및 글루타르알데히드와 같은 알데히드 고정제가 통상적으로 사용된다. 알코올 침지(Battifora 및 Kopinski의 문헌[J. Histochem. Cytochem.(1986) 34:1095])와 같은 다른 고정 기법을 이용하여 고정시킨 조직 샘플 역시 적합하다. 사용되는 샘플은 또한 파라핀에 포매시킨다. RNA는 본 발명의 방법을 이용하여 임의의 파라핀 포매된 생물학적 조직 샘플로부터 분리할 수 있다. 한 구체예에서, 샘플은 포르말린 고정되고 파라핀 포매된 것이다.

샘플의 파라핀 제거

파라핀 제거는 파라핀 포매된 샘플로부터 파라핀 덩어리를 제거한다. 다수의 파라핀 제거 기법이 알려져 있으며, 임의의 적절한 기법을 본 발명에 이용할 수 있다. 본 발명의 바람직한 방법은 파라핀을 용해시키기 위해 유기 용매 세척을 이용한다. 그러한 용매는 RNA 분리에 불리한 영향을 주지 않으면서 조직 샘플로부터 효과적으로 파라핀을 제거할 수 있다. 적절한 용매는 벤젠, 톨루엔, 에틸벤젠, 자일렌 및 이의 혼합물 중에서 선택할 수 있다. 자일렌이 본 발명의 방법에 사용하기에 바람직한 용매이다. 용매를 단독으로 또는 본 발명의 방법과 함께 병용하여 이용하면 고순도, 일반적으로 99% 이상의 순도가 얻어진다.

파라핀은 통상 유기 용매로 세척하고, 세게 혼합한 후 원심분리하여 제거한다. 샘플은 튜브 내에서 조직이 펠릿을 형성하도록 하기에 충분한 속도, 통상 약 10,000 ∼ 약 20,000 x g에서 원심분리한다. 원심분리 후, 유기 용매 상청액을 제거한다. 조직학 분야의 기술자라면 유기 용매의 사용 부피를 알 것이며, 필요한 세척 횟수는 샘플의 크기와 제거해야 할 파라핀의 양에 따라 달라진다는 것을 알 것이다. 더 많은 파라핀을 제거하려면 더 많은 세척이 필요하다. 일반적으로, 샘플은 1회 ∼ 약 10회 세척하며, 약 2회 ∼ 약 4회 세척하는 것이 바람직하다. 유기 용매의 통상적인 부피는 10 ㎛ 조직 표본의 경우 약 500 ㎕이다.

당업자에게 공지된 또 다른 파라핀 제거 방법 역시 본 발명의 방법에 이용될 수 있다. 그러한 방법으로는 직접 용융(Banerjee 등, 1995)이 있다.

샘플은 파라핀을 제거한 후에 재수화시키는 것이 바람직하다. 바람직한 재수화방법은 농도를 감소시키면서 저급 알코올 수용액으로 단계적으로 세척하는 것이다. 에탄올이 재수화에 바람직한 저급 알코올이다. 메탄올, 이소프로판올, 및 C₁-C₅ 범위의 다른 유사한 알코올을 비롯하여 다른 알코올 역시 본 발명에 사용하기에 적합할 수 있다. 다른 방법으로는 샘플을 알코올 용액과 세게 혼합한 후 원심분리한다. 바람직한 구체예에서, 알코올의 농도 범위는 수중 약 100%에서 약 70%로 약 3∼5회의 단계에 걸쳐 점차 감소시키며, 여기서 각 단계에서의 용액의 농도 변화는 일반적으로 약 10% 미만(즉, 100%, 95%, 90%, 80%, 70% 순으로)이다. 또 다른 구체예에서, 파라핀 제거 및 재수화는 EZ-DEWAX(바이오제넥스, 샌 레이먼, 캘리포니아주)와 같은 시약을 이용하여 동시에 수행한다.

균질화

파라핀을 제거하고 재수화시킨 샘플은 임의의 표준적 기계, 음파 또는 기타 적절한 기법으로 균질화할 수 있다. 조직 균질화는 표준 절차에 따라 기계적 조직 균질화기를 이용하여 수행하는 것이 바람직하다. 다수의 시판되는 균질화기가 본 발명에 사용하기에 적합하며, 그 예로는 울트라-투락스(Ultra-Turrax) 균질화기(IKA-워크스, 인코포레이티드, 윌밍턴, 노쓰캐롤라이나주); 티슈마이저(Tissumizer)(테크마-도르만, 신시내티, 오하이오주), 및 폴리트론(Polytron)(브링크만, 웨스트베리, 뉴욕주)이 있다.

한 구체예에서, 샘플은 카오트로픽 물질의 존재 하에 균질화한다. 파라핀 포매된 샘플로부터 정제된 유효량의 RNA가 카오트로픽 물질을 사용하지 않고 분리한 양의 약 10배 이상이 되도록 카오트로픽 물질을 선택한다. 카오트로픽 물질로는 구아니디늄 화합물, 우레아, 포름아미드, 요오드화칼륨, 칼륨 티오시아네이트 및 유사 화합물을 들 수 있다. 본 발명의 방법에 바람직한 카오트로픽 물질은 구아니디늄 화합물, 예를 들어 구아니디늄 이소티오시아네이트(구아니디늄 티오시아네이트로도 시판됨) 및 구아니디늄 히드로클로라이드이다. 다수의 음이온성 반대이온이 유용하며, 당업자라면 그러한 적절한 음이온을 이용하여 구아니디늄 염을 제조할 수 있다. 본 발명에 사용되는 구아니디늄 용액의 농도는 일반적으로 약 1 ∼ 약 5 M이며, 바람직한 값은 약 4 M이다. RNA가 이미 용액으로 존재한다면, 구아니디늄 용액은 샘플 중에서 얻어지는 최종 농도가 약 1 ∼ 약 5 M의 범위가 되도록 보다 고농도일 수 있다. 또한, 구아니디늄 용액은 Tris-Cl과 같은 적절한 생화학적 완충액을 사용하여 pH를 바람직하게는 약 3 ∼ 약 6, 보다 바람직하게는 약 4로 완충시킨다. 카오트로픽 용액은 환원제, 예를 들어 디티오트레이톨(DTT) 및 β-머캅토에탄올(BME)을 함유할 수도 있다. 카오트로픽 용액은 RNAse 억제제를 함유할 수도 있다.

가열

샘플은 약 60℃ ∼ 약 100℃의 온도에서 약 5분 ∼ 약 2 시간 동안 카오트로픽 용액 중에서 가열한다. 대안으로, 샘플은 약 50℃ ∼ 약 100℃의 온도에서 약 5분 ∼ 약 2 시간 동안 카오트로픽 용액 중에서 가열한다. 가열 횟수는 일반적으로 정제된 RNA의 양이 비가열 샘플보다 약 100배 이상, 보다 바람직하게는 약 1000배 이상이 되도록 선택한다. 바람직한 구체예에서, 샘플은 약 75℃ ∼ 약 100℃의 온도에서 약 20분 동안 가열한다. 보다 바람직하게는, 샘플을 약 95℃에서 30∼60분 동안 가열한다.

RNA 회수

가열한 후 RNA가 카오트로픽 용액의 1 이상의 성분으로부터 분리되도록 하는 임의의 적절한 기법으로 카오트로픽 용액으로부터 RNA를 회수할 수 있다. 유기 용매를 이용한 추출, 클로로포름 추출, 페놀 클로로포름 추출, 에탄올, 이소프로판올 또는 임의의 다른 저급 알코올을 이용한 침전에 의해, 이온 교환 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 실리카 겔 크로마토그래피 및 역상 크로마토그래피를 비롯한 크로마토그래피에 의해, 또는 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 및 아가로스 겔 전기영동을 비롯한 전기영동 기법으로 카오트로픽 용액으로부터 RNA를 회수할 수 있으며, 이러한 방법들은 당업자가 숙지하고 있는 것들이다. RNA는 페놀 클로로포름 추출을 이용하여 카오트로픽 용액으로부터 회수하는 것이 바람직하다.

RNA를 회수한 후에, RNA를 임의로 추가 정제할 수 있다. 추가로 정제하면 DNA나 단백질에 의해 실질적으로 오염되지 않은 RNA가 얻어진다. 추가 정제는 RNA 회수를 위한 전술한 기법 중 임의의 기법으로 수행할 수 있다. RNA는 저급 알코올, 특히 에탄올이나 이소프로판올을 이용한 침전으로 정제하는 것이 바람직하다. 침전은 침전을 촉진시키는 글리코겐과 같은 담체 존재 하에 수행하는 것이 바람직하다.

DNA 및 단백질 회수

본 발명의 방법은 조직 샘플로부터 DNA 또는 단백질을 정제하는 데 이용할 수 있다. 샘플을 유기 용매(예, 클로로포름)와 혼합하고 원심분리하면 용액은 3층, 즉 하부 유기층, 중간층 및 상부 수성층으로 분리된다. 적절한 카오트로픽 물질, 특히 구아니디늄 화합물을 사용하면, 샘플의 생물학적 성분들은 3층으로 격리된다. 상부 수성층은 RNA를 포함하고, 중간층은 DNA를 포함하며, 유기층은 단백질을 포함하게 된다. 당업자라면 본 발명의 방법이 DNA 층과 단백질 층은 물론, RNA를 포함하는 층의 회수에도 적합하다는 것을 알 것이다. DNA 회수는 본 발명의 방법에 의해 증대된다.

정제된 RNA

본 발명의 방법으로 정제된 RNA는 다양한 목적과 다양한 분자생물학 방법, 예를 들어 cDNA로의 역전사; 유전자 칩, 올리고뉴클레오타이드 마이크로어레이 등에서의 분석을 위한 방사능 표지, 형광 표지 또는 다른 방식으로 표지된 cDNA를 생성하는 방법; 아크릴아미드 또는 아가로스 겔 전기영동에 의한 전기영동; 크로마토그래피(예, 이온 교환, 실리카 겔, 역상, 또는 크기 배제 크로마토그래피)에 의한 정제; 핵산 프로브를 이용한 하이브리드화; 및 기계, 음파 또는 기타 수단에 의한 단편화(이에 국한되는 것은 아님)에 적합하다.

재료 및 방법

아래의 재료 및 방법은 하기 실시예들에 있어서 공통적이다.

샘플의 준비: 인간 세포주 SK1, H157, A431, HT29, HCC298 및 HH30의 특성에 대해서는 이미 공지되어 있다. 트립신을 처리하여 세포의 단층으로부터 세포들은 분리해 내고 3000 rpm에서 5분 동안 원심분리하여 펠릿으로 만들었다. 세포 펠릿을 -70℃에서 동결시키거나, 또는 24 시간 동안 포르말린 중에서 고정시킨 다음 파라핀에 포매시켰다.

수술 시에 대표적인 종양 조직의 절편을 입수하여, 대부분의 임상 병리 실험실에서 통상적으로 이용하는 절차로 포르말린 중에서 고정시키고 파라핀에 포매시켰다. 마이크로톰을 사용하여 조직을 횡단 절편(5 ㎛)으로 절단하였다.

RNA 분리: 다음과 같이 파라핀 포매된 조직으로부터 RNA를 분리하였다. 파라핀 포매된 조직의 5 ㎛ 단일 절편을 에펜도르프 튜브에 넣고 자일렌으로 15분씩 2회 세척하여 파라핀을 제거하였다. 농도를 감소시키면서(100%, 95%, 80% 및 70%) 알코올로 15분씩 연속 세척하여 조직을 재수화시켰다. 형성된 펠릿을 0.5% 사코신 및 20 mM 디티오트레이톨(DTT)을 포함하는 4 M 구아니딘 이소티오시아네이트 중에 현탁시켰다. 현탁액을 균질화한 후 약 50℃ ∼ 약 95℃에서 0∼60분 동안 가열하였다. 각 샘플에 대한 대조군으로서 0 시간 가열 시점도 포함시켰다. 아세트산나트륨(pH 4.0)을 0.2 M이 되도록 첨가하고, 그 용액을 페놀/클로로포름으로 추출하고, 이소프로판올 및 10 mg 글리코겐으로 침전시켰다. 원심분리(13000 rpm, 4℃, 15분)한 후, RNA 펠릿을 75% 에탄올 1 ㎖로 2회 세척한 후 RNAse가 없는 물에 재현탁시켰다.

역전사(RT): 가열 후, 랜덤 6량체(hexamer)를 이용하여 전체 RNA를 cDNA로 전환시켰다. RT 조건은 동결 조직에 대해 이미 공지된 바와 같았다(Horikoshi 등, 1992). 각 샘플에 대해 역전사효소를 포함하지 않는 대조군(무-RT)을 준비하였다.

퍼킨 엘머 세터스 7700 PCR 머신(Perkin Elmer Cetus 7700 PCR Machine)(태크만)을 이용한 TS 및 β-액틴의 실시간 PCR 정량: mRNA 수준의 정량은 기존에 알려진 형광 검출법을 기초로 한 실시간 PCR(Heid 등, 1996; Eads 등, 1999)을 이용하여 수행하였다. 전술한 대로 cDNA를 제조하였다. 5'-형광 리포터 염료(6FAM) 및 3'-켄처 염료(TAMRA)를 갖는 프로브를 사용하여 목적 cDNA와 기준 cDNA를 개별적으로 증폭시켰다. TAQ 폴리머라제의 5'-엑소뉴클레아제 활성은 프로브를 절단하고 리포터 분자를 방출시키며, 이것의 형광이 ABI 프리즘 서열 검출 시스템(ABI Prism Sequence Dectection System)(태크만)에 의해 검출된다. PCR 증폭은 형광 검출 한계치를 통과한 후, 생성된 PCR 생성물의 양에 비례하여 형광 시그널을 발생시킨다. 초기 주형 농도는 형광 시그널이 PCR 반응의 지수 상태에서 한계치를 통과한 사이클 수로부터 결정하였다. 상대적 유전자 발현은 목적 유전자와 기준 유전자의 한계치 사이클을 기초로 하여 결정하였다. 기준 유전자를 사용하면, 주요 오차 원인이 될 수 있는 RNA의 직접 정량을 실시할 필요가 없다.

프라이머 및 프로브의 서열은 다음과 같았다: TS: 서열 번호 1: GGC CTC GGT GTG CCT TT; 서열 번호 2: AAC ATC GCC AGC TAC GCC CTG C; 서열 번호 3: GAT GTG CGC AAT CAT GTA CGT. β-액틴: 서열 번호 4: TGA GCG CGG CTA CAG CTT; 서열 번호 5: ACC ACC ACG GCC GAG CGG; 서열 번호 6: TCC TTA ATG TCA CGC ACG ATT T. 실시간 PCR 실험의 경우 전술한 바와 같이 리포터 올리고뉴클레오타이드(서열 번호 2 및 5)를 6FAM으로 5' 표지하고, TAMRA로 3' 표지하였다.

각 PCR에 있어서, "무 역전사효소"(NRT 또는 무-RT) 대조군를 포함시켰다. 이 반응의 목적은 잔류 게놈 DNA 오염으로부터 발생되는 임의의 바탕값 증폭에 대해 보정하는 것이었다. 따라서, TS 및 β-액틴에 대한 각각의 전체값은 RT값에서 NRT값을 뺀 값(RT-NRT)으로서 계산된다.

통계 분석: 동일한 종양의 동결 조직 샘플과 FFPE 샘플 간의 TS 농도 차이가 유의적인 것인지 여부를 결정하기 위해 평균의 비모수적 비교 검정을 수행하였다.

실시예 1

일반적인 RNA 분리 절차

다음의 일반 절차를 이용하여 파라핀 포매된 조직으로부터 RNA를 추출하였다.

A. 절편의 파라핀 제거 및 수화

(1) 약 10 μM 절편의 일부분을 1.5 ㎖ 플라스틱 원심분리용 튜브에 넣는다.

(2) 자일렌 600 ㎕을 첨가하고, 혼합물을 실온(대개 20∼25℃)에서 약 10분 동안 세게 진탕한다.

(3) 실온에서, 벤치 탑 원심분리기의 최대 속도(약 10∼20,000 x g)에서 약 7분 동안 샘플을 원심분리한다.

(4) 대부분의 파라핀이 용해될 때까지 단계 (2)와 (3)을 반복한다. 최초 샘플 부분에 포함되어 있는 파라핀의 양에 따라 통상 2회 이상이 요구된다.

(5) 저급 알코올, 바람직하게는 100% 에탄올(약 600 ㎕)로 약 3분 동안 세게 진탕시키면서 자일렌 용액을 제거한다.

(6) 단계 (3)에서와 같이 약 7분 동안 튜브를 원심분리한다. 상청액을 따라내어 버린다. 펠릿은 백색으로 된다.

(7) 에탄올 용액을 연속적으로 더 희석시키면서(처음에는 약 95% 에탄올, 그 다음에는 약 80%, 마지막에는 약 70% 에탄올) 단계 (5)와 (6)을 반복한다.

(8) 단계 (3)에서와 같이 실온에서 7분 동안 샘플을 원심분리한다. 상청액을 제거하고 펠릿은 실온에서 약 5분 동안 건조시킨다.

B. 페놀-클로로포름을 이용한 RNA 분리

(1) 0.5% 사코신 및 1 M 디티오트레이톨 8 ㎕를 포함하는 구아니딘 이소티오시아네이트 용액 400 ㎕를 첨가한다.

(2) 그 후 샘플을 조직 균질화기(울트라-투락스, IKA-워크스, 인코포레이티드, 윌밍턴, 노쓰캐롤라이나주)를 이용하여, 속도를 저속(속도 1)에서 고속(속도 5)으로 점차적으로 증가시키면서 약 2∼3분 동안 균질화한다.

(3) 그 후 샘플을 약 95℃에서 약 5∼20분 동안 가열한다. 가열하기 전에 가는 바늘을 이용하여 샘플을 함유하는 튜브의 뚜껑을 뚫어두는 것이 바람직하다. 대안으로, 뚜껑을 플라스틱 클램프 또는 실험실용 필름으로 고정시킬 수 있다.

(4) 그 후 페놀 18 ㎖와, 1:49의 이소아밀 알코올:클로로포름 용액 3.6 ㎖을 혼합하여 새로 제조한 페놀/클로로포름/이소아밀 알코올(10:1.93:0.036) 600 ㎕ 및 2 M 아세트산나트륨(pH 4.0) 50 ㎕를 이용하여 샘플을 추출한다. 이 용액을 약 10초간 세게 진탕시킨 후 약 15분 동안 얼음 위에서 냉각시킨다.

(5) 용액을 최대 속도에서 약 7분 동안 원심분리한다. 상부(수성)층을 새 튜브로 옮긴다.

(6) 글리코겐 약 10 ㎕와 이소프로판올 400 ㎕를 이용하여 -20℃에서 30분 동안 RNA를 침전시킨다.

(7) 벤치 탑 원심분리기에서 최대 속도로 약 7분 동안 원심분리하여 RNA를 펠릿으로 만든다. 상청액을 따라 버리고, 70∼75% 에탄올 약 500 ㎕를 이용하여 펠릿을 세척한다.

(8) 최대 속도에서 7분 동안 샘플을 다시 원심분리한다. 상청액을 따라 내고 펠릿을 공기 건조시킨다. 그 후 펠릿을 후속 실험을 위해 적절한 완충액(예, 5 mM Tris-Cl 50 ㎕, pH 8.0)에 용해시킨다.

실시예 2

가열 시간

이 실시예는 가열 시간이 RNA의 수율에 미치는 영향을 예시한다.

도 1에 도시된 바와 같이, 침전 및 역전사 전에 카오트로픽 용액을 95℃에서 가열하는 것은 TS 및 β-액틴 표적의 검출 효율을 상당히 증가시켰다. 가열 단계가 포함되지 않은 경우, TS나 β-액틴 모두 검출되지 않았다(0분 시점). 95℃에서 20분 후 양 전사체 모두 검출되었으며, 가열 시간을 60분으로 추가로 증가시키자 TS의 검출 감도는 3배, β-액틴의 검출 감도는 4.5배 증가하게 되었다(NRT = 무 역전사효소 대조군, RT-NRT = 전체 상대적 유전자 발현 수준, 즉 역전사효소 - 무 역전사효소).

도 2는 정상(N) 조직 및 종양(T) 조직에서의 β-액틴 유전자의 RNA 발현량을 나타낸 것이다. 샘플을 95℃에서 0∼40분 동안 가열하였다. 대부분의 샘플에서 바람직한 가열 시간은 약 30분이었다.

도 3은 약 60분 이상의 가열 시간에서는, RNA가 열 분해된다는 것을 시사하면서 RNA 추출량이 감소하기 시작하는 반면, DNA 추출량은 증가하기 시작한다는 것을 보여준다. 이러한 현상은 일부 경우 DNA의 존재가 가(假) PCR 시그널을 유도하기 때문에 바람직하지 않다.

실시예 3

가열 용액

이 실시예는 카오트로픽 물질 존재 하에 RNA 용액을 가열하는 것이 고수율의 RNA를 얻는 데 있어서 중요하다는 것을 예시한다. 이것은 다양한 용액 중에서 분리된 RNA의 상대적 양의 척도로서 β-액틴 유전자 발현의 검출을 이용하는 RT-PCR 실험이었다.

식도암 FFPE 조직 샘플의 임상적 표본을 전술한 방법에 따라 처리하였으며, 단, 파라핀 제거 후에 얻은 초기 펠릿을 4 M 구아니디늄 이소티오시아네이트(GITC), 4 M 구아니디늄 이소티오시아네이트 + 100 μM β-머캅토에탄올(GITC + BME), 4 M 구아니디늄 이소티오시아네이트 + 20 μM 디티오트레이톨(GITC + DTT) 또는 Tirs-Cl 완충액(10 mM, pH 7.5) 또는 Tris-Cl 완충액 + 20 μM DTT(Tris/Cl + DTT)에 용해 또는 현탁시켰다. 그 후 샘플을 95℃로 30분 동안 가열하거나, 또는 가열하지 않았다(0분, 95℃). 그 후 Tirs/Cl 샘플을 4 M 구아니디늄 이소티오시아네이트로 처리하였다. β-액틴의 RT-PCR 및 실시간 PCR 검출로 RNA 농도를 측정하였다. 도 4에 도시된 바와 같이, 가열 시 카오트로픽 물질인 구아니디늄 이소티오시아네이트의 존재는 고수율의 RNA 회수에 있어서 중요하였다. DTT 또는 BME와 같은 환원제의 존재는 고수율의 RNA 회수에 있어서 필수적인 것은 아니다. 4 M 구아니디늄 이소티오시아네이트 용액은 50 mM Tris-HCl(pH 7.5), 25 mM EDTA 및 0.5% 사코신을 포함한다.

실시예 4

동일한 공급원 유래의 FFPE 조직 및 동결 조직에서 측정한 유전자 발현값의 비교

이 실시예는 본 발명의 방법이 동결 조직으로부터 얻은 유전자 발현값과 동일하게 포르말린 고정 및 파라핀 포매 샘플로부터의 유전자 발현값을 제공한다는 것을 보여준다.

6종의 세포주로부터의 샘플을 본 발명의 방법을 이용하여 FFPE 처리하고 TS 정량을 수행하였다(95℃, 30분 가열 포함). 얻어진 상대적 TS 값(도 5)을 공지된 방법을 이용하여 동결 세포 펠릿으로부터 얻은 값과 비교하였다. 상대적 TS 발현 수준은 동결 세포에서는 3.0∼19.5(평균 = 8.5)였고 FFPE 샘플에서는 3.0∼25.0(평균 = 9.0)이었다. 두 평균 간의 차이의 통계학적 분석으로, p값이 0.726임을 알게 되었으며, 이는 기존의 RT-PCR법을 이용하여 동결 세포 펠릿으로부터 얻은 TS 값과 본 발명의 방법을 이용하여 FFPE 세포 펠릿으로부터 얻은 TS 값 사이에 유의적인 차이가 없다는 것을 나타낸다.

종양 조직 샘플과 정상(비종양) 조직 샘플에서의 RNA 발현 수준은 또한 그 샘플이 포르말린 고정 및 파라핀 포매된 것인지 동결된 것인지와 무관하게 동일하였다. 5개의 정상 결장 조직 및 6개의 종양 결장 조직과 4개의 식도 종양 조직을 전술한 바와 같이 파라핀 조직과 동결 조직(FT)에 매치시켜서 상대적 TS 유전자 발현에 대해 비교하였다. 결과는 도 6에 도시되어 있다. 동결 조직 샘플에서 관찰되는 TS 수준과 동일한 조직의 FFPE 샘플에서 관찰되는 TS 값에는 유의적인 차이가 관찰되지 않았다. 이와 같은 현상은 결장과 식도 조직 유형 둘 다에서 나타났다(결장 FT 샘플 평균 = 3.46, 결장 FFPE 샘플 평균 = 3.06, p = 0.395; 식도 FT 샘플 평균 = 13.9, 식도 FFPE 샘플 평균 = 15.93, p = 0.21).

실시예 5

반응성 및 비반응성 종양 조직에서의 TS 수준의 비교

단계 IV 결장암에서 5-FU/로이코보린(LV)에 대해 반응한, 동결 조직과 대응하는 FFPE 샘플에서의 TS 수준의 상관관계. 동결 조직으로부터 얻은 RT-PCR 데이터를 기초로 한 이전 기록으로부터 종양에서의 고도의 TS 발현 수준(상대적 유전자 발현 ≥4.0)이 TS 처리에 대한 낮은 반응성의 지표라는 것을 알게 되었다. 반응성 종양은 TS의 발현 수준이 더 낮다는 것을 특징으로 할 수 있다. TS/β-액틴 비는 5-FU/LV에 대한 반응성이 동결 조직 샘플의 분석을 통해 TS 유전자 발현과 이미 연관성을 나타낸 17명의 환자로부터 얻은 파라핀 절편에서 측정하였다(도 7). 17명 중 6명은 TS에 반응하는 것으로 알려졌으며, 11명은 TS 처리에 대한 반응성이 낮은 것으로 알려졌다. 대응하는 파라핀 조직을 이용한 TS 결과 역시 이 치료에 대한 반응성을 예보한다는 것을 알게 되었다(반응자 FT 평균 = 2.87, 반응자 FFPE 평균 = 2.37, p = 0.641: 비반응자 FT 평균 = 7.66, 비반응자 FFPE 평균 = 7.84, p = 0.537).

동결 조직으로부터 얻은 TS 수준과 대응하는 FFPE 조직으로부터 얻은 TS 수준간에는 유의적인 차이가 없었다.

실시예 6

일차성 결장암 및 간 전이에서의 TS 유전자 발현 수준

이 실시예는 일차성 결장 종양과 동일한 환자로부터 얻은 재발된 간 전이에서의 TS 및 기타 유전자 발현의 분석을 예시한다.

도 8은 일차성 결장암과 1년 후 재발된 같은 환자로부터 얻은 간 전이(met)의 FFPE 샘플에서의 4 가지 유전자: TS; TP; 시클로옥시게나제-2(COX-2); 및 혈관 내피 성장 인자(VEGF)의 발현 수준을 나타낸 것이다. 이 관찰은 일차성 종양은 5-FU 요법에 민감하지만(TS = 2.32), 전이에는 효력이 없음(TS 전이 11.58)을 제시한다. COX-2 및 VEGF 발현 수준은, 이들이 공격적 질환에서 발현이 증가하고 동시에 조절된다는 공지된 사실과 상관성이 있다(COX-2 일차성 = 1.35; COX-2 전이 = 5.4; VEGF 일차성 = 5.02; VGEF 전이 = 14.4). 일차성 결장암의 5 μM FFPE 절편과 간 전이의 FFPE 절편으로부터 전술한 바와 같이 RNA를 분리하였다. 반응성 일차성 종양에서의 상대적 TS 유전자 발현은 2.32였으며, 전이 질환에서는 11.58이었다(도 8). 본 명세서에서 언급한 RT-PCR법으로 측정한 TS 발현의 이러한 5배 증가는 이차성(secondary) 질환은 5-FU에 반응하지 않으며 CPT-11과 같은 대체 요법이 적합할 수 있다는 것을 제시한다.

본 명세서에서 인용하는 모든 참고 문헌은 그 전체를 본원에 참고 문헌으로 포함한다.

참고 문헌

Claims (58)

1. 고정되고 파라핀 포매된 생물학적 조직 샘플로부터 RNA를 회수하는 방법으로서,

   샘플로부터 파라핀을 제거하는 단계;

   유효 농도의 카오트로픽(chaotropic) 물질을 포함하는 카오트로픽 용액 중에서 50℃∼100℃의 온도로 5분∼120분의 시간 동안 상기 샘플을 가열하는 단계; 및

   추출, 전기영동, 크로마토그래피, 침전 및 이의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 회수 기법을 이용하여 상기 카오트로픽 용액으로부터 RNA를 회수하는 단계

   를 포함하는 방법.
2. 제1항에 있어서, 카오트로픽 물질은 구아니디늄 화합물, 우레아, 포름아미드, 요오드화칼륨 및 칼륨 티오시아네이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
3. 제1항에 있어서, 가열하기 전에 샘플을 재수화하는 단계를 더 포함하는 방법.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 가열하기 전에 상기 샘플을 균질화하는 단계를 더 포함하는 방법.
5. 제1항에 있어서, 상기 RNA는 수불용성 유기 용매를 사용하여 상기 카오트로픽 용액으로부터 추출에 의해 회수하는 것인 방법.
6. 제5항에 있어서, 상기 수불용성 유기 용매는 클로로포름을 포함하는 것인 방법.
7. 제1항에 있어서, 상기 RNA를 정제하는 단계를 더 포함하는 방법.
8. 제1항 내지 제3항 및 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RNA는 에탄올 침전에 의해 정제하는 것인 방법.
9. 제1항에 있어서, 상기 시간은 10분∼60분인 방법.
10. 제1항 내지 제3항, 제5항 내지 제7항 및 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시간은 30분∼60분인 방법.
11. 제1항에 있어서, 상기 온도는 75℃∼100℃인 방법.
12. 제1항에 있어서, 상기 온도는 85℃∼100℃인 방법.
13. 제2항에 있어서, 상기 구아니디늄 화합물은 구아니디늄 히드로클로라이드 및 구아니디늄 이소티오시아네이트로부터 선택되는 것인 방법.
14. 제13항에 있어서, 상기 구아니디늄 화합물은 구아니디늄 이소티오시아네이트이고 2 M∼5 M의 농도로 존재하는 것인 방법.
15. 제1항에 있어서, 상기 카오트로픽 용액의 pH는 3∼6인 방법.
16. 제1항에 있어서, 상기 카오트로픽 용액은 환원제를 더 포함하는 것인 방법.
17. 제16항에 있어서, 상기 환원제는 β-머캅토에탄올 및 디티오트레이톨로부터 선택되는 것인 방법.
18. 제1항 내지 제3항, 제5항 내지 제7항 및 제11항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RNA는 유전자의 발현 수준을 측정하는 데 사용하는 것인 방법.
19. 제1항 내지 제3항, 제5항 내지 제7항 및 제11항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RNA에 대하여 역전사, 역전사와 폴리머라제 연쇄 반응, 전기영동, 크로마토그래피, 핵산 프로브를 이용한 하이브리드화, 및 단편화로 이루어진 군에서 선택되는 방법을 추가로 수행하는 것인 방법.
20. 제19항에 있어서, 상기 RNA를 역전사시키고, 그로써 생성된 cDNA는 표지(labeling)하는 것인 방법.
21. 제20항에 있어서, 표지된 cDNA는 유전자 칩 또는 마이크로어레이 분석에 사용하는 것인 방법.
22. 표적 유전자의 유전자 발현을 정량적으로 측정하는 방법으로서, 제1항 내지 제3항, 제5항 내지 제7항 및 제11항 내지 제17항 중 어느 한 항의 방법에 의해 RNA를 회수하는 단계를 포함하고,

    정제된 RNA를 역전사 반응에 의해 cDNA로 전환시키는 단계;

    적어도 특정 서열을 증폭시키기에 적합한 올리고뉴클레오티드 프로브, 폴리머라제 및 형광색소를 포함하는 폴리머라제 연쇄 반응 용액 중에서 상기 cDNA로 PCR 반응을 수행하는 단계;

    PCR 반응의 결과로서 나타나는 형광 강도의 변화를 측정하는 단계; 및

    형광 강도의 변화에 기초하여 샘플 중에 존재하는 특정 서열을 갖는 핵산의 양을 측정하는 단계

    를 더 포함하는 방법.
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