ES2616800T3

ES2616800T3 - Obtención de perfil de expresión génica en tejidos tumorales biopsiados

Info

Publication number: ES2616800T3
Application number: ES14163244.8T
Authority: ES
Inventors: Joffre Baker; Maureen T. Cronin; Michael C. Kiefer; Steve Shak; Michael G. Walker
Original assignee: Genomic Health Inc
Current assignee: Genomic Health Inc
Priority date: 2002-03-13
Filing date: 2003-03-12
Publication date: 2017-06-14
Anticipated expiration: 2023-03-12
Also published as: ES2433992T3; JP2011250809A; JP2013146279A; US20070141589A1; CA2478850A1; HK1120567A1; US10241114B2; ATE529535T1; JP5461729B2; ES2486265T3; DK2258872T3; WO2003078662A1; JP2013146277A; CA2478850C; DK3115470T3; EP2261369B1; EP1918386A9; JP2006129880A; US20070065846A1; CA2992643C

Abstract

Un método de predicción de la probabilidad de supervivencia a largo plazo de una paciente de cáncer de mama sin recidiva de cáncer de mama, tras la extirpación quirúrgica del tumor primario, que comprende: determinar el nivel de expresión del transcrito de ARN de GSTM3 en una muestra de tejido de cáncer de mama obtenida de la paciente, normalizado contra el nivel de expresión de un conjunto de referencia de transcritos de ARN, en el que un aumento de la expresión de GSTM3 indica un aumento de la probabilidad de supervivencia a largo plazo sin recidiva de cáncer de mama.

Description

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uno de hidrolasa de epóxido microsomal, pS2/factor trébol 1, GATA3 y gonadotropina coriónica humana.

En una realización específica, se predice la falta de respuesta o la disminución de la capacidad de respuesta si (i) el nivel de expresión normalizado de hidrolasa de epóxido microsomal está en el percentil 10º superior; o (ii) el nivel de expresión normalizado de pS2/factor trébol 1, o GATA3 o gonadotropina coriónica humana está en o por debajo del nivel de expresión promedio correspondiente en dicho conjunto de tejido de cáncer de mama, independientemente del nivel de expresión de RE o PR en el tejido de cáncer de mama obtenido del paciente.

En otro aspecto, la divulgación se refiere a un método para predecir la respuesta de una paciente diagnosticada con cáncer de mama a un taxano, que comprende las etapas de:

(a): someter el ARN extraído de un tejido de cáncer de mama obtenido de la paciente a un análisis de la expresión génica, en el que los niveles de expresión génicos se normalizan contra un gen o genes de control, y en comparación con la cantidad que se encuentra en un conjunto de tejido de cáncer de mama de referencia; y

(b): predecir la sensibilidad reducida a taxano si (i) se detecta una expresión de XIST nula o mínima; o (ii) el nivel de expresión normalizado de GST-π o propil endopeptidasa (PREP) está en el percentil 10º superior; o (iii) el nivel de expresión normalizado de PLAG1 está en el percentil 10º superior.

La divulgación también se refiere a un método para predecir la respuesta de una paciente diagnosticada con cáncer de mama a cisplatino o un análogo del mismo, que comprende las etapas de:

(b): predecir la resistencia o la sensibilidad reducida si el nivel de expresión normalizado de ERCC1 está en el percentil 10º superior.

La divulgación se refiere adicionalmente a un método para predecir la respuesta de una paciente diagnosticada con cáncer de mama a un ErbB2 o antagonista EGFR, que comprende las etapas de:

(b): predecir la respuesta del paciente en base a los niveles de expresión normalizados de al menos uno de Grb7, IGF1R, IGF1 e IGF2.

En una realización particular, se predice una respuesta positiva si el nivel de expresión normalizado de Grb7 está en el percentil 10º superior, y la expresión de IGF1R, IGF1 e IGF2 no se eleva por encima del percentil 90º.

En una realización particular adicional, se predice una disminución de la capacidad de respuesta si se eleva el nivel de expresión de al menos uno de IGF1R, IGF1 e IGF2.

En otro aspecto, la divulgación se refiere a un método para predecir la respuesta de una paciente diagnosticada con cáncer de mama a un fármaco de bis-fosfonato, que comprende las etapas de:

(b): predecir una respuesta positiva si el tejido de cáncer de mama obtenido del paciente expresa Ha-Ras mutante y expresa adicionalmente farnesil pirofosfato sintetasa o geranil pirofosfona sintetasa a un nivel de expresión normalizado en o por encima del percentil 90º.

En otro aspecto más, la divulgación se refiere a un método para predecir la respuesta de una paciente diagnosticada con cáncer de mama a un tratamiento con un inhibidor de ciclooxigenasa 2, que comprende las etapas de:

(b): predecir una respuesta positiva si el nivel de expresión normalizado de COX2 en el tejido de cáncer de mama obtenido del paciente está en o por encima del percentil 90º.

La divulgación se refiere adicionalmente a un método para predecir la respuesta de una paciente diagnosticada con cáncer de mama a un antagonista del receptor EGF (EGFR), que comprende las etapas de:

(a): someter el ARN extraído de un tejido de cáncer de mama obtenido de la paciente a un análisis de la expresión génica, en el que los niveles de expresión génicos se normalizan contra un gen o genes de control, y en

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comparación con la cantidad que se encuentra en un conjunto de tejido de cáncer de mama de referencia; y

(b) predecir una respuesta positiva a un antagonista de EGFR, si (i) el nivel de expresión normalizado de EGFR está en o por encima del percentil 10º, y (ii) el nivel de expresión normalizado de al menos uno de epirregulina, TGF-α, anfirregulina, ErbB3, BRK, CD9, MMP9, CD82, y Lot1 está por encima del percentil 90º.

En otro aspecto, la divulgación se refiere a un método para controlar la respuesta de una paciente diagnosticada con cáncer de mama a un tratamiento con un antagonista de EGFR, que comprende controlar el nivel de expresión de un gen seleccionado del grupo que consiste en epirregulina, TGF-α, anfirregulina, ErbB3, BRK, CD9, MMP9, CD82, y Lot1 en el paciente durante el tratamiento, en el que la reducción en el nivel de expresión es indicativa de la respuesta positiva a dicho tratamiento.

En otro aspecto más, la divulgación se refiere a un método para predecir la respuesta de una paciente diagnosticada con cáncer de mama a un fármaco dirigido a tirosina cinasa seleccionado del grupo que consiste en abl, c-kit, PDGFR-α, PDGFR-β y ARG, que comprende las etapas de:

(a): someter el ARN extraído de un tejido de cáncer de mama obtenido de la paciente a un análisis de la expresión génica, en el que los niveles de expresión génicos se normalizan contra un gen o genes de control, y en comparación con la cantidad que se encuentra en un conjunto de tejido de cáncer de mama de referencia;

(b): determinar el nivel de expresión normalizado de una tirosina cinasa seleccionada del grupo que consiste en abl, c-kit, PDGFR-α, PDGFR-β y ARG, y el ligando específico de la tirosina cinasa, y si el nivel de expresión normalizado de la tirosina cinasa está en el percentil 10º superior,

(c): determinar si la secuencia de la tirosina cinasa contiene cualquier mutación, en el que se predice una respuesta positiva si (i) el nivel de expresión normalizado de la tirosina cinasa está en el percentil 10º superior, (ii) la secuencia de la tirosina cinasa contiene una mutación de activación, o (iii) el nivel de expresión normalizado de la tirosina cinasa es normal y el nivel de expresión del ligando está en el percentil 10º superior.

Otro aspecto de la divulgación es un método para predecir la respuesta de una paciente diagnosticada con cáncer de mama a un tratamiento con un fármaco anti-angiogénico, que comprende las etapas de:

(b): predecir una respuesta positiva si (i) el nivel de expresión normalizado de VEGF está en el percentil 10º superior, y (ii) el nivel de expresión normalizado de KDR o CD31 está en el percentil 20º superior.

Un aspecto adicional de la divulgación es un método para predecir la probabilidad de que una paciente diagnosticada con cáncer de mama desarrolle resistencia a un fármaco que interactúa con el gen MRP-1 que codifica la P-glucoproteína de proteína de resistencia a múltiples fármacos, que comprende las etapas de:

(a): someter el ARN extraído de un tejido de cáncer de mama obtenido de la paciente a un análisis de la expresión génica para determinar el nivel de expresión de PTP1b, en el que el nivel de expresión se normaliza contra un gen o genes de control, y en comparación con la cantidad que se encuentra en un conjunto de tejido de cáncer de mama de referencia; y

(b): concluir que es posible que el paciente desarrolle resistencia a dicho fármaco si el nivel de expresión normalizado del gen MRP-1 está por encima del percentil 90º.

La divulgación se refiere adicionalmente a un método para predecir la probabilidad de que una paciente diagnosticada con cáncer de mama desarrolle resistencia a un fármaco quimioterapéutico o toxina que se usa en el tratamiento del cáncer, que comprende las etapas de:

(b): determinar los niveles de expresión normalizados de al menos uno de los siguientes genes: MDR1, SGTα, GSTπ, SXR, BCRP YB-1, y LRP/MVP, en el que el hallazgo de un nivel de expresión normalizado en el percentil 40º superior es una indicación de que es posible que el paciente desarrolle resistencia al fármaco.

También se incluye en el presente documento un método para medir la eficiencia traduccional de ARNm de VEGF en una muestra de tejido de cáncer de mama, que comprende determinar los niveles de expresión del ARNm de VEGF y EIF4E en la muestra, normalizados contra un gen o genes de control, y en comparación con la cantidad que se encuentra en un conjunto de tejido de cáncer de mama de referencia, en el que un nivel de expresión de EIF4E normalizado superior para el mismo nivel de expresión de VEGF es indicativo de la eficiencia traduccional relativamente superior para VEGF.

En otro aspecto, la divulgación proporciona un método para predecir la respuesta de una paciente diagnosticada con cáncer de mama a un antagonista de VEGF, que comprende determinar el nivel de expresión de ARNm de VEGF y

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EIF4E normalizado contra un gen o genes de control, y en comparación con la cantidad que se encuentra en un conjunto de tejido de cáncer de mama de referencia, en el que un nivel de expresión de VEGF por encima del percentil 90º y un nivel de expresión de EIF4E por encima del percentil 50º es un predictor de una buena respuesta del paciente.

La divulgación proporciona adicionalmente un método para predecir la probabilidad de recidiva del cáncer de mama en un paciente diagnosticado con cáncer de mama, que comprende determinar la relación de p53:p21 de la expresión de ARNm o p53:mdm2 de la expresión de ARNm en un tejido de cáncer de mama obtenido del paciente, normalizada contra un gen o genes de control, y en comparación con la cantidad que se encuentra en un conjunto de tejido de cáncer de mama de referencia, en el que una relación normal anterior es indicativa de un riesgo mayor de recidiva. Típicamente, un mayor riesgo de recidiva se indica si la relación está en el percentil 10º superior.

En otro aspecto más, la divulgación se refiere a un método para predecir la probabilidad de recidiva del cáncer de mama en una paciente de cáncer de mama tras la cirugía, que comprende determinar el nivel de expresión de ciclina D1 en un tejido de cáncer de mama obtenido del paciente, normalizado contra un gen o genes de control, y en comparación con la cantidad que se encuentra en un conjunto de tejido de cáncer de mama de referencia, en el que un nivel de expresión en el percentil 10º superior indica un aumento del riesgo de recidiva tras la cirugía. En una realización particular de este método, el paciente se somete a quimioterapia adyuvante, si el nivel de expresión está en el percentil 10º superior.

Otro aspecto de la divulgación es un método para predecir la probabilidad de recidiva del cáncer de mama en una paciente de cáncer de mama tras la cirugía, que comprende determinar el nivel de expresión de APC o E-cadherina en un tejido de cáncer de mama obtenido del paciente, normalizado contra un gen o genes de control, y en comparación con la cantidad que se encuentra en un conjunto de tejido de cáncer de mama de referencia, en el que un nivel de expresión en el percentil 5º superior indica un alto riesgo de recidiva tras la cirugía, y un mayor riesgo de acortar la supervivencia.

Un aspecto adicional de la divulgación es un método para predecir la respuesta de una paciente diagnosticada con cáncer de mama a un tratamiento con un fármaco proapoptótico que comprende determinar los niveles de expresión de BC12 y c-MYC en un tejido de cáncer de mama obtenido del paciente, normalizados contra un gen o genes de control, y en comparación con la cantidad que se encuentra en un conjunto de tejido de cáncer de mama de referencia, en el que (i) un nivel de expresión de BC12 en el percentil 10º superior en ausencia de la elevada expresión de c-MYC indica una buena respuesta, y (ii) no se indica una buena respuesta si el nivel de expresión c-MYC se eleva, independientemente del nivel de expresión de BC12.

Aún un aspecto adicional de la divulgación es un método para predecir el desenlace del tratamiento para un paciente diagnosticado con cáncer de mama, que comprende las etapas de:

(b): determinar los niveles de expresión normalizados de NFkB y al menos un gen seleccionado del grupo que consiste en cIAP1, cIAP2, XIAP y Survivina,

en el que se indica un mal pronóstico si los niveles de expresión para NFkB y al menos uno de los genes seleccionados del grupo que consiste en cIAP1, cIAP2, XIAP, y Survivina están en el percentil 5º superior.

La divulgación se refiere adicionalmente a un método para predecir el desenlace del tratamiento para un paciente diagnosticado con cáncer de mama, que comprende determinar los niveles de expresión de p53BP1 y p53BP2 en un tejido de cáncer de mama obtenido del paciente, normalizados contra un gen o genes de control, y en comparación con la cantidad que se encuentra en un conjunto de tejido de cáncer de mama de referencia, en el que se predice un mal desenlace si el nivel de expresión de p53BP1 o p53BP2 está en el percentil 10º inferior.

La divulgación se refiere adicionalmente a un método para predecir el desenlace del tratamiento para un paciente diagnosticado con cáncer de mama, que comprende determinar los niveles de expresión de uPA y PAI1 en un tejido de cáncer de mama obtenido del paciente, normalizados contra un gen o genes de control, y en comparación con la cantidad que se encuentra en un conjunto de tejido de cáncer de mama de referencia, en el que (i) se predice un mal desenlace si los niveles de expresión de uPA y PAI1 están en el percentil 20º superior, y (ii) se predice una disminución del riesgo de recidiva si los niveles de expresión de uPA y PAI1 no se elevan por encima de la media observada en el conjunto de referencia de cáncer de mama. En una realización particular, el mal desenlace se mide en cuanto a acortar la supervivencia o aumentar el riesgo de recidiva del cáncer tras la cirugía. En otra realización particular, se expresan uPA y PAI1 a niveles normales, y el paciente se somete a quimioterapia adyuvante tras la cirugía.

Otro aspecto de la divulgación es un método para predecir el desenlace del tratamiento en un paciente diagnosticado con cáncer de mama, que comprende determinar los niveles de expresión de catepsina B y la

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aproximadamente 20 bases de longitud. En otra realización, la Tm de los cebadores es aproximadamente 58-60 ºC. Los cebadores pueden seleccionarse, por ejemplo, del grupo que consiste en los cebadores directos e inversos enumerados en la Tabla 2.

La divulgación también se refiere a un método de transcriptasa inversa impulsado por la síntesis de ADNc de primera cadena, que comprende usar un cebador específico de genes de aproximadamente 18 a 24 bases de longitud y que tiene una Tm óptima entre aproximadamente 58 ºC y aproximadamente 60 ºC. En una realización particular, la síntesis de ADNc de la primera cadena se sigue por la amplificación de ADN por PCR, y el cebador sirve como el cebador inverso que impulsa la amplificación por PCR. En otra realización, el método usa una pluralidad de cebadores específicos de genes en la misma mezcla de reacción de la síntesis de ADNc de primera cadena. El número de los cebadores específicos de genes puede ser, por ejemplo, entre 2 y aproximadamente

40.000.

En un aspecto diferente, la invención se refiere a un método de predicción de la probabilidad de supervivencia a largo plazo de un paciente de cáncer de mama sin la recidiva del cáncer de mama, tras la eliminación quirúrgica del tumor primario, que comprende determinar el nivel de expresión de un transcrito de ARN de pronóstico en una muestra de tejido de cáncer de mama obtenida de dicho paciente, normalizado contra el nivel de expresión de un conjunto de referencia de transcritos de ARN, en el que el transcrito de pronóstico es GSTM3, en el que la sobreexpresión de GSTM3 indica un aumento de la probabilidad de supervivencia a largo plazo sin recidiva de cáncer de mama.

En una realización particular de este método, se determina el nivel de expresión de al menos 2, preferiblemente al menos 5, más preferiblemente al menos 10, mucho más preferiblemente al menos 15 transcritos de pronóstico o sus productos de expresión.

Cuando el cáncer de mama es carcinoma de mama invasivo, incluyendo tanto tumores que sobreexpresan el receptor de estrógenos (RE) (positivos para RE) como negativos para RE, el análisis incluye la determinación de los niveles de expresión de los transcritos de al menos dos de los siguientes genes, o sus productos de expresión: FOXM1, PRAME, Bcl2, STK15, CEGP1, Ki-67, GSTM1, PR, BBC3, NME1, SURV, GATA3, TFRC, YB-1, DPYD, Src, CA9, Contig51037, RPS6K1 y Her2.

Cuando el cáncer de mama es carcinoma de mama invasivo positivo para RE positive, el análisis incluye la determinación de los niveles de expresión de los transcritos de al menos dos de los siguientes genes, o sus productos de expresión: PRAME, Bcl2, FOXM1, DIABLO, EPHX1, HIF1A, VEGFC, Ki-67, IGF1R, VDR, NME1, GSTM3, Contig51037, CDC25B, CTSB, p27, CDH1, e IGFBP3.

Al igual que anteriormente, se prefiere determinar los niveles de expresión de al menos 5, más preferiblemente al menos 10, mucho más preferiblemente al menos 15 genes, o sus respectivos productos de expresión.

En una realización particular, se determina el nivel de expresión de uno o más transcritos de ARN de pronóstico, donde el ARN puede obtenerse, por ejemplo, a partir de un espécimen de tejido de cáncer de mama incluido en cera fijado del paciente. El aislamiento de ARN puede realizarse, por ejemplo, siguiendo cualquiera de los procedimientos que se han descrito anteriormente o a lo largo de toda la solicitud, o mediante cualquier otro método conocido en la técnica.

En otro aspecto más, la divulgación se refiere a una matriz que comprende polinucleótidos que hibridan en los siguientes genes: FOXM1, PRAME, Bcl2, STK15, CEGP1, Ki-67, GSTM1, PR, BBC3, NME1, SURV, GATA3, TFRC, YB-1, DPYD, CA9, Contig51037, RPS6K1 y Her2, inmovilizados sobre una superficie sólida.

En una realización particular, la matriz comprende polinucleótidos que hibridan en los siguientes genes: FOXM1, PRAME, Bcl2, STK15, CEGP1, Ki-67, GSTM1, CA9, PR, BBC3, NME1, SURV, GATA3, TFRC, YB-1, DPYD, GSTM3, RPS6 KB1, Src, Chk1, ID2, EstR1, p27, CCNB1, XIAP, Chk2, CDC25B, IGF1R, AK055699, P13KC2A, TGFB3, BAGI1, CYP3A4, EpCAM, VEGFC, pS2, hENT1, WISP1, HNF3A, NFKBp65, BRCA2, EGFR, TK1, VDR, Contig51037, pENT1, EPHX1, IF1A, CDH1, HIF1α, IGFBP3, CTSB, Her2 y DIABLO.

En un aspecto adicional, la divulgación se refiere a un método de predicción de la probabilidad de supervivencia a largo plazo de un paciente diagnosticado con cáncer de mama invasivo, sin la recidiva del cáncer de mama, tras la eliminación quirúrgica del tumor primario, que comprende las etapas de:

(1): determinar los niveles de expresión de los transcritos de ARN o los productos de expresión de los genes de un conjunto de genes seleccionado del grupo que consiste en

(a): Bcl2, ciclinaG1, NFKBp65, NME1, EPHX1, TOP2B, DR5, TERC, Src, DIABLO;

(b): Ki67, XIAP, hENT1, TS, CD9, p27, ciclinaG1, pS2, NFKBp65, CYP3A4;

(c): GSTM1, XIAP, Ki67, TS, ciclinaG1, p27, CYP3A4, pS2, NFKBp65, ErbB3;

(d): PR, NME1, XIAP, upa, ciclinaG1, Contig51037, TERC, EPHX1, ALDH1A3, CTSL;

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(f): TFRC, XIAP, Ki67, TS, ciclinaG1, p27, CYP3A4, pS2, ErbB3, NFKBp65;

(g): Bcl2, PRAME, ciclinaG1, FOXM1, NFKBp65, TS, XIAP, Ki67, CYP3A4, p27;

(h): FOXM1, ciclinaG1, XIAP, Contig51037, PRAME, TS, Ki67, PDGFRa, p27, NFKBp65;

(i): PRAME, FOXM1, ciclinaG1, XIAP, Contig51037, TS, Ki6, PDGFRa, p27, NFKBp65;

(j): Ki67, XIAP, PRAME, hENT1, contig51037, TS, CD9, p27, ErbB3, ciclinaG1;

(k): STK15, XIAP, PRAME, PLAUR, p27, CTSL, CD18, PREP, p53, RPS6 KB1;

(l): GSTM1, XIAP, PRAME, p27, Contig51037, ErbB3, GSTp, EREG, ID1, PLAUR;

(m): PR, PRAME, NME1, XIAP, PLAUR, ciclinaG1, Contig51037, TERC, EPHX1, DR5;

(n): CA9, FOXM1, ciclinaG1, XIAP, TS, Ki67, NFKBp65, CYP3A4, GSTM3, p27;

(o): TFRC, XIAP, PRAME, p27, Contig51037, ErbB3, DPYD, TERC, NME1, VEGFC; y

(p): CEGP1, PRAME, hENT1, XIAP, Contig51037, ErbB3, DPYD, NFKBp65, ID1, TS, inmovilizado en una superficie sólida.

En un aspecto adicional, la divulgación se refiere a una matriz que comprende polinucleótidos que hibridan en un conjunto de genes seleccionado del grupo que consiste en:

(a): PRAME, p27, IGFBP2, HIF1A, TIMP2, ILT2, CYP3A4, ID1, EstR1, DIABLO;

(b): Contig51037, EPHX1, Ki67, TIMP2, ciclinaG1, DPYD, CYP3A4, TP, AIB1, CYP2C8;

(c): Bcl2, hENT1, FOXM1, Contig51037, ciclinaG1, Contig46653, PTEN, CYP3A4, TIMP2, AREG;

(d): HIF1A, PRAME, p27, IGFBP2, TIMP2, ILT2, CYP3A4, ID1, EstR1, DIABLO;

(e): IGF1R, PRAME, EPHX1, Contig51037, ciclinaG1, Bcl2, NME1, PTEN, TBP, TIMP2;

(f): FOXM1, Contig51037, VEGFC, TBP, HIF1A, DPYD, RAD51C, DCR3, ciclinaG1, BAG1;

(g): EPHX1, Contig51037, Ki67, TIMP2, ciclinaG1, DPYD, CYP3A4, TP, AIB1, CYP2C8;

(h): Ki67, VEGFC, VDR, GSTM3, p27, upa, ITGA7, rhoC, TERC, Pin1;

(i): CDC25B, Contig51037, hENT1, Bcl2, HLAG, TERC, NME1, upa, ID1, CYP;

(j): VEGFC, Ki67, VDR, GSTM3, p27, upa, ITGA7, rhoC, TERC, Pin1;

(k): CTSB, PRAME, p27, IGFBP2, EPHX1, CTSL, BAD, DR5, DCR3, XIAP;

(l): DIABLO, Ki67, hENT1, TIMP2, ID1, p27, KRT19, IGFBP2, TS, PDGFB;

(m): p27, PRAME, IGFBP2, HIF1A, TIMP2, ILT2, CYP3A4, ID1, EstR1, DIABLO;

(n): CDH1; PRAME, VEGFC; HIF1A; DPYD, TIMP2, CYP3A4, EstR1, RBP4, p27;

(o): IGFBP3, PRAME, p27, Bcl2, XIAP, EstR1, Ki67, TS, Src, VEGF;

(p): GSTM3, PRAME, p27, IGFBP3, XIAP, FGF2, hENT1, PTEN, EstR1, APC;

(q): hENT1, Bcl2, FOXM1, Contig51037, CiclinaG1, Contig46653, PTEN, CYP3A4, TIMP2, AREG;

(r): STK15, VEGFC, PRAME, p27, GCLC, hENT1, ID1, TIMP2, EstR1, MCP1;

(s): NME1, PRAM, p27, IGFBP3, XIAP, PTEN, hENT1, Bcl2, CYP3A4, HLAG;

(t): VDR, Bcl2, p27, hENT1, p53, PI3KC2A, EIF4E, TFRC, MCM3, ID1;

(u): EIF4E, Contig51037, EPHX1, ciclinaG1, Bcl2, DR5, TBP, PTEN, NME1, HER2;

(v): CCNB1, PRAME, VEGFC, HIF1A, hENT1, GCLC, TIMP2, ID1, p27, upa;

(w): ID1, PRAME, DIABLO, hENT1, p27, PDGFRa, NME1, BIN1, BRCA1, TP;

(x): FBXO5, PRAME, IGFBP3, p27, GSTM3, hENT1, XIAP, FGF2, TS, PTEN;

(y): GUS, HIA1A, VEGFC, GSTM3, DPYD, hENT1, FBXO5, CA9, CYP, KRT18; y

(z): Bclx, Bcl2, hENT1, Contig51037, HLAG, CD9, ID1, BRCA1, BIN1, HBEGF, inmovilizado en una superficie sólida.

En todos los aspectos, los polinucleótidos pueden ser ADNc ("matrices de ADNc") que son típicamente de aproximadamente 500 a 5000 bases de longitud, aunque también se pueden usar ADNc más cortos o más largos y están dentro del alcance de esta invención. Como alternativa, los polinucleótidos pueden ser oligonucleótidos (micromatrices de ADN), que son típicamente de aproximadamente 20 a 80 bases de longitud, aunque también son adecuados los oligonucleótidos más cortos y más largos y están dentro del alcance de la invención. La superficie sólida puede ser, por ejemplo, vidrio o nylon, o cualquier otra superficie sólida usada típicamente en la preparación de matrices, tales como micromatrices, y es típicamente vidrio.

La figura 1 es un gráfico que ilustra el flujo de trabajo del proceso de la invención para la medición de la expresión génica. En la figura, FPET significa “tejido incluido en parafina fijado” y “RT-PCR” significa “PCR de transcriptasa inversa”. Se determina la concentración de ARN usando el protocolo y reactivo de cuantificación de ARN RiboGreen™ comercial.

La figura 2 es un diagrama de flujo que muestra las etapas de un método de extracción de ARN según la invención junto a un diagrama de flujo de un método comercial representativo.

La figura 3 es un esquema que ilustra las etapas de un método mejorado para preparar ARNm fragmentado para el análisis de obtención del perfil de expresión.

La figura 4 ilustra métodos para la amplificación de ARN antes de la RT-PCR. La figura 5 ilustra un esquema alternativo para la reparación y amplificación de ARNm fragmentado.

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que padece una enfermedad, específicamente cáncer, tal como cáncer de mama, con respecto a su expresión en un sujeto normal o control. Las expresiones también incluyen genes cuya expresión se activa a un nivel superior o inferior en diferentes estadios de la misma enfermedad. Se entiende también que un gen expresado de manera diferencial puede o bien activarse o inhibirse al nivel de ácido nucleico o nivel de proteína, o bien puede someterse a corte y empalme alternativo para dar como resultado un producto de polipéptido diferente. Tales diferencias pueden evidenciarse mediante un cambio en los niveles de ARNm, expresión superficial, secreción u otro reparto de un polipéptido, por ejemplo. La expresión génica diferencial puede incluir una comparación de la expresión entre dos o más genes, o una comparación de las razones de la expresión entre dos o más genes, o incluso una comparación de dos productos procesados de manera diferente del mismo gen, que difieren entre sujetos normales y sujetos que padecen una enfermedad, específicamente cáncer, o entre diversos estadios de la misma enfermedad. La expresión diferencial incluye tanto diferencias cuantitativas, así como cualitativas, en el patrón de expresión celular o temporal en un gen o sus productos de expresión entre, por ejemplo, células enfermas y normales, o entre células que han experimentado diferentes acontecimientos de enfermedad o estadios de enfermedad. Para el fin de esta invención, se considera que está presente “expresión génica diferencial” cuando existe una diferencia de al menos aproximadamente dos veces, preferiblemente al menos aproximadamente cuatro veces, más preferiblemente al menos aproximadamente seis veces, lo más preferiblemente al menos aproximadamente diez veces entre la expresión de un gen dado en sujetos normales y enfermos, o en diversos estadios del desarrollo de la enfermedad en un sujeto enfermo.

La expresión “amplificación génica” se refiere a un procedimiento mediante el cual se forman múltiples copias de un gen o fragmento de gen en una línea celular o célula particular. La región duplicada (un tramo de ADN amplificado) a menudo se denomina “amplicón”. Habitualmente, la cantidad del ARN mensajero (ARNm) producido, es decir, el nivel de expresión génica, también aumenta en la proporción del número de copias producidas del gen expresado particular.

El término “pronóstico” se usa en el presente documento para referirse a la predicción de la probabilidad de progresión o muerte atribuible al cáncer, incluyendo recidiva, propagación metastásica y resistencia a fármacos, de una enfermedad neoplásica, tal como cáncer de mama. El término “predicción” se usa en el presente documento para referirse a la probabilidad de que un paciente responda o bien favorable o bien desfavorablemente a un fármaco o conjunto de fármacos, y también el grado de estas respuestas. Los métodos predictivos de la presente invención pueden usarse clínicamente para tomar decisiones de tratamiento eligiendo las modalidades de tratamiento más apropiadas para cualquier paciente particular. Los métodos predictivos de la presente invención son herramientas valiosas en la predicción si es probable que un paciente responda favorablemente a un régimen de tratamiento, tal como intervención quirúrgica, quimioterapia con un fármaco dado o combinación de fármacos, y/o radioterapia.

La expresión “aumento de resistencia” a un fármaco particular u opción de tratamiento, cuando se usa según la presente invención, significa reducción de la respuesta con respecto a una dosis convencional del fármaco o a un protocolo de tratamiento convencional.

La expresión “reducción de la sensibilidad” a un fármaco particular u opción de tratamiento, cuando se usa según la presente invención, significa reducción de la respuesta con respecto a una dosis convencional del fármaco o a un protocolo de tratamiento convencional, cuando la respuesta reducida puede compensarse (al menos parcialmente) aumentando la dosis del fármaco o la intensidad de tratamiento.

Puede evaluarse la “respuesta del paciente” usando cualquier criterio de evaluación que indique un beneficio al paciente, incluyendo, sin limitación, (1) inhibición, en algún grado, del crecimiento tumoral, incluyendo ralentización y detención completa del crecimiento; (2) reducción del número de células tumorales; (3) reducción del tamaño del tumor; (4) inhibición (es decir, reducción, ralentización o detención completa) de la infiltración de células tumorales en tejidos y/u órganos periféricos adyacentes; (5) inhibición (es decir, reducción, ralentización o detención completa) de la metástasis; (6) potenciación de la respuesta inmunitaria antitumoral, que puede, pero no tiene que, dar como resultado la regresión o el rechazo del tumor; (7) alivio, en algún grado, de uno o más síntomas asociados con el tumor; (8) aumento en la duración de la supervivencia tras el tratamiento; y/o (9) reducción de la mortalidad en un punto de tiempo dado tras el tratamiento.

El término “tratamiento” se refiere tanto a tratamiento terapéutico como profiláctico o medidas preventivas, en el que el objeto es prevenir o ralentizar (disminuir) el trastorno o estado patológico seleccionado como diana. Los que necesitan tratamiento incluyen los que ya tienen el trastorno así como los propensos a tener el trastorno o aquellos en los que va a prevenirse el trastorno. En el tratamiento del tumor (por ejemplo, cáncer), un agente terapéutico puede reducir directamente la patología de células tumorales, o hacer que las células tumorales sean más susceptible al tratamiento mediante otros agentes terapéuticos, por ejemplo, radiación y/o quimioterapia.

El término “tumor”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a toda proliferación y crecimiento de células neoplásicas, ya sean malignas o benignas, y todos los tejidos y células cancerosas y precancerosas.

Los términos “cáncer” y “canceroso” se refieren a o describen el estado fisiológico en mamíferos que se caracteriza

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Gait, ed., 1984); "Animal Cell Culture" (R.I. Freshney, ed., 1987); "Methods in Enzymology" (Academic Press, Inc.); "Handbook of Experimental Immunology", 4ª edición (D.M. Weir & C.C. Blackwell, eds., Blackwell Science Inc., 1987); "Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells" (J.M. Miller & M.P. Calos, eds., 1987); "Current Protocols in Molecular Biology" (F.M. Ausubel y col., eds., 1987); y "PCR: The Polymerase Chain Reaction", (Mullis y col., eds., 1994).

1. Obtención del perfil de expresión génica

En general, los métodos de obtención del perfil de expresión génica pueden dividirse en dos grandes grupos: métodos basados en análisis de hibridación de polinucleótidos y métodos basados en la secuenciación de polinucleótidos. La mayoría de los métodos comúnmente usados conocidos en la técnica para la cuantificación de la expresión de ARNm en una muestra incluyen transferencia de tipo Northern e hibridación in situ (Parker & Barnes, Methods in Molecular Biology 106: 247-283 (1999)); ensayos de protección de ARNasa (Hod, Biotechniques 13: 852854 (1992)); y reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa (RT-PCR) (Weis y col., Trends in Genetics 8: 263-264 (1992)). Como alternativa, pueden emplearse los anticuerpos que pueden reconocer dúplex específicos, incluyendo dúplex de ADN, dúplex de ARN y dúplex híbridos de ADN-ARN o dúplex de proteína-ADN. Los métodos representativos para el análisis de la expresión génica basado en secuenciación incluyen análisis en serie de la expresión génica (SAGE), y análisis de la expresión génica mediante secuenciación de firma masiva en paralelo (MPSS).

2. PCR de transcriptasa inversa (RT PCR)

De las técnicas enumeradas anteriormente, el método cuantitativo más sensible y más flexible es RT-PCR, que puede usarse para comparar los niveles de ARNm en diferentes poblaciones de muestra, en tejidos normales y tumorales, con o sin tratamiento con fármacos, para caracterizar patrones de expresión génica, para discriminar entre ARNm estrechamente relacionados y analizar la estructura del ARN.

La primera etapa es el aislamiento de ARNm a partir de una muestra diana. El material de partida es normalmente ARN total aislado de las líneas de células tumorales o tumores humanos, y las correspondientes líneas celulares o tejidos normales, respectivamente. Por lo tanto, puede aislarse ARN a partir de una variedad de tumores primarios, incluyendo líneas de células tumorales o tumor de mama, pulmón, colon, próstata, cerebro, hígado, riñón, páncreas, bazo, timo, testículos, ovarios, útero, etc., con ADN combinado de donantes sanos. Si la fuente de ARNm es un tumor primario, puede extraerse ARNm, por ejemplo, a partir de muestras de tejido congelado o incluido en parafina archivado y fijado (por ejemplo fijado con formalina).

Los métodos generales para la extracción de ARNm se conocen bien en la técnica y se desvelan en libros de texto convencionales de biología molecular, incluyendo Ausubel y col., Current Protocols of Molecular Biology, John Wiley and Sons (1997). Se desvelan métodos para la extracción de ARN a partir de tejidos incrustados en parafina, por ejemplo, en Rupp y Locker, Lab Invest. 56: A67 (1987), y De Andrés y col., BioTechniques 18: 42044 (1995). En particular, puede realizarse el aislamiento del ARN usando un kit de purificación, conjunto de tampón y proteasa de fabricantes comerciales, tales como Qiagen, según las instrucciones del fabricante. Por ejemplo, puede aislarse el ARN total de células en cultivo usando mini-columnas RNeasy de Qiagen. Otros kits de aislamiento de ARN comercialmente disponibles incluyen el kit de purificación de ARN y ADN completo MasterPure™ (FPICENTRE®, Madison, WI), y el kit de aislamiento de ARN en bloque de parafina (Ambion, Inc.). Puede aislarse el ARN total de muestras de tejido usando ARN Stat-60 (Tel-Test). Puede aislarse ARN preparado a partir del tumor, por ejemplo, mediante centrifugación en gradiente de densidad de cloruro de cesio.

Puesto que el ARN no puede servir como molde para la PCR, la primera etapa en la obtención del perfil de expresión génica mediante RT-PCR es la transcripción inversa del molde de ARN para dar ADNc, seguido de su amplificación exponencial en una reacción PCR. Las dos transcriptasas inversas más comúnmente usadas son la transcriptasa inversa del virus de la mieloblastosis aviar (VMA-RT) y la transcriptasa inversa del virus de la leucemia murina de Moloney (VLMM-RT). La etapa de transcripción inversa normalmente se ceba usando cebadores específicos, hexámeros al azar, o cebadores de oligo-dT, dependiendo de las circunstancias y el objetivo de obtención del perfil de expresión. Por ejemplo, el ARN extraído puede transcribirse de manera inversa usando un kit de PCR de ARN GeneAmp (Perkin Elmer, CA, Estados Unidos), siguiendo las instrucciones del fabricante. Entonces puede usarse el ADNc derivado como molde en la posterior reacción PCR.

Aunque la etapa de PCR puede usar una variedad de ADN polimerasas dependientes de ADN termoestable, normalmente se emplea la Taq ADN polimerasa, que tiene un actividad nucleasa 5'-3' pero carece de una actividad endonucleasa 3'-5' de corrección de pruebas. Por tanto, la PCR TaqMan® normalmente utiliza la actividad nucleasa 5' de la Tth o Taq polimerasa para hidrolizar una sonda de hibridación unida a su amplicón diana, pero puede usarse cualquier enzima con actividad nucleasa 5' equivalente. Se usan dos cebadores de oligonucleótido para generar un amplicón típico de una reacción PCR. Se diseña un tercer oligonucleótido, o sonda, para detectar la secuencia de nucleótidos ubicada entre los dos cebadores de PCR. La sonda no puede extenderse mediante la enzima Taq ADN polimerasa, y se marca con un tinte fluorescente indicador y un tinte fluorescente extintor. Se extingue cualquier emisión inducida por láser del tinte indicador mediante el tinte de extinción cuando los dos tintes están ubicados

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cercanos entre sí ya que están en la sonda. Durante la reacción de amplificación, la enzima Taq ADN polimerasa escinde la sonda de una manera dependiente del molde. Los fragmentos de la sonda resultantes se disocian en disolución, y la señal del tinte indicador liberado está libre del efecto de extinción del segundo fluoróforo. Se libera una molécula de tinte indicador para cada nueva molécula sintetizada, y la detección del tinte indicador no extinguido proporciona la base para la interpretación cuantitativa de los datos.

Puede realizarse RT-PCR TaqMan® usando equipo comercialmente disponible, tal como, por ejemplo, ABI PRISM 7700™ Sequence Detection System™ (Perkin-Elmer-Applied Biosystems, Foster City, CA, Estados Unidos), o Lightcycler (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Alemania). En una realización preferida, el procedimiento de nucleasa 5' se realiza en un dispositivo de PCR cuantitativa en tiempo real tal como ABI PRISM 7700™ Sequence Detection System™. El sistema consiste en un termociclador, un láser, un dispositivo de carga acoplada (CCD), una cámara y un ordenador. El sistema amplifica muestras en un formato de 96 pocillos en un termociclador. Durante la amplificación, se recoge la señal fluorescente inducida por láser en tiempo real a través de cables de fibra óptica para todos los 96 pocillos, y se detecta en el CCD. El sistema incluye software para manejar el instrumento y para analizar los datos.

Los datos del ensayo de nucleasa 5' se expresan inicialmente como Ct, o el ciclo umbral. Tal como se trató anteriormente, se registran los valores de fluorescencia durante cada ciclo y representan la cantidad de producto amplificado en ese punto en la reacción de amplificación. El punto en el que se registra en primer lugar la señal fluorescente como estadísticamente significativa es el ciclo umbral (Ct).

Para minimizar los errores y el efecto de la variación muestra a muestra, se realiza habitualmente la RT-PCR usando un patrón interno. Se expresa el patrón interno ideal a un nivel constante entre diferentes tejidos, y no se ve afectado por el tratamiento experimental. Los ARN más frecuentemente usados para normalizar los patrones de expresión génica son ARNm para los genes de mantenimiento gliceraldehído-3-fosfato-deshidrogenasa (GAPDH) y β-actina.

Una variación más reciente de la técnica de RT-PCR es la PCR cuantitativa en tiempo real, que mide la acumulación de producto de PCR a través de una sonda fluorigénica doblemente marcada (es decir, sonda TaqMan®). La PCR en tiempo real es compatible tanto con la PCR competitiva cuantitativa, en la que se usa un competidor interno para cada secuencia diana para la normalización, como con la PCR comparativa cuantitativa usando un gen de normalización contenido dentro de la muestra, o un gen de mantenimiento para RT-PCR. Para detalles adicionales véase, por ejemplo, Held y col., Genome Research 6: 986-994 (1996).

3. Micromatrices

También puede identificarse la expresión génica diferencial, o confirmarse, usando la técnica de micromatrices. Por lo tanto, puede medirse el perfil de expresión de genes asociados con cáncer de mama en tejido de tumor o bien incluido en parafina o bien reciente, usando tecnología de micromatrices. En este método, se siembran en placas las secuencias de polinucleótido de interés, o se alinean, en un sustrato de microchip. Entonces se hibridan las secuencias alineadas con sondas de ADN específicas de células o tejidos de interés. Justo como en el método de RT-PCR, la fuente de ARNm normalmente es ARN total aislado de tumores humanos o líneas celulares tumorales, y las correspondientes líneas celulares o tejidos normales. Por tanto, puede aislarse ARN a partir de una variedad de tumores primarios o líneas celulares tumorales. Si la fuente de ARNm es un tumor primario, puede extraerse el ARNm, por ejemplo, de muestras de tejido congelado o incluido en parafina archivado y fijado (por ejemplo fijado con formalina), que se preparan de manera rutinaria y se conservan en la práctica clínica diaria.

En una realización específica de la técnica de micromatrices, se aplican insertos amplificados por PCR de clones de ADNc a un sustrato en un alineamiento denso. Preferiblemente, se aplican al menos 10.000 secuencias de nucleótidos al sustrato. Los genes microalineados, inmovilizados en el microchip a 10.000 elementos cada uno, son adecuados para la hibridación en condiciones rigurosas. Pueden generarse sondas de ADNc marcadas de manera fluorescente pueden generarse a través de la incorporación de nucleótidos fluorescentes mediante transcripción inversa de ARN extraído de tejidos de interés. Las sondas de ADNc marcadas aplicadas al chip se hibridan con especificidad a cada punto de ADN en el alineamiento. Tras el lavado riguroso para eliminar sondas no unidas específicamente, se explora el chip mediante microscopía láser confocal o mediante otro método de detección, tal como una cámara CCD. La cuantificación de la hibridación de cada elemento alineado permite la evaluación de la correspondiente abundancia de ARNm. Con la fluorescencia de doble color, se hibridan por parejas sondas de ADNc marcadas por separado generadas a partir de dos fuentes de ARN en el alineamiento. Por lo tanto, se determina simultáneamente la abundancia relativa de los transcritos a partir de las dos fuentes correspondientes a cada gen especificado. La escala miniaturizada de la hibridación permite una evaluación rápida y conveniente del patrón de expresión para grandes números de genes. Se ha mostrado que tales métodos tienen la sensibilidad requerida para detectar transcriptos raros, que se expresan a unas pocas copias por célula, y para detectar de manera reproducible diferencias de al menos aproximadamente dos veces en los niveles de expresión (Schena y col., Proc, Natl. Acad. Sci. USA 93(2): 106-149 (1996)). El análisis de micromatrices puede realizarse mediante equipo comercialmente disponible, siguiendo los protocolos del fabricante, tal como usando la tecnología Affymetrix GenChip, o la tecnología de micromatrices de Incyte.

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El desarrollo de métodos de micromatrices para análisis a gran escala de la expresión génica hace posible buscar sistemáticamente marcadores moleculares de la clasificación del cáncer y la predicción del desenlace en una variedad de tipos tumorales.

4. Análisis en serie de la expresión génica (SAGE)

El análisis en serie de la expresión génica (SAGE) es un método que permite el análisis cuantitativo y simultáneo de un gran número de transcritos de genes, sin la necesidad de proporcionar una sonda de hibridación individual para cada transcrito. En primer lugar, se genera una etiqueta de secuencia corta (aproximadamente 10-14 pb) que contiene información suficiente para identificar de manera única un transcrito, siempre que se obtenga el marcador a partir de una posición única dentro de cada transcrito. Entonces, muchos transcritos se unen entre sí para formar moléculas en serie largas, que pueden secuenciarse, revelando la identidad de las múltiples etiquetas simultáneamente. El patrón de expresión de cualquier población de transcritos puede evaluarse cuantitativamente determinando la abundancia de marcadores individuales e identificando el gen correspondiente a cada etiqueta. Para más detalles véanse, por ejemplo, Velculescu y col., Science 270: 484-487 (1995); y Velculescu y col., Cell 88: 243-51 (1997).

5. Análisis de la expresión génica mediante secuenciación de firma masiva en paralelo (MPSS)

Este método, descrito por Brenner y col., Nature Biotechnology 18: 630-634 (2000), es un enfoque de secuenciación que combina secuenciación de firma no basada en gel con clonación in vitro de millones de moldes en microperlas de 5 μm de diámetro separadas. En primer lugar, se construye una biblioteca de microperlas de moldes de ADN mediante clonación in vitro. A esto le sigue el ensamblaje de un alineamiento plano de las microperlas que contienen moldes en una célula de flujo a una alta densidad (normalmente superior a 3 x 106 microperlas/cm2). Se analizan simultáneamente los extremos libres de los moldes clonados en cada microperla, usando un método de secuenciación de firma basado en fluorescencia que no requiere separación de fragmentos de ADN. Se ha mostrado que este método proporciona de manera simultánea y precisa, en una única operación, cientos de miles de secuencias de firma de gen a partir de una biblioteca de ADNc de levadura.

6. Descripción general de los métodos de la invención de aislamiento, purificación y amplificación del ARNm

Se ilustran en la figura 1 las etapas de un protocolo representativo de la invención, incluyendo el aislamiento, la purificación, la extensión de cebador y la amplificación del ARNm. Tal como se muestra en la figura 1, este procedimiento representativo comienza con el corte de secciones de aproximadamente 10 μm de grosor de muestras de tejido de tumor incrustado en parafina. Después, se extrae el ARN, y se eliminan las proteínas y el ADN, siguiendo el método de la invención descrito a continuación. Tras el análisis de la concentración de ARN, pueden incluirse etapas de reparación y/o amplificación del ARN, si es necesario, y se trascribe de manera inversa el ARN usando promotores específicos de gen seguido de RT-PCR. Finalmente, se analizan los datos para identificar la mejo o mejores opciones de tratamiento disponibles para el paciente basándose en el patrón de expresión génica característico identificado en la muestra de tumor examinado. Las etapas individuales de este protocolo se tratarán en mayor detalle a continuación.

7. Método mejorado para el aislamiento de ácido nucleico a partir de muestras de tejido archivado

Como se ha analizado anteriormente, en la primera etapa del método de la invención, se extrae el ARN total del material de interés fuente, incluyendo muestras de tejido incrustado en parafina, fijado, y se purifica suficientemente para actuar como sustrato en un ensayo enzimático. A pesar de la disponibilidad de los productos comerciales, y el extenso conocimiento disponible referente al aislamiento de ácido nucleico, tal como ARN, a partir de tejidos, el aislamiento de ácido nucleico (ARN) a partir de muestras de tejido incrustado en parafina, fijado (FPET) no está libre de dificultad

En un aspecto, la presente invención se refiere a un método mejorado para el aislamiento de ácido nucleico a partir de muestras de tejido archivado, por ejemplo FPET. Los niveles medidos de especies de ARNm son útiles para definir el estado fisiológico o patológico de células y tejidos. La RT-PCR (que se trató anteriormente) es uno de los métodos más sensibles, reproducibles y cuantitativos para esta “obtención del perfil de expresión génica”. El tejido fijado con formalina, incluido en parafina es el material más ampliamente disponible para tales estudios. Varios laboratorios han demostrado que es posible usar satisfactoriamente el tejido incluido en parafina fijado (FPET) como fuente de ARN para RT-PCR (Stanta y col., Biotechniques 11: 304-308 (1991); Stanta y col., Methods Mol. Biol. 86: 23-26 (1998); Jackson y col., Lancet 1: 1391 (1989); Jackson y col., J. Clin. Pathol. 43: 499-504 (1999); Finke y col., Biotechniques 14: 448-453 (1993); Goldsworthy y col., Mol. Carcinog. 25: 86-91 (1999); Stanta y Bonin, Biotechniques 24: 271-276 (1998); Godfrey y col., J. Mol. Diagnostics 2: 84 (2000); Specht y col., J. Mol. Med. 78: B27 (2000); Specht y col., Am. J. Pathol. 158: 419-429 (2001)). Esto permite que la obtención del perfil de expresión génica se lleve a cabo en la fuente más comúnmente disponible de muestras de biopsias humanas, y por tanto que se cree potencialmente nueva información terapéutica y de diagnóstico valiosa.

Los protocolos más ampliamente usados utilizan disolventes orgánicos peligrosos, tales como xileno, u octano

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: o IGF2 disminuye la probabilidad de respuesta beneficiosa a Herceptin y también a antagonistas de EGFR.

Los pacientes cuyos tumores expresan Ha-Ras mutante, y también expresan ARNm de farnesil pirofosfato sintetasa

: o geranil pirofosfonato sintetasa a niveles por encima del décimo percentil comprenden un grupo que es especialmente probable que presente una respuesta beneficiosa a fármacos de bisfosfonato.

Cox2 es una enzima de control clave en la síntesis de prostaglandinas. Se expresa frecuentemente a niveles elevados en subconjuntos de diversos tipos de carcinomas incluyendo carcinoma de la mama. La expresión de este gen se controla al nivel de la transcripción, de modo que la RT-PCR sirve como un indicador válido de la actividad enzimática celular. La investigación no clínica ha mostrado que cox2 promueve la angiogénesis tumoral, lo que sugiere que esta enzima es una diana farmacológica prometedora en tumores sólidos. Varios antagonistas de Cox2 son productos comercializados para su uso en estados antiinflamatorios. El tratamiento de pacientes con poliposis adenomatosa familiar con el inhibidor de cox2 Celebrex disminuyó significativamente el número y tamaño de pólipos neoplásicos. Ningún inhibidor de cox2 se ha aprobado aún para el tratamiento del cáncer de mama, pero generalmente esta clase de fármacos es segura y podría prescribirse de manera no indicada en cánceres de mama en los que se sobreexpresa cox2. Los tumores que expresan COX2 a niveles en el percentil diez superior tienen un aumento de la posibilidad de respuesta beneficiosa a Celebrex u otros inhibidores de ciclooxigenasa 2.

Las tirosina cinasas ErbB1 [EGFR], ErbB3 y ErbB4 [Her4]; también los ligandos TGFalfa, anfiregulina, factor de 55 crecimiento similar a EGF de unión a heparina y epirregulina; también BRK, una cinasa no receptora. Varios fármacos en desarrollo clínico bloquean el receptor de EGF. ErbB2-4, los ligandos indicados y BRK también aumentan la actividad de la ruta de EGFR. Pacientes con cáncer de mama cuyos tumores expresan altos niveles de EGFR o EGFR y niveles anómalamente altos de los otros activadores indicados de la ruta de EGFR son candidatos potenciales para el tratamiento con un antagonista de EGFR.

Pacientes cuyos tumores expresan menos del 10 % del nivel promedio de ARNm de EGFR observado en el panel de referencia es relativamente menos probable que respondan a antagonistas de EGFR [tales como Iressa, o ImClone 225]. En casos en los que el EGFR está por encima de este bajo intervalo, la presencia adicional de epirregulina, TGFα, anfiregulina, o ErbB3, o BRK, CD9, MMP9, o Lot1 a niveles por encima del 90º percentil predispone a la 65 respuesta a antagonistas de EGFR. La expresión génica de epirregulina, en particular, es un buen marcador sustituto para la activación de EGFR, y puede usarse no sólo para predecir la respuesta a antagonistas de EGFR, sino también para monitorizar la respuesta a antagonistas de EGFR [tomando biopsias con agujas finas para proporcionar tejido tumoral durante el tratamiento]. Niveles de CD82 por encima del 90º percentil sugieren peor eficacia de los antagonistas de EGFR. Las tirosina cinasas abl, c-kit, PDGFRalfa, PDGFbeta y ARG; también, los ligandos que transmiten la señal ligando c-kit, PDGFA, B, C y D. Las tirosina cinasas enumeradas son todas dianas del fármaco Gleevec™ (imatinib mesilato, Novartis), y los ligandos enumerados estimulan una o más de las tirosina cinasas enumeradas. En las dos indicaciones para las que está aprobado Gleevec™, las dianas de tirosina cinasa (bcr-abl y ckit) se sobreexpresan y también contienen mutaciones activantes. Un hallazgo de que una de las dianas de tirosina cinasa diana de Gleevec™ se expresa en tejido de cáncer de mama dará lugar a una segunda fase de análisis en la que el gen se secuenciará para determinar si está mutado. Que una mutación encontrada es una mutación activante puede demostrarse mediante métodos conocidos en la técnica, tales como, por ejemplo, midiendo la actividad enzimática cinasa o midiendo el estado de fosforilación de la cinasa particular, en relación con la cinasa de tipo natural correspondiente. Pacientes con cáncer de mama cuyos tumores expresan altos niveles de ARNm que codifican para tirosina cinasas dianas de Gleevec™, específicamente, en el percentil diez superior, o ARNm para tirosina cinasas dianas de Gleevec™ en el intervalo promedio y ARNm para sus ligandos estimulantes del crecimiento relacionados en el percentil diez superior, son candidatos particularmente buenos para el tratamiento con Gleevec™.

VEGF es un factor angiogénico potente y patológicamente importante. (Véase a continuación en Indicadores de pronóstico). Cuando los niveles de ARNm de VEGF están en el percentil diez superior, se justifica un tratamiento agresivo. Tales niveles sugieren particularmente el valor del tratamiento con fármacos antiangiogénicos, incluyendo antagonistas de VEGF, tales como anticuerpos anti-VEGF. Adicionalmente, un nivel de ARNm de KDR o CD31 en el percentil 20 superior aumenta adicionalmente la probabilidad de beneficio de antagonistas de VEGF.

Farnesil pirofosfato sintetasa y geranil geranil pirofosfato sintetasa. Estas enzimas son dianas de fármacos de bisfosfonato comercializados, que se desarrollaron originalmente para el tratamiento de la osteoporosis pero que recientemente han comenzado a prescribirse de manera no indicada en el cáncer de mama. Niveles elevados de ARNm que codifican para estas enzimas en tejido de cáncer de mama, por enzima del 90º percentil, sugieren el uso de bisfosfonatos como opción de tratamiento.

2. Factores de resistencia a múltiples fármacos

Estos factores incluyen 10 genes: gamma glutamil cisteína sintetasa [GCS]; GST-α; GST-π; MDR-1; MRP1-4; 35 proteína de resistencia a cáncer de mama [BCRP]; proteína de resistencia pulmonar [MVP]; SXR; YB-1.

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de genes de los reguladores apoptóticos anteriores, y el uso explicado de manera resumida anteriormente de combinaciones y razones de los niveles de sus ARNm para el pronóstico del cáncer de mama.

Las proteínas p53BP1 y 2 se unen a p53 y promueven la activación transcripcional de genes proapoptóticos. Los niveles de p53BP1 y 2 están suprimidos en una fracción significativa de cánceres de mama, correlacionándose con un mal pronóstico. Cuando se expresa cualquiera en el décimo percentil inferior, se indica un mal pronóstico.

5. Factores que controlan la angiogénesis e invasión celular

Estos incluyen uPA, PAI1, catepsinas B, G y L, factor de dispersión [HGF], c-met, KDR, VEGF y CD31. El activador de plasminógeno uPA y su regulador de serpina PAI1 promueven la descomposición de matrices extracelulares y la invasión de células tumorales. Niveles anómalamente elevados de ambos ARNm en tumores de mama malignos (en el percentil veinte superior) significan un aumento del riesgo de supervivencia acortada, aumento de la recidiva en pacientes con cáncer de mama tras la cirugía y aumento de la importancia de recibir quimioterapia adyuvante. Por otro lado, los pacientes con nodo negativo cuyos tumores no expresan niveles elevados de estas especies de ARNm son menos probables que tengan recidiva de este cáncer y podrían considerarse más seriamente si los beneficios de la quimioterapia convencional justifican la toxicidad asociada.

Las catepsinas B o L, cuando se expresan en el percentil diez superior, predicen mala supervivencia global y libre de enfermedad. En particular, la catepsina L predice una corta supervivencia en pacientes con nodo positivo.

El factor de dispersión y su receptor relacionado c-met promueven la invasión y motilidad celular, el crecimiento celular y la angiogénesis. En cáncer de mama, niveles elevados de ARNm que codifican para estos factores deben dar lugar a tratamiento agresivo con fármacos quimioterápicos, cuando la expresión de cualquiera, o la combinación, está por encima del percentil 90º.

VEGF es un regulador positivo central de la angiogénesis, y niveles elevados en tumores sólidos predicen la supervivencia corta [obsérvense muchas referencias que muestran que un nivel elevado de VEGF predice 65 supervivencia corta]. Por tanto, los inhibidores de VEGF ralentizan el crecimiento de tumores sólidos en animales y seres humanos. La actividad de VEGF se controla al nivel de la transcripción. Niveles de ARNm de VEGF en el percentil diez superior indican un pronóstico significativamente peor que el promedio. Otros marcadores de vascularización, CD31 [PECAM] y KDR indican alta densidad de vasos en tumores que el tumor será particularmente maligno y agresivo, y por tanto que está justificada una estrategia terapéutica agresiva.

6. Marcadores para procesos y células inmunitarias e inflamatorias

Estos marcadores incluyen los genes para la cadena λ ligera de inmunoglobulinas CD18, CD3, CD68, Fas [CD95] y ligando Fas.

Varios conjuntos de pruebas sugieren que el mecanismo de acción de ciertos fármacos usados en el cáncer de mama suponen la activación de la respuesta inmunitaria/inflamatoria del huésped (por ejemplo, Herceptin®). Un aspecto de la presente invención es la inclusión en el conjunto de genes de marcadores para células inflamatorias e inmunitarias, y marcadores que predicen la resistencia tumoral frente a la vigilancia inmunitaria. La cadena ligera lambda de inmunoglobulinas es un marcador para células que producen inmunoglobulinas. CD18 es un marcador para todos los glóbulos blancos. CD3 es un marcador para células T. CD68 es un marcador para macrófagos.

CD95 y ligando Fas son un receptor: un par de ligandos que median una de las dos rutas principales mediante las cuales las células T citotóxicas y las células NK destruyen células seleccionadas como diana. La disminución de la expresión de CD95 y el aumento de la expresión del ligando Fas indica mal pronóstico en cáncer de mama. Tanto CD95 como el ligando Fas son proteínas transmembrana, y necesitan estar ancladas a la membrana para desencadenar la muerte celular. Ciertas células tumorales producen una variante soluble truncada de CD95, creada como resultado del corte y empalme alternativo del ARNm de CD95. Esto bloquea la destrucción de las células tumorales mediadas por el ligando FAS de células T citotóxicas y células NK. La presencia de CD95 soluble se correlaciona con escasa supervivencia en cáncer de mama. El conjunto de genes incluye variantes tanto solubles como de longitud completa de CD95.

7. Marcadores de proliferación celular

El conjunto de genes incluye los marcadores de proliferación celular Ki67/MiB1, PCNA, Pin1 y timidina cinasa. Altos niveles de expresión de marcadores de proliferación se asocian con un alto grado histológico, y corta supervivencia. Altos niveles de timidina cinasa en el percentil diez superior sugieren un aumento del riesgo de corta supervivencia. Pin1 es una prolil isomerasa que estimula el crecimiento celular, en parte a través de la activación transcripcional del gen de ciclina D1, y niveles en el percentil diez superior contribuyen a un perfil de pronóstico negativo.

8. Otros receptores y factores de crecimiento

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Este conjunto de genes incluye IGF1, IGF2, IGFBP3, IGF1R, FGF2, FGFR1, CSF-1R/fms, CSF-1, IL6 e IL8. Todas estas proteínas se expresan en cáncer de mama. La mayoría estimulan el crecimiento tumoral. Sin embargo, la expresión del factor de crecimiento FGF2 se correlaciona con buen desenlace. Algunos tienen actividad antiapoptótica, principalmente IGF1. La activación del eje de IGF1 mediante IGF1, IGF1R o IGFBP3 elevado (tal como se indica mediante la suma de estas señales en el percentil diez superior) inhibe la muerte de células tumorales y contribuye enormemente a un perfil de mal pronóstico.

9. Marcadores de expresión génica que definen subclases de cáncer de mama

Estos incluyen: oncogén GRO1 alfa, Grb7, citoqueratinas 5 y 17, proteína 4 de unión a retinol, factor nuclear de hepatocitos 3, integrina alfa 7 y lipoproteína lipasa. Estos marcadores dividen el cáncer de mama en diferentes tipos celulares que son fenotípicamente diferentes al nivel de la expresión génica. Los tumores que expresan señales para Bcl2, factor nuclear de hepatocitos 3, LIV1 y RE por encima de la media tienen el mejor pronóstico para la supervivencia global y libre de enfermedad tras la extirpación quirúrgica del cáncer. Otra categoría de tipo de tumor de cáncer de mama, caracterizada por expresión elevada de lipoproteína lipasa, proteína 4 de unión a retinol e integrina α7, acarrean un pronóstico intermedio. Los tumores que expresan o bien niveles elevados de citoqueratinas 5 y 17, oncogén GRO a niveles cuatro veces o mayores por encima de la media, o bien ErbB2 y Grb7 a niveles diez veces o más por encima de la media, tienen el peor pronóstico.

Aunque a lo largo de toda la presente descripción, incluyendo los ejemplos a continuación, se explican diversos aspectos de la invención con referencia a estudios de expresión génica, la divulgación puede realizarse de una manera similar, y pueden alcanzarse resultados similares aplicando técnicas de proteómica que se conocen bien en la técnica. El proteoma es la totalidad de las proteínas presentes en una muestra (por ejemplo, tejido, organismo o cultivo celular) en un determinado punto de tiempo. La proteómica incluye, entre otras cosas, el estudio de los cambios globales de la expresión de proteínas en una muestra (también denominada “proteómica de expresión”). La proteómica normalmente incluye las siguientes etapas: (1) separación de proteínas individuales en una muestra mediante electroforesis en gel bidimensional (2-D PAGE); (2) identificación de las proteínas individuales recuperadas 65 del gel, por ejemplo mediante espectrometría de masas y/o secuenciación N-terminal, y (3) análisis de los datos usando bioinformática. Los métodos de proteómica son complementos valiosos a otros métodos de obtención del perfil de expresión génica y pueden usarse solos o en combinación con otros métodos de la presente invención, para detectar los productos de los marcadores génicos de la presente invención.

Se describirán detalles adicionales de la invención en los siguientes ejemplos no limitantes.

Ejemplo 1

Aislamiento de ARN a partir de muestras de tejido incluido en parafina, fijado con formalina (FPET)

A. Protocolos

I. Protocolo de xileno EPICENTRE®

Aislamiento de ARN

(1): Cortar 1-6 secciones (grosor de 10 μm cada una) de tejido incluido en parafina por muestra usando una cuchilla de micrótomo limpia y colocarlas en un tubo eppendorf de 1,5 ml.

(2): Para extraer la parafina, añadir 1 ml de xileno e invertir los tubos durante 10 minutos sacudiendo en un nutador.

(3): Sedimentar las secciones mediante centrifugación durante 10 minutos a 14.000 x g en una microcentrífuga eppendorf.

(4): Eliminar el xileno, dejando algo en el fondo para evitar desplazar el sedimento.

(5): Repetir las etapas 2-4.

(6): Añadir 1 ml de etanol al 100 % e invertir durante 3 minutos sacudiendo en el nutador.

(7): Sedimentar los residuos mediante centrifugación durante 10 minutos a 14.000 x g en una microcentrífuga eppendorf.

(8): Eliminar el etanol, dejando algo en el fondo para evitar el sedimento. 35 (9) Repetir las etapas 6-8 dos veces.

(10): Eliminar todo el etanol restante.

(11): Para cada muestra, añadir 2 μl de 50 μg/μl de proteinasa K a 300 μl de solución de lisis celular y tisular.

(12): Añadir 300 μl de solución de lisis celular y tisular que contiene la proteinasa K a cada muestra y mezclar vigorosamente.

(13): Incubar a 65 ºC durante 90 minutos (mezclado con vórtex cada 5 minutos). Monitorizar visualmente el fragmento de tejido restante. Si todavía es visible tras 30 minutos, añadir 2 μl adicionales de 50 μg/μl de proteinasa K y continuar incubando a 65 ºC hasta que se disuelva el fragmento.

(14): Colocar las muestras en hielo durante 3-5 minutos y proceder con la eliminación de proteínas y precipitación del ácido nucleico total.

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Eliminación de proteínas y precipitación del ácido nucleico total

(1): Añadir 150 μl de reactivo de precipitación de proteínas MPC a cada muestra lisada y agitar con vórtex vigorosamente durante 10 segundos.

(2): Sedimentar los residuos mediante centrifugación durante 10 minutos a 14.000 x g en una microcentrífuga eppendorf.

(3): Transferir el sobrenadante a tubos eppendorf limpios y desechar el sedimento.

(4): Añadir 500 μl de isopropanol al sobrenadante recuperado y mezclar vigorosamente sacudiendo en el nutador durante 3 minutos.

(5): Sedimentar el ARN/ADN mediante centrifugación a 4 ºC durante 10 minutos a 14.000 x g en una microcentrífuga eppendorf.

(6): Eliminar todo el isopropanol con una pipeta, teniendo cuidado de no desplazar el sedimento.

Eliminación de ADN contaminante de preparaciones de ARN

(1): Preparar 200 μl de disolución de ADNasa I para cada muestra añadiendo 5 μl de ADNasa I libre de ARNasa (1 U/μl) a 195 μl de 1 x tampón de ADNasa.

(2): Suspender de nuevo completamente el ARN sedimentado en 200 μl de disolución de ADNasa I mediante agitación con vórtex.

(3): Incubar las muestras a 37 ºC durante 60 minutos.

(4): Añadir 200 μl de 2X T y solución de lisis C a cada muestra y agitar con vórtex durante 5 segundos.

(5): Añadir 200 μl de reactivo de precipitación de proteínas MPC, mezclar agitando con vórtex durante 10 segundos y colocar sobre hielo durante 3-5 minutos.

(6): Sedimentar los residuos mediante centrifugación durante 10 minutos a 14.000 x g en una microcentrífuga eppendorf.

(7): Transferir el sobrenadante que contiene el ARN para limpiar los tubos eppendorf y desechar el sedimento. (Tener cuidado para evitar transferir el sedimento).

(8): Añadir 500 μl de isopropanol a cada sobrenadante y sacudir las muestras en el nutador durante 3 minutos.

(9): Sedimentar el ARN mediante centrifugación a 4 ºC durante 10 minutos a 14.000 x g en una microcentrífuga eppendorf.

(10): Eliminar el isopropanol, dejando algo en el fondo para evitar desplazar el sedimento.

(11): Enjuagar dos veces con 1 ml de etanol al 75 %. Centrifugar brevemente si el sedimento de ARN se desplaza.

(12): Eliminar el etanol cuidadosamente.

(13): Poner bajo una campana de extracción durante aproximadamente 3 minutos para eliminar el etanol residual.

(14): Suspender de nuevo el ARN en 30 μl de tampón TE y almacenar a -30 ºC.

II. Protocolo de cera caliente/urea de la invención

Aislamiento de ARN

(1): Cortar 3 secciones (grosor de 10 μm cada una) de tejido incluido en parafina usando una cuchilla de micrótomo limpia y colocarlas en un tubo eppendorf de 1,5 ml.

(2): Añadir 300 μl de tampón de lisis (Tris 10 mM 7,5, lauroilsarcosina de sodio al 0,5 %, EDTA 0,1 mM pH 7,5, urea 4 M) que contiene 330 μg/ml de proteinasa K (añadida recientemente a partir de una disolución madre de 50 μg/μl) y agitar con vórtex brevemente.

(3): Incubar a 65 ºC durante 90 minutos (mezclado con vórtex cada 5 minutos). Monitorizar visualmente el fragmento de tejido. Si todavía es visible tras 30 minutos, añadir 2 μl adicionales de 50 μg/μl de proteinasa K y continuar incubando a 65 ºC hasta que se disuelva el fragmento.

(4): Centrifugar durante 5 minutos a 14.000 x g y transferir la fase acuosa superior a un nuevo tubo, teniendo cuidado de no romper el sello de parafina.

(5): Colocar las muestras sobre hielo durante 3-5 minutos y proceder con la eliminación de proteínas y la precipitación del ácido nucleico total.

Eliminación de proteínas y precipitación del ácido nucleico total

(1): Añadir 150 μl de NH4OAc 7,5 M a cada muestra lisada y agitar con vórtex vigorosamente durante 10 segundos.

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Eliminación de ADN contaminante de preparaciones de ARN

(1): Añadir 45 μl de 1X tampón de ADNasa I (Tris-Cl 10 mM, pH 7,5, MgCl2 2,5 mM, CaCl2 0,1 mM) y 5 μl de ADNasa I libre de ARNasa (2 U/μl, Ambion) a cada muestra.

(2): Incubar las muestras a 37 ºC durante 60 minutos.

Inactivar la ADNasa I calentando a 70 ºC durante 5 minutos.

B. Resultados

Las pruebas experimentales demuestran que el protocolo de extracción de ARN en caliente de la invención no compromete el rendimiento de ARN. Usando 19 muestras de cáncer de mama FPE, extrayendo ARN de tres secciones adyacentes en las mismas muestras, se midieron los rendimientos de ARN mediante electroforesis capilar con detección de fluorescencia (bioanalizador Agilent). Los rendimientos de ARN promedio en nanogramos y las desviaciones estándar con los métodos inventado y comercial, respectivamente, fueron: 139+/-21 frente a 141+/-34.

Además, se encontró que el tampón de lisis EPICENTRE® T&C puede sustituirse por el tampón de lisis que contiene urea de la presente invención, y la disolución de precipitación de proteínas EPICENTRE® MPC puede sustituirse por el reactivo NH4OAc 7,5 M usado para la precipitación de proteínas según la presente invención sin ningún compromiso significativo del rendimiento de ARN ni la eficacia de TaqMan®.

Ejemplo 2

Amplificación de especies de ARNm antes de la RT-PCR

Se usó el método descrito en la sección 10 anterior con ARN aislado a partir de tejido de cáncer de mama incrustado en parafina, fijado. Se realizaron análisis de TaqMan® con ADNc de la primera cadena generado con el cebador T7-GSP ((T7-GSPr) no amplificado), ARN amplificado de T7 ((T7-GSPr) amplificado). Se amplificó el ARN según la etapa 2 de la figura 4. Como control, se realizó también TaqMan® con ADNc generado con un GSPr no modificado ((GSPr) amplificado). Se usó una cantidad equivalente de molde inicial (1 ng/pocillo) en cada reacción de TaqMan®.

Los resultados se muestran en la figura 8. La transcripción in vitro aumentó la intensidad de la señal de RT-PCR en más de 10 veces, y para ciertos genes en más de 100 veces en relación con controles en los que los cebadores de RT-PCR eran los mismos cebadores usados en el método 2 para la generación de ADN bicatenario para la transcripción in vitro (GSP-T7r y GSPf). También se muestran en la figura 8 datos de RT-PCR generados cuando se usaron cebadores de RT-PCR optimizados convencionales (es decir, que carecen de colas de T7). Tal como se muestra, en comparación con este control, el nuevo método produjo aumentos sustanciales en la señal de RT-PCR (de 4 a 64 veces en este experimento).

El nuevo método requiere que cada secuencia de T7-GSP se optimice de modo que el aumento en la señal de RT-PCR sea el mismo para cada gen, en relación con la RT-PCR optimizada convencional (con cebadores sin cola de T7).

Ejemplo 3

Un estudio de la expresión génica en tumores de mama premalignos y malignos

Se diseñó un estudio de la expresión génica y se realizó con el objetivo primario de caracterizar molecularmente la expresión génica en muestras de tejido fijado, incluido en parafina de carcinoma ductal de mama invasivo, y de explorar la correlación entre tales perfiles moleculares y la supervivencia libre de enfermedad. Un objetivo adicional del estudio era comparar los perfiles moleculares en muestras de tejido de cáncer de mama invasivo con los perfiles 65 moleculares obtenidos en carcinoma ductal in situ. El estudio se diseñó adicionalmente para obtener datos sobre los perfiles moleculares en carcinoma lobular in situ y en muestras de tejido fijado, incluido en parafina de carcinoma lobular invasivo.

Se realizaron ensayos moleculares en tejidos de tumor mamario primario fijados con formalina, incrustados en parafina obtenidos de 202 pacientes individuales a los que se les diagnosticó cáncer de mama. Todos los pacientes se sometieron a cirugía con diagnóstico de carcinoma ductal invasivo de la mama, carcinoma ductal puro in situ (DCIS), carcinoma lobular de la mama o carcinoma lobular puro in situ (LCIS). Se incluyeron pacientes en el estudio sólo si la evaluación histopatológica, realizada tal como se describe en la sección de Materiales y métodos, indicaba cantidades adecuadas de tejido tumoral y patología homogénea.

Los individuos que participaban en el estudio se dividieron en los siguientes grupos:

Grupo 1: Carcinoma ductal puro in situ (DCIS); n = 18 Grupo 2: Carcinoma ductal invasivo n=130

Grupo 3: Carcinoma lobular puro in situ (LCIS); n = 7 Grupo 4: Carcinoma lobular invasivo n=16

Materiales y métodos

5 Se caracterizó cada bloque de tumor representativo mediante histopatología convencional para determinar el diagnóstico, la evaluación semicuantitativa de la cantidad de tumor y el grado del tumor. Se preparó un total de 6 secciones (10 micrómetros de grosor cada una) y se colocaron en dos tubos de microcentrífuga de marca Costar (polipropileno, tubos de 1,7 ml, transparentes, 3 secciones en cada tubo). Si el tumor constituía menos del 30 % del

10 área de muestra total, el patólogo puede haber diseccionado de manera rudimentaria el tejido tumoral, usando microdisección macroscópica, poniendo el tejido tumoral directamente en el tubo Costar.

Si se obtuvo más de un bloque de tumor como parte del procedimiento quirúrgico, se sometieron todos los bloques de tumor a la misma caracterización, tal como se describió anteriormente, y se usó para el análisis el bloque más 15 representativo de la patología.

Análisis de la expresión génica

Se extrajo el ARNm y se purificó a partir de muestras de tejido incrustado en parafina, fijado y se preparó para el 20 análisis de la expresión génica tal como se describe en los capítulos 7-11 anteriores.

Se realizaron ensayos moleculares de expresión génica cuantitativa mediante RT-PCR, usando el ABI PRISM 7900™ Sequence Detection System™ (Perkin-Elmer-Applied Biosystems, Foster City, CA, Estados Unidos). ABI PRISM 7900™ consiste en un termociclador, un láser, un dispositivo de carga acoplada (CCD), una cámara y un

25 ordenador. El sistema amplifica muestras en un formato de 384 pocillos en un termociclador. Durante la amplificación, se recoge la señal fluorescente inducida por láser en tiempo real a través de cables de fibra óptica para todos los 384 pocillos, y se detecta en el CCD. El sistema incluye software para manejar el instrumento y para analizar los datos.

30 Análisis y resultados

Se analizó tejido tumoral para 185 genes relacionados con cáncer y 7 genes de referencia. Se normalizaron los valores de ciclo umbral (CT) para cada paciente basándose en la mediana de todos los genes para ese paciente particular. Estaban disponibles datos de desenlace clínico para todos los pacientes de una revisión de datos de

35 registro y diagramas de pacientes seleccionados.

Los desenlaces se clasificaron como:

0 muertos debido a cáncer de mama o a causa desconocida o vivos con recidiva de cáncer de mama; 40 1 vivos sin recidiva de cáncer de mama o muertos debido a una causa distinta de cáncer de mama.

El análisis se realizó mediante:

1. Análisis de la relación entre la expresión génica normalizada y los desenlaces binarios de 0 o 1. 45

2. Análisis de la relación entre la expresión génica normalizada y el tiempo hasta el desenlace (0 o 1 tal como se definió anteriormente) en el que se censuraron los pacientes que estaban vivos sin recidiva de cáncer de mama o que murieron debido a una causa distinta a cáncer de mama. Se usó este enfoque para evaluar el impacto de pronóstico de genes individuales y también conjuntos de múltiples genes.

50 Análisis de 147 pacientes con carcinoma de mama invasivo mediante el enfoque binario

En el primer enfoque (binario), se realizó el análisis en todos los 146 pacientes con carcinoma de mama invasivo. Se realizó una prueba de la t en el grupo de pacientes clasificados como 0 o 1 y se calcularon los valores de p para las 55 5 diferencias entre los grupos para cada gen.

La siguiente tabla 4 enumera los 45 genes para los que el valor de p para las diferencias entre los grupos era <0,05.

Tabla 4

Gen/SEQ ID NO:: CT promedio Vivos CT promedio Muertos Valor de t Grados de libertad P

FOXM1: 33,66 32,52 3,92 144 0,0001

PRAME: 35,45 33,84 3,71 144 0,0003

Bcl2: 28,52 29,32 -3,53 144 0,0006

STK15: 30,82 30,10 3,49 144 0,0006

CEGP1: 29,12 30,86 -3,39 144 0,0009

Ki-67: 30,57 29,62 3,34 144 0,0011

GSTM1: 30,62 31,63 -3,27 144 0,0014

CA9: 34,96 33,54 3,18 144 0,0018

PR: 29,56 31,22 -3,16 144 0,0019

BBC3: 31,54 32,10 -3,10 144 0,0023

NME1: 27,31 26,68 3,04 144 0,0028

SURV: 31,64 30,68 2,92 144 0,0041

GATA3: 26,06 26,99 -2,91 144 0,0042

TFRC: 28,96 28,48 2,87 144 0,0047

YB-1: 26,72 26,41 2,79 144 0,0060

DPYD: 28,51 28,84 -2,67 144 0,0084

GSTM3: 28,21 29,03 -2,63 144 0,0095

RPS6KB1: 31,18 30,61 2,61 144 0,0099

Src: 27,97 27,69 2,59 144 0,0105

Chk1: 32,63 31,99 2,57 144 0,0113

ID1: 28,73 29,13 -2,48 144 0,0141

EstR1: 24,22 25,40 -2,44 144 0,0160

p27: 27,15 27,51 -2,41 144 0,0174

CCNB1: 31,63 30,87 2,40 144 0,0176

XIAP: 30,27 30,51 -2,40 144 0,0178

Chk2: 31,48 31,11 2,39 144 0,0179

CDC25B: 29,75 29,39 2,37 144 0,0193

IGFIR: 28,85 29,44 -2,34 144 0,0209

AK055699: 33,23 34,11 -2,28 144 0,0242

PI3KC2A: 31,07 31,42 -2,25 144 0,0257

TGFB3: 28,42 28,85 -2,25 144 0,0258

BAGI1: 28,40 28,75 -2,24 144 0,0269

CYP3A4: 35,70 35,32 2,17 144 0,0317

EpCAM: 28,73 28,34 2,16 144 0,0321

VEGFC: 32,28 31,82 2,16 144 0,0326

pS2: 28,96 30,60 -2,14 144 0,0341

hENT1: 27,19 26,91 2,12 144 0,0357

WISP1: 31,20 31,64 -2,10 144 0,0377

HNF3A: 27,89 28,64 -2,09 144 0,0384

NFKBp65: 33,22 33,80 -2,08 144 0,0396

BRCA2: 33,06 32,62 2,08 144 0,0397

EGFR: 30,68 30,13 2,06 144 0,0414

TK1: 32,27 31,72 2,02 144 0,0453

VDR: 30,08 29,73 1,99 144 0,0488

En la tabla 4 anterior, los valores de t inferiores (negativos) indican expresión superior (o CT inferiores), asociada con mejores desenlaces y, a la inversa, valores de t superiores (positivos) indican expresión superior (CT inferiores) asociada a peores desenlaces. Por lo tanto, por ejemplo, la expresión elevada del gen FOXM1 (valor de t = 3,92, CT

5 medio vivos > CT medio muertos) indica una probabilidad reducida de supervivencia libre de enfermedad. De manera similar, la expresión elevada del gen CEGP 1 (valor de t = -3, 39; CT medio vivos < CT medio muertos) indica un aumento de la probabilidad de supervivencia libre de enfermedad.

En base a los datos expuestos en la Tabla 4, la sobreexpresión de cualquiera de los siguientes genes en cáncer de

10 mama indica una probabilidad reducida de supervivencia sin recidiva de cáncer tras la cirugía: FOXM1; PRAME; SKT15, Ki-67; CA9; NME1; SURV; TFRC; YB-1; RPS6KB1; Src; Chk1; CCNB1; Chk2; CDC25B; CYP3A4; EpCAM; VEGFC; hENT1; BRCA2; EGFR; TK1; VDR.

15 mama indica un mejor pronóstico para la supervivencia sin recidiva de cáncer tras la cirugía: Blcl2; CEGP1; GSTM1; PR; BBC3; GATA3; DPYD; GSTM3; ID1; EstR1; p27; XIAP; IGF1R; AK055699; P13KC2A; TGFB3; BAGI1; pS2; WISP1; HNF3A; NFKBp65.

Análisis de 108 pacientes positivos para RE mediante el enfoque binario

20 Se sometieron 108 pacientes con CT normalizado para el receptor de estrógenos (RE) <25,2 (es decir, pacientes positivos para RE) a análisis separado. Se realizó una prueba de la t sobre los grupos de pacientes clasificados como 0 o 1 y se calcularon los valores de p para las diferencias entre los grupos para cada gen. La siguiente tabla 5 enumera los 12 genes en el que el valor de p para las diferencias entre los grupos era <0,05.

Tabla 5

PRAME: 35,54 33,88 3,03 106 0,0031

Bcl2: 28,24 28,87 -2,70 106 0,0082

FOXM1: 33,82 32,85 2,66 106 0,089

DIABLO: 30,33 30,71 -2,47 106 0,0153

EPHX1: 28,62 28,03 2,44 106 0,0163

HIF1A: 29,37 28,88 2,40 106 0,0180

VEGFC: 32,39 31,69 2,39 106 0,0187

Ki-67: 30,73 29,82 2,38 106 0,0191

IGFIR: 28,60 29,18 -2,37 106 0,0194

VDR: 30,14 29,60 2,17 106 0,0322

NME1: 27,34 26,80 2,03 106 0,0452

GSTM3: 28,08 28,92 -2,00 106 0,0485

Para cada gen, se utilizó un algoritmo de clasificación para identificar el mejor valor umbral (CT) para usar cada gen 5 solo en la predicción del desenlace clínico.

En base a los datos expuestos en la Tabla 5, la sobreexpresión de los siguientes genes en cáncer positivo para RE es indicativa de una probabilidad reducida de supervivencia sin recidiva del cáncer tras la cirugía: PRAME; FOXM1; EPHX1; HIF1A; VEGFC; Ki-67; VDR; NME1. Algunos de estos genes (PRAME; FOXM1; VEGFC; Ki-67; VDR; y 10 NME1) se identificaron también como indicadores de mal pronóstico en los análisis anteriores, no limitados a cáncer de mama positivo para RE. La sobreexpresión de los genes restantes (EPHX1 y HIF1A) parece ser un indicador negativo de la supervivencia libre de enfermedad en cáncer de mama positivo para RE solo. Basándose en los datos expuestos en la tabla 5, la sobreexpresión de los siguientes genes en cáncer positivo para RE es indicativa de un mejor pronóstico para la supervivencia sin recidiva del cáncer tras la cirugía: Bcl-2; DIABLO; IGF1R; GSTM3. De

15 estos últimos genes, Bcl-2; IGFR1; y GSTM3 también se han identificado como indicadores de buen pronóstico en el análisis anterior, no limitado a cáncer de mama positivo para RE. La sobreexpresión de DIABLO parece ser un indicador positivo de la supervivencia libre de enfermedad en cáncer de mama positivo para RE solo.

Análisis de múltiples genes e indicadores de desenlace

20 Se adoptaron dos enfoques con el fin de determinar si el uso de múltiples genes podría proporcionar una mejor discriminación entre desenlaces.

En primer lugar, se realizó un análisis de discriminación usando un enfoque gradual directo. Se generaron modelos 25 que clasificaban el desenlace con mayor discriminación que la obtenida con cualquier gen individual solo.

Según un segundo enfoque (enfoque de tiempo hasta evento), se definió para cada gen un modelo de riesgos proporcionales de Cox (véase, por ejemplo, Cox, D. R., y Oakes, D. (1984), Analysis of Survival Data, Chapman and Hall, London, Nueva York) con el tiempo hasta la recidiva o la muerte como variable dependiente, y el nivel de 30 expresión del gen como variable independiente. Se identificaron los genes que tienen un valor de p <0,05 en el modelo de Cox. Para cada gen, el modelo de Cox proporciona el riesgo relativo (RR) de recidiva o muerte para un cambio unitario en la expresión del gen. Puede elegirse repartir los pacientes en subgrupos a cualquier valor umbral de la expresión medida (en la escala de CT), cuando todos los pacientes con valores de expresión por encima del umbral tienen riesgo superior, y todos los pacientes con valores de expresión por debajo del umbral tienen riesgo

35 inferior, o viceversa, dependiendo de si el gen es un indicador de buen (RR>1,01) o mal (RR<1,01) pronóstico. Por tanto, cualquier valor umbral definirá subgrupos de pacientes con respectivamente aumento o disminución del riesgo. Los resultados se resumen en las siguientes tablas 6 y 7

Tabla 6 40 Resultados del modelo de Cox para 146 pacientes con cáncer de mama invasivo

Gen: Riesgo relativo (RR) Riesgo relativo SE valor de p

FOXM1: 0,58 0,15 0,0002

STK15: 0,51 0,20 0,0006

PRAME: 0,78 0,07 0,0007

Bcl2: 1,66 0,15 0,0009

CEGP1: 1,25 0,07 0,0014

GSTM1: 1,40 0,11 0,0014

Ki67: 0,62 0,15 0,0016

PR: 1,23 0,07 0,0017

Conrig51037: 0,81 0,07 0,0022

NME1: 0,64 0,15 0,0023

YB-1: 0,39 0,32 0,0033

TFRC: 0,53 0,21 0,0035

BBC3: 1,72 0,19 0,0036

GATA3: 1,32 0,10 0,0039

CA9: 0,81 0,07 0,0049

SURV: 0,69 0,13 0,0049

DPYD: 2,58 0,34 0,0052

RPS6KB1: 0,60 0,18 0,0055

GSTM3: 1,36 0,12 0,0078

Src.2: 0,39 0,36 0,0094

TGFB3: 1,61 0,19 0,0109

CDC25B: 0,54 0,25 0,0122

XIAP: 3,20 0,47 0,0126

CCNB1: 0,68 0,16 0,0151

IGF1R: 1,42 0,15 0,0153

Chk1: 0,68 0,16 0,0155

ID1: 1,80 0,25 0,0164

p27: 1,69 0,22 0,0168

Chk2: 0,52 0,27 0,0175

EstR1: 1,17 0,07 0,0196

HNF3A: 1,21 0,08 0,206

pS2: 1,12 0,05 0,0230

BAGI1: 1,88 0,29 0,0266

AK055699: 1,24 0,10 0,0276

pENT1: 0,51 0,31 0,0293

EpCAM: 0,62 0,22 0,0310

WISP1: 1,39 0,16 0,0338

VEGFC: 0,62 0,23 0,0364

TK1: 0,73 0,15 0,0382

NFKBp65: 1,32 0,14 0,0384

BRCA2: 0,66 0,20 0,0404

CYP3A4: 0,60 0,25 0,0417

EGFR: 0,72 0,16 0,0436

Tabla 7 Resultados del modelo de Cox para 108 pacientes con cáncer de mama invasivo para RE+

Gen: Riesgo relativo (RR) Riesgo relativo SE valor de p

PRAME: 0,75 0,10 0,0045

Contig51037: 0,75 0,11 0,0060

Blc2: 2,11 0,28 0,0075

HIF1A: 0,42 0,34 0,0117

IGFIR: 1,92 0,26 0,0117

FOXM1: 0,54 0,24 0,0119

EPHX1: 0,43 0,33 0,0120

Ki67: 0,60 0,21 0,0160

CDC25B: 0,41 0,38 0,0200

VEGFC: 0,45 0,37 0,0288

CTSB: 0,32 0,53 0,0328

DIABLO: 2,91 0,50 0,0328

p27: 1,83 0,28 0,0341

CDH1: 0,57 0,27 0,0352

IGFBP3: 0,45 0,40 0,0499

5 Los análisis binario y de tiempo hasta evento, con pocas excepciones, identificaron los mismos genes como marcadores de pronóstico. Por ejemplo, la comparación de las tablas 4 y 6 muestran que, con la excepción de un único gen, los dos análisis generaron la misma lista de 15 marcadores principales (tal como se define por los valores de p más bajos). Además, cuando ambos análisis identificaban el mismo gen, concordaban con respecto a la dirección (signo positivo o negativo) de la correlación con la supervivencia/recidiva. Globalmente, estos resultados

10 refuerzan la conclusión de que los marcadores identificados tienen un valor de pronóstico significativo.

Para modelos de Cox que comprenden más de dos genes (modelos multivariantes), se realiza una entrada gradual de cada gen individual en el modelo, cuando el primer gen introducido se preselecciona de entre los genes que tienen valores de p univariantes significativos, y el gen seleccionado para la entrada en el modelo en cada etapa

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9.: CDC25B, Contig51037, hENT1, Bcl2, HLAG, TERC, NME1, upa, ID1, CYP;

10.: VEGFC, Ki67, VDR, GSTM3, p27, upa, ITGA7, rhoC, TERC, Pin1;

11.: CTSB, PRAME, p27, IGFBP2, EPHX1, CTSL, BAD, DR5, DCR3, XIAP;

12.: DIABLO, Ki67, hENT1, TIMP2, ID1, p27, KRT19, IGFBP2, TS, PDGFB;

5 13. p27, PRAME, IGFBP2, HIF1A, TIMP2, ILT2, CYP3A4, ID1, EstR1, DIABLO;

14.: CDH1; PRAME, VEGFC; HIF1A; DPYD, TIMP2, CYP3A4, EstR1, RBP4, p27;

15.: IGFBP3, PRAME, p27, Bcl2, XIAP, EstR1, Ki67, TS, Src, VEGF;

16.: GSTM3, PRAME, p27, IGFBP3, XIAP, FGF2, hENT1, PTEN, EstR1, APC;

17.: hENT1, Bcl2, FOXM1, Contig51037, CiclinaG1, Contig46653, PTEN, CYP3A4, TIMP2, AREG; 10 18. STK15, VEGFC, PRAME, p27, GCLC, hENT1, ID1, TIMP2, EstR1, MCP1;

19.: NME1, PRAM, p27, IGFBP3, XIAP, PTEN, hENT1, Bcl2, CYP3A4, HLAG;

20.: VDR, Bcl2, p27, hENT1, p53, PI3KC2A, EIF4E, TFRC, MCM3, ID1;

21.: EIF4E, Contig51037, EPHX1, ciclinaG1, Bcl2, DR5, TBP, PTEN, NME1, HER2;

22.: CCNB1, PRAME, VEGFC, HIF1A, hENT1, GCLC, TIMP2, ID1, p27, upa; 15 23. ID1, PRAME, DIABLO, hENT1, p27, PDGFRa, NME1, BIN1, BRCA1, TP;

24.: FBXO5, PRAME, IGFBP3, p27, GSTM3, hENT1, XIAP, FGF2, TS, PTEN;

25.: GUS, HIA1A, VEGFC, GSTM3, DPYD, hENT1, FBXO5, CA9, CYP, KRT18;

26.: Bclx, Bcl2, hENT1, Contig51037, HLAG, CD9, ID1, BRCA1, BIN1, HBEGF.

20 Cabe destacar que muchos de los conjuntos de genes anteriores incluyen genes que solos no tenían suficiente valor predictivo para calificar como marcadores de pronóstico bajo los estándares que se han analizado anteriormente, pero en combinación con otros genes, su presencia proporciona información valiosa sobre la probabilidad de supervivencia del paciente a largo plazo sin recidiva del cáncer.

25 Aunque la presente invención se ha descrito con referencia a lo que se considera que son las realizaciones específicas, se entenderá que la invención no se limita a dichas realizaciones. Por el contrario, la invención pretende incluir diversas modificaciones y equivalente que se incluyen dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

30

imagen19

imagen20

imagen21

MYC NM_002467 193 194 195 PDGFA NM_002607 196 197 198 PDGFB NM_002608 199 200 201 PDGFC NM_016205 202 203 204 PDGFRA NM_006206 205 206 207 PDGFRB NM_002609 208 209 210 PGK1 NM_000291 211 212 213 PR NM_000926 214 215 216 PIN1 NM_006221 217 218 219 PLAU NM_002658 220 222 PPIH NM_006347 223 224 225 PTEN NM_000314 226 227 228 PTGS2 NM_000963 229 230 231 RBP4 NM_006744 232 233 234 RELA NM_021975 235 236 237 RPL19 NM_000981 238 239 240 RPLPO NM_001002 241 242 243 SCDGF-B NM_025208 244 245 246 SERPINE1 NM_000602 247 248 249 SLC19A1 NM_003056 250 251 252 TBP NM_003194 253 254 255 TFF1 NM_003225 256 257 258 TFRC NM_003234 259 260 261 TK1 NM_003258 262 263 264 TNFRSF6 NM_000043 265 266 267 TNFSF6 NM_000639 268 269 270 TOP2A NM_001067 271 272 273 TOP2B NM_001068 274 275 276 TP53 NM_000546 277 278 279 TYMS NM_001071 280 281 282 VEGF NM_003376 283 284 285

TABLA 3

GEN: N.º DE REGISTRO SEQ ID NO:

AK055699
AK055699: 286

BAG1: NM_004323 287

BBC3: NM_014417 288

Bcl2: NM_000633 289

BRCA2: NM_000059 290

CA9: NM_001216 291

CCNB1: NM_031966 292

CDC25B: NM_021874 293

CEGP1: NM_020974 294

Chk1: NM_001274 295

Chk2: NM_007194 296

CYP3A4: NM_017460 297

DIABLO: NM_019887 298

DPYD: NM_000110 299

EGFR: NM_005228 300

EpCAM: NM_002354 301

EPHX1: NM_000120 302

EstR1: NM_000125 303

FOXM1: NM_021953 304

GATA3: NM_002051 305

GSTM1: NM_000561 306

GSTM3: NM_000849 307

hENT1: NM_004955 308

HIF1A: NM_001530 309

HNF3A: NM_004496 310

ID1: NM_002165 311

IGF1R: NM_000875 312

Ki-67: NM_002417 313

NFKBp65: NM_021975 314

NME1: NM_000269 315

p27: NM_004064 316

PI3KC2A: NM_002645 317

PR: NM_000926 318

PRAME: NM_006115 319

pS2: NM_003225 320

RPS6KB1: NM_003161 321

Src: NM_004383 322

STK15: NM_003600 323

SURV: NM_001168 324

TFRC: NM_003234 325

TGFB3: NM_003239 326

TK1: NM_003258 327

VDR: NM_000376 328

VEGFC: NM_005429 329

WISP1: NM_003882 330

XIAP: NM_001167 331

YB-1: NM_004559 332

ITGA7: NM_002206 333

PDGFB: NM_002608 334

Upa: NM_002658 335

TBP: NM_003194 336

PDGFRs: NM_006206 337

Pin1: NM_006221 338

CYP: NM_006347 339

RBP4: NM_006744 340

BRCA1: NM_007296 341

APC: NM_000038 342

GUS: NM_000181 343

CD18: NM_000211 344

PTEN: NM_000314 345

P53: NM_000546 346

ALDH1A3: NM_000693 347

GSTp: NM_000852 348

TCP2B: NM_001058 349

TS: MM_001071 350

Bcix: NM_001191 351

AREG: NM_001667 352

TP: NM_001953 353

EIF4E: NM_001968 354

ErbB3: NM_001982 355

EREG: NM_001432 356

GGLC: NM_001498 357

CDS: NM_001769 358

HB-EGF: NM_001845 359

IGFBP2: NM_000597 360

CTSL: NM_001912 361

PREP: NM_002726 362

CYP3A4: NM_017460 363

ILT-2: NM_006889 364

MCM3: NM_002388 365

KRT18: NM_002276 366

KRT18: NM_000224 367

TIMP2: NM_003266 368

BAD: NM_004322 369

CYP2C8: NM_030878 370

DCR3: NM_016434 371

PLAUR: NM_002669 372

PI3KC2A: NM_002645 373

FGF2: NM_002006 374

HLA-G: NM_002127 375

AIB1: NM_005534 376

MCP1: NM_002982 377

Contig46653
Contig46653: 378

Claims

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