KR101151786B1

KR101151786B1 - 트리클로로에틸렌의 인체 노출에 특이적인 유전자 발현 여부 확인용 바이오 마커 및 이를 이용한 확인 방법

Info

Publication number: KR101151786B1
Application number: KR1020100026709A
Authority: KR
Inventors: 류재천; 송미경; 김연정; 최한샘
Original assignee: 한국과학기술연구원
Priority date: 2010-03-25
Filing date: 2010-03-25
Publication date: 2012-05-31
Also published as: KR20110107538A

Abstract

본 발명은 휘발성 유기 화합물류 중의 하나인 트리클로로에틸렌(Trichloroethylene) 의 인체 노출 정도에 따라 발현 변화를 일으키는 특이적인 유전자 발현 여부 확인용 바이오 마커 및 이를 이용한 확인 방법에 관한 것으로, 구체적으로 트리클로로에틸렌의 노출 정도에 따라 특이적으로 유전자 발현이 증가 혹은 감소하는 바이오 마커 및 이를 이용한 트리클로로에틸렌에 대한 인체 노출 여부를 확인하는 방법에 관한 것이며, 본 발명의 바이오 마커는 DNA 마이크로어레이 칩을 통하여 선별된 반응 유전자들을 바이오 마커로 이용하여 환경 중 노출된 인체 시료에서 트리클로로에틸렌의 오염을 모니터링 및 판정하는데 유용하게 사용될 수 있으며, 트리클로로에틸렌에 의해 유발되는 독성 작용 기작을 규명하는 도구로 이용될 수 있다.

Description

트리클로로에틸렌의 인체 노출에 특이적인 유전자 발현 여부 확인용 바이오 마커 및 이를 이용한 확인 방법{Specific biomarker for identification of genes after human exposure to trichloroethylene and the method of identification using thereof}

본 발명은 트리클로로에틸렌의 인체 노출 정도에 따라 특이적으로 발현이 변화하는 유전자 발현 여부 확인용 바이오 마커 및 이를 이용한 확인 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 트리클로로에틸렌의 노출 정도에 따라 특이적으로 유전자 발현이 변화하는 바이오 마커 및 이를 이용한 트리클로로에틸렌에 대한 인체 노출 여부를 확인하는 방법에 관한 것이다.

휘발성 유기 화합물류 중에서 트리클로로에틸렌은 공업용 세정제 및 드라이클리닝의 용제 등의 폐수에 의해 환경 중에 배출된다. 트리클로로에틸렌은 용제로 사용되거나 유기화합물의 합성원료로도 사용되며 소화제등의 약제로도 사용된다.

트리클로로에틸렌은 휘발성이 있으며 토양에서의 휘발성이 다른 화합물에 비해 빠르다. 대기중 반감기가 빨라 넓은 지역으로의 이동이 용이하며, 표면수에서 공기 중으로의 이동도 빠르다. 수중에서의 가수분해 전환과정은 매우 느리다. 대기 중에서의 전환은 광화학적인 수산화반응에 의해 일어난다. 국내 수질 중 휘발성 유기 화합물류의 오염도 조사연구에서 16개의 시료 중 6건에서 트리클로로에틸렌이 검출되었으며 대기중 휘발성 유기 화합물류의 오염도 조사연구에서 서울 주거지역에서 2.28ppb, 공단배후지역에서 0.86ppb, 도로변에서 2.51ppb가 검출되었다(환경부 자료실).

동물실험에서 트리클로로에틸렌은 노출 초기에 빠르게 흡수되어지고, 위 장관 벽을 침투하는 경우가 있기 때문에 경구를 통한 흡수는 급성 독성의 빈번한 원인이 된다. 지방조직의 양에 의해서는 크게 영향을 받지 않는다. 체내에서의 잔류는 육체적 활동에 의해 다르게 나타난다. 트리클로로에틸렌은 혈액을 통해 조직에 도달하며 지용성으로 인해 특히 지방조직에 잘 축적된다. 태반을 지나 태아의 혈액에서도 발견된다는 보고가 있다. 트리클로로에틸렌은 일차적으로 간에서 대사되며 다른 장기에서는 아주 적은 양이 대사된다. 주요 포유류의 대사물은 유리형태이며 접합체 형태의 트리클로에탄올(trichloethanol)과 트리클로아세트 산(trichloacetic acid)이다. 트리클로로에틸렌은 랫트에서 간과 신장에서 선종 및 보기 드문 손상을 나타낸 것으로 보고되었다(IPCS).

마우스와 랫트 실험의 연구에 의하면 TCE 고농도는 간, 신장, 폐암을 야기한다고 하였으며 음용수나 작업장의 공기에서 고농도의 TCE에 장기간 노출된 사람들을 대상으로 한 연구에서 암 발생률이 증가하는 것이 증명되었다. 또한, NTP(National Toxicology Program)에서 발암성에 대한 9번째 연구에서 TCE는 사람에게 발암물질이 될 수 있다고 하였으며, IARC(International Agency for Research on Cancer)은 TCE가 인간에게 발암가능성이 있다고 하였다. 트리클로로에틸렌에 의한 주된 건강영향은 중추신경계 독성, 시력장애, 피로, 오심 등의 일반적 증상이 있을 수 있으며, 드물게는 면역계통의 장애로 피부질환과 독성간염이 동시에 나타나는 스티븐스존슨 증후군이 나타날 수 있다(식품의약품안전청 위해 예방정책국).

또한, 휘발성 유기 화합물류의 인체 독성 정도와 유전자 발현 변화에 대한 연구는 일부 보고되고 있지만, 대표적인 휘발성 유기 화합물류로 알려진 포름알데하이드, 벤젠(Formaldehyde, Benzene)등에 대한 연구에 거의 국한되어 있다. 이처럼 트리클로로에틸렌의 인간에 대한 잠재적 위해성에도 불구하고 인체에서의 위해도 평가 데이터가 충분하지 않고, 노출에 대한 검색 방법 역시 GC-MS(Gas Chromatography-Mass Spectrometer) 또는 HPLC(High Performance Liquid Chromatography) 등의 고전적인 방법에 국한되어 있다. GC-MS 또는 HPLC 방법 등을 이용하면 정량은 가능하나 분석을 위한 적정 조건을 설정하여야 하며 고가의 장비 등이 필요하다. 그러므로, 보다 빠르고 간편한 스크리닝(screening) 방법, 예를 들면 프라이머(primer)를 이용하는 실시간(real-time) PCR(Real-time reverse transcript polymerase chain reaction)또는 DNA 마이크로어레이 칩 등으로 신속한 위해성 평가를 통해 인체에서의 독성작용, 특히 백혈병과 같은 혈액관련 질병을 진단할 수 있는 유전자 발현 여부 등을 탐색할 수 있는 분자적 지표를 발굴하고 활용하여 트리클로로에틸렌의 인체 노출에 대한 적절한 대책 및 관리를 수행하는 것이 중요한 과제라 하겠다.

포유류 6종, 미생물 292종 등 여러 종의 게놈(genome) 염기서열 프로젝트가 완성되어 NCBI(National Center for Biotechnology Information)에 보고되었다. 이렇게 얻어진 막대한 양의 데이터를 기본으로 유전자의 기능을 연구하기 위하여 게놈-와이드 익스프레션(genome-wide expression) 연구가 이루어지고 있다. 한 번의 실험으로 수천 개의 유전자의 발현을 분석하기 위하여 DNA 마이크로어레이(microarray) 분석을 수행한다(Schena, M., et al., Proc . Natl. Acad . Sci . USA 93:10614-10619, 1996).

마이크로어레이는 cDNA(complementary DNA)나 20 - 25 염기쌍(base pair) 길이의 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)들의 세트를 유리에 집적화한 것이다. cDNA 마이크로어레이는 학교 내의 연구실 또는 Agilent, Genomic Solutions 등의 회사에서 칩 위에 cDNA 수집물을 기계적으로 고정화하거나 잉크젯(ink jetting) 방법을 이용하여 생산하고 있다(Sellheyer K. et. al., J. Am . Acad . Dermatol. 51:681-692, 2004). 올리고뉴클레오티드 마이크로어레이는 Affymetrix사에서 사진 식각 공정(photolithography)을 이용하여 칩 위에서 직접 합성하는 방법에 의해 만들어 지고 있으며, Agillent사 등에는 합성된 올리고뉴클레오티드를 고정화하는 방법으로 생산하고 있다(Sellheyer, K. et. al., J. Am . Acad . Dermatol. 51:681-692, 2004).

유전자의 발현을 분석을 위해서는 조직 등 시료에서 RNA를 얻어 DNA 마이크로어레이에 있는 올리고뉴클레오티드와 교잡반응을 수행한다. 얻어진 RNA는 형광이나 동위원소로 표지화하며 cDNA로 전환시킨다. 올리고 마이크로어레이는 한 개의 형광(예: Cy3)나 주로 두 개의 다른 형광(예: Cy3 및 Cy5)으로 대조군과 실험군을 각각 표지화하여 같은 칩 상에서 동시에 교잡 반응을 수행한 후 광학적으로 이미지를 스캔하여 형광의 세기를 얻고 그 결과를 분석한다. 두 개의 형광 세기의 비율에 따라 유전자의 발현 여부를 결정한다(Somasundaram, K. et al., Genomics Proteomics I:1-10, 2002).

최근 DNA 마크로어레이 기술을 이용한 첨단 기법인 독성 유전체학(Toxicogenomics) 연구 등과 접목하여 대량(high throughput)으로 의약품 및 신의약 후보물질은 물론 대표적인 환경오염물질을 비롯한 모든 화학물질에 의한 특정 조직이나 세포주에서 발현되는 유전자들의 발현 패턴의 분석, 양적 분석이 가능해졌다. 이에 따라 인체에서의 특정 유전자의 발현 빈도를 분석함으로써 약물의 부작용 및 환경오염물질의 유해작용과 관련된 유전자의 발굴이 가능하며, 이를 통하여 환경오염물질의 유해작용과 약물의 작용 및 부작용에 따른 분자적 메커니즘을 이해하게 될 것이며 나아가 독성 및 부작용을 유발하는 물질의 검색 및 확인이 가능하게 될 것이다.

이에 본 발명자들은 인간 유전자 4만 4천 개가 집적된 올리고마이크로어레이를 이용하여 트리클로로에틸렌의 유전자 발현 프로파일을 실제 트리클로로에틸렌에 노출된 작업장의 근로자로부터 혈액시료를 얻어 관찰 및 분석함으로써 트리클로로에틸렌의 인체 노출 정도에 따라 특이적으로 발현이 증가 혹은 감소하는 유전자를 발굴하고 트리클로로에틸렌의 인체 노출시 유전자 발현 여부를 검출할 수 있는 바이오 마커 및 이를 이용한 인체 노출 여부를 확인하는 방법을 확립하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 트리클로로에틸렌의 인체 노출 정도에 따라 특이적으로 발현이 증가 혹은 감소하는 바이오 마커 및 상기 바이오 마커를 이용한 트리클로로에틸렌에 대한 인체 노출 여부를 확인하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 트리클로로에틸렌의 인체 노출 정도에 따라 특이적으로 발현 변화를 일으키는 것을 특징으로 하는 트리클로로에틸렌의 인체 노출 여부 확인용 바이오 마커를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 바이오 마커 유전자 서열의 전부 또는 일부를 포함하는 올리고뉴클레오티드 또는 이의 상보가닥 분자가 집적된 트리클로로에틸렌에 대한 인체 노출 여부 확인용 DNA 마이크로어레이 칩을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 바이오 마커를 이용한 트리클로로에틸렌의 인체 노출 정도에 따라 발현 변화를 일으키는 특이적인 유전자 발현 여부를 확인하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 트리클로로에틸렌의 인체 노출 정도에 따라 발현 변화를 일으키는 특이적인 유전자의 발현 여부 확인용 검색 키트를 제공한다.

아울러, 본 발명은 본 발명은 상기 본 발명의 바이오 마커 유전자를 증폭시키는 프라이머 세트를 포함하는 트리클로로에틸렌의 인체 노출 정도에 따라 발현 변화를 일으키는 특이적인 유전자 발현 여부 확인용 키트를 제공한다.

본 발명의 트리클로로에틸렌의 인체 노출 정도에 따라 발현이 변화하는 특이적인 발현 여부 확인용 바이오 마커 및 이를 이용한 확인 방법은 DNA 마이크로어레이 칩을 통하여 선별된 반응 유전자들을 바이오 마커로 이용하여 트리클로로에틸렌의 모니터링 및 인체 위해성을 판정하는데 유용하며, 트리클로로에틸렌에 의해 야기되는 독성 작용 기작을 규명하는 도구로 이용할 수 있다.

도 1은 마이크로어레이 칩을 이용한 톨루엔과 트리클로로에틸렌에 노출된 인간 혈액시료에서의 유전자 발현 양상을 분석한 결과를 나타내는 그림이다.
도 2는 톨루엔과 비교 분석 시 트리클로로에틸렌에서만 특이적으로 발현 변화를 보인 유전자 발현을 분석한 결과를 나타낸 그림이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 트리클로로에틸렌의 인체 노출 정도에 따라 특이적으로 발현 변화를 일으키는 것을 특징으로 하는 트리클로로에틸렌의 인체 노출에 특이적인 유전자의 발현 여부 확인용 바이오 마커를 제공한다.

상기 트리클로로에틸렌의 인체 노출 정도에 따라 특이적으로 발현 변화를 일으키는 유전자는 하기와 같이 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하나, 이에 한정되지 않는다: 유전자 등록번호(Genebank) NM_138693(KLF14, Kruppel-like factor 14), 유전자 등록번호(Genebank) NM_006254(PRKCD, protein kinase C, delta (PRKCD), transcript variant 1), 유전자 등록번호(Genebank) NM_032199(ARID5B, AT rich interactive domain 5B (MRF1-like)), 유전자 등록번호(Genebank) THC2544148(THC2544148, Q6TXI7_RAT (Q6TXI7) LRRGT00012, partial (5%) [THC2506462])

상기 바이오마커는 p-value < 0.00001인 유전자들 중 1.3 fold change 이상으로 유의성 있게 발현을 보인 유전자로써, 트리클로로에틸렌의 인체 노출지표인 요중 총삼염화물의 농도에 따라 그 발현이 증가 혹은 감소한 유전자 4종으로 구성되어 있다.

본 발명자들은 트리클로로에틸렌의 인체 노출 정도에 따라 발현 변화를 일으키는 특이적인 유전자 발현 여부 확인용 바이오 마커를 발굴하기 위하여, 인천지역 소재의 트리클로로에틸렌을 취급하는 S사업장의 근로자들을 대상으로 하였으며 사업장의 작업환경을 측정한 결과(N=3) 트리클로로에틸렌에 노출되는 것으로 추정되었다(표 1). 본래 생물학적 모니터링 대상자를 선정하기 위해서는 사업장 전체 근로자의 개인 노출 농도가 바람직하나 본 연구에서는 09년 노동부 작업환경측정 정도관리 규정에 의하여 시행한 결과를 토대로 사업장별로 3개 지점의 측정치를 이용하였다.

물질별 공기 중 노출 정도(작업환경측정 결과)

사업장명	물질명	작업환경측정 결과(ppm)			노출기준(ppm)
		1 지점	2 지점	3 지점
S 사업장	T.C.E	27.08	0.48	8.68	50

이후 상기 농도의 트리클로로에틸렌에 노출된 근로자의 혈액시료와 트리클로로에틸렌에 노출되지 않은 근로자의 혈액시료로부터 mRNA를 분리하여 증폭시킨 후 형광물질(Cy3)로 표지하였다. 상기 형광 표지된 aRNA(amplified RNA)를 44 k 올리고마이크로어레이 칩 Human whole genome microarray(Agilent, USA)와 혼성화하였고, 형광 이미지를 스캔하여 유전자 발현 양상의 차이를 분석하였다(도 1 참조). 분석 시 비노출군에 비해 유의하게 발현 변이를 나타낸 유전자들을 Parametric test use all available estimates, Multiple Testing Correction - Benjamini and Hochberg False Discovery Rate를 통해서 p-value < 0.00001인 유전자들 중 1.3 fold change 이상 증가 혹은 감소하는 유전자들로 선별하였다. 이때, 다른 대표적인 휘발성 유기 화합물류 중 하나인 톨루엔에 의한 유전자 발현 프로파일과 비교분석 시 두 물질 모두에서 공통으로 발현된 유전자 40종을 제외한 트리클로로에틸렌에서만 특이적으로 발현이 변화한 유전자를 선별한 결과 증가한 유전자가 45종, 감소된 유전자가 20종으로 총 65종이었다. 이 중 트리클로로에틸렌의 인체 노출지표인 요중 총삼염화물의 농도에 따라 그 발현이 증가 혹은 감소한 유전자 4종을 선정하였다. 상기 유전자 중 2종은 다른 화학물질에 의해서 트리클로로에틸렌에 의한 주된 영향인 각종 염증반응, 중추신경계 장애, 수면장애 등의 일반적 증상이 있을 수 있으며, 드물게는 면역계통의 장애로 백혈병 등에 관여한다고 보고되었으나(표 2), 본 발명에서 사용한 트리클로로에틸렌을 처리했을 때, 실제 인체에서 같은 증상을 나타낸다는 보고는 없다.

PKRCD, ARID5B 발현과 관련 질병

등록번호	유전자 약어	유전자명	관련 질병
NM_006254	PRKCD	protein kinase C, delta (PRKCD), transcript variant 1, mRNA [NM_006254]	백혈병(Leukemia)
			백혈구 감소증(Leukopenia)
			림프종(lymphoma)
			정신 질환(Memory Disorders)
			알츠하이머(AlzheimerDisease)
			자폐증(AutisticDisorder)
NM_032199	ARID5B	AT rich interactive domain 5B (MRF1-like) (ARID5B), mRNA [NM_032199]	감염(Inflammation)
			우울증(Depressive disorder)
			긴장이상(Dystonia)
			발작(Seizures)
			자궁근종(Leiomyoma)
			백혈병(Leukemia)
			백혈구증가증(Leukocytosis)
			백질연화증(Leukomalacia)

또한, 본 발명은 상기 바이오 마커 유전자 서열의 전부 또는 일부를 포함하는 올리고뉴클레오티드 또는 그의 상보 가닥 분자가 집적된 트리클로로에틸렌에 특이적인 인체 노출 여부 확인용 DNA 마이크로어레이 칩을 제공한다.

상기 올리고 뉴클레오티드 또는 이의 상보가닥 분자는 상기 바이오 마커 유전자의 18 내지 30개의 핵산을 포함하고, 바람직하게는 20 내지 25개의 핵산을 포함한다.

본 발명의 트리클로로에틸렌 검색용 DNA 마이크로어레이 칩은 당업자에게 알려진 방법으로 제작할 수 있다. 상기 마이크로어레이 칩을 제작하는 방법은 하기와 같다. 상기 탐색된 바이오 마커를 탐침 DNA 분자로 이용하여 DNA 칩의 기판상에 고정화시키기 위해 파이조일렉트릭(piezoelectric) 방식을 이용한 마이크로피펫팅(micropipetting)법 또는 핀(pin) 형태의 스폿터(spotter)를 이용한 방법 등을 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 바람직한 실시예에서는 핀 형태의 스폿터인 마이크로어레이를 이용하였다. 상기 DNA 마이크로어레이 칩의 기판은 아미노-실란(amino-silane), 폴리-L-라이신(poly-L-lysine) 및 알데히드(aldehyde)로 이루어진 군에서 선택되는 하나의 활성기가 코팅된 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 기판은 슬라이드 글래스, 플라스틱, 금속, 실리콘, 나일론 막, 및 니트로셀룰로스 막(nitrocellulose membrane)으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며, 본 발명의 바람직한 실시예에서는 아미노-실란이 코팅된 슬라이드 글래스를 이용하였다.

본 발명은 하기와 같은 과정을 포함하는 트리클로로에틸렌의 인체 노출 정도에 따라 발현이 변화하는 특이적인 유전자 발현 여부를 확인하는 방법을 제공한다:

1) 트리클로로에틸렌이 노출된 인체로부터 수득된 실험군 혈액 시료 및 톨루엔이 노출되지 않은 인체로부터 수득된 대조군 혈액으로부터 RNA를 분리하는 단계;

2) 단계 1)의 실험군과 대조군의 RNA를 증폭하여 실험군과 대조군을 형광물질로 표지하는 단계;

3) 단계 2)의 형광물질로 표지된 aRNA(amplified RNA)를 제 1항의 DNA 마이크로어레이 칩과 혼성화시키는 단계;

4) 단계 3)의 반응한 DNA 마이크로어레이 칩을 분석하는 단계; 및

5) 단계 4)의 분석한 데이터에서 제 1항의 DNA 마이크로어레이 칩에 집적된 유전자의 발현 정도를 대조군과 비교하여 확인하는 단계.

상기 노출 여부를 확인하는 방법에 있어서, 단계 1)의 혈액시료는 트리클로로에틸렌에 노출되거나 노출되지 않은 근로자의 그룹으로부터 수득되는 것을 사용하는 것이 바람직하다.

상기 노출 여부를 확인하는 방법에 있어서, 단계 3)의 형광물질은 Cy3, FITC(poly L-lysine-fluorescein isothiocyanate), RITC(rhodamine-B-isothiocyanate) 및 로다민(rhodamine)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 당업자에게 알려진 형광물질은 모두 사용 가능하다.

상기 노출 여부를 확인하는 방법에 있어서, 단계 5)의 DNA 마이크로어레이 칩은 Whole Human Genome Microarray(operon, USA)등을 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 인간 게놈 중 본 발명에서 상기 유전자(표 7 참조)가 탑재된 마이크로어레이 칩이라면 사용 가능하고, 상기 본 발명자가 제작한 DNA 마이크로어레이 칩을 사용하는 것이 가장 바람직하다. 또한, 단계 5)의 분석 방법은 GeneSpring GX 7.3.1(Agilent Technology, USA) software를 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 당업자에게 알려진 분석 소프트웨어를 사용하여도 무방하다.

또한, 본 발명은 트리클로로에틸렌의 인체 노출 정도에 따라 발현 변화를 일으키는 특이적인 유전자 발현 여부 확인용 키트를 제공한다.

본 발명은 상기 본 발명에서 제작한 DNA 마이크로어레이 칩을 포함하는 트리클로로에틸렌의 인체 노출 정도에 따라 발현 변화를 일으키는 특이적인 유전자 발현 여부 확인용 키트를 제공한다.

상기 확인용 키트에 추가적으로 음성 대조군 및 양성 대조군의 인간 혈액시료를 포함하는 트리클로로에틸렌의 인체 노출 정도에 따라 발현 변화를 일으키는 특이적인 유전자 발현 여부 확인용 키트를 제공한다. 상기 인간 혈액시료는 트리클로로에틸렌에 노출되거나 노출되지 않은 근로자의 그룹으로부터 수득되는 것을 사용하는 것이 바람직하다.

상기 키트에 추가적으로 형광물질을 포함할 수 있으며, 상기 형광물질은 스트렙아비딘-알칼리 탈인화효소 접합물질(strepavidin-like phosphatease conjugate), 화학형광물질(chemiflurorensce) 및 화학발광물질(chemiluminescent)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 바람직한 실시예에서는 Cy3를 사용하였다.

상기 키트에 추가적으로 반응 시약을 포함시킬 수 있으며, 상기 반응 시약은 혼성화에 사용되는 완충용액, RNA로부터 cDNA를 합성하기 위한 역전사효소, cNTPs 및 rNTP(사전 혼합형 또는 분리 공급형), 형광 염색제의 화학적 유도제와 같은 표식시약, 세척 완충용액 등으로 구성될 수 있으나 이에 한정된 것은 아니며, 당업자에게 알려진 DNA 마이크로어레이 칩의 혼성화 반응에 필요한 반응 시약은 모두 포함시킬 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 연구모집단 및 혈액시료 수득

<1-1> 연구모집단

노출군과 비노출군 근로자들은 연세대학교 의과대학 산업보건연구소 연구원들에 의해 모집되었다. 본 연구의 모집단은 S업체의 트리클로로에틸렌에 노출되거나 노출되지 않은 근로자들(N=24)로 구성되었다(표 3). 마이크로어레이를 위한 시료(N=17)는 성별, 연령분포, 근무경력, 흡연이나 음주 등의 생활습관, 평균 근무시간 등의 요인들과 무관하게 선정하였으며 약물 복용자는 제외하였고 또한 실험 진행을 위한 RNA의 상태가 양호하지 못한 시료는 제외하고 수득하였다. 실험에 앞서 본 연구방법은 IRB 위원회로부터 평가되고 인증받았으며(승인번호 4-2009-0275), 실험에 앞서 모든 참가자는 동의서를 읽고 서명하였다.

유전자 발현 시료 구성표

트리클로로에틸렌 노출군	트리클로로에틸렌 비노출군
13 번	1-1
14 번	2-2
15 번	3-3(약물복용)
16 번(약물 복용)	4-4
17 번(약물 복용)	5-5
18 번	6-6
	7-7
	8-8
	9-9(약물복용)
	10-10(약물복용)
	11-11
	12-12
	13-13 번
	14-14 번
	15-15 번
	16-16 번(약물 복용)
	17-17 번
	18-18 번(약물 복용)

<1-2> 연구모집단의 피검화합물 노출여부 확인

산업안전보건법 제43조[건강진단], 동법 시행규칙 제99조 3항[특수건강 진단실시]에 적용되는 검사항목 중 유해물질의 생체지표물질 분석방법을 활용하여 요중 총 삼염화물 분석을 하였다. 측정을 위하여 노출군 및 비노출군 근로자의 작업 전 소변과 주말작업 종료시 소변으로 2회에 걸쳐 채취하여 작업 전, 후의 트리클로로에틸렌 개인 노출량에 차이가 있는지를 검정하였으며, 노출군과 비 노출군의 농도 평균을 비교하였다(표 4).

요중 총 삼염화물 분석 결과

노출군	요중 총삼염화물 (㎎/ℓ )		비노출군	요중 총삼염화물 (㎎/ℓ )
노출군	작업전	작업후	비노출군	작업전	작업후
13	20.95	31.08	13-13	4.03	2.85
14	11.32	12.53	14-14	2.67	2.90
15	5.01	5.42	15-15	0.89	0.58
16	7.59	9.79	16-16	0.97	0.88
17	8.78	10.65	17-17	0.58	0.58
18	17.73	28.27	18-18	1.46	0.58
Median (min-max)	10.050 (5.01-20.95)	11.590 (5.42-31.18)	Median (min-max)	1.215 (0.58-4.03)	0.730 (0.58-2.90)
P-value	0.028		P-value	0.138
P-value	0.004

<1-3> 혈액시료

동의서를 받은 후, 혈액시료는 연구 간호사에 의해 PAXgene Blood RNA tube를 사용하여 수득하였으며 -20℃에서 24시간 보관 후 -80℃에서 보관하였다.

< 실시예 2> 마이크로어레이 실험

<2-1> 표적 RNA 의 분리

트리클로로에틸렌의 노출군과 비노출군 혈액시료로 부터의 RNA 추출은 Human blood RNA kit(Qiagen, USA)를 사용하여 정제하였다. 게놈 DNA는 RNA 정제 동안 RNase-free DNase set(Qiagen, USA)를 사용하여 제거하였다. 각 전체 RNA 시료의 양은 Nanodrop(NanoDrop Technologies Inc, USA)을 이용하여 측정하였고, 농도는 Experion(Automated Electrophoresis station, Bio-Rad) 로 확인하였다.

<2-2> RNA 증폭

올리고 마이크로어레이 분석을 위하여 실시 예 2-1에서 수득한 트리클로로에틸렌 처리군의 전체 RNA가 다소 적은 양이므로 RNA 증폭 과정을 Kreatech의 RNA ampULSe kit(GEA-002)의 amplification protocol에 따라 진행하였다. 상기 수득한 전체 RNA 1 ㎍과 올리고(dT) 프라이머 1 ㎍/㎕과 혼합하고 70℃에서 10분간 반응시킨 후 바로 얼음에 넣어 어닐링(annealing)시켰다. 상기 어닐링된 RNA의 역전사(Reverse Transcript) 반응을 위해 반응 혼합물에 2 ㎕의 10× first strand 버퍼, 4 ㎕ dNTPs mixture, 최종적으로 200U의 SuperScript^TMII(Invitrogen,CA)RNaseH Reverse Transcriptase를 혼합한 후 42℃에서 2시간 동안 반응을 하였다. 이후, second strand cDNA를 합성하기 위해 표 5와 같이 시약을 혼합하여 16℃에서 2시간 반응을 진행하였다.

구성	부피(㎕)
10×second strand buffer	10
dNTPs	4
DNA polymerase	2
RNase H	1

cDNA 합성 반응이 끝난 후 합성된 cDNA에서 세포 내 전사를 통해서 aRNA를 합성하기 위해 표 6과 같이 시약을 혼합하였다.

구성	부피(㎕)
T7 rNTP mixture	16
T7 10×reaction buffer	4
T7 enzyme mix	4

증폭된 aRNA는 농축을 거쳐 완전히 건조시킨 후 획득하였으며 획득된 aRNA 2 ㎍에 Cy3-ULS와 10X labeling solution을 첨가하고 표지화하였다. 이때 시료는 Microcon YM-30 컬럼(Millipore, USA)을 사용하여 혼합, 정제되었다. 발광 표지된 aRNA의 양은 Nanodrop을 이용하여 측정하였고, 농도는 Experion으로 확인하였다.

<2-3> 혼성화 반응

혼성화 및 세척 과정은 지노첵(주)의 지시방법에 따라 수행되었다. 혼성화는 12시간 동안 62℃ 오븐에서 수행되었다. DNA 마이크로어레이 칩으로는 44 k Whole Human Genome Oligo Microarray(Agilent, USA)를 이용하였다. 세척(5분간 2× SSC/0.1% SDS에 세척, 5분간 1× SSC, 10분간 0.2× SSC에 세척) 후 슬라이드는 20초간 3,000 rpm으로 원심분리하여 건조하였다.

<2-4> 형광 이미지 획득

슬라이드 상의 혼성화 이미지는 Agilent scanner(Agilent technologies, USA)로 스캔하였다. 결합하지 않은 유전자를 세척한 칩은 레이저 광 스캐너(laser fluorescence scanner)를 사용하여 형광 이미지를 획득하였다. 스캔한 이미지들은 유전자 발현 비율을 얻기 위하여 Feature Extraction v10.7 software(Agilent technologies, USA)로 분석하였다(도 1). 이렇게 하여 얻어진 데이터를 톨루엔의 데이터와 비교분석 후 이로부터 트리클로로에틸렌에 대한 특이적인 마커 유전자를 선별하였다(도 2).

그 결과, 올리고 칩 상에 존재하는 대략 4만 4천 개의 유전자 중에서 트리클로로에틸렌에 의해 비노출군에 비해 유의하게 발현 변이를 나타낸 유전자들을 Parametric test use all available estimates, Multiple Testing Correction - Benjamini and Hochberg False Discovery Rate를 통해서 p-value < 0.00001인 유전자들 중 1.3 fold change 이상 증가 혹은 감소하는 유전자들로 선별하였다. 이때, 다른 대표적인 휘발성 유기 화합물류 중 하나인 톨루엔에 의한 유전자 발현 프로파일과 비교분석 시 두 물질 모두에서 공통으로 발현된 유전자 40종을 제외한 트리클로로에틸렌에서만 특이적으로 발현이 변화한 유전자를 선별한 결과 증가된 유전자가 45종, 감소된 유전자가 20종으로 총 65종이었다. 이 중 트리클로로에틸렌의 인체 노출지표인 요중 총삼염화물의 농도에 따라 그 발현이 증가 혹은 감소한 유전자 4종을 선정하였다. 상기 유전자 중 2종은 다른 화학물질에 의해서 트리클로로에틸렌에 의한 주된 영향인 각종 염증반응, 중추신경계 장애, 수면장애 등의 일반적 증상이 있을 수 있으며, 드물게는 면역계통의 장애로 백혈병 등에 관여한다고 보고되었으나(표 2), 본 발명에서 사용한 트리클로로에틸렌을 처리했을 때, 실제 인체에서 같은 증상을 나타낸다는 보고는 없다.

트리클로로에틸렌의 노출 정도에 따라 발현이 증가하는 유전자

시료수			T13	T18	T14	T15
요중 총삼염화물 분석 결과(㎎/ℓ)			31.08	28.27	12.53	5.42
등록번호	유전자명	유전자 약어	중간값의 비
NM_138693	Kruppel-like factor 14 (KLF14), mRNA [NM_138693]	KLF14	1.92	1.81	1.81	1.77
NM_006254	protein kinase C, delta (PRKCD), transcript variant 1, mRNA [NM_006254]	PRKCD	1.86	1.86	1.82	1.81
NM_032199	AT rich interactive domain 5B (MRF1-like) (ARID5B), mRNA [NM_032199]	ARID5B	0.40	0.41	0.46	0.50
THC2544148	Q6TXI7_RAT (Q6TXI7) LRRGT00012, partial (5%) [THC2506462]	THC2544148	0.70	0.72	0.72	0.74

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명은 휘발성 유기 화합물류 중의 하나인 트리클로로에틸렌(Trichloroethylene)의 인체 노출 정도에 따라 발현 변화를 일으키는 특이적인 유전자 발현을 DNA 마이크로어레이 칩을 통하여 바이오 마커로 선별하여, 이들을 이용한 확인 키트 및 마이크로칩을 개발하여 환경 중 노출된 인체 시료에서 톨루엔의 오염을 모니터링 및 판정하는데 유용하게 사용될 수 있다.

Claims

하기 모든 유전자 또는 그의 상보가닥 분자가 집적된 트리클로로에틸렌의 인체 노출 정도에 따라 발현 변화를 일으키는 특이적인 유전자 발현 여부 확인용 DNA 마이크로어레이 칩:
유전자 등록번호(Genebank) NM_138693(KLF14, Kruppel-like factor 14), 유전자 등록번호(Genebank) NM_006254(PRKCD, protein kinase C, delta (PRKCD), transcript variant 1), 유전자 등록번호(Genebank) NM_032199(ARID5B, AT rich interactive domain 5B (MRF1-like)), 유전자 등록번호(Genebank) THC2544148(THC2544148, Q6TXI7_RAT (Q6TXI7) LRRGT00012, partial (5%) [THC2506462]).
1) 실험군으로서 피검체 유래 혈액 시료 및 트리클로로에틸렌이 노출되지 않은 인체로부터 수득된 대조군 혈액으로부터 RNA를 분리하는 단계;
2) 단계 1)의 실험군과 대조군의 RNA를 증폭하여 실험군과 대조군을 형광물질로 표지하는 단계;
3) 단계 2)의 형광물질로 표지된 aRNA(amplified RNA)를 제 1항의 DNA 마이크로어레이 칩과 혼성화시키는 단계;
4) 단계 3)의 반응한 DNA 마이크로어레이 칩을 분석하는 단계; 및
5) 단계 4)의 분석한 데이터에서 제 1항의 DNA 마이크로어레이 칩에 집적된 유전자의 발현 정도를 대조군과 비교하여 확인하는 단계를 포함하는 트리클로로에틸렌의 인체 노출 정도에 따라 발현 변화를 일으키는 특이적인 유전자 발현 여부를 확인하는 방법.
제 2항에 있어서, 단계 1)의 혈액시료는 트리클로로에틸렌에 노출되거나 노출되지 않은 인체로부터 수득되는 것을 특징으로 하는 트리클로로에틸렌의 인체 노출 정도에 따라 발현 변화를 일으키는 특이적인 유전자 발현 여부를 확인하는 방법.
제 2항에 있어서, 단계 3)의 형광물질은 Cy3, FITC(poly L-lysine-fluorescein isothiocyanate), RITC(rhodamine-B-isothiocyanate) 및 로다민(rhodamine)으로 이루어진 군으로부터 선택하여 사용하는 것을 트리클로로에틸렌의 인체 노출 정도에 따라 발현 변화를 일으키는 특이적인 유전자 발현 여부를 확인하는 방법.
제 1항의 DNA 마이크로어레이 칩을 포함하는 것을 특징으로 하는 트리클로로에틸렌의 인체 노출 정도에 따라 발현 변화를 일으키는 특이적인 유전자 발현 여부 확인용 키트.
제 5항에 있어서, 음성 대조군 및 양성 대조군의 인간 혈액시료를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 트리클로로에틸렌에 특이적인 인체 노출 여부 확인용 키트.
하기 각각의 유전자를 증폭시키는 프라이머 세트를 모두 포함하는 트리클로로에틸렌의 인체 노출 정도에 따라 발현이 변화하는 특이적인 유전자 발현 여부 확인용 키트:
유전자 등록번호(Genebank) NM_138693(KLF14, Kruppel-like factor 14), 유전자 등록번호(Genebank) NM_006254(PRKCD, protein kinase C, delta (PRKCD), transcript variant 1), 유전자 등록번호(Genebank) NM_032199(ARID5B, AT rich interactive domain 5B (MRF1-like)), 유전자 등록번호(Genebank) THC2544148(THC2544148, Q6TXI7_RAT (Q6TXI7) LRRGT00012, partial (5%) [THC2506462]).