ES2433992T3 - Obtención de perfil de expresión génica en tejidos tumorales biopsiados - Google Patents

Abstract

Método de predicción de la probabilidad de supervivencia a largo plazo de un paciente con cáncer de mamasin la recidiva de cáncer de mama, tras la extirpación quirúrgica del tumor primario, que comprende determinar el nivel del transcrito de ARN de BAG1 en una muestra de tejido de cáncer de mama obtenidade dicho paciente, normalizado frente al nivel de expresión de todos los transcritos de ARN sometidos aensayo en dicha muestra, o un conjunto de referencia de transcritos de ARN, en el que un aumento del nivel normalizado del transcrito de ARN de BAG1 en comparación con el nivelnormalizado del transcrito de ARN de BAG1 en un conjunto de referencia de tejidos de cáncer de mamaindica un aumento de la probabilidad de supervivencia a largo plazo sin recidiva de cáncer de mama.

Description

Obtención de perfil de expresión génica en tejidos tumorales biopsiados

5 Campo de la invención

La presente invención se refiere a la obtención del perfil de expresión génica en tejidos tumorales biopsiados. En particular, la presente invención se refiere a métodos sensibles para medir los niveles de ARNm en tejidos tumorales biopsiados, incluyendo material de biopsia incrustado en parafina archivado. Además, la invención proporciona un conjunto de genes cuya expresión es importante en el diagnóstico y tratamiento del cáncer de mama.

Los oncólogos disponen de varias opciones de tratamiento, incluyendo diferentes combinaciones de fármacos quimioterápicos que se caracterizan como “tratamiento de referencia”, y varios fármacos que no portan un declarado en la etiqueta para un cáncer particular, pero para los que hay pruebas de eficacia en ese cáncer. La mejor

15 probabilidad de un buen desenlace del tratamiento requiere que los pacientes se asignen al tratamiento contra el cáncer disponible óptimo, y que esta asignación se haga lo más rápidamente como sea posible tras el diagnóstico.

Actualmente, las pruebas de diagnóstico usadas en la práctica clínica son de analito único, y por tanto no capturan el valor potencial de conocer las relaciones entre docenas de diferentes marcadores. Además, las pruebas de diagnóstico frecuentemente son no cuantitativas, basándose en inmunohistoquímica. Este método produce a menudo diferentes resultados en diferentes laboratorios, en parte porque los reactivos no están normalizados, y en parte porque las interpretaciones son subjetivas y no pueden cuantificarse fácilmente. Las pruebas basadas en ARN no se han usado a menudo debido al problema de la degradación del ARN a lo largo del tiempo y el hecho de que es difícil obtener muestras de tejido recientes de los pacientes para el análisis. Está más fácilmente disponible tejido

25 incrustado en parafina fijado y se han establecido métodos para detectar ARN en tejido fijado. Sin embargo, estos métodos normalmente no permiten el estudio de grandes números de genes (ADN o ARN) a partir de pequeñas cantidades de material. Por tanto, pocas veces se ha usado tejido fijado de manera tradicional para otras cosas que para la detección inmunohistoquímica de proteínas.

Recientemente, varios grupos han publicado estudios referentes a la clasificación de diversos tipos de cáncer mediante análisis de la expresión génica con microalineamientos (véanse, por ejemplo Golub et al., Science 286:531-537 (1999); Bhattacharjae et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 98:13790-13795 (2001); Chen-Hsiang et al., Bioinformatics 17 (supl. 1):S316-S322 (2001); Ramaswamy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:15149-15154 (2001)). También se han notificado ciertas clasificaciones de cánceres de mama humanos basándose en los

35 patrones de expresión génica (Martin et al., Cancer Res. 60:2232-2238 (2000); West et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 98:11462-11467 (2001); Sorlie et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 98:10869-10874 (2001); Yan et al., Cancer Res. 61:8375-8380 (2001)). Sin embargo, estos estudios se centran en su mayor parte en mejorar y refinar la clasificación ya establecida de diversos tipos de cáncer, incluyendo cáncer de mama, y generalmente no proporcionan nuevas percepciones en las relaciones de los genes expresados de manera diferencial, y no vinculan los hallazgos a estrategias de tratamiento con el fin de mejorar el desenlace clínico de la terapia contra el cáncer.

Aunque la moderna bioquímica y biología molecular han revelado más de 100 genes cuyas actividades influyen en el comportamiento de células tumorales, el estado de su diferenciación y su sensibilidad o resistencia a ciertos fármacos terapéuticos, con unas pocas excepciones, el estado de estos genes no se ha aprovechado para el fin de

45 tomar decisiones clínicas de manera rutinaria sobre los tratamientos farmacológicos. Una notable excepción es el uso de la expresión de la proteína de receptor de estrógenos (RE) en carcinomas de mama para seleccionar pacientes a tratamiento con fármacos antiestrógenos, tales como tamoxifeno. Otro ejemplo excepcional es el uso de la expresión de la proteína ErbB2 (Her2) en carcinomas de mama para seleccionar pacientes con el fármaco antagonista de Her2 Herceptin® (Genentech, Inc., South San Francisco, CA).

A pesar de los recientes avances, el desafío del tratamiento contra el cáncer sigue siendo dirigir regímenes de tratamiento específicos a tipos de tumores patogénicamente distintos, y en última instancia personalizar el tratamiento tumoral con el fin de maximizar el desenlace. Por tanto, existe una necesidad de pruebas que proporcionan simultáneamente información predictiva sobre las respuestas de los pacientes a la variedad de

55 opciones de tratamiento. Esto es particularmente cierto para cáncer de mama, cuya biología se entiende mal. Está claro que la clasificación del cáncer de mama en unos cuantos subgrupos, tales como el subgrupo ErbB2+ y los subgrupos caracterizados por expresión génica de baja a ausente del receptor de estrógenos (RE) y unos cuantos factores de transcripción adicionales (Perou et al., Nature 406:747-752 (2000)) no se refleja en la heterogeneidad celular y molecular del cáncer de mama, y no permite el diseño de estrategias de tratamiento que maximicen la respuesta del paciente

El documento WO 01/04343 A2 (BURNHAM INST [EE.UU.]; REED JOHN C [EE.UU.] cita un método de predicción de la probabilidad de supervivencia a largo plazo de cáncer de mama sin recidiva basado en la determinación del nivel de expresión de ARNm de BAG1 (véase la reivindicación 6) pero el documento no proporciona ningún ejemplo

65 práctico de tal método ni ninguna evidencia experimental de correlación entre dichos niveles de ARNm y el pronóstico del cáncer de mama.

TOWNSEND ET AL (JOURNAL OF PATHOLOGY, vol. 17, n.º 1, págs. 51-59, 2002) dan a conocer que no existe ninguna correlación entre los niveles de expresión de la proteína BAG1 y de expresión de ARN.

5 Sumario de la invención

Según un aspecto de la presente invención, se proporciona un método de predicción de la probabilidad de supervivencia a largo plazo de un paciente con cáncer de mama sin recidiva de cáncer de mama, tras la extirpación quirúrgica del tumor primario tal como se especifica en la reivindicación 1.

10 La presente invención adapta el uso de material de biopsia incrustado en parafina archivado para el ensayo de todos los marcadores en el conjunto, y por tanto es compatible con el tipo de material de biopsia más ampliamente disponible.

15 En una realización particular, se determina el nivel de expresión de uno o más transcritos de ARN de pronóstico, en el que puede obtenerse ARN, por ejemplo, a partir de una muestra de tejido de cáncer de mama incrustado en cera, fijado del paciente. El aislamiento del ARN puede llevarse a cabo, por ejemplo, siguiendo cualquiera de los procedimientos descritos anteriormente o a lo largo de la solicitud, o mediante cualquier otro método conocido en la técnica.

20 Puede cuantificarse el nivel de transcrito de ARN de BAG1 mediante RT-PCR.

Puede cuantificarse el nivel de expresión del transcrito de ARN de BAG1, o su producto de expresión, mediante alineamiento. 25

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 es un gráfico que ilustra el flujo de trabajo del procedimiento de la invención para la medición de la expresión génica. En la figura, FPET significa “tejido incrustado en parafina fijado” y “RT-PCR” significa “PCR con 30 transcriptasa inversa”. Se determina la concentración de ARN usando el protocolo y reactivo de cuantificación de ARN RiboGreen™ comercial.

La figura 2 es un diagrama de flujo que muestra las etapas de un método de extracción de ARN según la invención junto a un diagrama de flujo de un método comercial representativo.

35 La figura 3 es un esquema que ilustra las etapas de un método mejorado para preparar ARNm fragmentado para el análisis de obtención del perfil de expresión.

La figura 4 ilustra métodos para la amplificación de ARN antes de la RT-PCR. 40 La figura 5 ilustra un esquema alternativo para la reparación y amplificación de ARNm fragmentado.

La figura 6 muestra la medición de los niveles de ARNm del receptor de estrógenos en 40 muestras de cáncer de mama FPE mediante RT-PCR. Se usaron tres secciones de 10 micrómetros para cada medición. Cada punto de 45 datos representa el promedio de mediciones por triplicado.

La figura 7 muestra los resultados de la medición de los niveles de ARNm del receptor de progesterona en 40 muestras de cáncer de mama FPE mediante RT-PCR realizada tal como se describe en la leyenda de la figura 6 anterior.

50 La figura 8 muestra resultados de un experimento de IVT/RT-PCR.

La figura 9 es una representación de la expresión de 92 genes a través de 70 muestras de cáncer de mama FPE. El eje y muestra la expresión como tiempos de ciclo umbral. Estos genes son un subconjunto de los genes 55 enumerados en la tabla 1.

La tabla 1 muestra una lista de genes del cáncer de mama.

La tabla 2 expone las secuencias de cebadores y amplicones usadas para la amplificación de ARNm fragmentado. 60 La tabla 3 muestra los números de registro y las SEQ ID NO de los genes del cáncer de mama examinados.

Descripción detallada de la realización preferida

65 A. Definiciones

A menos que se defina lo contrario, los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que se entiende comúnmente por un experto habitual en la técnica a la que esta invención pertenece. Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2ª ed., J. Wiley & Sons (Nueva York, NY 1994), y March, Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Structure 4ª ed., John Wiley & Sons

5 (Nueva York, NY 1992), proporcionan al experto en la técnica una guía general para muchos de los términos usados en la presente solicitud.

Un experto en la técnica reconocerá muchos métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento, que podrían usarse en la práctica de la presente invención. De hecho, la presente invención no se limita de ningún modo a los métodos y materiales descritos. Para los fines de la presente invención, los siguientes términos se definen a continuación.

El término “microalineamiento” se refiere a una disposición ordenada de elementos de alineamiento hibridables, preferiblemente sondas de polinucleótido, sobre un sustrato.

15 El término “polinucleótido”, cuando se usa en singular o plural, se refiere generalmente a cualquier polirribonucleótido o polidesoxirribonucleótido, que puede ser ADN o ARN no modificado o ADN o ARN modificado. Por tanto, por ejemplo, los polinucleótidos tal como se definen en el presente documento incluyen, sin limitación, ADN mono y bicatenario, ADN que incluye regiones mono y bicatenarias, ARN mono y bicatenario, y ARN que incluye regiones mono y bicatenarias, moléculas híbridas que comprenden ADN y ARN que puede ser monocatenario o, más normalmente, bicatenario o incluyen regiones mono y bicatenarias. Además, el término “polinucleótido” tal como se usa en el presente documento se refiere a regiones tricatenarias que comprenden ARN

o ADN o tanto ARN como ADN. Las cadenas en tales regiones pueden ser de la misma molécula o de moléculas diferentes. Las regiones pueden incluir todas de una o más de las moléculas, pero más normalmente implican sólo

25 una región de algunas de las moléculas. Una de las moléculas de una región de triple hélice es a menudo un oligonucleótido. El término “polinucleótido” incluye específicamente ADN y ARN que contienen una o más bases modificadas. Por tanto, ADN o ARN con estructuras principales modificadas para lograr estabilidad o por otros motivos son “polinucleótidos” tal como está previsto el término en el presente documento. Además, ADN o ARN que comprenden bases poco comunes, tales como inosina, o bases modificadas, tales como bases tritiadas, se incluyen dentro del término “polinucleótidos” tal como se define en el presente documento. En general, el término “polinucleótido” abarca todas las formas química, enzimática y/o metabólicamente modificadas de polinucleótidos no modificados, así como las formas químicas de ADN y ARN características de virus y células, incluyendo células sencillas y complejas.

35 El término “oligonucleótido” se refiere a un polinucleótido relativamente corto, incluyendo, sin limitación, desoxirribonucleótidos monocatenarios, ribonucleótidos mono o bicatenarios, híbridos de ARN:ADN y ADN bicatenarios. Los oligonucleótidos, tales como oligonucleótidos de sonda de ADN monocatenario, se sintetizan a menudo por métodos químicos, por ejemplo usando sintetizadores de oligonucleótidos automatizados que están comercialmente disponibles. Sin embargo, pueden prepararse oligonucleótidos mediante una variedad de otros métodos, incluyendo técnicas mediadas por ADN recombinante in vitro y mediante la expresión de ADN en células y organismos.

Las expresiones “gen expresado de manera diferencial”, “expresión génica diferencial” y sus sinónimos, que se usan de manera intercambiable, se refieren a un gen cuya expresión se activa a un nivel superior o inferior en un sujeto 45 que padece una enfermedad, específicamente cáncer, tal como cáncer de mama, con respecto a su expresión en un sujeto normal o control. Las expresiones también incluyen genes cuya expresión se activa a un nivel superior o inferior en diferentes estadios de la misma enfermedad. Se entiende también que un gen expresado de manera diferencial puede o bien activarse o inhibirse al nivel de ácido nucleico o nivel de proteína, o bien puede someterse a corte y empalme alternativo para dar como resultado un producto de polipéptido diferente. Tales diferencias pueden evidenciarse mediante un cambio en los niveles de ARNm, expresión superficial, secreción u otro reparto de un polipéptido, por ejemplo. La expresión génica diferencial puede incluir una comparación de la expresión entre dos o más genes, o una comparación de las razones de la expresión entre dos o más genes, o incluso una comparación de dos productos procesados de manera diferente del mismo gen, que difieren entre sujetos normales y sujetos que padecen una enfermedad, específicamente cáncer, o entre diversos estadios de la misma enfermedad. La expresión

55 diferencial incluye tanto diferencias cuantitativas, así como cualitativas, en el patrón de expresión celular o temporal en un gen o sus productos de expresión entre, por ejemplo, células enfermas y normales, o entre células que han experimentado diferentes acontecimientos de enfermedad o estadios de enfermedad. Para el fin de esta invención, se considera que está presente “expresión génica diferencial” cuando existe una diferencia de al menos aproximadamente dos veces, preferiblemente al menos aproximadamente cuatro veces, más preferiblemente al menos aproximadamente seis veces, lo más preferiblemente al menos aproximadamente diez veces entre la expresión de un gen dado en sujetos normales y enfermos, o en diversos estadios del desarrollo de la enfermedad en un sujeto enfermo.

La expresión “amplificación génica” se refiere a un procedimiento mediante el cual se forman múltiples copias de un

65 gen o fragmento de gen en una línea celular o célula particular. La región duplicada (un tramo de ADN amplificado) a menudo se denomina “amplicón”. Habitualmente, la cantidad del ARN mensajero (ARNm) producido, es decir, el

nivel de expresión génica, también aumenta en la proporción del número de copias producidas del gen expresado particular.

El término “pronóstico” se usa en el presente documento para referirse a la predicción de la probabilidad de

5 progresión o muerte atribuible al cáncer, incluyendo recidiva, propagación metastásica y resistencia a fármacos, de una enfermedad neoplásica, tal como cáncer de mama. El término “predicción” se usa en el presente documento para referirse a la probabilidad de que un paciente responda o bien favorable o bien desfavorablemente a un fármaco o conjunto de fármacos, y también el grado de estas respuestas. Los métodos predictivos de la presente invención pueden usarse clínicamente para tomar decisiones de tratamiento eligiendo las modalidades de tratamiento más apropiadas para cualquier paciente particular. Los métodos predictivos de la presente invención son herramientas valiosas en la predicción si es probable que un paciente responda favorablemente a un régimen de tratamiento, tal como intervención quirúrgica, quimioterapia con un fármaco dado o combinación de fármacos, y/o radioterapia.

15 La expresión “aumento de resistencia” a un fármaco particular u opción de tratamiento, cuando se usa según la presente invención, significa reducción de la respuesta con respecto a una dosis convencional del fármaco o a un protocolo de tratamiento convencional.

La expresión “reducción de la sensibilidad” a un fármaco particular u opción de tratamiento, cuando se usa según la presente invención, significa reducción de la respuesta con respecto a una dosis convencional del fármaco o a un protocolo de tratamiento convencional, cuando la respuesta reducida puede compensarse (al menos parcialmente) aumentando la dosis del fármaco o la intensidad de tratamiento.

Puede evaluarse la “respuesta del paciente” usando cualquier criterio de evaluación que indique un beneficio al

25 paciente, incluyendo, sin limitación, (1) inhibición, en algún grado, del crecimiento tumoral, incluyendo ralentización y detención completa del crecimiento; (2) reducción del número de células tumorales; (3) reducción del tamaño del tumor; (4) inhibición (es decir, reducción, ralentización o detención completa) de la infiltración de células tumorales en tejidos y/u órganos periféricos adyacentes; (5) inhibición (es decir, reducción, ralentización o detención completa) de la metástasis; (6) potenciación de la respuesta inmunitaria antitumoral, que puede, pero no tiene que, dar como resultado la regresión o el rechazo del tumor; (7) alivio, en algún grado, de uno o más síntomas asociados con el tumor; (8) aumento en la duración de la supervivencia tras el tratamiento; y/o (9) reducción de la mortalidad en un punto de tiempo dado tras el tratamiento.

El término “tratamiento” se refiere tanto a tratamiento terapéutico como profiláctico o medidas preventivas, en el que

35 el objeto es prevenir o ralentizar (disminuir) el trastorno o estado patológico seleccionado como diana. Los que necesitan tratamiento incluyen los que ya tienen el trastorno así como los propensos a tener el trastorno o aquellos en los que va a prevenirse el trastorno. En el tratamiento del tumor (por ejemplo, cáncer), un agente terapéutico puede reducir directamente la patología de células tumorales, o hacer que las células tumorales sean más susceptible al tratamiento mediante otros agentes terapéuticos, por ejemplo, radiación y/o quimioterapia.

El término “tumor”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a toda proliferación y crecimiento de células neoplásicas, ya sean malignas o benignas, y todos los tejidos y células cancerosas y precancerosas.

Los términos “cáncer” y “canceroso(a)” se refieren a o describen el estado fisiológico en mamíferos que se

45 caracteriza normalmente por crecimiento de células no regulado. Los ejemplos de cáncer incluyen pero no se limitan a, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer de pulmón, cáncer de próstata, cáncer hepatocelular, cáncer gástrico, cáncer pancreático, cáncer cervical, cáncer de ovarios, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, cáncer de las vías urinarias, cáncer de tiroides, cáncer renal, carcinoma, melanoma y cáncer de cerebro.

La “patología” del cáncer incluye todos los fenómenos que comprometen el bienestar del paciente. Esto incluye, sin limitación, crecimiento de células anómalo o no controlado, metástasis, interferencia con el funcionamiento normal de células vecinas, liberación de citocinas u otros productos secretores a niveles anómalos, supresión o agravamiento de la respuesta inflamatoria o inmunológica, neoplasia, premalignidad, malignidad, invasión de órganos o tejidos distantes o circundantes, tales como ganglios linfáticos, etc.

55 La “rigurosidad” de las reacciones de hibridación puede determinarse fácilmente por un experto habitual en la técnica, y generalmente es un cálculo empírico dependiente de la longitud de la sonda, temperatura de lavado y concentración de sales. En general, sondas más largas requieren temperaturas superiores para un apareamiento apropiado, mientras que sondas más cortas necesitan temperaturas inferiores. La hibridación depende generalmente de la capacidad del ADN desnaturalizado para aparearse de nuevo cuando están presentes cadenas complementarias en un entorno por debajo de su temperatura de fusión. Cuanto mayor es el grado de homología deseada entre la sonda y la secuencia hibridable, mayor es la temperatura relativa que puede usarse. Como resultado, se deduce que temperaturas relativas superiores tenderían a hacer las condiciones de reacción más rigurosas, mientras que temperaturas inferiores las harían menos rigurosas. Para detalles adicionales y explicación

65 de la rigurosidad de reacciones de hibridación, véase Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology. Wiley Interscience Publishers, (1995).

“Condiciones rigurosas” o “condiciones de alta rigurosidad”, tal como se definen en el presente documento, normalmente: (1) emplean fuerza iónica baja y temperatura elevada para el lavado, por ejemplo cloruro de sodio 0,015 M/citrato de sodio 0,0015 M/dodecilsulfato de sodio al 0,1% a 50ºC; (2) emplean durante la hibridación un 5 agente de desnaturalización, tal como formamida, por ejemplo, formamida al 50% (v/v) en albúmina sérica bovina al 0,1%/Ficoll al 0,1%/polivinilpirrolidona al 0,1%/tampón fosfato de sodio 50 mM a pH 6,5 con cloruro de sodio 750 mM, citrato de sodio 75 mM a 42ºC; o (3) emplean formamida al 50%, 5 x SSC (NaCl 0,75 M, citrato de sodio 0,075 M), fosfato de sodio 50 mM (pH 6,8), pirofosfato de sodio al 0,1%, 5 x disolución de Denhardt, ADN de esperma de salmón sonicado (50 μg/ml), SDS al 0,1% y sulfato de dextrano al 10% a 42ºC, con lavados a 42ºC en 0,2 x SSC

10 (cloruro de sodio/citrato de sodio) y formamida al 50% a 55ºC, seguido de un lavado de alta rigurosidad que consiste en 0,1 x SSC que contiene EDTA a 55ºC.

“Condiciones moderadamente rigurosas” pueden identificarse tal como se describe por Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Nueva York: Cold Spring Harbor Press, 1989, e incluyen el uso de disolución de 15 lavado y condiciones de hibridación (por ejemplo, temperatura, fuerza iónica y % de SDS) menos rigurosas que las descritas anteriormente. Un ejemplo de condiciones moderadamente rigurosas es la incubación durante la noche a 37ºC en una disolución que comprende: formamida al 20%, 5 x SSC (NaCl 150 mM, citrato de trisodio 15 mM), fosfato de sodio 50 mM (pH 7,6), 5 x disolución de Denhardt, sulfato de dextrano al 10% y ADN de esperma de salmón fragmentado desnaturalizado 20 mg/ml, seguido de lavado de los filtros en 1 x SSC a aproximadamente 37

20 50ºC. El experto reconocerá cómo ajustar la temperatura, fuerza iónica, etc. según sea necesario para adaptar factores tales como la longitud de la sonda y similares.

En el contexto de la presente invención, la referencia a “al menos uno”, “al menos dos”, “al menos cinco”, etc. de los genes enumerados en cualquier conjunto de genes particular significa una cualquiera o cualquiera y todas las 25 combinaciones de los genes enumerados.

Las expresiones “corte y empalme” y “corte y empalme de ARN” se usan de manera intercambiable y se refieren al procesamiento del ARN que elimina intrones y une exones para producir ARNm maduro con secuencia codificante continua que se traslada al citoplasma de una célula eucariota .

30 En teoría, el término “exón” se refiere a cualquier segmento de un gen interrumpido que está representado en el producto de ARN maduro (B. Lewin. Genes IV Cell Press, Cambridge Mass. 1990). En teoría, el término “intrón” se refiere a cualquier segmento de ADN que se transcribe pero se elimina del transcrito cortando y empalmando juntos los exones en cualquier lado del mismo. Operativamente, se producen secuencias de exón en la secuencia de

35 ARNm de un gen tal como se define por los números de Ref. Seq ID. Operativamente, las secuencias de intrón son las secuencias intermedias dentro del ADN genómico de un gen, entremedias de las secuencias de exón y que tienen secuencias consenso de corte y empalme GT y AG en sus extremos 5’ y 3’.

B. Descripción detallada

40 La practica de la presente invención empleará, a menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales de biología molecular (incluyendo técnicas recombinantes), microbiología, biología celular y bioquímica, que están dentro del conocimiento de la técnica. Tales técnicas se explican completamente en la bibliografía, tal como, “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, 2ª edición (Sambrook et al., 1989); “Oligonucleotide Synthesis” (M.J. Gait,

45 ed., 1984); “Animal Cell Culture” (R.I. Freshney, ed., 1987); “Methods in Enzymology” (Academic Press, Inc.); “Handbook of Experimental Immunology”, 4ª edición (D.M. Weir & C.C. Blackwell, eds., Blackwell Science Inc., 1987); “Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells” (J.M. Miller & M.P. Calos, eds., 1987); “Current Protocols in Molecular Biology” (F.M. Ausubel et al., eds., 1987); y “PCR: The Polymerase Chain Reaction”, (Mullis et al., eds., 1994).

1. Obtención del perfil de expresión génica

En general, los métodos de obtención del perfil de expresión génica pueden dividirse en dos grandes grupos: métodos basados en análisis de hibridación de polinucleótidos y métodos basados en la secuenciación de 55 polinucleótidos. La mayoría de los métodos comúnmente usados conocidos en la técnica para la cuantificación de la expresión de ARNm en una muestra incluyen transferencia de tipo Northern e hibridación in situ (Parker & Barnes, Methods in Molecular Biology 106:247-283 (1999)); ensayos de protección de ARNasa (Hod, Biotechniques 13:852854 (1992)); y reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa (RT-PCR) (Weis et al., Trends in Genetics 8:263-264 (1992)). Alternativamente, pueden emplearse los anticuerpos que pueden reconocer dúplex

60 específicos, incluyendo dúplex de ADN, dúplex de ARN y dúplex híbridos de ADN-ARN o dúplex de proteína-ADN. Los métodos representativos para el análisis de la expresión génica basado en secuenciación incluyen análisis en serie de la expresión génica (SAGE), y análisis de la expresión génica mediante secuenciación de firma masiva en paralelo (MPSS).

65 2. PCR con transcriptasa inversa (RT-PCR)

De las técnicas enumeradas anteriormente, el método cuantitativo más sensible y más flexible es RT-PCR, que puede usarse para comparar los niveles de ARNm en diferentes poblaciones de muestra, en tejidos normales y tumorales, con o sin tratamiento con fármacos, para caracterizar patrones de expresión génica, para discriminar entre ARNm estrechamente relacionados y analizar la estructura del ARN.

5 La primera etapa es el aislamiento de ARNm a partir de una muestra diana. El material de partida es normalmente ARN total aislado de las líneas de células tumorales o tumores humanos, y las correspondientes líneas celulares o tejidos normales, respectivamente. Por tanto, puede aislarse ARN a partir de una variedad de tumores primarios, incluyendo líneas e células tumorales o tumor de mama, pulmón, colon, próstata, cerebro, hígado, riñón, páncreas, bazo, timo, testículos, ovarios, útero, etc., con ADN combinado de donantes sanos. Si la fuente de ARNm es un tumor primario, puede extraerse ARNm, por ejemplo, a partir de muestras de tejido congelado o incrustado en parafina archivado y fijado (por ejemplo fijado con formalina).

Los métodos generales para la extracción de ARNm se conocen bien en la técnica y se dan a conocer en libros de

15 texto convencionales de biología molecular, incluyendo Ausubel et al., Current Protocols of Molecular Biology, John Wiley and Sons (1997). Se dan a conocer métodos para la extracción de ARN a partir de tejidos incrustados en parafina, por ejemplo, en Rupp y Locker, Lab Invest. 56:A67 (1987), y De Andrés et al., BioTechniques 18:42044 (1995). En particular, puede realizarse el aislamiento del ARN usando un kit de purificación, conjunto de tampón y proteasa de fabricantes comerciales, tales como Qiagen, según las instrucciones del fabricante. Por ejemplo, puede aislarse el ARN total de células en cultivo usando mini-columnas RNeasy de Qiagen. Otros kits de aislamiento de ARN comercialmente disponibles incluyen el kit de purificación de ARN y ADN completo MasterPure™ (EPICENTRE®, Madison, WI), y el kit de aislamiento de ARN en bloque de parafina (Ambion, Inc.). Puede aislarse el ARN total de muestras de tejido usando ARN Stat-60 (Tel-Test). Puede aislarse ARN preparado a partir del tumor, por ejemplo, mediante centrifugación en gradiente de densidad de cloruro de cesio.

25 Puesto que el ARN no puede servir como molde para la PCR, la primera etapa en la obtención del perfil de expresión génica mediante RT-PCR es la transcripción inversa del molde de ARN para dar ADNc, seguido de su amplificación exponencial en una reacción PCR. Las dos transcriptasas inversas más comúnmente usadas son la transcriptasa inversa del virus de la mieloblastosis aviar (VMA-RT) y la transcriptasa inversa del virus de la leucemia murina de Moloney (VLMM-RT). La etapa de transcripción inversa normalmente se ceba usando cebadores específicos, hexámeros al azar, o cebadores de oligo-dT, dependiendo de las circunstancias y el objetivo de obtención del perfil de expresión. Por ejemplo, el ARN extraído puede transcribirse de manera inversa usando un kit de PCR de ARN GeneAmp (Perkin Elmer, CA, EE.UU.), siguiendo las instrucciones del fabricante. Entonces puede usarse el ADNc derivado como molde en la posterior reacción PCR.

35 Aunque la etapa de PCR puede usar una variedad de ADN polimerasas dependientes de ADN termoestable, normalmente se emplea la Taq ADN polimerasa, que tiene un actividad nucleasa 5’-3’ pero carece de una actividad endonucleasa 3’-5’ de corrección de pruebas. Por tanto, la PCR TaqMan® normalmente utiliza la actividad nucleasa 5’ de la Tth o Taq polimerasa para hidrolizar una sonda de hibridación unida a su amplicón diana, pero puede usarse cualquier enzima con actividad nucleasa 5’ equivalente. Se usan dos cebadores de oligonucleótido para generar un amplicón típico de una reacción PCR. Se diseña un tercer oligonucleótido, o sonda, para detectar la secuencia de nucleótidos ubicada entre los dos cebadores de PCR. La sonda no puede extenderse mediante la enzima Taq ADN polimerasa, y se marca con un tinte fluorescente indicador y un tinte fluorescente extintor. Se extingue cualquier emisión inducida por láser del tinte indicador mediante el tinte de extinción cuando los dos tintes están ubicados

45 cercanos entre sí ya que están en la sonda. Durante la reacción de amplificación, la enzima Taq ADN polimerasa escinde la sonda de una manera dependiente del molde. Los fragmentos de la sonda resultantes se disocian en disolución, y la señal del tinte indicador liberado está libre del efecto de extinción del segundo fluoróforo. Se libera una molécula de tinte indicador para cada nueva molécula sintetizada, y la detección del tinte indicador no extinguido proporciona la base para la interpretación cuantitativa de los datos.

Puede realizarse RT-PCR TaqMan® usando equipo comercialmente disponible, tal como, por ejemplo, ABI PRISM 7700™ Sequence Detection System™ (Perkin-Elmer-Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.), o Lightcycler (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Alemania). En una realización preferida, el procedimiento de nucleasa 5’ se lleva a cabo en un dispositivo de PCR cuantitativa en tiempo real tal como ABI PRISM 7700™ Sequence

55 Detection System™. El sistema consiste en un termociclador, un láser, un dispositivo de carga acoplada (CCD), una cámara y un ordenador. El sistema amplifica muestras en un formato de 96 pocillos en un termociclador. Durante la amplificación, se recoge la señal fluorescente inducida por láser en tiempo real a través de cables de fibra óptica para todos los 96 pocillos, y se detecta en el CCD. El sistema incluye software para manejar el instrumento y para analizar los datos.

Los datos del ensayo de nucleasa 5’ se expresan inicialmente como Ct, o el ciclo umbral. Tal como se trató anteriormente, se registran los valores de fluorescencia durante cada ciclo y representan la cantidad de producto amplificado en ese punto en la reacción de amplificación. El punto en el que se registra en primer lugar la señal fluorescente como estadísticamente significativa es el ciclo umbral (Ct).

65 Para minimizar los errores y el efecto de la variación muestra a muestra, se realiza habitualmente la RT-PCR usando

un patrón interno. Se expresa el patrón interno ideal a un nivel constante entre diferentes tejidos, y no se ve afectado por el tratamiento experimental. Los ARN más frecuentemente usados para normalizar los patrones de expresión génica son ARNm para los genes de mantenimiento gliceraldehído-3-fosfato-deshidrogenasa (GAPDH) y β-actina.

5 Una variación más reciente de la técnica de RT-PCR es la PCR cuantitativa en tiempo real, que mide la acumulación de producto de PCR a través de una sonda fluorigénica doblemente marcada (es decir, sonda TaqMan®). La PCR en tiempo real es compatible tanto con la PCR competitiva cuantitativa, en la que se usa un competidor interno para cada secuencia diana para la normalización, como con la PCR comparativa cuantitativa usando un gen de normalización contenido dentro de la muestra, o un gen de mantenimiento para RT-PCR. Para detalles adicionales véase, por ejemplo Held et al., Genome Research 6:986-994 (1996).

3. Microalineamientos

También puede identificarse la expresión génica diferencial, o confirmarse, usando la técnica de microalineamientos.

15 Por tanto, puede medirse el perfil de expresión de genes asociados con cáncer de mama en tejido de tumor o bien incrustado en parafina o bien reciente, usando tecnología de microalineamientos. En este método, se siembran en placas las secuencias de polinucleótido de interés, o se alinean, en un sustrato de microchip. Entonces se hibridan las secuencias alineadas con sondas de ADN específicas de células o tejidos de interés. Justo como en el método de RT-PCR, la fuente de ARNm normalmente es ARN total aislado de tumores humanos o líneas celulares tumorales, y las correspondientes líneas celulares o tejidos normales. Por tanto, puede aislarse ARN a partir de una variedad de tumores primarios o líneas celulares tumorales. Si la fuente de ARNm es un tumor primario, puede extraerse el ARNm, por ejemplo, de muestras de tejido congelado o incrustado en parafina archivado y fijado (por ejemplo fijado con formalina), que se preparan de manera rutinaria y se conservan en la práctica clínica diaria.

25 En una realización específica de la técnica de microalineamientos, se aplican insertos amplificados por PCR de clones de ADNc a un sustrato en un alineamiento denso. Preferiblemente, se aplican al menos 10.000 secuencias de nucleótidos al sustrato. Los genes microalineados, inmovilizados en el microchip a 10.000 elementos cada uno, son adecuados para la hibridación en condiciones rigurosas. Pueden generarse sondas de ADNc marcadas de manera fluorescente pueden generarse a través de la incorporación de nucleótidos fluorescentes mediante transcripción inversa de ARN extraído de tejidos de interés. Las sondas de ADNc marcadas aplicadas al chip se hibridan con especificidad a cada punto de ADN en el alineamiento. Tras el lavado riguroso para eliminar sondas no unidas específicamente, se explora el chip mediante microscopía láser confocal o mediante otro método de detección, tal como una cámara CCD. La cuantificación de la hibridación de cada elemento alineado permite la evaluación de la correspondiente abundancia de ARNm. Con la fluorescencia de doble color, se hibridan por parejas

35 sondas de ADNc marcadas por separado generadas a partir de dos fuentes de ARN en el alineamiento. Por tanto, se determina simultáneamente la abundancia relativa de los transcritos a partir de las dos fuentes correspondientes a cada gen especificado. La escala miniaturizada de la hibridación permite una evaluación rápida y conveniente del patrón de expresión para grandes números de genes. Se ha mostrado que tales métodos tienen la sensibilidad requerida para detectar transcriptos raros, que se expresan a unas pocas copias por célula, y para detectar de manera reproducible diferencias de al menos aproximadamente dos veces en los niveles de expresión (Schena et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93(2):106-149 (1996)). El análisis de microalineamientos puede realizarse mediante equipo comercialmente disponible, siguiendo los protocolos del fabricante, tal como usando la tecnología Affymetrix GenChip, o la tecnología de microalineamientos de Incyte.

45 El desarrollo de métodos de microalineamientos para análisis a gran escala de la expresión génica hace posible buscar sistemáticamente marcadores moleculares de la clasificación del cáncer y la predicción del desenlace en una variedad de tipos tumorales.

4. Análisis en serie de la expresión génica (SAGE)

El análisis en serie de la expresión génica (SAGE) es un método que permite el análisis cuantitativo y simultáneo de un gran número de transcritos de genes, sin la necesidad de proporcionar una sonda de hibridación individual para cada transcrito. En primer lugar, se genera una etiqueta de secuencia corta (aproximadamente 10-14 pb) que contiene información suficiente para identificar de manera única un transcrito, siempre que se obtenga el marcador a

55 partir de una posición única dentro de cada transcrito. Entonces, muchos transcritos se unen entre sí para formar moléculas en serie largas, que pueden secuenciarse, revelando la identidad de las múltiples etiquetas simultáneamente. El patrón de expresión de cualquier población de transcritos puede evaluarse cuantitativamente determinando la abundancia de marcadores individuales e identificando el gen correspondiente a cada etiqueta. Para más detalles véanse, por ejemplo Velculescu et al., Science 270:484-487 (1995); y Velculescu et al., Cell 88:243-51 (1997).

5. Análisis de la expresión génica mediante secuenciación de firma masiva en paralelo (MPSS)

Este método, descrito por Brenner et al., Nature Biotechnology 18:630-634 (2000), es un enfoque de secuenciación

65 que combina secuenciación de firma no basada en gel con clonación in vitro de millones de moldes en microperlas de 5 μm de diámetro separadas. En primer lugar, se construye una biblioteca de microperlas de moldes de ADN

mediante clonación in vitro. A esto le sigue el ensamblaje de un alineamiento plano de las microperlas que contienen moldes en una célula de flujo a una alta densidad (normalmente superior a 3x106 microperlas/cm2). Se analizan simultáneamente los extremos libres de los moldes clonados en cada microperla, usando un método de secuenciación de firma basado en fluorescencia que no requiere separación de fragmentos de ADN. Se ha mostrado

5 que este método proporciona de manera simultánea y precisa, en una única operación, cientos de miles de secuencias de firma de gen a partir de una biblioteca de ADNc de levadura.

6. Descripción general de los métodos de la invención de aislamiento, purificación y amplificación del ARNm

Se ilustran en la figura 1 las etapas de un protocolo representativo de la invención, incluyendo el aislamiento, la purificación, la extensión de cebador y la amplificación del ARNm. Tal como se muestra en la figura 1, este procedimiento representativo comienza con el corte de secciones de aproximadamente 10 μm de grosor de muestras de tejido de tumor incrustado en parafina. Entonces se extrae el ARN, y se eliminan las proteínas y el ADN, siguiendo el método de la invención descrito a continuación. Tras el análisis de la concentración de ARN,

15 pueden incluirse etapas de reparación y/o amplificación del ARN, si es necesario, y se trascribe de manera inversa el ARN usando promotores específicos de gen seguido de RT-PCR. Finalmente, se analizan los datos para identificar la(s) mejor(es) opción/opciones de tratamiento disponible(s) para el paciente basándose en el patrón de expresión génica característico identificado en la muestra de tumor examinado. Las etapas individuales de este protocolo se tratarán en mayor detalle a continuación.

7. Método mejorado para el aislamiento de ácido nucleico a partir de muestras de tejido archivado

Tal como se trató anteriormente, en la primera etapa del método de la invención, se extrae el ARN total del material de interés fuente, incluyendo muestras de tejido incrustado en parafina, fijado, y se purifica suficientemente para

25 actuar como sustrato en un ensayo enzimático. A pesar de la disponibilidad de los productos comerciales, y el extenso conocimiento disponible referente al aislamiento de ácido nucleico, tal como ARN, a partir de tejidos, el aislamiento de ácido nucleico (ARN) a partir de muestras de tejido incrustado en parafina, fijado (FPET) no está libre de dificultad.

En un aspecto, la presente invención se refiere a un método mejorado para el aislamiento de ácido nucleico a partir de muestras de tejido archivado, por ejemplo FPET. Los niveles medidos de especies de ARNm son útiles para definir el estado fisiológico o patológico de células y tejidos. La RT-PCR (que se trató anteriormente) es uno de los métodos más sensibles, reproducibles y cuantitativos para esta “obtención del perfil de expresión génica”. El tejido fijado con formalina, incrustado en parafina es el material más ampliamente disponible para tales estudios. Varios

35 laboratorios han demostrado que es posible usar satisfactoriamente el tejido incrustado en parafina fijado (FPET) como fuente de ARN para RT-PCR (Stanta et al., Biotechniques 11:304-308 (1991); Stanta et al., Methods Mol. Biol 86:23-26 (1998); Jackson et al., Lancet 1:1391 (1989); Jackson et al., J. Clin. Pathol. 43:499-504 (1999); Finke et al., Biotechniques 14:448-453 (1993); Goldsworthy et al., Mol. Carcinog. 25:86-91 (1999); Stanta y Bonin, Biotechniques 24:271-276 (1998); Godfrey et al., J. Mol. Diagnostics 2:84 (2000); Specht et al., J. Mod. Med 78:B27 (4000); Specht et al., Am. J. Pathol. 158:419-429 (2001)). Esto permite que la obtención del perfil de expresión génica se lleve a cabo en la fuente más comúnmente disponible de muestras de biopsias humanas, y por tanto que se cree potencialmente nueva información terapéutica y de diagnóstico valiosa.

Los protocolos más ampliamente usados utilizan disolventes orgánicos peligrosos, tales como xileno, u octano

45 (Finke et al., citado anteriormente) para eliminar la cera del tejido en los bloques de parafina antes de la extracción del ácido nucleico (ARN y/o ADN). Siguen la eliminación del disolvente orgánico obligatorio (por ejemplo con etanol) y etapas de rehidratación, que necesitan múltiples manipulaciones, y adición del tiempo total sustancial al protocolo, los que puede llevar varios días. Los protocolos y kits comerciales para la extracción de ARN a partir de FPET [kit de purificación de ARN y ADN completo MasterPure™ (EPICENTRE®, Madison, WI); kit de aislamiento de ARN en bloque de parafina (Ambion, Inc.) y kit RNeasy™ Mini (Qiagen, Chatsworth, CA)] usan xileno para la desparafinación, en procedimientos que requieren normalmente múltiples centrifugaciones y cambios de tampón de etanol, e incubaciones tras la incubación con xileno.

La presente invención proporciona un protocolo de extracción de ácido nucleico mejorado que produce ácido

55 nucleico, en particular ARN, suficientemente intacto para mediciones de expresión génica. La etapa clave en el protocolo de extracción de ácido nucleico en el presente documento es la realización de la eliminación de la cera sin el uso de ningún disolvente orgánico, eliminando así la necesidad de múltiples manipulaciones asociadas con la eliminación del disolvente orgánico, y reduciendo sustancialmente el tiempo total en el protocolo. Según la invención, la cera, por ejemplo parafina se elimina de las muestras de tejido incrustado en cera mediante incubación a 65-75ºC en un tampón de lisis que solubiliza el tejido e hidroliza la proteína, tras el enfriamiento para solidificar la cera.

La figura 2 muestra un diagrama de flujo de un protocolo de extracción de ARN de la presente invención en comparación con un método comercial representativo, usando xileno para eliminar la cera. Se muestran en el diagrama los tiempos requeridos para las etapas individuales en los procedimientos y para los procedimientos

65 globales. Tal como se muestra, el proceso comercial requiere aproximadamente el 50% más tiempo que el procedimiento de la invención.

El tampón de lisis puede ser cualquier tampón conocido para la lisis celular. Sin embargo, se prefiere que no se usen métodos basados en oligo-dT de purificación selectiva de ARNm poliadenilado para aislar el ARN para la presente invención, ya que se espera que la masa de las moléculas de ARNm esté fragmentada y por tanto no tendrán una

5 cola poliadenilada intacta, y no se recuperarán o estarán disponibles para ensayos analíticos posteriores. De otra manera, puede usarse cualquier número de esquemas de purificación de ácido nucleico convencionales. Estos incluye extracciones con disolvente orgánico y caotropo, extracción usando perlas de vidrio o filtros, métodos basados en precipitación y precipitación con sales, o cualquiera de los métodos de purificación conocidos en la técnica para recuperar el ARN total o ácido nucleicos totales a partir de una fuente biológica.

Están comercialmente disponibles tampones de lisis, tal como, por ejemplo, de Qiagen, Epicentre o Ambion. Un grupo preferido de tampones de lisis normalmente contiene urea, y proteinasa K u otra proteasa. La proteinasa K es muy útil en el aislamiento de ADN o ARN no dañado, de alta calidad, puesto que la mayoría de las ADNasas y ARNasas de mamíferos se inactivan rápidamente por esta enzima, especialmente en presencia de dodecilsulfato de

15 sodio al 0,5 - 1% (SDS). Esto es particularmente importante en el caso de ARN, que es más susceptible a la degradación que el ADN. Mientras que las ADNasas requieren iones de metal para la actividad, y por tanto pueden inactivarse fácilmente mediante agentes quelantes, tales como EDTA, no existe ningún requisito de cofactor similar para ARNasas.

El enfriamiento y la solidificación resultante de la cera permite una fácil separación de la cera del ácido nucleico total, que puede precipitarse convenientemente, por ejemplo mediante isopropanol. El procesamiento adicional depende del fin pretendido. Si el método propuesto del análisis de ARN se ve sometido a un sesgo por ADN contaminante en un extracto, puede tratarse adicionalmente el extracto de ARN, por ejemplo mediante ADNasa, tras la purificación para eliminar específicamente el ADN mientras que se conserva el ARN. Por ejemplo, si el objetivo es aislar ARN de

25 alta calidad para posterior amplificación por RT-PCR, a la precipitación del ácido nucleico le sigue la eliminación de ADN, habitualmente mediante tratamiento con ADNasa. Sin embargo, puede eliminarse el ADN en diversas fases del aislamiento del ácido nucleico, mediante ADNasa u otras técnicas bien conocidas en la técnica.

Aunque las ventajas del protocolo de extracción de ácidos nucleicos de la invención son lo más evidentes para el aislamiento de ARN de muestras de tejido incrustado en parafina, archivado, la etapa de eliminación de la cera de la presente invención, que no implica el uso de un disolvente orgánico, también puede incluirse en cualquier protocolo convencional para la extracción de ácido nucleico total (ARN y ADN) o ADN sólo. Todos estos aspectos están específicamente dentro del alcance de la invención.

35 Usando calor seguido de enfriamiento para eliminar la parafina; el procedimiento de la presente invención ahorra tiempo de procesamiento valioso, y elimina una serie de manipulaciones, aumentando así potencialmente el rendimiento de ácido nucleico. De hecho, las pruebas experimentales presentadas en los ejemplos a continuación demuestran que el método de la presente invención no compromete el rendimiento de ARN.

8. Cebado específico de gen multiplexado en 5’ de la transcripción inversa

La RT-PCR requiere la transcripción inversa de la población de ARN de prueba como primera etapa. El cebador más comúnmente usado para la transcripción inversa es oligo-dT, que funciona bien cuando el ARN está intacto. Sin embargo, este cebador no será eficaz cuando el ARN esté sumamente fragmentado como es el caso en los tejidos

45 FPE.

La presente invención incluye el uso de cebadores específicos de gen, que tienen aproximadamente 20 bases de longitud con una Tm óptima entre aproximadamente 58ºC y 60ºC. Estos cebadores también servirán como cebadores inversos que dirige la amplificación de ADN por PCR.

Otro aspecto de la invención es la inclusión de múltiples cebadores específicos de gen en la misma mezcla de reacción. El número de tales diferentes cebadores puede variar mucho y puede ser de tan solo y como máximo

40.000 o más. La tabla 2 presenta ejemplos de cebadores inversos que pueden usarse satisfactoriamente para llevar a cabo los métodos de la invención. La figura 9 muestra los datos de expresión obtenidos usando esta

55 estrategia de cebado específico de gen multiplexado. Específicamente, la figura 9 es una representación de la expresión de 92 genes (un subconjunto de genes enumerados en la tabla 1) a través de 70 muestras de cáncer de mama FPE. El eje y muestra la expresión como tiempos de ciclo umbral.

Un enfoque alternativo se basa en el uso de hexámeros al azar como cebadores para la síntesis de ADNc. Sin embargo, se ha demostrado experimentalmente que el método de uso de una multiplicidad de cebadores específicos de gen es superior con respecto al enfoque conocido usando hexámeros al azar.

9. Preparación de ARNm fragmentado para los ensayos del perfil de expresión

65 Es de interés analizar la abundancia de especies de ARNm específicas en muestras biológicas, ya que este perfil de expresión proporciona un índice del estado fisiológico de esa muestra. El ARNm es notoriamente difícil de extraer y

mantener en su estado nativo, en consecuencia, el ARNm recuperado de fuentes biológicas está a menudo fragmentado o algo degradado. Esto es especialmente cierto en muestras de tejido humano que se han almacenado y fijado químicamente durante periodos de tiempo prolongados.

5 En un aspecto, la presente invención proporciona un medio de preparación del ARNm extraído de diversas fuentes, incluyendo muestras de tejido archivado, para la obtención del perfil de expresión de manera que se conserve su abundancia relativa y los ARNm de interés puedan medirse satisfactoriamente. Esto método es útil como medio de preparación del ARNm para análisis mediante cualquiera de los métodos de obtención del perfil de expresión conocidos, incluyendo RT-PCR acoplada con exonucleasa 5’ de sondas indicadoras (ensayos de tipo TaqMan®), tal

10 como se trató anteriormente, ensayos con endonucleasa flap (ensayos de tipo Cleavase® e Invader®), alineamientos de hibridación de oligonucleótidos, alineamientos de hibridación de ADNc, ensayos de ligamiento de oligonucleótidos, ensayos de extensión de nucleótidos individuales en 3’ y otros ensayos diseñados para evaluar la abundancia de secuencias de ARNm específicas en una muestra biológica.

15 Según el método de la invención, se extrae el ARN total del material fuente y se purifica suficientemente para actuar como sustrato en un ensayo enzimático. Se ha tratado anteriormente el procedimiento de extracción, incluyendo una manera nueva y mejorada de eliminar la cera (por ejemplo parafina) usada para incrustar las muestras de tejido. También se ha indicado que se prefiere que no se usen los métodos basados en oligo-dT de purificación selectiva de ARNm poliadenilado para aislar ARN para esta invención ya que se espera que el volumen del ARNm esté

20 fragmentado, no estará poliadenilado y, por tanto, no se recuperará y estará disponible para posteriores ensayos analíticos si se usa un método basado en oligo-dT.

Se muestra en la figura 3, un diagrama de un método mejorado para reparar el ARN fragmentado. Se mezcla el ARN fragmentado purificado a partir de la muestra de tejido con moldes de ADN, monocatenario, específico de gen o 25 universal para cada especie de ARNm de interés. Estos moldes pueden ser copias de ADN de longitud completa del ARNm derivado de las fuentes de genes clonados, pueden ser fragmentos del gen que representan sólo el segmento del gen que va a someterse a ensayo, pueden ser una serie de oligonucleótidos largos que representan o bien el gen de longitud completa o el/los segmento(s) de interés específicos(s). El molde puede representar o bien una secuencia consenso única o bien ser una mezcla de variantes polimórficas del gen. Este molde de ADN, o 30 armazón, incluirá preferiblemente uno o más sitios dUTP o rNTP en su longitud. Esto proporcionará un medio de eliminación del molde antes de llevar a cabo las posteriores etapas analíticas para evitar que actúe como sustrato o diana en estos últimos ensayos de análisis. Esta eliminación se logra tratando la muestra con uracil-ADN glicosilasa (UDG) y calentándola para provocar roturas de cadena donde UDG ha generado sitios abásicos. En el caso de rNTP, la muestra puede calentarse en presencia de un tampón básico (pH ~10) para inducir roturas de la cadena

35 donde se ubican rNTP en el molde.

Se mezcla el molde de ADN monocatenario con el ARN purificado, se desnaturaliza la mezcla y se aparea de manera que los fragmentos de ARN complementarios al molde de ADN se conviertan efectivamente en cebadores que puedan extenderse a lo largo de los moldes de ADN monocatenario. La ADN polimerasa I requiere un cebador 40 para la extensión pero se usará eficazmente o bien un cebador de ARN o bien un cebador de ADN. Por tanto, en presencia de ADN polimerasa I y dNTP, el ARN fragmentado puede extenderse a lo largo de los moldes de ADN complementario. Con el fin de aumentar la eficacia de la extensión, esta reacción puede ciclarse térmicamente, permitiendo el solapamiento de los moldes y que los productos de extensión se hibriden y se extiendan hasta que la población global de ARN fragmentado quede representada como ADN bicatenario extendido a partir de los

45 cebadores de fragmento de ARN.

Tras la generación de este ARN “reparado”, la muestra debe tratarse con UDG o tratarse con calor en una disolución ligeramente basificada para fragmentar el molde de ADN (armazón) e impedir que participe en las posteriores reacciones analíticas.

50 Entonces puede usarse el producto resultante de esta extensión enzimática como molde en un ensayo de obtención del perfil enzimático convencional que incluye amplificación y generación de señal detectable tal como fluorescente, quimioluminiscente, colorimétrica u otra lectura común a partir de ensayos basados en enzimas. Por ejemplo, para ensayos tipo TaqMan®, se añade este producto de ADN bicatenario como molde en un ensayo convencional; y,

55 para la hibridación de alineamientos, este producto actúa como molde de ADNc para la reacción de marcaje de ARNc normalmente usada para generar ARN marcado, monocatenario para la hibridación de alineamientos.

Este método de preparación del molde tiene la ventaja de recuperar información a partir de fragmentos de ARNm demasiado cortos como para actuar de manera eficaz como moldes en esquemas de generación de ADNc 60 convencionales. Además, este método actúa conservando las ubicaciones específicas en las secuencias de ARNm seleccionadas como diana por ensayos de análisis específicos. Por ejemplo, los ensayos TaqMan® se basan en una secuencia contigua única en una copia de ADNc de ARNm para actuar como molde de amplificación por PCR seleccionado como diana por una sonda indicadora marcada. Si se producen roturas de la cadena de ARNm en esta secuencia, el ensayo no detectará ese molde y subestimará la cantidad de ese ARNm en la muestra original. Este

65 método de preparación de la diana minimiza el efecto de la fragmentación del ARN.

Puede controlarse el producto de extensión formado en el ensayo de extensión de cebador de ARN controlando la cantidad de entrada del molde de ADN monocatenario y limitando la ciclación de la reacción de extensión. Esto es importante en la conservación de la abundancia relativa de las secuencias de ARNm seleccionadas como diana para el análisis.

5 Este método tiene la ventaja añadida de no requerir preparación paralela para cada secuencia diana ya que se multiplexa fácilmente. También es posible usar grandes combinaciones de oligonucleótidos largos de secuencia al azar o bibliotecas completas de secuencias clonadas para extender toda la población de secuencias de ARNm en el extracto de muestra para el análisis de genoma expresado completo en vez de análisis específico de gen seleccionado como diana.

10. Amplificación de especies de ARNm antes de la RT-PCR

Debido a la cantidad limitada y escasa calidad de ARNm que puede aislarse a partir de FPET, un nuevo

15 procedimiento que pueda amplificar con precisión ARNm de interés sería muy útil, particularmente para la cuantificación en tiempo real de la expresión génica (TaqMan®) y especialmente para un número cuantitativamente grande (>50) de genes >50 a 10.000.

Los protocolos actuales (por ejemplo Eberwine, Biotechniques 20:584-91 (1996)) están optimizados para la amplificación de ARNm a partir de una cantidad pequeña de ARN de poli A+ o total principalmente para análisis de microalineamientos. La presente invención proporciona un protocolo optimizado para la amplificación de pequeñas cantidades de ARN total fragmentado (tamaño promedio de aproximadamente 60-150 pb), utilizando secuencias específicas de gen como cebadores, tal como se ilustra en la figura 4.

25 El procedimiento de amplificación de la invención usa un número muy grande, normalmente nada menos que 100 –

190.000 cebadores específicos de gen (GSP) en una ronda de transcripción inversa. Cada GSP contiene un promotor de ARN polimerasa, por ejemplo un promotor de polimerasa ARN dependiente de ADN de T7, en el extremo 5’ para la posterior amplificación de ARN. Se prefieren GSP como cebadores debido al pequeño tamaño del ARN. Los protocolos actuales utilizan cebadores dT, que no representarían adecuadamente todos los transcritos inversos de ARNm debido al tamaño pequeño del ARN FPET. Puede diseñarse GSP optimizando parámetros habituales, tales como longitud, Tm, etc. Por ejemplo, puede diseñarse GSP usando Primer Express® (Applied Biosystems), o el programa de software Primer 3 (MIT). Normalmente se diseñan al menos 3 conjuntos por gen, y se seleccionan los que proporcionan el Ct más bajo en el ARN FPET (los que funcionan mejor).

35 Se realiza la síntesis de ADNc de segunda cadena mediante procedimientos convencionales (véase la figura 4, método 1), o mediante cebadores GSPf y Taq pol en condiciones de PCR (por ejemplo, 95ºC, 10 min. (activación de Taq) luego 60ºC, 45 s). Las ventajas de este último métodos son que el segundo cebador específico de gen, SGFf añade especificidad adicional (y la síntesis de segunda cadena potencialmente más eficaz) y la opción de realizar varios ciclos de PCR, si es necesario más ADN de partida para la amplificación de ARN mediante ARN polimerasa de T7. Entonces se realiza la amplificación de ARN en condiciones convencionales para generar múltiples copias de ARNc, que luego se usa en una reacción TaqMan® convencional.

Aunque se ilustra este procedimiento usando amplificación de ARN basada en T7, un experto en la técnica entenderá que también pueden usarse otros promotores de ARN polimerasa que no requieren un cebador, tal como

45 T3 o Sp6, y están dentro del alcance de la invención.

11. Método de elongación de ARN fragmentado y posterior amplificación

Este método, que combina y modifica las invenciones descritas en las secciones 9 y 10 anteriores, se ilustra en la figura 5. El procedimiento comienza con la elongación de ARNm fragmentado. Esto se produce tal como se describió anteriormente excepto porque los ADN de armazón se etiquetan con la secuencia promotora de ARN polimerasa de T7 en sus extremos 5’, conduciendo a ADN bicatenario extendido a partir de fragmentos de ARN. Las secuencias de molde necesitan eliminarse tras la transcripción in vitro. Estos moldes pueden incluir nucleótidos de dUTP o rNTP, que permiten la eliminación enzimática de los moldes tal como se describe en la sección 9, o los moldes pueden

55 eliminarse mediante tratamiento con ADNasa I.

El ADN de molde puede ser una población que representa diferentes ARNm de cualquier número. Puede generarse una fuente de moldes de ADN (armazones) de alta complejidad de secuencia agrupando ARN de una variedad de células o tejidos. En una realización, estos ARN se convierten en ADN bicatenario y se clonan en fagémidos. Entonces puede rescatarse el ADN monocatenario mediante crecimiento de fagémidos y aislamiento de ADN monocatenario a partir de fagémidos purificados.

Esta invención es útil porque aumenta las señales del perfil de expresión génica de dos modos diferentes: tanto aumentando la longitud de la secuencia de polinucleótido del ARNm de prueba como mediante amplificación por 65 transcripción in vitro. Una ventaja adicional es que elimina la necesidad de llevar a cabo optimización de la transcripción inversa con cebadores específicos de gen etiquetados con la secuencia promotora de ARN polimerasa

de T7 y, por tanto, es comparativamente rápida y económica.

Esta invención puede usarse con una variedad de diferentes métodos para obtener el perfil de expresión génica, por ejemplo RT-PCR o una variedad de métodos de alineamiento de ADN. Justo como en el protocolo anterior, este 5 enfoque se ilustra usando un promotor de T7 pero la invención no se limita de ese modo. Un experto en la técnica apreciará, sin embargo, que pueden usarse también otros promotores de ARN polimerasa, tales como T3 o Sp6.

12. Conjunto de genes de cáncer de mama, subsecuencias génicas sometidas a ensayo y aplicación clínica de los datos de expresión génica

Un importante aspecto de la presente invención es usar la expresión medida de ciertos genes por tejido de cáncer de mama para asignar pacientes a los mejores fármacos o combinaciones de fármacos, y para proporcionar información de pronóstico. Para este fin es necesario corregir (normalizar) tanto las diferencias en la cantidad de ARN sometido a ensayo como la variabilidad en la calidad del ARN usado. Por tanto, el ensayo mide e incorpora la 15 expresión de ciertos genes de normalización, incluyendo genes de mantenimiento bien conocidos, tales como GAPDH y Cyp1. Alternativamente, la normalización puede basarse en la media o mediana de la señal (Ct) de todos los genes sometidos a ensayo o un gran subconjunto de los mismos (enfoque de normalización global). En una base de gen a gen, se compara la cantidad normalizada medida de un ARNm de tumor del paciente con la cantidad encontrada en un conjunto de referencia de tejido de cáncer de mama. El número (N) de tejidos de cáncer de mama en este conjunto de referencia debe ser suficientemente alto para garantizar que diferentes conjuntos de referencia (como un todo) se comporten esencialmente del mismo modo. Si se cumple esta condición, la identidad de los tejidos de cáncer de mama individuales presentes en un conjunto particular no tendrá ningún impacto significativo sobre las cantidades relativas de los genes sometidos a ensayo. Habitualmente, el conjunto de referencia de tejido de cáncer de mama consiste en al menos aproximadamente 30, preferiblemente al menos aproximadamente 40

25 diferentes muestras de tejido de cáncer de mama FPE. A menos que se indique lo contrario, los niveles de expresión normalizada para cada ARNm/tumor sometido a prueba/paciente se expresarán como un porcentaje del nivel de expresión medido en el conjunto de referencia. Más específicamente, el conjunto de referencia de un número suficientemente alto (por ejemplo 40) los tumores produce una distribución de niveles normalizados de cada especie de ARNm. El nivel medido en una muestra de tumor particular que va a analizarse se encuentra en algún percentil dentro de este intervalo, lo que puede determinarse mediante métodos bien conocidos en la técnica. A continuación, a menos que se indique lo contrario, la referencia a niveles de expresión de un gen supone expresión normalizada en relación con el conjunto de referencia aunque esto no siempre se establece de manera explícita.

El conjunto de genes de cáncer de mama se muestra en la tabla 1. Los números de registro de los genes, y las SEQ

35 ID NO para el cebador directo, cebador inverso y secuencias de amplicón que pueden usarse para la amplificación génica, se enumeran en la tabla 2. La base para la inclusión de marcadores, así como la significación clínica de las variaciones del nivel de ARNm con respecto al conjunto de referencia, se indica a continuación. Los genes se agrupan en subconjuntos basándose en el tipo de significación clínica indicada por sus niveles de expresión: A. Predicción de la respuesta del paciente a los fármacos usados en el tratamiento del cáncer de mama, o a fármacos que se aprueban para otras indicaciones y podrían usarse de manera no indicada en el tratamiento de cáncer de mama. B. Pronóstico para la supervivencia o recidiva del cáncer.

C. Predicción de la respuesta del paciente a fármacos terapéuticos

45 1. Moléculas que influyen específicamente en la sensibilidad celular a fármacos

La tabla 1 enumera 74 genes (mostrados en cursiva) que influyen específicamente en la sensibilidad celular a potentes fármacos, que también se enumeran. La mayoría de los fármacos mostrados están aprobados y se usan ya para tratar el cáncer de mama (por ejemplo, antraciclinas; ciclofosfamida; metotrexato; 5-FU y análogos). Varios de los fármacos se usan para tratar el cáncer de mama de manera no indicada o están en fase de desarrollo clínico (por ejemplo, bisfosfonatos y AcM anti-VEGF). Varios de los fármacos no se han usado ampliamente para tratar el cáncer de mama pero se usan en otros cánceres en los que se expresa la diana indicada (por ejemplo, se usa Celebrex para tratar el cáncer de colon familiar; se usa cisplatino para tratar el cáncer de ovarios y otros).

55 Se indica la respuesta del paciente a 5FU si la cantidad de ARNm de timidilato sintasa normalizada está en o por debajo del 15º percentil, o la suma de la expresión de timidilato sintasa más dihidropirimidina fosforilasa está en o por debajo del 25º percentil, o la suma de la expresión de estos ARNm más timidina fosforilasa está en o por debajo del 20º percentil. Los pacientes con dihidropirimidina deshidrogenasa por debajo del 5º percentil están en riesgo de respuesta adversa a 5FU, o análogos tales como Xeloda.

Cuando los niveles de timidilato sintasa y dihidropirimidina deshidrogenasa están dentro del intervalo aceptable tal como se define en el párrafo anterior, la amplificación de ARNm de c-myc en el 15% superior, contra un fondo de p53 de tipo natural [tal como se define a continuación] predice una respuesta beneficiosa a 5FU (véase D. Arango et al., Cancer Res. 61:4910-4915 (2001)). En presencia de niveles normales de timidilato sintasa y dihidropirimidina

65 deshidrogenasa, los niveles de NFκB y cIAP2 en el 10% superior indican resistencia de los tumores de mama al fármaco quimioterápico 5FU.

Se indica resistencia del paciente a antraciclinas si el nivel de ARNm normalizado de topoisomerasa IIα está por debajo del 10º percentil, o si el nivel de ARNm normalizado de topoisomerasa IIβ está por debajo del 10º percentil o si las señales de topoisomerasa IIα y IIβ normalizadas combinadas están por debajo del 10º percentil.

5 La sensibilidad del paciente a metotrexato está comprometida si los niveles de DHFR son más de diez veces superiores al nivel del conjunto de referencia promedio para esta especie de ARNm, o si los niveles de portador de folato reducido están por debajo del 10º percentil.

10 Los pacientes cuyos tumores expresan CYP1B1 en el 10% superior tienen una probabilidad reducida de responder a docetaxol.

La suma de señales para aldehído deshidrogenasa 1A1 y 1A3, cuando es más de diez veces superior que el promedio del conjunto de referencia, indica probabilidad reducida de respuesta a ciclofosfamida.

15 Actualmente, la expresión del receptor de estrógenos y progesterona tal como se mide mediante inmunohistoquímica se usa para seleccionar pacientes para terapia antiestrógenos. Se han demostrado ensayos de RT-PCR para los niveles de ARNm del receptor de estrógenos y progesterona que predicen los niveles de estas proteínas tal como se determina mediante pruebas de diagnóstico clínico convencionales, con alto grado de

20 concordancia (figuras 6 y 7).

Los pacientes cuyos tumores expresan ARNm de REα o RP en el 70% superior es probable que respondan a tamoxifeno u otros antiestrógenos (por tanto, operativamente, los niveles inferiores de REα que estos van a definir tumores negativos para REα). Sin embargo, cuando la señal para la epóxido hidrolasa microsomal está en el 10%

25 superior o cuando los ARNm para pS2/factor trébol, GATA3 o gonadotropina coriónica humana están en o por debajo de los niveles promedio encontrados en tumores negativos para REα, la terapia antiestrógenos no será beneficiosa.

La ausencia de señal de XIST compromete la probabilidad de respuesta a taxanos, como también la elevación de la

30 señal de GST-π o prolil endopeptidasa [PREP] en el 10% superior. La elevación de PLAG1 en el 10% superior disminuye la sensibilidad a taxanos.

La expresión de ARNm de ERCC1 en el 10% superior indica riesgo significativo de resistencia a cisplatino o análogos.

35 Un ensayo de RT-PCR de la expresión de ARNm de Her2 predice la sobreexpresión de Her2 tal como se mide mediante una prueba de diagnóstico convencional, con alto grado de concordancia (datos no mostrados). Los pacientes cuyos tumores expresan Her2 (normalizado a cyp.1) en el 10% superior tienen un aumento de la probabilidad de respuesta beneficiosa al tratamiento con Herceptin u otros antagonistas de ErbB2. La medición de la

40 expresión de ARNm de Grb7 sirve como prueba para la amplificación génica de HER2, porque el gen de Grb7 está estrechamente vinculado a Her2. Cuando la expresión de Her2 es alta tal como se definió anteriormente en este párrafo, Grb7 elevado de manera similar indica amplificación génica de Her2. La sobreexpresión de IGF1R y o IGF1

o IGF2 disminuye la probabilidad de respuesta beneficiosa a Herceptin y también a antagonistas de EGFR.

45 Los pacientes cuyos tumores expresan Ha-Ras mutante, y también expresan ARNm de farnesil pirofosfato sintetasa

o geranil pirofosfonato sintetasa a niveles por encima del décimo percentil comprenden un grupo que es especialmente probable que presente una respuesta beneficiosa a fármacos de bisfosfonato.

Cox2 es una enzima de control clave en la síntesis de prostaglandinas. Se expresa frecuentemente a niveles

50 elevados en subconjuntos de diversos tipos de carcinomas incluyendo carcinoma de la mama. La expresión de este gen se controla al nivel de la transcripción, de modo que la RT-PCR sirve como un indicador válido de la actividad enzimática celular. La investigación no clínica ha mostrado que cox2 promueve la angiogénesis tumoral, lo que sugiere que esta enzima es una diana farmacológica prometedora en tumores sólidos. Varios antagonistas de Cox2 son productos comercializados para su uso en estados antiinflamatorios. El tratamiento de pacientes con poliposis

55 adenomatosa familiar con el inhibidor de cox2 Celebrex disminuyó significativamente el número y tamaño de pólipos neoplásicos. Ningún inhibidor de cox2 se ha aprobado aún para el tratamiento del cáncer de mama, pero generalmente esta clase de fármacos es segura y podría prescribirse de manera no indicada en cánceres de mama en los que se sobreexpresa cox2. Los tumores que expresan COX2 a niveles en el percentil diez superior tienen un aumento de la posibilidad de respuesta beneficiosa a Celebrex u otros inhibidores de ciclooxigenasa 2.

60 Las tirosina cinasas ErbB1 [EGFR], ErbB3 y ErbB4 [Her4]; también los ligandos TGFalfa, anfiregulina, factor de crecimiento similar a EGF de unión a heparina y epiregulina; también BRK, una cinasa no receptora. Varios fármacos en desarrollo clínico bloquean el receptor de EGF. ErbB2-4, los ligandos indicados y BRK también aumentan la actividad de la ruta de EGFR. Pacientes con cáncer de mama cuyos tumores expresan altos niveles de

65 EGFR o EGFR y niveles anómalamente altos de los otros activadores indicados de la ruta de EGFR son candidatos

potenciales para el tratamiento con un antagonista de EGFR.

Pacientes cuyos tumores expresan menos del 10% del nivel promedio de ARNm de EGFR observado en el panel de referencia es relativamente menos probable que respondan a antagonistas de EGFR [tales como Iressa, o ImClone

5 225]. En casos en los que el EGFR está por encima de este bajo intervalo, la presencia adicional de epiregulina, TGFα, anfiregulina, o ErbB3, o BRK, CD9, MMP9, o Lot1 a niveles por encima del 90º percentil predispone a la respuesta a antagonistas de EGFR. La expresión génica de epiregulina, en particular, es un buen marcador sustituto para la activación de EGFR, y puede usarse no sólo para predecir la respuesta a antagonistas de EGFR, sino también para monitorizar la respuesta a antagonistas de EGFR [tomando biopsias con agujas finas para proporcionar tejido tumoral durante el tratamiento]. Niveles de CD82 por encima del 90º percentil sugieren peor eficacia de los antagonistas de EGFR.

Las tirosina cinasas abl, c-kit, PDGFRalfa, PDGFbeta y ARG; también, los ligandos que transmiten la señal ligando c-kit, PDGFA, B, C y D. Las tirosina cinasas enumeradas son todas dianas del fármaco Gleevec™ (imatinib mesilato, 15 Novartis), y los ligandos enumerados estimulan una o más de las tirosina cinasas enumeradas. En las dos indicaciones para las que está aprobado Gleevec™, las dianas de tirosina cinasa (bcr-abl y ckit) se sobreexpresan y también contienen mutaciones activantes. Un hallazgo de que una de las dianas de tirosina cinasa diana de Gleevec™ se expresa en tejido de cáncer de mama dará lugar a una segunda fase de análisis en la que el gen se secuenciará para determinar si está mutado. Que una mutación encontrada es una mutación activante puede demostrarse mediante métodos conocidos en la técnica, tales como, por ejemplo, midiendo la actividad enzimática cinasa o midiendo el estado de fosforilación de la cinasa particular, en relación con la cinasa de tipo natural correspondiente. Pacientes con cáncer de mama cuyos tumores expresan altos niveles de ARNm que codifican para tirosina cinasas dianas de Gleevec™, específicamente, en el percentil diez superior, o ARNm para tirosina cinasas dianas de Gleevec™ en el intervalo promedio y ARNm para sus ligandos estimulantes del crecimiento relacionados

25 en el percentil diez superior, son candidatos particularmente buenos para el tratamiento con Gleevec™.

VEGF es un factor angiogénico potente y patológicamente importante. (Véase a continuación en Indicadores de pronóstico). Cuando los niveles de ARNm de VEGF están en el percentil diez superior, se justifica un tratamiento agresivo. Tales niveles sugieren particularmente el valor del tratamiento con fármacos antiangiogénicos, incluyendo antagonistas de VEGF, tales como anticuerpos anti-VEGF. Adicionalmente, un nivel de ARNm de KDR o CD31 en el percentil 20 superior aumenta adicionalmente la probabilidad de beneficio de antagonistas de VEGF.

Farnesil pirofosfato sintetasa y geranil geranil pirofosfato sintetasa. Estas enzimas son dianas de fármacos de bisfosfonato comercializados, que se desarrollaron originalmente para el tratamiento de la osteoporosis pero que

35 recientemente han comenzado a prescribirse de manera no indicada en el cáncer de mama. Niveles elevados de ARNm que codifican para estas enzimas en tejido de cáncer de mama, por enzima del 90º percentil, sugieren el uso de bisfosfonatos como opción de tratamiento.

2. Factores de resistencia a múltiples fármacos

Estos factores incluyen 10 genes: gamma glutamil cisteína sintetasa [GCS]; GST-α; GST-π; MDR-1; MRP1-4; proteína de resistencia a cáncer de mama [BCRP]; proteína de resistencia pulmonar [MVP]; SXR; YB-1.

GCS y tanto GST-α como GST-π regulan los niveles de glutatión, que disminuye la sensibilidad celular a fármacos

45 quimioterápicos y otras toxinas mediante derivatización reductora. El glutatión es un cofactor necesario para bombas resistentes a múltiples fármacos, MDR-1 y los MRP. MDR1 y MRP funcionan transportando de manera activa fuera de las células varios fármacos quimioterápicos importantes usados en el cáncer de mama.

Se han estudiado de manera extensa GST, MDR-1 y MRP-1 para determinar si tienen una posible significación predictiva o de pronóstico en cáncer humano. Sin embargo, existe mucho desacuerdo en la bibliografía con respecto a estas cuestiones. Recientemente, se han identificado nuevos miembros de la familia de MRP: MRP-2, MRP-3, MRP-4, BCRP y proteína de resistencia pulmonar [proteína Vault principal]. Estas tienen especificidades de sustrato que se solapan con las de MDR-1 y MRP-1. La incorporación de todos estos miembros relevantes de la familia ABC así como enzimas sintéticas de glutatión en la presente invención captura la contribución de esta familia a la

55 resistencia a fármacos, de un modo que no pueden hacer ensayos de analito único o doble.

MRP-1, el gen que codifica para la proteína de resistencia a múltiples fármacos.

P-glicoproteína no se regula principalmente al nivel de la transcripción. Sin embargo, p-glicoproteína estimula la transcripción de PTP1b. Una realización de la presente invención es el uso del nivel de ARNm para la fosfatasa PTP1b como una medida sustituta de la actividad de MRP-1/p-glicoproteína.

El gen SXR también es un activador de resistencia a múltiples fármacos, ya que estimula la transcripción de ciertos factores de resistencia a múltiples fármacos.

65 El impacto de factores de resistencia a múltiples fármacos con respecto a los agentes quimioterápicos usados en el

cáncer de mama es tal como sigue. La respuesta beneficiosa a doxorubicina está comprometida cuando los niveles de ARNm de o bien MDR1, GSTα, GSTπ, SXR, BCRP YB-1 o bien LRP/MVP están en el percentil cuatro superior. Se inhibe la respuesta beneficiosa a metotrexato si los niveles de ARNm de cualquiera de MRP1, MRP2, MRP3 o MRP4 o gamma-glutamil cisteína sintetasa están en el percentil cuatro superior.

3. Factor de iniciación de la traducción eucariota 4E [EIF4E]

Los niveles de ARNm de EIF4E proporcionan pruebas de expresión de proteínas y de ese modo se expande la capacidad de la RT-PCR para indicar variación en la expresión génica. Por tanto, una reivindicación de la presente invención es el uso de EIF4E como un indicador añadido de la expresión génica de ciertos genes [por ejemplo, ciclinaD1, mdm2, VEGF y otros]. Por ejemplo, en dos muestras de tejido que contienen la misma cantidad de ARNm de VEGF normalizado, es probable que el tejido que contiene el nivel normalizado superior de EIF4E presente el mayor nivel de expresión génica de VEGF.

15 Los antecedentes son los siguientes. Un punto clave en la regulación de la traducción del ARNm es la selección de ARNm por el complejo EIF4G para que se unan a la subunidad ribosómica 43S. La proteína EIF4E [la proteína de unión a m7G CAP] es a menudo limitante porque existen más copias de ARNm que de EIF4E en las células. UTR en 5’ sumamente estructuradas o sumamente ricas en GC se traducen ineficazmente, y éstas a menudo codifican para genes que llevan a cabo funciones relevantes para el cáncer [por ejemplo, ciclinaD1, mdm2 y VEGF]. EIF4E se regula por sí misma al nivel de la transcripción/ARNm. Por tanto, la expresión de EIF4E proporciona una indicación añadida de aumento de actividad de varias proteínas.

También es de notar que la sobreexpresión de EIF4E transforma células cultivadas, y por tanto es un oncogén. Se produce sobreexpresión de EIF4E en varios tipos diferentes de carcinomas pero es particularmente significativa en

25 cáncer de mama. EIF4E se expresa normalmente a niveles muy bajos en tejido de mama normal.

D. Indicadores de pronóstico

1. Enzimas de reparación del ADN

La pérdida de actividad de BRCA1 o BRCA2 mediante mutación representa la etapa oncogénica crítica en el/los tipo(s) más común/comunes de cáncer de mama familiar. Los niveles de ARNm de estas importantes enzimas son anómalos en subconjuntos de cáncer de mama esporádico también. La pérdida de señales de cualquiera [hasta el percentil diez inferior] acentúa el riesgo de corta supervivencia.

2. Reguladores del ciclo celular

Los reguladores del ciclo celular incluyen 14 genes: c-MYC; c-Src; Ciclina D1; Ha-Ras; mdm2; p14ARF; p21WAF1/CIP; p16INK4a/p14; p23; p27; p53; PI3K; PKC-epsilon; PKC-delta.

El gen para p53 [TP53] está mutado en una gran fracción de cánceres de mama. Frecuentemente, los niveles de p53 se elevan cuando se produce la mutación de pérdida de función. Cuando la mutación es dominante-negativa, crea un valor de supervivencia para la célula cancerosa porque se promueve el crecimiento y se inhibe la apoptosis. Se han encontrado miles de mutaciones de p53 diferentes en el cáncer de mama, y las consecuencias funcionales

45 de muchas de ellas no están claras. Un gran grupo de bibliografía académica aborda la significación predictiva y de pronóstico de p53 mutado y los resultados son sumamente contradictorios. La presente invención proporciona una medida genómica funcional de la actividad de p53, tal como sigue. La molécula de p53 de tipo natural activada desencadena la transcripción del inhibidor del ciclo celular p21. Por tanto, la razón de p53 con respecto a p21 debe ser baja cuando p53 es de tipo natural y está activado. Cuando p53 es detectable y la razón de p53 con respecto a p21 está elevada en tumores en relación con la mama normal, significa p53 no funcional o dominante negativo p53. La bibliografía del cáncer proporciona pruebas de esto tal como se confirma mediante un mal pronóstico.

Mdm2 es un importante regulador de p53. p53 de tipo natural activado estimula la transcripción de mdm2. La proteína mdm2 se une a p53 y promueve su destrucción proteolítica. Por tanto, niveles anómalamente bajos de

55 mdm2 en presencia de niveles normales o superiores de p53 indican que p53 está mutado o inactivado.

Un aspecto de la presente invención es el uso de razones de los niveles de ARNm p53:p21 y p53:mdm2 para proporcionar una imagen del estado de p53. Pruebas de mutación dominante negativa de p53 (tal como se indica mediante razones de ARNm p53:p21 altas y/o p53:mdm2 altas, específicamente en el percentil diez superior) presagian un riesgo superior de recidiva en cáncer de mama y por tanto inducen a una decisión a usar quimioterapia en cáncer de mama tras cirugía con nodo negativo.

Otro importante regulador del ciclo celular es p27, que en la forma activada bloquea la progresión del ciclo celular al nivel de cdk4. La proteína se regula principalmente mediante fosforilación/desfosforilación, en vez de al nivel de la

65 transcripción. Sin embargo, los niveles de ARNm de p27 varían. Por tanto, un nivel de ARNm de p27 en el percentil diez superior indica riesgo reducido de recidiva del cáncer de mama tras cirugía.

La ciclina D 1 es un regulador positivo principal de la entrada en fase S del ciclo celular. El gen para ciclina D1 está amplificado en aproximadamente el 20% de los pacientes con cáncer de mama, y por tanto promueve el crecimiento tumoral en esos casos. Un aspecto de la presente invención es el uso de los niveles de ARNm de ciclina D1 para

5 fines de diagnóstico en cáncer de mama. Un nivel de ARNm de ciclina D1 en el percentil diez superior sugiere alto riesgo de recidiva en cáncer de mama tras cirugía y sugiere un beneficio particular de la quimioterapia adyuvante.

3. Otros supresores de tumores y proteínas relacionadas

Estos incluyen APC y E-cadherina. Se sabe desde hace mucho que el supresor de tumores APC se pierde en aproximadamente el 50% de los cánceres de colon, con regulación por incremento de la transcripción concomitante de E-cadherina, una importante molécula de adhesión celular y supresor del crecimiento. Recientemente, se ha encontrado que el gen de APC está silenciado en el 15-40% de los cánceres de mama. Asimismo, el gen de Ecadherina está silenciado [mediante metilación de islas CpG] en aproximadamente el 30% de los cánceres de

15 mama. Un nivel anómalamente bajo de ARNm de APC y/o E-cadherina en el percentil 5 inferior sugiere un alto riesgo de recidiva en cáncer de mama y riesgo acentuado de supervivencia acortada.

4. Reguladores de la apoptosis

Estos incluyen los miembros de la familia BCl/BAX BCl2, Bcl-xl, Bak, Bax y factores relacionados, NFκ-B y factores relacionados, y también p53BP1/ASPP1 y p53BP2/ASPP2.

Bax y Bak son proapoptóticos y BCl2 y Bcl-xl son antiapoptóticos. Por tanto, las razones de estos factores influyen en la resistencia o sensibilidad de una célula a fármacos tóxicos (proapoptóticos). En cáncer de mama, a diferencia

25 de otros cánceres, un nivel elevado de BCl2 (en el percentil diez superior) se correlaciona con buen desenlace. Esto refleja el hecho de que BCl2 tiene actividad inhibidora del crecimiento así como actividad antiapoptótica, y en cáncer de mama la significación de la primera actividad tiene más peso que la significación de la última. El impacto de BC12 depende a su vez del estado del factor de transcripción que estimula el crecimiento c-MYC. El gen para c-MYC está amplificado en aproximadamente el 20% de los cánceres de mama. Cuando los niveles de mensajero de c-MYC están anómalamente elevados en relación con BC12 (de manera que esta razón está en el percentil diez superior), entonces el nivel elevado de ARNm de BC12 ARNm ya no es un indicador positivo.

NFκ-B es otro factor antiapoptótico importante. Originalmente reconocido como un factor de transcripción proinflamatorio, ahora está claro que previene la muerte celular programada en respuesta a varios factores tóxicos 35 extracelulares [tales como factor de necrosis tumoral]. La actividad de este factor de transcripción se regula principalmente mediante acontecimientos de fosforilación/desfosforilación. Sin embargo, los niveles de NFκ-B varían no obstante de célula a célula, y niveles elevados deben correlacionarse con aumento de la resistencia a la apoptosis. De manera importante para los presentes fines, NFκ-B ejerce su actividad antiapoptótica en gran medida a través de su estimulación de la transcripción de ARNm que codifican para ciertos miembros de la familia IAP [inhibidor de la apoptosis] de proteínas, específicamente cIAP1, cIAP2, XIAP y survivina. Por tanto, niveles anómalamente elevados de ARNm para estos IAP y para NFκ-B cualquiera en el percentil 5 superior significan la activación de la ruta antiapoptótica de NFκ-B. Esto sugiere un alto riesgo de recidiva en cáncer de mama tras quimioterapia y por tanto un mal pronóstico. Una realización de la presente invención es la inclusión en el conjunto de genes de los reguladores apoptóticos anteriores, y el uso explicado de manera resumida anteriormente de

45 combinaciones y razones de los niveles de sus ARNm para el pronóstico del cáncer de mama.

Las proteínas p53BP1 y 2 se unen a p53 y promueven la activación transcripcional de genes proapoptóticos. Los niveles de p53BP1 y 2 están suprimidos en una fracción significativa de cánceres de mama, correlacionándose con un mal pronóstico. Cuando se expresa cualquiera en el décimo percentil inferior, se indica un mal pronóstico.

5. Factores que controlan la angiogénesis e invasión celular

Estos incluyen uPA, PAI1, catepsinas B, G y L, factor de dispersión [HGF], c-met, KDR, VEGF y CD31. El activador de plasminógeno uPA y su regulador de serpina PAI1 promueven la descomposición de matrices extracelulares y la

55 invasión de células tumorales. Niveles anómalamente elevados de ambos ARNm en tumores de mama malignos (en el percentil veinte superior) significan un aumento del riesgo de supervivencia acortada, aumento de la recidiva en pacientes con cáncer de mama tras la cirugía y aumento de la importancia de recibir quimioterapia adyuvante. Por otro lado, los pacientes con nodo negativo cuyos tumores no expresan niveles elevados de estas especies de ARNm son menos probables que tengan recidiva de este cáncer y podrían considerarse más seriamente si los beneficios de la quimioterapia convencional justifican la toxicidad asociada.

Las catepsinas B o L, cuando se expresan en el percentil diez superior, predicen mala supervivencia global y libre de enfermedad. En particular, la catepsina L predice una corta supervivencia en pacientes con nodo positivo.

65 El factor de dispersión y su receptor relacionado c-met promueven la invasión y motilidad celular, el crecimiento

celular y la angiogénesis. En cáncer de mama, niveles elevados de ARNm que codifican para estos factores deben dar lugar a tratamiento agresivo con fármacos quimioterápicos, cuando la expresión de cualquiera, o la combinación, está por encima del percentil 90º.

5 VEGF es un regulador positivo central de la angiogénesis, y niveles elevados en tumores sólidos predicen la supervivencia corta [obsérvense muchas referencias que muestran que un nivel elevado de VEGF predice supervivencia corta]. Por tanto, los inhibidores de VEGF ralentizan el crecimiento de tumores sólidos en animales y seres humanos. La actividad de VEGF se controla al nivel de la transcripción. Niveles de ARNm de VEGF en el percentil diez superior indican un pronóstico significativamente peor que el promedio. Otros marcadores de vascularización, CD31 [PECAM] y KDR indican alta densidad de vasos en tumores que el tumor será particularmente maligno y agresivo, y por tanto que está justificada una estrategia terapéutica agresiva.

6. Marcadores para procesos y células inmunitarias e inflamatorias

15 Estos marcadores incluyen los genes para la cadena λ ligera de inmunoglobulinas CD18, CD3, CD68, Fas [CD95] y ligando Fas.

Varios conjuntos de pruebas sugieren que el mecanismo de acción de ciertos fármacos usados en el cáncer de mama suponen la activación de la respuesta inmunitaria/inflamatoria del huésped (por ejemplo, Herceptin®). Un aspecto de la presente invención es la inclusión en el conjunto de genes de marcadores para células inflamatorias e inmunitarias, y marcadores que predicen la resistencia tumoral frente a la vigilancia inmunitaria. La cadena ligera lambda de inmunoglobulinas es un marcador para células que producen inmunoglobulinas. CD18 es un marcador para todos los glóbulos blancos. CD3 es un marcador para células T. CD68 es un marcador para macrófagos.

25 CD95 y ligando Fas son un receptor: un par de ligandos que median una de las dos rutas principales mediante las cuales las células T citotóxicas y las células NK destruyen células seleccionadas como diana. La disminución de la expresión de CD95 y el aumento de la expresión del ligando Fas indica mal pronóstico en cáncer de mama. Tanto CD95 como el ligando Fas son proteínas transmembrana, y necesitan estar ancladas a la membrana para desencadenar la muerte celular. Ciertas células tumorales producen una variante soluble truncada de CD95, creada como resultado del corte y empalme alternativo del ARNm de CD95. Esto bloquea la destrucción de las células tumorales mediadas por el ligando FAS de células T citotóxicas y células NK. La presencia de CD95 soluble se correlaciona con escasa supervivencia en cáncer de mama. El conjunto de genes incluye variantes tanto solubles como de longitud completa de CD95.

35 7. Marcadores de proliferación celular

El conjunto de genes incluye los marcadores de proliferación celular Ki67/MiB1, PCNA, Pin1 y timidina cinasa. Altos niveles de expresión de marcadores de proliferación se asocian con un alto grado histológico, y corta supervivencia. Altos niveles de timidina cinasa en el percentil diez superior sugieren un aumento del riesgo de corta supervivencia. Pin1 es una prolil isomerasa que estimula el crecimiento celular, en parte a través de la activación transcripcional del gen de ciclina D1, y niveles en el percentil diez superior contribuyen a un perfil de pronóstico negativo.

8. Otros receptores y factores de crecimiento

45 Este conjunto de genes incluye IGF1, IGF2, IGFBP3, IGF1R, FGF2, FGFR1, CSF-1R/fms, CSF-1, IL6 e IL8. Todas estas proteínas se expresan en cáncer de mama. La mayoría estimulan el crecimiento tumoral. Sin embargo, la expresión del factor de crecimiento FGF2 se correlaciona con buen desenlace. Algunos tienen actividad antiapoptótica, principalmente IGF1. La activación del eje de IGF1 mediante IGF1, IGF1R o IGFBP3 elevado (tal como se indica mediante la suma de estas señales en el percentil diez superior) inhibe la muerte de células tumorales y contribuye enormemente a un perfil de mal pronóstico.

9. Marcadores de expresión génica que definen subclases de cáncer de mama

Estos incluyen: oncogén GRO1 alfa, Grb7, citoqueratinas 5 y 17, proteína 4 de unión a retinal, factor nuclear de

55 hepatocitos 3, integrina alfa 7 y lipoproteína lipasa. Estos marcadores dividen el cáncer de mama en diferentes tipos celulares que son fenotípicamente diferentes al nivel de la expresión génica. Los tumores que expresan señales para Bcl2, factor nuclear de hepatocitos 3, LIV1 y RE por encima de la media tienen el mejor pronóstico para la supervivencia global y libre de enfermedad tras la extirpación quirúrgica del cáncer. Otra categoría de tipo de tumor de cáncer de mama, caracterizada por expresión elevada de lipoproteína lipasa, proteína 4 de unión a retinol e integrina α7, acarrean un pronóstico intermedio. Los tumores que expresan o bien niveles elevados de citoqueratinas 5 y 17, oncogén GRO a niveles cuatro veces o mayores por encima de la media, o bien ErbB2 y Grb7 a niveles diez veces o más por encima de la media, tienen el peor pronóstico.

Aunque a lo largo de toda la presente descripción, incluyendo los ejemplos a continuación, se explican diversos

65 aspectos de la invención con referencia a estudios de expresión génica, la divulgación puede realizarse de una manera similar, y pueden alcanzarse resultados similares aplicando técnicas de proteómica que se conocen bien en

la técnica. El proteoma es la totalidad de las proteínas presentes en una muestra (por ejemplo, tejido, organismo o cultivo celular) en un determinado punto de tiempo. La proteómica incluye, entre otras cosas, el estudio de los cambios globales de la expresión de proteínas en una muestra (también denominada “proteómica de expresión”). La proteómica normalmente incluye las siguientes etapas: (1) separación de proteínas individuales en una muestra

5 mediante electroforesis en gel bidimensional (2-D PAGE); (2) identificación de las proteínas individuales recuperadas del gel, por ejemplo mediante espectrometría de masas y/o secuenciación N-terminal, y (3) análisis de los datos usando bioinformática. Los métodos de proteómica son complementos valiosos a otros métodos de obtención del perfil de expresión génica y pueden usarse solos o en combinación con otros métodos de la presente divulgación, para detectar los productos de los marcadores génicos de la presente invención.

10 Detalles adicionales de la invención se describirán en los siguientes ejemplos no limitativos.

Ejemplo 1

15 Aislamiento de ARN a partir de muestras de tejido incrustado en parafina, fijado con formalina (FPET)

A. Protocolos

I. Protocolo de xileno EPICENTRE®

20 Aislamiento de ARN

(1) Cortar 1-6 secciones (grosor de 10 μm cada una) de tejido incrustado en parafina por muestra usando una

cuchilla de micrótomo limpia y colocarlas en un tubo eppendorf de 1,5 ml. 25

(2)

Para extraer la parafina, añadir 1 ml de xileno e invertir los tubos durante 10 minutos sacudiendo en un nutador.

(3)

Sedimentar las secciones mediante centrifugación durante 10 minutos a 14.000 x g en una microcentrífuga

eppendorf. 30

(4) Eliminar el xileno, dejando algo en el fondo para evitar desplazar el sedimento.

(5) Repetir las etapas 2-4. 35 (6) Añadir 1 ml de etanol al 100% e invertir durante 3 minutos sacudiendo en el nutador.

(7) Sedimentar los residuos mediante centrifugación durante 10 minutos a 14.000 x g en una microcentrífuga eppendorf.

40 (8) Eliminar el etanol, dejando algo en el fondo para evitar el sedimento.

(9) Repetir las etapas 6-8 dos veces.

(10) Eliminar todo el etanol restante. 45

(11)

Para cada muestra, añadir 2 μl de proteinasa K 50 μg/μl a 300 μl de disolución de lisis celular y tisular.

(12)

Añadir 300 μl de disolución de lisis celular y tisular que contiene la proteinasa K a cada muestra y mezclar

concienzudamente. 50

(13) Incubar a 65ºC durante 90 minutos (mezclado con vórtex cada 5 minutos). Monitorizar visualmente el fragmento de tejido restante. Si todavía es visible tras 30 minutos, añadir 2 μl adicionales de proteinasa K 50 μg/μl y continuar incubando a 65ºC hasta que se disuelva el fragmento.

55 (14) Colocar las muestras en hielo durante 3-5 minutos y proceder con la eliminación de proteínas y precipitación del ácido nucleico total.

Eliminación de proteínas y precipitación del ácido nucleico total

60 (1) Añadir 150 μl de reactivo de precipitación de proteínas MPC a cada muestra lisada y agitar con vórtex vigorosamente durante 10 segundos.

(2) Sedimentar los residuos mediante centrifugación durante 10 minutos a 14.000 x g en una microcentrífuga

eppendorf. 65

(3)

Transferir el sobrenadante a tubos eppendorf limpios y desechar el sedimento.

(4)

Añadir 500 μl de isopropanol al sobrenadante recuperado y mezclar concienzudamente sacudiendo en el nutador

durante 3 minutos. 5

(5)

Sedimentar el ARN/ADN mediante centrifugación a 4ºC durante 10 minutos a 14.000 x g en una microcentrífuga eppendorf.

(6)

Eliminar todo el isopropanol con una pipeta, teniendo cuidado de no desplazar el sedimento. Eliminación de ADN contaminante de preparaciones de ARN

(1)

Preparar 200 μl de disolución de ADNasa I para cada muestra añadiendo 5 μl de ADNasa I libre de ARNasa (1

U/μl) a 195 μl de 1X tampón de ADNasa. 15

(2)

Resuspender completamente el ARN sedimentado en 200 μl de disolución de ADNasa I mediante agitación con vórtex.

(3)

Incubar las muestras a 37ºC durante 60 minutos.

(4)

Añadir 200 μl de 2X T y disolución de lisis C a cada muestra y agitar con vórtex durante 5 segundos.

(5)

Añadir 200 μl de reactivo de precipitación de proteínas MPC, mezclar agitando con vórtex durante 10 segundos y

colocar sobre hielo durante 3-5 minutos. 25

(6)

Sedimentar los residuos mediante centrifugación durante 10 minutos a 14.000 x g en una microcentrífuga eppendorf.

(7)

Transferir el sobrenadante que contiene el ARN para limpiar los tubos eppendorf y desechar el sedimento. (Tener cuidado para evitar transferir el sedimento).

(8)

Añadir 500 μl de isopropanol a cada sobrenadante y sacudir las muestras en el nutador durante 3 minutos.

(9)

Sedimentar el ARN mediante centrifugación a 4ºC durante 10 minutos a 14.000 x g en una microcentrífuga 35 eppendorf.

(10)

Eliminar el isopropanol, dejando algo en el fondo para evitar desplazar el sedimento.

(11)

Enjuagar dos veces con 1 ml de etanol al 75%. Centrifugar brevemente si el sedimento de ARN se desplaza.

(12)

Eliminar el etanol cuidadosamente.

(13)

Poner bajo una campana de extracción durante aproximadamente 3 minutos para eliminar el etanol residual. 45 (14) Resuspender el ARN en 30 μl de tampón TE y almacenar a -30ºC.

II. Protocolo de cera caliente/urea de la invención Aislamiento de ARN

(1)

Cortar 3 secciones (grosor de 10 μm cada una) de tejido incrustado en parafina usando una cuchilla de micrótomo limpia y colocarlas en un tubo eppendorf de 1,5 ml.

(2)

Añadir 300 μl de tampón de lisis (Tris 10 mM 7,5, lauroilsarcosina de sodio al 0,5%, EDTA 0,1 mM pH 7,5, urea 4

55 M) que contiene proteinasa K 330 μg/ml (añadida recientemente a partir de una disolución madre de 50 μg/μl) y agitar con vórtex brevemente.

(3)

Incubar a 65ºC durante 90 minutos (mezclado con vórtex cada 5 minutos). Monitorizar visualmente el fragmento de tejido. Si todavía es visible tras 30 minutos, añadir 2 μl adicionales de proteinasa K 50 μg/μl y continuar incubando a 65ºC hasta que se disuelva el fragmento.

(4)

Centrifugar durante 5 minutos a 14.000 x g y transferir la fase acuosa superior a un nuevo tubo, teniendo cuidado de no romper el sello de parafina.

65 (5) Colocar las muestras sobre hielo durante 3-5 minutos y proceder con la eliminación de proteínas y la

precipitación del ácido nucleico total.

Eliminación de proteínas y precipitación del ácido nucleico total

5 (1) Añadir 150 μl de NH4OAc 7,5 M a cada muestra lisada y agitar con vórtex vigorosamente durante 10 segundos.

(2)

Sedimentar los residuos mediante centrifugación durante 10 minutos a 14.000 x g en una microcentrífuga eppendorf.

(3)

Transferir el sobrenadante a tubos eppendorf limpios y desechar el sedimento.

(4)

Añadir 500 μl de isopropanol al sobrenadante recuperado y mezclar concienzudamente sacudiendo en el nutador durante 3 minutos.

15 (5) Sedimentar el ARN/ADN mediante centrifugación a 4ºC durante 10 minutos a 14.000 x g en una microcentrífuga eppendorf.

(6)

Eliminar todo el isopropanol con una pipeta, teniendo cuidado de no desplazar el sedimento.

Eliminación de ADN contaminante de preparaciones de ARN

(1)

Añadir 45 μl de 1X tampón de ADNasa I (Tris-Cl 10 mM, pH 7,5, MgCl2 2,5 mM, CaCl2 0,1 mM) y 5 μl de ADNasa I libre de ARNasa (2 U/μl, Ambion) a cada muestra.

25 (2) Incubar las muestras a 37ºC durante 60 minutos.

Inactivar la ADNasa I calentando a 70ºC durante 5 minutos.

B. Resultados

Las pruebas experimentales demuestran que el protocolo de extracción de ARN en caliente de la invención no compromete el rendimiento de ARN. Usando 19 muestras de cáncer de mama FPE, extrayendo ARN de tres secciones adyacentes en las mismas muestras, se midieron los rendimientos de ARN mediante electroforesis capilar con detección de fluorescencia (bioanalizador Agilent). Los rendimientos de ARN promedio en nanogramos y las

35 desviaciones estándar con los métodos inventado y comercial, respectivamente, fueron: 139+/-21 frente a 141+/-34.

Además, se encontró que el tampón de lisis EPICENTRE® T&C puede sustituirse por el tampón de lisis que contiene urea de la presente invención, y la disolución de precipitación de proteínas EPICENTRE® MPC puede sustituirse por el reactivo NH4OAc 7,5 M usado para la precipitación de proteínas según la presente invención sin ningún compromiso significativo del rendimiento de ARN ni la eficacia de TaqMan®.

Ejemplo 2

Amplificación de especies de ARNm antes de la RT-PCR

45 Se usó el método descrito en la sección 10 anterior con ARN aislado a partir de tejido de cáncer de mama incrustado en parafina, fijado. Se realizaron análisis de TaqMan® con ADNc de la primera cadena generado con el cebador T7-GSP ((T7-GSPr) no amplificado), ARN amplificado de T7 ((T7-GSPr) amplificado). Se amplificó el ARN según la etapa 2 de la figura 4. Como control, se realizó también TaqMan® con ADNc generado con un GSPr no modificado ((GSPr) amplificado). Se usó una cantidad equivalente de molde inicial (1 ng/pocillo) en cada reacción de TaqMan®.

Los resultados se muestran en la figura 8. La transcripción in vitro aumentó la intensidad de la señal de RT-PCR en más de 10 veces, y para ciertos genes en más de 100 veces en relación con controles en los que los cebadores de RT-PCR eran los mismos cebadores usados en el método 2 para la generación de ADN bicatenario para la

55 transcripción in vitro (GSP-T7r y GSPf). También se muestran en la figura 8 datos de RT-PCR generados cuando se usaron cebadores de RT-PCR optimizados convencionales (es decir, que carecen de colas de T7). Tal como se muestra, en comparación con este control, el nuevo método produjo aumentos sustanciales en la señal de RT-PCR (de desde 4 hasta 64 veces en este experimento).

El nuevo método requiere que cada secuencia de T7-GSP se optimice de modo que el aumento en la señal de RT-PCR sea el mismo para cada gen, en relación con la RT-PCR optimizada convencional (con cebadores sin cola de T7).

Ejemplo 3

65 Un estudio de la expresión génica en tumores de mama premalignos y malignos

Se diseñó un estudio de la expresión génica y se realizó con el objetivo primario de caracterizar molecularmente la expresión génica en muestras de tejido fijado, incrustado en parafina de carcinoma ductal de mama invasivo, y de explorar la correlación entre tales perfiles moleculares y la supervivencia libre de enfermedad. Un objetivo adicional

5 del estudio era comparar los perfiles moleculares en muestras de tejido de cáncer de mama invasivo con los perfiles moleculares obtenidos en carcinoma ductal in situ. El estudio se diseñó adicionalmente para obtener datos sobre los perfiles moleculares en carcinoma lobular in situ y en muestras de tejido fijado, incrustado en parafina de carcinoma lobular invasivo.

10 Se realizaron ensayos moleculares en tejidos de tumor mamario primario fijados con formalina, incrustados en parafina obtenidos de 202 pacientes individuales a los que se les diagnosticó cáncer de mama. Todos los pacientes se sometieron a cirugía con diagnóstico de carcinoma ductal invasivo de la mama, carcinoma ductal puro in situ (DCIS), carcinoma lobular de la mama o carcinoma lobular puro in situ (LCIS). Se incluyeron pacientes en el estudio sólo si la evaluación histopatológica, realizada tal como se describe en la sección de Materiales y métodos, indicaba

15 cantidades adecuadas de tejido tumoral y patología homogénea.

Los individuos que participaban en el estudio se dividieron en los siguientes grupos:

Grupo 1: Carcinoma ductal puro in situ (DCIS); n=18

20 Grupo 2: Carcinoma ductal invasivo n=130

Grupo 3: Carcinoma lobular puro in situ (LCIS); n=7

25 Grupo 4: Carcinoma lobular invasivo n=16

Materiales y métodos

Se caracterizó cada bloque de tumor representativo mediante histopatología convencional para determinar el

30 diagnóstico, la evaluación semicuantitativa de la cantidad de tumor y el grado del tumor. Se preparó un total de 6 secciones (10 micrómetros de grosor cada una) y se colocaron en dos tubos de microcentrífuga de marca Costar (polipropileno, tubos de 1,7 ml, transparentes, 3 secciones en cada tubo). Si el tumor constituía menos del 30% del área de muestra total, el patólogo puede haber diseccionado de manera rudimentaria el tejido tumoral, usando microdisección macroscópica, poniendo el tejido tumoral directamente en el tubo Costar.

35 Si se obtuvo más de un bloque de tumor como parte del procedimiento quirúrgico, se sometieron todos los bloques de tumor a la misma caracterización, tal como se describió anteriormente, y se usó para el análisis el bloque más representativo de la patología.

40 Análisis de la expresión génica

Se extrajo el ARNm y se purificó a partir de muestras de tejido incrustado en parafina, fijado y se preparó para el análisis de la expresión génica tal como se describe en los capítulos 7-11 anteriores.

45 Se realizaron ensayos moleculares de expresión génica cuantitativa mediante RT-PCR, usando el ABI PRISM 7900™ Sequence Detection System™ (Perkin-Elmer-Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.). ABI PRISM 7900™ consiste en un termociclador, un láser, un dispositivo de carga acoplada (CCD), una cámara y un ordenador. El sistema amplifica muestras en un formato de 384 pocillos en un termociclador. Durante la amplificación, se recoge la señal fluorescente inducida por láser en tiempo real a través de cables de fibra óptica para todos los 384 pocillos,

50 y se detecta en el CCD. El sistema incluye software para manejar el instrumento y para analizar los datos.

Análisis y resultados

Se analizó tejido tumoral para 185 genes relacionados con cáncer y 7 genes de referencia. Se normalizaron los

55 valores de ciclo umbral (CT) para cada paciente basándose en la mediana de todos los genes para ese paciente particular. Estaban disponibles datos de desenlace clínico para todos los pacientes de una revisión de datos de registro y diagramas de pacientes seleccionados.

Los desenlaces se clasificaron como:

60 0 muertos debido a cáncer de mama o a causa desconocida o vivos con recidiva de cáncer de mama;

1 vivos sin recidiva de cáncer de mama o muertos debido a una causa distinta de cáncer de mama.

65 El análisis se realizó mediante:

1.

Análisis de la relación entre la expresión génica normalizada y los desenlaces binarios de 0 ó 1.

2.

Análisis de la relación entre la expresión génica normalizada y el tiempo hasta el desenlace (0 ó 1 tal como se definió anteriormente) en el que se censuraron los pacientes que estaban vivos sin recidiva de cáncer de mama o

5 que murieron debido a una causa distinta a cáncer de mama. Se usó este enfoque para evaluar el impacto de pronóstico de genes individuales y también conjuntos de múltiples genes.

Análisis de 147 pacientes con carcinoma de mama invasivo mediante el enfoque binario

10 En el primer enfoque (binario), se realizó el análisis en todos los 146 pacientes con carcinoma de mama invasivo. Se realizó una prueba de la t en el grupo de pacientes clasificados como 0 ó 1 y se calcularon los valores de p para las diferencias entre los grupos para cada gen.

La siguiente tabla 4 enumera los 45 genes para los que el valor de p para las diferencias entre los grupos era <0,05. 15 Tabla 4

Gen/SEQ ID NO:

CT medio vivos CT medio muertos Valor de t Grados de libertad p

FOXM1

33,66 32,52 3,92 144 0,0001

PRAME

35,45 33,84 3,71 144 0,0003

Bcl2

28,52 29,32 -3,53 144 0,0006

STK15

30,82 30,10 3,49 144 0,0006

CEGP1

29,12 30,86 -3,39 144 0,0009

Ki-67

30,57 29,62 3,34 144 0,0011

GSTM1

30,62 31,63 -3,27 144 0,0014

CA9

34,96 33,54 3,18 144 0,0018

PR

29,56 31,22 -3,16 144 0,0019

BBC3

31,54 32,10 -3,10 144 0,0023

NME1

27,31 26,68 3,04 144 0,0028

SURV

31,64 30,68 2,92 144 0,0041

GATA3

26,06 26,99 -2,91 144 0,0042

TFRC

28,96 28,48 2,87 144 0,0047

YB-1

26,72 26,41 2,79 144 0,0060

DPYD

28,51 28,84 -2,67 144 0,0084

GSTM3

28,21 29,03 -2,63 144 0,0095

RPS6KB

31,18 30,61 2,61 144 0,0099

Src

27,97 27,69 2,59 144 0,0105

Chk1

32,63 31,99 2,57 144 0,0113

ID1

28,73 29,13 -2,48 144 0,0141

EstR1

24,22 25,40 -2,44 144 0,0160

p27

27,15 27,51 -2,41 144 0,0174

CCNB1

31,63 30,87 2,40 144 0,0176

XIAP

30,27 30,51 -2,40 144 0,0178

Chk2

31,48 31,11 2,39 144 0,0179

CDC25B

29,75 29,39 2,37 144 0,0193

IGF1R

28,85 29,44 -2,34 144 0,0209

AK055699

33,23 34,11 -2,28 144 0,0242

PI3KC2A

31,07 31,42 -2,25 144 0,0257

TGFB3

28,42 28,85 -2,25 144 0,0258

BAGI1

28,40 28,75 -2,24 144 0,0269

CYP3A4

35,70 35,32 2,17 144 0,0317

EpCAM

28,73 28,34 2,16 144 0,0321

VEGFC

32,28 31,82 2,16 144 0,0326

pS2

28,96 30,60 -2,14 144 0,0341

hENT1

27,19 26,91 2,12 144 0,0357

WISP1

31,20 31,64 -2,10 144 0,0377

HNF3A

27,89 28,64 -2,09 144 0,0384

NFKBp65

33,22 33,80 -2,08 144 0,0396

BRCA2

33,06 32,62 2,08 144 0,0397

EGFR

30,68 30,13 2,06 144 0,0414

TK1

32,27 31,72 2,02 144 0,0453

VDR

30,08 29,73 1,99 144 0,0488

En la tabla 4 anterior, los valores de t inferiores (negativos) indican expresión superior (o CT inferiores), asociada con mejores desenlaces y, a la inversa, valores de t superiores (positivos) indican expresión superior (CT inferiores) asociada con peores desenlaces. Por tanto, por ejemplo, la expresión elevada del gen FOXM1 (valor de t = 3,92, CT

5 medio vivos > CT medio muertos) indica una probabilidad reducida de supervivencia libre de enfermedad. De manera similar, la expresión elevada del gen CEGP 1 (valor de t = -3,39; CT medio vivos < CT medio muertos) indica un aumento de la probabilidad de supervivencia libre de enfermedad.

Basándose en los datos expuestos en la tabla 4, la sobreexpresión de cualquiera de los siguientes genes en cáncer

10 de mama indica una probabilidad reducida de supervivencia sin recidiva del cáncer tras la cirugía: FOXM1; PRAME; SKT15, Ki-67; CA9; NME1; SURV; TFRC; YB-1; RPS6KB1; Src; Chk1; CCNB1; Chk2; CDC25B; CYP3A4; EpCAM; VEGFC; hENT1; BRCA2; EGFR; TK1; VDR.

Basándose en los datos expuestos en la tabla 4, la sobreexpresión de cualquiera de los siguientes genes en cáncer

15 de mama indica un mejor pronóstico para la supervivencia sin recidiva del cáncer tras la cirugía: Blc12; CEGP1; GSTM1; PR; BBC3; GATA3; DPYD; GSTM3; ID1; EstR1; p27; XIAP; IGF1R; AK055699; P13KC2A; TGFB3; BAGI1; pS2; WISP1; HNF3A; NFKBp65.

Análisis de 108 pacientes positivos para RE mediante el enfoque binario

20 Se sometieron 108 pacientes con CT normalizado para el receptor de estrógenos (RE) < 25,2 (es decir, pacientes positivos para RE) a análisis separado. Se realizó una prueba de la t sobre los grupos de pacientes clasificados como 0 ó 1 y se calcularon los valores de p para las diferencias entre los grupos para cada gen. La siguiente tabla 5 enumera los 12 genes en el que el valor de p para las diferencias entre los grupos era <0,05.

25 Tabla 5

Gen/SEQ ID NO:

CT medio vivos CT medio muertos Valor de t Grados de libertad p

PRAME

35,54 33,88 3,03 106 0,0031

Bcl2

28,24 28,87 -2,70 106 0,0082

FOXM1

33,82 32,85 2,66 106 0,089

DIABLO

30,33 30,71 -2,47 106 0,0153

EPHX1

28,62 28,03 2,44 106 0,0163

HIF1A

29,37 28,88 2,40 106 0,0180

VEGFC

32,39 31,69 2,39 106 0,0187

Ki-67

30,73 29,82 2,38 106 0,0191

IGF1R

28,60 29,18 -2,37 106 0,0194

VDR

30,14 29,60 2,17 106 0,0322

NME1

27,34 26,80 2,03 106 0,0452

GSTM3

28,08 28,92 -2,00 106 0,0485

Para cada gen, se utilizó un algoritmo de clasificación para identificar el mejor valor umbral (CT) para usar cada gen solo en la predicción del desenlace clínico.

5 Basándose en los datos expuestos en la tabla 5, la sobreexpresión de los siguientes genes en cáncer positivo para RE es indicativa de una probabilidad reducida de supervivencia sin recidiva del cáncer tras la cirugía: PRAME; FOXM1; EPHX1; HIF1A; VEGFC; Ki-67; VDR; NME1. Algunos de estos genes (PRAME; FOXM1; VEGFC; Ki-67; VDR; y NME1) se identificaron también como indicadores de mal pronóstico en los análisis anteriores, no limitados a cáncer de mama positivo para RE. La sobreexpresión de los genes restantes (EPHX1 y HIF1A) parece ser un

10 indicador negativo de la supervivencia libre de enfermedad en cáncer de mama positivo para RE solo. Basándose en los datos expuestos en la tabla 5, la sobreexpresión de los siguientes genes en cáncer positivo para RE es indicativa de un mejor pronóstico para la supervivencia sin recidiva del cáncer tras la cirugía: Bcl-2; DIABLO; IGF1R; GSTM3. De estos últimos genes, Bcl-2; IGFR1; y GSTM3 también se han identificado como indicadores de buen pronóstico en el análisis anterior, no limitado a cáncer de mama positivo para RE. La sobreexpresión de DIABLO parece ser un

15 indicador positivo de la supervivencia libre de enfermedad en cáncer de mama positivo para RE solo.

Análisis de múltiples genes e indicadores de desenlace

Se adoptaron dos enfoques con el fin de determinar si el uso de múltiples genes podría proporcionar una mejor 20 discriminación entre desenlaces.

En primer lugar, se realizó un análisis de discriminación usando un enfoque gradual directo. Se generaron modelos que clasificaban el desenlace con mayor discriminación que la obtenida con cualquier gen individual solo.

25 Según un segundo enfoque (enfoque de tiempo hasta evento), se definió para cada gen un modelo de riesgos proporcionales de Cox (véase, por ejemplo Cox, D. R., y Oakes, D. (1984), Analysis of Survival Data, Chapman and Hall, Londres, Nueva York) con el tiempo hasta la recidiva o la muerte como variable dependiente, y el nivel de expresión del gen como variable independiente. Se identificaron los genes que tienen un valor de p < 0,05 en el modelo de Cox. Para cada gen, el modelo de Cox proporciona el riesgo relativo (RR) de recidiva o muerte para un

30 cambio unitario en la expresión del gen. Puede elegirse repartir los pacientes en subgrupos a cualquier valor umbral de la expresión medida (en la escala de CT), cuando todos los pacientes con valores de expresión por encima del umbral tienen riesgo superior, y todos los pacientes con valores de expresión por debajo del umbral tienen riesgo inferior, o viceversa, dependiendo de si el gen es un indicador de buen (RR>1,01) o mal (RR<1,01) pronóstico. Por tanto, cualquier valor umbral definirá subgrupos de pacientes con respectivamente aumento o disminución del

35 riesgo. Los resultados se resumen en las siguientes tablas 6 y 7.

Tabla 6

Resultados del modelo de Cox para 146 pacientes con cáncer de mama invasivo 40

Gen

Riesgo relativo (RR) Riesgo relativo SE Valor de p

FOXM1

0,58 0,15 0,0002

STK15

0,51 0,20 0,0006

PRAME

0,78 0,07 0,0007

Bcl2

1,66 0,15 0,0009

CEGP1

1,25 0,07 0,0014

GSTM1

1,40 0,11 0,0014

Ki67

0,62 0,15 0,0016

PR

1,23 0,07 0,0017

Contig51037

0,81 0,07 0,0022

NME1

0,64 0,15 0,0023

YB-1

0,39 0,32 0,0033

TFRC

0,53 0,21 0,0035

BBC3

1,72 0,19 0,0036

GATA3

1,32 0,10 0,0039

CA9

0,81 0,07 0,0049

SURV

0,69 0,13 0,0049

DPYD

2,58 0,34 0,0052

RPS6KB1

0,60 0,18 0,0055

GSTM3

1,36 0,12 0,0078

Src.2

0,39 0,36 0,0094

TGFB3

1,61 0,19 0,0109

CDC25B

0,54 0,25 0,0122

XIAP

3,20 0,47 0,0126

CCNB1

0,68 0,16 0,0151

IGF1R

1,42 0,15 0,0153

Chk1

0,68 0,16 0,0155

ID1

1,80 0,25 0,0164

p27

1,69 0,22 0,0168

Chk2

0,52 0,27 0,0175

EstR1

1,17 0,07 0,0196

HNF3A

1,21 0,08 0,206

pS2

1,12 0,05 0,0230

BAGI1

1,88 0,29 0,0266

AK055699

1,24 0,10 0,0276

pENT1

0,51 0,31 0,0293

EpCAM

0,62 0,22 0,0310

WISP1

1,39 0,16 0,0338

VEGFC

0,62 0,23 0,0364

TK1

0,73 0,15 0,0382

NFKBp65

1,32 0,14 0,0384

BRCA2

0,66 0,20 0,0404

CYP3A4

0,60 0,25 0,0417

EGFR

0,72 0,16 0,0436

Tabla 7

Resultados del modelo de Cox para 108 pacientes con cáncer de mama invasivo RE+

Gen

Riesgo relativo (RR) Riesgo relativo SE Valor de p

PRAME

0,75 0,10 0,0045

Contig51037

0,75 0,11 0,0060

Blc2

2,11 0,28 0,0075

HIF1A

0,42 0,34 0,0117

IGF1R

1,92 0,26 0,0117

FOXM1

0,54 0,24 0,0119

EPHX1

0,43 0,33 0,0120

Ki67

0,60 0,21 0,0160

CDC25B

0,41 0,38 0,0200

VEGFC

0,45 0,37 0,0288

CTSB

0,32 0,53 0,0328

DIABLO

2,91 0,50 0,0328

p27

1,83 0,28 0,0341

CDH1

0,57 0,27 0,0352

IGFBP3

0,45 0,40 0,0499

5 Los análisis binario y de tiempo hasta evento, con pocas excepciones, identificaron los mismos genes como marcadores de pronóstico. Por ejemplo, la comparación de las tablas 4 y 6 muestran que, con la excepción de un único gen, los dos análisis generaron la misma lista de 15 marcadores principales (tal como se define por los valores de p más bajos). Además, cuando ambos análisis identificaban el mismo gen, concordaban con respecto a la dirección (signo positivo o negativo) de la correlación con la supervivencia/recidiva. Globalmente, estos resultados

10 refuerzan la conclusión de que los marcadores identificados tienen un valor de pronóstico significativo.

Para modelos de Cox que comprenden más de dos genes (modelos multivariantes), se realiza una entrada gradual de cada gen individual en el modelo, cuando el primer gen introducido se preselecciona de entre los genes que tienen valores de p univariantes significativos, y el gen seleccionado para la entrada en el modelo en cada etapa

15 posterior es el gen que mejora más el ajuste del modelo a los datos. Este análisis puede realizarse con cualquier número total de genes. En el análisis cuyos resultados se muestran a continuación, se realiza la entrada gradual para hasta 10 genes.

El análisis multivariante se realiza usando la siguiente ecuación:

20 RR = exp[coef(gen A) x Ct(gen A) + coef(gen B) x Ct(gen B) + coef(gen C) x Ct(gen C) + ...]

En esta ecuación, los coeficientes para genes que son factores pronóstico de desenlace beneficioso son números positivos y los coeficientes para genes que son factores pronóstico de desenlace desfavorable son números 25 negativos. Los valores de “Ct” en la ecuación son ΔCt, es decir, reflejan la diferencia entre el valor de Ct normalizado promedio para una población y el Ct normalizado medido para el paciente en cuestión. La convención usada en el presente análisis ha sido que ΔCt inferiores y superiores al promedio de la población tienen signos positivos y negativos, respectivamente (reflejando una mayor o menor abundancia de ARNm). El riesgo relativo (RR) calculado al resolver esta ecuación indicará si el paciente tiene un aumento o una reducción de las posibilidades de

30 supervivencia a largo plazo sin recidiva del cáncer.

Análisis génico multivariante de 147 pacientes con carcinoma de mama invasivo

(a) Se realizó un análisis gradual multivariante, usando el modelo de riesgos proporcionales de Cox, sobre los datos

35 de expresión génica obtenidos para los 147 pacientes con carcinoma de mama invasivo. Se excluyeron los genes CEGP1, FOXM1, STK15 y PRAME de este análisis. Se ha identificado mediante este análisis que los siguientes conjuntos de diez genes tienen un valor predictivo particularmente fuerte de la supervivencia de los pacientes sin recidiva del cáncer tras la extirpación quirúrgica del tumor primario.

1. Bc12, ciclinaG1, NFKBp65, NME1, EPHX1, TOP2B, DR5, TERC, Src, DIABLO;

2. Ki67, XIAP, hENT1, TS, CD9, p27, ciclinaG1, pS2, NFKBp65, CYP3A4; 5

3.

GSTM1, XIAP, Ki67, TS, ciclinaG1, p27, CYP3A4, pS2, NFKBp65, ErbB3;

4.

PR, NME1, XIAP, upa, ciclinaG1, Contig51037, TERC, EPHX1, ALDH1A3, CTSL;

10 5. CA9, NME1, TERC, ciclinaG1, EPHX1, DPYD, Src, TOP2B, NFKBp65, VEGFC;

6. TFRC, XIAP, Ki67, TS, ciclinaG1, p27, CYP3A4, pS2, ErbB3, NFKBp65.

(b) Se realizó un análisis gradual multivariante, usando el modelo de riesgos proporcionales de Cox, sobre los datos

15 de expresión génica obtenidos para los 147 pacientes con carcinoma de mama invasivo, usando un conjunto de interrogación que incluía un número reducido de genes. Se ha identificado mediante este análisis que los siguientes conjuntos de diez genes tienen un valor predictivo particularmente fuerte de la supervivencia de los pacientes sin recidiva del cáncer tras la extirpación quirúrgica del tumor primario.

20 1. Bc12, PRAME, ciclinaG1, FOXM1, NFKBp65, TS, XIAP, Ki67, CYP3A4, p27;

2. FOXM1, ciclinaG1, XIAP, Contig51037, PRAME, TS, Ki67, PDGFRa, p27, NFKBp65;

3. PRAME, FOXM1, ciclinaG1, XIAP, Contig51037, TS, Ki6, PDGFRa, p27, NFKBp65; 25

4.

Ki67, XIAP, PRAME, HENTI, contig51037, TS, CD9, p27, ErbB3, ciclinaG1;

5.

STK15, XIAP, PRAME, PLAUR, p27, CTSL, CD18, PREP, p53, RPS6KB1;

30 6. GSTM1, XIAP, PRAME, p27, Contig51037, ErbB3, GSTp, EREG, IDI, PLAUR;

7. PR, PRAME, NME1, XIAP, PLAUR, ciclinaG1, Contig51037, TERC, EPHX1, DR5;

8. CA9, FOXM1, ciclinaG1, XIAP, TS, Ki67, NFKBp65, CYP3A4, GSTM3, p27; 35

9.

TFRC, XIAP, PRAME, p27, Contig51037, ErbB3, DPYD, TERC, NME1, VEGFC;

10.

CEGP1, PRAME, hENT1, XIAP, Contig51037, ErbB3, DPYD, NFKBp65, ID1, TS.

40 Análisis multivariante de pacientes con carcinoma de mama invasivo positivo para RE

Se realizó un análisis gradual multivariante, usando el modelo de riesgos proporcionales de Cox, sobre los datos de expresión génica obtenidos para pacientes con carcinoma de mama invasivo positivo para RE. Se ha identificado mediante este análisis que los siguientes conjuntos de diez genes tienen un valor predictivo particularmente fuerte

45 de la supervivencia de los pacientes sin recidiva del cáncer tras la extirpación quirúrgica del tumor primario.

1. PRAME, p27, IGFBP2, HIF1A, TIMP2, ILT2, CYP3A4, ID1, EstR1, DIABLO;

2. Contig51037, EPHX1, Ki67, TIMP2, ciclinaG1, DPYD, CYP3A4, TP, AIB1, CYP2C8; 50

3.

Bc12, hENT1, FOXM1, Contig51037, ciclinaG1, Contig46653, PTEN, CYP3A4, TIMP2, AREG;

4.

HIF1A, PRAME, p27, IGFBP2, TIMP2, ILT2, CYP3A4, ID1, EstR1, DIABLO;

55 5. IGF1R, PRAME, EPHX1, Contig51037, ciclinaG1, Bc12, NME1, PTEN, TBP, TIMP2;

6. FOXM1, Contig51037, VEGFC, TBP, HIF1A, DPYD, RAD51C, DCR3, ciclinaG1, BAG1;

7.

EPHX1, Contig51037, Ki67, TIMP2, ciclinaG1, DPYD, CYP3A4, TP, AIB1, CYP2C8; 60

8. Ki67, VEGFC, VDR, GSTM3, p27, upa, ITGA7, rhoC, TERC, Pin1;

9.

CDC25B, Contig51037, hENT1, Bc12, HLAG, TERC, NME1, upa, ID1, CYP; 65 10. VEGFC, Ki67, VDR, GSTM3, p27, upa, ITGA7, rhoC, TERC, Pin1;

11.

CTSB, PRAME, p27, IGFBP2, EPHX1, CTSL, BAD, DR5, DCR3, XIAP;

12.

DIABLO, Ki67, hENT1, TIMP2, ID1, p27, KRT19, IGFBP2, TS, PDGFB;

5 13. p27, PRAME, IGFBP2, HIF1A, TIMP2, ILT2, CYP3A4, ID1, EstR1, DIABLO;

14. CDH1; PRAME, VEGFC; HIF1A; DPYD, TIMP2, CYP3A4, EstR1, RBP4, p27;

15.

IGFBP3, PRAME, p27, Bcl2, XIAP, EstR1, Ki67, TS, Src, VEGF; 10

16. GSTM3, PRAME, p27, IGFBP3, XIAP, FGF2, hENT1, PTEN, EstR1, APC;

17.

hENT1, Bcl2, FOXM1, Contig51037, CiclinaG1, Contig46653, PTEN, CYP3A4, TIMP2, AREG; 15 18. STK15, VEGFC, PRAME, p27, GCLC, hENT1, ID1, TIMP2, EstR1, MCP1;

19. NME1, PRAM, p27, IGFBP3, XIAP, PTEN, hENT1, Bcl2, CYP3A4, HLAG;

20.

VDR, Bcl2, p27, hENT1, p53, PI3KC2A, EIF4E, TFRC, MCM3, ID1; 20

21. EIF4E, Contig51037, EPHX1, ciclinaG1, Bcl2, DR5, TBP, PTEN, NME1, HER2;

22.

CCNB1, PRAME, VEGFC, HIF1A, hENT1, GCLC, TIMP2, ID1, p27, upa; 25 23. ID1, PRAME, DIABLO, hENT1, p27, PDGFRa, NME1, BIN1, BRCA1, TP;

24. FBXO5, PRAME, IGFBP3, p27, GSTM3, hENT1, XIAP, FGF2, TS, PTEN;

25. GUS, HIA1A, VEGFC, GSTM3, DPYD, hENT1, FBXO5, CA9, CYP, KRT18; 30

26. Bclx, Bcl2, hENT1, Contig51037, HLAG, CD9, ID1, BRCA1, BIN1, HBEGF.

Es de notar que muchos de los conjuntos de genes anteriores incluyen genes que solos no tenían suficiente valor predictivo para calificar como marcadores de pronóstico bajo los estándares tratados anteriormente, pero en 35 combinación con otros genes, su presencia proporciona información valiosa sobre la probabilidad de supervivencia del paciente a largo plazo sin recidiva del cáncer.

TABLA 1

1.

ADD3 42. c-myc 77. Gamma-GCS 115. KDR 156. Pin1 (aducina 3 (glutamil cisteína gamma)* sintetasa)

2.

AKT1/Proteína 43. cN-1 78. GATA3^ 116. Ki-67/MIB1 157. PKC-ε cinasa B

3.

AKT 2 44. criptocromo1* 79. Geranil geranil 117. Lipoproteína 158. Pkc-δ pirofosfato sintetasa lipasa^

4.

AKT 3 45. c-Src 80. G-CSF 118. LIV1 159. PLAG1 (adenoma pleiomórfico 1)*

5.

Aldehído 46. Ciclina D1 81. GPC3 119. Proteína de 160. PREP prolil deshidrogenasa resistencia endopeptidasa*PEP 1A1 pulmonar/MVP

6. Aldehído

47. CYP1B1 82. gravina* [AK 120. Lot1 161. Receptor de

deshidrogenasa

AP258] progesterona

1A3

7. Anfirregulina

48. CYP2C9* 83. Oncogén GRO1 121. Maspin 162. pS2/factor trébol

alfa^

1

8. APC

49. Citoqueratina 5^ 84. Grb7^ 122. MCM2 163. PTEN

9. ARG

50. Citoqueratina 17^ 85. GST-alfa 123. MCM3 164. PTP1b

10. ATM

51. Citoqueratina 18^ 86. GST-pi^ 124. MCM7 165. RAR-alfa

11. Bak

52. DAP-Cinasa-1 87. Ha-Ras 125. MCP-1 166. RAR-beta2

12. Bax

53. DHFR 88. HB-EGF 126. Proteína 4 167. RCP

asociada a

microtúbulos

13. Bcl2

54. DIABLO 89. HE4- Homólogo 127. MCI 168. Portador de folato

de inhibidor de

reducido

14. Bcl-xl 15. BRK 16. BCRP 17. BRCA-1 18. BRCA-2 19. Caspasa-3

55. Dihidropirimidina deshidrogenasa 56. EGF 57. ECadherina / CDH1^ 58. ELF.3* 59. Endotelina 60. Epirregulina

20. Catepsina B

61. ER-alfa^

21. Catepsina G

62. ErbB-1

22. Catepsina L

63. ErbR-2^

23. CD3

64. ErbB-3

24. CD9

65. ErbB-4

25. CD18

66. ER-Beta

26. CD31 27. CD44^ 28. CD68 29. CD82/KAI-1 30. Cdc25A 31. Cdc25B 32. CGA

67. Factor de iniciación de la traducción eucariota 4B*(EIF4B) 68. EIF4E 69. Farnesil pirofosfato sintetasa 70. FAS (CD95) 71. FasL 72. FGFR1* 73. FGF2 [bFGF]

33. COX2 34. CSF-1 35. CSF-1R/fms 36. cIAP1 37. cIAP2 38. c-abl

74. 53BP1 75. 53BP2 76. GALC (galactosilceramidasa)*

39. c-kit 40. c-kit L

41. c-met

Gen N.º de registro

ABCB1 NM_000927 ABCC1 NM_004996 ABCC2 NM_000392 ABCC3 NM_003786 ABCC4 NM_005845 ABL1 NM_005157 ABL2 NM_005158 ACTB NM_001101

proteinasa extracelular*

90.

Factor nuclear de hepatocitos 3^

91.

HER-2

92.

HGF/Factor de dispersión

93.

hIAP1

94.

hIAP2

95.

HIF-1

96.

Calicreína humana 10

97.

MLH1

98.

hsp 27

99.

Gonadotropina coriónica humana/CGA

100.

Proteína extracelular humana S1-5

101.

Id-1

102.

ld-2

103.

Id-3

104.

IGF-1

105.

IGF2

106.

IGF1R

107.

IGFBP3

108.

Integrina intersticial alfa 7

109.

IL6

110.

IL8

111.

IRF-2*

112.

Proteína IRF9

113.

Calicreína 5

114.

Calicreína 6

TABLA 2

Cebador directo SEQ ID NO. 1 4 7 10 13 16 19 22

128. mdm2

169. Proteína de unión

a retinol 4^

129. MDR-1

170. STK15/BTAK

130. Epóxido

171. Survivina

hidrolasa microsomal

131. MMP9

172. SXR

132. MRP1

173. Syk

133. MRP2

174. TGD (timina-ADN

glicosilasa)*

134. MRP3

175. TGFalfa

135. MRP4

176. Timidina cinasa

136. MSN (Moesina)*

177. Timidina

fosforilasa

137. mTOR.

178. Timidilato sintasa

138. Muc1/CA 15-3

179. Topoisomerasa II

α

139. NF-kB

180. Topoisomerasa II

β

140. P14ARF

181. TRAMP

182. UPA

183. VEGF

141. P16INK4a/p14

184. Vimentina

142. p21wAF1/CIP1

185. WTH3

186. XAF1

143. p23

187. XIAT

144. p27

188. XIST

145. p311*

189. XPA

146. p53

190. YB-1

147. PAI1

148. PCNA

* Sensibilidad farm.

149. PDGF-A

NCI 60/Marcador de

resistencia

150. PDGF-B

151. PDGF-C

^ Subclase de tumor

152. PDGF-D

de definición en

agrupamiento

153. PDGPR-α

154. PDGFR-β

19/1/02

155. PI3K

Cebador inverso Amplicón SEQ ID NO. SEQ ID NO. 2 3 5 6 8 9 11 12 14 15 17 18 20 21 23 24

AKT1 NM_005163 25 26 27 AKT3 NM_005465 28 29 30 ALDH1 NM_000689 31 32 33 ALDH1A3 NM_000693 34 35 36 APC NM_000038 37 38 39 AREG NM_001657 40 41 42 B2M NM_004048 43 44 45 BAK1 NM_001188 46 47 48 BAX NM_004324 49 50 51 BCL2 NM_000633 52 53 54 BCL2L1 NM_001191 55 56 57 BIRC3 NM_001165 58 59 60 BIRC4 NM_001167 61 62 63 BIRC5 NM_001168 64 65 66 BRCA1 NM_007295 67 68 69 BRCA2 NM_000059 70 71 72 CCND1 NM_001758 73 74 75 CD3Z NM_000734 76 77 78 CD68 NM_001251 79 80 81 CDC25A NM_001789 82 83 84 CDH1 NM_004360 85 86 87 CDKN1A NM_000389 88 89 90 CDKN1B NM_004064 91 92 93 CDKN2A NM_000077 94 95 96 CYP1B1 NM_000104 97 98 99 DHFR NM_000791 100 101 102 DPYD NM_000110 103 104 105 ECGF1 NM_001953 106 107 108 EGFR NM_005228 109 110 111 EIF4E NM_001968 112 113 114 ERBB2 NM_004448 115 116 117 ERBB3 NM_001982 118 119 120 ESR1 NM_000125 121 122 123 ESR2 NM_001437 124 125 126 GAPD NM_002046 127 128 129 GATA3 NM_002051 130 131 132 GRB7 NM_005310 133 134 135 GRO1 NM_001511 136 137 138 GSTP1 NM_000852 139 140 141 GUSB NM_000181 142 143 144 hHGF M29145 145 146 147 HNF3A NM_004496 148 149 150 ID2 NM_002166 151 152 153 IGF1 NM_000618 154 155 156 IGFBP3 NM_000598 157 158 159 ITGA7 NM_002206 160 161 162 ITGB2 NM_000211 163 164 165 KDR NM_002253 166 167 168 KIT NM_000222 169 170 171 KITLG NM_000899 172 173 174 KRT17 NM_000422 175 176 177 KRT5 NM_000424 178 179 180

LPL NM_000237 181 182 183 MET NM_000245 184 185 186 MKI67 NM_002417 187 188 189 MVP NM_017458 190 191 192 MYC NM_002467 193 194 195 PDGFA NM_002607 196 197 198 PDGFB NM_002608 199 200 201 PDGFC NM_016205 202 203 204 PDGFRA NM_006206 205 206 207 PDGFRB NM_002609 208 209 210 PGK1 NM_000291 211 212 213 PGR NM_000926 214 215 216 PIN1 NM_006221 217 218 219 PLAU NM_002658 220 221 222 PPIH NM_006347 223 224 225 PTEN NM_000314 226 227 228 PTGS2 NM_000963 229 230 231 RBP4 NM_006744 232 233 234 RELA NM_021975 235 236 237 RPL19 NM_000981 238 239 240 RPLPO NM_001002 241 242 243 SCDGF-B NM_025208 244 245 246 SERPINE1 NM_000602 247 248 249 SLC19A1 NM_003056 250 251 252 TBP NM_003194 253 254 255 TFF1 NM_003225 256 257 258 TFRC NM_003234 259 260 261 TK1 NM_003258 262 263 264 TNFRSF6 NM_000043 265 266 267 TNFSF6 NM_000639 268 269 270 TOP2A NM_001067 271 272 273 TOP2B NM_001068 274 275 276 TP53 NM_000546 277 278 279 TYMS NM_001071 280 281 282 VEGF NM_003376 283 284 285

TABLA 3

GEN

N.º DE REGISTRO SEQ ID NO:

AK055699

AK055699

286

BAG1

NM_004323 287

BBC3

NM_014417 288

Bcl2

NM_000633 289

BRCA2

NM_000059 290

CA9

NM_001216 291

CCNB1

NM_031966 292

CDC25B

NM_021874 293

CEGP1

NM_020974 294

Chk1

NM_001274 295

Chk2

NM_007194 296

CYP3A4

NM_017460 297

DIABLO

NM_019887 298

DPYD

NM_000110 299

EGFR

NM_005228 300

EpCAM

NM_002354 301

EPHX1

NM_000120 302

EstR1

NM_000125 303

FOXM1

NM_021953 304

GATA3

NM_002051 305

GSTM1

NM_000561 306

GSTM3

NM_000849 307

hENT1

NM_004955 308

HIF1A

NM_001530 309

HNF3A

NM_004496 310

ID1

NM_002165 311

IGF1R

NM_000875 312

Ki-67

NM_002417 313

NFKBp65

NM_021975 314

NME1

NM_000269 315

p27

NM_004064 316

P13KC2A

NM_002645 317

PR

NM_000926 318

PRAME

NM_006115 319

pS2

NM_003225 320

RPS6KB1

NM_003161 321

Src

NM_004383 322

STK15

NM_003600 323

SURV

NM_001168 324

TFRC

NM_003234 325

TGFB3

NM_003239 326

TK1

NM_003258 327

VDR

NM_000376 328

VEGFC

NM_005429 329

WISP1

NM_003882 330

XIAP

NM_001167 331

YB-1

NM_004559 332

ITGA7

NM_002206 333

PDGFB

NM_002608 334

Upa

NM_002658 335

TBP

NM_003194 336

PDGFRa

NM_006206 337

Pin1

NM_006221 338

CYP

NM_006347 339

RBP4

NM_006744 340

BRCA1

NM_007295 341

APC

NM_000038 342

GUS

NM_000161 343

CD18

NM_000211 344

PTEN

NM_000314 345

P53

NM_000546 346

ALDH1A3

NM_000693 347

GSTp

NM_000852 348

TOP2B

NM_001068 349

TS

NM_001071 350

Bclx

NM_001191 351

AREG

NM_001657 352

TP

NM_001953 353

EIF4E

NM_001968 354

ErbB3

NM_001982 355

EREG

NM_001432 356

GCLC

NM_001498 357

CD9

NM_001769 358

HB-EGF

NM_001945 359

IGFBP2

NM_000597 360

CTSL

NM_001912 361

PREP

NM_002726 362

CYP3A4

NM_017460 363

ILT-2

NM_006669 364

MCM3

NM_002388 365

KRT19

NM_002276 366

KRT18

NM_000224 367

TIMP2

NM_003255 368

BAD

NM_004322 369

CYP2C8

NM_030878 370

DCR3

NM_016434 371

PLAUR

NM_002859 372

PI3KC2A

NM_002645 373

FGF2

NM_002006 374

HLA-G

NM_002127 375

AIB1

NM_005534 376

MCP1

NM_002982 377

Contig46653

Contig46653

378

RhoC

NM_005167 379

DR5

NM_003842 380

RAD51C

NM_058216 381

BIN1

NM_004305 382

VDR

NM_000376 383

TERC

U86046 384

Lista de secuencias

<110> GENOMIC HEALTH

Baker, Joffre B. Cronin, Maureen T. Kiefer, Michael C. Shak, Steve Walker, Michael Graham 5

<120> OBTENCIÓN DE PERFIL DE EXPRESIÓN GÉNICA EN TEJIDOS TUMORALES BIOPSIADOS

<130> H64199PCEPT1

<140> por asignar

<141>

<150> US 60/412.049

<151> 15

<150> US 60/364.890

<151>

<160> 384

<170> FastSEQ para Windows versión 4.0

<210> 1

<211> 18 25 <212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 1

<210> 2

<211> 19

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 2

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<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 3

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<212> ADN

<213> Homo sapiens

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<213> Homo sapiens

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<212> ADN

<213> Homo sapiens

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<212> ADN

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<212> ADN

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15

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20

<400> 49

<213> Homo sapiens

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<212> ADN

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<212> ADN

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25

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<211> 20

<212> ADN

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30

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<212> ADN

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<210>

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<210>

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40

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15

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<212> ADN

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20

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<212> ADN

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20

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25

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<211> 20

<212> ADN 20 <213> Homo sapiens

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<213> Homo sapiens

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<213> Homo sapiens

<400> 139

40

<210> 140

<211> 23

<212> ADN

<213> Homo sapiens

45

<400> 140

<210> 141 50 <211> 76

<212> ADN

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<210> 142

<211> 20

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<210> 143

<211> 20

<212> ADN 10 <213> Homo sapiens

<400> 143

15 <210> 144

<211> 73

<212> ADN

<213> Homo sapiens

20 <400> 144

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<211> 24 25 <212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 145

30

<210> 146

<211> 26

<212> ADN

<213> Homo sapiens

35

<400> 146

<210> 147 40 <211> 85

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<210> 148

<211> 24

<212> ADN 50 <213> Homo sapiens

<400> 148

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<211> 22

<212> ADN

<213> Homo sapiens

60 <400> 149

<210> 150

<211> 73

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 150

10

<210> 151

<211> 23

<212> ADN

<213> Homo sapiens

15

<400> 151

<210> 152 20 <211> 22

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<210> 153

<211> 76

<212> ADN 30 <213> Homo sapiens

<400> 153

35 <210> 154

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

40 <400> 154

<210> 155

<211> 20 45 <212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 155

50

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55

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15

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55

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<400> 175

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<400> 286

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10

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15

<400> 289

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<210> 291

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10

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15

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296 10 <211> 2547

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<213> Homo sapiens

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<210> 301

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<400> 301

<210> 303

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<213> Homo sapiens

<400> 307

<210>

308 10 <211> 2162

10

<210> 302

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<212> ADN

<213> Homo sapiens

15

<400> 302

<210> 304

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<212> ADN

<213> Homo sapiens

5

<220>

<221> no seguro

<222> (0)...(0)

<223> n = A, T, C o G

10

<400> 304

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 308

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<212> ADN

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<400> 309

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<212> ADN

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<210> 311

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<212> ADN

<213> Homo sapiens

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<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 314

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<212> ADN

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<212> ADN

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<400> 317

<210> 318

<211> 3014

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 318

<210> 319

<211> 2148 10 <212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 319

<210> 320

<211> 540

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 320

10 <210> 321

<211> 2346

<212> ADN

<213> Homo sapiens

15 <400> 321

<210> 322

<211> 2420

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 322

<210> 323

<211> 2253

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 323

<210> 324

<211> 1619

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 324

<210> 325

<211> 5010

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 325

<210> 326

<211> 2574

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 326

<210> 327

<211> 1421

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 327

<210> 328

<211> 4604

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 328

<210> 329

<211> 2076

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 329

<210> 330 10 <211> 2819

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 330

<210> 331

<211> 2540

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 331

<210> 332

<211> 1474

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 332

<210> 333

<211> 4079

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 333

<210> 334

<211> 3373

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 334

<210> 335

<211> 2304

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 335

<210> 336

<211> 1876

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 336

<210> 337

<211> 6633

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 337

<210> 338

<211> 994

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 338

<210> 339

<211> 772

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 339

10 <210> 340

<211> 919

<212> ADN

<213> Homo sapiens

15 <400> 340

<210> 341

<211> 7365

<212>

ADN 20 <213> Homo sapiens

<400> 341

<210> 342

<211> 10386

<212>

ADN 5 <213> Homo sapiens

<220>

<221> no seguro

<222> (0)...(0) 10 <223> n = a, t, c, o g

<400> 342

<210> 343

<211> 2191

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 343

<210> 344

<211> 2776

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 344

<210> 345

<211> 3160

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 345

<210> 346

<211> 2629

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 346

<210> 347

<211> 3442

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 347

<210> 348

<211> 737

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 348

<210> 349

<211> 5189

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<210> 350

<211> 1536

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 350

<210> 351 10 <211> 2386

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 351

<210> 352

<211> 1270

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 352

<210> 353

<211> 1600

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 353

10 <210> 354

<211> 1842

<212> ADN

<213> Homo sapiens

15 <400> 354

<210> 355

<211> 4975

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 355

<210> 356

<211> 4627

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 356

<210> 357

<211> 2634

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 357

<210> 358

<211> 1246

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 358

<210> 359

<211> 2360

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 359

<210> 360

<211> 1433

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 360

<210>

361 10 <211> 1632

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 361

<210> 362

<211> 2756

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 362

<210> 363

<211> 2768

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 363

<210> 364

<211> 2984

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 364

<210> 365

<211> 3061

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 365

<210> 366

<211> 1360

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 366

<210> 367

<211> 1412

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 367

<210>

368 10 <211> 1075

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 368

<210> 369

<211> 1127

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 369

10 <210> 370

<211> 1890

<212> ADN

<213> Homo sapiens

15 <400> 370

<210> 371

<211> 4946

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 371

<210> 372

<211> 1743

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 372

<210>

373 10 <211> 5061

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 373

<210> 374

<211> 6802

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 374

<210> 375

<211> 1840

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 375

<210> 376

<211> 6754

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 376

<210> 377

<211> 757

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 377

<210>

378 10 <211> 476

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<210> 379

<211> 2518

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 379

<210> 380

<211> 4160

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 380

<210> 381

<211> 1295

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 381

<210> 382

<211> 2210

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 382

<210> 383

<211> 4604

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 383

<210> 384

<211> 545

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 384

Claims (5)

1. REIVINDICACIONES

   1. Método de predicción de la probabilidad de supervivencia a largo plazo de un paciente con cáncer de mama sin la recidiva de cáncer de mama, tras la extirpación quirúrgica del tumor primario, que comprende

   5 determinar el nivel del transcrito de ARN de BAG1 en una muestra de tejido de cáncer de mama obtenida de dicho paciente, normalizado frente al nivel de expresión de todos los transcritos de ARN sometidos a ensayo en dicha muestra, o un conjunto de referencia de transcritos de ARN,

   10 en el que un aumento del nivel normalizado del transcrito de ARN de BAG1 en comparación con el nivel normalizado del transcrito de ARN de BAG1 en un conjunto de referencia de tejidos de cáncer de mama indica un aumento de la probabilidad de supervivencia a largo plazo sin recidiva de cáncer de mama.

2. 2.

   Método según la reivindicación 1, en el que el cáncer de mama es cáncer de mama invasivo. 15

3. 3. Método según la reivindicación 1 ó 2, en el que dicho ARN se aísla de una muestra de tejido de cáncer de mama incrustado en cera, fijado de dicho paciente.

4. 4.

   Método según la reivindicación 1, 2 ó 3, en el que el nivel del transcrito de ARN de BAG1 se cuantifica 20 mediante RT-PCR.

5. 5. Método la reivindicación 1, 2 ó 3, en el que el nivel del transcrito de ARN de BAG1 se cuantifica mediante un alineamiento.