ES2685702T3

ES2685702T3 - Obtención de perfil de expresión génica en tejidos tumorales biopsiados

Info

Publication number: ES2685702T3
Application number: ES16181799.4T
Authority: ES
Inventors: Joffre Baker; Maureen T. Cronin; Michael C. Kiefer; Steve Shak; Michael G. Walker
Original assignee: Genomic Health Inc
Current assignee: Genomic Health Inc
Priority date: 2002-03-13
Filing date: 2003-03-12
Publication date: 2018-10-10
Anticipated expiration: 2023-03-12
Also published as: HK1148032A1; US10241114B2; JP2013146277A; CA2478850C; EP1488007A1; US8071286B2; EP2258873A2; EP2261369B1; US20070065845A1; CA2478850A1; DK1918386T3; ES2374311T3; EP1918386A1; ATE529535T1; US20070141588A1; AU2003253986A1; US20070141589A1; EP2261368A1; US20070059737A1; WO2003078662A9

Abstract

Un método para predecir la probabilidad de supervivencia a largo plazo de un paciente con cáncer de mama sin recidiva de cáncer de mama, después de la escisión quirúrgica del tumor primario, que comprende: determinar el nivel del transcrito de ARN de GSTM1 en una muestra de tejido de cáncer de mama obtenida del paciente, normalizada frente al nivel de expresión de todos los transcritos de ARN ensayados en la muestra, o frente a un conjunto de referencia de transcritos de ARN, en el que el nivel normalizado aumentado del transcrito de ARN de GSTM1 comparado con el nivel normalizado del transcrito de ARN de GSTM1 en un conjunto de referencia de tejido de cáncer de mama indica una mayor probabilidad de supervivencia a largo plazo sin recidiva de cáncer de mama.

Description

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referencia; y

(b) predecir la resistencia o la sensibilidad reducida si el nivel de expresión normalizado de ERCC1 está en el percentil 10º superior.

5 La divulgación se refiere adicionalmente a un método para predecir la respuesta de una paciente diagnosticada con cáncer de mama a un ErbB2 o antagonista EGFR, que comprende las etapas de:

(a) someter el ARN extraído de un tejido de cáncer de mama obtenido de la paciente a un análisis de la expresión génica, en el que los niveles de expresión génicos se normalizan contra un gen o genes de

10 control, y en comparación con la cantidad que se encuentra en un conjunto de tejido de cáncer de mama de referencia; y

(b) predecir la respuesta del paciente en base a los niveles de expresión normalizados de al menos uno de Grb7, IGF1R, IGF1 e IGF2.

15 En una realización particular, se predice una respuesta positiva si el nivel de expresión normalizado de Grb7 está en el percentil 10º superior, y la expresión de IGF1R, IGF1 e IGF2 no se eleva por encima del percentil 90º.

En una realización particular adicional, se predice una disminución de la capacidad de respuesta si se eleva el nivel de expresión de al menos uno de IGF1R, IGF1 e IGF2.

20 En otro aspecto, la divulgación se refiere a un método para predecir la respuesta de una paciente diagnosticada con cáncer de mama a un fármaco de bis-fosfonato, que comprende las etapas de:

(a) someter el ARN extraído de un tejido de cáncer de mama obtenido de la paciente a un análisis de la

25 expresión génica, en el que los niveles de expresión génicos se normalizan contra un gen o genes de control, y en comparación con la cantidad que se encuentra en un conjunto de tejido de cáncer de mama de referencia; y

(b) predecir una respuesta positiva si el tejido de cáncer de mama obtenido del paciente expresa Ha-Ras

mutante y expresa adicionalmente farnesil pirofosfato sintetasa o geranil pirofosfona sintetasa a un nivel de 30 expresión normalizado en o por encima del percentil 90º.

En otro aspecto más, la divulgación se refiere a un método para predecir la respuesta de una paciente diagnosticada con cáncer de mama a un tratamiento con un inhibidor de ciclooxigenasa 2, que comprende las etapas de:

35 (a) someter el ARN extraído de un tejido de cáncer de mama obtenido de la paciente a un análisis de la expresión génica, en el que los niveles de expresión génicos se normalizan contra un gen o genes de control, y en comparación con la cantidad que se encuentra en un conjunto de tejido de cáncer de mama de referencia; y

(b) predecir una respuesta positiva si el nivel de expresión normalizado de COX2 en el tejido de cáncer de 40 mama obtenido del paciente está en o por encima del percentil 90º.

La divulgación se refiere adicionalmente a un método para predecir la respuesta de una paciente diagnosticada con cáncer de mama a un antagonista del receptor EGF (EGFR), que comprende las etapas de:

45 (a) someter el ARN extraído de un tejido de cáncer de mama obtenido de la paciente a un análisis de la expresión génica, en el que los niveles de expresión génicos se normalizan contra un gen o genes de control, y en comparación con la cantidad que se encuentra en un conjunto de tejido de cáncer de mama de referencia; y

(b) predecir una respuesta positiva a un antagonista de EGFR, si (i) el nivel de expresión normalizado de

50 EGFR está en o por encima del percentil 10º, y (ii) el nivel de expresión normalizado de al menos uno de epirregulina, TGF-α, anfirregulina, ErbB3, BRK, CD9, MMP9, CD82, y Lot1 está por encima del percentil 90º.

En otro aspecto, la divulgación se refiere a un método para controlar la respuesta de una paciente diagnosticada con

55 cáncer de mama a un tratamiento con un antagonista de EGFR, que comprende controlar el nivel de expresión de un gen seleccionado del grupo que consiste en epirregulina, TGF-α, anfirregulina, ErbB3, BRK, CD9, MMP9, CD82, y Lot1 en el paciente durante el tratamiento, en el que la reducción en el nivel de expresión es indicativa de la respuesta positiva a dicho tratamiento.

60 En otro aspecto más, la divulgación se refiere a un método para predecir la respuesta de una paciente diagnosticada con cáncer de mama a un fármaco dirigido a tirosina cinasa seleccionado del grupo que consiste en abl, c-kit,

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del paciente.

La divulgación proporciona adicionalmente un método para predecir la probabilidad de recidiva del cáncer de mama en un paciente diagnosticado con cáncer de mama, que comprende determinar la relación de p53:p21 de la

5 expresión de ARNm o p53:mdm2 de la expresión de ARNm en un tejido de cáncer de mama obtenido del paciente, normalizada contra un gen o genes de control, y en comparación con la cantidad que se encuentra en un conjunto de tejido de cáncer de mama de referencia, en el que una relación normal anterior es indicativa de un riesgo mayor de recidiva. Típicamente, un mayor riesgo de recidiva se indica si la relación está en el percentil 10º superior.

10 En otro aspecto más, la divulgación se refiere a un método para predecir la probabilidad de recidiva del cáncer de mama en una paciente de cáncer de mama tras la cirugía, que comprende determinar el nivel de expresión de ciclina D1 en un tejido de cáncer de mama obtenido del paciente, normalizado contra un gen o genes de control, y en comparación con la cantidad que se encuentra en un conjunto de tejido de cáncer de mama de referencia, en el que un nivel de expresión en el percentil 10º superior indica un aumento del riesgo de recidiva tras la cirugía. En una

15 realización particular de este método, el paciente se somete a quimioterapia adyuvante, si el nivel de expresión está en el percentil 10º superior.

Otro aspecto de la divulgación es un método para predecir la probabilidad de recidiva del cáncer de mama en una paciente de cáncer de mama tras la cirugía, que comprende determinar el nivel de expresión de APC o E-cadherina

20 en un tejido de cáncer de mama obtenido del paciente, normalizado contra un gen o genes de control, y en comparación con la cantidad que se encuentra en un conjunto de tejido de cáncer de mama de referencia, en el que un nivel de expresión en el percentil 5º superior indica un alto riesgo de recidiva tras la cirugía, y un mayor riesgo de acortar la supervivencia.

25 Un aspecto adicional de la divulgación es un método para predecir la respuesta de una paciente diagnosticada con cáncer de mama a un tratamiento con un fármaco proapoptótico que comprende determinar los niveles de expresión de BC12 y c-MYC en un tejido de cáncer de mama obtenido del paciente, normalizados contra un gen o genes de control, y en comparación con la cantidad que se encuentra en un conjunto de tejido de cáncer de mama de referencia, en el que (i) un nivel de expresión de BC12 en el percentil 10º superior en ausencia de la elevada

30 expresión de c-MYC indica una buena respuesta, y (ii) no se indica una buena respuesta si el nivel de expresión c-MYC se eleva, independientemente del nivel de expresión de BC12.

Aún un aspecto adicional de la divulgación es un método para predecir el desenlace del tratamiento para un paciente diagnosticado con cáncer de mama, que comprende las etapas de:

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(a) someter el ARN extraído de un tejido de cáncer de mama obtenido de la paciente a un análisis de la expresión génica, en el que los niveles de expresión génicos se normalizan contra un gen o genes de control, y en comparación con la cantidad que se encuentra en un conjunto de tejido de cáncer de mama de referencia; y

40 (b) determinar los niveles de expresión normalizados de NFkB y al menos un gen seleccionado del grupo que consiste en cIAP1, cIAP2, XIAP y Survivina,

en el que se indica un mal pronóstico si los niveles de expresión para NFkB y al menos uno de los genes seleccionados del grupo que consiste en cIAP1, cIAP2, XIAP, y Survivina están en el percentil 5º superior.

45 La divulgación se refiere adicionalmente a un método para predecir el desenlace del tratamiento para un paciente diagnosticado con cáncer de mama, que comprende determinar los niveles de expresión de p53BP1 y p53BP2 en un tejido de cáncer de mama obtenido del paciente, normalizados contra un gen o genes de control, y en comparación con la cantidad que se encuentra en un conjunto de tejido de cáncer de mama de referencia, en el que se predice un

50 mal desenlace si el nivel de expresión de p53BP1 o p53BP2 está en el percentil 10º inferior.

La divulgación se refiere adicionalmente a un método para predecir el desenlace del tratamiento para un paciente diagnosticado con cáncer de mama, que comprende determinar los niveles de expresión de uPA y PAI1 en un tejido de cáncer de mama obtenido del paciente, normalizados contra un gen o genes de control, y en comparación con la 55 cantidad que se encuentra en un conjunto de tejido de cáncer de mama de referencia, en el que (i) se predice un mal desenlace si los niveles de expresión de uPA y PAI1 están en el percentil 20º superior, y (ii) se predice una disminución del riesgo de recidiva si los niveles de expresión de uPA y PAI1 no se elevan por encima de la media observada en el conjunto de referencia de cáncer de mama. En una realización particular, el mal desenlace se mide en cuanto a acortar la supervivencia o aumentar el riesgo de recidiva del cáncer tras la cirugía. En otra realización

60 particular, se expresan uPA y PAI1 a niveles normales, y el paciente se somete a quimioterapia adyuvante tras la cirugía.

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Otro aspecto de la divulgación es un panel de dos o más cebadores específicos de genes seleccionados del grupo que consiste en los cebadores directos e inversos enumerados en la Tabla 2.

Otro aspecto más de la divulgación es un método para la transcripción inversa de una población de ARN

5 fragmentado en la amplificación por RT-PCR, que comprende usar una multiplicidad de cebadores específicos de genes como los cebadores inversos en la reacción de amplificación. En una realización particular, el método usa entre dos y aproximadamente 40.000 cebadores específicos de genes en la misma reacción de amplificación. En otra realización, los cebadores específicos de genes son de aproximadamente 18 a 24 bases, tal como de aproximadamente 20 bases de longitud. En otra realización, la Tm de los cebadores es aproximadamente 58-60 ºC.

10 Los cebadores pueden seleccionarse, por ejemplo, del grupo que consiste en los cebadores directos e inversos enumerados en la Tabla 2.

La divulgación también se refiere a un método de transcriptasa inversa impulsado por la síntesis de ADNc de primera cadena, que comprende usar un cebador específico de genes de aproximadamente 18 a 24 bases de 15 longitud y que tiene una Tm óptima entre aproximadamente 58 ºC y aproximadamente 60 ºC. En una realización particular, la síntesis de ADNc de la primera cadena se sigue por la amplificación de ADN por PCR, y el cebador sirve como el cebador inverso que impulsa la amplificación por PCR. En otra realización, el método usa una pluralidad de cebadores específicos de genes en la misma mezcla de reacción de la síntesis de ADNc de primera cadena. El número de los cebadores específicos de genes puede ser, por ejemplo, entre 2 y aproximadamente

20 40.000.

En un aspecto diferente, la invención se refiere a un método de predicción de la probabilidad de supervivencia a largo plazo de un paciente de cáncer de mama sin la recidiva del cáncer de mama, tras la eliminación quirúrgica del tumor primario, que comprende determinar el nivel de expresión de un transcrito de ARN de pronóstico en una

25 muestra de tejido de cáncer de mama obtenida de dicho paciente, normalizado contra el nivel de expresión de un conjunto de referencia de transcritos de ARN, en el que el transcrito de pronóstico es GSTM1, en el que la sobreexpresión de GSTM3 indica un aumento de la probabilidad de supervivencia a largo plazo sin recidiva de cáncer de mama.

30 En una realización particular de este método, se determina el nivel de expresión de al menos 2, preferiblemente al menos 5, más preferiblemente al menos 10, mucho más preferiblemente al menos 15 transcritos de pronóstico o sus productos de expresión.

Cuando el cáncer de mama es carcinoma de mama invasivo, incluyendo tanto tumores que sobreexpresan el

35 receptor de estrógenos (RE) (positivos para RE) como negativos para RE, el análisis incluye la determinación de los niveles de expresión de los transcritos de al menos dos de los siguientes genes, o sus productos de expresión: FOXM1, PRAME, Bcl2, STK15, CEGP1, Ki-67, GSTM1, PR, BBC3, NME1, SURV, GATA3, TFRC, YB-1, DPYD, Src, CA9, Contig51037, RPS6K1 y Her2.

40 Cuando el cáncer de mama es carcinoma de mama invasivo positivo para RE positive, el análisis incluye la determinación de los niveles de expresión de los transcritos de al menos dos de los siguientes genes, o sus productos de expresión: PRAME, Bcl2, FOXM1, DIABLO, EPHX1, HIF1A, VEGFC, Ki-67, IGF1R, VDR, NME1, GSTM3, Contig51037, CDC25B, CTSB, p27, CDH1, e IGFBP3.

45 Al igual que anteriormente, se prefiere determinar los niveles de expresión de al menos 5, más preferiblemente al menos 10, mucho más preferiblemente al menos 15 genes, o sus respectivos productos de expresión.

En una realización particular, se determina el nivel de expresión de uno o más transcritos de ARN de pronóstico, donde el ARN puede obtenerse, por ejemplo, a partir de un espécimen de tejido de cáncer de mama incluido en cera

50 fijado del paciente. El aislamiento de ARN puede realizarse, por ejemplo, siguiendo cualquiera de los procedimientos que se han descrito anteriormente o a lo largo de toda la solicitud, o mediante cualquier otro método conocido en la técnica.

En otro aspecto más, la divulgación se refiere a una matriz que comprende polinucleótidos que hibridan en los

55 siguientes genes: FOXM1, PRAME, Bcl2, STK15, CEGP1, Ki-67, GSTM1, PR, BBC3, NME1, SURV, GATA3, TFRC, YB-1, DPYD, CA9, Contig51037, RPS6K1 y Her2, inmovilizados sobre una superficie sólida.

En una realización particular, la matriz comprende polinucleótidos que hibridan en los siguientes genes: FOXM1, PRAME, Bcl2, STK15, CEGP1, Ki-67, GSTM1, CA9, PR, BBC3, NME1, SURV, GATA3, TFRC, YB-1, DPYD, 60 GSTM3, RPS6 KB1, Src, Chk1, ID2, EstR1, p27, CCNB1, XIAP, Chk2, CDC25B, IGF1R, AK055699, P13KC2A, TGFB3, BAGI1, CYP3A4, EpCAM, VEGFC, pS2, hENT1, WISP1, HNF3A, NFKBp65, BRCA2, EGFR, TK1, VDR,

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En todos los aspectos, los polinucleótidos pueden ser ADNc ("matrices de ADNc") que son típicamente de aproximadamente 500 a 5000 bases de longitud, aunque también se pueden usar ADNc más cortos o más largos y están dentro del alcance de esta invención. Como alternativa, los polinucleótidos pueden ser oligonucleótidos

5 (micromatrices de ADN), que son típicamente de aproximadamente 20 a 80 bases de longitud, aunque también son adecuados los oligonucleótidos más cortos y más largos y están dentro del alcance de la invención. La superficie sólida puede ser, por ejemplo, vidrio o nylon, o cualquier otra superficie sólida usada típicamente en la preparación de matrices, tales como micromatrices, y es típicamente vidrio.

10 Breve descripción de los dibujos

La figura 1 es un gráfico que ilustra el flujo de trabajo del proceso de la invención para la medición de la expresión génica. En la figura, FPET significa “tejido incluido en parafina fijado” y “RT-PCR” significa “PCR de transcriptasa inversa”. Se determina la concentración de ARN usando el protocolo y reactivo de

15 cuantificación de ARN RiboGreen™ comercial. La figura 2 es un diagrama de flujo que muestra las etapas de un método de extracción de ARN según la invención junto a un diagrama de flujo de un método comercial representativo. La figura 3 es un esquema que ilustra las etapas de un método mejorado para preparar ARNm fragmentado para el análisis de obtención del perfil de expresión.

20 La figura 4 ilustra métodos para la amplificación de ARN antes de la RT-PCR. La figura 5 ilustra un esquema alternativo para la reparación y amplificación de ARNm fragmentado. La figura 6 muestra la medición de los niveles de ARNm del receptor de estrógenos en 40 muestras de cáncer de mama FPE mediante RT-PCR. Se usaron tres secciones de 10 micrómetros para cada medición. Cada punto de datos representa el promedio de mediciones por triplicado.

25 La figura 7 muestra los resultados de la medición de los niveles de ARNm del receptor de progesterona en 40 muestras de cáncer de mama FPE mediante RT-PCR realizada tal como se describe en la leyenda de la figura 6 anterior. La figura 8 muestra resultados de un experimento de IVT/RT-PCR. La figura 9 es una representación de la expresión de 92 genes a través de 70 muestras de cáncer de mama

30 FPE. El eje y muestra la expresión como tiempos de ciclo umbral. Estos genes son un subconjunto de los genes enumerados en la tabla 1. La tabla 1 muestra una lista de genes del cáncer de mama. La tabla 2 expone las secuencias de cebadores y amplicones usadas para la amplificación de ARNm fragmentado.

35 La tabla 3 muestra los números de registro y las SEQ ID NO de los genes del cáncer de mama examinados.

Descripción detallada de la realización preferida

40 A. Definiciones

A menos que se defina otra cosa, los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que se entiende comúnmente por un experto habitual en la técnica a la que esta invención pertenece. Singleton y col., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2ª ed., J. Wiley & Sons (Nueva York,

45 NY 1994), y March, Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Structure 4ª ed., John Wiley & Sons (Nueva York, NY 1992), proporcionan al experto en la técnica una guía general para muchos de los términos usados en la presente solicitud.

Un experto en la técnica reconocerá muchos métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el

50 presente documento, que podrían usarse en la práctica de la presente invención. De hecho, la presente invención no se limita de ningún modo a los métodos y materiales descritos. Para los fines de la presente invención, los siguientes términos se definen a continuación.

El término “micromatriz” se refiere a una disposición ordenada de elementos de alineamiento hibridables, 55 preferiblemente sondas de polinucleótido, sobre un sustrato.

El término “polinucleótido”, cuando se usa en singular o plural, se refiere generalmente a cualquier polirribonucleótido o polidesoxirribonucleótido, que puede ser ADN o ARN no modificado o ADN o ARN modificado. Por tanto, por ejemplo, los polinucleótidos tal como se definen en el presente documento incluyen, sin limitación, 60 ADN mono y bicatenario, ADN que incluye regiones mono y bicatenarias, ARN mono y bicatenario, y ARN que incluye regiones mono y bicatenarias, moléculas híbridas que comprenden ADN y ARN que puede ser

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monocatenario o, más normalmente, bicatenario o incluyen regiones mono y bicatenarias. Además, el término “polinucleótido” como se usa en el presente documento, se refiere a regiones tricatenarias que comprenden ARN o ADN o tanto ARN como ADN. Las cadenas en tales regiones pueden ser de la misma molécula o de moléculas diferentes. Las regiones pueden incluir todas de una o más de las moléculas, pero más normalmente implican sólo 5 una región de algunas de las moléculas. Una de las moléculas de una región de triple hélice es a menudo un oligonucleótido. El término “polinucleótido” incluye específicamente ADN y ARN que contienen una o más bases modificadas. Por lo tanto, ADN o ARN con estructuras principales modificadas para lograr estabilidad o por otros motivos son “polinucleótidos” tal como está previsto el término en el presente documento. Además, ADN o ARN que comprenden bases poco comunes, tales como inosina, o bases modificadas, tales como bases tritiadas, se incluyen

10 dentro del término “polinucleótidos” tal como se define en el presente documento. En general, el término “polinucleótido” abarca todas las formas química, enzimática y/o metabólicamente modificadas de polinucleótidos no modificados, así como las formas químicas de ADN y ARN características de virus y células, incluyendo células sencillas y complejas.

15 El término “oligonucleótido” se refiere a un polinucleótido relativamente corto, incluyendo, sin limitación, desoxirribonucleótidos monocatenarios, ribonucleótidos mono o bicatenarios, híbridos de ARN:ADN y ADN bicatenarios. Los oligonucleótidos, tales como oligonucleótidos de sonda de ADN monocatenario, se sintetizan a menudo por métodos químicos, por ejemplo usando sintetizadores de oligonucleótidos automatizados que están comercialmente disponibles. Sin embargo, pueden prepararse oligonucleótidos mediante una variedad de otros

20 métodos, incluyendo técnicas mediadas por ADN recombinante in vitro y mediante la expresión de ADN en células y organismos.

Las expresiones “gen expresado de manera diferencial”, “expresión génica diferencial” y sus sinónimos, que se usan de manera intercambiable, se refieren a un gen cuya expresión se activa a un nivel superior o inferior en un sujeto 25 que padece una enfermedad, específicamente cáncer, tal como cáncer de mama, con respecto a su expresión en un sujeto normal o control. Las expresiones también incluyen genes cuya expresión se activa a un nivel superior o inferior en diferentes estadios de la misma enfermedad. Se entiende también que un gen expresado de manera diferencial puede o bien activarse o inhibirse al nivel de ácido nucleico o nivel de proteína, o bien puede someterse a corte y empalme alternativo para dar como resultado un producto de polipéptido diferente. Tales diferencias pueden 30 evidenciarse mediante un cambio en los niveles de ARNm, expresión superficial, secreción u otro reparto de un polipéptido, por ejemplo. La expresión génica diferencial puede incluir una comparación de la expresión entre dos o más genes, o una comparación de las razones de la expresión entre dos o más genes, o incluso una comparación de dos productos procesados de manera diferente del mismo gen, que difieren entre sujetos normales y sujetos que padecen una enfermedad, específicamente cáncer, o entre diversos estadios de la misma enfermedad. La expresión 35 diferencial incluye tanto diferencias cuantitativas, así como cualitativas, en el patrón de expresión celular o temporal en un gen o sus productos de expresión entre, por ejemplo, células enfermas y normales, o entre células que han experimentado diferentes acontecimientos de enfermedad o estadios de enfermedad. Para el fin de esta invención, se considera que está presente “expresión génica diferencial” cuando existe una diferencia de al menos aproximadamente dos veces, preferiblemente al menos aproximadamente cuatro veces, más preferiblemente al

40 menos aproximadamente seis veces, lo más preferiblemente al menos aproximadamente diez veces entre la expresión de un gen dado en sujetos normales y enfermos, o en diversos estadios del desarrollo de la enfermedad en un sujeto enfermo.

La expresión “amplificación génica” se refiere a un procedimiento mediante el cual se forman múltiples copias de un

45 gen o fragmento de gen en una línea celular o célula particular. La región duplicada (un tramo de ADN amplificado) a menudo se denomina “amplicón”. Habitualmente, la cantidad del ARN mensajero (ARNm) producido, es decir, el nivel de expresión génica, también aumenta en la proporción del número de copias producidas del gen expresado particular.

50 El término “pronóstico” se usa en el presente documento para referirse a la predicción de la probabilidad de progresión o muerte atribuible al cáncer, incluyendo recidiva, propagación metastásica y resistencia a fármacos, de una enfermedad neoplásica, tal como cáncer de mama. El término “predicción” se usa en el presente documento para referirse a la probabilidad de que un paciente responda o bien favorable o bien desfavorablemente a un fármaco o conjunto de fármacos, y también el grado de estas respuestas. Los métodos predictivos de la presente

55 invención pueden usarse clínicamente para tomar decisiones de tratamiento eligiendo las modalidades de tratamiento más apropiadas para cualquier paciente particular. Los métodos predictivos de la presente invención son herramientas valiosas en la predicción si es probable que un paciente responda favorablemente a un régimen de tratamiento, tal como intervención quirúrgica, quimioterapia con un fármaco dado o combinación de fármacos, y/o radioterapia.

60 La expresión “aumento de resistencia” a un fármaco particular u opción de tratamiento, cuando se usa según la

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presente invención, significa reducción de la respuesta con respecto a una dosis convencional del fármaco o a un protocolo de tratamiento convencional.

La expresión “reducción de la sensibilidad” a un fármaco particular u opción de tratamiento, cuando se usa según la

5 presente invención, significa reducción de la respuesta con respecto a una dosis convencional del fármaco o a un protocolo de tratamiento convencional, cuando la respuesta reducida puede compensarse (al menos parcialmente) aumentando la dosis del fármaco o la intensidad de tratamiento.

Puede evaluarse la “respuesta del paciente” usando cualquier criterio de evaluación que indique un beneficio al

10 paciente, incluyendo, sin limitación, (1) inhibición, en algún grado, del crecimiento tumoral, incluyendo ralentización y detención completa del crecimiento; (2) reducción del número de células tumorales; (3) reducción del tamaño del tumor; (4) inhibición (es decir, reducción, ralentización o detención completa) de la infiltración de células tumorales en tejidos y/u órganos periféricos adyacentes; (5) inhibición (es decir, reducción, ralentización o detención completa) de la metástasis; (6) potenciación de la respuesta inmunitaria antitumoral, que puede, pero no tiene que, dar como

15 resultado la regresión o el rechazo del tumor; (7) alivio, en algún grado, de uno o más síntomas asociados con el tumor; (8) aumento en la duración de la supervivencia tras el tratamiento; y/o (9) reducción de la mortalidad en un punto de tiempo dado tras el tratamiento.

El término “tratamiento” se refiere tanto a tratamiento terapéutico como profiláctico o medidas preventivas, en el que

20 el objeto es prevenir o ralentizar (disminuir) el trastorno o estado patológico seleccionado como diana. Los que necesitan tratamiento incluyen los que ya tienen el trastorno así como los propensos a tener el trastorno o aquellos en los que va a prevenirse el trastorno. En el tratamiento del tumor (por ejemplo, cáncer), un agente terapéutico puede reducir directamente la patología de células tumorales, o hacer que las células tumorales sean más susceptible al tratamiento mediante otros agentes terapéuticos, por ejemplo, radiación y/o quimioterapia.

25 El término “tumor”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a toda proliferación y crecimiento de células neoplásicas, ya sean malignas o benignas, y todos los tejidos y células cancerosas y precancerosas.

Los términos “cáncer” y “canceroso” se refieren a o describen el estado fisiológico en mamíferos que se caracteriza

30 normalmente por crecimiento de células no regulado. Los ejemplos de cáncer incluyen, pero sin limitación, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer de pulmón, cáncer de próstata, cáncer hepatocelular, cáncer gástrico, cáncer pancreático, cáncer cervical, cáncer de ovarios, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, cáncer de las vías urinarias, cáncer de tiroides, cáncer renal, carcinoma, melanoma y cáncer de cerebro.

35 La “patología” del cáncer incluye todos los fenómenos que comprometen el bienestar del paciente. Esto incluye, sin limitación, crecimiento de células anómalo o no controlado, metástasis, interferencia con el funcionamiento normal de células vecinas, liberación de citocinas u otros productos secretores a niveles anómalos, supresión o agravamiento de la respuesta inflamatoria o inmunológica, neoplasia, premalignidad, malignidad, invasión de órganos o tejidos distantes o circundantes, tales como ganglios linfáticos, etc.

40 La “rigurosidad” de las reacciones de hibridación puede determinarse fácilmente por un experto habitual en la técnica, y generalmente es un cálculo empírico dependiente de la longitud de la sonda, temperatura de lavado y concentración de sales. En general, sondas más largas requieren temperaturas superiores para un apareamiento apropiado, mientras que sondas más cortas necesitan temperaturas inferiores. La hibridación depende generalmente

45 de la capacidad del ADN desnaturalizado para hibridarse de nuevo cuando están presentes cadenas complementarias en un entorno por debajo de su temperatura de fusión. Cuanto mayor es el grado de homología deseada entre la sonda y la secuencia hibridable, mayor es la temperatura relativa que puede usarse. Como resultado, se deduce que temperaturas relativas superiores tenderían a hacer las condiciones de reacción más rigurosas, mientras que temperaturas inferiores las harían menos rigurosas. Para detalles adicionales y explicación

50 de la rigurosidad de reacciones de hibridación, véase Ausubel y col., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995).

“Condiciones rigurosas” o “condiciones de alta rigurosidad”, como se definen en el presente documento, normalmente: (1) emplean fuerza iónica baja y temperatura elevada para el lavado, por ejemplo cloruro de sodio 55 0,015 M/citrato de sodio 0,0015 M/dodecilsulfato de sodio al 0,1 % a 50 ºC; (2) emplean durante la hibridación un agente de desnaturalización, tal como formamida, por ejemplo, formamida al 50 % (v/v) en albúmina sérica bovina al 0,1 %/Ficoll al 0,1 %/polivinilpirrolidona al 0,1 %/tampón fosfato de sodio 50 mM a pH 6,5 con cloruro de sodio 750 mM, citrato de sodio 75 mM a 42 ºC; o (3) emplean formamida al 50 %, 5 x SSC (NaCl 0,75 M, citrato de sodio 0,075 M) , fosfato de sodio 50 mM (pH 6,8), pirofosfato de sodio al 0,1 %, 5 x disolución de Denhardt, ADN de 60 esperma de salmón sonicado (50 μg/ml), SDS al 0,1 % y sulfato de dextrano al 10 % a 42 ºC, con lavados a 42 ºC en 0,2 x SSC (cloruro de sodio/citrato de sodio) y formamida al 50 % a 55 ºC seguido de un lavado de alta

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rigurosidad que consiste en 0,1 x SSC que contiene EDTA a 55 ºC.

“Condiciones moderadamente rigurosas” pueden identificarse tal como se describe por Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laborator y Manual, Nueva York: Cold Spring Harbor Press, 1989, e incluyen el uso de disolución de 5 lavado y condiciones de hibridación (por ejemplo, temperatura, fuerza iónica y % de SDS) menos rigurosas que las descritas anteriormente. Un ejemplo de condiciones moderadamente rigurosas es la incubación durante la noche a 37 ºC en una disolución que comprende: formamida al 20 %, 5 x SSC (NaCl 150 mM, citrato de trisodio 15 mM), fosfato de sodio 50 mM (pH 7,6), 5 x disolución de Denhardt, sulfato de dextrano al 10 % y 20 mg/ml de ADN de esperma de salmón fragmentado desnaturalizado, seguido de lavado de los filtros en 1 x SSC a aproximadamente

10 37-50 ºC. El experto reconocerá cómo ajustar la temperatura, fuerza iónica, etc. según sea necesario para adaptar factores tales como la longitud de la sonda y similares.

En el contexto de la presente invención, la referencia a “al menos uno”, “al menos dos”, “al menos cinco”, etc. de los genes enumerados en cualquier conjunto de genes particular significa una cualquiera o cualquiera y todas las

15 combinaciones de los genes enumerados.

Las expresiones “corte y empalme” y “corte y empalme de ARN” se usan de manera intercambiable y se refieren al procesamiento del ARN que elimina intrones y une exones para producir ARNm maduro con secuencia codificante continua que se traslada al citoplasma de una célula eucariota.

20 En teoría, el término “exón” se refiere a cualquier segmento de un gen interrumpido que está representado en el producto de ARN maduro (B. Lewin. Genes IV Cell Press, Cambridge Mass. 1990). En teoría, el término “intrón” se refiere a cualquier segmento de ADN que se transcribe pero se elimina del transcrito cortando y empalmando juntos los exones en cualquier lado del mismo. Operativamente, se producen secuencias de exón en la secuencia de

25 ARNm de un gen tal como se define por los números de Ref. Seq ID. Operativamente, las secuencias de intrón son las secuencias intermedias dentro del ADN genómico de un gen, entremedias de las secuencias de exón y que tienen secuencias consenso de corte y empalme GT y AG en sus extremos 5' y 3'.

B. Descripción detallada

30 La practica de la presente invención empleará, a menos que se indique otra cosa, técnicas convencionales de biología molecular (incluyendo técnicas recombinantes), microbiología, biología celular y bioquímica, que están dentro del conocimiento de la técnica. Tales técnicas se explican completamente en la bibliografía, tal como, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2ª edición (Sambrook y col., 1989); "Oligonucleotide Synthesis" (M.J.

35 Gait, ed., 1984); "Animal Cell Culture" (R.I. Freshney, ed., 1987); "Methods in Enzymology" (Academic Press, Inc.); "Handbook of Experimental Immunology", 4ª edición (D.M. Weir & C.C. Blackwell, eds., Blackwell Science Inc., 1987); "Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells" (J.M. Miller & M.P. Calos, eds., 1987); "Current Protocols in Molecular Biology" (F.M. Ausubel y col., eds., 1987); y "PCR: The Polymerase Chain Reaction", (Mullis y col., eds., 1994).

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1. Obtención del perfil de expresión génica

En general, los métodos de obtención del perfil de expresión génica pueden dividirse en dos grandes grupos: métodos basados en análisis de hibridación de polinucleótidos y métodos basados en la secuenciación de

45 polinucleótidos. La mayoría de los métodos comúnmente usados conocidos en la técnica para la cuantificación de la expresión de ARNm en una muestra incluyen transferencia de tipo Northern e hibridación in situ (Parker & Barnes, Methods in Molecular Biology 106: 247-283 (1999)); ensayos de protección de ARNasa (Hod, Biotechniques 13: 852854 (1992)); y reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa (RT-PCR) (Weis y col., Trends in Genetics 8: 263-264 (1992)). Como alternativa, pueden emplearse los anticuerpos que pueden reconocer dúplex

50 específicos, incluyendo dúplex de ADN, dúplex de ARN y dúplex híbridos de ADN-ARN o dúplex de proteína-ADN. Los métodos representativos para el análisis de la expresión génica basado en secuenciación incluyen análisis en serie de la expresión génica (SAGE), y análisis de la expresión génica mediante secuenciación de firma masiva en paralelo (MPSS).

55 2. PCR de transcriptasa inversa (RT PCR)

De las técnicas enumeradas anteriormente, el método cuantitativo más sensible y más flexible es RT-PCR, que puede usarse para comparar los niveles de ARNm en diferentes poblaciones de muestra, en tejidos normales y tumorales, con o sin tratamiento con fármacos, para caracterizar patrones de expresión génica, para discriminar

60 entre ARNm estrechamente relacionados y analizar la estructura del ARN.

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un patrón interno. Se expresa el patrón interno ideal a un nivel constante entre diferentes tejidos, y no se ve afectado por el tratamiento experimental. Los ARN más frecuentemente usados para normalizar los patrones de expresión génica son ARNm para los genes de mantenimiento gliceraldehído-3-fosfato-deshidrogenasa (GAPDH) y β-actina.

5 Una variación más reciente de la técnica de RT-PCR es la PCR cuantitativa en tiempo real, que mide la acumulación de producto de PCR a través de una sonda fluorigénica doblemente marcada (es decir, sonda TaqMan®). La PCR en tiempo real es compatible tanto con la PCR competitiva cuantitativa, en la que se usa un competidor interno para cada secuencia diana para la normalización, como con la PCR comparativa cuantitativa usando un gen de normalización contenido dentro de la muestra, o un gen de mantenimiento para RT-PCR. Para detalles adicionales

10 véase, por ejemplo, Held y col., Genome Research 6: 986-994 (1996).

3. Micromatrices

También puede identificarse la expresión génica diferencial, o confirmarse, usando la técnica de micromatrices. Por

15 lo tanto, puede medirse el perfil de expresión de genes asociados con cáncer de mama en tejido de tumor o bien incluido en parafina o bien reciente, usando tecnología de micromatrices. En este método, se siembran en placas las secuencias de polinucleótido de interés, o se alinean, en un sustrato de microchip. Entonces se hibridan las secuencias alineadas con sondas de ADN específicas de células o tejidos de interés. Justo como en el método de RT-PCR, la fuente de ARNm normalmente es ARN total aislado de tumores humanos o líneas celulares tumorales, y

20 las correspondientes líneas celulares o tejidos normales. Por tanto, puede aislarse ARN a partir de una variedad de tumores primarios o líneas celulares tumorales. Si la fuente de ARNm es un tumor primario, puede extraerse el ARNm, por ejemplo, de muestras de tejido congelado o incluido en parafina archivado y fijado (por ejemplo fijado con formalina), que se preparan de manera rutinaria y se conservan en la práctica clínica diaria.

25 En una realización específica de la técnica de micromatrices, se aplican insertos amplificados por PCR de clones de ADNc a un sustrato en un alineamiento denso. Preferiblemente, se aplican al menos 10.000 secuencias de nucleótidos al sustrato. Los genes microalineados, inmovilizados en el microchip a 10.000 elementos cada uno, son adecuados para la hibridación en condiciones rigurosas. Pueden generarse sondas de ADNc marcadas de manera fluorescente pueden generarse a través de la incorporación de nucleótidos fluorescentes mediante transcripción

30 inversa de ARN extraído de tejidos de interés. Las sondas de ADNc marcadas aplicadas al chip se hibridan con especificidad a cada punto de ADN en el alineamiento. Tras el lavado riguroso para eliminar sondas no unidas específicamente, se explora el chip mediante microscopía láser confocal o mediante otro método de detección, tal como una cámara CCD. La cuantificación de la hibridación de cada elemento alineado permite la evaluación de la correspondiente abundancia de ARNm. Con la fluorescencia de doble color, se hibridan por parejas sondas de ADNc

35 marcadas por separado generadas a partir de dos fuentes de ARN en el alineamiento. Por lo tanto, se determina simultáneamente la abundancia relativa de los transcritos a partir de las dos fuentes correspondientes a cada gen especificado. La escala miniaturizada de la hibridación permite una evaluación rápida y conveniente del patrón de expresión para grandes números de genes. Se ha mostrado que tales métodos tienen la sensibilidad requerida para detectar transcriptos raros, que se expresan a unas pocas copias por célula, y para detectar de manera reproducible

40 diferencias de al menos aproximadamente dos veces en los niveles de expresión (Schena y col., Proc, Natl. Acad. Sci. USA 93(2): 106-149 (1996)). El análisis de micromatrices puede realizarse mediante equipo comercialmente disponible, siguiendo los protocolos del fabricante, tal como usando la tecnología Affymetrix GenChip, o la tecnología de micromatrices de Incyte.

45 El desarrollo de métodos de micromatrices para análisis a gran escala de la expresión génica hace posible buscar sistemáticamente marcadores moleculares de la clasificación del cáncer y la predicción del desenlace en una variedad de tipos tumorales.

4. Análisis en serie de la expresión génica (SAGE)

50 El análisis en serie de la expresión génica (SAGE) es un método que permite el análisis cuantitativo y simultáneo de un gran número de transcritos de genes, sin la necesidad de proporcionar una sonda de hibridación individual para cada transcrito. En primer lugar, se genera una etiqueta de secuencia corta (aproximadamente 10-14 pb) que contiene información suficiente para identificar de manera única un transcrito, siempre que se obtenga el marcador a

55 partir de una posición única dentro de cada transcrito. Entonces, muchos transcritos se unen entre sí para formar moléculas en serie largas, que pueden secuenciarse, revelando la identidad de las múltiples etiquetas simultáneamente. El patrón de expresión de cualquier población de transcritos puede evaluarse cuantitativamente determinando la abundancia de marcadores individuales e identificando el gen correspondiente a cada etiqueta. Para más detalles véanse, por ejemplo, Velculescu y col., Science 270: 484-487 (1995); y Velculescu y col., Cell 88:

60 243-51 (1997).

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el uso de ningún disolvente orgánico, eliminando así la necesidad de múltiples manipulaciones asociadas con la eliminación del disolvente orgánico, y reduciendo sustancialmente el tiempo total en el protocolo. Según la invención, la cera, por ejemplo parafina se elimina de las muestras de tejido incorporado en cera mediante incubación a 6575 ºC en un tampón de lisis que solubiliza el tejido e hidroliza la proteína, tras el enfriamiento para solidificar la cera.

5 La figura 2 muestra un diagrama de flujo de un protocolo de extracción de ARN de la presente invención en comparación con un método comercial representativo, usando xileno para eliminar la cera. Se muestran en el diagrama los tiempos requeridos para las etapas individuales en los procedimientos y para los procedimientos globales. Tal como se muestra, el proceso comercial requiere aproximadamente el 50 % más tiempo que el

10 procedimiento de la invención.

El tampón de lisis puede ser cualquier tampón conocido para la lisis celular. Sin embargo, se prefiere que no se usen métodos basados en oligo-dT de purificación selectiva de ARNm poliadenilado para aislar el ARN para la presente invención, ya que se espera que la masa de las moléculas de ARNm esté fragmentada y por tanto no tendrán una

15 cola poliadenilada intacta, y no se recuperarán o estarán disponibles para ensayos analíticos posteriores. De otra manera, puede usarse cualquier número de esquemas de purificación de ácido nucleico convencionales. Estos incluyen extracciones con disolvente orgánico y caótropo, extracción usando perlas de vidrio o filtros, métodos basados en precipitación y precipitación con sales, o cualquiera de los métodos de purificación conocidos en la técnica para recuperar el ARN total o ácido nucleicos totales a partir de una fuente biológica.

20 Están disponibles en el mercado tampones de lisis, tal como, por ejemplo, de Qiagen, Epicentre o Ambion. Un grupo preferido de tampones de lisis normalmente contiene urea, y proteinasa K u otra proteasa. La proteinasa K es muy útil en el aislamiento de ADN o ARN no dañado, de alta calidad, puesto que la mayoría de las ADNasas y ARNasas de mamíferos se inactivan rápidamente por esta enzima, especialmente en presencia de dodecilsulfato de sodio al 0,

25 5 -1 % (SDS). Esto es particularmente importante en el caso de ARN, que es más susceptible a la degradación que el ADN. Mientras que las ADNasas requieren iones de metal para la actividad, y por tanto pueden inactivarse fácilmente mediante agentes quelantes, tales como EDTA, no existe ningún requisito de cofactor similar para ARNasas.

30 El enfriamiento y la solidificación resultante de la cera permite una fácil separación de la cera del ácido nucleico total, que puede precipitarse convenientemente, por ejemplo mediante isopropanol. El procesamiento adicional depende del fin pretendido. Si el método propuesto del análisis de ARN se ve sometido a un sesgo por ADN contaminante en un extracto, puede tratarse adicionalmente el extracto de ARN, por ejemplo mediante ADNasa, tras la purificación para eliminar específicamente el ADN mientras que se conserva el ARN. Por ejemplo, si el objetivo es aislar ARN de

35 alta calidad para posterior amplificación por RT-PCR, a la precipitación del ácido nucleico le sigue la eliminación de ADN, habitualmente mediante tratamiento con ADNasa. Sin embargo, puede eliminarse el ADN en diversas fases del aislamiento del ácido nucleico, mediante ADNasa u otras técnicas bien conocidas en la técnica.

Aunque las ventajas del protocolo de extracción de ácidos nucleicos de la invención son lo más evidentes para el

40 aislamiento de ARN de muestras de tejido incorporado en parafina, archivado, la etapa de eliminación de la cera de la presente invención, que no implica el uso de un disolvente orgánico, también puede incluirse en cualquier protocolo convencional para la extracción de ácido nucleico total (ARN y ADN) o ADN sólo. Todos estos aspectos están específicamente dentro del alcance de la invención.

45 Usando calor seguido de enfriamiento para eliminar la parafina; el procedimiento de la presente invención ahorra tiempo de procesamiento valioso, y elimina una serie de manipulaciones, aumentando así potencialmente el rendimiento de ácido nucleico. De hecho, las pruebas experimentales presentadas en los ejemplos a continuación demuestran que el método de la presente invención no compromete el rendimiento de ARN.

50 8. Cebado específico de gen multiplexado en 5' de la transcripción inversa

La RT-PCR requiere la transcripción inversa de la población de ARN de prueba como primera etapa. El cebador más comúnmente usado para la transcripción inversa es oligo-dT, que funciona bien cuando el ARN está intacto. Sin embargo, este cebador no será eficaz cuando el ARN esté sumamente fragmentado como es el caso en los tejidos

55 FPE.

La presente invención incluye el uso de cebadores específicos de gen, que tienen aproximadamente 20 bases de longitud con una Tm óptima entre aproximadamente 58 ºC y 60 ºC. Estos cebadores también servirán como cebadores inversos que dirige la amplificación de ADN por PCR.

60 Otro aspecto de la invención es la inclusión de múltiples cebadores específicos de gen en la misma mezcla de

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múltiples copias de ARNc, que luego se usa en una reacción TaqMan® convencional.

Aunque se ilustra este procedimiento usando amplificación de ARN basada en T7, un experto en la técnica entenderá que también pueden usarse otros promotores de ARN polimerasa que no requieren un cebador, tal como 5 T3 o Sp6, y están dentro del alcance de la invención.

11. Método de elongación de ARN fragmentado y posterior amplificación

Este método, que combina y modifica las invenciones descritas en las secciones 9 y 10 anteriores, se ilustra en la

10 figura 5. El procedimiento comienza con la elongación de ARNm fragmentado. Esto se produce tal como se describió anteriormente excepto porque los ADN de armazón se etiquetan con la secuencia promotora de ARN polimerasa de T7 en sus extremos 5', conduciendo a ADN bicatenario extendido a partir de fragmentos de ARN. Las secuencias de molde necesitan eliminarse tras la transcripción in vitro. Estos moldes pueden incluir nucleótidos de dUTP o rNTP, que permiten la eliminación enzimática de los moldes tal como se describe en la sección 9, o los moldes pueden

15 eliminarse mediante tratamiento con ADNasa I.

El ADN de molde puede ser una población que representa diferentes ARNm de cualquier número. Puede generarse una fuente de moldes de ADN (armazones) de alta complejidad de secuencia agrupando ARN de una variedad de células o tejidos. En una realización, estos ARN se convierten en ADN bicatenario y se clonan en fagémidos.

20 Entonces puede rescatarse el ADN monocatenario mediante crecimiento de fagémidos y aislamiento de ADN monocatenario a partir de fagémidos purificados.

Esta invención es útil porque aumenta las señales del perfil de expresión génica de dos modos diferentes: tanto aumentando la longitud de la secuencia de polinucleótido del ARNm de prueba como mediante amplificación por

25 transcripción in vitro. Una ventaja adicional es que elimina la necesidad de llevar a cabo optimización de la transcripción inversa con cebadores específicos de gen etiquetados con la secuencia promotora de ARN polimerasa de T7 y, por lo tanto, es comparativamente rápida y económica.

Esta invención puede usarse con una variedad de diferentes métodos para obtener el perfil de expresión génica, por

30 ejemplo RT-PCR o una variedad de métodos de alineamiento de ADN. Justo como en el protocolo anterior, este enfoque se ilustra usando un promotor de T7 pero la invención no se limita de ese modo. Un experto en la técnica apreciará, sin embargo, que pueden usarse también otros promotores de ARN polimerasa, tales como T3 o Sp6.

12. Conjunto de genes de cáncer de mama, subsecuencias génicas sometidas a ensayo y aplicación clínica de los 35 datos de expresión génica

Un importante aspecto de la presente invención es usar la expresión medida de ciertos genes por tejido de cáncer de mama para asignar pacientes a los mejores fármacos o combinaciones de fármacos, y para proporcionar información de pronóstico. Para este fin es necesario corregir (normalizar) tanto las diferencias en la cantidad de 40 ARN sometido a ensayo como la variabilidad en la calidad del ARN usado. Por tanto, el ensayo mide e incorpora la expresión de ciertos genes de normalización, incluyendo genes de mantenimiento bien conocidos, tales como GAPDH y Cyp1. Como alternativa, la normalización puede basarse en la media o mediana de la señal (Ct) de todos los genes sometidos a ensayo o un gran subconjunto de los mismos (enfoque de normalización global). En una base de gen a gen, se compara la cantidad normalizada medida de un ARNm de tumor del paciente con la cantidad 45 encontrada en un conjunto de referencia de tejido de cáncer de mama. El número (N) de tejidos de cáncer de mama en este conjunto de referencia debe ser suficientemente alto para garantizar que diferentes conjuntos de referencia (como un todo) se comporten esencialmente del mismo modo. Si se cumple esta condición, la identidad de los tejidos de cáncer de mama individuales presentes en un conjunto particular no tendrá ningún impacto significativo sobre las cantidades relativas de los genes sometidos a ensayo. Habitualmente, el conjunto de referencia de tejido 50 de cáncer de mama consiste en al menos aproximadamente 30, preferiblemente al menos aproximadamente 40 diferentes muestras de tejido de cáncer de mama FPE. A menos que se indique otra cosa, los niveles de expresión normalizada para cada ARNm/tumor sometido a prueba/paciente se expresarán como un porcentaje del nivel de expresión medido en el conjunto de referencia. Más específicamente, el conjunto de referencia de un número suficientemente alto (por ejemplo 40) los tumores produce una distribución de niveles normalizados de cada especie

55 de ARNm. El nivel medido en una muestra de tumor particular que va a analizarse se encuentra en algún percentil dentro de este intervalo, lo que puede determinarse mediante métodos bien conocidos en la técnica. A continuación, a menos que se indique lo contrario, la referencia a niveles de expresión de un gen supone expresión normalizada en relación con el conjunto de referencia aunque esto no siempre se establece de manera explícita.

60 El conjunto de genes de cáncer de mama se muestra en la tabla 1. Los números de registro de los genes, y las SEQ ID NO para el cebador directo, cebador inverso y secuencias de amplicón que pueden usarse para la amplificación

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disminuye la sensibilidad a taxanos.

La expresión de ARNm de ERCC1 en el 10 % superior indica riesgo significativo de resistencia a cisplatino o análogos.

5 Un ensayo de RT-PCR de la expresión de ARNm de Her2 predice la sobreexpresión de Her2 tal como se mide mediante una prueba de diagnóstico convencional, con alto grado de concordancia (datos no mostrados). Los pacientes cuyos tumores expresan Her2 (normalizado a cyp.1) en el 10 % superior tienen un aumento de la probabilidad de respuesta beneficiosa al tratamiento con Herceptin u otros antagonistas de ErbB2. La medición de la

10 expresión de ARNm de Grb7 sirve como prueba para la amplificación génica de HER2, porque el gen de Grb7 está estrechamente vinculado a Her2. Cuando la expresión de Her2 es alta tal como se definió anteriormente en este párrafo, Grb7 elevado de manera similar indica amplificación génica de Her2. La sobreexpresión de IGF1R y o IGF1

o IGF2 disminuye la probabilidad de respuesta beneficiosa a Herceptin y también a antagonistas de EGFR.

15 Los pacientes cuyos tumores expresan Ha-Ras mutante, y también expresan ARNm de farnesil pirofosfato sintetasa

o geranil pirofosfonato sintetasa a niveles por encima del décimo percentil comprenden un grupo que es especialmente probable que presente una respuesta beneficiosa a fármacos de bisfosfonato.

Cox2 es una enzima de control clave en la síntesis de prostaglandinas. Se expresa frecuentemente a niveles

20 elevados en subconjuntos de diversos tipos de carcinomas incluyendo carcinoma de la mama. La expresión de este gen se controla al nivel de la transcripción, de modo que la RT-PCR sirve como un indicador válido de la actividad enzimática celular. La investigación no clínica ha mostrado que cox2 promueve la angiogénesis tumoral, lo que sugiere que esta enzima es una diana farmacológica prometedora en tumores sólidos. Varios antagonistas de Cox2 son productos comercializados para su uso en estados antiinflamatorios. El tratamiento de pacientes con poliposis

25 adenomatosa familiar con el inhibidor de cox2 Celebrex disminuyó significativamente el número y tamaño de pólipos neoplásicos. Ningún inhibidor de cox2 se ha aprobado aún para el tratamiento del cáncer de mama, pero generalmente esta clase de fármacos es segura y podría prescribirse de manera no indicada en cánceres de mama en los que se sobreexpresa cox2. Los tumores que expresan COX2 a niveles en el percentil diez superior tienen un aumento de la posibilidad de respuesta beneficiosa a Celebrex u otros inhibidores de ciclooxigenasa 2.

30 Las tirosina cinasas ErbB1 [EGFR], ErbB3 y ErbB4 [Her4]; también los ligandos TGFalfa, anfiregulina, factor de 55 crecimiento similar a EGF de unión a heparina y epirregulina; también BRK, una cinasa no receptora. Varios fármacos en desarrollo clínico bloquean el receptor de EGF. ErbB2-4, los ligandos indicados y BRK también aumentan la actividad de la ruta de EGFR. Pacientes con cáncer de mama cuyos tumores expresan altos niveles de

35 EGFR o EGFR y niveles anómalamente altos de los otros activadores indicados de la ruta de EGFR son candidatos potenciales para el tratamiento con un antagonista de EGFR.

Pacientes cuyos tumores expresan menos del 10 % del nivel promedio de ARNm de EGFR observado en el panel de referencia es relativamente menos probable que respondan a antagonistas de EGFR [tales como Iressa, o

40 ImClone 225]. En casos en los que el EGFR está por encima de este bajo intervalo, la presencia adicional de epirregulina, TGFα, anfiregulina, o ErbB3, o BRK, CD9, MMP9, o Lot1 a niveles por encima del 90º percentil predispone a la 65 respuesta a antagonistas de EGFR. La expresión génica de epirregulina, en particular, es un buen marcador sustituto para la activación de EGFR, y puede usarse no sólo para predecir la respuesta a antagonistas de EGFR, sino también para monitorizar la respuesta a antagonistas de EGFR [tomando biopsias con

45 agujas finas para proporcionar tejido tumoral durante el tratamiento]. Niveles de CD82 por encima del 90º percentil sugieren peor eficacia de los antagonistas de EGFR. Las tirosina cinasas abl, c-kit, PDGFRalfa, PDGFbeta y ARG; también, los ligandos que transmiten la señal ligando c-kit, PDGFA, B, C y D. Las tirosina cinasas enumeradas son todas dianas del fármaco Gleevec™ (imatinib mesilato, Novartis), y los ligandos enumerados estimulan una o más de las tirosina cinasas enumeradas. En las dos

50 indicaciones para las que está aprobado Gleevec™, las dianas de tirosina cinasa (bcr-abl y ckit) se sobreexpresan y también contienen mutaciones activantes. Un hallazgo de que una de las dianas de tirosina cinasa diana de Gleevec™ se expresa en tejido de cáncer de mama dará lugar a una segunda fase de análisis en la que el gen se secuenciará para determinar si está mutado. Que una mutación encontrada es una mutación activante puede demostrarse mediante métodos conocidos en la técnica, tales como, por ejemplo, midiendo la actividad enzimática

55 cinasa o midiendo el estado de fosforilación de la cinasa particular, en relación con la cinasa de tipo natural correspondiente. Pacientes con cáncer de mama cuyos tumores expresan altos niveles de ARNm que codifican para tirosina cinasas dianas de Gleevec™, específicamente, en el percentil diez superior, o ARNm para tirosina cinasas dianas de Gleevec™ en el intervalo promedio y ARNm para sus ligandos estimulantes del crecimiento relacionados en el percentil diez superior, son candidatos particularmente buenos para el tratamiento con Gleevec™.

60 VEGF es un factor angiogénico potente y patológicamente importante. (Véase a continuación en Indicadores de

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Tabla 4

Gen/SEQ ID NO:: CT promedio Vivos CT promedio Muertos Valor de t Grados de libertad P

FOXM1: 33,66 32,52 3,92 144 0,0001

PRAME: 35,45 33,84 3,71 144 0,0003

Bcl2: 28,52 29,32 -3,53 144 0,0006

STK15: 30,82 30,10 3,49 144 0,0006

CEGP1: 29,12 30,86 -3,39 144 0,0009

Ki-67: 30,57 29,62 3,34 144 0,0011

GSTM1: 30,62 31,63 -3,27 144 0,0014

CA9: 34,96 33,54 3,18 144 0,0018

PR: 29,56 31,22 -3,16 144 0,0019

BBC3: 31,54 32,10 -3,10 144 0,0023

NME1: 27,31 26,68 3,04 144 0,0028

SURV: 31,64 30,68 2,92 144 0,0041

GATA3: 26,06 26,99 -2,91 144 0,0042

TFRC: 28,96 28,48 2,87 144 0,0047

YB-1: 26,72 26,41 2,79 144 0,0060

DPYD: 28,51 28,84 -2,67 144 0,0084

GSTM3: 28,21 29,03 -2,63 144 0,0095

RPS6KB1: 31,18 30,61 2,61 144 0,0099

Src: 27,97 27,69 2,59 144 0,0105

Chk1: 32,63 31,99 2,57 144 0,0113

ID1: 28,73 29,13 -2,48 144 0,0141

EstR1: 24,22 25,40 -2,44 144 0,0160

p27: 27,15 27,51 -2,41 144 0,0174

CCNB1: 31,63 30,87 2,40 144 0,0176

XIAP: 30,27 30,51 -2,40 144 0,0178

Chk2: 31,48 31,11 2,39 144 0,0179

CDC25B: 29,75 29,39 2,37 144 0,0193

IGFIR: 28,85 29,44 -2,34 144 0,0209

AK055699: 33,23 34,11 -2,28 144 0,0242

PI3KC2A: 31,07 31,42 -2,25 144 0,0257

TGFB3: 28,42 28,85 -2,25 144 0,0258

BAGI1: 28,40 28,75 -2,24 144 0,0269

CYP3A4: 35,70 35,32 2,17 144 0,0317

EpCAM: 28,73 28,34 2,16 144 0,0321

VEGFC: 32,28 31,82 2,16 144 0,0326

pS2: 28,96 30,60 -2,14 144 0,0341

hENT1: 27,19 26,91 2,12 144 0,0357

WISP1: 31,20 31,64 -2,10 144 0,0377

HNF3A: 27,89 28,64 -2,09 144 0,0384

NFKBp65: 33,22 33,80 -2,08 144 0,0396

BRCA2: 33,06 32,62 2,08 144 0,0397

EGFR: 30,68 30,13 2,06 144 0,0414

TK1: 32,27 31,72 2,02 144 0,0453

VDR: 30,08 29,73 1,99 144 0,0488

En la tabla 4 anterior, los valores de t inferiores (negativos) indican expresión superior (o CT inferiores), asociada con mejores desenlaces y, a la inversa, valores de t superiores (positivos) indican expresión superior (CT inferiores)

5 asociada a peores desenlaces. Por lo tanto, por ejemplo, la expresión elevada del gen FOXM1 (valor de t = 3,92, CT medio vivos > CT medio muertos) indica una probabilidad reducida de supervivencia libre de enfermedad. De manera similar, la expresión elevada del gen CEGP 1 (valor de t = -3, 39; CT medio vivos < CT medio muertos) indica un aumento de la probabilidad de supervivencia libre de enfermedad.

10 En base a los datos expuestos en la Tabla 4, la sobreexpresión de cualquiera de los siguientes genes en cáncer de mama indica una probabilidad reducida de supervivencia sin recidiva de cáncer tras la cirugía: FOXM1; PRAME; SKT15, Ki-67; CA9; NME1; SURV; TFRC; YB-1; RPS6KB1; Src; Chk1; CCNB1; Chk2; CDC25B; CYP3A4; EpCAM;

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umbral tienen riesgo superior, y todos los pacientes con valores de expresión por debajo del umbral tienen riesgo inferior, o viceversa, dependiendo de si el gen es un indicador de buen (RR>1,01) o mal (RR<1,01) pronóstico. Por tanto, cualquier valor umbral definirá subgrupos de pacientes con respectivamente aumento o disminución del riesgo. Los resultados se resumen en las siguientes tablas 6 y 7

Tabla 6 Resultados del modelo de Cox para 146 pacientes con cáncer de mama invasivo

Gen: Riesgo relativo (RR) Riesgo relativo SE valor de p

FOXM1: 0,58 0,15 0,0002

STK15: 0,51 0,20 0,0006

PRAME: 0,78 0,07 0,0007

Bcl2: 1,66 0,15 0,0009

CEGP1: 1,25 0,07 0,0014

GSTM1: 1,40 0,11 0,0014

Ki67: 0,62 0,15 0,0016

PR: 1,23 0,07 0,0017

Conrig51037: 0,81 0,07 0,0022

NME1: 0,64 0,15 0,0023

YB-1: 0,39 0,32 0,0033

TFRC: 0,53 0,21 0,0035

BBC3: 1,72 0,19 0,0036

GATA3: 1,32 0,10 0,0039

CA9: 0,81 0,07 0,0049

SURV: 0,69 0,13 0,0049

DPYD: 2,58 0,34 0,0052

RPS6KB1: 0,60 0,18 0,0055

GSTM3: 1,36 0,12 0,0078

Src.2: 0,39 0,36 0,0094

TGFB3: 1,61 0,19 0,0109

CDC25B: 0,54 0,25 0,0122

XIAP: 3,20 0,47 0,0126

CCNB1: 0,68 0,16 0,0151

IGF1R: 1,42 0,15 0,0153

Chk1: 0,68 0,16 0,0155

ID1: 1,80 0,25 0,0164

p27: 1,69 0,22 0,0168

Chk2: 0,52 0,27 0,0175

EstR1: 1,17 0,07 0,0196

HNF3A: 1,21 0,08 0,206

pS2: 1,12 0,05 0,0230

BAGI1: 1,88 0,29 0,0266

AK055699: 1,24 0,10 0,0276

pENT1: 0,51 0,31 0,0293

EpCAM: 0,62 0,22 0,0310

WISP1: 1,39 0,16 0,0338

VEGFC: 0,62 0,23 0,0364

TK1: 0,73 0,15 0,0382

NFKBp65: 1,32 0,14 0,0384

BRCA2: 0,66 0,20 0,0404

CYP3A4: 0,60 0,25 0,0417

EGFR: 0,72 0,16 0,0436

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GEN: N.º DE REGISTRO SEQ ID NO:

EstR1: NM_000125 303

FOXM1: NM_021953 304

GATA3: NM_002051 305

GSTM1: NM_000561 306

GSTM3: NM_000849 307

hENT1: NM_004955 308

HIF1A: NM_001530 309

HNF3A: NM_004496 310

ID1: NM_002165 311

IGF1R: NM_000875 312

Ki-67: NM_002417 313

NFKBp65: NM_021975 314

NME1: NM_000269 315

p27: NM_004064 316

PI3KC2A: NM_002645 317

PR: NM_000926 318

PRAME: NM_006115 319

pS2: NM_003225 320

RPS6KB1: NM_003161 321

Src: NM_004383 322

STK15: NM_003600 323

SURV: NM_001168 324

TFRC: NM_003234 325

TGFB3: NM_003239 326

TK1: NM_003258 327

VDR: NM_000376 328

VEGFC: NM_005429 329

WISP1: NM_003882 330

XIAP: NM_001167 331

YB-1: NM_004559 332

ITGA7: NM_002206 333

PDGFB: NM_002608 334

Upa: NM_002658 335

TBP: NM_003194 336

PDGFRs: NM_006206 337

Pin1: NM_006221 338

CYP: NM_006347 339

RBP4: NM_006744 340

BRCA1: NM_007296 341

APC: NM_000038 342

GUS: NM_000181 343

CD18: NM_000211 344

PTEN: NM_000314 345

P53: NM_000546 346

ALDH1A3: NM_000693 347

GSTp: NM_000852 348

TCP2B: NM_001058 349

TS: MM_001071 350

Bcix: NM_001191 351

AREG: NM_001667 352

TP: NM_001953 353

EIF4E: NM_001968 354

ErbB3: NM_001982 355

EREG: NM_001432 356

GGLC: NM_001498 357

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Claims

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