KR100862972B1

KR100862972B1 - 휘발성 유기 화합물 검색용 바이오마커 및 이를 이용한유해성을 나타내는 휘발성 유기 화합물 검색 방법

Info

Publication number: KR100862972B1
Application number: KR1020060105644A
Authority: KR
Inventors: 류재천; 김연정
Original assignee: 한국과학기술연구원
Priority date: 2006-10-30
Filing date: 2006-10-30
Publication date: 2008-10-13
Also published as: KR20080038583A

Abstract

본 발명은 휘발성 유기 화합물 검색용 바이오마커 및 이를 이용한 검색 방법에 관한 것으로, 구체적으로 휘발성 유기 화합물의 대표적인 화학물질인 벤젠, 톨루엔, 크실렌에 공통적으로 유전자 발현이 증가 또는 감소하는 바이오마커 및 이를 이용한 휘발성 유기 화합물의 검색 방법에 관한 것이다. 본 발명의 바이오마커는 DNA 마이크로어레이 칩을 통하여 선별된 반응 유전자들을 바이오마커로 이용하여 환경이나 실생활에서 휘발성 유기 화합물, 특히 유해성을 나타내는 휘발성 유기 화합물을 모니터링 및 판정하는데 유용하게 사용될 수 있으며, 휘발성 유기 화합물이 독성을 일으키는 작용 기작을 규명하는 도구로 이용될 수 있다.

휘발성 유기 화합물, 바이오마커, 마이크로어레이.

Description

휘발성 유기 화합물 검색용 바이오마커 및 이를 이용한 유해성을 나타내는 휘발성 유기 화합물 검색 방법{Biomaker and screening method of volatile organic compounds having toxicity using thereof}

도 1은 휘발성 유기 화합물(벤젠, 톨루엔 및 크실렌)의 인간 골수성 백혈병 세포주에서의 세포 독성을 조사한 그래프이다.

도 2는 마이크로어레이 칩을 이용한 휘발성 유기 화합물을 처리한 인간 골수성 백혈병 세포의 유전자 발현 양상을 분석한 결과를 나타낸 도면이다.

도 3은 휘발성 유기 화합물들에 의해 공통적으로 발현 변화하는 유전자의 개수를 도식화한 밴다이어그램 도면이다.

도 4는 실시간 정량 RT-PCR을 이용한 휘발성 유기 화합물들에 의해 공통적으로 발현 변화하는 10종의 유전자 발현량을 검증한 결과를 나타낸 도면이다.

본 발명은 휘발성 유기 화합물 검색용 바이오마커 및 이를 이용한 검색 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 휘발성 유기 화합물의 대표적인 화학물질인 벤 젠, 톨루엔, 크실렌에 공통적으로 유전자 발현이 증가 또는 감소하는 바이오마커 및 이를 이용한 휘발성 유기 화합물의 검색 방법에 관한 것이다.

휘발성 유기 화합물(Volatile Organic Compounds : VOCs)은 대기 중에서 태양 빛을 받아 광화학 반응을 일으켜 지표오존(ground level ozone)을 만들고 스모그를 형성하는 물질로 정의되며 대기 오염의 주요인 중의 하나이다.

휘발성 유기 화합물은 화학, 제약, 전자 공업뿐 만 아니라 용매 및 세정제를 사용하는 일반 산업체에서도 광범위하게 배출되고 있다. 또한 가솔린과 자동차 배출원은 도시 대기오염의 주범이 되고 있으며(Sigsby et al., Environ Sci Technol, 21, 466-475, 1987; Zweidinger et al., Environ Sci Technol, 22, 956-962, 1988; Daisy et al., Atmospheric environment 28(2), 3557-3562, 1994), 미국의 경우 대기중 벤젠 농도의 약 80% 가량이 자동차 배기가스나 가솔린 등에 의한 것으로 보고된 바 있다.

특히, 휘발성 유기 화합물의 대부분이 휘발성이 강해 증기 형태로 배출되어 대기 오염의 원인이 됨은 물론, 호흡기를 통해 쉽게 인체로 유입되어 유해를 야기한다. 이들 중 상당수(벤젠, 염화 비닐 등)는 발암물질로 증명되어 매우 중요시 되는 물질 군으로 알려져 있다. 이들 오염도 및 위해도는 실내에서 높은 것으로 보고되고 있으며, 노출 정도는 개인의 특성에 따라 변이가 크기 때문에 개인 노출 평가가 필수적이라고 할 수 있다(Fawell and Hun, John Wiley & Sons, 1998; Wallace, Environmental Research, 35, 293-319, 1984). 이와 같은 오염원에 의해 발생된 대 기중의 휘발성 유기 화합물은 만성 노출시에는 인체내 기관에 축적되어 폐부종, 신장독성, 혈액암 등의 유해한 영향을 끼치게 된다(Otto et al., Arch . Environ . Health, 47, 23-30, 1992; Hudnell et al., Arch . Environ . Health, 47, 31-38, 1992; Koren et al., Arch . Environ . Health, 47, 39-44, 1992).

최근, 환경문제로 대두되고 있는 새집 증후군은 휘발성 유기 화합물의 배출로 인해 사람이 두통이나 알레르기 증세를 일으킬 수 있는 일종의 생활 공해이다. 우리나라에서는 아직까지 새집 증후군의 사례가 많지 않지만, 휘발성 유기 화합물 배출은 집에서 흔하게 볼 수 있는 벽지, 장판 등 친숙한 자재들로부터 나온다. 휘발성 유기용제(에스테르, 알데히드, 케톤 등)는 페인트, 접착제, 스프레이, 연소과정, 세탁소, 의복, 방향제, 건축자재, 왁스 등에서 발생하고 피로감, 정신착란, 두통, 구토증, 현기증, 중추신경 억제작용 등으로, 우리가 생각했던 것보다 많은 화학물질이 배출되며 사람이 나타낼 수 있는 증상도 다양하다

벤젠(bezene)은 인간에게 발암성 물질(EPA에서 A 군으로 분류)로 고노출 근로자들에서 백혈병 및 임파암과 혈액암의 발생율이 증가하였으며, 또한 무형성 빈혈(재생 불량성 빈혈)의 원인으로 작용하고 있는 것으로 밝혀져 많은 연구가 진행되어 왔다.

또한 톨루엔(toluene)은 신경계 독성 물질로 작용하여 인간의 신경계 중심에 압박을 가져와 우울증의 원인이 되기도 한다. 또한 간 독성과 신장 독성을 유발하는 것으로 알려져 있으며, 설치류 세포에서 염색체 변형 및 자매염색체 교환을 유발하나 발암성은 없는 것으로 보고되었다.

크실렌(o-xylene)은 성장 장애, 태아 독성, 임신 독성 등의 영향을 미치는 것으로 밝혀졌다. 또한 톨루엔과 마찬가지로 중추신경계에 영향을 보이며 지속적인 노출시 신경행동학적 기능 저하를 유발하는 것으로 보고되었다.

이처럼 휘발성 유기 화합물의 중요성에도 불구하고, 인체에서의 위해도 평가 데이터가 충분하지 않고, 노출에 대한 검색 방법 역시 고전적인 방법에 국한되어 있어 보다 빠르고 정확한 위해성 평가 방법을 통해 인체에서의 오염 정도를 파악하고 적절한 대책 및 관리를 수행하는 것이 중요한 과제라 하겠다.

따라서, 이들 휘발성 유기 화합물 중에서 배출 농도와 오염도 특히 위해도 측면에서 주로 문제시 되는 벤젠, 톨루엔 그리고 크실렌에 대한 위해도 평가를 위해 바이오마커를 발굴하는 것이 필요하다.

포유류 6종, 미생물 292종 등 여러 종의 게놈(genome) 염기서열 프로젝트가 완성되어 NCBI(National Center for Biotechnology Information)에 보고되었다. 이렇게 얻어진 막대한 양의 데이터를 기본으로 유전자의 기능을 연구하기 위하여 게놈-와이드 익스프레션(genome-wide expression) 연구가 이루어지고 있다. 한번의 실험으로 수천 개의 유전자의 발현을 분석하기 위하여 DNA 마이크로어레이(microarray) 분석을 수행한다(Schena, M., et al ., Proc. Natl . Acad . Sci . USA 93:10614-10619, 1996).

마이크로어레이는 cDNA(complementary DNA)나 20-25 염기쌍(base pair) 길이의 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)들의 세트를 유리에 집적화한 것이다. cDNA 마이크로어레이는 학교 내의 연구실 또는 Agilent, Genomic Solutions 등의 회사에서 칩 위에 cDNA 수집물을 기계적로 고정화 하거나 잉크젯(ink jetting) 방법을 이용하여 생산하고 있다(Sellheyer, K and Belbin, T.J., J. Am . Acad . Dermatol. 51:681-692, 2004). 올리고뉴클레오티드 마이크로어레이는 Affymetrix사에서 사진 식각 공정(photolithography)을 이용하여 칩 위에서 직접 합성 방법에 의해 만들고 있으며, Agillent사 등에는 합성된 올리고뉴클레오티드를 고정화하는 방법으로 생산하고 있다(Sellheyer, K. and Belbin, T.J., J. Am . Acad . Dermatol. 51:681-692, 2004).

유전자의 발현을 분석을 위해서는 조직 등 시료에서 RNA를 얻어 DNA 마이크로어레이에 있는 올리고뉴클레오티드와 교잡반응을 수행한다. 얻어진 RNA는 형광이나 동위원소로 표지화하며, cDNA로 전환시킨다. cDNA 마이크로어레이는 주로 두개의 다른 형광(예: Cye3과 Cye5)으로 대조군과 실험군을 각각 표지화하여 같은 칩 상에서 동시에 교잡 반응을 수행한 후 광학적으로 이미지를 스캔하여 형광의 세기를 얻고 그 결과를 분석한다. 두개의 형광 세기의 비율에 따라 유전자의 발현 여부를 결정한다(Somasundaram, K., et al ., Genomics Proteomics I:1-10, 2002).

최근 DNA 마크로어레이 기술을 이용한 첨단 기법인 독성 유전체학(Toxicogenomics) 연구 등과 접목하여 대량(high throughput)으로 의약품 및 신의약 후보물질은 물론 모든 화학물질에 의한 특정 조직이나 세포주에서 발현되는 유전자들의 발현 패턴의 분석, 양적 분석이 가능해졌다. 이에 따라 특정 세포 내에서 특정 유전자의 발현 빈도를 분석함으로써 약물의 부작용과 관련된 유전자의 발굴이 가능하며, 이를 통하여 약물의 작용 및 부작용에 따른 분자적 메커니즘을 이해하게 될 것이며 나아가 독성 및 부작용을 유발하는 물질의 검색 및 진단이 가능하게 될 것이다.

이에 본 발명자들은 인간 유전자 3만 6천개가 집적된 올리고마이크로어레이를 이용하여 휘발성 유기 화합물을 대표하는 3종의 화학물질들의 유전자 발현 프로파일을 인간 골수성 백혈병 세포인 HL-60 세포주에서 관찰 및 분석함으로써 휘발성 유기 화합물에 의해 공통적으로 과발현 또는 저발현 되는 유전자를 발굴하고, 실시간(real-time) RT-PCR 방법에 의해 상기 유전자들의 발현 양상을 확인함으로써 휘발성 유기 화합물을 검출할 수 있는 바이오마커 및 이를 이용한 검색 방법을 확립하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 휘발성 유기 화합물에 의해 공통적으로 과발현 또는 저발현되는 바이오마커 및 상기 바이오마커를 이용한 휘발성 유기 화합물 검색 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 휘발성 유기 화합물에 의해 자극받은 인간 골수성 백혈병 세포에서 발현 변화를 일으키는 것을 특징으로 하는 휘발성 유기 화합물 검색용 바이오마커를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 바이오마커 유전자 서열의 전부 또는 일부를 포함하는 올리고뉴클레오티드 또는 그의 상보가닥 분자가 집적된 휘발성 유기 화합물 검색용 DNA 마이크로어레이 칩을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 바이오바커를 이용한 휘발성 유기 화합물 검색 방법을 제공한다.

아울러, 본 발명은 휘발성 유기 화합물 검색 키트를 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 휘발성 유기 화합물에 의해 자극받은 인간 골수성 백혈병 세포에서 발현 변화를 일으키는 것을 특징으로 하는 휘발성 유기 화합물 검색용 바이오마커를 제공한다.

상기 휘발성 유기 화합물은 벤젠, 톨루엔 및 크실렌으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 바이오마커는 면역 반응, 아팝토시스, 전사 조절, 전달, 세포 주기 및 대사 관련 유전자로 구성되어 있다.

본 발명은 하기와 같이 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 바이오마커를 제공한다: 유전자 등록번호(Genebank) BC071718[Chemokine(C-C motif) ligand 4-like 1], 유전자 등록번호 NM_022168(Interferon induced with helicase C domain 1), 유전자 등록번호 AK095515(Interferon-induced protein with tetratricopeptide repeats 1), 유전자 등록번호 CD521853[Chemokine(C-C motif) ligand 4], 유전자 등록번호 AK023956(2'-5'-oligoadenylate synthetase-like), 유전자 등록번호 BC032839(Interferon-induced protein with tetratricopeptide repeats 2), 유전자 등록번호 AF026939(Interferon-induced protein with tetratricopeptide repeats 3), 유전자 등록번호 BX649185[B-cell CLL/lymphoma 6(zinc finger protein 51)], 유전자 등록번호 AI742278(Interleukin 8), 유전자 등록번호 X74328(Cannabinoid receptor 2(macrophage)), 유전자 등록번호 BF690887(BCL2-related protein A1), 유전자 등록번호 NM_001165(Baculoviral IAP repeat-containing 3), 유전자 등록번호 D90070(Phorbol-12-myristate-13-acetate -induced protein 1), 유전자 등록번호 M83221(V-rel reticuloendotheliosis viral oncogene homolog B), 유전자 등록번호 NM_004430(Early growth response 3), 유전자 등록번호 AK123009(Growth factor independent 1), 유전자 등록번호 NM_003764(Syntaxin 11), 유전자 등록번호 NM_014331(Solute carrier family 7, member 11), 유전자 등록번호 NM_000104(Cytochrome P450, family 1, subfamily B, polypeptide 1), 유전자 등록번호 AY123223(Sestrin 2), 유전자 등록번호 NM_002395(Malic enzyme 1, NADP(+)-dependent, cytosolic), 유전자 등록번호 NM_024625(Zinc finger CCCH-type, antiviral 1), 유전자 등록번호 AF302505[Pellino homolog 1 (Drosophila)], 유전자 등록번호 AL834442(Nuclear receptor coactivator 7), 유전자 등록번호 NM_017414(Ubiquitin specific peptidase 18), 유전자 등록번호 NM_002133[Heme oxygenase(decycling) 1], 유전자 등록번호 AY337518(Hect domain and RLD 5), 유전자 등록번호 D80008(DNA replication complex GINS protein PSF1).

1) 상기 바이오마커 중에서 휘발성 유기 화합물로 자극하여 발현이 증가하는 바이오마커 유전자는 하기와 같다: 유전자 등록번호(Genebank) BC071718[Chemokine(C-C motif) ligand 4-like 1], 유전자 등록번호 NM_022168(Interferon induced with helicase C domain 1), 유전자 등록번호 AK095515(Interferon-induced protein with tetratricopeptide repeats 1), 유전자 등록번호 CD521853[Chemokine(C-C motif) ligand 4], 유전자 등록번호 AK023956(2'-5'-oligoadenylate synthetase-like), 유전자 등록번호 BC032839(Interferon-induced protein with tetratricopeptide repeats 2), 유전자 등록번호 AF026939(Interferon-induced protein with tetratricopeptide repeats 3), 유전자 등록번호 BX649185[B-cell CLL/lymphoma 6(zinc finger protein 51)], 유전자 등록번호 AI742278(Interleukin 8), 유전자 등록번호 BF690887(BCL2-related protein A1), 유전자 등록번호 NM_001165(Baculoviral IAP repeat-containing 3), 유전자 등록번호 D90070(Phorbol-12-myristate-13-acetate -induced protein 1), 유전자 등록번호 M83221(V-rel reticuloendotheliosis viral oncogene homolog B), 유전자 등록번호 NM_004430(Early growth response 3), 유전자 등록번호 NM_003764(Syntaxin 11), 유전자 등록번호 NM_014331(Solute carrier family 7, member 11), 유전자 등록번호 AY123223(Sestrin 2), 유전자 등록번호 NM_002395[Malic enzyme 1, NADP(+)-dependent, cytosolic], 유전자 등록번호 NM_024625(Zinc finger CCCH-type, antiviral 1), 유전자 등록번호 AF302505[Pellino homolog 1(Drosophila)], 유전자 등록번호 AL834442(Nuclear receptor coactivator 7), 유전자 등록번호 NM_017414(Ubiquitin specific peptidase 18), 유전자 등록번호 NM_002133[Heme oxygenase(decycling) 1], 유전자 등록번호 AY337518(Hect domain and RLD 5).

2) 상기 바이오마커 중에서, 휘발성 유기 화합물로 자극하여 발현이 감소하는 바이오마커 유전자는 하기와 같다: 유전자 등록번호 X74328[Cannabinoid receptor 2(macrophage)], 유전자 등록번호 AK123009(Growth factor independent 1), 유전자 등록번호 NM_000104(Cytochrome P450, family 1, subfamily B, polypeptide 1), 유전자 등록번호 D80008(DNA replication complex GINS protein PSF1).

본 발명자들은 휘발성 유기 화합물 검색용 바이오마커를 발굴하기 위하여, 휘발성 유기 화합물로서 오염도 및 인체에서 위해성를 지니는 대표적인 화학물질인 벤젠(benzene), 톨루엔(toluene) 및 크실렌(o-xylene)을 인간 골수성 백혈병 세포주(HL-60)에 처리하여 세포 독성을 확인하였다. 그 결과, 상기 3 종의 휘발성 유기 화합물은 인간 골수성 백혈병 세포주에 독성을 가짐이 확인되었고(도 1 참조), 상기 실험을 바탕으로 각각의 화학물질의 농도를 결정하였다. 이후 상기 결정된 농도로 각각의 휘발성 유기 화합물을 인간 골수성 백혈병 세포주에 처리하고, 상기 화학물질을 처리한 세포주에서 mRNA를 분리하여 cDNA를 합성하면서 형광물질(Cy5)로 표지하였으며, 화학물질을 처리하지 않은 대조군의 경우 Cy3로 표지하였다. 상 기 형광표지된 cDNA를 36 k 올리고마이크로어레이 칩 Human V4.0 OpArray(Operon, Germany)와 혼성화하였고, 형광 이미지를 스캔하여 유전자 발현 양상의 차이를 분석하였다(도 2 참조). 분석시 Cy5/Cy3 비율이 2.0 배 이상인 경우 발현 증가된 유전자로 분류하였고, 0.5 배 이하인 경우 발현 감화소된 유전자로 분류하였다. 분석 결과, 발현 증가된 유전자는 벤젠의 경우 0.53%(36910개의 유전자 중 196개), 톨루엔은 0.99%(36910개의 유전자 중 364개), 크실렌은 0.24%(36910개의 유전자 중 88개)임을 확인하였다. 또한, 발현이 감소된 유전자는 벤젠의 경우, 0.38%(36910개의 유전자 중 141개), 톨루엔은 2.46%(36910개의 유전자 중 907개), 크실렌은 0.20%(36910개의 유전자 중 72개)임을 확인하였다(도 3 참조). 이때, 3종의 휘발성 유기 화합물에 의해 공통적으로 2.0배 이상 과발현되거나 저발현 되는 유전자들을 분류한 결과, 24개의 유전자 발현이 증가하고, 4개의 유전자 발현이 감소하였다. 이들 유전자들을 기능별로 분류하면 면역반응(immune response), 아팝토시스(apoptosis), 전사(transcription), 세포 주기(cell cycle), 대사(metabolism) 및 전달(transport)에 관련된 유전자들이었다(표 2, 3 및 도 3 참조). 상기 유전자들은 본 발명에서 사용한 휘발성 유기 화합물(벤젠, 톨루엔 및 크실렌)을 처리했을 때, 인간 골수성 백혈병 세포에서 독성과 관련이 있다는 보고는 없다.

이후, 본 발명자들은 상기 유전자 중 면역반응 및 아팝토시스 관련 유전자 10종을 분리하여 실시간 RT-PCR(real-time reverse transcript polymerase chain reaction) 방법으로 발현 양상을 조사하였다. 그 결과, 9종의 과발현 유전자들과 1종의 저발현 유전자의 발현 양상이 올리고마이크로어레이 칩 결과와 유사하게 나 타남을 확인하였다(도 4 참조).

본 발명의 휘발성 유기 화합물 검색용 DNA 마이크로어레이 칩은 당업자에게 알려진 방법으로 제작할 수 있다. 상기 마이크로어레이칩을 제작하는 방법은 하기와 같다. 상기 탐색된 바이오마커를 탐침 DNA 분자로 이용하여 DNA 칩의 기판 상에 고정화시키기 위해 파이조일렉트릭(piezoelectric) 방식을 이용한 마이크로피펫팅(micropipetting)법 또는 핀(pin) 형태의 스폿터(spotter)를 이용한 방법 등을 사용하는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 바람직한 실시예에서는 핀 형태의 스폿터인 마이크로어레이를 이용하였다. 상기 DNA 마이크로어레이 칩의 기판은 아미노-실란(amino-silane), 폴리-L-라이신(poly-L-lysine) 및 알데히드(aldehyde)로 이루어진 군에서 선택되는 하나의 활성기가 코팅된 것이 바람직하나, 이에 한정하는 것은 아니다. 또한, 상기 기판은 슬라이드 글래스, 플라스틱, 금속, 실리콘, 나일론 막, 및 니트로셀룰로스 막(nitrocellulose membrane)으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며 본 발명의 바람직한 실시예에서는 아미노-실란이 코팅된 슬라이드 글래스를 이용하였다.

본 발명의 하기와 같은 과정을 포함하는 휘발성 유기 화합물 검색 방법을 제공한다: 1) 인간 골수성 백혈병 세포에 피검화합물을 처리하는 단계; 2) 단계 1)의 피검 화합물을 처리한 실험군 세포와 피검화합물을 처리하지 않은 대조군 세포에서 RNA를 분리하는 단계; 3) 단계 2)의 실험군과 대조군의 RNA를 cDNA로 합성하면서 실험군과 대조군을 각기 다른 형광물질을 표지하는 단계; 4) 단계 3)의 각기 다른 형광물질로 표지된 cDNA를 DNA 마이크로어레이칩과 혼성화시키는 단계; 5) 단계 4)의 반응한 DNA 마이크로어레이칩을 분석하는 단계; 및 6) 단계 5)의 분석한 데이터에서 본 발명의 바이오마커의 발현 정도를 대조군과 비교하여 확인하는 단계.

상기 검색 방법에 있어서, 단계 1)의 인간 골수성 백혈병 세포는 HL-60를 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 인간의 혈액 세포 및 조직에서 유래한 세포라면 모두 사용 가능하다.

상기 검색 방법에 있어서, 단계 3)의 형광물질은 Cy3, Cy5, FITC(poly L-lysine-fluorescein isothiocyanate), RITC(rhodamine-B-isothiocyanate) 및 로다민(rhodamine)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 당업자에게 알려진 형광물질은 모두 사용 가능하다.

상기 검색 방법에 있어서, 단계 5)의 DNA 마이크로어레이 칩은 36k 올리고마이크로어레이 Human V4.0 OpArray(Operon, Germany), Whole human genome oligo microarray(Agilent, USA) 등을 사용하는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니며, 인간 지놈 중 본 발명에서 상기 공통적으로 과발현 또는 저발현 유전자(표 2 및 포 3 참조)가 탑재된 마이크로어레이 칩이라면 사용 가능하고, 상기 본 발명자가 제작한 DNA 마이크로어레이 칩을 사용하는 것이 가장 바람직하다. 또한, 단계 5)의 분석 방법은 GenePix 4.1 소프트웨어(Axon Instruments, USA)를 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 당업자에게 알려진 분석 소프트웨어를 사용하여도 무방하다.

또한, 본 발명의 하기와 같은 과정을 포함하는 휘발성 유기 화합물 검색 방법을 제공한다: 1) 인간 골수성 백혈병 세포에 피검화합물을 처리하는 단계; 2) 단계 1)의 피검화합물을 처리한 실험군 세포와 피검화합물을 처리하지 않은 대조군 세포에서 RNA를 분리하는 단계; 3) 단계 2)의 RNA를, 본 발명의 바이오마커에 상보적이고 바이오마커 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머를 사용하여 실시간 RT-PCR(Real-time reverse transcript polymerase chain reaction)을 수행하는 단계; 및 4) 단계 3)의 유전자 산물을 대조군과 비교하여 발현 정도를 확인하는 단계.

상기 검색 방법에 있어서, 프라이머는 본 발명에서 탐색된 바이오마커 유전자와 상보적이고, 바이오마커를 증폭할 수 있는 프라이머라면 모두 사용가능하다. 본 발명에서는 서열번호 1 내지 20으로 기재되는 정방향 및 역방향 프라이머 10쌍을 제시하였으나 이에 한정되는 것은 아니다.

아울러, 본 발명은 휘발성 유기 화합물 검색용 키트를 제공한다.

본 발명은 상기 본 발명에서 제작한 DNA 마이크로어레이 칩을 포함하는 휘발성 유기 화합물 검색용 키트를 제공한다.

본 발명은 상기 검색 키트에 추가적으로 인간 골수성 백혈병 세포를 포함하는 휘발성 유기 화합물 검색용 키트를 제공한다. 상기 인간 골수성 백혈병 세포는 HL-60를 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 인간의 혈액 세포 및 조직에서 유래한 세포라면 모두 사용 가능하다.

상기 검색 키트에 추가적으로 형광물질을 포함할 수 있으며, 상기 형광물질은 스트렙타비딘-알칼리 탈인화효소 접합물질(strepavidin-like phosphatease conjugate), 화학형광물질(chemiflurorensce) 및 화학발광물질(chemiluminescent)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 바람직한 실시예에서는 Cy3와 Cy5를 사용하였다. 아울러, 상기 검색 키트에 추가적으로 반응 시약을 포함시킬 수 있으며, 상기 반응 시약은 혼성화에 사용되는 완충용액, RNA로부터 cDNA를 합성하기 위한 역전사효소, cNTPs 및 rNTP(사전 혼합형 또는 분리 공급형), 형광 염색제의 화학적 유도제와 같은 표식시약, 세척 완충용액 등으로 구성될 수 있으나 이에 한정된 것은 아니며, 당업자에게 알려진 DNA 마이크로어레이 칩의 혼성화 반응에 필요한 반응 시약은 모두 포함시킬 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 바이오마커 유전자에 상보적이고, 바이오마커 유전자 를 증폭할 수 있는 프라이머를 포함하는 휘발성 유기 화합물 검색용 키트를 제공한다.

상기 검색 키트의 프라이머는 서열번호 1 내지 20으로 기재되는 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 2개 이상의 정방향 및 역방향 프라이머를 사용하는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니며, 상기 바이오마커에 상보적이며, 바이오마커 유전자를 증폭할 수 있는 정방향 및 역방향 프라이머쌍은 모두 사용 가능하다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 세포 배양 및 화학물질 처리

<1-1> 세포배양

인간 골수성 백혈병 세포주인 HL-60 세포(CCL-240, ATCC, USA)를 10% FBS가 첨가된 RPMI-1640 배지(Gibro-BRL, USA)를 이용하여 T75 플라스크에서 5 × 10⁵ 세포/㎖이 되도록 배양하였다. 본 발명자들은 기존의 연구와 보고를 통해 휘발성 유기 화합물들 중 유해성이 높은 물질인 벤젠(benzene), 톨루엔(o-toluene) 및 크실렌(o-xylene) 등의 3종을 선정하였으며, DMSO에 용해시켰다. 매질(vehicle) 농도는 모든 실험에서 0.1% 이하였다.

<1-2> 세포 독성 실험( MTT assay ) 및 화학 물질 처리

Mossman 등(J. Immunol . Methods, 65, 55-63, 1983)의 방법으로 HL-60 세포주를 이용한 MTT 실험을 수행하였다. 세포는 5 ㎖ 튜브에 튜브 당 2 × 10⁵ 세포수로 RPMI-1640 배지(Gibro-BRL, USA)에서 각 매질에 용해된 3종의 휘발성 유기 화합물(벤젠, 톨루엔 및 크실렌)을 처리하고 3시간 후에 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) 5 ㎎/㎖을 혼합하여 튜브에 가하여 37℃에서 3 시간 동안 배양하였다. 이 후 배지를 제거하고 형성된 포르마잔 크리스탈(formazan crystal)을 DMSO 500 ㎕에 용해하였다. 96-웰 플레이트로 옮겨 분주(aliquot)하고 흡광도 540 nm에서 O.D.값을 측정하였다.

HL-60 세포주에서 각 휘발성 유기 화합물들의 세포독성을 살펴본 결과, 50% 생존율을 보이는 농도(IC₅₀)는 벤젠의 경우 8.75 mM, 톨루엔은 2.74 mM, 그리고 크실렌은 0.84 mM이었으며(도 1), 상기 농도들로 결정하여 마이크로어레이 실험을 수행하였다.

< 실시예 2> 마이크로어레이 실험

<2-1> 표적 RNA 의 분리 및 형광 물질 표지

1 × 10⁵ cell/㎖ 농도로 5 ㎖ 튜브에 HL-60 세포를 분주한 후, 실시예 1-2에서 결정된 각 휘발성 유기 화합물들의 농도대로 각 휘발성 유기 화합물들을 3 시간 동안 처리하였다. 이후, 상기 처리한 세포에서 트리졸(trizol) 시약(Invitrogen life technologies, USA)을 사용하여 제조사의 방법대로 전체 RNA를 분리하고, RNeasy mini kit(Qiagen, USA)를 사용하여 정제하였다. 게놈 DNA는 RNA 정제 동안 RNase-free DNase set(Qiagen, USA)를 사용하여 제거하였다. 각 전체 RNA 시료의 양은 분광광도계로 측정하였고, 농도는 Agilent 2100 Bioanalyzer(Agilent Technologies, USA)와 아가로스 젤 전기영동으로 확인하였다.

<2-2> 표지된 cDNA 제조

올리고 마이크로어레이 분석을 위하여 실시예 2-1에서 수득한 휘발성 유기 화합물 처리군의 전체 RNA를 사용하여 cDNA를 제조하였다. 상기 수득한 전체 RNA 30 ㎍과 올리고(dT) 프라이머 2 ㎍(1 ㎍/㎕)과 혼합하고 65℃에서 10분간 반응시킨 후 바로 얼음에 넣어 어닐링(annealing)시켰다. 상기 어닐링된 RNA의 역전사(Reverse Transcript) 반응을 위해 표 1과 같이 시약을 혼합하였다.

구성	부피(㎕)
5X first strand buffer	6
dNTPs	0.6
0.1 M DDT	3
SuperScript II enzyme	3
Cy-3 or Cy-5 dUTP	2

대조군인 HL-60 세포주에서 분리한 전체 RNA는 Cy3-dUTP(녹색)으로 표지화하였고, 휘발성 유기 화합물들을 처리한 HL-60 세포주로부터 분리한 RNA는 Cy5-dUTP(적색)를 표지화하였다. 이때 두 시료는 Microcon YM-30 컬럼(Millipore, USA)을 사용하여 혼합, 정제되었다.

<2-3> 혼성화 반응

혼성화 및 세척 과정은 지노첵(주)의 지시방법에 따라 수행되었다. 혼성화는 12시간 동안 62℃ 오븐에서 수행되었다. DNA 마이크로어레이 칩으로 36 k 마이크로어레이 Human V4.0 OpArray(Operon, Germany)를 이용하였다. 세척(2분간 2×SSC/0.1% SDS에 세척, 3분간 1×SSC, 2분간 0.2× SSC에 세척) 후 슬라이드는 3분간 800 rpm으로 원심분리하여 건조하였다.

<2-4> 형광 이미지 획득

슬라이드 상의 혼성화 이미지는 Genepix 4000B(Axon Instruments, USA)로 스캔하였다. 결합되지 않은 유전자를 세척한 칩은 레이저 광 스캐너(laser fluorescence scanner)를 사용하여 형광 이미지를 획득하였다. 이때 녹색 형광 이미지는 대조군에서, 적색 형광 이미지는 실험군에서만 특이하게 발현되는 유전자의 활성 정도를 나타내게 되며, 노란색 형광 이미지는 녹색과 적색의 보색으로 두 군의 발현이 큰 차이가 없음을 의미한다. 스캔한 이미지들은 유전자 발현 비율을 얻기 위하여 GenePix 4.1 소프트웨어(Axon Instruments, USA)로 분석하였다. 이렇게 얻어진 데이터로부터 각각의 휘발성 유기 화합물에 대한 마커 유전자를 선별하였다(도 2).

그 결과, 올리고 칩 상에 존재하는 대략 3만 6천 개의 유전자 중에서 Cy5/Cy3의 비율이 2.0배 이상으로 유전자 발현 증가를 보이는 유전자는 벤젠의 경우 0.53%(36910개의 유전자 중 196개), 톨루엔은 0.99%(36910개의 유전자 중 364개), 크실렌은 0.24%(36910개의 유전자 중 88개)임을 확인하였다. 또한, 발현이 감소된 유전자는 벤젠의 경우, 0.38%(36910개의 유전자 중 141개), 톨루엔은 2.46%(36910개의 유전자 중 907개), 크실렌은 0.20%(36910개의 유전자 중 72개)임을 확인하였다(도 3 참조).

이때, 3종의 휘발성 유기 화합물에 의해 공통적으로 2.0배 이상 과발현 되거나 저발현 되는 유전자들을 분류하였으며, 24개의 유전자 발현이 증가하고, 4개의 유전자 발현이 감소하였다. 이들 유전자들을 기능별로 분류하면 면역반응(immune response), 아팝토시스(apoptosis), 전사(transcription), 세포 주기(cell cycle), 대사(metabolism) 및 전달(transport)에 관련된 유전자들이었다(표 2, 3 및 도 3 참조). 상기 유전자들은 본 발명에서 사용한 휘발성 유기 화합물(벤젠, 톨루엔 및 크실렌)을 처리했을 때, 인간 골수성 백혈병 세포에서 독성과 관련이 있다는 보고는 없다.

휘발성 유기 화합물에 의해 발현이 증가하는 유전자

등록번호	유전자 약어	유전자명	중간값의 비
등록번호	유전자 약어	유전자명	벤젠	톨루엔	크실렌
(A) 면역 반응(Immune response)
BC071718	CCL4L1	Chemokine (C-C motif) ligand 4-like 1	9.55	2.91	5.37
NM_02216	IFIH1	Interferon induced with helicase C domain 1	3.55	11.84	8.47
AK095515	IFIT1	Interferon-induced protein with tetratricopeptide repeats 1	41.05	86.26	36.35
CD521853	CCL4	Chemokine (C-C motif) ligand 4	6.83	2.97	6.55
AK023956	OASL	2'-5'-oligoadenylate synthetase-like	3.16	5.07	5.67
BC032839	IFIT2	Interferon-induced protein with tetratricopeptide repeats 2	130.94	155.84	338.33
AF026939	IFIT3	Interferon-induced protein with tetratricopeptide repeats 3	5.63	10.44	6.06
BX649185	BCL6	B-cell CLL/lymphoma 6 (zinc finger protein 51)	4.35	4.29	2.61
AI742278	IL8	Interleukin 8	6.69	2.52	5.51
(B) 아팝토시스(Apoptosis)
BF690887	BCL2A1	BCL2-related protein A1	3.62	3.02	2.94
NM_001165	BIRC3	Baculoviral IAP repeat-containing 3	4.38	3.54	2.78
D90070	PMAIP1	Phorbol-12-myristate-13-acetate-induced protein 1	4.93	10.64	5.03
(C) 전사(Transcription)
M83221	RELB	V-rel reticuloendotheliosis viral oncogene homolog B	2.63	4.90	4.46
NM_004430	EGR3	Early growth response 3	6.32	2.66	4.22
(D) 전달(Transport)
NM_003764	STX11	Syntaxin 11	3.96	2.61	2.43
NM_014331	SLC7A11	Solute carrier family 7, member 11	3.74	4.25	2.00
(E) 세포 주기 조절(Cell cycle regulation)
AY123223	SESN2	Sestrin 2	5.15	2.19	2.19
(F) 대사(Metabolism)
NM_002395	ME1	Malic enzyme 1, NADP(+)-dependent, cytosolic	2.39	2.37	2.23
(G) 미상(unknown)
NM_024625	ZC3HAV1	Zinc finger CCCH-type, antiviral 1	2.38	3.60	2.22
AF302505	PELI1	Pellino homolog 1 (Drosophila)	2.35	2.98	2.43
(H) 기타(etc)
AL834442	NCOA7	Nuclear receptor coactivator 7	2.88	4.87	2.01
NM_017414	USP18	Ubiquitin specific peptidase 18	2.83	8.03	13.08
NM_002133	HMOX1	Heme oxygenase (decycling) 1	6.01	12.22	17.86
AY337518	HERC5	Hect domain and RLD 5	4.34	10.87	3.54

휘발성 유기 화합물에 의해 발현이 감소하는 유전자

등록번호	유전자 약어	유전자명	중간값의 비
등록번호	유전자 약어	유전자명	벤젠	톨루엔	크실렌
(A) 면역 반응(Immune response)
X74328	CNR2	Cannabinoid receptor 2 (macrophage)	0.35	0.36	0.30
(B) 전사(Transcription)
AK123009	GFI1	Growth factor independent 1	0.44	0.42	0.48
(C) 전달(Transfort)
NM_000104	CYP1B1	Cytochrome P450, family 1, subfamily B, polypeptide 1	0.35	0.45	0.32
(D) 기타(etc)
D80008	KIAA0186	DNA replication complex GINS protein PSF1	0.49	0.41	0.44

< 실시예 3> 실시간 RT -PCR( Real - time reverse transcriptase polymerase chain reaction) 정량

휘발성 유기 화합물에 의해 발현 유도된 상기 실시예 2의 과발현된 유전자 중 휘발성 유기 화합물에 의해 주로 야기되는 면역 독성 관련 유전자와 아팝토시스 관련 유전자 10종을 선별하였다. 이들 유전자들은 유전자 등록번호(Genebank) BC071718[Chemokine(C-C motif) ligand 4-like 1], 유전자 등록번호 NM_022168(Interferon induced with helicase C domain 1), 유전자 등록번호 AK095515(Interferon-induced protein with tetratricopeptide repeats 1), 유전자 등록번호 CD521853[Chemokine(C-C motif) ligand 4], 유전자 등록번호 BC032839(Interferon-induced protein with tetratricopeptide repeats 2), 유전자 등록번호 AF026939(Interferon-induced protein with tetratricopeptide repeats 3), 유전자 등록번호 BX649185[B-cell CLL/lymphoma 6(zinc finger protein 51)], 유전자 등록번호 X74328[Cannabinoid receptor2 (macrophage)], 유전자 등록번호 D90070(Phorbol-12-myristate-13-acetate-induced protein 1), 유전자 등록번호 AY123223(Sestrin 2)이다.

상기 BCL-6 유전자는 종양 유전자로서 생성된 단백질은 주로 배 중심 B-세포에서 주로 발현된다. BCL-6 유전자는 비홉킨즈 림프종에서 염색체 전위, 미세절단, 점 돌연변이의 주요 타겟이 되며, 정상 림프구의 분화와 염증반응의 조절자로서 중요한 역할을 하며, 특히 림프구의 활성화, 분화, 증식 및 이동에 수반되는 유전자들의 전사를 억제한다(Dent et al ., Crit Rev Oncol Hematol 41:1-9, 2002). PMAIP1 유전자는 Bcl-2 구성원의 하나로 p53 관련 아팝토시스의 중요 매개자로 작용하며, 최근 저산소증에 의해 야기되는 아팝토시스에도 관여함이 밝혀진 바 있다(Oda et al., Science 288: 1053-1058, 2000; Kim et al ., J. Exp . Med . 199: 113-123, 2004). 또한 유전자 프로파일링 실험을 통해 인터페론과 이중가닥 RNA에 의해 발현이 유도되는 유전자로 밝혀지기도 하였다(Sun Y & Leaman DW. J. Interferon Cytokine Res . 24: 350-361, 2004). SEST2 유전자는 최근 세포의 생존을 조절하는 스트레스 반응 유전자로 밝혀졌다(Budanov et al ., Oncogene 21:6017-6031, 2002). SEST2 유전자는 저산소증, 산화적 스트레스, UV 혹은 γ-방사성 조사 등과 같은 세포의 스트레스에 의해 과발현되며, 세포 주기의 정치를 통한 아팝토시스를 야기할 수 있는 것으로 알려졌다.

CCL4와 CCL4L1 유전자는 케모카인 유전자이다. 케모카인은 백혈구의 이동을 유도하며 염증반응을 활성화 시키고 종양 관련 혈관재생의 조절함으로써 종양의 성장을 변형시킬 수 있다(Sallusto & Mackay, Annu Rev Immunol. 18:593-620, 2000; Chada et al., Curr Opin Mol Ther . 5:463-474, 2003).

인터페론(IFNs) 유전자는 포유류의 면역계에서 중요한 부분을 차지한다. IFIT1, IFIT2, IFIT3 및 IFIH1은 1형 인터페론으로, IFIT1의 과발현은 골수형성이상증후군에 대한 잠재적 진단 표지이다(Pellagatti et . al. Blood 108: 337-345, 2006). 골수형성이상증후군은 대략 30%에서 40%의 빈도로 급성 골수성 백혈병으로 전이되는 것으로 알려져 있다(Aul et al ., Haematologica 83: 71-86, 1998; Heaney & Golde N Engl J Med . 340: 1649-1660. 1999). 본 발명에서 조사된 IFIT1 유전자의 과발현은 휘발성 유기 화합물이 급성 골수성 백혈병을 야기할 수 있음을 암시한다. IFIT2 유전자는 급성 인플루엔자 환자에서 발현이 유도되는 것으로 보고되었다(Kawada et al., J. Gen . Virol . 87:1677-1683, 2006). IFIT3 유전자 역시 인터페론에 의해 유도되는 유전자이다. IFIH1 유전자는 초기 1형 인터페론 베타 반응성 유전자로 항바이러스 면역 반응에서 바이러스에 감염된 세포가 아팝토시스를 일으키도록 하는데 기여한다. 휘발성 유기 화합물에 의한 인터페론 관련 유전자들의 발현 변화의 원인 및 기전은 아직 명확하지 않지만 추후 연구를 위한 중요한 정보를 제공한다.

또한 CNR2 유전자는 면역세포에서 주로 존재하는 종양 유전자로서, 이 유전자의 비정상적인 발현에 의해 호중구의 분화를 억제함으로써 백혈병을 유발되는 것으로 알려져 있다(Valk et al ., Evi11 . J. Virol . 71: 6796-6804, 1997; Jorda et al., Blood 104: 526-534, 2004).

상기 유전자들의 발현변화 정도를 조사 및 정량하기 위해 My IQ 실시간 PCR(My IQ Real-time PCR)(Bio-rad, USA)을 이용하여 정량적인 실시간 RT-PCR을 실시하였다.

구체적으로, 올리고 dT 프라이머와 Superscript kit(Omniscipt™ kit , Qiagen, Co., USA)를 이용하여 역전사반응을 수행하여 cDNA를 합성하였다. PCR 산물을 정량하기 위하여 사이버그린(SYBR Green) I 염색(Bio-rad, USA)으로 염색하였다. 사이버그린 I 염색은 이중나선 DNA에 결합하는 염색법으로서, PCR 과정 동안 이중나선 DNA가 생성될수록 형광강도(fluroscense intensity)가 증가하게 된다. 먼저 PCR에 이용한 표적 유전자와 내재성(endogenous) 대조군(GAPDH)에 대한 프라이머를 사이버그린 마스터 믹스(Master mix)에 첨가하여 PCR을 실시한 후, 적절한 농도를 선택하는 프라이머 적합화(primer optimization) 과정을 수행하였다. 합성된 cDNA 시료와 각각의 프라이머(표 4)를 혼합하고, 사이버그린 마스터 믹스를 첨가한 후 PCR를 수행하였고, 정량 소프트웨어(software)를 사용하여 분석하였다(도 4).

프라이머 서열

등록번호	유전자명	PCR 프라이머 서열(5'-> 3')
AK095515	Interferon-induced protein with tetratricopeptide repeats 1(IFIT1)	센스(서열번호 1)	TCATCAGGTCAAGGATAGTCTG
		안티센스 (서열번호 2)	GGTGTTTCACATAGGCTAGTAG
BC032839	Interferon-induced protein with tetratricopeptide repeats 2(IFIT2)	센스 (서열번호 3)	ACTGCAACCATGAGTGAGAAC
		안티센스 (서열번호 4)	GCCTCGTTTTGCCCTTTGAG
AF026939	Interferon-induced protein with tetratricopeptide repeats 3(IFIT3)	센스 (서열번호 5)	GACAGGAAGACTTCTGAAGAACAA
		안티센스 (서열번호 6)	CAGGGAATTCTTGGTGACCTC
NM_022168	Interferon induced with helicase C domain 1(IFIH1)	센스 (서열번호 7)	CCGAGAGAAGATGATGTATAAAGCTA
		안티센스 (서열번호 8)	TTTGCATCTGTAATTCCAAAATCT
CD521853	Chemokine(C-C motif) ligand 4(CCL4)	센스 (서열번호 9)	CGCCTGCTGCTTTTCTTACAC
		안티센스 (서열번호 10)	CAGACTTGCTTGCTTCTTTTGG
BX649185	B-cell CLL/lymphoma 6(zinc finger protein 51)(BCL6)	센스 (서열번호 11)	TGTAGGCAGACACAGGGACTTGAA
		안티센스 (서열번호 12)	AACACAAGCATGACGCAGAATGGG
BC071718	Chemokine(C-C motif) ligand 4-like 1(CCL4L1)	센스 (서열번호 13)	CTTCCTCGCAACTTTGTGGT
		안티센스 (서열번호 14)	CTTGCCTCTTTTGGTTTGGA
D90070	Phorbol-12-myristate-13-acetate-induced protein 1(PMAIP1)	센스 (서열번호 15)	GGAGATGCCTGGGAAGAAG
		안티센스 (서열번호 16)	CCAAATCTCCTGAGTTGAGTAGC
AY123223	Sestrin 2(SESN2)	센스 (서열번호 17)	AAGGACCGATTCCAGGCACTTTCT
		안티센스 (서열번호 18)	CCTGCACGGGTATTTAATGTGGCA
X74328	Cannabinoid receptor 2(macrophage)(CNR2)	센스 (서열번호 19)	TTTGCTTTCTGCTCCATGCTGTGC
		안티센스 (서열번호 20)	TCACACACTTCTTCCAGTGAGCCA
NM_002046	Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase(GAPDH)	센스 (서열번호 21)	TGCACCACCAACTGCTTAGC
		안티센스 (서열번호 22)	GGCATGGACTGTGGTCATGA

그 결과, 9종의 과발현 유전자들 및 1종의 저발현 유전자의 유전자 발현 양상은 휘발성 유기 화합물들에 의한 유전자 발현을 조사한 올리고 마이크로어레이 결과와 매우 유사하게 나타남을 확인하였다.

본 발명의 휘발성 유기 화합물 검색용 바이오마커 및 이를 이용한 휘발성 유기 화합물 검색 방법은 DNA 마이크로어레이 칩을 통하여 선별된 반응 유전자들을 바이오마커로 이용하여 휘발성 유기 화합물의 모니터링 및 위해성을 판정하는데 유용하며, 휘발성 유기 화합물에 의해 야기되는 독성 작용 기작을 규명하는 도구로 이용할 수 있다.

<110> Korea Institute of Science and Technology <120> Biomarker and screening method of volatile organic compuonds having toxicity using thereof <130> 6p-10-24 <160> 22 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IFIT1 sense primer <400> 1 tcatcaggtc aaggatagtc tg 22 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IFIT1 antisense primer <400> 2 ggtgtttcac ataggctagt ag 22 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IFIT2 sense primer <400> 3 actgcaacca tgagtgagaa c 21 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IFIT2 antisense primer <400> 4 gcctcgtttt gccctttgag 20 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IFIT3 sense primer <400> 5 gacaggaaga cttctgaaga acaa 24 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IFIT3 antisense primer <400> 6 cagggaattc ttggtgacct c 21 <210> 7 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IFIH1 sense primer <400> 7 ccgagagaag atgatgtata aagcta 26 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IFIH1 antisense primer <400> 8 tttgcatctg taattccaaa atct 24 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CCL4 sense primer <400> 9 cgcctgctgc ttttcttaca c 21 <210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CCL4 antisense primer <400> 10 cagacttgct tgcttctttt gg 22 <210> 11 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BCL6 sense primer <400> 11 tgtaggcaga cacagggact tgaa 24 <210> 12 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BCL6 antisense primer <400> 12 aacacaagca tgacgcagaa tggg 24 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CCL4L1 sense primer <400> 13 cttcctcgca actttgtggt 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CCL4L1 antisense primer <400> 14 cttgcctctt ttggtttgga 20 <210> 15 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PMAIP1 sense primer <400> 15 ggagatgcct gggaagaag 19 <210> 16 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PMAIP1 antisense primer <400> 16 ccaaatctcc tgagttgagt agc 23 <210> 17 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SESN2 sense primer <400> 17 aaggaccgat tccaggcact ttct 24 <210> 18 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SENSE2 antisense primer <400> 18 cctgcacggg tatttaatgt ggca 24 <210> 19 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CNR2 sense primer <400> 19 tttgctttct gctccatgct gtgc 24 <210> 20 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CNR2 antisense primer <400> 20 tcacacactt cttccagtga gcca 24 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH sense primer <400> 21 tgcaccacca actgcttagc 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH antisense primer <400> 22 ggcatggact gtggtcatga 20

Claims

하기의 군으로부터 선택되는 유전자 서열의 전체 또는 일부를 포함하는 올리고뉴클레오티드 또는 그의 상보적인 올리고뉴클레오티드가 집적된 벤젠, 톨루엔 또는 o-크실렌으로 이루어진 군으로부터 선택된 휘발성 유기 화합물 검색용 DNA 마이크로어레이 칩:

유전자 등록번호(Genebank) BC071718[Chemokine(C-C motif) ligand 4-like 1], 유전자 등록번호 NM_022168(Interferon induced with helicase C domain 1), 유전자 등록번호 AK095515(Interferon-induced protein with tetratricopeptide repeats 1), 유전자 등록번호 CD521853[Chemokine(C-C motif) ligand 4], 유전자 등록번호 AK023956(2'-5'-oligoadenylate synthetase-like), 유전자 등록번호 BC032839(Interferon-induced protein with tetratricopeptide repeats 2), 유전자 등록번호 AF026939(Interferon-induced protein with tetratricopeptide repeats 3), 유전자 등록번호 BX649185[B-cell CLL/lymphoma 6(zinc finger protein 51)], 유전자 등록번호 AI742278(Interleukin 8), 유전자 등록번호 X74328[Cannabinoid receptor 2(macrophage)], 유전자 등록번호 BF690887(BCL2-related protein A1), 유전자 등록번호 NM_001165(Baculoviral IAP repeat-containing 3), 유전자 등록번호 D90070(Phorbol-12-myristate-13-acetate -induced protein 1), 유전자 등록번호 M83221(V-rel reticuloendotheliosis viral oncogene homolog B), 유전자 등록번호 NM_004430(Early growth response 3), 유전자 등록번호 AK123009(Growth factor independent 1), 유전자 등록번호 NM_003764(Syntaxin 11), 유전자 등록번호 NM_014331(Solute carrier family 7, member 11), 유전자 등록번호 NM_000104(Cytochrome P450, family 1, subfamily B, polypeptide 1), 유전자 등록번호 AY123223(Sestrin 2), 유전자 등록번호 NM_002395[Malic enzyme 1, NADP(+)-dependent, cytosolic], 유전자 등록번호 NM_024625(Zinc finger CCCH-type, antiviral 1), 유전자 등록번호 AF302505[Pellino homolog 1(Drosophila)], 유전자 등록번호 AL834442(Nuclear receptor coactivator 7), 유전자 등록번호 NM_017414(Ubiquitin specific peptidase 18), 유전자 등록번호 NM_002133[Heme oxygenase (decycling) 1], 유전자 등록번호 AY337518(Hect domain and RLD 5), 유전자 등록번호 D80008(DNA replication complex GINS protein PSF1).
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1) 인간 골수성 백혈병 세포에 피검화합물을 처리하는 단계;

2) 단계 1)의 피검화합물을 처리한 실험군 세포와 피검화합물을 처리하지 않은 대조군 세포에서 RNA를 분리하는 단계;

3) 단계 2)의 실험군 및 대조군의 RNA를 cDNA로 합성하면서 실험군과 대조군을 각기 다른 형광물질로 표지하는 단계;

4) 단계 3)의 각기 다른 형광물질로 표지된 cDNA를 제 1항의 DNA 마이크로어레이칩과 혼성화시키는 단계;

5) 단계 4)의 반응한 DNA 마이크로어레이칩을 분석하는 단계; 및

6) 단계 5)의 분석한 데이터에서 제 1항에 기재된 유전자의 발현 정도를 대조군과 비교하여 확인하는 단계를 포함하는 벤젠, 톨루엔 또는 o-크실렌으로 이루어진 군으로부터 선택된 휘발성 유기 화합물 검색 방법.
제 6항에 있어서, 단계 1)의 인간 골수성 백혈병 세포는 HL-60 세포 또는 인간 혈액 또는 림프 조직으로부터 유래된 백혈병 세포인 것을 특징으로 하는 검색 방법.
제 6항에 있어서, 단계 3)의 형광물질은 Cy3, Cy5, FITC(poly L-lysine-fluorescein isothiocyanate), RITC(rhodamine-B-isothiocyanate) 및 로다민(rhodamine)으로 이루어진 군으로부터 선택하여 사용하는 것을 특징으로 하는 검색 방법.
1) 인간 골수성 백혈병 세포에 피검화합물을 처리하는 단계;

2) 단계 1)의 피검화합물을 처리한 실험군 세포와 피검화합물을 처리하지 않은 대조군 세포에서 RNA를 분리하는 단계;

3) 단계 2)의 RNA를, 제 1항에 기재된 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머를 사용하여 실시간 RT-PCR(Real-time reverse transcript polymerase chain reaction)을 수행하는 단계;

4) 단계 3)의 유전자 산물을 대조군과 비교하여 발현 정도를 확인하는 단계를 포함하는 벤젠, 톨루엔 또는 o-크실렌으로 이루어진 군으로부터 선택된 휘발성 유기 화합물 검색 방법.
제 9항에 있어서, 단계 1)의 인간 골수성 백혈병 세포는 HL-60 세포 또는 인간 혈액 또는 림프 조직으로부터 유래된 백혈병 세포인 것을 특징으로 하는 검색 방법.
제 1항의 DNA 마이크로어레이 칩을 포함하는 벤젠, 톨루엔 또는 o-크실렌으로 이루어진 군으로부터 선택된 휘발성 유기 화합물 검색용 키트.
제 11항에 있어서, 인간 골수성 백혈병 세포를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 휘발성 유기 화합물 검색용 키트.
서열번호 1 내지 20으로 기재되는 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 2개의 정방향 및 역방향 프라이머쌍을 포함하는 벤젠, 톨루엔 또는 o-크실렌으로 이루어진 군으로부터 선택된 휘발성 유기 화합물 검색 키트.
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