CN1554025A - 患病状态的细胞为基础的检测和鉴别 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种具有高度灵敏度和特异性的检测和辨别疾病状态的方法。该方法全程能确定细胞为基础的样品中是否含有异常细胞，以及对于某些疾病能够确定存在的疾病的组织学类型。该方法检测细胞样品中分子标记物的表达水平和模式的改变。还提供了检测面板的选择和验证程序。

Description

患病状态的细胞为基础的检测和鉴别
                            发明背景
本发明涉及早期检测患者的总体患病状态。本发明还涉及早期特殊患病状态之间的辨别(鉴别)。
当疾病尚处局部性并且其病理作用限于解剖学和生理学时，特殊患病状态的早期检测得以早期诊断和早期治疗可大大地提高患者存活的机会。任何一种试验或疾病检测方法的两个关键性评价标准是其灵敏度(灵敏度＝真阳性/(真阳性+假阴性)和特异性(特异性＝真阴性/(假阳性+真阴性)，它们衡量了该试验进行地如何好以精确地无例外地检测出所有患病个体，并且不会错误的包括了没有患目标疾病的个体。历史上，由于灵敏度和特异性差许多诊断试验都遭到过批评。
灵敏度是衡量一种试验正确检测被测试个体患目标疾病能力的一种标准。一种灵敏度差的试验会产生高比例的假阴性，例如，个体但患有疾病被错误的鉴定没有患该病。假阴性潜在的危险是患病个体在一段时间里仍然没得到确诊和治疗，而此时间里疾病可能发展到晚期，那时如果给予任何治疗可能已没有什么效果。一种灵敏度低的试验例子是HIV的蛋白质为基础的血液试验。这种类型的试验显示灵敏度差是因为直到疾病已明确并且病毒大量侵入血液时它才能检测到病毒的存在。相反，灵敏度高的试验例子是采用聚合酶链反应(PCR)的病毒负荷检测。获得高灵敏度是由于这种类型的试验可检测到非常少量的病毒(见Lewis，D.R.等“分子诊断学：旧医学和新医学之间的基因组桥：诊断技术和服务行业上的一张白纸”(Molecular Diagnostics：The Genomic BridgeBetween Old and New Medicine：A White Paper on the Diagnostic Technologyand Services Industry)Thomas Weisel Partners，2001年6月13日)。
另一方面，特异性是衡量一种试验的精确鉴定患者没有患该病能力的一种标准。特异性差的试验含产生高比例的假阳性，例如个体被错误地鉴定为患有该疾病。假阳性的缺点是迫使患者经受伴有风险、情感和经济压力的不须要的药物治疗，这可能对患者的健康产生副作用。使得难以开发对其具有高度特异性的诊断试验的疾病的特征，是该疾病的机制常常涉及多种的基因和蛋白质。另外，与疾病无关的某些蛋白质可能升高。具有高特异性的试验的例子是可检测出p53突变的以基因为基础的试验。除非存在癌细胞，从来没有检测到p53突变(见Lewis，D.R.等“分子诊断学：旧医学和新医学之间的基因组桥：诊断技术和服务行业上的一张白纸”(Molecular Diagnostics：The GenomicBridge Between Old and New Medicine：A White Paper on the DiagnosticTechnology and Services Industry)Thomas Weisel Partners，2001年6月13日)。
细胞标记物是细胞中天然产生的分子结构，可发现该分子结构并用于特征鉴定或鉴别健康和患病细胞。它们的存在可用人类发明和开发的探针检测，此种探针与标记物的结合使得能够通过影像系统显现和/或定量检测这些标记物。四种以细胞为基础的标记物检测技术是：细胞病理学、细胞计量术、细胞遗传学和蛋白组学(proteomics)，将在下文中鉴定和描述。
细胞病理学依赖于人类专家对染色的整个细胞群中细胞形态学改变的肉眼评估。一个例子是细胞技术学家和细胞病理学家分别进行的巴氏染色宫颈-阴道标本的细胞学筛选和细胞诊断。与细胞遗传学、且学和细胞计量术不同，细胞病理学不是一种定量测定方法。虽然它在临床诊断细胞学上是最新型的，但它是主观的并且诊断结果常常灵敏度不高或不可重现，特别是在癌症早期(例如，ASCUS、LSIL)。
依赖于形态学分析的试验包括在显微镜下观察患者细胞的样品以鉴定细胞和核形状、大小或染色行为的异常。当通过显微镜观察时，正常成熟的上皮细胞显示大的和分化良好的浓缩细胞核。然而，以发育异常为特征的细胞，可能处在不同的分化期，一些细胞非常不成熟。最后，以侵袭性癌为特征的细胞常常表现为未分化、具有非常少的细胞质和相对大的细胞核。
依赖于形态分析的诊断试验的缺点在于细胞形态学是一个落后指标。由于形式服从功能，常常当某疾病已发展到危险期时，该疾病才被形态学分析所证明。疾病初期包含有分子水平上的化学变化。显微镜观察可检测到的细胞特征变化直到疾病晚期才明显。因此，测定分子水平上的化学变化的试验，称为“分子诊断”试验，比仅依赖形态分析的试验更可能提供早期检测。
细胞计量术是基于对溶液中单个移动的(流式细胞计数)荧光染色细胞的流式显微荧光仪器分析，或是对沉积在显微镜玻璃载物片(图象细胞计数)上着染细胞的计算机辅助显微镜仪器分析。流式细胞仪的应用包括白血病和淋巴瘤免疫表型分析。图象细胞计数的应用包括DNA倍性、恶性肿瘤相关的变化(MACs)和S-相分析。流式和图象细胞计数方法可产生能特征鉴定悬浮液中或显微镜玻璃载物片上细胞的定量资料。流式和图象细胞计数可产生良好的标记物检测和鉴别结果，这取决于细胞染色的灵敏度和特异性及所用的流式/图象测定仪特性。
从二十世纪的早期到中期就已定量观察和报道了恶性肿瘤相关的变化(MAC)(OC Gruner：在Birt J Surg 3：506-522，1916中的“某些恶性病例中与白细胞相符的变化的研究”(Study of change met with leukocytes incertain cases of malignant disease)(HE Neiburgs，FG Zak，DC Allen，H Reisman，T Clardy：“人和动物组织材料中的系统性细胞变化”(Systemiccellular change in material from human and animal tissues)，第七次Ann Mtg Inter Soc Cytol Council学报，137-144，1959)。从十九世纪中期到1975年，文件记载了对颊粘膜和颊粘膜涂片(Nieburgs，Finch，Klawe)、十二指肠(Nieburges)、肝(Elias，Nieburgs)、巨核细胞(Ramsdahl)、子宫颈(Nieburges，Howdon)、皮肤(Kwitiken)、血液和骨髓(Nieburgs)、单核细胞和白细胞(van Haas，Matison，Clausen)和肺及痰液中MAC的独立的定性组织学和细胞学研究。1975年以前，这些定性研究报道了对于具体疾病检测的MAC为基础的灵敏度从76％到97％，而特异性从50％到90％。1975年OppenToth报道在定性的痰液分析研究中灵敏度为76％和特异性为81％。
关于MAC-为基础的探针分析的定量观察开始于二、三十年前(H Klawe，JRowinski：“通过物镜图象分析检测口颊粘膜涂片细胞中恶性肿瘤相关的变化(MAC)”(Malignancy associated changes(MAC)in cells of buccal smearsdetected by means of objective image analysis”，Acta Cytol 18：30-33，1974)(GL Wied，PH Bartels，M Bibbo，JJ Sychra：“子宫癌中间细胞的细胞形态标记”(Cytomorphometric markers for uterine cancer inintermediate cell)，Analyt Quant Cytol 2：257-263，1980)(G Burger，U Jutting，K Rodenacker：“子宫颈癌及其前体中良性细胞群的变化”AnalytQuant Cytol 3：261-271，1981)。在颊粘膜和涂片(Klawe，Burger)、子宫颈(Wied，Burger，Bartels，Vooijs，Reinhardt，Rosenthal，Boon，Katzke，Haroske，Zahniser)、乳房(King，Bibbo，Susnik)、膀胱和前列腺(Sherman，Montironi)、结肠(Bibbo)、肺和痰液(Swank，MacAulay，Payne)、和鼻粘膜(Reith)研究中进行独立的定量组织学和细胞学研究，证明MAC，MAC-为基础的灵敏度从70％到89％而特异性从52％到100％。Marek和Nakhosteen显示(1999，美国胸科协会年会)两项定量肺部研究结果，表明(a)灵敏度89％和特异性92％以及(b)灵敏度91％和特异性100％。
显然恶性肿瘤相关变化(MACs)是图象细胞计数标记检测技术所产生的有潜在性用途的探针。DNA-染色细胞核的MAC-为基础的特征可与其它分子诊断探针联用以产生用于检测和鉴别肺癌和其它疾病的最优化的分子诊断面板。
细胞遗传学采用，例如，原位杂交(ISH)技术检测特性异染色体为基础的细胞内变化。ISH技术可基于荧光(FISH)、多色荧光(M-FISH)、或光吸收为基础的发色成象(CHRISH)技术。ISH技术家族采用DNA或RNA探针来检测克隆的细菌细胞或培养的真核细胞中互补DNA序列的存在。例如，FISH技术可。用于检测某些癌症相关的遗传异常。例子包括Trisomy 8和HER-2 neu的探针。其它技术例如聚合酶链反应(PCR)可用于检测B-细胞和T-细胞的基因重排。由于细胞遗传学检测的是产生病理状况的致病或“触发”分子事件，故它是一种高度特异性的标记检测技术。因为可能存在的检测事件较少，它可能比其它标记检测技术灵敏性低。原位杂交(ISH)是一种分子诊断方法，采用基因为基础的分析检测遗传水平上的异常，例如突变、染色体差错或遭受特异性病原体插入的遗传物质。例如，原位杂交可包括采用设计的能与特异性mRNA杂交的标记引物处理患者细胞样品，洗去未结合的引物并测定此标记的信号来测定特异性mRNA的水平。由于基因序列的唯一性，一项包括基因序列测定的试验将可能具有高特异性，产生非常少的假阳性。然而，由于细胞样品中遗传物质的量非常低，可能只得到非常弱的信号。因此，不采用前置放大技术的原位杂交试验将有可能特异性差，产生许多假阴性。
蛋白组学取决于正常或异常细胞类型群体中的独特的或特异性蛋白质的过度表达，表达不足或存在/缺乏所致的细胞特性或分化。蛋白组学不仅包括蛋白质的鉴定和定量，还包括测定它们的位置、修饰、相互作用、化学活性、和细胞/胞外功能。免疫化学技术(QIHC)(细胞中为免疫细胞化学，组织中为免疫组织化学(IHC))是采用抗体定性或定量地染色抗原(即，蛋白体)的技术。免疫染色方法采用染料作为检测指示剂。IHC应用的例子包括分析ER(雌激素受体)、PR(黄体酮受体)、p53肿瘤抑制基因、和EGRF预后标记。蛋白体学通常是一种比细胞遗传学更灵敏的标记检测技术，因为采用蛋白体学检测的蛋白质分子常常比采用细胞遗传学检测的细胞遗传突变或基因序列变化高几个数量级。但是，由于多种病理过程可导致相似地蛋白质过量表达或表达不足等变化，蛋白体学可能比细胞遗传标记检测技术的特异性差。免疫化学分别包括免疫活性物质在组织切片或细胞制剂中的组织学或细胞学定位，常采用标记抗体作为探针试剂。可利用免疫化学，采用对疾病标记上的某表位具有特异性的标记抗体(探针)试剂处理细胞，然后洗去未结合的抗体并测定该标记的信号来测定细胞样品中该疾病标记(特异性蛋白质)的浓度。免疫化学是根据癌细胞拥有正常细胞不同水平的某些疾病标记的特性。癌细胞中一种疾病标记的浓度通常足够大能产生大的信号。因此，依赖于免疫化学的试验将可能具有高的灵敏性，产生很少的假阴性。然而，因为除了虽病状态外其它因子也可引起疾病标记的浓度升高或降低，依赖于特异性疾病标记的免疫化学分析的试验将很可能特异性差，产生高比例的假阳性。
本发明提供了一种具有高灵敏度和高特异性的非侵害性疾病检测和区别方法。该方法包括使怀疑含有患病细胞的细胞学样品与含有多种试剂的探针面板相接触，各个试剂能与一种特异性疾病标记物定量结合，并检测和分析探针试剂结合的模式。本发明还提供了构建和验证用于检测一种特异性疾病(或一组疾病)和区分其不同疾病状态的探针面板的方法。还提供了用于检测肺癌和区分不同类型肺癌的说明性探针面板。
人体疾病是由于人体器官的适应机制不能抵抗外部或内部损害，导致机体细胞、组织、器官或系统结构或功能异常。疾病可通过共有的致病机制分类，见下文表1中举例说明。
                       表1
疾病类别 疾病状态举例
过敏反应 对食物和植物发生不良反应
心血管疾病 心力衰竭、动脉粥样硬化
退化性(神经和肌肉的)疾病 老年性痴呆和帕金森氏症
饮食性疾病 非营养性物质和过量/不平衡营养
遗传性疾病 镰状细胞贫血、囊性纤维化
免疫性疾病 HIV和自身免疫病
传染病 病毒、细菌、真菌、寄生虫
代谢性疾病 糖尿病
分子和细胞生物学 癌症(瘤形成)
毒性损伤 酒精、药物、环境诱变剂和致癌物
外伤 汽车碰撞产生的身体损伤
疾病是亚细胞、细胞、组织、器官、或人体解剖或生理系统水平上的异常变化(即病理状况)所引起或者所导致的。许多病病(例如，肺癌)的特征是亚细胞或细胞水平的异常变化。可收集疑患有疾病的患者的样品(例如，宫颈PAP涂片、废弃的尿液、血液、痰液、结肠灌洗液)以诊断那些患者是否存在疾病及其类型。分子病理学是试图鉴定和从诊断上利用这些细胞为疾病相关分子的变化的学科。
肺癌是这类疾病的一个说明性例子，其中高危人群和危险个体的筛检可采用诊断试验进行(例如分子诊断性面板分析)以检测疾病的存在。而且，使用这些方法已检测出患肺癌或其它疾病的患者，可采用有关的诊断试验将相关的或同时发生的疾病状态与特异性疾病状态相鉴别。例如，在这个肺癌例子中，其它的分子诊断性面板试验可能表明该患者的疾病可能与下列肺癌类型之一相一致：(a)肺鳞状细胞癌，(b)肺腺癌，(c)大细胞肺癌，(d)小细胞肺癌，或(e)间皮瘤。以细胞为基础疾病状态的早期检测和鉴别是改善患者结局的一种假定的方法。
癌是一种肿瘤疾病，其天然病程是致命的。癌细胞，不象良性肿瘤细胞，表现出入侵和转移特性并是高度退行发育的。癌包括癌瘤和肉瘤两大类别，但在正常用法中常与癌瘤作为同义词使用。根据世界卫生组织(WHO)报道，癌症每年侵袭1000万以上的人口，并造成超过620万人的死亡。
实际上，癌症是可发生在机体任何部分的疾病的异质性集合体。结果，在所有癌症中甚至在其具体类型癌症的诸阶段中不同的治疗不是同样有效。在某些情况下，当有更大数量的治疗方法可选择时，诊断学的进步(例如乳房造影术、子宫颈细胞学、和血清PSA检测)，得以进行早期癌症的检测，并且治疗倾向于更加有效。当一个实体瘤小而局限时，仅外科手术就足以治愈。然而，当肿瘤已扩散时，外科手术最多仅可提供有限的益处。在这种情况下，化学疗法和/或放射疗法的加入可用于治疗转移性疾病。虽然对延长生命有某些效果，但治疗患有转移性疾病的患者很少治愈。即使可能有最初的反应，随着疾病的发展，患者最终死于疾病的影响和/或治疗药物的毒性作用。
虽然没有证实，人们通常承认早期检测和治疗将减少发病率、死亡率和癌症治疗费用。在许多情况下，早期检测得以能在转移前开始治疗。而且，由于有更多的治疗方法可选择，率获得治愈或明显改善的长期存活可能性更高。
开发一种可用于筛检“危险”人群的试验一直是医护人员的目标。虽然在诸如乳腺癌的乳房造影术、前列腺癌的PSA测试和子宫颈癌的PAP涂片等取得了某种成功，但是在多数情况下，是在患者出现症状和疾病几乎已经致命的较晚期才检出癌。对于大多数癌症，尚没有试验或试验的组合已显示出必需的灵敏度和特异性，得以低费用有效地鉴定患有早期疾病的患者。
对于成功的和得到患者、医生和第三方付款人所接受的癌症筛检程序，必然暗示该试验有益(能改变结局)，广泛可得到并能够在一般的卫生保健框架中容易地进行。该试验就是相对不具有侵害性，导致(病人)充分的顺应性，具有高灵敏度和合理的特异性并有预测价值。另外，该试验必须可得到，且费用较低。
对于怀疑患有癌症的患者，必须证实诊断并且对肿瘤作出适当的细胞学和临床分期以便医生进行适当的医疗介入。然而，目前癌症诊断和分期所采用的某些试验不是缺乏足够的灵敏度或特异性，就是太具侵害性，或是作为人群为基础的筛检试验证明费用太高。例如，下文表2和3显示了对肺癌诊断方法的灵敏度和特异性估计，以及用于检测肺癌的诊断试验的费用估计。
                       表2：
            肺癌诊断的灵敏性和特异性估计[1]
诊断试验     灵敏性(％)     特异性(％)
常规痰液细胞学     51.0     100.0
胸部x-射线照相     16-85*     90-95
白光支气管镜检     48.0-80.0     91.1-96.8
LIFE支气管镜检     72.0     86.7
计算机X-射线断层术     63.0-99.9     80.0-61
PET扫描     88.0-92.5     83.0-93.0
*取决于诊断时的疾病期
                表3：
    用于肺癌的诊断试验的费用估计[1]
诊断试验     费用($)
痰液细胞学     90
胸部X-射线照相     44
支气管镜检     725
计算机X-射线断层术     378
PET扫描     800-3000
开胸活组织检查     12,847-14,121
由于胸部射线照相(X-射线)具有合理的灵敏度、高特异性和低费用，故常常用于检测和定位癌症病灶。然而，小病灶常常难以检测到，虽然较大的肿瘤相对容易在胸片上发现，但检测时大量肿瘤已经转移。因此，胸部X-射线照相用作早期检测方法缺乏必须的灵敏度。
计算机X-射线层析照相术(CT)可用于证实和特征鉴定肺结节并得以检测出标准胸部X-射线照相术常常不能检测到的微小异常[2]。CT、和螺旋CT(Spiral CT)方法是特别对患有先前恶性痰液细胞学结果或声带麻痹的患者保留了可选择的试验。CT较常规胸片具有改进的灵敏度，已成为拍摄中心气道的主要手段[3]。虽然能够检测大范围的区域，CT常常受心脏和呼吸运动的假象所影响，虽然通过使用碘化对比材料可获得分辨率的改进。
螺旋CT(Spiral CT)是CT的一种更快速和灵敏形式，具有比常规CT或X-射线更可靠地检测早期癌症病灶的潜力。螺旋CT在诊断早期疾病中似乎具有大大改进的灵敏性。然而，该试验具有20％的假阳性率，特异性较低[4]。螺旋CT在检测占所有肺癌1/3的中心病灶的灵敏度也较低。并且，虽然最初试验的费用较低($300)，但随访的费用可能很高。采用分子诊断性面板试验的细胞学作为螺旋CT的附属试验提供了有显著应用前景的方法，可通过评价螺旋CT-怀疑的肺结节的细针抽吸物(FNA)或活组织检查(FNB)使假阳性结果最小化，来改进螺旋CT试验的特异性。
荧光支气管镜检提供了比常规白光支气管镜检更高的灵敏度，显著改进了中心气道内小病灶的检测[5]。然而，荧光支气管镜检不能检测外周病灶，支气管镜检人员要花很长时间检测患者的气道，并且这是一种昂贵的方法。另外，该方法具有中度侵害性，用作人群筛检试验会产生难以克服的障碍。
正电子发射X射线层析照相术(PET)是一种高灵敏度试验，采用放射性葡萄糖鉴定肺中癌细胞的存在[6-8]。建立检测设施的费用很高，并且在现场或附近需要回旋加速器。这，加上该试验的高费用，限制了PET仅用于扫描给肺癌患者分期而不是用于该病的早期检测。
尽管痰液细胞学用作筛检肺癌的方法已有一些时间，但由于灵敏度低和不能减少疾病-特异性死亡率，采用痰液细胞学仅获得有限成功。在常规的痰液细胞学中，病理学家采用细胞形态的特征性改变来鉴定恶性细胞并诊断癌症。今天只有15％的“处在危险中”的患者或者怀疑患有肺癌的患者进行了痰液细胞学测试，不到5％的患者进行了多种评价[9]。包括肿瘤大小、位置、分化程度、细胞聚集、释放细胞和痰液到外部环境的清除机制失效、以及痰液中细胞稳定性差等许多因素导致该试验整体效果差。
癌症诊断传统上依赖于单一分子标记的检测。不幸的是，癌症是这样一种疾病，其中单一标记通常不能检测或区别该疾病的多种形式。因此，仅识别单一标记的探针已显示基本上无效。耗尽精力地寻找“魔术子弹”(magic bullet)的诊断试验已进行了几十年，尽管至今也没有发现通用的成功的魔术子弹探针。
本发明一个主要应用前景是细胞为基础的癌症诊断和筛检。对其它疾病的诊断和治疗监控将随着技术的发展得到显著改进，超过采用单一标记/探针分析而不是采用多种同时标记探针的试剂盒。由于癌症不是一种单一疾病，这种多元分析方法特别适用于癌症诊断。而且，这种多-因子“检测面板(panel)”方法在细胞学和临床学上与癌症的非均质特性相一致。
将面板方法成功实施于细胞为基础的试验的关键，是设计和开发可在化学上识别能特表鉴定和区分各种疾病的标记物模式的优化探针面板。本专利申请描述了设计和开发这种新颖优化面板的有效和独特方法。
用于样品收集(例如用于痰液细胞学的point-of-care混合器)和制备(例如，新的细胞学保存和转运液体，和液体为基础的细胞学制备设备)的改进方法正在开发中并成为可商品化购得。结合现有的和这些新兴的方法，这种分子诊断学以细胞为为基础的面板试验的成功实施将导致(a)对恶性肿瘤和其它疾病分子概乳的特征性鉴定，(b)对早期癌症和其它疾病的检测和鉴别方法的改进，和(c)为改进临床诊断、预后、患者特定治疗方法和治疗性监控提供了机会。
                            发明概述
本发明涉及采用细胞为基础诊断方法检测普通疾病或辨别特殊疾病状态之间差别的一种面板(panel)。该面板包含多个探针，各个探针能特异性地结合与普通或特殊疾病状态相关的一种标记，其中该面板的组成探针与细胞学样品中的细胞结合的模式是诊断所述疾病的存在或特性的依据。本发明还涉及采用以细胞为基础的诊断方法检测患者疾病或辨别疾病状态之间差别的面板的形成方法。该方法包括测定探针结合的灵敏度和特异性，各个探针能特异性地结合与疾病相关的标记物文库的一个成员并选择有限的数所述探针，其结合模式对所述疾病的存在或具体特性有诊断意义。本方法还涉及检测疾病或辨别疾病状态之间差别的方法。该方法包括使怀疑含有某疾病特征性的异常细胞的细胞样品与权利要求1所述的面板相接触，并检测所述探针的结合模式，该模式对所述疾病的存在或具体特性有诊断意义。
                            附图的简要说明
图1、分子标记是包含在用于鉴定不同组织类型肺癌的面板中的优选标记物。标示为“％”的拦目表示表达其具体标记物的肿瘤样品的百分比。
图2、潜在的方法，其中可采用不同的标记来辨别具体类型肺癌之间的差异。SQ表示鳞状细胞癌，AD表示腺癌，LC表示大细胞癌，SC表示小细胞癌，ME表示间皮瘤。各个小格中出现的数字代表一种细胞类型相对于另一种细胞类型中标记物变化的频率。为了包含于此表中，比率必须大于2.0或小于0.5。数字大于100通常表示第二种标记不被表达。在这种情况下，为了分析目的将分母设定为0.1。最后，空的小格代表表达上无差别或者缺乏表达数据。
图3、在对照组织和癌组织中探针7和15的H-评分之间的比较。X-轴显示H-评分而y-轴显示病例的百分比。
图4、相关矩阵，其中相关性测定一对变量之间的线性相关量。该矩阵中具有50％或更高的相关数字的所有标记被认为是相关标记。
图5、检测面板组合物、成对方式(pair-wise)辨别面板组合物和联合的辨别面板组合物。面板组合物采用决策树分析，显示步进式LR和步进式LD。
图6、检测面板组合物，其中探针7不作为探针包含在内。面板组合物采用决策树分析，显示步进式LR和步进式LD。
图7、检测面板组合物仅采用商品化的优选探针。面板组合物采用决策树分析，显示步进式LR和步进式LD。
                            发明详述
1.导言
本发明提供了一种具有高灵敏度和特异性的非侵害性疾病状态的检测和辨别方法。该方法包括使怀疑含有患疾病细胞的细胞样品与含有多种试剂的面板相接触，各个面板能定量地与一种疾病标记物相结合，并检测试剂结合的模式。该模式包括与面板结合的组成探针的位置和密度/浓度。本发明还提供了用于检测疾病和用于辨别疾病状态之间差异的面板以及用于检测早期肺癌和辨别不同类型肺癌之间差别的面板的制备方法。面板试验已用于医学。例如，面板可用于血清分析。然而，由于细胞学分析包括个体细胞和组织中特异性标记物的成象和定位，在本发明之前，面板方法对细胞学样品是否有效是不清楚的。另外，统计分析是否可应用于设计和开发优化的细胞为基础的诊断性探针面板也是不清楚。
细胞为基础的筛检程序的不多例子之一是筛检子宫颈癌的PAP涂片。该方法已经实施了50多年，并且大大地促成了这样的事实，即今天几乎没有一个具有规律性PAP涂片的妇女死于子宫颈癌。然而，PAP涂片筛检程序有其缺点。例如，PAP涂片劳动强度大，不能普遍接受。目前采用探针面板的分子诊断细胞为基础的筛检方法滑有这些缺点。该方法可以完全自动化并因此减少开支，增加了这种类型试验的可接受性。
本发明提供了一种用于检测疾病状态和辨别疾病状态之间差异的具有高特异性和高灵敏度的方法。本发明适用于任何以细胞为为基础疾病，例如癌症和传染病。
此面板对癌病的存在或具体特性有诊断意义。本发明能够快速、精确、相对无侵害性和容易地检测和辨别细胞学样品中患病的细胞，克服了已知的疾病检测方法的局限性和缺点，同时保持了低费用。
制备本发明面板的本发明方法的特征是快速，可用这种速度开发该面板。
在检测疾病和辨别疾病类型之间差别的方法中使用试剂面板(a panel ofagent)有几个好处。一个好处是试剂面板具有足够的丰余度得以检测和特征鉴定疾病，因此提高了此试验的灵敏度和特异性。鉴于许多疾病的异质性特点，单一试剂不能鉴定巨大数量的大多数病例。
采用面板的另一个好处是面板的使用得以根据表达的特异性模式(探针的位置和密度/浓度)对各种类型疾病之间的差异进行辨别。由于各种类型疾病在发展速率、对治疗的反应、和死亡率上可能表现出显著的差异，知晓具体类型即可帮助医生选择最适的治疗方法。
2.面板
本发明的面板包含有多种试剂，各个试剂可定量地与一疾病标记物相结合，其中面板组成试剂的结合模式(位置和密度/浓度)可诊断一种疾病的存在或具体特性。因此，该面板可以是检测面板或辨别面板。检测面板检测细胞样品中是否存在普通疾病状态，而辨别面板可区别已知受到含有不同类型疾病的疾病状态影响的细胞样品中不同的具体疾病状态。检测面板和辨别面板之间的差异在于面板所包含的具体试剂。检测面板包含具有诊断疾病存在的结合模式的试剂，而辨别面板包含具有能测定疾病具体特性(即各个类型)的结合模式的试剂。
一个面板，从定义上讲，包含一个以上元件。为什么采用标记物面板检测普通疾病或辨别具体疾病中的差别比只用一种标记物有利有几个原因。一个原因是对于存在于所有患病细胞而不存在于健康细胞中，其行为可用高特异性和灵敏度方法检测以产生精确测试结果的一个标记物，不可能存在一种探针。如果存在这种单一探针可用于高灵敏度和特异性检测某具体疾病，它应当已经用于临床检测。相反地，它导致面板试验的选择，每一个面板由多个探针组成，它们一起提供的检测能力可保证临床上足够的检测。
然而，如果选择构建包含一个或非常少探针的面板试验，那么由于一些原因(例如由于生物变异性造成样品细胞反应性减低；许多探针试剂之间固有的变异性；弱的、过时的或有缺陷的加工试剂；对探针的不适宜加工时间或条件)任何单一标记物/探针的组合不能执行其标记功能，可能导致该试验检测或辨别目标疾病的灾难性失败。在各个面板试验中包含多种探针，甚至丰余的探针可大大增加以下可能性，即任何一个探针的失败将不会导致该试验的灾难性失败。
探针是能与疾病标记物结合的任何分子结构或亚结构。本文使用的术语“试剂”也可指能与疾病标记物结合的分子结构或亚结构。分子探针是生物学家和临床医生使用的用以检测和定位表示具体疾病状态的标记物的寻的装置。例如，可生产出能特异性结合先前鉴定为小细胞肺癌标记物的蛋白质的抗体。然后该抗体探针通过适当的免疫化学方法和培育来定位怀疑患病患者的细胞和组织中的目标蛋白标记物。如果此抗体探针能以化学计量(即定量)方式与其目标标记物结合，并被产色的或有色的“标记物”标记，那么探针和其目标标记物的定位和定量可间接地采用光学显微镜和图象细胞计量技术完成。
本发明采用本领域普通技术人员可获得的一些方法在DNA、RNA或蛋白质水平上检测分子标记物表达的变化。典型的探针可以是多克隆或单克隆抗体或其片段或与编码面板中的分子标记物的核酸序列互补的核酸序列。探针也可以是一种染料，例如DNA染料。用于本发明的许多抗体对作为标记物的各种细胞表面或细胞内抗原具有特异性。该抗体可使用本领域技术人员通常已知的技术合成。例如，在初步产生了抗标记物的抗体后，可测定抗体的序列，并随后通过重组技术制备。另外，可购买抗体。
在本发明的实施例中，探针含有标记。一个含有标记的探针本文常称为“标记探针”。该标记可以是能够附着在探针上的任何物质，因此当探针与标记物结合时即发出一种信号或者标记探针可通过检测者或分析仪检测。该标记也可称做“标记物”。标记可使用读出装置显现。术语“读出装置”指用于检测探针的分析仪器。本发明预想的标记是能发出信号并得以鉴定样品中成分的任何标记。优选的标记包括放射性、荧光、产色或酶分子。因此，可能的检测方法包括但不限于：免疫细胞化学法、免疫组织化学法、原位杂交、荧光原位杂交、流式细胞计量术和图象细胞计量术。标记探针产生的信号应具有足够的强度使得医师可以检测到。
“标记物”、“疾病标记物”或“分子标记物”是与疾病状态或病原体相关的任何分子结构或亚结构。术语“抗原”可与“标记物，”相互交换使用。广义地定义，标记物是由检测者或仪器特意使用的生物指示剂，以揭示、检测、或测定特定条件、事件或物质的存在或频率和/或数量。例如，核苷酸碱基的特定和独特的序列可用作遗传标记物以在个体中和整个家族中追踪基因遗传的模式。相似地，分子标记物是特异的分子，例如蛋白质或蛋白质片段，它在细胞或组织中的存在表示存在特定的疾病状态。例如，增殖性癌细胞可表达在相同类型正常细胞上没有发现的新的细胞表面蛋白，或可过量表达特异性的分泌蛋白，其丰度的增加和下降(例如分别为过量表达或表达不足)可用作特殊疾病的标记物。
用于细胞学面板的适当的标记物是定位于细胞核、细胞质或细胞膜之中或之上的物质。标记物也可位于存在于细胞中任何位置的细胞器中。位于细胞核中的典型标记物包括但不限于成视网膜细胞瘤基因产物(Rb)、细胞周期蛋白A、二磷酸核苷激酶/nm23、端粒酶、Ki-67、细胞周期蛋白D1、增殖性细胞核抗原(PCNA)、p120(增殖相关的核仁抗原)和甲状腺转录因子1(TTF-1)。位于细胞质的典型标记物包括但不限于VEGF、表面活性物质脱辅基蛋白A(SP-A)、核苷nm23、黑色素瘤抗原-1(MAGE-1)、粘蛋白1、表面活性物质脱辅基蛋白B(SP-B)、ER相关蛋白质p29和黑色素瘤抗原-3(MAGE-3)。位于细胞膜上的典型标记物包括但不限于VEGF、凝血调节蛋白、CD44v6、E-钙粘着蛋白、粘蛋白1、人上皮相关抗原(HERA)、成纤维细胞生长因子(FGF)、肝细胞生长因子受体(C-MET)、BCL-2、N-钙粘着蛋白、表皮生长因子受体(EGFR)和葡萄糖转运蛋白-3(GLUT-3)。位于细胞质的细胞器中的标记物例子是BCL-2，位于(部分)线粒体膜上。位于核的细胞器中的标记物例子是p120(增殖相关的核仁抗原)，位于核仁。
较佳的是表达发生变化的标记物：其在疾病发展的早期产生，由大多数患病细胞所显示，能检测到75％以上的特定疾病类型，最佳90％以上的特定疾病类型和/或能区分不同类型疾病特特之间的差别。
由于探针能与标记物结合，应注意到本发明的面板可称作探针面板或标记物面板。因此，该面板可包含许多标记物或可包含能与特异性标记物相结合的许多探针。为了一致的缘故，本发明面板称为探针面板；然而，它也可称为标记物面板。
标记物还可包括例如细胞核中恶性肿瘤相关的变化(MACs)等特征或与癌症患者的家族史有关的特征。恶性肿瘤相关的变化，或MACs，是发生于位于癌细胞附近外观正常的细胞中的典型的视觉以下的变化。这些细胞核中极为微小的变化生物学上可能起因于核基质和染色质分布模式的变化。即使训练有素的检测者通过单个细胞的肉眼观察也不能鉴定它们，但是可采用高度自动化的、计算机化的高速图象细胞计数仪进行细胞群的统计学分析来测定。检测MACs的技术是本领域技术人员熟知的，更详细的描述见：Gruner，O.C.Brit J.Surg.3；506-522(1916)；Neiburgs，H.E.等，Transaction，7th Annual Mtg.Inter.Soc.Cytol.Council 137-144(1959)；Klawe，H.Acta.Cytol.18；30-33(1974)；Wied，G.L.，等，Analty.Quant.Cytol.2；257-263(1980)；和Burger，G.，等，Analyt.Quant.Cytol.3；261-271(1981)。
本发明包括与疾病相关的任何标记物。各标记物本身仅仅是本发明的工具。因此，本发明不限于具体的标记物。分类标记物的一个方法是利用它们与其它分子的功能关系。如本文所使用的，“功能上相关”标记物是作为所述标记物的经历相同生物加工或途径的组分，并是本领域技术人员已知能与所述标记物一起异常表达的组分。例如，许多标记物与细胞增殖途径相关，例如成纤维细胞生长因子(FGF)、(血管内皮细胞生长因子)VEGF、细胞周期蛋白A和细胞周期蛋白D1。其它的标记物是葡萄糖转运蛋白，例如Glut-1和Glut-3。
本领域普通的技术人员经良好配备能测定功能相关的标记物，并能研究各种标记物或进行实验测定标记物的功能行为。通过非限制性的例子，可将标记物分类为参与血管生成的分子、跨膜糖蛋白、细胞表面糖蛋白、肺表面活性蛋白、核DNA-结合磷蛋白、跨膜Ca2+依赖性细胞粘着分子、细胞周期蛋白-依赖性激酶(CDK)的调节亚基、二磷酸核苷激酶、核糖核蛋白酶、在增殖性正常和肿瘤细胞中表达的核蛋白、DNA聚合酶δ的辅助因子、在正常组织中沉默而当在恶性肿瘤中表达时可为自身的、肿瘤定向和特性的细胞毒T细胞(CTL)所识别的基因、糖基化分泌性蛋白质、胃肠道或泌尿生殖道、肺部表面活性物质的疏水性蛋白质、跨膜醣蛋白、参与增殖、分化和血管生成的分子、原致癌基因、同源结构域转录因子、线粒体膜蛋白、在快速增殖细胞的核仁中发现的分子、葡萄糖转运蛋白、或雌激素相关的热休克蛋白。
生物标记物和探针的类别包括，但不限于：(a)形态学生物标记物，包括DNA倍性、MAC和癌变前疾损；(b)遗传性生物标记物包括DNA加合物、DNA突变和调亡(apoptotic)指数；(c)细胞周期生物标记物包括细胞增殖、分化、调节分子和调亡标记物，和(d)分子和生化生物标记物包括致癌基因、肿瘤抑制基因、肿瘤抗原、生长因子和受体、酶、蛋白质、前列腺素水平和粘着分子。
“疾病状态”可以是任何以细胞为为基础的疾病。在某些实施例中，该疾病是癌症。在其它实施例中，该疾病是传染病。癌症可以是任何癌症，包括，但不限于肺、尿道、胃肠道和生殖道的上皮细胞为癌；实体癌和/或以分泌性肿瘤为基础的癌症，例如肉瘤、乳腺癌、胰腺癌、肝癌、肾癌、甲状腺癌、和前列腺癌；和以血液为基础的癌症，例如白血病和淋巴瘤。本发明可检测的典型癌症是肺、膀胱、胃肠、宫颈、乳腺前列腺癌。可检测的典型传染病的例子是以细胞为基础的疾病，其中传染性的生物是病毒、细菌、原生动物、寄生虫或真菌。该传染病，例如，可以是HIV、肝炎、流感、脑膜炎、单核细胞增多症、肺结核和性传播疾病(STD)，例如衣原体、滴虫、淋病、疱疹和梅毒。
如本文所用，术语“普通疾病状态”指包含几种具体疾病类型的疾病，例如肺癌、性传播疾病和免疫为基础的疾病。具体的疾病状态还指疾病的组织类型。例如，术语“肺癌”包括几种具体的疾病，其中有鳞状细胞癌、腺癌、大细胞癌、小细胞肺癌和间皮瘤。术语“性传播疾病”包括几种具体的疾病，其中有淋病、人乳头瘤病毒(HPV)、疱疹和梅毒。术语“免疫为基础的疾病”包括几种具体的疾病，例如全身性红斑狼疮(狼疮)、类风湿性关节炎和恶性贫血。
如本文所用，术语“高危险人群”指一组接触过致病因子的个体，例如，在家里或工作场所的致癌源(即肺癌的“高危险人群”可能是吸烟、被动吸烟和职业性接触)。“高危险人群中”的个体也可具有遗传倾向。
术语“在危险中”指无症状的个体，但是由于家族史或明显的接触而处于发生疾病的明显危险中(即，处于肺癌危险中的个体具有超过30包一年的吸烟史；“包-年”是将每天吸烟的包数乘以接触的年数计算出的测量单位)。
癌症是一种细胞分离失去控制的疾病，归因于例如，基因表达的改变。在本发明的方法和面板中，癌症可以是任何器官的恶性生长。例如，癌症可以是肺、膀胱、肠胃、宫颈、乳房或前列腺癌。各个癌可包含患病或癌症的组织类型的集合。术语“组织类型”指不同组织学的癌症。取决于癌症，可以有一种或几种组织类型。例如，肺癌包括，但不限于，鳞状细胞癌、腺癌、大细胞癌、小细胞癌和间皮瘤。知道患者的癌症组织类型非常有用，因为它可帮助医师定位和特征鉴定法疾病等确定最佳治疗策略。
传染病包括以细胞为为基础的疾病，其中传染性生物是病毒、细菌、原生动物、寄生虫或真菌。
典型的检测和辨别面板是检测肺癌，一种普通疾病的面板，和能辨别不同于所有其它类型肺癌和假阳性的一种类型肺癌、特定疾病的面板。假阳性可包括不同类型的转移性癌，例如转移性肝、肾或胰腺癌。
3.制备面板的方法
制备检测患者普通疾病态或辨别特殊疾病状态之间差别的面板的方法，包括测定探针与普通或特殊疾病状态相关的标记物文库结合的灵敏度和特异性，并选择多个所述探针，其结合模式(位置和密度/浓度)可诊断该疾病的存在或具体特性。在一些实施例中，进行了任选的初步删减和制备步骤。制备本发明面板的方法包括分析与已知组织病理学样品中的标记物相结合的模式，即金标准。然后可用根据金标准数据设计的分类器设计用于细胞计量术，具体是自动细胞计量术的分类器。因此，用选自病理分析的标记物探针组来制备取自细胞样品，例如痰液、细针抽吸物、尿等的新的培训数据组。从特定病灶脱落的细胞将以类似于金标准的模式染色。这里描述的方法消除了选择最佳特征组中的实验误差，因为基于金标准的组织病理学样品的完整性诊断是很高的。原则上，虽然可采用细胞学样品来产生面板，但这不够理想，因为细胞学样品包含碎片，细胞样品中的细胞可能恶化，并且病理学诊断可能难以得到临床证实。
标记物文库是一组标记物。该文库可包含任何数量的标记物。然而，在一些实施例中此文库中标记物的数量受到技术和/或商品化实践性所限制，例如样品的大小。例如，在一些实施例中，针对面板中所有的标记物检测各个样品。因此，标记物的数量不一定大于样品可分成的样品数量。另一个技术实践性是时间。通常，该文库包含不到60个标记物。较佳地，该文库含有不足50个标记物。更加地，该文库含有不足40个标记物。最佳地，该文库含有10-30个标记物。潜在的面板成员文库含有10个以上标记物是较佳的，这样有可能优化面板的性能。如本文所使用术语“大约”意思是加减3个标记物。
在某些实施例中，通过咨询含有关于各种标记物的信息和标记物和普通/特异性疾病之间相互关系的信息的资料获得文库。典型的资料包括实验结果、理论的或预测的分析和文献资料，例如杂志、书、分类目录和网址。这些各种各样的资料可利用组织学或细胞学并可依赖于细胞遗传学，例如原位杂交；蛋白组学，免疫组织化学；细胞计量术例如MAC或DNA倍性；和/或细胞病理学例如形态学。该标记物可定位于细胞内或细胞上的任何位置。例如，该标记物可定位于细胞核、细胞质或细胞膜之中或之上。该标记物还可定位于任何前述位置中的细胞器中。
在某些实施例中，该文库可具有不相称的大小。因此，在启动制备面板的基础方法前可能需要一个或多个删减步骤。该删减步骤可包括一个或几个后续的删减步骤。一个删减步骤可包括，例如，设定灵敏度和/或特异性的一任意阈值。因此，可将实验的或预测的灵敏度和/或特异性低于此阈值的标记物从文库中除去。可单独或与其它删减步骤顺次进行的其它示范性删减步骤，可能取决于检测技术的要求，进入的约束条件和报道结果的不可重复性。关于检测技术要求，有可能难以获得检测具体标记物所需的机器。关于进入的约束条件，有可能许可证的限制使得难以或不可能获得能与具体标记物结合的探针。在某些实施例中，对各个标记物进行了适当的深入的研究。
在某些实施例中，在启动制备面板的基础方法前，可能需要进行准备步骤。典型的准备步骤包括优化用于客观定量检测文库中的标记物的方法和收集组织学样品。优化用于标记物的客观定量检测方法是本领域普通技术人员已知的技术。例如，必须获得必要的试剂和供给，例如缓冲液、试剂、软件和设备。有可能试剂的浓度需要校正。例如，如果观察到非-特异性结合，本领域普通技术人员可稀释探针溶液的浓度。
在某些实施例中，该组织样品是“金标准”(Gold Standards)。本领域普通技术人员知道术语“金标准”是指此样品的组织学和临床诊断是已知的。该金标准常常称做“培训”数据组。该金标准包含一组可能对辨别过程有贡献的所有特征的测量、或可靠估计量。这种特征可从代表性数量的患有已知疾病的患者收集的样品中采集。标准样品可以是细胞学样品，但这对于面板的选择这不够理想。
可通过本领域技术人员已知的任何技术，例如活组织检查，获得组织样品。在某些实施例中，每个患者的样品的大小必须足够大，这样可获得足够的组织切片以测试文库中的各个标记物。
在某些实施例中，从诊断患有各个特殊疾病的多个患者获得样品。每个患者可获得一个样品，或者每个患者可获得多个样品。在实施例中，从各个患者获得多个样品，外科专家依赖于确定从一个患者获得的各样晶类假于从该患者获得的其样品。还可从对照组患者获得样品。对照组患者可以是健康患者或不患有待检测的普通或特殊疾病的患者。
该基础方法的第一步是测定探针与所述疾病相关标记物文库结合的灵敏度和特异性。在这一步骤中，将对文库中各个标记物具有特异性的探针加到患者标本的样品中。因此在一些实施例中，例如，如果此文库中有30个标记物，各个患者的标本将被分为30个样品并且各个样品将用对30个标记物之一具有特异性的探针处理。该探针包含可看见的标记。因此，可检测到探针与该标记物结合的模式和水平。结合的模式和水平可定量检测，即通过分析仪，或由人，例如病理学家定性检测。
在某些实施例中，开发了目标和/或定量评分方法以检测探针与标记物结合的模式和水平。该评分方法可启发式地进行设计。例如，评分方法可用于客观评价病理学家做出的主观解释。确定适当的评分方法是本领域普通技术人员已知的。在某些实施例中，该评分方法可包括分类特征，例如标记物探针染色的密度：无、弱、中等或强。在另一个实施例中，这些特征可在显微镜载玻片图象上用公式算法测定。一个典型的评分方法是将比率和密度合并成给强度分级获得的一种“H评分”如：无＝0、弱＝1、中等＝2、强＝3，和细胞百分比如：0-5％＝0、6-25％＝1、26-50％＝2、51-75％＝3，＞75％＝4，然后将两个评分相乘。例如，50％弱染色加上50％中等染将得分6＝(1×2)+(2×2)。该“H评分”以已故的Kenneth Hirsch本发明者之一命名。
本领域普通技术人员能够提出关于使与病理学家和样品有关的潜在偏差最小化的问题。例如，可采用随机化来最大程度减少形成系统误差的机会。盲法可用于消除执行实验的人造成的实验偏差。例如，在某些实施例中，可通过进行双盲研究使病理学家到病理学家间的差异减到最小。如本文所用，术语“双盲研究”是避免偏差的已完善建立的方法，其数据收集和数据分析是独立完成的。在另一个实施例中，通过随机测试样品使样品到样品的差异最小化。例如，在病理学家分析样品之前随机测试样品。在实验方案中也应包括随机化。在某些实施例中，各个样品通过至少两个病理学家的分析。对于每个患者，得到探针与标记物结合的可靠评价。在一个实施例中，这种诊断由有资格的病理学家作出，每个患者用两个病理学家来核查可靠性。
应收集充足数量的样品以产生可靠的设计和可靠的统计学性能估计。测定多少样品足以产生可靠的设计和可靠的统计学性能估计本领域是普的技术人员已知的。大多数标准分类器设计包具有确定性能估计的可靠性的方法，并且样品大小应逐渐增加直到获得可靠的估计。例如，用200个收集的样品和从各个样品中评估的27个不同特征可达到产生可靠设计的充分评估。
第二个步骤是挑选有限数量的探针。该挑选步骤可采用统计分析和/或模式识别技术。为了进行此挑选步骤，可将数据合并入数据库。在某些实施例中，可给探针编号以在分析它们的效果过程中当看不见时提供操作方法并进一步减少偏差。由于这种方法产生了大量的数据因此使用了严格的统计技术。可采用任何统计方法并且普通的熟练的统计人员能够鉴定那一种或多少方法是适当的。
可采用任何数量的统计分析和/或模式识别方法。由于数据的结构最初不知道，并且由于用不同分类器设计方法对不同的结构更好，所以根据数据宜采用至少两种设计方法。在某些实施例中，可使用三种不同的方法。数据组的统计分析和/或模式识别领域的普通技术人员将从该数据组结构特征认识到某些统计方法比其它方法更可能产生有效的结果，其中在这种情况下有效是指用所需数量的探针可获得一定水平的灵敏度和特导性。本领域普通技术人员将得统计分析和/或方法的效果是由数据决定的。
典型的统计分析和/或模式识别方法描述如下：
一种决策树方法，称做C4.5。C4.5是公众领域软件可经ftp获自http：//www.cse.unsw.edu.au/～quinlan/的，不受版权限制的软件。它非常适合于可通过依次对具体特征顺序应用决定阈值最佳的数据。这一工作最好使用不相关的数据；它还用提供方差差异的类型方法处理数据。可使用C4.5包提供本文显示的例子。
a)线性辨别分析。这包括能给出最好类别分离的特征的加权组合的发现。这些方法用相关的数据运行得很好，但在具有相似的平均值和不同方差的数据中运行得不好。取决于所需的性能估计和图解输出，使用了几个统计包(SPSS、SAS和R)。Fisher的线性辨别函数用于获得使误差率最小的分类器。采用了规范的辨别函数计算接受器工作特征(ROC)曲线，当决定阈值改变时该曲线显示灵敏度和选择性之间的平衡。
c)逻辑回归。这是线性回归模式的非线性转化：因变量为对数奇数比(对元)所取代。线性回归，象辨别分析，属于在线性模式基础上建立的统计方法类型。这种模式依据说明变量之间的线性关系。
用足够数量的样品，采用上述技术和软件包，寻找能给出类别之间良好分辨力的特征组合是可能的。其它典型的统计学分析和/或模式识别方法是SPSS中的线性辨别函数方法和R和SAS中的逻辑回归方法。SPSS是产品的全名并购自位于SPSS公司，总部在233 S.Wacker Drive，11楼，Chicago，Illinois60606的SPCC公司( www.spss.com)。SAS产品的全名购自SAS研究所，公司，100 SAS Campus Drive，Cary，NC 27513-2414，USA( www.sas.com)。R是产品全名在自由软件基金会GNU(通用的公众许可证General Public License)名目下可作为免费软件得到。
http：//www.r-project.org/。
在某些实施例中，获得一个相关矩阵。相关性是测定一对变量之间的线性相关数量。相关矩阵通过用一个标记物获得的数据与用另一个标记物获得的数据相关联获得。阈值相关数例如可设定为50％相关。假如这样的话，具有50％或更高相关数目的所有标记物将被认为是相关标记物。
在本发明的某些实施例中，可利用用户提供的因素来获得最佳检测面板。这种权衡可能与任何因素相关。例如，某些标记物可能比其它标记物更占权衡，因为成本、商业因素、错误分类或误差比率、一个地区普通疾病流行、一个地区特异性疾病流行、探针的冗余和可利用性。可能鼓励用户权衡某些标记物高于其它标记物的某些成本相关因素，是探针的成本和商业选取问题，例如许可证有效期和条件。可能鼓励用户权衡某些标记物高于其它标记物的某些商业考虑相关因素是，研究和开发(R&D)时间、R&D成本、R&D风险，即探针工作的可能性、分析设备的最终花费、最终的性能和进入市场的时间。在一个检测面板中，例如，可能鼓励用户权衡某些标记物高于其它标记物的某些错误分类或误差比率相关因素是尽量减少阴性可能是需要的。另一方面，在一个辨别面板中，可能尽量减小假阳性是需要的。与在一个地区内普通或特殊疾病流行相关的某些因素可能鼓励用户权衡某些探针高于其它探针，这些因素是在某些地区内某些普通或特殊疾病的发病或多或少地流行。关于丰余部分，在某些情况下需要该面板中有丰余部分。例如，如果某种原因使一个探能没能检测到，是由于面板中标记物的生物性变异，但疾病仍可通过其它标记物得到检测。在某些实施例中，标记物是优选的丰余标记物，可能要更重地权衡。
本发明在适应于特征的可利用性上具有灵活性，其中成本或供给问题可能不允许最好的组合。在一个实施例中，本发明可简单地加入可利用的特征以找到另一种组合。在另一个实施例中，使用公式算法选出允许在选择过程中权衡成本的特征以达到尽可能减少成本的解决方案。在该实施例中，显示了对于从所有收集的标记物选出的组合或对于只有一组市售的优选的探针的标记物性能估计。该实施例还显示了在其高成本的基础上C4.5包如何可用于减少对某些探针的权衡。这些探针组合可能不象最佳组合那样运行得很好，但是在成本是重要因素的情况下其性能可被接受。
采用某些方法使得可将这些考虑加到分类中。这可在C4.5中得到，其中树型设计可优化成本。而且，辨别函数方法可给出可用于提出所需要的假阳性或假阴性可能性的单一参数输出。用于不同阈值设定的这些参数的绘图称为接受器运算特征(ROC)曲线。ROC曲线显示对于分类器的不同阈值水平假阳性与真阳性评分的估计百分比。
鉴于许多普通疾病的异质特性，面板的构成应其丰余度以确保诊试验具有足够的灵敏度、特异性、阳性预测值(阳性预测值＝真阳性/(真阳性+假阳性)和阴性预测值(阴性预测值＝真阴性/(加阴性+真阴性)以验证它们用作人群筛检的用途。然而，局部和地域性一差别可能支配该试验在全球市场的不同部分的具体使用，因此可能显著影响用于构建某给定市场的最终面板试验(paneltest)的标准。而临床应用的优化极端重要，包括负担费用(成本)、技术能力、实验室和保健提供者资源、作业流程问题、人力需求和探针和标记物的可获得性都将影响到面板中使用的标记物的最终和局部选择。可利用众所周知的线性辨别函数分析来包括和评估所有潜在的选择因素，通过线性辨别函数分析每个局部因素在方程中由一个术语代表，并且每个局部因素根据其局部确定的意义加以权衡。这样，在一个区域使用的优化的面板试验可能与在不同区域使用的优化的面板试验有所不同。
一旦使用上述方法设计出检测或辨别面板(panel)，下一步是用已知的细胞样品验证该面板。验证之前可进行任选的优化步骤。在某些实施例中，可改进收集细胞样品的方法。这包括从患者获得样品的方法以及混合细胞样品的方法。在其它实施例中，可改进细胞提供方法。例如鉴定最佳的固定剂(防腐液)或转运液体。
用于验证采用金标准组织样品产生的检测面板的细胞学样品，是已明确诊断的细胞学样品。这些样品可用本领域技术人员已知的任何方法收集。例如，痰液样品可通过自发产生、诱导产生和通过采用增加痰液产生的药物收集。面使该样品与面板中的各个探针接触，并分析探针结合的水平和模式以确定该面板的性能。在某些实施例中，可能需要进一步优化面板。例如，可能需要从面板中除去一个探针。或者，可能需要在面板中加入一个额外的探针。另外，可能需要用另一个探针代替面板上的一个探针。如果加入一个新的探针，该探针可能如相关矩阵确定的那样是一种相关标记物。另外，该探针可能是一个功能相似的标记物。一旦面板被优化，该面板可进行进一步在临床研究中作检测。
在其它实施例中，不需要优化面板。如果细胞学样品的结果与组织样品的结果相关，就不需要优化面板并且该面板可在临床研究中进行进一步的检测。
4.使用方法
一旦用上述方法获得检测面板，就可应用于细胞学样品。为了说明该方法，可将癌症特别是肺癌用做例子。相似的步骤和程序将应用于其它疾病。预计具体病灶脱落的细胞将以相似的方式染色并显示于细胞学样品中，例如细针抽吸物、痰液、尿，以类似于获得检测面板的组织病理学样品所用方式染色。
本发明的基本方法典型地包含两个步骤。第一，使怀疑含有患疾病细胞的细胞学样品与含有多种试剂的检测面板接触，其中各个试剂定量地与疾病标记物结合。然后，检测各个试剂与疾病标记物结合的水平和模式。检测结果可用于诊断普通疾病的存在或分辨特殊疾病之间的差别。一种任选的初步试验步骤是鉴定试剂的优化检测面板，该面板将辅助疾病的检测或分辨细胞学样品中疾病之间的差别。
细胞学标本可包括但不限于，从体液中收集的细胞样品，例如血液、尿、脊髓液、和淋巴系统；上皮细胞为基础的器官系统，例如肺部气管，如肺部痰液，尿道，例如膀胱冲洗液，生殖道，例如宫颈PAP涂片，和胃肠道，例如结肠冲洗液；和取自器官和系统中固体组织部位的细针抽吸物，例如乳房、胰、肝、肾、甲状腺、骨髓、肌肉、前列腺和肺；取自例如乳房、胰、肝、肾、甲状腺、骨髓、肌肉、前列腺和肺等器官和系统的固体组织部位的活组织检查；和组织学样品，例如外科活组织检查得到的组织。
本发明的说明性试剂检测面板包含允许精确检测细胞学样品中恶性细胞的任何数量的试剂。本发明预想的分子标记物可以是有助于恶性细胞检测的任何分子。检测面板中包含的标记物选择可根据与该标记物的表达水平或模式的变化相关的几种不同标准。优选的是表达发生变化的以下分子标记物：发生于肿瘤进展的早期，为大多数肿瘤细胞所表达，能使给定肿瘤类型75％以上得到检测，最优选超过给定肿瘤类型的90％和/或得以分辨癌症的组织类型之间的差别。
基本方法的第一步是检测细胞学样品中试剂面板的表达水平或模式的改变。该步骤通常包括使细胞学样品与试剂，例如标记的多克隆或单克隆抗体或其片段或核酸探针接触，并观察各个细胞中的信号。检测到细胞中信号改变即表示标记探针所针对的分子标记物表达水平改变。该改变依据是被测定的组织或部位点获得的非恶性细胞相比表达水平增加或减少。
分析试剂面板表达水平或模式的改变使本领域技术人员能以高灵敏度和高特异性确定恶性细胞是否存在于该细胞学样品中。术语“灵敏度”指患病者通过临床试验得到正确鉴定的条件机率，(真阳性结果的数目除以真阳性加假阴性结果的数目)。因此，如果一种癌症检测方法具有高灵敏度，检出癌症的百分比高，例如80％，优选大于90％。术语“特异性”指不患病者通过临床试验得到正确鉴定的条件机率，(即真阴性结果的数目除以真阴性加假阳性结果的数目)。因此，如果一种癌症检测方法具有80％、优选90％、更优选95％的高特异性，该方法产生的假阳性百分比就低。“细胞学样品”包括从包含患病细胞的患者收集的任何样品。本发明预想的细胞学样品的例子包括体液、上皮细胞为基础的器官系统冲洗液、刮削的碎屑、刷洗液、涂片或渗出液、和细针抽吸物和活组织检查。
本发明所述的标记物的用途假定常规获得充足的细胞学样品是可能的，为了随后的评估可充分地保存该样品。细胞学样品可作加工和贮藏在适当的保存剂中。较佳地，将细胞学样品收集在含有保存剂的小瓶中。该保存剂是已知能保持细胞形态和抑制或阻遏细胞蛋白和核酸降解的任何分子或分子组合。为了确保适当的混合，可在收集地点高速混合样品以分散样品和/或分离混淆的材料例如粘液、使细胞接触于保存剂中。
一旦获得样本，需用一适当的混合装置将其匀化。这得以分成等分用于多种目的，包括可能要将等分样品送到一个以上的测试地点，以及制备多个载玻片和/或在一个载玻片上产生多个沉积点。使用前，标本和各个等分先匀化将保证每个个体的载玻片将具有基本上相同分布的细胞，这样一波载玻片的结果与另一载玻片比较才有意义。
用于分析的标本制备包括将一个样品加到显微镜载玻片上，使用的方法包括但不限于，涂片、离心、或单层细胞沉积。这些方法可以是手工操作、半自动化、或全自动化。可抽吸细胞悬浮液，将细胞沉积在滤膜上，可加工转移到准备好的载玻片上的单层细胞用于进一步的评估。通过重复这些过程可按需要制备其它载玻片。本发明包括检测每波载玻片上的一个分子标记物。也预想了检测每张载玻片上几个分子标记物。所选每波载玻片上可检测1-6个标记物。在某些实施例中每张载玻片上可检测到2个标记物。在其它实施例中每张载玻片上可检测3个标记物。
本发明考虑采用本领域普通技术人员可获得的许多方法之一检测DNA、RNA或蛋白质水平上分子标记物表达的变化。检测细胞学样品中分子标记物表达的水平和模式的变化通常包括使细胞学样品接触多克隆或单克隆抗体或其片段，或接触编码检测面中的分子标记物的核酸序列互补的核酸序列，(统称为“探针”和标记)。通常，使探针和标记组分操作性相连接，这样当探针与分子标记物反应时，发出一个信号(一个“标记探针”)。本发明预想的标记是能发出或启动一个信号得以确定样品中某成分的任何标记。优选的标记包括放射性的、荧光的、产色的或酶促分子。因此，检测的可能方法包括但不限于，免疫细胞化学；蛋白组学，例如免疫化学；细胞遗传学，例如原位杂交、和荧光原位杂交；放射检测、细胞计量术和场效应，例如MAC和DNA倍性(采用计算机自动化的细胞计量术进行化学计量染色核DNA的定量测定)和；细胞病理学，例如基于形态学的定量细胞病理学。标记探针产生的信号较佳地具有足够的强度使医生或技术人员能检测到。
一旦制成载玻片，医生进行载玻片的显微镜观察以鉴定细胞是否显示出具有癌症诊断特征的标记物表达的变化。医生可利用图象分析系统和自动显微镜鉴定感兴趣的细胞。数据的分析可利用信息处理系统和算法，这将有助于医生做出明确诊断和选择最佳治疗方法。医生还可采用能够检测标记试剂存在的设备平台检测样品。
分子诊断面板试验将产生一个或多个具有标记细胞和/或组织切片的玻璃显微镜载玻片。对于人类专家客观地评估这些(细胞)病理学多重标记细胞制品并具有临床上有意义的结果的挑战，实际上是一种人类难以克服的检测和认识问题。
可开发和使用计算机辅助图象系统(即Photonic MicroscopesTM)以定量和重现性评估探针标记的细胞和组织的数量和位置。这种PhotonicMicroscopesTM组合了机器人载玻片处理能力、数据管理系统(例如医疗信息)、和定量数字(光学的和电子的)图象分析硬件和软件模数，来检测和报道细胞为基础探针的含量和位置数据，该数据不能通过具有相当的灵敏度和精确性的人肉眼目测获得。这些探针数据可用于特征鉴定和区别细胞样品，对于各种疾病，将根据在它们各自的细胞为基础的标记物中它们的相关特征和差别。
本方法是这样一种方法，将分子诊断面板应用于细胞为基础的标本和样品，并且随后利用计算机辅助成象系统来定量和报告分子诊断面板试验(paneltest)的结果。这种成象系统可用于评价在给定的载玻片样品上同时采用多个探针的细胞样品，其中的探针可作分别分析、定量和报告，因为这些探针在显微镜细胞学或组织载玻片上染色有所区别。
如果样品中标记试剂产生的信号具有适当的类型和足够的强度，它们可被人类观察者(例如病理学家)通过使用标准显微镜或计算机辅助显微镜检测到[167]。该计算机辅助显微镜是一种人类工程学的、计算机界面的显微镜工作站，它将鼠标驱动控制的显微镜操作(例如相变动、聚焦)与主要功能的计算机化自动控制(例如载玻片扫描模式)相结合。中央数据管理系统(DataManagement System)储存、组织和展示有关患者的信息以及所有标本筛选和病理学家观察得到的结果。在条形码上打印上鉴定编号并粘贴在各个样品的载玻片上可唯一地鉴定数据库中的各个样品，并与原始标本和患者相关联。
在一个较佳的实施例中采用自动图象分析系统或介面连接于中央数据管理系统的光学显微镜Photonic Microscope，检测和定量样品中标记试剂产生的信号。该光学显微镜提供完全自动化的显微镜操作的软件控制并加入了检测器和其它适用于定量的组件，即使信号不能被人类观察者检测到，例如非常弱的信号或放射性标记发出的信号。用电子学方法储存检测到的信号位置，通过自动化仪器快速重新定位，供人类使用计算机辅助显微镜观察[168]。
中央的数据管理系统使用条形码鉴定编号将所有的患者和样品数据编档保存。该数据可不同期从多个位点获得，可能得自多位观察者供人类细胞学家和/或自动化分析仪分析。这些数据可包括从等分的事先匀化的患者样品的多张样品载玻片获得的结果，可将部分或全部数据转移到医院的实验室信息系统或从该系统中取出来满足报告、归档、编制报表或调节的需要。可能产生具有面板试验和人类观察者整合结果的一份全面报告并以硬拷贝形式或通过网络计算机或互联网传递给医生。
在某些实施例中，本方法使得能差异性辨别不同疾病，例如癌症的不同组织类型。术语“组织类型”是指特殊疾病状态。根据普通疾病可以有一种或几种组织类型。例如，肺癌包括但不限于，鳞状细胞癌、腺癌、大细胞癌、小细胞癌和间皮瘤。知道患者的癌症组织类型非常有用，因为它帮助医生定位和特征鉴定该疾病并确定最佳的治疗策略。
为了测定特殊疾病状态，选择一种标记物检测面板，使得以区分特殊疾病状态之间的差别。例如，在一个分子标记物检测面板内，可鉴定出表明癌症具体组织类型的表达模式。检测分子标记物面板的表达水平可通过上述方法实现。优选采用具有1-20个分子标记物的面板来区别肺癌不同组织类型之间的差异。然而，优选采用4-7个标记物。可开发决策树以有助于根据标记物表达模式区分不同组织类型之间的差别。
除了能检测细胞样品中的恶性细胞外，本发明也用于疾病的分子特征鉴定。这种信息常常具有预后意义并可帮助医生为具体患者选择最佳治疗方法。另外，本发明所述的标记物检测面板可用于监控患者复发或测定用于治疗该疾病的疗法的效果。
通过非限制性的实施例，可通过肺癌检测面板检测肺癌的存在并可通过辨别面板检测肺癌的具体类型。如果医生确定恶性细胞存在于细胞样品中，可进行肺癌组织类型的进一步分析。本发明的肺癌组织类型包括但不限于，鳞状细胞癌、腺癌、大细胞癌、小细胞癌和间皮瘤。图1显示鉴定肺癌不同组织类型的面板中所包含的分子标记物是优选的分子标记物。标有“％”的栏目表示表达该具体标记物的肿瘤标本的百分比。
在确定肺癌的各种组织类型时，分析了其标记物表达的相对水平。图2说明可如何利用不同的标记物来区分不同癌症组织类型之间的差别。在该表中，SQ表示鳞状细胞癌，AD表示腺癌，LC表示大细胞癌，SC表示小细胞癌和ME表示间皮瘤。各个小格中出现的数字代表一种细胞类型与另一种细胞类型中标记物变化的频率。此表中包括的比率必须大于2.0或小于0.5。大于100的数字通常表示第二个标记物不表达。在这种情况下，为了分析目的将分母设定为0.1。最后，空的小格代表表达没有区别或缺乏表达数据。
分析所收集数据的一个方法是构建决策图。图1-4是决策图的例子，可构建该决策图以能够利用表达模式差别性确定肺癌的组织类型。本发明不以任何方式限于图1-4中所提出的决策图。某标记物表达的相对水平可高于、低于、或等于(ND)不同组织类型恶性细胞中分子标记物表达的水平。各个图通过利用所示的分子标记物检测面板能够分辨肺癌的五个组织类型之间的差别。
例如，图1中面的检测面板包括HERA、MAGE-3、凝血调节蛋白和细胞周期蛋白D1。首先使样品与针对HERA的标记探针接触。如果HERA的表达比对照低，则此试验表明肺癌的组织类型是间皮瘤。然而，如果表达高于或等于对照，使此样品与针对MAGE-3的探针接触。如果MAGE-3的表达低于对照，使此样品与针对细胞周期蛋白D1的标记探针接触可能确定为小细胞肺癌(SC)或腺癌(AD)。如果MAGE-3的表达高于或等于对照，使此样品与针对凝血调节蛋白的标记探针接触，可能确定为鳞状细胞癌(SC)或大细胞肺癌(LC)。
                           图1
在图2中，检测面板包括E-钙粘着蛋白、肺表面活性物质B(PulmonarySurfactant B)和凝血调节蛋白。首先，使样品与针对E-钙粘着蛋白的标记探针接触。如果E-钙粘着蛋白的表达低于对照，该试验表明肺癌的组织类型是间皮瘤(ME)。然而，如果表达高于或等于对照，使此样品与针对肺表面活性物质B的探针接触。如果肺表面活性物质B的表达低于对照，使此样品与针对凝血调节蛋白的标记探针接触，可能确定为鳞状细胞癌(SQ)或大细胞癌(LC)。如果肺表面活性物质B高于或等于对照，使此样品与针对CD44v6的标记探针接触，可能确定为腺癌(AD)和小细胞肺癌(SC)。(更多决策图的例子见图3和4)。
                           图2
Figure A0280975900332
                       图3
Figure A0280975900341
                       图4
一个较佳的方法包括使用分子标记物检测面板，在该面板中表达模式的差别得以分辨肺癌不同组织类型之间的差别。
可构建许多不同的决策图以分析标记物表达模式。这些信息可为医生或其它保健供应者所使用以做出对患者治疗的决定并选择最佳的治疗策略。
5.检测面板分析结果的报告
面板分析的结果可以几种方式报告。例如，结果可报告为简单的“是或不是”。或者，结果可报告为测试结果正确的机率。例如，检测面板研究的结果可能表明患者是否患有普通疾病。由于该面板还报告特异性和灵敏度，结果还可报告为患者患普通疾病的机率。辨别面板分析的结果将分辨特异性疾病之间的差别。其结果可报告为对于该特异性疾病是否存在的“是或不是”。或者，其结果可报告为特异性疾病存在的机率。还可能对一个患者的样品进行几种辨别面板分析，并报告存在的疾病是其它可能性的特异性疾病的机率范围。其它可能性也可包括假阳性。
在产生了各个特殊疾病存在的机率范围的实施例中，有几种可能的结果。例如，可能所有的可能性都是非常小的可能性。在这种情况下，医生可能推断患者的标本诊断为假阳性。还有可能除了一种可能性在80-90％以上外，所有的可能性都很低。在这种情况下，医生可能推断此试验证实患者患有显示高可能性的特殊疾病。还有可能大多数疾病的可能性都很低，但对于两种特殊疾病报告了相似的高可能性。假如这样的话，医生可建议更广泛的面板试验以确保鉴定出正确的疾病。另一种可能性是报告的所有疾病的可能性都很低，但其中一种梢高于其它却没有高到80-90％的范围。假如这样的话，医生可建议更广泛的面板试验以确保鉴定出正确的疾病和/或排除不同癌症类型的远处源发肿瘤的转移性癌症。
下面的实施例是本发明方法的说明，该方法用于选择疾病检测面板、疾病辨别面板、面板的验证和面板用于在临床中筛检选疾病和分辨不同疾病亚型当中的区别。选择肺癌用于这种说明性的例子，部分是因为它对于全球健康的重要性，但应理解根据前面通用的公开内容，相似的方法将应用于其它类型的癌症，以及传染病退行性疾病和自身免疫疾病。
                         说明性实施例
本方法用于开发肺癌检测面板以及一种肺癌类型特异性辨别面板。肺癌是多种疾病极为复杂的组合，可分为两个主要的类别。占全部肺癌大约70-80％的非-小细胞肺癌(NSCLC)可进一步细分为三种主要的组织类型，包括鳞状细胞癌、腺癌和大细胞癌。余下的20-30％的肺癌患者患有小细胞肺癌(SCLC)。另外，胸隔的恶性转移病可在暴露于石棉的个体中发展并常常广泛蔓延侵袭其它胸部结构。不同形式的肺癌倾向于定位在肺的不同区域，具有不同的预后，并对各种治疗形式反应不同。
根据世界卫生组织最新的统计(Globocan 2000)，肺癌已成为男人和妇女中最常见的致命性恶性肿瘤，估计每年有124万新的病例和110万人死亡。仅在美国，国家癌症研究所(National Cancer Institute)报道有大约186,000新的肺癌病例和每年162,000人死于这种疾病，占全部癌症相关死亡的25％。在美国，肺癌患者整体一年存活率是40％，然而仅14％活过5年。在世界的其它地区，5年存活率明显更低(英国为5％)。肺癌的高死亡率可归因于这样的事实，即大多数患者(85％)被诊断时已是癌症晚期，此时治疗选择有限且疾病可能已转移。在这些患者中，5年存活率在2-30％之间，取决于诊断时的阶段。这与患者获得早期诊断的病例形成强烈对比，其5年存活率大于75％。的确许多新的化学治疗制剂已引入临床应用以治疗晚期肺癌，迄今为止，没有一种制剂在长期存活上产生明显的改善。尽管早期疾病患者大概可能通过手术治愈，他们仍处在显著的危险中，因为他们具有产生第二次恶性肿瘤的高可能性。因此，对于肺癌患者，早期诊断和治疗随后进行积极的监控提供了获得长期存活率明显改进连同降低死亡率和费用的最好机会。
目前，被怀疑患有肺癌的患者或者是由于在X-光照片上见到可疑的病灶或者由于患者出现症状。结果，大多数患者被诊断患有相对晚期的疾病。另外，由于大多数方法对于早期疾病的检测缺乏足够的灵敏度，美国国家癌症研究所(NCI)、国家健康研究院最近的政策推荐对处在明显危险中的患者人群进行肺癌筛检测。然而，在本发明的这个实施例中，采用痰液细胞学提供的是相对无侵害性、更加有效和有成本效益的方法来早期检测肺癌。痰液细胞学的特异性较高。最近的研究表明有经验的细胞技术专家能够高度精确和可靠地识别恶性的或发育严重异常的细胞[10]。虽然当从患有相对晚期的疾病的患者中收集样品时，检出率高达80-90％[11，12]，总的来说，痰液细胞学30-40％灵敏度仅为[13，14]。鉴于获得和制备样品可能相对昂贵，痰液细胞学的低灵敏度特别重要。而且，不能检测到恶性肿瘤可能明显地延误治疗从而减少获得治愈的机会。
“处在危险中”人群的选择也能可影响痰液细胞学作为筛检工具的价值。处在显著危险中的个体包括先前诊断为肺癌的那些个体、长期吸烟者或从前的吸烟者(＞30包年)和长期接触石棉或肺部致癌物质的个体。具有遗传倾向或家族史的人也包括处在“危险”的人群中。这些个体很可能从检测中获益。虽然包括低危险性的个体可导致受检测病例绝对数量的增加，但将难以证明保健费用含大大增加。
对于常规痰液细胞学的较差性能有影响的其它因素包括病灶的位置、肿瘤大小、组织类型和样品的质量。鳞状细胞癌占所有原发肺肿瘤的31％。这些肿瘤的大多数发生在区段支气管产生并延伸到最接近的肺叶和远端亚区段分支[15]。由于这个原因，痰液细胞学在检测这些病灶中相当有效(79％)。最近，鳞状细胞癌被看作为肺癌的唯一类型，它在原位或射线方法不能检出阶段经得起细胞学检测[15]，由于脱落的细胞对于评价可能有用。在一项大的研究中，患者进行胸部X光照片和痰液细胞学随访，单靠细胞学检测出所有肺癌患者的23％，提示肿瘤处在早期并且射线方法检测不出[16]。在另一项研究中[17]，痰液细胞学检出76％患者是射线方法不能检出。
在腺癌情况下，70％的肿瘤发生于肺的外围，不太可能在常规痰液标本中发现恶性细胞。由于这一原因，用痰液细胞学腺癌较少被检测到(45％)[12，18，19]，一个重要的顾虑，因为腺癌的发病率似乎在增加，特别是在妇女中[20-22]。
肿瘤的大小也可影响获得正确诊断的可能性，当考虑用于无症状个体疾病检测的筛检测试时，该因素特别重要。虽然仅有50％的机会小于24mm的肿瘤将被读作真阳性，检测出较大病灶的机率超过84％[12]。
最近的报道也表明标本的细胞构成将影响痰液细胞学的灵敏度[14，23]。通常，鳞状细胞癌患者产生具有明显数量的肿瘤细胞标本，从而增加了正确诊断的可能性[14，23]。对于腺癌患者，据报道在痰液标本中存在肿瘤细胞在95％的标本中不到10％，在75％的标本中不到2％，使诊断明显地更加困难。
分化的程度也可影响病理学家检出恶性细胞的能力，特别是腺癌。分化良好的肿瘤细胞常常类似于非肿瘤性呼吸上皮细胞。在小细胞癌情况下，痰液样品常常含有具有独特外观的松散凝聚的细胞巢(nest)。然而，最近用于加工痰液样品的技术倾向于解聚细胞，使诊断更加困难。
样品质量是可造成痰液细胞学低灵敏度的另一个因素。最近的报道提出可能从70-85％受试者获得充足的样品。然而，获得成功的测定常常需要患者提供多个标本[13]。这一方法不方便、耗时并费用大。由于常常要求患者收集好几天标本，患者的顺从性通常也低。观察先前的吸烟者同样重要，虽然他们处在发生肺癌的明显危险中，但常常不能产生足够的标本。样品的保存和加工是另一个关键因素，可能影响痰液细胞学作为诊断试验的价值。
最后，即使能够获得充足的样品和最佳地制备，细胞技术专家一般要观察每个样品的2-4个玻片，每一玻片通常花费4分钟[24]。鉴于常规痰液细胞学的灵敏度低、技术复杂性高和劳动强度，毫不奇怪该试验作为肺癌早期检测的人群筛检几乎被普遍地否定[25]。
即使这些技术问题得到解决，痰液细胞学灵敏度仍是一个重要的问题。假阴性结果的频繁出现可大大延误患者接受潜在的有疗治疗。虽然有可能开发出具有较大灵敏度的试验，这种改进必须不会丧失特异性。假阳性结果数量的增加将使患者遭受不必要的、常常是侵害性的和费用高的随访、并将对患者的生活质量产生负面影响。本发明克服了与先前早期癌症检测方法相关的许多限制，包括与肺癌早期检测所用的痰液细胞学相关的那些限制。
肺癌是疾病的一种异质性集合体。为了确保试验具有必需水平的灵敏度和特异性以证明其作为人群筛检的用途，本发明预想采用，例如，10-30个细胞标记物的文库来开发检测面板。本发明文库的选择是根据相关科学文献的回顾和再分析，其中，在大多数情况下，检测取自肺癌患者的活组织中标记物的表达，并试图将表达与预后相联系。
例如，一种早期检测、特征鉴定、和/或监测患者痰液中肺癌的优选面板可包括分子标记物，在至少75％的肿瘤样品中该标记物表达的变化发生。一种典型的面板包括选自VEGF、凝血调节蛋白、CD44v6、SP-A、Rb、E-钙粘着蛋白、细胞周期蛋白A、nm23、端粒酶、Ki-67、细胞周期蛋白D1、PCNA、MAGE-1、粘蛋白、SP-B、HERA、FGF-2、C-MET、甲状腺转录因子、Bcl-2、N-钙粘着蛋白、EGFR、Glut-1、ER-相关的(p29)、MAGE-3和Glut-3的标记物。一种优选面板包括在85％以上肿瘤标本中发生变化的分子标记物。一种典型的面板包括选自Glut1、HERA、Muc-1、端粒酶、VEGF、HGF、FGF、E-钙粘着蛋白、细胞周期蛋白A、EGF受体、Bcl-2、细胞周期蛋白D1和N-钙粘着蛋白的分子标记物。除Rb和E-钙粘着蛋白外，肺癌诊断与标记物表达的增加相关。在下面的表4中提供了在本发明实施例中所用的探针/标记物文库的简要描述。注意到下表中抗体的编号与贯穿本实施例的抗体/探针/标记物的编号一致。
                                     表4：
                            用于肺部检测面板的探针和标记物
  编号   标记物简称   抗体探针的全称   靶标记物名称/描述
  1.   VEGF   抗-VEGF   血管内皮生长因子蛋白
  2.   凝血调节蛋白   抗-凝血调节蛋白   跨膜糖蛋白
3. CD44v6 抗-CD44v6   细胞表面糖蛋白(CD44 vanant 6基因)；细胞粘着分子
4. SP-A   抗-表面活性物质脱辅基蛋白a 肺部表面活性物质脱辅基蛋白
5. 成视网膜细胞瘤   抗-成视网膜细胞瘤基因产物 磷蛋白
  6.   E-钙粘着蛋白   抗-E-钙粘着蛋白   跨膜Ca++依赖性细胞粘着分子
7. 细胞周期蛋白A 抗-细胞周期蛋白A   细胞周期蛋白-依赖性激酶的蛋白质亚基；用于细胞周期调节
8. nm23 抗-nm23   由nm23-H1和H2基因产生的2个密切相关的蛋白质
  9.   端粒酶   抗-端粒酶   染色体修复的核糖核蛋白酶
  10.   Mib-1(Kl-67)   抗-Kl-67   在增殖性细胞中表达的核蛋白；
11. 细胞周期蛋白D1 抗-细胞周期蛋白D1   细胞周期蛋白-依赖性激酶的蛋白质亚基；用于细胞周期调节
  12.   PCNA   抗-增殖性细胞核抗原   DNA聚合酶δ的蛋白质辅助因子
  13.   MAGE-1   抗-黑色素瘤-相关抗原1   MAGE基因家族编码的细胞识别蛋白
14. 粘蛋白1(MUC-1) 抗-粘蛋白1   细胞表面和分泌的粘蛋白(高度糖基化蛋白)
15. SP-B   抗-成熟表面活性物质脱辅基蛋白B 肺部表面活性物质脱辅基蛋白
16. HERA   抗-人上皮细胞相关抗原(MOC-31) 细胞表面抗原(跨膜蛋白质)
  17.   FGF-2(碱性FGF)   抗-成纤维细胞生长因子   与细胞表面结合的蛋白质
18. c-MET 抗-MET   肝细胞生长因子(HGF)的跨膜受体蛋白
19. 甲状腺转录因子1 抗-TTF-1   甲状腺特异性基因的调节剂，也在肺中表达
  20.   BCL-2   抗-BCL-2   BCL2基因编码的胞内膜结合蛋白
  21.   P120   抗-P120   与增殖相关的核仁抗原蛋白
  22.   N-钙粘着蛋白   抗-N-钙粘着蛋白   跨膜Ca++依赖性细胞粘着分子
  23.   EGFR   抗-EGFR   表皮生长因子受体，跨膜糖蛋白
  24.   Glut1   抗-Glut1   葡萄糖转运，Glut家族的跨膜蛋白质
25. ER-相关(p29)   抗-ER-相关p29；抗-HSP27   与雌激素受体相关的p29蛋白；热休克蛋白27
  26.   Mage3   抗-黑色素瘤相关抗原3   MAGE基因家族编码的细胞识别蛋白
  27.   Glut3   抗-Glut3   葡萄糖转运，蛋白质的跨膜Glut家族
  28.   PCNA(较高稀释度)   抗增殖性细胞核抗原   DNA聚合酶δ因子的跨膜蛋白质
下文描述了该优选面板中的各个分子标记物。表5，列举了各型肺癌组织中标记物表达的百分比，在这一节的末尾给出。
葡萄糖转运蛋白(Glut1和Glut3)[26-28]
葡萄糖转运蛋白1(Glut1)和葡萄糖转运蛋白-3(Glut3)是一种遍在性表达的高亲合力葡萄糖转运蛋白。肿瘤细胞常常显示比正常细胞高的呼吸率、葡萄糖吸收和葡萄糖代谢，并且认为肿瘤细胞中葡萄糖摄入的提高由葡萄糖转运蛋白所介导。已报道在肺癌中某些类型的GLUT同工型过量表达。Glut1的细胞定位在细胞膜上。GLUT-1和GLUT-3是用于疾病检测的标记物。
恶性细胞显示葡萄糖摄入增加，这似乎是由葡萄糖转运蛋白(Glut)家族所介导。致癌基因和生长因子似乎可调节这些蛋白的表达以及它们的活性。蛋白质Glut家族的成员在不同的人体组织中显示不同模式的分布，并且快速增殖常常与它们的过量表达相关联。最近证据提示Glut1是由大百分率的NSCLC和大多数的SCLC表达的。
虽然在NSCLC和SCLC中Glut3的表达相对低，相当比率(39.5％)的大细胞癌表达此蛋白质。在I期肿瘤中，在25％的病例中83％的肿瘤以75-100％的细胞染色水平表达Glut1。这些数据提示在肿瘤发展过程中Glut1的过量表达是相对早的事件。在＞90％的II期和IIIA期癌症中还检测了Glut1的免疫反应性。在Glut1和Glut3的免疫反应性和肿瘤分化之间还显示出逆相关。表达高水平的Glut1的肿瘤似乎特别具有攻击性，这与不良预后相关联。如果肿瘤的此蛋白质为阴性，可观察到更好的存活率。
人上皮相关抗原(HERA)[29，30]
HERA是一种目前尚未知其功能的跨膜糖蛋白。HERA存在于大多数正常和恶性上皮上。最近的报道提示在NSCLC的所有组织类型中HERA表达很高，使之可以用做检测标记物。相反，在间皮瘤中缺乏HERA表达，因此提示它具有作为辨别标记物的用途。HERA的细胞定位在细胞表面。
碱性成纤维细胞生长因子(FGF)[31-34]
碱性成纤维细胞生长因子(FGF)是一种对肝素和其它氨基葡聚糖具有高度亲合力的多肽生长因子。在癌症中，FGF行使强促细胞分裂原功能，在血管生成、分化和增殖中起作用，并参与肿瘤的发展和转移。FGF的过量表达常发生于SCLC和鳞状细胞癌中。在许多病例中(62％)，细胞还表达FGF受体，提示存在一种自分泌环。48％的1期肿瘤过量表达FGF。II期肺癌FGF的频率为84％。生长因子或其受体的表达与不良预后相关。那些I期疾病患者、表达FGF5年存活率为73％，相对于那些FGF阴性的患者5年存活率为80％。细胞定位在细胞膜。
端粒酶[35-42]
端粒酶是一种核糖核蛋白酶，它延伸和保持真核染色体的端粒。它包含具有逆转录酶活性的催化蛋白质亚基和具有逆转录酶活性的RNA亚基以及用做端粒延伸的模板的RNA亚基。不表达端粒酶的细胞随着每次细胞分裂具有相继缩短的端粒，这最终导致染色体不稳定、老化和细胞死亡。端粒酶的细胞定位是核。
端粒酶的表达似乎发生在无限增殖化的细胞中，并且酶的活性是恶性表型的共同特征。大约80-94％的肺癌显示高水平的端粒酶活性。另外，71％的化生、80％的组织转化和82％的发育异常表达酶活性。所有的原位癌(CIS)标本显示酶活性。在恶化前组织中低水平的表达可能与样品中仅少量的细胞(5和20％)表达酶活性的事实相关。这与肿瘤中20-60％的细胞可表达酶活性形成对比。根据样品有限的数量，将出现端粒酶活性的表达在SCLC中也是常见的。
增殖性细胞核抗原(PCNA)[43-51]
PCNA行使DNA聚合酶δ的辅助因子功能。PCNA在细胞周期的S期和与DNA修复相关的DNA合成期中表达。PCNA在广泛的正常和恶性组织的增殖细胞中表达。PCNA的细胞定位为细胞核。
PCNA的表达是快速分裂细胞的共同特征并在98％的肿瘤中检测到。免疫组织化学染色是在83％的NSCLC中检测到中到强染色的细胞核。在51％的p-53-阴性肿瘤中观察到强PCNA染色。然而，当PCNA(＞50％的细胞染色)和p53都过量表达时(＞10％的细胞染色)，预后倾向于在更短的发展时间里更差。虽然PCNA常在肺癌的所有阶段中检测到，但在转移性疾病中更常见强染色。31％的CIS也过量表达PCNA。
CD44[51-58]
CD44v6是一种作用为细胞粘着分子的细胞表面糖蛋白。它在上皮、间皮和造血组织的广范正常和恶性细胞中表达。已显示在某些人恶性肿瘤中特异性CD44的剪接变体的表达与转移和不良预后相关。预计它可用于鳞状细胞癌和腺癌之间的检测和辨别。CD44是一种细胞粘着分子，似乎在肿瘤入侵和转移中起作用。另一种剪接导致几个变体同工型的表达。通常在SCLC中缺乏CD44表达，在NSCLC中不定表达。最高水平的表达发生于鳞状细胞癌，因此其在肿瘤类型之间的辨别中具有价值。在非肿瘤的组织中，在支气管上皮细胞、巨噬细胞、淋巴细胞和肺小泡细胞(alveolar pneumocyte)中观察到CD44染色。在CD44表达和肿瘤分期、复发或存活率之间没有明显的相关性，特别是当过量表达发生于疾病早期时。在转移性的病灶中，100％的鳞状细胞癌和75％的腺癌显示CD44v6强阳性。这些数据倾向于表明CD44表达的变化发生在肿瘤发展的相对晚期，这限制了其作为早期检测标记物的价值。最近的发现提示CD44v8-10变体由大部分的NACLC表达，使之可能成为候选的标记物。
细胞周期蛋白A[59-62]
细胞周期蛋白A是在细胞周期的特定时期控制转变点的细胞周期蛋白-依赖性激酶(CDK)的调节性亚基。在S期和在向G2期发展的过程中可检测到它。细胞周期蛋白A的细胞定位是细胞核。
含有细胞周期蛋白和细胞周期蛋白依赖性激酶的蛋白质复合体具有调节细胞周期进程的功能。细胞周期蛋白表达的变化与影响CCDN1基因的遗传改变相关。虽然细胞周期蛋白起调节分子的作用，细胞周期蛋白-依赖性激酶细胞周期蛋白作为活化和灭活Rb的催化亚基。
免疫组织化学分析揭示细胞周期蛋白的过量表达与Ki-67高标记指数所表明的细胞增殖的提高有关。细胞周期蛋白的过量表达发生于75％的NSCLC中并似乎发生在肿瘤进程的相对早期。最近的报道表明66.7％的I/II期和70.9％的III期肿瘤过量表达细胞周期蛋白A。在不良分化的肿瘤中核着色是普遍的。细胞周期蛋白A的表达常常与平均存活时间减少和产生抗药性倾向相关。然而，表达的增加还与对阿霉素的较大反应相关。
细胞周期蛋白D1[63-73]
细胞周期蛋白D1，与细胞周期蛋白A一样，是控制细胞周期特定时期转变点的细胞周期蛋白-依赖性激酶(CDK)的调节亚基。细胞周期蛋白D1调节细胞进入细胞周期的S期。在大范围的人类恶性肿瘤中该基因常被扩增和/或其表达下调。细胞周期蛋白D1的细胞定位是细胞核。
和细胞周期蛋白A一样，细胞周期蛋白D1行使调节细胞周期进程的功能。细胞周期蛋白D1的着色主要是细胞质与组织类型无关。报道提示细胞周期蛋白D1的过量表达发生于40-70％的NSCLC和80％的SCLC中。在37.9％的I期60％的II期和57.9％的III期肿瘤中观察到细胞周期蛋白D1着色。细胞周期蛋白D1的表达还见于发育异常和化组织中，提供了这些变化发生于肿瘤进程相对早期的证据。过度表达细胞周期蛋白D1的患者显示较短的平均存活时间和较低的5年存活率。
肝细胞生长因子受体(C-MET)[74-77]
C-MET是一种编码用于HGF的跨膜受体酪氨酸激酶的原癌基因。HGF是肝细胞和内皮细胞的一种促有丝分裂原，并对几种上皮细胞起源类型的细胞发挥多效(pleitrophic)活性。C-MET的细胞定位是细胞表面。
肝细胞生长因子/扩散因子(HGF/SF)刺激广谱的上皮细胞，引起它们增殖、移动和进行包括血管生成的复杂分化过程。HGF/SF结合由c-MET致癌基因编码的受体。尽管正常和恶性组织都表达HGF受体，HGF/SF的表达似乎局限于恶性组织。
尽管人肺通常表达低水平的HGF/SF，但在NSCLC中表达明显增加。采用蛋白质印迹分析，88.5％的肺癌显示此蛋白质表达增加。所有组织类型的肿瘤都以增加的浓度表达此蛋白质。尽管蛋白质水平的增加发生于疾病的所有阶段，最近的证据提示除癌细胞外，基质细胞和/或炎性细胞可能产生此生长因子。
粘蛋白(Mucin)-MUC-1[78-82]
粘蛋白-1来自高度糖基化的分泌蛋白家族，该家族包括的主要蛋白成分为包被和保护气管支气管树、胃肠道和泌尿生殖道的粘液凝胶。粘蛋白-1在上皮性肿瘤中非典型地表达。粘蛋白-1的细胞定位是细胞质和细胞表面。
粘蛋白是一种高分子量的糖蛋白家族，由多种分泌性上皮细胞合成，有膜结合性或分泌性。在呼吸道内，这些蛋白质形成包被和保护气管支气管树的粘液凝胶。粘蛋白表达的变化常发生于包括肺癌的恶性转移结合处。现存的证据表明这些变化可作用于细胞生长调节的改变、免疫系统的识别和肿瘤的转移潜力。
虽然正常肺组织表达MUC-1，但发现在具有最高水平腺癌发生的肺癌中有明显较高水平的表达。着色似乎与疾病期无关，在吸烟者中比在先前吸烟者或不吸烟者中更常见。一些恶变前病灶也显示出MUC-1表达增加。
甲状腺转录因子-1(TTF-1)[83-84]
TTF-1属于同源域转录因子家族，能活化甲状腺特异性和肺特异性分化基因。TTF-1的细胞定位是细胞核。
TTF-1是一种最初发现能介导甲状腺球蛋白转录的蛋白质。最近，在间脑和细支气管小泡上皮细胞中也发现了TTF-1的表达。在肺中，TTF-1功能是作为调节表面活性物质蛋白和克拉拉分泌蛋白合成的转录因子。TTF-1的过量表达发生于大部分的肺腺癌中并可能有助于鉴别原发肺癌和转移到肺的癌。可检测到表达TTF-1并具细胞角蛋白7阳性和细胞角蛋白20阴性的腺癌，灵敏度95％。
血管内皮生长因子(VEGF)[33-，61，85-89]
VEGF在血管发生中起重要作用，它促进肿瘤发展和转移。有多种形式的VEGF；两种较小的同工型是分泌蛋白并起扩散剂作用，而较大的两种保持与细胞联接。VEGF的细胞定位是细胞质、细胞表面和胞外基质。
血管内皮生长因子(VEGF)是一种重要的新血管生成因子和内皮细胞特异性促有丝分裂质。新血管生成是癌发生后期、肿瘤发展中的重要过程，在产生远距离转移中特别重要。VEGF能与常常存在于表达生长因子的肿瘤中的特异性受体Flt结合，提示存在一种自分泌环。
免疫组织化学分析揭示表达VEGF的细胞显示扩散性和细胞质着色模式。虽然非肿瘤细胞不表达，VEGF存在于大部分的NSCLC和较小比例的SCLC中。一些报道显示在早期肺癌中有高水平的VEGF。
VEGF的表达与转移频率的增加相关。研究显示VEGF表达表明腺癌(但不是鳞状细胞癌)不良预后和较短的无病间隔。与低水平VEGF组3年和5年存活率分别为90.9和77.9％相比较，表达高水平VEGF的组3年和5年存活率为50％和16.7％。
表皮生长因子受体(EGFR)[90-104]
表皮生长因子受体(EGFR)是一种跨膜糖蛋白，它能被各种配体结合并活化。结合启动了一系列事件导致DNA合成、细胞增殖和细胞分化。已证明EGFR存在于广谱的正常组织中，并发现在各种肿瘤中有EGFR的量表达。肺腺癌和大细胞癌(而非-小细胞肺癌)中观察到其表达增加。EGFR的细胞定位是细胞表面。
EGFR在细胞生长和分化中起重要作用。EGFR均一地存在于表皮细胞层，但不存在于组织学正常的支气管上皮的表层。由于这个例外，正常组织不会均一着色。最近的证据提示EGF受体的过量表达对于侵入性肺癌的发展不是绝对必要的条件。然而，似乎在EGFR发生过量表达的情况下，这是一个在更多晚期疾病中具有较强的染色强度的相对早期事件。
对于患有侵入性癌的患者，肿瘤的EGF着色为50-77％。EGFR的过量表达在鳞状细胞癌中比在腺癌中更常见并且在SCLC中常见。最高水平的EGFR发生在晚期和转移性疾病结合处，其水平约为I/II期肿瘤中见到的EGFR浓度的两倍。这些评价提示在I期肿瘤中观察到的EGFR水平大约为正常组织中见到的两倍。另外，48％的支气管病灶也显示EGFR着色，包括组织转化、非典型、发育异常和CIS。在这些相同的癌症患者“正常的”支气管粘膜中，，39％的病例观察到EGFR过量表达，但是在非癌症的支气管上皮中未见到EGFR过量表达。另外，发生EGFR的过量表达在吸烟者的肿瘤中比不吸烟者中更为频繁，特别是在鳞状细胞癌中。
尽管几项研究提示EGFR的过量表达与不良预后相关联，其它的研究未能获得这一相关性。
二磷酸核苷激酶/nm23[105-111]
二磷酸核苷激酶(NDP激酶)/nm23是一种二磷酸核苷激酶。具有高度转移潜力的肿瘤细胞常常缺乏或仅少表达的nm23蛋白质，所以nm23蛋白被描述为转移抑制蛋白。nm23的细胞定位是核和细胞质。
nm23/二磷酸核苷/激酶A(nm23)的表达是肿瘤进殿的一个标志，其中在表达和转移潜力之间具有反相关。如果I期肿瘤过量表达nm23，在平均35个月的随访中没有见到转移的证据。免疫组织化学分析揭示染色是扩散的、细胞质的和通常局限于恶性细胞。肺泡巨噬细胞也表达此蛋白质。鉴于其高水平表达与低转移潜力相关，目前还不能解释为什么正常上皮细胞不表达nm23。
在高比率的NSCLC中，特别是大细胞肺癌和74％的SCLC中观察到强烈染色，提示该蛋白质在肿瘤进展中起重要作用。除鳞状细胞癌外，染色强度似乎随病期的发展而增高。根据可得到的证据，似乎nm23在SCLC和NSCLC中都是预后因子。
Bcl-2[101-，112-125]
Bcl-2是一种在调亡抑制中起中心作用的线粒体膜蛋白。Bcl-2过量表达是程序性细胞死亡受抑制的细胞的共同特征。Bcl-2的细胞定位是细胞表面。
Bel-2是被认为在促进细胞的最终分化、延长非-周期细胞(non-细胞周期蛋白g cell)存活和阻抑周期细胞凋亡中起作用的一种原癌基因。Bcl-2可能作为同型二聚体存在或可形成具有Bax的异质二聚体。作为一种同型二聚体，Bax行使诱导凋亡的功能。然而，Bax-bcl-2复合体的形成阻抑了细胞凋亡。通过阻抑凋亡，bcl-2表达似乎向受疾病侵袭的细胞提供了存活优势。Bcl-2表达也可在抗药性发展中起作用。Bcl-2的表达受p53的负调节。
bcl-2的免疫组织化学分析揭示细胞质染色为异质模式。在腺癌中，bcl-2的表达明显地与较小肿瘤(＜2cm)和较低的增殖活性相关。大百分率的SCLC中，bcl-2的表达似乎与神经内分泌分化和发生更加密切相关。
肿瘤前病灶中不存在Bcl-2的过量表达，提示bcl-2的变化在肿瘤发展进程中发生得相对较晚。除肿瘤细胞外，bcl-2的免疫染色也发生于基底细胞中和正常细支气管的腔(luminal)表面，但在更多的分化的细胞类型中通常检测不到。
在NSCLC中bcl-2免疫反应性与改进的预后相关是有争议的。一些报道提出虽有表达bcl-2的肿瘤的患者具有良好的预后并且复发需要更长的时间。一些报道表明bcl-2的表达在患有转移性疾病的患者中倾向于降低。对鳞状细胞癌患者，bcl-2的表达与5年存活率的改善相联系。然而，在三个较大规模的研究中没有将存活着处与bcl-2表达相关联，特别是对早期疾病患者。
雌激素受体-相关蛋白(p29)[126]
ER相关蛋白p29是一种发现与雌激素受体的表达相关的雌激素-相关热休克蛋白。p29的细胞定位是细胞质。
雌激素依赖性细胞内加工在正常组织的生长调节中很重要并可能在恶性肿瘤的调节中起作用。在一项研究中，111个肺癌有109个肺癌检测到(98％)p29的表达。p29表达和存活时间之间的关系对于男人和女人是不同的。p29的表达与较差的存活相关，特别是在I和II期疾病的妇女中。在男人中，p29表达与长期存活之间没有相关性。
成视网膜细胞瘤基因产物(Rb)[68，73，123，127-141]
成视网膜细胞瘤基因产物(Rb)是一种核DNA-结合磷蛋白。磷酸化的Rb能结合DNA肿瘤病毒的癌蛋白以及基因调节蛋白从而抑制DNA的复制。Rb蛋白可能通过调节转录起作用；Rb功能的丧失导致失控的细胞生长。Rb的细胞定位是核。
成视网膜细胞瘤蛋白(pRb)是一种由成视网膜细胞瘤基因编码的蛋白质并以细胞周期依赖方式磷酸化和脱磷酸化。认为PRb是在G0/G1期行使调节细胞周期功能的一种重要的肿瘤抑制基因。在其高磷酸化(hypophosphorylated)状态中，pRb能抑制从G1向S期的转变。在G1期中，当细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)磷酸化此蛋白时，发生pRb的生长抑制特性的失活。pRb的高磷酸化(hyperphosphorylation)阻止其形成具有E2F的复合体，该复合体功能是作为DNA合成所需要的转录因子蛋白。
已在不同类型癌症中证明成视网膜细胞瘤(Rb)基因的失活，包括肺癌。小细胞癌不能对pRb染色表明Rb功能丧失。总的说来，17.6％的肿瘤不能表达pRb，与关于病期或结节状况报见的无相关性。在31％发育异常的支气管活组织检查中也见到染色的减少。然而，似乎在pRb表达和发育异常的严重程度之间没有相关性。相反，取自临近肿瘤区域的正常支气管上皮和细胞表达了pRb阳性核。这些数据提示Rb蛋白表达的改变可能发生在某些肺癌发展的早期。
Rb阳性的癌患者倾向于具有略微良好的预后，但是在大多数研究中此差异并不明显。然而，腺癌患者，其肿瘤是pRb阴性和或者p53ras阳性，显示5年存活率下降。鳞状细胞癌中没有出现相似的关系。已报道pRb阴性肿瘤比Rb阳性肿瘤更可能显示对阿霉素的抗性。
凝血调节蛋白[142-147]
凝血调节蛋白是一种跨膜糖蛋白。通过它加速蛋白质C的活化(进而通过结合蛋白质S和凝血酶起抗凝血剂)，TM的合成是减少内皮细胞表面凝块形成的几种重要机制之一。凝血调节蛋白的细胞定位是细胞表面。
循环性肿瘤细胞凝聚宿主血小板似乎在转移过程中起重要作用。凝血调节蛋白通过凝血酶在活化抗凝血剂蛋白C中起着重要作用是血管内凝血的重要调节剂。除了在正常鳞状上皮中表达外，凝血调节蛋白的表达也发生在鳞状上皮组织转化、原位癌、和侵入性鳞状细胞癌中。虽然存在于74％的源发鳞状细胞癌中，只有44％的转移性病灶对凝血调节蛋白着色。这些数据提示，随着癌症的发展，凝血调节蛋白的表达下降。当与分化不良的肿瘤相比时，较高水平的表达倾向于发生在良好和中度分化的肿瘤中。
凝血调节蛋白-阴性鳞状细胞癌患者倾向于具有更差的预后。18％凝血调节蛋白-阴性患者拥有5年存活率，与之相比，此蛋白质染色阳性的肿瘤病例5年存活率为60％。发展成为转移性疾病在凝血调节蛋白-阴性肿瘤中也更常见(69％比37％)这些肿瘤发展到胸部外(extrathorasic)的倾向更大。因此，鳞状细胞癌病例丧失凝血调节蛋白表达似乎是预兆性的。观察凝血调节蛋白表达的变化发生于NSCLC的晚期并且是正常支气管上皮细胞表达此蛋白质这将倾向于限制其作为早期检测标记物的用途。然而，由于大部分间皮瘤和仅一小部分腺癌表达凝血调节蛋白，该标记物具有辨别这两种肿瘤类型的潜在用途。
E-钙粘着蛋白和N-钙粘着蛋白[148-151]
E-钙粘着蛋白是一种跨膜Ca2+依赖性细胞粘着分子。它通过控制组织结构和保持组织完整性的机制在细胞的生长和发育中起重要作用。E-钙粘着蛋白促进上皮细胞的细胞间粘着、上皮极化的建立、腺体分化和层化。已在许多癌瘤中观察到E-钙粘着蛋白表达下调并通常与晚期和进程相关。E-钙粘着蛋白的细胞定位是细胞表面。
E-钙粘着蛋白是一种钙依赖性上皮细胞粘着分子。E-钙粘着蛋白表达的下降与肿瘤去分化和转移以及存活率降低相联系。在中度分化和分化差的鳞状细胞癌和SCLC中观察到其表达下降。腺癌中E-钙粘着蛋白表达没有变化。而且，虽然腺癌表达E-钙粘着蛋白，但这些肿瘤不能表达N-钙粘着蛋白，这与间皮瘤表达N-钙粘着蛋白而不表达E-钙粘着蛋白相反。因此，这些标记物可用于分辨腺癌和间皮瘤之间的差别。
E-钙粘着蛋白的表达还可用于评估鳞状细胞癌患者的预后。其中60％的表达E-钙粘着蛋白的肿瘤患者存活了3年，仅36％的显示表达降低的患者存活了3年。
MAGE-1和MAGE-3[152-156]
黑色素瘤抗原-1(MAGE-3)和黑色素瘤抗原-3(MAGE-3)是在正常组织中通常沉默但在恶性肿瘤中表达的一个基因家族的成员，可为自身指向肿瘤的特异性细胞毒T细胞(CTLV’s)所识别。MAGE-1和MAGE-3的细胞定位是细胞质。
MAGE-1、MAGE-3和MAGE-4基因产物是可为细胞毒T淋巴细胞所识别的肿瘤相关抗原。如此，它们在NSCLC中可用做免疫疗法的靶标。一些SCLC也表达MAGE蛋白，但正常细胞不表达。当MAGE表达的频率下降至低于用做检测标记物所必需的水平时，组织类型之间表达模式的差别提示MAGE表达可用作辨别标记物。这一用途还得到如下观察的支持，即50％的鳞状细胞癌中超过90％的肿瘤细胞显示出的MAGE-3过量表达的证据，30％的肿瘤在至少50％的细胞中显示其过量表达。
核仁蛋白(p120)[157]
p120(与增殖相关的核仁抗原)见于G1早期快速增殖细胞的核仁中。P120的细胞定位是核。
核仁蛋白p120是一种其功能尚未阐明的与增殖相关的蛋白质。在肿瘤的组织中检测到强染色，但在巨噬细胞和正常组织中没有检测到。p120的过量表达在鳞状细胞癌中比在腺癌或大细胞癌中更加常见，提出了这一标记物可用于辨别肿瘤类型的可能性。
肺表面活性物质[83，158-166]
肺表面活性物质是一种富含磷脂的混合物，其功能是减小肺泡-液体界面上的表面张力，因此提供了换气所必需的肺泡稳定性。表面活性物质蛋白似乎专门在气道中表达，由肺泡II型细胞产生。非肿瘤性肺中，在正常和化生的肺泡II型细胞和一些无纤毛支气管上皮细胞中检测到原-表面活性物质-B的免疫反应性。60％的腺癌的10-50％肿瘤细胞含有强的细胞质免疫反应性显大部分染色。对于原-表面活性物质-B鳞状细胞癌和大细胞癌不能染色。
表面活性物质脱辅基蛋白B(SP-B)是组成肺表面活性物质的四种疏水性蛋白质之一，是由II型肺泡细胞分泌的磷脂和蛋白质的复合物。肺鳞状细胞和大细胞癌以及非肺部腺癌不表达SP-B。SP-B的细胞定位是细胞质。
SP-A是一种肺表面活性物质蛋白，在吐气结束时防止肺泡塌陷中具有重要作用。SP-A是肺泡上皮细胞(II型呼吸细胞(pneumocyte))唯一的分化标记物；即使在肿瘤状态下该抗原也被保存。SP-A的细胞定位是细胞质。
肺部表面活性物质A似乎比粘蛋白性类型对100％染色的非粘蛋白性支气管肺泡癌具有特异性。肺表面活性物质潜在地具有辨别肺癌与其它肺部转移癌症的用途。除肿瘤细胞外，对肺表面活性物质A非肿瘤性呼吸细胞也着色。对于肺表面活性物质A用肺表面活性物质B染色在腺癌中相对常见，但在其它形式的NSCLC或SCLC中不常见。间皮瘤也不能表达肺表面活性物质A，导致有人提出肺表面活性物质A可能具有辨别腺癌和间皮瘤的用途。
Ki-67
Ki-67是一种在增殖性正常细胞和肿瘤细胞中表达并在休眠细胞中下调的核蛋白。它存在于细胞周期的G1、S、G2和M期，但不存在于Go期。通常用做增殖的标记物。Ki-67的细胞定位是核。
                                     表5：
标记物     鳞状细胞癌 腺癌     大细胞癌     小细胞癌 间皮瘤
  Glut1     100.0+     64.5     80.5     64.0     NDA*
  Glut3     17.5     16.0     39.5     9.0     NDA*
  HERA     100.0     100.0     100.0     NDA     4.5
  碱性FGF     83.0     48.7     50.0     100.0     NDA
  端粒酶     82.3     86.3     93.0     66.7     NDA
  PCNA     80.0     69.8     87.7     51.0     NDA
  CD44v6     79.3     34.8     44.2     0.0     NDA
  细胞周期蛋白A     79.0     68.0     83.5     97.0     NDA
  细胞周期蛋白D     42.7     36.0     62.0     90.0     NDA
  肝细胞生长因子/扩散因子     75.5     78.3     100.0     NDA     100.0
  MUC-1     55.5     90.0     100.0     100     NDA
  TTF-1     38.0     76.0     NDA     83.0     NDA
  VEGF     61.8     68.3     100.0     43.5     NDA
  EGF受体     63.1     45.3     96.0     频繁     NDA
  Nm23     68.0     52.6     83.5     73.5     NDA
  Bcl-2     45.5     43.3     42.5     92.0     NDA
  PRb表达的缺失     20.1     25.8     35.4     85.3     NDA
  凝血调节蛋白     66.8     12.2     4.0     0.0     81.0
  E-钙粘着蛋白     69.0     85.0     NDA     100.0     0.0
  N-钙粘着蛋白     NDA     4.0     NDA     NDA     94.0
  MAGE1     45.0     35.0     NDA     16.5     NDA
  MAGE3     72.0     33.3     NDA     33.5     NDA
  MAGE4     45.5     11.0     NDA     50.0     NDA
  核仁蛋白(p120)     68.0     35.0     30.0     NDA     NDA
  肺表面活性物质B     0.0     61.5     0.0     NDA     NDA
  肺表面活性物质A     12.0     52.9     17.5     20     0.0
+显示标记物表达变化的肿瘤百分比
*没有获得数
a.获得适当大小的标记物文库
为了获得与肺癌相关的适当大小的标记物文库需要初步的删减步骤。在文献中已知一百多个与肺癌相关的标记物。文献中鉴定的和评估的可能包含在面板实验中的候选探针的部分列表包括针对：bax、Bcl-2、c-MET(HGFr)、CD44S、CD44v4、CD44v5、CD44v6、cdk2激酶、CEA(癌胚抗原)、细胞周期蛋白A、细胞周期蛋白D1(bcl-1)、E-钙粘着蛋白、EGFR、ER-相关(p29)、erbB-1、erbB-2、FGF-2(bFGF)、FOS、Glut-1、Glut-2、Glut-3、Glut-4、Glut-5、HERA(MOC-31)、HPV-16、HPV-18、HPV-31、HPV-33、HPV-51、整合蛋白VLA2、整合蛋白VLA3、整合蛋白VLA6、JUN、角蛋白、角蛋白7、角蛋白8、角蛋白10、角蛋白13、角蛋白14、角蛋白16、角蛋白17、角蛋白18、角蛋白19、A-型核纤层蛋白(A；C)、B-型核纤层蛋白(B1；B2)、MAGE-1、MAGE-3、MAGE-4、黑色素瘤相关抗原克隆NKI/C3、mdm2、mib-1(Ki-67)、粘蛋白1(MUC-1)、粘蛋白2(MUC-2)、粘蛋白3(MUC-3)、粘蛋白4(MUC-4)、MYC、N-钙粘着蛋白、NCAM(中性细胞粘着蛋白)、nm23、p120、p16、p21、p27、p53、p-钙粘着蛋白、PCNA、成视网膜细胞瘤、SP-A、SP-B、端粒酶、凝血调节蛋白、甲状腺转录因子1、VEGF、波形蛋白和waf1的抗体。通过文献的初出评估检测早期癌细胞中探针的表观效果、不同癌症状态细胞之间的差别和对靶癌细胞的定位标记，对最初的标记物名单作了删减。该标记物名单通过除去一些标记物作进一步删减，这些标记物利用将难以还源为实践，因为它们难以产生或获得，具有不适当的检测技术需求或报道的结果再现性很差。完成了所有的删减步骤后，获得了一个27个标记物的文库。
b.优化方案和获得金标准肺癌样品
获得检测面板前还需要初步的制备步骤。从端口卖主获得含有适当标记物的探针。分析探测的方案用于以优化客观定量检测。例如，测定出PCNA的浓度太低。起初，PCNA以S809缓冲液作1∶4000稀释。进行第二次稀释，以S809作1∶3200稀释。各个标记物的最佳方案见以下表中。注意第二栏目为“抗体名称”。除了MOC-31外，这一列表中的探针是以标记物名称列出，因为许多供应商以标记物名称平抗体。注意这些试剂可能以另一种方式列出，例如，抗VEGF、抗-凝血调节蛋白、抗-CD44v6等。
从UCLA获得金标准组织标本。从两个来源获得组织标本。病例采用标准方法进行诊断，包括观查苏木精和曙红(H&E)染色的玻片以及病史。用任意数字编码和标记标本玻片，以使作研究的病理学家看不到病史诊断和抗体标记物以及保护患者的隐私。
采用载有癌和非癌(对照)组织的组织切片的标本玻片。分析了总共175个不同病例。在这一组中，位于表6中的如下诊断具有以下的发生频率：
                   表6：
    诊断     发生的病例数
癌症     腺癌     25
    大细胞癌     18
    间皮瘤     26
    小细胞肺癌     20
    鳞状细胞癌     24
对照     肺气肿     34
    肉芽肿性疾病     3
    间质性肺病     25
c.分子标记物检测面板表达水平的测定
制备了各病例足够的标本玻片，这样每个玻片中仅检测一个探针。通常，制备含有细胞样品的显微镜载片，使该细胞样品与一个或多个针对具体分子标记物的标记探针接触。每项研究的病理学家独立地检查H&E染色的载玻片作出各病例的诊断，然后检查各个与探针反应的和免疫化学染色的载玻片以评估探针结合的水平，在标准化数据的表格上记录结果。
更详细地，在甲醛固定、石蜡包埋(FFPE)的组织上进行免疫组织化学染色。在用聚-L-赖氨酸覆盖的载玻片上将组织切片切成4微米厚，室温干燥过夜。组织切片的脱去石蜡和复水如下进行：为了完全除去标本的所有包埋介质，将载玻片在两次连续的二甲苯-替代物(Histoclear)水浴中培育各5分钟。在于两次连续的100％试剂级的乙醇水浴培育各3分钟前拍去载玻片上所有的液体。在两次95％的试剂级乙醇最终水浴中培育各3分钟前再次拍去载玻片上所有过多的液体。经过最后一次95％乙醇水浴之后，用自来水冲洗载玻片并保存于洗涤缓冲液中(含有0.05％Tween 20的Tris-缓冲盐洗涤缓冲液，相当于1∶10稀释的DAKO自染色仪(Autostainer)洗涤缓冲液，编码S3306)。下表7给出用于本研究的试剂的完全名单以及相应的产物编码。本研究中使用的检测系统是DAKO EnVision+HRP小鼠(编码K4007)或家兔(编码K4003)和LSAB+HRP(编码K0690)。根据包装说明书进行免疫试验方案。该试剂盒含有两种液体成分DAB+底物生色原(编码K3468)。
                    表7：
MonoGen研究中使用的试剂
试剂     编码#
国家诊断HistoClear     HS-200
Mallinckrodt Reagent AlchoholAbsolute     7019-10
DAKO抗体稀释剂     S809
DAKO本底降低账抗体稀释剂     S3022
DAKO自动染色仪缓冲液10X     S3306
DAKO靶再生溶液     S1700
DAKO高pH靶再生溶液     S3307
DAKO蛋白酶K     S3020
Rite辅助过氧化氢3％     无
DAKO蛋白质不含阻遏血清     X0909
DAKO山羊血清     X0501
DAKO猪血清     X0901
DAKO EnVision+小鼠     K4007
DAKO EnVision+家兔     K4003
DAKO LSAB+     K0690
DAKO DAB+     K3468
DAKO苏木精     S3302
Dakomount封固剂     S3025
仪器     序列号
DAKO自动染色仪(Autostainer)     3400-661303
    3400-6142R-03
自动染色仪IHC V3.0.2版软件
预处理在优化肺组织上的这些抗体中是关键的。由于抗体需要酶消化，在室温下使用DAKO蛋白质酶K(编码S3020)5分钟。需要诱导的靶再生抗体采用DAKO靶再生溶液(编码S1700)或DAKO高pH靶再生溶液(编码S3307)作预处理。将组织放置于预热的靶再生溶液中并在95℃水浴中培育20或40分钟(取决于具体的方案)。然后使组织切片在室温下冷却20分钟。
脱去石蜡、复水和组织预处理后，将所有的标本培育在3％过氧化氢溶液中以粹灭内源性过氧化物酶活性。为了尽可能减少非特异性本底，对于两种抗体FGF和端粒酶特别采用了封闭试剂。
如表8中所示，将组织标本与200微升最佳稀释的第一抗体一起培育特定的时间。注意表8中标记物/抗体的编号与贯穿本文的抗体探针和标记物的编号一致。然后以DAKO 1X自动染色仪缓冲液(编码S3306)洗涤载玻片。根据抗体，采用正确的检测系统。用于DAKO EnVision+HRP和LSAB+HRP检测系统的步骤和总培养时间显示于下文表9中。采用3，3’-二氨基联苯胺(DAB)进行显色反应，在反应部位产生棕色沉淀。
                                                                表8：
                用于Mono Gen肺检测面板的抗体
    抗体针对
  #     标记物    预处理     阻断   稀释度   第一次培育   检测系统   供应商   编码#
  1     VEGF    高pH TRS 20分钟S3307     无   以S809作1∶15   30分钟   EnV+小鼠   JH121   NeoMarkers   MS-350-P
  2     凝血调节蛋白    无     无   以S809作1∶100   30分钟   EnV+小鼠   1009   DAKO   M0617
  3     CD44v6    TRS 20分钟S1700     无   RTU   30分钟   EnV+小鼠   VFF-7   NeoMarkers   MS-1093-R7
  4     SP-A    无     无   以S809作1∶200   30分钟   EnV+小鼠   PE10   DAKO   M4501
  5     Retino blastoma    TRS 40分钟S1700     无   以S809作1∶25   30分钟   EnV+小鼠   Rb1   DAKO   M7131
  6     E-钙粘着蛋白    TRS 20分钟S1700     无   以S809作1∶100   30分钟   EnV+小鼠   NCH-38   DAKO   M3612
  7     细胞周期蛋白A    TRS 20分钟S1700     无   以S809作1∶25   30分钟   EnV+小鼠   6E6   NeoMarkers   NCL117205
  8     nm2    高pH TRS 20分钟S3307     无   以S809作1∶50   30分钟   EnV+兔子   Polycional   DAKO   A0096
  9     端粒酶    TRS 20分钟S1700   Prot阻断X0909，30分钟  以S809作1∶400   过夜   EnV+兔子   Polycional   AplhaDiagnostic   EST21-A
  5％羊血清X0901
  10     Ki-67    TRS 40分钟S1700   无  以S809作1∶200   30分钟   EnV+小鼠   IVAK-2   DAKO   M7240
  11     细胞周期蛋白D1    高pH TRS 20分钟S3307   无  S3022中1∶200   30分钟   EnV+小鼠   DCS-6   DAKO   M7155
  12     PCNA稀释液1    TRS 20分钟S1700   无  以S809作1∶4000   30分钟   EnV+小鼠   PC10   DAKO   M0879
  13     MAGE-1    高pH TRS 20分钟S3307   无  以S809作1∶250   30分钟   EnV+小鼠   MA454   NeoMarkers   MS1087
  14     粘蛋白1    TRS 20分钟S1700   无  以S809作1∶40   30分钟   EnV+小鼠   VU4H5   Sanca CruzBiotech   Sc-7313
  15     SP-B    TRS 20分钟S1700   无  以S809作1∶100   30分钟   EnV+小鼠   SPB02   NeoMarkers   MS-1300-P1
  16     HERA    TRS 40分钟S1700   无  以S809作1∶50   30分钟   EnV+小鼠   MOC-31   DAKO   M3525
  17     FGF-2    无   Prot阻断X0909，30分钟  以S809作1∶50   过夜   EnV+小鼠   Bfm-2   UpstateBiotech   #05118
  5％猪血清X0901
  18   C-Met   不完全   无  不完全   不完全   EnV+小鼠   BF11   NeoMarkers   116405
  19   TTF-1   TRS 40分钟S1700   无  以S809作1∶25   30分钟   EnV+小鼠   8G7G3M   DAKO   M3575
  20   Bcl-2   高pH TRS 20分钟S3307   无  以S809作1∶75   30分钟   EnV+小鼠   124   DAKO   M0857
  21   p120   TRS 20分钟S1700   无  以S809作1∶10   30分钟   EnV+小鼠   FB-2   Biogenex   MU196-UC
  22   N-钙粘着蛋白   TRS 40分钟S1700   无  以S809作1∶75   30分钟   EnV+小鼠   6G4和6G11   DAKO
  23   EGFR   Prot K 1:25 5分钟   无  以S809作1∶1500   30分钟   EnV+小鼠   2-18C9   DAKO   K1492
  24   Glut1   TRS 40分钟S1700   无  以S809作1∶200   30分钟   LSAB+   Polycional   Sanca CruzBiotech   SC1505
  25   ER-相关(p29)   TRS 40分钟S1700   无  以S809作1∶200   30分钟   EnV+小鼠   G3.1   Biogenex   MU171-UC
  26   Mage3   TRS 40分钟S1700   无  以S809作1∶20   30分钟   EnV+小鼠   57B   G.Soagnol
  27   Glut3   TRS 20分钟S1700   无  以S809作1∶80   30分钟   LSAB+   Polycional   Sanca CruzBiotech   SC7581
  28   PCNA稀释液2   TRS 20分钟S1700   无  以S809作1∶3200   30分钟   EnV+小鼠   PC10   DAKO   M0879
                                   表9：
        用于Mono Gen研究的检测系统
步骤
1  脱蜡和复水
 2次Histoclear浸泡各5分钟
 2次100％乙醇浸泡各3分钟
 2次95％乙醇浸泡各3分钟
 水漂洗
2  预处理
 IRS 40或20分钟
 高pH TRS 20分钟
 蛋白质酶K5分钟
 水漂洗
3  过氧化物酶封闭
 过氧化氢浸泡5分钟
 水漂洗
 缓冲液5分钟
 H202封闭后蛋白质封闭30分钟
4  第一Ab
 室温30分钟或过夜
5  检测系统
 EnV+系统   标记的聚合体  OR  LSAB+系统   第二试剂
  30分钟   15分钟第二Ab连接
  第三试剂
  15分钟SA-HRP
6  生色原
  生色原
  5分钟DAB
免疫染色后，所有的载玻片在DAKO苏木精(编码S3302)中培育3分钟并用DAKO Mount Media(S3025)封固盖玻片。所有方案采用IHC3.0.2版软件在DAKO自动染色仪上进行。
免疫染色在光学显微镜下观察以确定对照正常染色其组织完整。标记载玻片、装箱并送给指定的病理学家进行结果分析。经培训的病理学家鉴定样品中见到的癌估计染色密度和染色细胞的比例评估标记物探针的灵敏度。将这些评分放进患者的数据表中。病理学家不知道原始诊断和免疫染色中使用的抗体标记物。每张载玻片由至少两个病理学家解读，其结果记录在数据收集表上。为了对该程序提供额外的完整性，由第二位或第三位病理学家重复该方法。然后将获得的数据配对以鉴定数据登的差错。补充的数据还促进了更好的分类器设计。
对于每个病例，分析了多达27张载玻片，对于编号为1-17、19-28的每一个标记物分别染色。标记物18(C-MET)的染色不能优化，并因此该标记物/探针没有使用。病理学家1评价了所有175个病例的载玻片。病理学家2评价了99个病例的载玻片。病理学家3评价了80个病例的载玻片。
下表10显示各位病理学家对每种诊断的多少病例所作的载玻片评分：
                    表10：
      诊断 病理学家1 病理学家2 病理学家3
癌症   腺癌     25     12     14
  大细胞癌     18     9     9
  间皮瘤     26     14     8
  小细胞肺癌     20     12     6
  鳞状细胞癌     24     13     11
对照   肺气肿     34     23     13
  肉芽肿性疾病     3     3     2
  间质性肺病     25     13     17
对于一些选择的统计分析技术，必需kw考虑那些所有27张载玻片都有评分的病例。下表11显示每种诊断有多少病例完成了所有27张载玻片的评分。
                       表11：
    诊断 病理学家1 病理学家2 病理学家3
癌症     腺癌     14     10     8
    大细胞癌     12     9     3
    间皮瘤     17     13     3
    小细胞肺癌     7     9     1
    鳞状细胞癌     12     13     4
对照     肺气肿     32     21     1
    肉芽肿性疾病     2     1     0
    间质性肺病     23     7     3
从此表可以计算出各位病理学家评价了以下总数的完全病例。病理学家1评价了119个病例所有27张载玻片。病理学家2评价了83个病例的所有27张载玻片。病理学家3评价了23个病例的所有27张载玻片。
癌症数据点的总数是172。这包括病理学家1的113个数据点和病理学家2的60个数据点。对照数据点的总数是101。这包括病理学家1的62个数据点和病理学家2的39个数据点。
图3显示在对照组织和癌组织中探针7和15的H-评分之间的比较。X-轴显示H-评分而y-轴显示具有该具体H-评分的病例的百分比。H-评分之间的差异明显。
对于每一个患者将其评分通过电子学方法输入病理检查表(Pathology ReviewForm)，它整理该评分进入数据库，数据库显示患者的鉴定人以及诊断、染色细胞的比例和染色密度。将该比例和密度整理后输入通过强度分级获得的单一的“H-评分”中，强度分级为：无＝0、弱＝1、中＝2、强＝3，和细胞百分比为：0-5％＝0、6-25％＝1、26-50％＝2、51-75％＝3、＞75％＝4，然后将两个级别相乘。例如，50％的弱染色加50％的中染色将得分10＝2×2+2×3。这是贯穿本分析的标准评分系统，除了部分3(f)、下文，标题为“采用其它(非-H-评分)客观评分参数的效果”，它研究另一种评分系统。
采用标准分类方法寻找探针的最佳组合。通常这要用例如“分支和束缚算法”(Branch and Bound Algorithm)的搜寻程序来发现最佳特征的结构层次，根据鉴别力试验分级，并根据显著性试验截取。这一过程还确定了决策规则或最佳分类规则。
设计具有这些特征的分类器性能可从用于设计该分类器的数据评估。将所有的设计数据直接用于分类器得到非常不可靠的性能估计。
对本实施例收集数据的分析提供具有最佳类别分离的探针的最佳选择。因此，获得了仅需要几个探针进行此分析的检测面板。然而，数据显示用其它探针组合可获得接近最佳的性能。因此，当成本或供应问题可能不允许最佳组合时，本发明在适应于探针的可用性方面是灵活的。在某些情况下，本发明可简单地应用于可得到的特征以寻找另一种组合。在其它情况下，可用该算法来选择允许将成本考虑包括在选择过程中特征以获得低成本解决方法。
选择数据收集和分析试验的设计以通过良好建立的双盲方法避免偏差，其中数据收集和数据分析是独立进行的。
在第一种情况下，病理学家用常规染色检查载玻片以作出诊断。将该诊断输入病理检查表。然后以随机次序向病理学家提供用标记物探针染色的载玻片，给染色细胞的百分比和染色的相对浓度评分。给载玻片编号以不让病理学家知道有关探针的信息。为了使被核查的数据具有完整性，两个病理学家检查了所有患者。
将数据整理输入数据库，然后由一组统计学家进行检查。给探针编号以在分析它们的有效性过程中不知道染色它们的方法。
分析的第一阶段是通过比较各个患者的记录核查数据的完整性。当发现大的差异时，核查该数据记录并纠正任何明显的差错。无法说明的差异放在数据。
然后，由4个统计学家分别分析数据，因为不同的统计学方法适合于数据中不同类型信息的辨别这一事实，采用了不同的技术。
选择最佳探针组合过程的第一步是将数据分成两组，一组用于设计分类器，一组用于测试分类器的性能。通过选择作出设计(培训)组的设计，但显示对测试组评价的最佳性能，可有把握的作出结论此分类器对数据的结构已通用化并且不适合培训组中见到的具体情况。
为了检测可靠性，通常用许多随机选择的排列数据和测试数据组进行重复分析。该方法由于给出分类器性能的良好估计而得到普遍的接受。当这些测试显示不一致的探针选择时，则怀疑这种探针选择是不可靠的。
    d.统计分析和/或模式识别
1.数据分析导论
  a.输入数据
    i.原始数据
将每一位患者的评分用电子学方法输入病理检查表，整理这些评分输入数据库，显示患者的鉴定人以及诊断、染色细胞的比例、和染色密度。
    ii.计算数据
分析中使用了各个探针的评分效率，从强度/百分数表得以计算。将该比例和密度整理输入具有简单规则的单一“H-评分”中，其中H＝染色比例x(如果染色强为3+染色中等为2+染色弱为1)。这是于探针相关的特征值
    iii.另一种计算数据参数
上述H-评分是启发式地得出的，一种寻找结合百分比和强度的更好方法的简单分析没有显示超过H-评分的明显改进(部分3(f)，标题为“采用其它(非-H-评分)客观评分参数的效果”)。一个更大的数据库可能允许将来选取更好的规则。
    iv.用户提供的对每个标记物的权衡
当成本或供应问题可能不允许最佳组合时，本发明在适应于特征的可获得性方面是灵活的。例如，本发明可简单地应用于可获得的特征来寻找另一种组合。或者，用于选择特征的算法允许将成本考虑包括在选择过程以获得最少成本的解决方案。对于选自所有收集的标记物或仅得自一个供应商的那些标记物的组合显示了标记物性能估计。还显示了假定在探针高成本的基础上，C4.5包如何可用于减少某些探针的考虑。这些探针组合不象最佳组合那样运行，但是当成本是重要因素时，其性能是可以接受的。
    v.用户提供的对每种类别的权衡
所用的某些方法允许权衡应用于类别的加权。这在C4.5中可以获得，其中树图设计可优化成本。而且，辨别功能方法给出可用于得到所需假阳性或假阴性可能性的单一参数输出。用于不同阈值设定的这些参数图表称为接收器操作曲线(Receiver Operating Curve)。
    vi.检测面板-假定
假定低的假阴性的可能性对于癌症检测方法是需要的(避免以增加需要重新筛检的假阳性数目为代价而错过阳性患者)。还假定该癌症辨别方法需要较低的假阳性评分(尽量减少患者接收错误治疗)。
假定检测面板需要6个或更多个探针以获得可接收的性能而成本不高。还假定不接受假阴性误差率超过5％的检测面板。不接受超出这一范围的检测面板。假定认为细胞计量术面板可能比本文分析的组织学为基础的面板的性能更差。最终目的是好于20％的误差率的细胞计量术面板，这接近子宫颈PAP涂片筛检器的性能。
    vii.辨别面板-假定
假定需要6个或更多个探针的面板花费不大并假定需要好于20％的误差率。不接受超出这一范围的面板。
  b.输出数据
  由本分析提供的输出数据包括：
·模糊矩阵(Confusion Matrices)，显示测试组的数据如何分类为真阳性、假阳性、真阴性或假阴性。这些可显示为实际数字或百分比。模糊矩阵在标题为“性能矩阵”的章节2(d)中讨论。模糊矩阵显示测试组数据如何分类为真阳性、假阳性、真阴性或假阴性。一个通过决策图分析的数据获得的典型模糊矩阵显示于下表12中，用于同时辨别腺癌、鳞状细胞癌、大细胞癌、间皮瘤和小细胞癌。
                                  表12：
  腺癌     鳞状细胞癌   大细胞癌   间皮瘤   小细胞癌
    腺癌   67.74％     6.45％   19％.40   0.00％   6.45％
 鳞状细胞癌   2.94％     76.47％   11.67％   0.00％   8.82％
 大细胞癌   28.00％     8.00％   44.00％   8.00％   12.00％
 间皮瘤   0.00％     25.64％   51.28％   89.74％   2.56％
 小细胞   0.00％     3.85％   23.08％   3.85％   69.23％
·误差率，总结模糊矩阵中的数据作为所有错误分类的和除以分类总数并以百分比表示。
·接收器操作特征(Recerver Operating Characteristic)(ROC)曲线显示在分类器中对于不同的阈值假阳性和假阴性评分的估计百分比(或每单位的概率)。一种不能比随机选择更好地辨别的无差别分类器，将提供具有相等的真和假读数的ROC曲线。该曲线下的面积将是50％(0.5的概率)。
·曲线下的面积(AUC)常常用做分类器性能和提供这种AUC图形的最标准的辨别功能包的总体评价。一种完美的分类器可具有100％的曲线下面积，而一种无价值的分类器仅具有近50％的AUC(0.5)。
·灵敏度和特异性(可从模糊矩阵获得)。见标题为“灵敏度和特异性”的章节2(d)(iii)。
·标记物相关矩阵。见图4。
    i.检测面板：组成
这些面板根据数据被分成两类：患有五种癌症的任何一种的患者和无任何一种癌症的患者。并不是对所有的患者都提供所有的探针。对某具体分析缺失一个或多个探针时，将这些病例从数据中删去。所以，当探针数目减少时进行分析，数据组可能包括略微更多的病例。
包含于该分析中的探针数目是27。尽管在许多情况下加入了一个错误的探针，输入的那个探针数据来自设定在统一产生的数字0和12之间的随机数字产生器。将该错误探针包含于许多早期分析中以确保探针选择过程中的完整性。该错误探针还用于一种逐渐从分析中消除探针的方法。比该错误探针提供更少信息的探针可能不难鉴定并从选择过程中除去。及早消除这种探针加速了分析并使该分析更不易受到这些探针引起的结果(噪声)变化的影响。
    ii.检测面板的性能
如从该研究得到的那样，报道了通过不同方法选择的探针组合以及根据模糊矩阵、％误差率、和AUC对它们的性能的估计。
    iii.检测面板-另一种组成
检测面板也可从减少了的探针组中选择。在一组面板中，获得了权衡过商业上优选的标记物的面板性能测定。当将最佳探针从分析中除去以寻找辨别探针的新组合时还分析了获得的性能。发现作用于其自身的一个探针的性能非常高(探针7)。然而，如下面性能图13中所示，用线性辨别分析评估，当加入更多的标记物时其性能得到改善。采用最佳的亚组逻辑回归确定了最佳的亚组探针。该改进具有统计学显著性。
              表13：
探针7
    癌症     对照
    癌症     87.93％     12.07％
    对照     0.00％     100.00％
探针7和16
    癌症     对照
    癌症     93.10％     6.90％
    对照     1.16％     98.84％
探针7、15和16
    癌症     对照
    癌症     90.52％     9.48％
    对照     1.16％     98.84％
探针1、7、15和16
    癌症    对照
    癌症     90.52％    9.48％
    对照     0.00％    100.00％
探针1、4、7、15和16
    癌症     对照
    癌症     92.24％     7.76％
    对照     1.16％     98.84％
用逻辑回归评价的最佳和次佳探针亚组(采用最佳亚组逻辑回归确定)显示于下表中。AUC＝ROC曲线下的面积。注意平均AUC是在随机系列和测试划分(70％∶30％)基础上从100次试验获得的平均值。该结果显示于下表14中。
           表14：
    探针     平均AUC
    7     94.28
    28     80.14
    7.16     95
    7.15     94.59
    7.15.16     95.94
    1.7.16     95.33
    1.7.15.16     95.61
    4.7.15.16     95.34
    1.4.7.15.16     95.3
    1.7.11.15.16     95.57
    iv.辨别面板-组成
本研究的这一部分中设计并检测了五种分类器，每个分类器设计用于检测所有癌症患者中一种癌症的存在。这五种配对方式系统的应用使得可疑的病例在分析中出现不只一次，或根本不出现。可鉴定这些病例并进行更密切的监视、重新检测或采用另一种检测方案。
本研究中探针的数目仍为27个，一个假探针用于早期以减少分析数量。
    v.辨别面板-性能
采用上述性能估计量来显示用不同技术发现的最佳探针组合的性能。
    vi.辨别面板-另一种组成
反复分析了含有商业优选探针的探针组合。性能退化，但对几种减少组分类器并非异常。采用最佳亚组逻辑回归确定的不含探针7的最佳探针亚组显示于下表15中。采用线性辨别分析评价了这些数据。
            表15：
探针28
  癌症   对照
    癌症   0.706897   0.293103
    对照   0.093023   0.906977
探针10和28
  癌症   对照
    癌症   0.793103   0.206897
    对照   0.034884   0.965116
探针10、15和28
  癌症   对照
    癌症   0.810345   0.189655
    对照   0.011628   0.988372
探针1、10、15和28
  癌症   对照
    癌症   0.827586   0.172414
    对照   0.011628   0.988372
探针1、10、15、16和28
  癌症   对照
    癌症   0.827586   0.712414
    对照   0.011628   0.988372
用逻辑回归评价具有探针7的最佳和次佳探针亚组(采用最佳亚组逻辑回归确定)显示于下表中。AUC＝ROC曲线下的面积。注意平均AUC是在随机系列和测试划分(70％∶30％)基础上从100次试验获得的平均值。该结果显示于下表16中。
              表16：
    探针     平均AUC
    28     79.36％
    10     82.28％
    10，28     94.21％
    15，28     88.68％
    10，15，28     92.90％
    1，10，28     93.59％
    1，10，15，28     92.99％
    8，10，15，28     93.20％
    1，10，15，16，28     93.13％
    1，8，10，15，28     93.57％
2.数据分析方法
在这节中，描述了获得数据结构的初步理解过程作为解释所用的不同方法获得的结果的指南。
  a.不同性分析
    i.病理学家与病理学家之间的不同性和病理学家的合并评分
      (1)t-检验
在本临床试验中两个病理学家检查了每个患者的载玻片。病理学家1检查了所有的患者，病理学家2也检查了该组的大约一半，而病理学家3检查了余下的患者。采用两种H-评分的独立估计，可检测病理学家工作的一致性。
采用一种易于获得的统计方法检验病理学家之间的差异。这是配对样品的t-检验。它采集各对评估之间的差异，使之平均并表示为总差异的比例。然后t-检验将这一比例转化为估计从同一人群获得两组样品的可能性的概率(P值)。
将该检验用于各个标记物探针、对病理学家1和病理学家2检查的所有病例、以及由病理学家1和病理学家3检查的所有病例的评分。由于应用了27种试验(覆盖了所有探针)，选出一个低值P＝0.01作为“显著性阈值”。显示各个探针和两对病理学家的P评分的结果见下表17、18、19和20。显然病理学家1和病理学家2比病理学家1和病理学家3更具有一致性。
                            表17：
                  病理学家1、病理学家2的评分：
   X1   X2   X3   X4  X5  X6   X7
   0.5875446   0.01051847   0.4659704   0.4659704  0.3772894  0.2307273   0.01001357
   X8   X9   X10   X11   X12   X13   X14
   0.004131056   0.7703014   0.1640003   0.2374452   0.9580652   0.1587876   0.001200265
  X15   X16   X17   X18   X19   X20   X21
  0.19742   0.3860899   0.3829022   NA   0.544601   0.08873848   0.1686243
  X22   X23   X24   X25   X26   X27   X28
  0.5428451   0.1912477   0.4031977   0.2477236   0.5673386   0.9174037   0.00339071
                      表18：
病理学家1、病理学家2在0.01时的评分阈值(α＝1％水平的显著性)：
X1 X2 X3 X4 X5 X6 X7
真 真 真 真 真 真 真
X8  X9 X10 X11 X12 X13 X14
假 真 真 真 真 真 假
X15 X16 X17 X18 X19 X20 X21
真 真 真 无 真 真 真
X22 X23 X24 X25 X26 X27 X28
真 真 真 真 真 真 假
                            表19：
                  病理学家2、病理学家3的评分：
  X1   X2   X3   X4   X5   X6   X7
  3.814506e-09   0.0399131   0.1954867   5.671062-e-05   0.01856276   0.2757166   0.2292583
  X8   X9   X10   X11   X12   X13   X14
  2.044038e-12   0.004166467   0.00983267   0.003710155   0.01461007   0.03312421   0.0003367823
  X15   X16   X17   X18   X19   X20   X21
  0.0005162036   0.2276537   0.002987705   4.267708e-06   0.007287372   0.1654067
  X22   X23   X24   X25   X26   X27   X28
  0.02400127   0.0009497766   2.478456e-07   0.1591684   0.08318303   3.122143e-05   1
                          表20：
病理学家1、病理学家3在0.01时的评分阈值(α＝1％水平的显著性)：
    X1     X2     X3     X4     X5     X6     X7
    假     真     假     假     真     真     真
    X8     X9     X10     X11     X12     X13     X14
    假     假     假     假     真     真     假
  X15   X16   X17   X18   X19   X20   X21
  假   真   假   假   假   假   真
    X22     X23     X24     X25     X26     X27     X28
    真     假     假     真     真     假     真
由于H-评分是主观的，它倾向于对边缘病例产生标尺因素差异和噪声。因此，不管显示病理学家1和病理学家2之间统计学差异评分的三个特征，该合并数据作为测量仪器的代表可被接受。将病理学家1和病理学家2的数据合并成单一数据组用于分析加工。病理学家3的结果没有用于独立检验目的。采用病理学家3的数据进行的这种检验由于明显的差异将产生显示性能低下的偏差。
由于认为它们是不同的病例，具有任何一个病例的结果之间的独立性程度的差异性，故将病理学家1和病理学家2的数据组合。当用这种数据检验时，性能估计将偏向于更乐观的值。这是由于同一患者的样品可在培训检验亚组中同时产生。然而，这不会使用于寻找特征最佳组合的方法无效，它仅仅使性能的估计产生偏差。
                       (2)H-评分不同性的分析
                            (a)背景
在各个探针内，H-评分可能由于各种原因而不同。在某种程度上它们因疾病类型而相应地变化，这很有用，由于这种原因造成的差异使病理学家解读载玻片时有启发性，而随机变化对以前两种差异来源的检测设置了限制。
方差分析(ANOVA)是减少数据变异来源和检验其统计学显著性的一种标准技术。ANOVA概括数据组的总变差作为合计项，它可归因于变异的具体来源或原因。
ANOVA可在许多统计包中得到。选择了公众结构功能域包(public domainpackage)“R”(“用于统计计算的R项目”(The R Project for StatisticalComputing)，http：//www.R-project.org/)。
                            (b)目的
为了对病理学家1和2的H-评分数据进行ANOVA分析和考虑这种数据是否可安全地融入一连贯组中用于进一步分析来选择面板。
                            (c)方法
从数据库中，选出病理学家1和2的数据。只有对给定的探针完整的数据才用于该探针的ANOVA分析。
将肺气肿、肉芽肿性疾病和间质性肺病的对照类别聚合在一起称为给出因子疾 病内的6种水平的“标准”。
给病理学家编码为具有2水平的因子(病理学家1、病理学家2)。
手写R以依次对各个探针进行标准ANOVA分析，所用的因子有：疾病、病理学家、和相互作用项疾病：病理学家。结果显示于下表21中。“Df”定义为自由度。在n次观察的一数据组中，已知与平均值偏离的n-1，nth是自动测定的。N-1是自由度的数目。合计Sq和平均Sq是离势值。F是根据F分布的关于两种变量相等的统计检验。Pr(＞F)是用于测定该不同性是否具有统计学显著性的概率。
                              表21：
                        H-评分的不同性分析
探针1Df           合计Sq       平均Sq     F值      Pr(＞F)疾病            5            443.56       88.71      15.8202  3.690e-13***病理学家        1            0.66         0.66       0.1174   0.7323疾病：病理学    5            15.34        3.07       0.5470   0.7405家剩余            204          1143.93  5.61---显著性代码：0“***”0.001“**”0.01“*”0.05“.”0.1“”1
探针2Df           合计Sq       平均Sq     F值      Pr(＞F)疾病            5            1067.39      213.48     24.1234  ＜2e-16***病理学家        1            13.02        13.02      1.4709   0.2263疾病：病理学    5            27.98        5.60       0.6324   0.6752家剩余            249          2203.50      8.85---显著性代码：0“***”0.001“**”0.01“*”0.05“.”0.1“”1
探针3Df  合计Sq   平均Sq  F值      Pr(＞F)疾病          5   1098.49  219.70  21.0751  ＜2e-16***病理学家      1   6.73     6.73    0.6458   0.4224疾病：病理学  5   29.72    5.94    0.5703   0.7227家剩余          243 2533.16  10.42
---显著性代码：0“***”0.001“**”0.01“*”0.05“.”0.1“”1
探针4Df          合计Sq         平均Sq        F值      Pr(＞F)疾病            5           631.8          126.4         9.3707   3.454e-08***病理学家        1           6.6            6.6           0.4869   0.4860疾病：病理学    5           13.1           2.6           0.1939   0.9647家剩余            246         3317.1         13.5---显著性代码：0“***”0.001“**”0.01“*”0.05“.”0.1“”1
探针5Df        合计Sq      平均Sq      F值       Pr(＞F)疾病           5         754.30      150.86      25.2826   ＜2e-16***病理学家       1         14.25       14.25       2.3875    0.1236疾病：病理学   5         7.54        1.51        0.2528    0.9381家剩余           248       1479.80     5.97---显著性代码：0“***”0.001“**”0.01“*”0.05“.”0.1“”1
探针6Df         合计Sq      平均Sq       F值       Pr(＞F)疾病          5          721.91      144.38       11.8515   2.771e-10***病理学家      1          1.91        1.91         0.1568     0.6925疾病：病理学  5          47.82       9.56         0.7850     0.5613家剩余          246        2996.93     12.18---显著性代码：0“***”0.001“**”0.01“*”0.05“.”0.1“”1
探针7Df   合计Sq   平均Sq  F值     Pr(＞F)疾病          5    1171.47  234.29  77.6802 ＜2e-16***病理学家      1    8.84     8.84    2.9294  0.08847疾病：病理学  5    46.36    9.27    3.0742  0.01063家剩余          209  630.37   3.02
---显著性代码：0“***”0.001“**”0.01“*”0.05“.”0.1“”1
探针8Df      合计Sq      平均Sq       F值       Pr(＞F)疾病          5       209.82      41.96        6.4352    1.201e-05***病理学家      1       12.66       12.66        1.9407    0.16483疾病：病理学  5       71.20       14.24        2.1838    0.05654家剩余          251     1636.76     6.52---显著性代码：0“***”0.001“**”0.01“*”0.05“.”0.1“”1
探针9Df       合计Sq      平均Sq    F值        Pr(＞F)疾病           5        197.21      39.44     8.4348     2.015e-07***病理学家       1        7.33        7.33      1.5681     0.2116疾病：病理学   5        24.56       4.91      1.0505     0.3884家剩余           265     1239.17      4.68---显著性代码：0“***”0.001“**”0.01“*”0.05“.”0.1“”1
探针10Df      合计Sq      平均Sq     F值       Pr(＞F)疾病             5       1113.46     222.69     39.0730   ＜2e-16***病理学家         1       1.01        1.01       0.1778    0.67371疾病：病理学     5       62.45       12.49      2.1916    0.05635家剩余             213     1213.96     5.70---显著性代码：0“***”0.001“**”0.01“*”0.05“.”0.1“”1
探针11Df    合计Sq   平均Sq   F值     Pr(＞F)疾病          5     320.15   64.03    9.5553  2.416e-08***病理学家      1     1.28     1.28     0.1918  0.6618疾病：病理学  5     10.04    2.01     0.2996  0.9128家
剩余             245       1641.76       6.70---显著性代码：0“***”0.001“**”0.01“*”0.05“.”0.1“”1
探针12Df      合计Sq      平均Sq    F值       Pr(＞F)疾病          5       832.26      166.45    27.8793   ＜2e-16***病理学家      1       0.18        0.18      0.0307    0.8610疾病：病理学  5       15.16       3.03      0.5079    0.7701家剩余          248     1480.68     5.97---显著性代码：0“***”0.001“**”0.01“*”0.05“.”0.1“”1
探针13Df         合计Sq    平均Sq       F值      Pr(＞F)疾病         5          46.594    9.319        7.8408   8.674e-07***病理学家     1          0.044     0.044        0.0368   0.8481疾病：病理学 5          10.143    2.029        1.7069   0.1343家剩余         210        249.584   1.188---显著性代码：0“***”0.001“**”0.01“*”0.05“.”0.1“”1
探针14Df        合计Sq     平均Sq    F值      Pr(＞F)疾病            5         1305.69    261.14    23.9460  ＜2e-16***病理学家        1         28.66      28.66     2.6279   0.10630疾病：病理学    5         142.90     28.58     2.6208   0.02492家剩余            243       2649.98      10.91---显著性代码：0“***”0.001“**”0.01“*”0.05“.”0.1“”1
探针15Df   合计Sq  平均Sq  F值     Pr(＞F)疾病         5    401.02  80.20   21.268  ＜2e-16***病理学家     1    13.17   13.17   3.493   0.0630疾病：病理学 5    6.17    1.23    0.327   0.8963家剩余         214  807.02  3.77
---显著性代码：0“***”0.001“**”0.01“*”0.05“.”0.1“”1
探针16Df      合计Sq      平均Sq    F值      Pr(＞F)疾病           5       2520.26     504.05    65.5572  ＜2e-16***病理学家       1       0.15        0.15      0.0194   0.8892疾病：病理学   5       24.29       4.86      0.6318   0.6757家剩余           247    1899.12      7.69---显著性代码：0“***”0.001“**”0.01“*”0.05“.”0.1“”1
探针17Df      合计Sq     平均Sq     F值       Pr(＞F)疾病             5       530.64     106.13     13.0178   2.426e-11***病理学家         1       8.42       8.42       1.0325    0.31050疾病：病理学     5       109.96     21.99      2.6975    0.02131家剩余             266     2168.55    8.15---显著性代码：0“***”0.001“**”0.01“*”0.05“.”0.1“”1
探针19Df        合计Sq      平均Sq       F值      Pr(＞F)疾病             5         1670.86     334.17       29.1960  ＜2e-16***病理学家         1         2.17        2.17         0.1895   0.6637疾病：病理学     5         32.61       6.52         0.5698   0.7231家剩余             248       2838.56     11.45---显著性代码：0“***”0.001“**”0.01“*”0.05“.”0.1“”1
探针20Df  合计Sq   平均Sq   F值      Pr(＞F)疾病         5   964.71   192.94   34.2760  ＜2e-16***病理学家     1   8.83     8.83     1.5687   0.2116疾病：病理学 5   19.60    3.92     0.6963   0.6267家剩余         245 1379.12  5.63
---显著性代码：0“***”0.001“**”0.01“*”0.05“.”0.1“”1
探针21Df      合计Sq     平均Sq     F值     Pr(＞F)疾病            5       6.927      1.385      2.0604  0.07076病理学家        1       0.464      0.464      0.6906  0.40670疾病：病理学    5       1.576      0.315      0.4687  0.79945家剩余            263     176.830    0.672---显著性代码：0“***”0.001“**”0.01“*”0.05“.”0.1“”1
探针22Df      合计Sq     平均Sq       F值        Pr(＞F)疾病          5       640.16     128.03       31.7250    ＜2e-16***病理学家      1       1.64       1.64         0.4058     0.5247疾病：病理学  5       18.78      3.76         0.9305     0.4617家剩余          247     996.81     4.04---显著性代码：0“***”0.001“**”0.01“*”0.05“.”0.1“”1
探针23Df        合计Sq       平均Sq     F值      Pr(＞F)疾病             5         1915.62      383.12     46.5565  ＜2e-16***病理学家         1         10.77        10.77      1.3093   0.2537疾病：病理学     5         20.92        4.18       0.5084   0.7698家剩余             246       2024.39      8.23---显著性代码：0“***”0.001“**”0.01“*”0.05“.”0.1“”1
探针24Df        合计Sq      平均Sq     F值       Pr(＞F)疾病           5         516.06      103.21     24.0786   ＜2e-16***病理学家       1         9.52        9.52       2.2210    0.1376疾病：病理学   5         12.48       2.50       0.5823    0.7135家剩余           216       925.87      4.29---显著性代码：0“***”0.001“**”0.01“*”0.05“.”0.1“”1
探针25Df      合计Sq     平均Sq   F值      Pr(＞F)疾病           5       1761.26    352.25   34.5245  ＜2e-16***病理学家       1       11.51      11.51    1.1285   0.2891疾病：病理学   5       41.49      8.30     0.8134   0.5411家剩余           248     2530.33    10.20---显著性代码：0“***”0.001“**”0.01“*”0.05“.”0.1“”1
探针26Df       合计Sq      平均Sq     F值       Pr(＞F)疾病           5        399.85      79.97      13.6548   1.428e-11***病理学家       1        0.30        0.30       0.0517    0.8204疾病：病理学   5        14.81       2.96       0.5056    0.7719家剩余           214      1253.31     5.86---显著性代码：0“***”0.001“**”0.01“*”0.05“.”0.1“”1
探针27Df        合计Sq        平均Sq      F值       Pr(＞F)疾病            5         117.92        23.58       6.2551    1.956e-05***病理学家        1         0.64          0.64        0.1695    0.6810疾病：病理学    5         25.52         5.10        1.3539    0.2431家剩余            212       799.31        3.77---显著性代码：0“***”0.001“**”0.01“*”0.05“.”0.1“”1
探针28Df        合计Sq       平均Sq    F值      Pr(＞F)疾病            5         1634.60      326.92    38.171   ＜2e-16***病理学家        1         8.40         8.40      0.981    0.3229疾病：病理学    5         16.15        3.23      0.377    0.8643家剩余            267       2286.76      8.56---显著性代码：0“***”0.001“**”0.01“*”0.05“.”0.1“”1
                       (d)结果分析
在所有病例下(除探针21)探针的反应与疾病有关。这并不奇怪，因为这些探针是为了这一目的而推测性选择的。探针的反应与病理学家没有关系(p＝0.05水平)。这表明可安全地合并这些数据并用两个病理学家的数据作为数据的两次测量。
在少数病例，探针7、14、17，有一些获得显著性相互作用项的证据。这表明病理学家之间对某些疾病的评分具有某些差异。这些情况中的某些很可能归因于数据中一个偶然的逸出值。
                       (e)结论
结果表明合并这一数据用于进一步分析是安全的。该数据表明在某些情况下病理学家和疾病之间的微小的相互作用似乎归因于随机来源。
    ii.患者与患者的不同性
通过章节2(a)(i)(2)的疾病：疾病的不同性测定了患者与患者的不同性(见上文，“H-评分的不同性分析”)。
    iii.标记物与标记物的不同性
绘制柱形图(PathologistData.xls，工作表：柱形图)显示用于对照和癌症的各个探针的标记物评分的分布。
  b.标记物相关矩阵分析
群体相关系数(“应用的多元统计分析”(Applied Mulitvariate StatisticalAnalysis)，R.A.Johnson和D.W.Wichern，第二版，1988，Prentice-Hall，N.J.)测定一对随机变量之间的线性相关的量。通常，不知道随机变量的分布和相关参数并且不可能直接计算的群体相关系数。在这种情况下，可从样品数据中计算出样品相关系数。见图4。然而，样品相关系数仅仅是群体相关系数的一种估计。而且，由于它是在样品数据的基础上计算的，纯粹意外地，当实际上在相应的随机变量之间可能没有实际关系时它可能显示出强阳性或阴性相关(“现代初级统计学”(Modern Elementary Statistics)J.E.Freund，第六版，1984，Prentice-Hall，N.J.)。
相关系数可衡量一个变量预测其它变量的能力。然而，强的线性相关并不意味着因果关系。相关系数的平方称为决定系数。对于二元变量数据组计算出的决定系数可衡量一个变量中不同性的比例，这可用它与其它变量的线性关系来解释。当涉及几个变量时，可依次计算出每一对的相关数并且该系数组可书写为矩阵称作系数矩阵。见图4。
可模拟各个标记物的H-评分作为随机变量。该多元变量数据组的样品相关矩阵可从标题为“输入数据”的上述章节中描述的输入数据计算出来。
  c.模式识别
统计学模式识别是在定量测定(称做特征)的基础上分类信号或几形模型的一种方法。统计学模型识别本质上归纳为将n-维特征空间分成相应于感兴趣的种类或类别的区域的问题。
本研究所用的不同的分类器方法对数据中不同的结构形式很灵敏。
对于决策图方法，不同数据组合的初步分析鉴定到从不为C4.5所用的用于检测面板的标记物。将这些标记物从分析中除去，这导致更一致的结果，被除去的探针的故障只会在选择过程中产生噪声。
用于检测面板的探针的相似的初步分析鉴定出要在详细分析前除去的噪声探针。
SPSS中的线性辨别功能方法具有用于减少分析中标记物数量的部步进式过程。通常，这减少用于分析的探针到2和7之间。
R和SAS中的逻辑回归方法对变量选择实施步进式的步骤。在SAS中，还提供了一个最佳亚组变量选择项。在R中用该步进式方法与多重随机试验结合以开发用于选择变量的启发式的方法，根据一个给定的特征在100次训练和试验数据的随机选择中使用的次数(分别分为70％∶30％)。可与人工随机特征的计数相比较的计数特征被逐步消除直到获得超过100次运行的最小的一致性特征组。
    i.统计学方法
根据多元变量统计学分析地点，问题是一个在高维空间(和将这一空间分成感兴趣的区域)估计的密度函数。假定随机(特征)载体的分布是已知的，理论上最好的分类器是Bayes分类器，因为它使分类误差的机率减至最小(K.Fukunaga，“统计学模式识别”(Statistical Pattern Recognition)，第二版，学术出版社Academic Press，1990，第三页)。不幸的是，由于它的复杂性，特别是当特征空间的维度很高时Bayes分类器的使用很困难。在实践中，使用更简单的参数分类器。参数分类器是依据对基础密度或辨别功能的假设。最普通的这种分类器是线性和二次分类器。在多元变量统计学分析中，这种分类器归入辨别分析的标题之下。辨别分析技术与多元变量线性回归模型密切相关并概括了线性模型(包括逻辑和多项式回归)。
                (1)具有二项式反应的逻辑回归
                          (a)背景
选择一组用于检测面板上使用的标记物的问题可作为具有二项式反应的逻辑回归问题加以阐明。反应变量是具有两种水平的因子：正常(非癌症)和异常(癌症)。说明性变量是标记物H-评分。
选择一组用于癌辨别面板上使用的标记物的问题也可作为具有二项式反应的逻辑回归问题加以阐明。反应变量是具有两种水平的因子：正常(不是感兴趣的癌)和异常(感兴趣的癌)。说明性变量是标记物H-评分。
步进式变量选择可用于选择用于分辨两种类型之间的区别的原始变量(标记物)的亚组。这是一种在计算上要花费很多的运用，并最适合于计算机。几种商品化的和不公众领域软件包---例如R、S-plus、和SAS-实施步进式逻辑回归。
根据分别在R和SAS中发现的步进式变量选择方法研究了特征选择的两种不同方法。
                          (b)试验数据
用于本分析的数据包括由病理学家1和病理学家2检查病例的标记物1-17、和19-28的H-评分，以及在本报告的其它部分中描述的H-评分。另外，将一个虚拟的标记物，18，加入此数据组。该虚拟的标记物包括从均匀分布随机选择的0-12的整数值。
                          (c)方法1：使用R包(1.4.1版)
计算机化的模型拟合程序通常不能处理丢失的数据。这是用于R的glm(广义的线性模型的glm基底)程序的例子。因此，当使用glm拟合一模型时必需排除其中有一个或多个漏测值的所有病例。当拟合含有27个真实标记物和一个虚拟标记物的初始完全模型时，这使数据组减少至仅202个病例。使用这样少的观察资料，决定进行变量选择以训练采用的选择变量的分类器，评估其性能的最好方法是对数据随机划分成训练组和试验组进行100次试验。
                 (i)划分数据成为训练组和试验组
在每次试验开始时，将数据划分成试验组和训练组。这通过随机选择30％的异常和30％的正常以形成试验组来完成，并用余下的观察资料形成训练组。
                 (ii)变量(标记物)的选择
在每次试验开始时，将包括所有变量(标记物)的完全模型拟合到训练数据中。在R中使用glm拟合逻辑回归模型。所用的编码片段如下：
my.模型<-类别～X1+X2+X3+X4+X5+X6+X7+X8+X9+X10+X11+X12+X13+X14+X15+X16+X17+X18+X19+X20+X21+X22+X23+X24+X25+X26+X27+X28
my.glm<-glm(my.模型，系列＝二项式(连接＝对元)，数据＝训练数据)
然后根据Akaike信息标准(Akaike Information Criterion)(AIC)用程序step AIC进行步进式变量选择。该程序是可公开得到的MASS文库的一部分。该文库和程序的描述见“具有S-PLUS的现代实用统计学”(Modern Applied Statisticswith S-PLUS)(W.N.Venable and B.D.Ripley，Springer-Verlag，Pathologist NewYork，1999)。进行这一步骤的R编码片段如下：
my.步骤<-step AIC(my.glm，方向＝双向)
然后根据试验数据上评估得到的模型。所用的编码片段如下：
概率异常<-预测(my.步骤，检验数据，类型＝？反应？)
在错误分类的实际误差率(AER)和ROC曲线下的面积(AUC)方面记录了该分类器的性能。100次试验后，仍然保留100个模型以及它们相关的AER和AUC。构建了一个频率表，记录在100个模型中各个变量出现的次数。一个例子显示于表12中：
                          表22：
Figure A0280975900801
该表用于决定弃去哪一个标记物。首先，频率小于或等于10的所有标记物被弃去。接着根据虚拟标记物的频率(通常为虚拟标记物频率的1到1.5倍)选择截断频率。弃去频率低于该截断值的所有标记物。然后余下的标记物，和虚拟标记物一起，用作另外100次试验的完全模型并重复此删减步骤。如果需要，可提高削减的严格度以迫使一个或更多的标记物离开模型。如果需要，余下的标记物可用作又100次试验的完全模型。当达到所需的面板成员数或当前模型的平均AUC低于以前的模型时停止删减。
为了阐明删减步骤设想了上述表格。利用检测面板数据获得该表。涂有阴影的项目表示删减后保留的那些标记物。采用以下的完全模型进行另外100次试验。
my.模型<-类别～X6+X7+X8+X12+X16+X18+X23+X25
再构建了频率表，表23：
                         表23：
Figure A0280975900811
涂有阴影的项目显示删减后保留的标记物(使用47截断值)。另外100次试验采用以下的完全模型进行：
my.模型<-类别～X6+X7+X8+X12+X18+X23+X25
还构建了频率表，表24：
                         表24：
在这一点上选择50截断值。涂有阴影的项目显示用于5或员面板的剩余标记物。在每一步中，平均的AUC提高：94.37％  95.45％  95.78％。
                  (iii)评估该检测面板的性能
为了评估该面板的性能，象前面一样进行了100次试验，但是不进行步进式选择程序。对于各次试验，记录AUC、灵敏度和特异性。对于上述检测面板的例子，结果为：
>my.模型<-类别～X7+X25+X6+X23+X12
>总计(AUC)
最小值       第一次计数      中值      平均值     第三次计数   最大值
0.9289       0.9590          0.9615    0.9601     0.9630       0.9630
>总计(灵敏度)
最小值       第一次计数      中值      平均值     第三次计数   最大值
0.8519       0.9630          0.9630    0.9737     1.0000       1.0000
>总计(特异性)
最小值       第一次计数      中值      平均值     第三次计数   最大值
0.8378       0.9730          0.9730    0.9749     1.0000       1.0000
总的来说，该面板具有97.37％的灵敏度和97.49％的特异性。ROC下的面积是96.01％。
                 (d)方法2：使用SAS(8.2版)
可在SAS中采用程序LOGISTIC进行逻辑回归。当反应变量是两级因子时，该程序适合于二元对数模型(与系列＝二元和连接＝对数与R中的glm等价)。对于指定的模型，SAS自动排除所有遗漏的多元变量观察资料。不象R，SAS能够进行最佳亚组变量选择程序。在SAS中进行这一步骤所需要的编码片段如下：
PROC LOGISTIC DATA＝WORK.panel；
   CLASS Class；
   MODEL Class＝X1 X2 X3 X4 X5 X6 X7 X8 X9 X10 X11 X12 X13 X14 X15 X16 X17X18 X19 X20 X21 X22 X23 X24 X25 X26 X27 X28/SELECTION＝
  SCORE BEST＝28；
RUN；
该程序应用于完整的数据组。参数BEST＝28指导SAS寻找最佳的28个单变量模型、最佳的28个双变量模型、最佳的28个三变量模型、直至最佳的28个28-变量模型。
                     (i)评估面板的性能
将模型1中描述的程序用于评估各个面板的性能。下表25产生自检测面板数据。它只列出了两个最佳的1-、2-、3-、4-、和5-标记物面板结果。
                           表25：
    面板     面板成员   灵敏度   特异性    ROC下的面积
    1     7    94.28％
    2     28    80.14％
    3     7，16    95.00％
    4     7，15    94.59％
    5     7，15，16    95.94％
    6     1，7，16    95.33％
    7     1，7，15，16    95.61％
    8     4，7，15，16    95.34％
    9     1，4，7，15，16    95.30％
    10     1，7，11，15，16    95.57％
                       (2)线性辨别分析
                          (a)背景
商品化统计学包SPSS具有允许设计和检验单纯线性辨别功能的程序。一种通常使用的方法是Fisher线性辨别功能。这在特征空间中找到高平面(hyper-plane)，它给出类别的良好分离。对于类别分布具有不同平均值，但相似的多元变量高斯分布的两个类别问题，此分类器给出最佳的性能。该方法可启发性地延伸到多类别问题，但这没有应用于本研究中。
此方法在其手段上过于简单，但对于与含有大量特征的数据组有关的问题是健全的(robust)(在我们的例子中探针数目是27，对于只含有约200个标本(病例)的数据组产生问题)。
这个统计包具有一种程序，能鉴定有助于辨别过程的特征。这种“步进式方法”首先发现最有辨别力的特征。然后顺次加入其它特征并对分类器作评估。探索组合，这样如果发现较佳的组合，最终的解决方案可排除最初选出的特征。特征的数目逐渐增加，直到统计学检验显示余下的特征对分类过程没有实际贡献。
采用留一种方法而获得对性能的估计。这将从数据组中除去一个样品形成训练组。留出的样品留作试验组，应用于分类器，得到的分类累积在模糊矩阵(confusion matrix)中。对数据中的情况重复该程序。该程序可得出没有偏差的性能估计，但该估计将具有一个高的分歧。
方法
在SPSS中选择适当的数据组用于分析，选择“分析”、选择“分类”、选择“辨别…”，在表格上选择“Fishers方法”、“留出一种的检验”和“采用步进式方法”。输入诊断作为分组变量和输入所有的特征作为独立变量。输入“OK”以完成分析。对于其它参数的预设值在设定时被舍去。
分析输出包括本分析中使用的特征的列表、规范的辨别函数和模糊矩阵以及正确的分类比率(I-误差率)。
为了计算ROC曲线，将规范的辨别函数应用于选择的特征以产生新的特征。在SPSS中，采用Graph、ROC绘制该曲线。
                   ii.分层次的方法：决策图
                          (1)背景
决策图学习是用于归纳推理的最广泛使用和实用的方法之一。它是一种分类方法，该方法对于噪声数据是健全的并能够认识到分离性的表达(Tom M.Mitchell，“机器学习”(Machine Learning)，McGraw-Hill，New York，NY，1997)。
最通用的和可获得的机器学习包是“C4.5”，其源码发表于：(J.Ross Quinlan，“C4.5：机器学习程序”，Morgan Kaufmann，San Mateo CA，1993)。
当一个决策图正在被训练(在训练数据上)时，该算法决定在图表树(tree)的每个节点上，数据的哪一种属性在这一节点上使用最好作出决定。因此当完成图表树构建时，它将选择一些属性组来使用并忽略其它属性征。在我们的申请中，采用决策图来加工从分子探针获得的测量值，该决策图有效地选择了一种探针面板，以及组合探针评分的方法，最好地解释了数据的分类。为了获得对面板性能的无偏向估计，得到的图表树必需根据训练中没有使用的数据进行评估。进行这一步骤的一种标准技术是交叉(cross-validation)。采用了10-倍(10-fold)交叉证实。
交叉证实是最佳利用有限数据的一种方法。在10-倍交叉证实中，将数据随机分成10份差不多相等大小的部分，小心使各个部分中含有大约相同数量的一类病例。然后，在组合的部分2-9上训练决策图并在部分1上测试，然后在组合的部分1、3-9上训练并在部分2上测试，如此进行，轮流维持检验组10次通过数据一次。以这种方式，检验仅在维持的数据上进行，因此是无偏向的，并且所有的数据刚好被检测一次，因此可计算出整个数据组的总误差率。
通常构建图表树直到它们非常适合于训练数据，然后通过修剪除去“噪声”的枝和叶将它们“删减掉”。这改进了决策图对未发现的数据的概括能力并对获得良好性能是必要的。C4.5包包括两种删减图表树的方法，首先是标准图表树删减算法，其次是规则选取算法(rule extraction algorithm)。通常，可在这一数据上找到基于图表树的方法以得出优良结果。因此，没有报告规则为基础的方法。
                         (2)数据准备
如其它地方所描述获得各种探针对于正常组织和五种不同癌症(腺癌、大细胞癌、间皮瘤、小细胞肺癌和鳞状细胞癌)的反应的数据。从数据库中摘录探针1-28、和病理学家中病理学家1和病理学家2的H-评分并输入平面数据文件中。对于决策图分析，采用各个数据点(甚至由两个病理学家对一个相同的物理载波片进行观察)作为疾病对染色的作用的独立观察资料。这可能略微正向偏离分类的性能但对面板选择应没有影响。
·将肺气肿、肉芽肿性疾病、和间质性肺病的对照类别综合在一起并称为“正常”。
·对于检测面板将所有的癌症综合在一起并称为“异常”，使之成为2个类别问题。
·对于一个辨别面板，从数据中除去正常病例以形成5个类别问题。
·对于维持辨别面板，依次维持各个癌症，余下癌症综合为“其它”，以产生一个五种2类别的问题组。
C4.5需要一个“名称”文件，该文件描述包括在分析中的数据和属性。该辨别面板的命名文件例子是，表26：
                   表26：
C4.5用于MonoGen ZF21诊断数据的命名文件腺癌、大细胞癌、间皮瘤、小细胞肺癌、鳞状细胞癌    类别P1     ：    连续的。P2     ：    连续的。P3     ：    连续的。P4     ：    连续的。P5     ：    连续的。P6     ：    连续的。P7     ：    连续的。P8     ：    连续的。P9     ：    连续的。P10    ：    连续的。P11    ：    连续的。P12    ：    连续的。P13    ：    连续的。P14    ：    连续的。P15    ：    连续的。P16    ：    连续的。P17    ：    连续的。P18    ：    忽略。P19    ：    连续的。P20    ：    连续的。P21    ：    连续的。P22    ：    连续的。P23    ：    连续的。P24    ：    连续的。P25    ：    连续的。P26    ：    连续的。P27    ：    连续的。P28    ：    连续的。
从数据中遗漏掉探针18并在所有的设计中设定为“忽略”。在该命名文件中设定属性至“忽略”是从面板中修剪探针的简单而有效的方法并用于数据分析。
                        (3)数据分析
采用提供有的附用软件包的C4.5.标准(缺省)参数的“xval.sh”原本在各个数据组上运行10倍交叉证实。交叉证实是开发用于对小数据组进行分类器训练和测试的一种技术。它包括将数据随机分成N个相等大小的部分。然后分类器在N-1部分上训练并在其余部分测试。这样重复N次。
由于在一次交叉证实(CV)试验中训练的决策图可能与在另一次中获得的决策图不同(选出的探针和决策图系数都不同)，计算出由决策图在10次试验中选择各个探针的次数。
通过设置略去在10次CV试验中5次或更多次数没有在删减的决策图表中出现的探针，进行了探针的初次拣选。
然后用这个较小的候选探针组重复交叉证实。通过设置略去在10次试验中5次或更多次数没有在删减的决策图中出现的探针，进行探针的第二次拣选。如果还有探针被除去，进行第三次CV试验。
通过各种试验选择面板，并且它们的估计误差性能显示于结果图表中。用于决策图分析的面板性能显示于下表27中。
         表27：
    面板性能-决策图
  癌症   对照
  癌症   99.42％   0.58％
  对照   17.82％   82.18％
检测面板探针：3、7、19、25和28
  腺癌   其它
    腺癌   67.74％   32.26％
    其它   11.20％   88.80％
成对辨别4、6、14、19和23
  鳞状细胞癌   其它
  鳞状细胞癌   70.59％   29.41％
  其它   4.07％   95.93％
成对辨别3、6、17、19和25
  大细胞癌     其它
  大细胞癌   36.36％     63.64％
  其它   7.37％     92.63％
成对辨别1、5、10、13、21、27和28
  间皮瘤   其它
  间皮瘤   82.05％   17.95％
  其它   5.00％   95.00％
成对辨别3、12和16
  小细胞肺癌   其它
  小细胞肺癌   69.23％   30.77％
  其它   1.49％   98.51％
成对辨别12、17、20、23和25
  癌症   对照
    癌症   89.60％   10.40％
    对照   3.30％   96.70％
检测(不包含探针7)6、10、16和19
  癌症   对照
  癌症   92.80％   7.20％
  对照   5.49％   94.51％
检测(只用商品化的优选探针)5、6、10、16、19和23
一个典型的决策图结构显示于下表28和29中，用于在小细胞肺癌和其余四种类型肺癌之间的辨别。
C4.5信息输出公式
                 表28：
P23<＝3：P25<＝2：小细胞肺癌(18.0)P25>2：P17<＝5：小细胞肺癌(2.0)P17>5：P20<＝11：其它(9.0)P20>11：小细胞肺癌(2.0)P23>3：P12>7：其它(120.0)P12<＝7：P20<＝2：其它(5.0)P20>2：小细胞肺癌(4.0)省去的决策表对训练数据的评价(160项)：删  减  前   删  减  后大小  误差   大小 误差估计13 0 (0.0％) 13   0 (0.0％) (5.2％)<<
              表29：
图示形式：
步进式线性辨别的面板性能显示于下表30中：
           表30：
    面板性能-步进式LD
  癌症   对照
癌症   92.24％   7.76％
对照   1.16％   98.84％
检测面板1、4、7、15和16
  腺癌   其它
腺癌   91.67％   8.33％
其它   5.43％   94.57％
成对辨别4、5、14、19、20、25和27
  鳞状细胞癌   其它
鳞状细胞癌   88.00％   12.00％
其它   6.59％   93.41％
成对辨别1、2、3、24、25和26
    大细胞癌     其它
大细胞癌     80.95％     19.05％
其它     26.32％     73.68％
成对辨别1和7
    间皮瘤     其它
间皮瘤     96.67％     3.33％
其它     4.65％     95.35％
成对辨别3、12和6
  小细胞肺癌     其它
小细胞肺癌   93.75％     6.25％
其它   5.00％     95.00％
成对辨别12、19、22和23
    癌症     对照
癌症     89.60％     10.40％
对照     3.30％     96.70％
检测(不包含探针7)1、2、3、4、10、11、15、16、23、24、27和28
    癌症     对照
癌症     81.20％     18.80％
对照     1.16％     98.84％
检测(只用商品化的优选探针)8、10、11、19、23和28
步进式逻辑回归分析的面板性能显示于下表31中：
          表31：
     面板性能-步进式LR
    癌症     对照
癌症     97.49％     2.63％
对照     2.51％     97.49％
检测面板6、7、12、23和24
    腺癌     其它
腺癌     96.39％     3.61％
其它     12.29％     87.71％
成对辨别14、19、20、25和27
  鳞状细胞癌     其它
鳞状细胞癌   94.93％     5.07％
其它   35.86％     64.14％
成对辨别3和10
    大细胞癌     其它
大细胞癌     95.11％     4.89％
其它     61.00％     39.00％
成对辨别1、4、6、16和21
    间皮瘤     其它
间皮瘤     95.07％     4.93％
其它     10.89％     89.11％
成对辨别3、7、12和16
    小细胞肺癌     其它
小细胞肺癌     98.90％     1.10％
其它     4.00％     96.00％
成对辨别12、13和23
    癌症     对照
癌症     94.00％     6.00％
对照     5.80％     94.20％
检测(不包含探针7)1、10、19、23和28
    癌症     对照
癌症     93.88％     6.12％
对照     6.39％     93.61％
检测(只用商品化的优选探针)10、19、20、23和28
                    iii.神经网络和另一种方法
人造神经网络ANN’s是候选的模式识别技术，它可容易地应用于选择特征和设计与本发明有关的分类器。然而这种技术很少了解数据的结构以及具体探针以LDF给出的方式所产生的影响。由于这个原因，本研究中没有采用这一类算法。LDF代表线性辨别函数，特征的线性组合的结果是确定分类的阈值。
这一类技术包括例如多层感知机MLP、Back-Prop、Kohonen的自我组织图谱(Self-Organizing Maps)、学习载体量子化(Learning Vector Quantization)、K-毗邻(K-nacyest meighbors)和遗传算法等算法。
iv.专门的主题
                             (1)假设
·线性辨别分析
·假定两个类别的协方差矩阵是相等的。
·只有当两个类别是多元变量正态分布时将错误分类的成本减到最小。
·假定说明性变量是连续的而不是绝对的(在本研究中，H-评分是绝对的，而在实践中(即在自动化系统中)强度可在连续的范围内测定)。
·逻辑回归(二项式广义线性模型)
见Venerable和Ripley，第7章(“具有S-PLUS的现代实用统计学”(W.N.Venerable和B.D.Ripley，Springer-Verlag，New York，1999)。
                             (2)标记物排斥(解除选择)
辨别分析和回归程序的计算机化执行包括步进式变量选择程序；例如，R中的步骤AIC。设计这些程序以选择最佳变量亚组用做说明性变量。实际上，由于这些程序的步进性质，不保证挑选到预测的最佳变量(Johnson和Wichern，299页)。然而，这种程序的确提供了标记物选择和解除选择的基础。
                             (3)成对式检验
在“实用多元变量的统计学分析”R.A.Johnson和D.W.Wichern，第二版，1988，Prentice Hall，H.J.中讨论了设计多类分类器中固有的问题。这是开发几种不同的二-类分类器的动机。
                             (4)面板组成中的多余考虑
“线性模型形成了分类统计学的核心并依然是许多统计学实践的基础”“具有S-PLUS的现代实用统计学”(W.N.Venable and B.D.Ripley，Springer-Verlag，Pathologist New York，1999)。线性模型是t-检验、方差分析(ANOVA)、回归分析以及各种多元变量方法包括辨别分析的基础。说明性变量可以或不可以作为第一次序项进入该模型。(非线性)逻辑回归也是这样。逻辑回归模型是线性回归模型的简单的非线性转化：因变量由对数优势率(对元)所取代。总之，这些统计学方法是基于说明性变量之间的线性关系。因此，寻找面板中多余部分的一个途径是鉴定高度相关的变量(标记物)。在面板中可以用一个标记物代替另一个标记物以获得相似的性能。
寻找面板中多余部分的另一种方法是进行“最佳亚组”回归分析。鉴于起始模型具有所有感兴趣的说明性变量，其目的是寻找最佳的单变量回归模型、最佳的双变量回归模型等。该方法在SAS统计学包中进行。
                      (5)权衡评分的应用
                      (a)商业和临床考虑
由于许多原因，包括策略上的和商业上的因素；成本；有用性；使用的便利性，它可优选地用于鼓励面板中某些探针的选择并惩罚其它探针的选择，同时针对面板的大小或性能直辖市这种选择。
                      (b)属性成本计算
这种属性权衡(在决策图中)的方法已在其它文章中的机器学习文献中提出，例如背景知识的结合(M.Nunez，“背景知识的应用”(The Use of BackgroundKnowledge)，机器学习(Machine Learning)6：231-250，1991)，以及从机器人传感器获得信息的差价成本计算(M.Tan，“分类知识的成本敏感性学习及其在机器人学中的应用”(Cost-sensitive Learning of Classification Knowledge and itsApplications in Robotics)，机器学习.13：7-33，1993)。
通过对被称为“C4.5”的标准机器学习软件包的微小改变进实这文献中的两种成本敏感算法(J.Ross Quinlan，“C4.5：用于机器学习的程序”，MorganKaufmann，CA.1993.)。为方便起见，在本方法后实行Nunez的“EG2”算法。
在.C4.5决策图构建阶段，该算法比较各个变量属性以分开和选择能获得最大量信息的一种属性，Gi。在EG2算法中，(2Gi-1)/(Ci+1)被最大化，将它并入属性i，Ci的信息成本。权衡的载体需要用户设定一个优先值。
                       (i)编码修改
修改C4.5源码以进行M.Nunez提出的经济的广义“EG2”算法(背景知识的应用，机器学习6：231-250，1991)。
对C4.5包的精确修改如下。
在文件“R8/Src/contin.c”中的下列行后。(J.Ross Quinlan，“C4.5：机器学习的程序”，Morgan Kaufmann，CA.1993)
ForEach(I，Xp，Lp-1)(if((Val＝SplitGain[i]-ThreshCost)>BestVal)(BestI＝I；BestVal＝Val；))
插入新的一行：
BestVal＝(powf(2.0，BestVal)-1.0/(AttributeCosts[Att]+1.0)
其中属性成本的向量事先已从用户保存的文本文件中读入。
                           (ii)实验方法
商品化的优选探针是：2、4、5、6、8、10、11、12、16、19、20、22、23、28。
为了举例，假设由于成本的原因上述探针是商品化的优选探针并希望考虑这种成本而重新选择检测面板。
采用修改的C4.5决策图软件，给予商品化的优选探针零罚分而非商品化优选探针2个罚分。用修改的C4.5算法运行10-倍交叉证实面板选择方法(如其它地方所描述的)。
                           (iii)结果
标准决策图检测面板由探针3、7、19、25、28组成。获得的面板成员：是2、6、7、10、19、25、28，它们仅使用了2个商品化优选探针，P7和P25。尽管由于对于这些数据它们的优良性能造成成本增加，注意到这些探针是用本方法选出的。该面板现在增大了：7个探针而原来为5个。对于这些数据面板性能没有明显下降，虽然作为降低探针成本的一种折衷方案其性能现在是次优的。
                           (iv)结论
已建立了一种将使用探针的成本并入面本选择方法的直接方法。
                       (c)错误分类成本计算
                           (i)背景
由于许多原因，可能需要选择最佳的面板，记住不同类型的分类错误的成本可能不同。例如，可能需要选择一个对一种疾病(比方说大细胞癌)具有增加的灵敏度的面板，并希望用模糊矩阵中某处特异性的降低和灵敏度来交换。
理论上，可能需要将错误分类成本的矩阵(具有与模糊矩阵相同的维度)包含了所有可能的成本组合。实际上，仅输入那些不一致(non unity)的花费(不履行default)。
商业决策图软件See5(RuleQuest Research Pty Ltd，30 Athena Avenue，St Ives Pathologist 3SW 2075，Australia.(http：//www.rulequest.com))包含了这一能力并用于下面的论证中。
                          (ii)目的
标准联合辨别面板(在别处描述的)由以下成员组成：P2、3、4、5、12、14、16、19、22、23、28。并给出如下估计的模糊矩阵：
                       (a)                   (b)                (c)                (d)                   (e)             <分类为------                ------              ------             ------                -------                   -                  -                     -24                    4                   2                  5                     2              (a)类别  腺癌8                     7                   3                  5                     4              (b)类别  大细胞癌1                     1                   33                 1                     4              (c)分类  间皮瘤6                     2                   1                  23                                   (d)分类  小细胞肺癌4                     4                   3                  2                     24             (e)分类  鳞状细胞癌
(检出)大细胞癌的灵敏度低至26％。如果希望在一个新设计的面板中提高这个灵敏度，可使用如下方法。
                          (iii)方法
产生如下成本文件：
ZF21Discrim的成本文件对“大细胞癌”灵敏度提高间皮瘤，大细胞癌：10腺癌，大细胞癌：10间皮瘤，大细胞癌：10小细胞肺癌，大细胞癌：10鳞状细胞癌，大细胞癌：10
该文件与任何其它癌症一样以10的系数向上权衡大细胞癌的错误分类。这将倾向于在这一类别中提高检测的灵敏度(在别处的性能降低)，但是没有权衡能够确保完美的分类。
采用了标准决策图面板选择方法(用See5而不是C4.5)。
                          (iv)结果
新的面板成员是：P2、3、4、5、6、9、12、14、16、17、25、28。具有估计的性能：
            (a)            (b)             (c)              (d)             (e)          <分类为------          ------          ------           ------          ---------            ---             ---              ---             ---20              13              1                1               2            (a)类别  腺癌3               13              3                2               6            (b)类别  大细胞癌癌1               9               27               2               1            (c)分类  间皮瘤2               9                                21                           (d)分类  小细胞肺癌癌1               15              2                1               18           (e)分类  鳞状细胞癌癌
以上证明了大细胞癌的估计灵敏度现在提高到48％。
                         (v)结论
证明了可将错误分类的差价成本计算包括面板选择方法中的直接方法。
  d.性能矩阵
表明各个方法的估计性能的分析提供的输出包括：
    i.ROC分析
接受器工作特征(ROC)曲线显示了分类器中不同阈值水平的假阳性和假阴性评分的估计百分比(或每单位概率)。一个无差别的分类器(不能比随机选择更好地辨别)，将显示ROC曲线具有相等的真和假读数。此曲线下的面积将为50％(0.5概率)。
曲线下的面积(AUC)常常用做分类器性能总的评估并且大多数商业购买的辨别函数包计算这一特征。一个完美的分类器将具有100％的曲线下面积，一个无价值的分类器将具有近50％的AUC(0.5)。
    ii.模糊矩阵：计数和百分率
模糊矩阵显示检验组的数据是怎样分类的。对于成对方式的检验，这些分类是真阳性、假阳性、真阴性或假阴性的评分的计数。这些可显示为实际计数或百分率。对于试图仅用一个面板得出唯一诊断的多方式面板，模糊矩阵将显示出各个正确分类的计数。例如，每次检测出小细胞癌，象这样它将被输入矩阵的一对角线。错误的评分；例如小细胞癌怎样经常地被错误地鉴定为鳞状细胞癌将被输入矩阵的适当的非对角线单元。利用误差率将模糊矩阵中的数据相加作为所有错误分类的总和除以分类的总数目，表示为百分率。
    iii.灵敏度和特异性
特异性指任何定义排除有病病例的程度。如果一个定义具有差的特异性，其假阳性就高。这意味着当实际上不存在疾病时，它标记个体有疾病症。灵敏度是指任何定义包括所有健康人的程度。如果一个定义具有差的灵敏度，其假阴性就高(患病的个体被错误地诊断为没有患病)。
3.数据分析和结果
  a.样品大小和变异性
·组合的病理学家1和病理学家2数据组的354个病例中，仅202个病例有每个标记物(变量或特征)的H-评分。
·完成观察的数量少和大量的变量导致评估问题(维度的原因)。因此，必需严格地删减用于建立分类器的变量数目。
·由于观察的数量少，将数据分成不同的训练组和检验组(对于分类器性能的健全估计是必需的)是不慎重的。由于这种原因，需要采用重新取样的方法(例如交叉证实和多重随机试验)。
·由于对各个类型的癌症的观察太少，用于癌症辨别的多类分类器的设计很困难。
  b.撤消-选择的标记物
标记物采用上述方法撤消选择。撤消选择的标记物在面板中以非-选择物表示。
  c.检测面板的组成
    i.选择的标记物探针
用于所有三种方法的选择的标记物探针概括于图5中。
    ii.最大程减小选择的标记物组
对于检测面板，很清楚对于一个标记物探针7传递了最佳的检测性能。分析了探针的组合以考察是否可能获更多探针的可靠面板。
                         (1)方法
逻辑回归方法允许最佳亚组根据性能测定(Fisher评分)进行排列。该分析用于选择1-5个探针的组合。Fishers线性辨别函数和对数模型(逻辑回归)用于说明这些组合的性能。上文显示了数据。
                         (2)结论
探针7自身作为一个分类器性能良好；然而，单用探针7的一个缺点是探针7具有高的假阴性评分。采用Fishers线性辨别函数作为一个分类器的最佳性能，是采用探针7和16。在采用其它组合的面板中结果的变异性提示更多的特征加入的噪声超过改进分类评分的任何潜能。少量的错误评分的样品产生了这些较稀有事件的统计学不良显示。设计具有较大量病例的分类器可能允许设计更好的分类器。根据数据的结构，采用不同分类器选择最佳探针组合的技术可能产生不同的最佳面板。
    iii.补充的标记物
显示可设计出适合不同探针的有用性的面板。可采用不同的方法选择这些亚组：决策图、逻辑回归、和线性辨别函数。数据在上文中显示。
方法
采用SPSS，将Fisher线性辨别函数应用于从面板获得的评分，其中由于选取限制因素应用了限制。例如，所有的探针获自一个供应商。另外，选择步进式选择来寻打特征的最佳组合。采用留出一个(Leave-One-Out)的交叉证实检验评估了性能。
    iv.另一种标记物：作用的生物学机制
(功能上等价的标记物)
本领域普通技术人员能够测定功能上等价的标记物。该面板中所用的标记物的功能行为在通篇文章中描述。
    v.标记物定位
本研究中所用的各种标记物的定位描述于本文的其它地方。
    vi.面板性能
三种方法的性能显示于上文中。
    vii.面板性能解释的局限
·由于小的数据组和需要采用重新取样的方法，分类器具有被过度删减的危险(使拟合数据大靠近)。
·采用细胞学标本的面板性能难以精确预测，由于不清楚痰液细胞学样品是否将含有足够数目的细胞，该细胞是组织学验证研究中的分析的细胞的代表。假定给出一个足够大小的细胞样品，人们还是希望优化的面板与细胞学标本表现相似。
  d.辨别面板的组成
    i.用于所有癌症的一种5-方面(5-way)面板
在三种分析技术中，只有决策图是接受单一的5-方面面板。因此构建了一种决策图以同时分类所有类型的肺癌。该面板的成员显示于图5中。该面板的性能在上文面板性能表中显示。
    ii.用于分辨一种类型肺癌和所有其它肺癌的检测面板板
线性辨别函数不能很好地适合于同时进行多类别分辨。分析了五个不同分类器的性能，其中分别设计每一个分类器以分辨一种癌症与合并的所有癌症组的差别，。当具有候选癌症之一时，这种组合具有不将其它病例分类的潜力，或当具有两种或多种候选癌症时分出一种疾病的潜力。这在识鉴定不一致病例作进一步检查中具有潜在的优越性。
已知道一种辨别面板对于所有癌症类型的总的误差率具有相当高(一个五种方式的分类器)。在上文显示的面板性能数据中，显示了五个成对方式分类器的性能，设计每种分类器能从四种其它可能的癌症中鉴定出一种癌症。这种方法与使用决策图和线性辨别函数进行分析相适应。这种技术当应用时，具有传递有两种以上解释发现的潜力，对一位患者给出两种或多种诊断，提示要作进一步的临床研究。该技术具有不传递发现的潜能，又一次提示要作进一步的调查(或许用检测面板进行再检验)。
    iii.说明检测面板的假阳性病例可能性的面板
可训练一个另外的面板来分辨假阳性病例(来自检测面板)和五种癌症类型之间的区别。这包括从检测面板中选出那些被错误地分类为异常的个体病例。这训练了一个对于检测这些“特殊”病例的较难问题的专用分类器。然而，虽然这在理论上是合理的任务，但数据组只产生这些病例中的四种，并且认为该人群对于分析不中充分代表性的。
    iv.选择的标记物
用于所有三种方法的选择的标记物探针概括于图5中。
    v.最大程度减少选出标记物组
本标题是在“采用不同方法获得相似结果论证方法的有效性”下提出的。
    vi.补充的标记物
本标题是在“采用不同方法获得相似结果论证方法的有效性”下提出的。
    vii.其它标记物：作用的生物学机制
本领域普通技术人员能够确定功能上等价的标记物。面板中所用的标记物的功能行为在通篇文章中描述。
    viii.标记物定位
本研究所用的各种标记物的定位在通篇文章中描述。
    ix.面板性能
三种方法的性能概括于图5中。
  e.权衡参数的作用
除前面讨论的用于标记物以及用于疾病(分类)的用户提供的权衡标准外，还可采用二元权衡方案。例如，如果权衡所有非-DAKO提供的探针为“0”，而且权衡所有DAKO提供的探针为“1”，那么最优化面板将仅含有DAKO提供的探针。这对于任何意图只采用它们的提供物来开发和销售分子诊断面板试剂盒的供应商是一种重要的产品设计能力。
  f.采用其它(非H-评分)客观评分参数的效果
    i.背景
含有一组逻辑框的病理检查表如下表32：
             表32：
强度0-5％6-25％26-50％51-75％＞75％   无01234   弱01234   适中01234   强01234
此标准评分系统采用通过给强度分级获得的“H评分”，如：无＝0，弱＝1，中＝2，强＝3，并且细胞百分比如：0-5％＝0，6-25％＝1，26-50％＝2，51-75％＝3，＞75％＝4，然后将两种级别相乘。例如，50％的弱染色加上50％的中等染色将得分10＝2×2+2×3。
    ii.方法
分析了另一种评分方法，其中反应被分为以下的低、中和高：
(a)如果超过50％的细胞具有中等或中等以上染色→高
(b)如果超过50％的细胞不染色→低
(c)其它→中
采用这种3-级因子代替H-评分重复决策图检测面板选择方法。如果需要，这使该图表在各个节点上分为3个分支。
    iii.结果
选出的面板为：探针3、7、10、11、16、19、20、28。具有如下的估计性能：
分类为->   (a)   (b)
对照(a)   79   22   特异性＝78％
癌症(b)   24   149   灵敏度＝86％
这应与具有H-评分的参考性能相比较：
分类为->  (a)  (b)
对照(a)  85  6 特异性＝78％
癌症(b)  5  120 灵敏度＝86％
    iv.结论
·当采用推荐的另一种评分系统时，性能基本上损失了(较大的面板、较低灵敏度和较低的特异性)。
·将H-评分处理为连续的变量(在0-12的范围内)似乎对在检测数据的基础上的面板选择是接近最佳的。
·没有检查许多其它可能的评分系统，但是它们对于实验检测的面板设计和开发方法是可行的和可采用的。
4.肺癌的检测和辨别面板
下面列出的是由上述说明性的实施例确定的典型的肺癌检测和辨别面板。注意尽管下文列出的面板列举了具体的探针，但各具体探针可为相关的探针或功能相关的探针所取代。
检测(无约束条件)
·结合有一种或多种附加探针的抗-细胞周期蛋白A
·抗-细胞周期蛋白A、抗-人上皮相关抗原(MOC-31)
·抗-细胞周期蛋白A、抗-ER-相关P29
·抗-细胞周期蛋白A、抗-成熟表面活性物质脱辅基蛋白B
·抗-细胞周期蛋白A、抗-人上皮相关抗原(MOC-31)、抗-VEGF
·抗-细胞周期蛋白A、抗-人上皮相关抗原(MOC-31)、抗-成熟表面活性物质脱辅基蛋白B
·抗-细胞周期蛋白A、抗-成熟表面活性物质脱辅基蛋白B、抗-人上皮相关抗原(MOC-31)、抗-VEGF
·抗-细胞周期蛋白A、抗-成熟表面活性物质脱辅基蛋白B、抗-人上皮相关抗原(MOC-31)、抗-表面活性物质脱辅基蛋白A
·抗-细胞周期蛋白A、抗-成熟表面活性物质脱辅基蛋白B、抗-人上皮相关抗原(MOC-31)、抗-VEGF、抗-表面活性物质脱辅基蛋白A
·抗-细胞周期蛋白A、抗-成熟表面活性物质脱辅基蛋白B、抗-人上皮相关抗原(MOC-31)、抗-VEGF、抗-细胞周期蛋白D1
·抗-细胞周期蛋白A、结合有一种或多种附加探针的抗-人上皮相关抗原(MOC-31)
·抗-细胞周期蛋白A、结合有一种或多种附加探针的抗-ER-相关P29
·抗-细胞周期蛋白A、结合有一种或多种附加探针的抗-成熟表面活性物质脱辅基蛋白B
·抗-细胞周期蛋白A、抗-人上皮相关抗原(MOC-31)、结合有一种或多种附加探针的抗-VEGF
·抗-细胞周期蛋白A、抗-人上皮相关抗原(MOC-31)、结合一种或多种附加探针的抗-成熟表面活性物质脱辅基蛋白B
·抗-细胞周期蛋白A、抗-成熟表面活性物质脱辅基蛋白B、抗-人上皮相关抗原(MOC-31)、结合有一种或多种附加探针的抗-VEGF
·抗-细胞周期蛋白A、抗-成熟表面活性物质脱辅基蛋白B、抗-人上皮相关抗原(MOC-31)、结合有一种或多种附加探针的抗-表面活性物质脱辅基蛋白A
·抗-细胞周期蛋白A、抗-成熟表面活性物质脱辅基蛋白B、抗-人上皮相关抗原(MOC-31)、抗-VEGF、结合有一种或多种附加探针的抗-表面活性物质脱辅基蛋白A
·抗-细胞周期蛋白A、抗-成熟表面活性物质脱辅基蛋白B、抗-人上皮相关抗原(MOC-31)、抗-VEGF、结合有一种或多种附加探针的抗-细胞周期蛋白D1
检测(W/O抗-细胞周期蛋白A)
·结合一种或多种附加探针的抗-Ki-67。
·结合有选自抗-VEGF、抗-人上皮相关抗原(MOC-31)、抗-TTF-1、抗-EGFR、抗-增殖性细胞核抗原和抗-成熟表面活性物质脱辅基蛋白B的任何一个探针的抗-Ki-67。
·结合有选自抗-VEGF、抗-人上皮相关抗原(MOC-31)、抗-TTF-1、抗-EGFR、抗-增殖性细胞核抗原和抗-成熟表面活性物质脱辅基蛋白B的任何两种探针的抗-Ki-67。
·结合有选自抗-VEGF、抗-人上皮相关抗原(MOC-31)、抗-TTF-1、抗-EGFR、抗-增殖性细胞核抗原和抗-成熟表面活性物质脱辅基蛋白B的任何三种探针的抗-Ki-67。
·结合有选自抗-VEGF、抗-人上皮相关抗原(MOC-31)、抗-TTF-1、抗-EGFR、抗-增殖性细胞核抗原和抗-成熟表面活性物质脱辅基蛋白B的任何四种探针的抗-Ki-67。
·结合有选自抗-VEGF、抗-人上皮相关抗原(MOC-31)、抗-TTF-1、抗-EGFR、抗-增殖性细胞核抗原和抗-成熟表面活性物质脱辅基蛋白B的任何五种探针的抗-Ki-67。
·抗-Ki-67、抗-VEGF、抗-人上皮相关抗原(MOC-31)、抗-TTF-1、抗-EGFR、抗-增殖性细胞核抗原和抗-成熟表面活性物质脱辅基蛋白B
·结合有选自抗-VEGF、抗-人上皮相关抗原(MOC-31)、抗-TTF-1、抗-EGFR、抗-增殖性细胞核抗原和抗-成熟表面活性物质脱辅基蛋白B的任何一个探针并具有一种或多种附加探针的抗-Ki-67。
·结合有选自抗-VEGF、抗-人上皮相关抗原(MOC-31)、抗-TTF-1、抗-EGFR、抗-增殖性细胞核抗原和抗-成熟表面活性物质脱辅基蛋白B的任何两种探针并具有一种或多种附加探针的抗-Ki-67。
·结合有选自抗-VEGF、抗-人上皮相关抗原(MOC-31)、抗-TTF-1、抗-EGFR、抗-增殖性细胞核抗原和抗-成熟表面活性物质脱辅基蛋白B的任何三种探针并具有一种或多种附加探针的抗-Ki-67。
·结合有选自抗-VEGF、抗-人上皮相关抗原(MOC-31)、抗-TTF-1、抗-EGFR、抗-增殖性细胞核抗原和抗-成熟表面活性物质脱辅基蛋白B的任何四种探针并具有一种或多种附加探针的抗-Ki-67。
·结合有选自抗-VEGF、抗-人上皮相关抗原(MOC-31)、抗-TTF-1、抗-EGFR、抗-增殖性细胞核抗原和抗-成熟表面活性物质脱辅基蛋白B的任何五种探针并具有一种或多种附加探针的抗-Ki-67。
·抗-Ki-67、抗-VEGF、抗-人上皮相关抗原(MOC-31)、抗-TTF-1、抗-EGFR、抗-增殖性细胞核抗原、抗-成熟表面活性物质脱辅基蛋白B和一种或多种附加探针。用商品化的优选探针进行检测
·结合有一种或多种附加探针的抗-Ki-67。
·结合有一种或多种附加探针的抗-TTF-1。
·结合有一种或多种附加探针的抗-EGFR。
·结合有一种或多种附加探针的抗-增殖性细胞核抗原。
·选自抗-Ki-67、抗-TTF-1、抗-EGFR和抗-增殖性细胞核抗原的两种探针。
·选自抗-Ki-67、抗-TTF-1、抗-EGFR和抗-增殖性细胞核抗原的三种探针。
·抗-Ki-67、抗-TTF-1、抗-EGFR和抗-增殖性细胞核抗原。
·选自抗-Ki-67、抗-TTF-1、抗-EGFR和抗-增殖性细胞核抗原、和一种或多种附加探针的两种探针。
·选自抗-Ki-67、抗-TTF-1、抗-EGFR和抗-增殖性细胞核抗原、和一种或多种附加探针的三种探针。
·抗-Ki-67、抗-TTF-1、抗-EGFR和抗-增殖性细胞核抗原、和一种或多种附加探针。
分辨腺癌和其它肺癌之间的差别
·抗-粘蛋白1和抗-TTF-1
·与选自抗-VEGF、抗-表面活性物质脱辅基蛋白A、抗-BCL2、抗-ER-相关P29和抗-Glut3的任何一种探针结合的抗-粘蛋白1和抗-TTF-1。
·与选自抗-VEGF、抗-表面活性物质脱辅基蛋白A、抗-BCL2、抗-ER-相关P29和抗-Glut3的任何两种探针结合的抗-粘蛋白1和抗-TTF-1。
·与选自抗-VEGF、抗-表面活性物质脱辅基蛋白A、抗-BCL2、抗-ER-相关P29和抗-Glut3的任何三种探针结合的抗-粘蛋白1和抗-TTF-1。
·与选自抗-VEGF、抗-表面活性物质脱辅基蛋白A、抗-BCL2、抗-ER-相关P29和抗-Glut3的任何四种探针结合的抗-粘蛋白1和抗-TTF-1。
·抗-VEGF、抗-表面活性物质脱辅基蛋白A、抗-粘蛋白1、抗-TTF-1、抗-BCL2、抗-ER-相关P29和抗-Glut3。
·抗-粘蛋白1、抗-TTF-1和一种或多种附加的探针。
·与选自抗-VEGF、抗-表面活性物质脱辅基蛋白A、抗-BCL2、抗-ER-相关P29和抗-Glut3的任何一种探针结合、并具有一种或多种附加探针的抗-粘蛋白1和抗-TTF-1。
·与选自抗-VEGF、抗-表面活性物质脱辅基蛋白A、抗-BCL2、抗-ER-相关P29和抗-Glut3的任何两种探针结合、并具有一种或多种附加探针的抗-粘蛋白1和抗-TTF-1。
·与选自抗-VEGF、抗-表面活性物质脱辅基蛋白A、抗-BCL2、抗-ER-相关P29和抗-Glut3的任何三种探针结合、并具有一种或多种附加探针的抗-粘蛋白1和抗-TTF-1。
·与选自抗-VEGF、抗-表面活性物质脱辅基蛋白A、抗-BCL2、抗-ER-相关P29和抗-Glut3的任何四种探针结合、并具有一种或多种附加探针的抗-粘蛋白1和抗-TTF-1。
·抗-VEGF、抗-表面活性物质脱辅基蛋白A、抗-粘蛋白1、抗-TTF-1、抗-BCL2、抗-ER-相关P29、抗-Glut3和一种或多种附加探针。
分辨鳞状细胞癌和其它肺癌之间的差别
·结合有一种或多种附加探针的抗-CD44v6。
·结合有选自抗-VEGF、抗-凝血调节蛋白、抗-Glut1、抗-ER-相关P29和抗-黑色素瘤相关抗原3的任何一种探针的抗-CD44v6。
·结合有选自抗-VEGF、抗-凝血调节蛋白、抗-Glut1、抗-ER-相关P29和抗-黑色素瘤相关抗原3的任何两种探针的抗-CD44v6。
·结合有选自抗-VEGF、抗-凝血调节蛋白、抗-Glut1、抗-ER-相关P29和抗-黑色素瘤相关抗原3的任何三种探针的抗-CD44v6。
·结合有选自抗-VEGF、抗-凝血调节蛋白、抗-Glut1、抗-ER-相关P29和抗-黑色素瘤相关抗原3的任何四种探针的抗-CD44v6。
·抗-CD44v6、抗-VEGF、抗-凝血调节蛋白、抗-Glut1、抗-ER-相关P29和抗-黑色素瘤相关抗原3。
·结合有选自抗-VEGF、抗-凝血调节蛋白、抗-Glut1、抗-ER-相关P29和抗-黑色素瘤相关抗原3的任何一种探针，并具有一种或多种附加探针的抗-CD44v6。
·结合有选自抗-VEGF、抗-凝血调节蛋白、抗-Glut1、抗-ER-相关P29和抗-黑色素瘤相关抗原3的任何两种探针，并具有一种或多种附加探针的抗-CD44v6。
·结合有选自抗-VEGF、抗-凝血调节蛋白、抗-Glut1、抗-ER-相关P29和抗-黑色素瘤相关抗原3的任何三种探针，并具有一种或多种附加探针的抗-CD44v6。
·结合有选自抗-VEGF、抗-凝血调节蛋白、抗-Glut1、抗-ER-相关P29和抗-黑色素瘤相关抗原3的任何四种探针，并具有一种或多种附加探针的抗-CD44v6。
·抗-CD44v6、抗-VEGF、抗-凝血调节蛋白、抗-Glut1、抗-ER-相关P29和抗-黑色素瘤相关抗原3和一种或多种附加探针。
分辨大细胞癌和其它肺癌之间的差别
·结合有一种或多种附加探针的抗-VEGF。
·抗-VEGF和抗-p120
·抗-VEGF和抗-Glut3
·抗-VEGF、抗-p120和抗-细胞周期蛋白A
·抗-VEGF、抗-p120和一种或多种附加探针
·抗-VEGF、抗-Glut3和一种或多种附加探针
·抗-VEGF、抗-p120、抗-细胞周期蛋白A和一种或多种附加探针分辨间皮瘤和其它肺癌之间的差别
·结合一种或多种附加探针的抗-CD44v6。
·结合一种或多种附加探针的抗-增殖性细胞核抗原。
·结合一种或多种附加探针的抗-人上皮相关抗原(MOC-31)
·与一种或多种附加探针结合的、选自抗-CD44v6、抗-增殖性细胞核抗原和抗-人上皮相关抗原(MOC-31)的两个探针
·抗-CD44v6、抗-增殖性细胞核抗原、抗-人上皮相关抗原(MOC-31)和一种或多种附加探针。
分辨小细胞肺癌和其它肺癌之间的差别
·结合一种或多种附加探针的抗-增殖性细胞核抗原。
·结合一种或多种附加探针的抗-BCL2。
·结合一种或多种附加探针的抗-EGFR。
·选自抗-增殖性细胞核抗原、抗-BCL2和抗-EGFR的两个探针
·抗-增殖性细胞核抗原、抗-BCL2、抗-EGFR
·选自抗-增殖性细胞核抗原、抗-BCL2和抗-EGFR，并结合一种或多种附加探针的两个探针
·抗-增殖性细胞核抗原、抗-BCL2、抗-EGFR和一种或多种附加探针同时分辨腺癌、鳞状细胞癌、大细胞癌、间皮瘤和小细胞癌的差别
·选自抗-VEGF、抗-凝血调节蛋白、抗-CD44v6、抗-表面活性物质脱辅基蛋白A、抗-增殖性细胞核抗原、抗-粘蛋白1、抗-人上皮相关抗原(MOC-31)、抗-TTF-1、抗-N-钙粘着蛋白、抗-EGFR和抗-增殖性细胞核抗原的两种或多种探针
·抗-VEGF、抗-凝血调节蛋白、抗-CD44v6、抗-表面活性物质脱辅基蛋白A、抗-增殖性细胞核抗原、抗-粘蛋白1、抗-人上皮相关抗原(MOC-31)、抗-TTF-1、抗-N-钙粘着蛋白、抗-EGFR和抗-增殖性细胞核抗原
·选自与一种或多种附加探针结合的、抗-VEGF、抗-凝血调节蛋白、抗-CD44v6、抗-表面活性物质脱辅基蛋白A、抗-增殖性细胞核抗原、抗-粘蛋白1、抗-人上皮相关抗原(MOC-31)、抗-TTF-1、抗-N-钙粘着蛋白、抗-EGFR和抗-增殖性细胞核抗原的两种或多种探针
·与一种或多种附加探针结合的抗-VEGF、抗-凝血调节蛋白、抗-CD44v6、抗-表面活性物质脱辅基蛋白A、抗-增殖性细胞核抗原、抗-粘蛋白1、抗-人上皮相关抗原(MOC-31)、抗-TTF-1、抗-N-钙粘着蛋白、抗-EGFR和抗-增殖性细胞核抗原
5.结论
  a.分子诊断面板方法的有效性
    i.非-直观解决方案
绘制柱形图(PathologistData.xls，工作表：柱形图)显示用于比较对照和癌症的各个探针的标记物评分的分布。从这些柱形图中清楚可见用于具体面板的探针的直观选择无疑是不明显的，并且在缺乏明显方法时描述的本发明允许寻找有效的组合。
    ii.各种产物用途的优化
    iii.采用不同方法获得的相似结果证实方法的有效性
本文中各种分析所获得结果的详细研究总结在图表中，显示了以下的发现。
1.各个探针性能的仔细研究没有制成可能比任何一个探针性能更好的明显探针组合。
2.对所有三种分类方法在相似的特征组基础上进行了评估。小的差异可归因于数据结构，这种数据结构可能对一种分类器比对另一种分类器更有利。
3.当检验设计过程中不让看见的独立的病理学家提供的数据时，用这些方法中的一种设计的所有分类器显示获得了良好的性能。这给予本发明很高的信心。
4.基于单用探针7的检测面板给出了高性能。
5.如果探针7与探针16或25组合，那么可获得更好的性能。
6.尽管其它探针与探针7组合似乎进一步改善性能，但捕捉额外病例的数量太少以致于它们可能不具有代表性并且如此设计的分类器不能通用。
7.选自除探针7外的探针面板的性能提供了某种辨别力，这种辨别力与当今实际用于人筛选的相比较是足够好的，但可能在未来的临床诊断细胞学领域中对自动化细胞计数器不是足够好的(见图6)。
8.其它探针组合可提供有用的、但较差的性能。
9.如果某些探针难以获得，本发明允许选择其它探针组合。这通过根据商品化的优选探针组的分类器设计作了说明。见图7。
10.本发明允许针对昂贵的探针采用权衡法，不是完全从分析中排除它们，如果它们的作用重要允许包含在面板中。
11.本发明允许设计一种类型肺癌的特异性辨别面板，该面板可从所有其它癌症中辨别出一种类型的肺癌。
12.一种能区分五种癌症的面板的性能分析显示辨别是可能的，但其总误差率比一组五个面板大，后者中各个面板设计用于从其它类型中辨别一种癌症。
13.一种非常有用的辨别力是通过组合五个两方法分类器而获得的。
14.通过用于五种辨别面板三种分类方法选出的普通探针组，再一次给出这一结果的可信性。
15.用于分离腺癌病例的探针是1、14、19、20、25和27。
16.用于分离鳞状细胞癌病例的探针是1、2、3、24、25和26。
17.用于分离大细胞肺癌病例的探针是1和7或1和21。
18.用于分离间皮瘤病例的探针是3、12和16。
19.用于分离小细胞肺癌病例的探针是12、20和23。
20.用于同时识别所有癌症的探针是1、2、3、4、12、14、19、22、23和28。
21.采用本发明定义的多重成对面板的优点是，可疑病例在五种面板的任何一种上可能不得分，而混淆的病例可在两种或多种面板上显示。这种反常的报告提醒细胞学家需要进一步的分析。
    iv.风险处理研究
应用于本研究的所有检验是根据实际统计的。当检验新的数据时根据性能上小的改进选出的探针有统计学变异的风险。为了得到结果的可信度，检验了对病理学家1和病理学家2的数据进行线性辨别分析的最佳分类器。应记住病理学家3的数据与病理学家1和病理学家2的数据有统计学差异，所以如果当采用病理学家3的数据检验时获得了良好结果，那么这的确是鼓舞人心的。
           (1)用未看见的数据进行检验的报告-检测面板
             (a)方法
在上文标题为“检测面板的组成”的章节中，我们显示了用特征7和16获得的良好分类。采用SUSS，选出报告了7和16的H评分的所有病理学家3的数据。然后利用转换和计算，产生了规范的辨别功能作为一个新特征。然后检验这一特征单独性能。
              (b)结果
这些是测试根据病理学家1和病理学家2的数据设计的分类器以及测试病理学家3的数据的结果。采用对探针7和16的线性辨别函数设计出分类器。规范的病理学家2的函数＝0.965*探针7-0.298*探针16。
采用探针7和16对病理学家3的数据进行分类的结果
                            预计的分组成员数              总数
               诊断(UCLA)                  0       1
原始计数                0                  20      1      21
                        1                  6       41     47
％                      0                  95.2    4.8    100.0
                        1                  12.8    87.2   100.0
交叉证实计数            0                  20      1      21
                        1                  6       41     47
％                      0                  95.2    4.8    100.0
                        1                  12.8    87.2   100.0
a.仅对分析的那些病例进行交叉证实。在交叉证实中，各个病例通过产生自除那个病例外的所有病例的函数进行分类。
b.89.7％的原始分组的病例被正确分类
c.89.7％的交叉证实分组的病例被正确分类
这比将根据探针7的病理学家3的数据分类更好，显示如下
只采用探针7对病理学家3的数据分类的结果
                              预计的分组成员数             总数
                  诊断(UCLA)                 0       1
原始计数                   0                 20      1     21
                           1                 8       39    47
％                         0                 95.2    4.8   100.0
                           1                 17.0    83.0  100.0
交叉证实计                 0                 20      1     21
数
                           1                 8       39    47
％                         0                 95.2    4.8   100.0
                           1                 17.0    83.0  100.0
a.仅对分析的那些病例进行交叉证实。在交叉证实中，各个病例通过产生自除那个病例外的所有病例的函数进行分类。
b.86.8％的原始分组的病例被正确分类
c.86.8％的交叉证实分组的病例被正确分类
             (c)结论
这使人们相信基于7和16的双-探针分类器比仅用探针7的更好。
          (2)用未看见的数据进行检验的报告-辨别面板
             (a)背景
下面的报告是采用病理学家1和病理学家2采用LOF得出的数据设计并用未看见的病理学家3的数据检验过的分类器的性能。在设计阶段病例数相对少，而且检验数据的病例数也少，所以在第一和第二组的性能之间可预见变异性程度良好。
             (b)方法
在SPSS中，建立了标题为“模式识别”的章节中产生的标准辨别函数并根据病理学家3的数据对所有五种类型的癌症进行检验。
             (c)结果
间皮瘤LDF＝探针3sc*.385-探针12s*.317+探针16s*1.006
分类结果
                              预计的分组成员数             总数
                 间皮瘤＝1                   0       1
                   其它＝0
原始计数                 0                   38      2     40
                         1                   1       7     8
％                       0                   95.0    5.0   100.0
                         1                   12.5    87.5  100.0
交叉证实计数             0                   38      2     40
                         1                   1       7     8
％                       0                   95.0    5.0   100.0
                         1                   12.5    87.5  100.0
a.仅对分析的那些病例进行交叉证实。在交叉证实中，各个病例通过产生自除那个病例外的所有病例的函数进行分类。
b.93.8％的原始分组的病例被正确分类
c.93.8％的交叉证实分组的病例被正确分类
小细胞癌LDF＝探针12s*.575-探针20s*.408-探针22s*.423+探针23s*.344
分类结果
                               预计的分组成员数                总数
              小细胞癌＝1                     0        1
                  其它＝0
原始计数                0                     39       3       42
                        1                     1        5       6
％                      0                     92.9     7.1     100.0
                        1                     16.7     83.3    100.0
交叉证实计数            0                     39       3       42
                        1                     1        5       6
％                      0                     92.9     7.1     100.0
                        1                     16.7     83.3    100.0
a.仅对分析的那些病例进行交叉证实。在交叉证实中，各个病例通过产生自除那个病例外的所有病例的函数进行分类。
b.91.7％的原始分组的病例被正确分类
c.91.7％的交叉证实分组的病例被正确分类
鳞状细胞癌LDF＝探针1sc*.328-探针2sc*.295-探针3sc*.741+探针24s*.490+探针25s*.393+探针26s*.426
分类结果
                             预计的分组成员数                  总数
            鳞状细胞癌＝1                   0         1
                  其它＝0
原始计数                0                   31        4        35
                        1                   2         9        11
％                      0                   88.6      11.4     100.0
                        1                   18.2      81.8     100.0交叉证实计数              0                   31        4        35
                        1                   2         9        11
％                      0                   88.6      11.4     100.0
                        1                   18.2      81.8     100.0
a.仅对分析的那些病例进行交叉证实。在交叉证实中，各个病例通过产生自除那个病例外的所有病例的函数进行分类。
b.87.0％的原始分组的病例被正确分类
c.87.0％的交叉证实分组的病例被正确分类
大细胞癌LDF＝探针1sc*.847+探针7sc*.452
分类结果
                        预计的分组成员数              总数
           大细胞癌＝1                 0       1
               其它＝0
原始计数             0                 23      15     38
                     1                 4       5      9
％                   0                 60.5    39.5   100.0
                     1                 44.4    55.6   100.0
交叉证实计数         0                 23      15     38
                     1                 4       5      9
％                   0                 60.5    39.5   100.0
                     1                 44.4    55.6   100.0
a.仅对分析的那些病例进行交叉证实。在交叉证实中，各个病例通过产生自除那个病例外的所有病例的函数进行分类。
b.59.6％的原始分组的病例被正确分类
c.59.6％的交叉证实分组的病例被正确分类
用非常少量的大细胞癌的病例设计和检验的分类器的性能较低但有用，所以这一结果仍非常令人鼓舞。
腺癌，LDF＝探针4sc*.515+探针5sc*.299-探针14s*.485+探针19s*.347+探针20s*.723+探针25s*.327+探针27s*.327
分类结果
                        预计的分组成员数              总数
              腺癌＝1                  0       1
              其它＝0
原始计数            0                  29      5      34
                    1                  0       14     14
％                  0                  85.3    14.7   100.0
                    1                  0       100.0  100.0
交叉证实计数        0                  29      5      34
                    1                  0       14     14
％                  0                  85.3    14.7   100.0
                    1                  0       100.0  100.0
a.仅对分析的那些病例进行交叉证实。在交叉证实中，各个病例通过产生自除那个病例外的所有病例的函数进行分类。
b.89.6％的原始分组的病例被正确分类
c.89.6％的交叉证实分组的病例被正确分类
             (d)结论
注意到这些分类器的性能经得起应用于不看见数据的检验是非常鼓舞人心的。这得出在检测各个癌症的能力上具有非常高的把握。
         (3)对不同患者和病理学家的数据进行训练和检验
作为有效性(robustness)的“最后”检验，在病理学家1和病理学家2检查的数据上训练了LDF。这样去除了病理学家3检查的数据。因此对病理学家3和病理学家1检查的数据进行了检验，数据没有偏差。以前，通过采用用于检测和训练的同一患者的数据的检验过程具有偏差。
LDF产生了相同的特征组，除了不包括探针4。该LDF＝探针1sc*.288+探针7sc*.846-探针15s*.249-探针16s*.534
分类结果
曲线下的面积＝0.977
                          预计的分组成员数                总数
             诊断(UCLA)                  0        1
原始计数              0                  20       0       20
                      1                  9        37      46
％                    0                  100.0    .0      100.0
                      1                  19.6     80.4    100.0
交叉证实计数          0                  20       0       20
                      1                  9        37      46
％                    0                  100.0    .0      100.0
                      1                  19.6     80.4    100.0
a.仅对分析的那些病例进行交叉证实。在交叉证实中，各个病例通过产生自除那个病例外的所有病例的函数进行分类。
b.86.4％的原始分组的病例被正确分类
c.86.4％的交叉证实分组的病例被正确分类
对病理学家3的数据仅用探针7仍获得了一个合理的结果，但是与曲线下较小的面积相似的结果，。
分类结果
曲线下面积＝.908
                        预计的分组成员数             总数
             诊断(UCLA)                0       1
原始计数              0                19      1     20
                      1                7       39    46
％                    0                95.0    5.0   100.0
                      1                15.2    84.8  100.0
交叉证实计数          0                19      1     20
                      1                7       39    46
％                    0                95.0    5.0   100.0
                      1                15.2    84.8  100.0
a.仅对分析的那些病例进行交叉证实。在交叉证实中，各个病例通过产生自除那个病例外的所有病例的函数进行分类。
b.87.9％的原始分组的病例被正确分类
c.87.9％的交叉证实分组的病例被正确分类
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Claims (47)

1.一种采用细胞为基础的诊断检测普通疾病状态或分辨特殊疾病状态之间的区别的检测面板，其特征在于，所述面板包含多个探针，每一个探针能特异性地结合与普通或特殊病状联合的标记物，其中细胞学样品中面板的成分探针与细胞结合的模式诊断所述疾病的存在或具体特性具有诊断意义。
2.如权利要求1所述的面板，其特征在于，所述普通疾病选自癌症和传染病。
3.如权利要求2所述的面板，其特征在于，所述癌症选自上皮细胞为基础的癌症、实体瘤为基础的癌症、分泌性肿瘤为基础的癌症和血液为基础的癌症。
4.如权利要求2所述的面板，其特征在于，所述传染病选自细胞为基础的疾病，其中传染性生物是病毒、细菌、原生动物、寄生虫或真菌。
5.如权利要求1所述的面板，其特征在于，所述面板通过权衡以下因数得以优化，所述因素选自成本、一地区中流行的普通疾病一地区中流行的特殊疾病探针的可用性和商业上的考虑。
6.如权利要求1所述的面板，其特征在于，所述各个探针含有一个可检测的标记物。
7.如权利要求6所述的面板，其特征在于，所述探针包含抗体。
8.如权利要求6所述的面板，其特征在于，所述标记物选自生色团、荧光团、染料、放射性同位素和酶。
9.如权利要求8所述的面板，其特征在于，所述标记物是可用电磁辐射检测的生色团，所述电磁辐射选自β射线、γ射线、X射线、紫外线、可见光、红外线和微波。
10.如权利要求1所述的面板，其特征在于，所述结合模式用光子显微镜检术检测。
11.如权利要求10所述的面板，其特征在于，所述光子显微镜检术利用至少一种电磁辐射，所述电磁辐射选自γ射线、X射线、β射线、紫外线、可见光、红外线和微波。
12.如权利要求3所述的面板，其特征在于，所述检测是用于肺癌，而所述分辨是辨别鳞状细胞癌、腺癌、大细胞癌、小细胞癌和间皮瘤之间的区别。
13.如权利要求1所述的面板，其特征在于，所述检测是用于性传播播疾病而所述分辨是辨别原体、滴虫(trichomonas)、淋病、疱疹和梅毒之间的区别。
14.一种形成采用细胞为基础检测诊断检测患者疾病或在疾病状态之间区别的面板的方法，其特征在于，所述方法包括：
(a)确定探针结合的灵敏度和特异性，各个探针能特异性地结合与一疾病相关的标记物文库的一个成员；和
(b)选择有限数量的所述探针，其结合模式对于所述疾病的存在或具体特性有诊断意义。
15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述确定包括：
(a)分别将从已知患有所述疾病的患者的组织学或细胞学样品和已知没有患所述疾病的患者的组织学或细胞学样品与所述的各个探针接触；
(b)测定在已知所述标记物存在于所述样品的细胞中的位置上，各个探针与其互补的疾病标记物特异性结合的量；和
(c)使所述的各个量与所述疾病的存在和具体特性相关联。
16.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述选择包括一种或多种统计学分析方法、模式识别方法和神经网络分析。
17.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述选择包括采用权衡因素方法。
18.一种检测疾病或分辨疾病状态之间的区别的方法，其特征在于，所述方法包括：
(a)使怀疑含有某疾病的特征性异常细胞的细胞学样品与权利要求1所述的面板接触；和
(b)检测所述探针的结合模式，所述模式对于所述疾病的存在或具体特性具有诊断意义。
19.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述细胞学样品是从体液、上皮细胞为基础的器官系统、细针抽吸物(fine needle aspiration)或活组织检查收集的细胞样品。
20.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述细胞学样品是痰液。
21.一种采用细胞为基础的诊断检测普通疾病或分辨特殊疾病状态之间区别的面板，其特征在于，所述面板根据权利要求14所述的方法形成。
22.如权利要求21所述的面板，其特征在于，所述疾病是肺癌。
23.如权利要求1所述的面板，其特征在于，所述疾病标记物选自形态学生物标记物、遗传性生物标记物、细胞周期生物标记物、分子生物标记物和生化生物标记物。
24.如权利要求3所述的面板，其特征在于，所述上皮细胞为基础的癌症是呼吸道、尿道、胃肠道或生殖道癌症。
25.如权利要求3所述的面板，其特征在于，所述实体瘤为基础的癌症选自肉瘤、乳腺癌、胰腺癌、肝癌、肾癌、甲状腺癌、和前列腺癌。
26.如权利要求3所述的面板，其特征在于，所述分泌性肿瘤为基础的癌症选自肉瘤、乳腺癌、胰腺癌、肝癌、肾癌、甲状腺癌、和前列腺癌。
27.如权利要求3所述的面板，其特征在于，所述血液为基础的癌症选自白血病和淋巴瘤。
28.如权利要求24所述的面板，其特征在于，所述疾病是肺癌并且所述探针结合的标记物选自Glut1、HERA、FGF、端粒酶、PCNA、CD44v6、细胞周期蛋白A、HGF、MUC-1、甲状腺转录因子、VEGF、EGF受体、PCNA、nm23、E-钙粘着蛋白、Bcl-2、细胞周期蛋白D1、RB、N-粘着蛋白、凝血调节蛋白及它们的功能性等价物。
29.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述体液选自血液、尿、脊髓液和淋巴液。
30.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述上皮细胞为基础的器官系统选自呼吸道、尿道、生殖道和胃肠道。
31.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述细针抽吸物取自器官和系统中的实体组织类型。
32.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述活组织检查取自器官和系统中的实体组织类型。
33.如权利要求31或32所述的方法，其特征在于，所述器官和系统选自乳房、胰腺、肝、肾、甲状腺、骨髓、肌肉、前列腺和肺。
34.如权利要求23所述的面板，其特征在于，所述形态学生物标记物选自DNA倍性、MACs和恶变前的病灶。
35.如权利要求23所述的面板，其特征在于，所述遗传性生物标记物选自DNA加合物、DNA突变和细胞凋亡指数。
36.如权利要求23所述的面板，其特征在于，所述细胞周期生物标记物选自细胞增殖标记物、分化标记物、调节分子和细胞凋亡标记物。
37.如权利要求23所述的面板，其特征在于，所述分子生物标记物或生化生物标记物选自致癌基因、肿瘤抑制基因、肿瘤抗原、生长因子和受体、酶、蛋白质、前列腺素和粘附分子。
38.如权利要求24所述的面板，其特征在于，所述肺部癌症是肺癌。
39.如权利要求38所述的用于检测肺癌的面板，其特征在于，所述多个探针包括能与细胞周期蛋白A、或其相关的标记物或其功能上相关的标记物结合的探针。
40.如权利要求39所述的面板，其特征在于，所述多个探针还包括能与SP-B、HERA或ER-相关的(p29)、或相关的标记物或其功能上相关的标记物结合的一种或多种探针。
41.如权利要求38所述的能分辨腺癌与其它类型肺癌中区别的面板，其特征在于，所述多个探针包括能与粘蛋白1和甲状腺转录因子1、或其相关的标记物或其功能上相关的标记物结合的探针。
42.如权利要求41所述的面板，其特征在于，所述多个探针还包括能与VEGF、SP-A、BCL-2、ER-相关的(p29)和Glut3、或其相关的标记物或其功能上相关的标记物结合的一种或多种探针。
43.如权利要求38所述的能分辨与鳞状细胞癌其它类型肺癌的区别的面板，其特征在于，所述多个探针包括能结合CD44v6和ER-相关的(p29)之一或二者、或其相关的标记物或其功能上相关的标记物的探针。
44.如权利要求43所述的面板，其特征在于，所述多个探针还包括能与VEGF、凝血调节蛋白、Glut1和MAGE3、或其相关的标记物或其功能上相关的标记物结合的一种或多种探针。
45.如权利要求38所述的能分辨大细胞癌与其它类型肺癌的区别的面板，其特征在于，所述多个探针包括能与VEGF、细胞周期蛋白A和P120、或其相关的标记物或其功能上相关的标记物结合的一种或多种探针。
46.如权利要求38所述的能分辨间皮瘤与其它类型肺癌的区别的面板，其特征在于，所述多个探针包括能与CD44v6、PCNA和HERA，或其相关的标记物或其功能上相关的标记物结合的一种或多种探针。
47.如权利要求38所述的能分辨小细胞癌与其它类型肺癌的区别的面板，其特征在于，所述多个探针包括与PCNA、BCL-2和EGFR、或其相关的标记物或其功能上相关的标记物结合的一种或多种探针。
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