KR101661547B1 - 환경유해물질 검출용 바이오마커 및 이를 이용한 환경유해물질의 검출 방법 - Google Patents

환경유해물질 검출용 바이오마커 및 이를 이용한 환경유해물질의 검출 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 새로운 환경유해물질 검출용 바이오마커 및 이를 이용한 환경유해물질의 검출 방법에 관한 것이다.
본 발명의 방법에 따르면 종래의 고전적인 위해성 평가방법에서 해결할 수 없었던 극미량, 장기간 노출의 독성문제나 통계에 의존한 가상적인 위해성 평가방법에 사용할 수 있는 휘발성 유기화합물, 잔류성 유기화합물 또는 다환 방향족 탄화수소 검출용 바이오마커 유전자를 효과적으로 스크리닝할 수 있다.
뿐만 아니라, 본 발명의 방법에 따라 선별된 바이오마커 유전자는 휘발성 유기화합물, 잔류성 유기화합물 또는 다환 방향족 탄화수소 검출 목적으로 용이하게 사용될 수 있다.
휘발성 유기화합물, 잔류성 유기화합물, 다환 방향족 탄화수소, 바이오마커

Description

환경유해물질 검출용 바이오마커 및 이를 이용한 환경유해물질의 검출 방법{BIOMARKER FOR DETECTING ENVIRONMENTALLY HAZARDOUS CHEMICALS AND METHOD FOR DETECTING HAZARDOUS CHEMICALS USING THE SAME}
본 발명은 새로운 환경유해물질 검출용 바이오마커 및 이를 이용한 환경유해물질의 검출 방법에 관한 것이다. 더 구체적으로는, 본 발명은 세포주를 사용한 휘발성 유기 화합물 (VOC), 다환 방향족 탄화수소 (PAH), 및 잔류성 유기 오염물질 (POP)을 포함하는 환경유해물질 검출용 바이오마커 스크리닝 방법, 바이오마커 및 이를 이용한 환경유해물질의 검출 방법에 관한 것이다.
휘발성 유기화합물(Volatile Organic Compounds: VOCs), 잔류성 유기화합물(Persistent organic pollutants: POPs), 다환 방향족 탄화수소다환 방향족 탄화수소(polyaromatic hydrocarbon: PAH)를 포함한 환경유해물질은 대기중에 휘발돼 악취나 오존을 발생시키는 탄화수소화합물을 일컫는 말로, 피부접촉이나 호흡기 흡입을 통해 신경계에 장애를 일으키는 발암물질이다. 이들 화합물은 대부분 저 농도에서도 악취를 유발하며, 화합물 자체로서도 환경 및 인체에 직접적으로 유해하거나 대기 중에서 광화학반응에 참여하여 광화학산화물등 2차 오염물질을 생성하기도 한다.
휘발성 유기화합물은 대기중에 휘발하여 악취나 오존을 발생시키는 탄화수소화합물을 일컫는 말로, 국내에서는 탄화수소류중 레이드 증기압이 10.3 킬로파스칼 (또는 1.5 psia)이상인 석유화학제품·유기용제 기타 물질로서 고시로 정하는 물질로 관리하고 있다. 미국 및 유럽에서는 대기 중에서 태양광선에 의해 질소산화물(NOx)과 광화학적 산화반응을 일으켜 지표면의 오존농도를 증가시켜 스모그현상을 일으키는 유기화합물질로 정의한다.
휘발성 유기화합물은 피부접촉이나 호흡기 흡입을 통해 신경계에 장애를 일으키는 발암물질이다. 이들 휘발성 유기화합물은 대개의 경우 저농도에서도 악취를 유발하며, 화합물 자체로서도 환경 및 인체에 직접적으로 유해하거나 대기 중에서 광화학반응에 참여하여 광화학산화물 등 2차 오염물질을 생성하기도 한다.
즉, 대기중의 휘발성유기화합물질(VOC)의 가장 중요한 역할은 NOx와 같이 존재하여 OH 라디칼(Radical)과 반응하여 오존을 생성시켜서 광화학옥시단트의 원인물질이 되는 것이다.
VOC + 2NO + 2O2 → H2O + 2NO2 + R′C(O) R″
NO2 + hv → NO + O
O + O2 + M → O3 + M
∴ VOC + 3O2 → H2O + O3 + R′C(O) R″
다환 방향족 탄화수소(polyaromatic hydrocarbon: PAHs)는 여러 방향족 고리로 구성되고 헤테로 원자나 치환기를 함유하지 않는 화합물로 정의 된다. PAHs는 오일, 석탄 및 타르 침전물에서 발견되고 화석연료 또는 바이오매스 연료 같은 연료 연소의 부산물로 생성되기도 한다. 여기에 속하는 화합물 중 몇몇은 발암물질, 돌연변이 유발물질 및 기형 유발물질로 분류되기 때문에 환경 및 인체에 대한 중요한 오염원으로 인식되고 있다. PAHs는 구운 고기와 같은 조리된 음식에서 발견되기도 한다.
PAHs는 주로 혼합물로 발생하여 조성이 복잡하고 발생과정에 따라서 조성이 다르기 때문에 PAHs를 함유하는 모든 혼합물을 상세하게 확인하기는 어려움이 있다. IPCS(International programme on chemical safety)에서는 33개의 개별 화합물(31 PAHs 및 2개의 alkyl 유도체)을 독성학적 영향 및 노출관련자료의 유효성 평가하기 위하여 선정하였다. PAH는 방향족 고리가 2 내지 4개인 경우 기체 또는 고체에 흡착된 형태로 분포하지만 5개 이상이 되면 주로 고체에 흡착된 상태로 존재한다. 배출된 대기 중의 PAHs는 오존에 의해 변화되어 분해 반응이 일어나며 NO2등과의 반응에 의해 니트로-PAH, 히드록시-PAH 및 히드로니트로-PAH등이 형성된다.
PAH의 오염원은 매우 다양하며 모든 탄소화합물의 연소과정에서 나타난다. 대다수가 화석 연료를 사용하는 산업 공정이나 자동차 배출가스 및 나무의 연소, 담배등, 쓰레게연소시 또는 용광로, 음식, 자연적으로는 화산, 산불, 원유등에서 많이 나타난다. PAH 화합물은 물에 대한 용해도가 낮고 유기용매에 대한 용해도가 큰물질이며 증기압이 비교적 낮아 입자상 물질에 흡착되어 인체에 흡수되며 일반적으로 환경발암물질에 장기간 만성적인 노출이 단기간의 급성 노출보다도 훨씬 중요하다. 일반적으로 유해폐기물 처리장, 소각장, 자동차 밀집 지역에 사는 사람들에게 PAH 노출이 심하다고 알려져 있다. 환경노출의 정상조건하에서 고농도의 PAH를 포함하는 토양, 기름, 콜타르 등에 접촉시 피부를 통해 몸으로 흡수되며 지방분을 포함하는 모든 신체조직에 유입되어 신장, 간등에 축적되며 대부분의 PAH는 분비물을 통해 체외로 빠져나간다. PAH를 포함하는 혼합물에 호홉과 피부폭로가 인간의 암과 관련이 있다는 보고들이 많으며 특히 벤조피렌은 거의 모든 동물종에서 발암성을 나타내는 물질로서 가장 주목을 받고 있다.
잔류성 유기화합물(Persistent organic pollutants: POPs)은 자연환경에서 분해되지 않고 생태계 먹이사슬을 통해 동식물 체내에 축적되어 면역체계교란, 중추 신경계 손상 등을 초해하는 유해물질로 정의된다. 주로 인간의 생산 활동이나 폐기물의 처리과정에서 생성되는 인공적인 산물이며 이 물질은 생태계에나 인체에 일단 유입되면 매우 안정적으로 존재하면서 변이현상을 유발한다. 대부분 산업생산 공정과 폐기물 저온 소각과정에서 발생하며 주요 물질로는 DDT, 알드린 등 농약류와 PCB, 헥사클로로벤젠 등 산업용 화학물질, 다이옥신, 퓨란등이 있다.
60, 70년대 이래 산업, 농약용으로 사용된 화학물질이 인체 및 환경에 미치는 폐해가 규명됨에 따라 UNEP(유엔 환경게획(United Nations Environment Programme))이 중심이 되어 화학물질 안전관리 방안을 마련하게 되었으며, 2001년 5월 12 종류의 POPs를 규제하기 위한 POPs규제 협약(스톡홀롬 협약)이 체택되었다.12 종류의 규제대상 POPs는 염화폐비닐(PCBs), 다이옥신(dioxins), 퓨란(furans), 올드린(토양살충제), 딜드린(방충제), DDT(살충제), 엔드린(살충제), 클로로덴(제초제), 헥사클로르벤젠(살충제), 마이렉스(화염억지제 또는 살충제), 톡사펜(살충제) 및 헵타클로르(토양살충제)이다.
상기 화학물질 중 염화폐비닐(Polychlorinated Biphenyls: PCBs)로 오염되면 출생 후 감각반응과 신체발육이 느리게되고 조산 위험이 있으며 지각적인 변별 장애가 나타나기도 하고 단기 기억장애를 일으킬 수 있다.
플라스틱이나 쓰레기를 소각할 때 발생하는 다이옥신(dioxins)은 염소로 치환된 두 개의 벤젠핵을 산소로 결합한 유기 화합물로서 독성이 강하며, 암을 유발하거나 기형아 출산의 원인이 된다.
퓨란은 다이옥신과 비슷한 구조를 가진 유기화합물로서 두 개의 벤젠고리가, 하나의 산소원자를 포함한 5각형 고리를 형성하면서 연결된 화합물인 디벤조푸란(dibenzofuran)들을 지칭하는데, 다이옥신과 마찬가지로 치환된 염소의 숫자와 위치에 따라 135종의 염화퓨란이 존재한다.
최근에는 빠른 산업화에 따른 환경오염이 심각해짐에 따라 극미량의 환경유해 물질의 위험성을 조기에 확인하고 분석할 수 있는 효과적인 분석 시스템이 필요하며, 특히 저 농도로 장기간 축적되는 형태의 환경유해물질노출에 의한 인간의 건강 피해 평가는 매우 중요한 환경기술로 대두되고 있다. 최근의 유해성 평가기술은 과거의 고용량으로 실험된 독성실험결과에 의존하기보다는 현실적인 생활환경에서 의 인체노출 수준을 반영할 수 있는 저용량 노출영향규명에 초점을 두고, 저용량 노출에서의 유해 영향이 나타나지 않는 수준을 고려하여 관리기준을 설정하는 방법으로 발전하고 있다.
고전적으로, 환경유해 물질들을 평가하기 위해서는 생체 외에서(in vitro), 즉 96 웰 플레이트(96 well plate)와 같은 세포배양 플레이트에서 세포를 배양한 후 독성물질을 처리하고 MTT 검정(assay)을 통해 살아있는 세포의 수를 흡광도를 통하여 검출하거나 직접 생체 내(in vivo), 즉 동물실험을 수행하여 생화학적, 혈액학적, 병리학적 소견을 보는 방법이 주로 사용되었다. 이 방법은 많은 시료와 시간이 소모되고 동물실험에서 오는 윤리적 문제가 존재한다.
유해물질의 독성평가를 위하여 E-스크린 검정(E-screen assay)을 사용할 수 있다. 검사하고자 하는 환경유해 물질의 에스트로겐 활성(estrogenicity)을 생체 외(in vitro) 방법으로 평가하는 방법으로서 Soto등이 개발하였으며 화학물질이 MCF-7 세포 (Bus cell)에 미치는 세포증식 효과를 매개변수로 하여 화학물질의 에스트로겐 활성을 평가하는 방법으로서 에스트로겐에 의하여 유도되는 유전자 발현에 기초한 검정(assay) 방법이며 클론된 MCF-7 Bus 세포를 사용하여 실험 수행한다.
에스트로겐 수용체 결합 검정(Estrogen receptor binding assay)은 미국 EPA의 EDSTAC의 Tier 1 Screening in vitro method에서 권장하는 방법으로서 에스트로겐 활성 효과의 분자적 기작을 밝히는데 필요한 방법이며 간편하고 빠르게 스크리닝(screening)할 수 있는 장점이 있다.
자궁비대반응시험(Uterotrophic assay)은 에스트로겐에 의해 유발된 자궁조직 매스의 증가를 측정함으로서 에스트로겐 활성을 간접적으로 평가하는 방법이다. Uterotrophic assay는 미국 EPA의 EDSTAC에서 Tier 1 Screening in vivo method으로 권장하는 방법이며 종종 "gold standard" 방법이라 하기도 한다. 자궁비대반응시험은 에트스로겐 활성을 평가하는 데 있어 오랜 기간 동안 널리 사용되어온 방법이다. 그러나 투여경로나 세부적인 실험방법이 표준화되어 있지 않아 실험군 간의 차이도 있어 국제적으로 실험방법을 표준화하려는 노력이 진행되고 있다.
세계적으로 이러한 환경 위해성 물질들의 위해성을 예측하기 위한 많은 연구가 진행되고 있는데, 독성이 알려진 물질 및 미지의 물질에 대한 위해성을 평가하는데 마이크로어레이 기술을 이용한 DNA 칩(chip) 등 대량으로 스크린 할 수 있는 기술은 매우 유용한 것으로 판단되어 미국 등 선진국에서는 국가적으로 관련 기술 개발에 많은 노력을 기울이고 있다. 이러한 관련 기술 개발의 일환으로 현재 위해성 예측을 위한 기술로 DNA 칩 기술과 단백질 대량 스크린 기술분야에 많은 발전이 있는 실정이다. DNA 칩의 경우 그 종에서 알려진 거의 모든 유전자들에 대한 발현 스크린이 가능할 정도로 기술이 발전하였다.
이러한 기술 발전과 현재까지 DNA 칩과 같은 기술들을 이용한 독성예측기술을 개발코자 하는 많은 노력에 비해 독성예측을 위한 명확한 분석방법이 개발되지 않았기 때문에 위해성 예측을 위해서 다양한 분석적 접근이 이루어지고 있다. DNA 칩의 경우 알려진 전 유전자의 발현을 스크린 할 수 있는 기술임에도 불구하고 분석시 유전자 발현 비교분석하는 이론에 따라서 분석 결과에 차이가 있는 문제점이 보고되고 있으며, 또한 전체의 유전자를 이용한 분석보다 전체 유전자를 이용한 분석을 통해 특정 유전자를 선별하여, 선별된 소수의 특정 유전자를 이용한 분석 방법의 정확도가 오히려 높다는 연구 결과가 보고되어 있다(Russel S. Thomas 2001).
미국, 일본, EU 등 선진국에서는 환경 유해물질에 대한 환경 중 분포, 인체 노출량에 대한 조사와 함께 독성영향평가를 위한 새로운 독성유전체 기술을 이용한 시험법 개발, 작용기전 연구 등을 장기적인 전략을 수립하여 단계적으로 실시하고 있다. 그러나, 현재까지 국제적으로 통용되는 검출 및 시험 방법이 없어 연구 기관간에 시험데이터의 비교평가가 곤란한 상황이므로 국립기관 및 관련물질 생산기관에서도 공통적으로 받아들여질 수 있는 환경 유해물질 검색 시험법이 요구된다. 환경 유해물질에 대한 접근은 단순히 그 물질이 "있다" "없다"의 개념이 아닌 첨단 기술력을 바탕으로 정확한 환경 유해물질의 위해성 기작(mechanism) 분석을 통해 물질의 노출로부터 사전 예방할 수 있는 방안이 필요하며 그 연구에 독성 유전체 기술의 도입이 절실히 요청된다.
종래의 방법에서는 인체가 환경 유해물질에 노출되었을 때의 변화를 조사함으로써 현저하게 나타나는 독성은 평가할 수 있으나 아직 나타나지 않는 독성을 예측하거나 극히 미약한 위해성 평가에는 반드시 효과적이지 않는 단점이 있다. 따라서, 본 발명에서는 독성유전체 기술의 결과를 통해 잠재적인 독성을 나타내는 환경 유해물질, 특히 휘발성 유기화합물(Volatile Organic Compounds: VOCs), 잔류성 유기화합물(Persistent organic pollutants: POPs), 다환 방향족 탄화수소(polyaromatic hydrocarbon: PAH)를 예측하기 위하여 이와 같은 독성 예측, 즉 검출에 사용될 수 있는 바이오마커인 유전자를 스크리닝하는 방법 및 바이오마커를 제공하고자 한다. 또한, 이와 같은 새로운 바이오마커를 사용하여 환경유해물질을 검출하는 방법을 제공하고자 한다.
본 발명자들은 전체 유전자 마이크로 어레이를 이용하여 대표적으로 알려진 휘발성 유기화합물, 다환 방향족 탄화수소 또는 잔류성 유기화합물에 노출되었을 때 동물의 세포주에서 유의성 있는 발현의 변화를 보이는 유전자를 검색하기 위하여 한 가지 이상의 특정 휘발성 유기화합물 또는 잔류성 유기화합물 또는 다환 방향족 탄화수소 각각에 대하여 대조군 세포주과 비교하여 유의한 발현 변화를 보이는 유전자를 선별하는 경우 환경유해물질 검출에 유용한 것을 발견하였다.
따라서, 본 발명은
(a) 동물 세포주에 기지의 휘발성 유기화합물(VOC), 잔류성 유기화합물(POP) 및 다환 방향족 탄화수소(PAH)로 이루어진 군에서 선택된 한 가지 이상의 시험 화합물을 각각 독립적으로 처리한 시험 샘플에서 각각의 유전자 발현 프로파일을 검출하는 단계;
(b) 단계 (a)와는 별도로 동일 세포주에 상기 시험 화합물을 처리하지 않은 것을 제외하고는 단계 (a)와 동일한 조건으로 유지한 대조군 샘플의 유전자 발현 프로파일을 검출하는 단계; 및
(c) 단계 (a) 및 (b)의 프로파일을 비교하여 상기 한 가지 이상의 시험 화합물에서 시험 샘플과 대조군 샘플 사이의 발현 프로파일이 유의한 변화를 나타내는 유전자를 선별하여 VOC, POP 또는 PAH 검출용 바이오마커 유전자로 판단하는 단계를 포함하는, 휘발성 유기화합물, 잔류성 유기화합물 또는 다환 방향족 탄화수소 검출용 바이오마커 유전자를 스크리닝하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명의 스크리닝 방법에 의하여 선별된, 휘발성 유기화합물, 잔류성 유기화합물 또는 다환 방향족 탄화수소 검출용 바이오마커 유전자들을 제공한다.
또한, 본 발명은
(a) 환경유해물질을 포함하는 것으로 의심되는 시험 시료를 동물 세포주에 처리하는 단계;
(b) 상기 세포주로부터 얻은 시험 세포주 샘플에서 단계 (a)의 처리 전후 제 4 항의 바이오마커 유전자의 발현 프로파일을 검출하는 단계; 및
(c) 단계 (b)에서 검출된 프로파일을 시험 시료를 처리하지 않은 것을 제외하고는 단계 (a) 및 (b)와 동일한 단계를 거친 대조군 세포주 샘플의 바이오마커 유전자 발현 프로파일과 비교하여 발현에 유의한 차이를 보이는 시험 시료를 휘발성 유기화합물, 잔류성 유기화합물 또는 다환 방향족 탄화수소를 포함하는 것으로 판단하는 단계를 포함하는, 휘발성 유기화합물, 잔류성 유기화합물 또는 다환 방향족 탄화수소 검출방법을 제공한다.
더욱이, 본 발명은 하나 이상의 상기 바이오마커 유전자에 상보적으로 결합하는 프로브가 지정된 위치에 배열되어 있는, 휘발성 유기화합물, 잔류성 유기화합물 또는 다환 방향족 탄화수소 검출용 마이크로어레이를 제공한다.
이하에서는 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.
본 발명의 한 양태에서
(a) 동물 세포주에 기지의 휘발성 유기화합물(VOC), 잔류성 유기화합물(POP) 및 다환 방향족 탄화수소(PAH)로 이루어진 군에서 선택된 한 가지 이상의 시험 화합물을 각각 독립적으로 처리한 시험 샘플에서 각각의 유전자 발현 프로파일을 검출하는 단계;
(b) 단계 (a)와는 별도로 동일 세포주에 상기 시험 화합물을 처리하지 않은 것을 제외하고는 단계 (a)와 동일한 조건으로 유지한 대조군 샘플의 유전자 발현 프로파일을 검출하는 단계; 및
(c) 단계 (a) 및 (b)의 프로파일을 비교하여 상기 한 가지 이상의 시험 화합물에서 시험 샘플과 대조군 샘플 사이의 발현 프로파일이 유의한 변화를 나타내는 유전자를 선별하여 VOC, POP 또는 PAH 검출용 바이오마커 유전자로 판단하는 단계를 포함하는, 휘발성 유기화합물, 잔류성 유기화합물 또는 다환 방향족 탄화수소 검출용 바이오마커 유전자를 스크리닝하는 방법을 제공한다.
상기 단계 (a) 및 (b)는 그 세포가 가지는 가능한 모든 유전자 발현을 스크리닝할 수 있다면 어떤 수단을 이용하여도 무방하다. 바람직하게는 발현 패턴을 용이하게 검출할 수 있는 전체 게놈 올리고뉴클레오티드 마이크로어레이(whole genome oligoneucleotide microarray)를 사용할 수 있지만 이에 제한되지 않는다.
동물 세포주는 휘발성 유기화합물, 잔류성 유기화합물 또는 다환 방향족 탄화수소를 포함하는 환경유해물질에 대하여 반응할 수 있는 어떤 동물 세포주여도 무방하다. 바람직하게는 상기 세포주는 포유동물 유래이고, 더 바람직하게는 인간 세포주이지만 이에 제한되지 않는다. 환경유해물질의 스크리닝을 위한 바이오마커는 가장 우선적으로는 인체에 유해한 물질을 검출하는 것이 목적이므로 인간 세포주를 표적으로 바이오마커를 스크리닝하는 것이 가장 바람직하다.
본 발명에 이용할 수 있는 한 가지 이상의 기지의 휘발성 유기화합물, 잔류성 유기화합물 또는 다환 방향족 탄화수소는 특별히 한정되지 않는다. 이들 화합물의 악영향이 충분히 검증된 물질일수록 더욱 바람직하다. 휘발성 유기화합물은 치환 또는 비치환된 벤젠, 톨루엔, 자일렌 및 포름알데히드 계열 중에 선택되는 것이 바람직하다. 바람직하게는 본 발명의 휘발성 유기화합물은 치환 또는 비치환된 벤젠, 톨루엔, 자일렌 및 포름알데히드로 구성된 군으로부터 선택된다.
본 발명의 한 구체예에서는 본 발명의 기지의 휘발성 유기화합물(VOC)은 디 클로로메탄, 에틸렌벤젠 및 트리클로로에틸렌, 잔류성 유기화합물(POP)은 톡사펜, 헥사클로로벤젠, 및 클로로데인, 상기 다환 방향족 탄화수소(PAH)는 벤조피렌, 벤조안트라센, 페난트렌, 및 나프탈렌을 사용하여 MTT 검정에 의하여 IC50 값을 측정하여 결과의 농도로 시험 화합물을 인간 세포주에 처리하여 세포 내 전체 유전자 발현 프로필의 변화를 미처리 대조군과 비교하였다.
본 발명의 방법에서는 유전자 발현 프로필의 변화를 보이는 바이오마커 유전자를 스크리닝하기 위하여 한 가지 이상의 유기화합물, 잔류성 유기화합물 또는 다환 방향족 탄화수소를 각각 처리한 결과를 취합하여 공통적으로 발현 프로필의 유사한 변화를 보이는 유전자만을 선별한다. 따라서, 단지 한 가지의 유기화합물, 잔류성 유기화합물 또는 다환 방향족 탄화수소를 처리하여 얻은 결과와 비교하여 높은 신뢰성을 가진 일반적으로 사용 가능한 바이오마커 유전자 검출 시스템을 개시한다.
본 발명의 다른 양태에서는 새로운 유기화합물, 잔류성 유기화합물 또는 다환 방향족 탄화수소 검출용 바이오마커 유전자들을 제공한다.
본 발명의 유기화합물, 잔류성 유기화합물 또는 다환 방향족 탄화수소 검출용 바이오마커 유전자는 상기 본 발명의 방법에 의하여 스크리닝되는 어떤 유전자일 수 있다. 본 발명자들은 상기 방법에 의하여 특정 유기화합물, 잔류성 유기화합물 또는 다환 방향족 탄화수소를 처리한 결과 558 종의 바이오마커 유전자를 검출하였으나(표 1 내지 5 참조), 상기 방법을 사용하여 검출될 수 있는 유전자는 이에 제한되지 않는다.
(표 1)
Figure 112009008814756-pat00001
Figure 112009008814756-pat00002
Figure 112009008814756-pat00003
Figure 112009008814756-pat00004
(표 2)
Figure 112009008814756-pat00005
Figure 112009008814756-pat00006
(표 3)
Figure 112009008814756-pat00007
Figure 112009008814756-pat00008
(표 4)
Figure 112009008814756-pat00009
Figure 112009008814756-pat00010
(표 5)
Figure 112009008814756-pat00011
상기 표에서는 각 바이오마커 유전자의 GeneBank ID와 GeneSymbol을 나란히 표시한다. 당업자는 본 발명에 따라 스크리닝된 바이오마커 유전자를 당업계에서 사용되는, 예를 들어 Genbank와 같은, 검색 데이터베이스를 통하여 본 발명의 구체예에서 사용된 인간 뿐 아니라 다른 동물에서 유사한 기능을 가진 상동성 유전자를 본 발명의 목적과 동일하게 사용할 수 있다. 따라서, 본 발명의 바이오마커 유전자와 대응하는 다른 동물에서 발현되는 유전자들 또한 본 발명의 바이오마커 유전자의 범위 내에 있다는 것은 당업자에게 명백하다.
본 발명의 한 양태에서는 사용한 전체 게놈 올리고뉴클레오티드 마이크로어 레이 칩에 적용된 19 종의 유기화합물, 잔류성 유기화합물 또는 다환 방향족 탄화수소 처리군과 비처리군을 비교하여 1.5배 이상 발현이 증가한 유전자와 1.5배 이상 발현이 감소한 유전자 중 두 가지 휘발성 유기화합물에 대하여 공통으로 상기 발현 변화 패턴을 보인 유전자를 선별하여 표 1 내지 4에 표시하였다. 그 선별 과정은 도 6에 나타내었다.
본 발명의 또 다른 양태에서는
(a) 환경유해물질을 포함하는 것으로 의심되는 시험 시료를 동물 세포주에 처리하는 단계;
(b) 상기 세포주로부터 얻은 시험 세포주 샘플에서 단계 (a)의 처리 전후 제 4 항의 바이오마커 유전자의 발현 프로파일을 검출하는 단계; 및
(c) 단계 (b)에서 검출된 프로파일을 시험 시료를 처리하지 않은 것을 제외하고는 단계 (a) 및 (b)와 동일한 단계를 거친 대조군 세포주 샘플의 바이오마커 유전자 발현 프로파일과 비교하여 발현에 유의한 차이를 보이는 시험 시료를 휘발성 유기화합물, 잔류성 유기화합물 또는 다환 방향족 탄화수소를 포함하는 것으로 판단하는 단계를 포함하는, 휘발성 유기화합물, 잔류성 유기화합물 또는 다환 방향족 탄화수소 검출방법을 제공한다.
본 발명에서 환경유해물질을 포함하는 것으로 의심되는 샘플은 본 발명의 바이오마커 유전자가 전체 게놈 올리고뉴클레오티드 마이크로어레이 칩으로부터 스크리닝된 것이므로 동일한 세포주에서 발현 프로필 변화를 검출함에 의하여 효과적으로 휘발성 유기화합물, 잔류성 유기화합물 또는 다환 방향족 탄화수소를 포함하는 지 여부를 판단할 수 있다.
휘발성 유기화합물, 잔류성 유기화합물 또는 다환 방향족 탄화수소를 포함하는 것으로 의심되는 샘플을 처리한 군과 처리하지 않은 군의 mRNA를 분리하여 형광 Cy3-dUTP, Cy5-dUTP로 각각 표지된 전체 cDNA 를 만들어 마이크로어레이 칩과 혼성화하는 방법을 사용하여 빨간색은 대조군에서, 녹색은 실험군에서만 특이하게 발현되는 유전자의 활성 정도를 나타내고, 노란색은 녹색과 빨간색의 보색이므로 두 군에서 큰 차이가 없음을 의미한다. 전반적인 강도(intensities)는 하우스키핑 유전자의 비율에서 얻어진 상관계수를 사용하여 표준화한다. 이렇게 얻어진 발현 프로파일 데이터로부터 바이오마커 유전자에 대한 발현 패턴을 확인하면 쉽게 샘플 내의 시험 화합물 존부를 확인할 수 있다. 따라서, 본 발명의 유전자들은 상기 방법에 의하여 휘발성 유기화합물, 잔류성 유기화합물 또는 다환 방향족 탄화수소를 검색하여 판정하는데 유용하게 이용될 수 있다.
또 다른 양태에서 본 발명은 하나 이상의 상기 바이오마커 유전자에 상보적으로 결합하는 프로브가 지정된 위치에 배열되어 있는, 휘발성 유기화합물, 잔류성 유기화합물 또는 다환 방향족 탄화수소 검출용 마이크로어레이를 제공한다.
상기 프로브는 본 발명의 스크리닝 방법에 의하여 선별된 바이오마커 유전자에 대한 상보적 폴리올리고뉴클레오티드를 화학합성하여 쉽게 제작할 수 있다. 바이오마커 유전자가 선별되면 프로브의 제작은 당업자에게 주지의 어떤 방법을 사용하여 수행할 수 있다.
상기 방법은 예시적인 것일 뿐, 본 발명의 바이오마커 유전자 사용하여 고전 적인 방법으로 유전자 발현 프로파일의 변화를 측정하여 환경유해물질 존부를 확인하는 방법도 모두 본 발명의 범위 안에 있다.
본 발명의 방법에 따르면 종래의 고전적인 위해성 평가방법에서 해결할 수 없었던 극미량, 장기간 노출의 독성문제나 통계에 의존한 가상적인 위해성 평가방법에 사용할 수 있는 휘발성 유기화합물 검출용 바이오마커 유전자를 효과적으로 스크리닝할 수 있다.
뿐만 아니라, 본 발명의 방법에 따라 선별된 바이오마커 유전자는 휘발성 유기화합물 검출 목적으로 용이하게 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 바이오마커 유전자 스크리닝 방법 및 바이오마커 유전자는 실질적인 생물학적 반응에 대한 환경의 특성을 고려한 환경 유전체학(ecotoxicogenomics)연구에 유용하다.
이하의 실시예를 통하여 본 발명의 특정 구체예를 설명한다.
본 명세서에서 사용된 용어는 일반적, 사전적 의미로 한정하여 해석되어서는 안되며 본 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위하여 특정 용어의 개념을 적절한 범위 내에서 정의할 수 있다. 본 명세서 또는 당업계 종래 기술을 고려하면 여기에서 개시하는 본 발명의 범위 내에 있는 다양한 균등 또는 변형된 구체예들 또한 당업자에게 자명하다. 이하에 기재하는 구체예는 예시적인 목적으로 기술된 것일 뿐이며, 본 발명의 범위는 오직 특허청구범위에 의하여만 한정된다.
<실시예>
실시예 1: 세포배양 및 화학물질 처리
1-1 세포배양
인간 전골수성 백혈병 세포주인 HL-60 세포(한국 세포주 은행으로부터 입수)를 10% FBS가 첨가된 RPMI 배지(Gibro-BRL, USA)를 이용하여 T-75 세포배양 플라스크에서 80% 정도 컨플루언시로 자랄 때까지 배양하였다. 바이오마커 유전자 스크리닝을 위하여, 기존의 연구와 보고를 토대로 하여 휘발성 유기화합물(VOC)은 벤젠, 에틸벤젠, 디클로로메탄, o-자일렌, 트리클로로에틸렌 및 톨루엔으로, 잔류성 유기화합물(POP)은 톡사펜, 헥사클로로벤젠, 클로로데인으로, 상기 다환 방향족 탄화수소(PAH)는 벤조피렌, 벤조안트라센, 벤조플루오란텐, 크라이센, 디벤조안트라센, 인데노(1,2,3,cd)피렌, 3-메틸콜란트렌, 페난트렌, 및 나프탈렌으로 선정하였으며, 이들 각각을 DMSO에 용해시켰다. 부형제(vehicle) 농도는 모든 실험에서 0.1% 이하였다.
1-2 세포 독성 실험(MTT assay) 및 화학 물질 처리
Mossman 등(J. Immunol. Methods, 65:55-63, 1983)의 방법을 사용하여 HL-60 세포주를 이용한 MTT 실험을 수행하였다. 세포는 15 ㎖ 튜브에 1 × 106 cell/㎖ 세포 농도로 RPMI 배지(Gibro-BRL, USA)에서 DMSO에 용해된 상기 1-1 절에서 선정된 시험 화합물들 각각을 처리하였고 48시간 후에 MTT(3-4, 5-dimethylthiazol-2, 5-diphenyltetra zolium bromide) 5 ㎎/㎖을 혼합하여 튜브에 가하여 37℃에서 3 시 간 동안 배양하였다. 이 후 배지를 제거하고 형성된 포르마잔 크리스탈(formazan crystal)을 DMSO 500 ㎕에 용해하였다. 96-웰 플레이트로 옮겨 분주(aliquot)하였고 흡광도 540 ㎜에서 O.D.값을 측정하였다.
HL-60 세포주에서 시험 화합물들과 세포독성 사이의 관계를 적정하여 본 결과, 50% 생존율을 보이는 농도(IC50)는, 예를 들어 에틸벤젠, 디클로로메탄, 트리클로로에틸린에 대하여 각각 53.86 mM, 0.9854 mM, 4.112 mM이었으며, 상기 농도를 사용하여 마이크로어레이 실험을 수행하였다. 다른 화합물에 대하여도 동일한 실험을 통하여 산출된 농도를 사용하여 실험을 수행하였다.
실시예 2: 전체 RNA 분리
1 × 106 cell/㎖ 농도로 T-75 플라스크에 HL-60 세포를 분주한 후, 실시예 1-2에서 결정한 농도의 시험 화합물을 3시간 동안 처리하였다. 이후, 상기 처리한 세포로부터 트리졸(trizol) 시약(Invitrogen life technologies, USA)을 사용하여 제조사의 지시에 따라 전체 RNA를 분리하였고, RNeasy mini kit(Qiagen, USA)를 사용하여 정제하였다. 게놈 DNA는 RNA 정제 동안 RNase-free DNase set(Qiagen, USA)를 사용하여 제거하였다. 각 전체 RNA 샘플의 양은 나노드랍으로 측정하였고 질은 Agilent bioanalyzer 2100(Agilent technologies)으로 확인하였다.
실시예 3: 마이크로 어레이
3-1 표지된 전체 cDNA 제조
마이크로 어레이 분석을 위하여 참조 대조군 및 화학물질 처리 시험군의 전 체 RNA를 사용하여 cDNA를 제조하였다. 표지화(labeling) 및 혼성화(hybridization)는 MICROMAX direct cDNA microarray system(PerkinElmer life sciences, MA, USA)를 변형하여 사용하여 수행하였다. 상기에서 준비한 전체 RNA 30 내지 50 ㎍을 올리고(dT) 프라이머 2 ㎍(1 ㎍/㎕)와 혼합한 후 70℃에서 5분간 반응시킨 후 바로 얼음에 넣어 어닐링(annealing)시켰다. 다음으로, 어닐링된 RNA의 역전사(RT) 반응을 하기 위해 하기 다음과 표와 같이 시약을 혼합하였다.
Figure 112009008814756-pat00012
시험 화합물을 처리한 HL-60 세포로부터 분리한 RNA는 Cy3-dUTP(NEN, MA, USA)로 표지화(labeling)하였고, 비처리(대조군) 세포로부터 분리한 RNA는 Cy5-dUTP(NEN)를 표지화하였다. 이때 두 색은 알콜 침전형성 (Alcohol precipitation)을 사용하여 혼합, 정제되었다.
3-2 혼성화 반응
혼성화는 12시간 동안 62℃ 혼성화 오븐에서 수행되었다. 세척(62℃에서 5분간 2×SSC/0.1% SDS, 상온에서 10분간 0.1×SSC/0.1% SDS, 상온에서 1분간 0.1×SSC) 후 슬라이드는 20초간 3000rpm으로 원심분리하여 건조하였다.
3-3 형광 이미지 획득
슬라이드 상의 혼성화 이미지는 GenePix 4000B(Axon instruments)로 스캔하 였다. 결합이 되지 않은 유전자를 제거하기 위한 세척을 수행한 후 칩은 레이저 형광 스캐너(laser fluoroscence scanner)에 의해서 판독하였다. 이때 빨간색은 대조군에서 녹색은 실험군에서만 특이하게 발현되는 유전자의 활성 정도를 나타내게 되며 노란색은 녹색과 빨간색의 보색으로 두 군에서 큰 차이가 없음을 의미한다. 스캔한 이미지들은 유전자 발현 비율을 얻기 위하여 GenePix 5.1 소프트웨어(Axon Instruments, CA, USA)로 분석하였다. 전반적인 강도(intensities)는 포지티브 대조군 유전자의 비율에서 얻어진 상관 계수를 사용하여 표준화하였다. 이와 같이 얻어진 데이터로부터 상기 실시예에서 기지의 시험 화합물로 사용한 디클로로메탄, 에틸렌벤젠 및 트리클로로에틸렌을 포함하는 휘발성 유기화합물(VOC), 톡사펜, 헥사클로로벤젠, 및 클로로데인을 포함하는 잔류성 유기화합물(POP), 벤조피렌, 벤조안트라센, 페난트렌, 및 나프탈렌을 포함하는 다환 방향족 탄화수소(PAH) 각각에 대한 발현 프로파일 변화가 일치하는, 즉 동일하게 유의한 증가를 보이거나 동일하게 유의한 감소를 보이는 유전자를 선별하였다.
상기 실시예에서 사용한 전체 게놈 올리고뉴클레오티드 칩에 적용된 시험 화합물을 처리한 시험군과 대조군을 비교하여 1.5배 이상 발현이 증가한 유전자와 1.5배 이상 발현이 감소한 유전자 중 하나 이상의 시험 화합물에 대하여 공통으로 발현 변화 패턴을 보인 유전자를 선별하였다.
요약하면, 인간 세포주 샘플의 전체 RNA를 사용하여 상기 스크리닝을 수행한 결과 시험 화합물 처리에 의하여 바이오마커로 판정된 유전자는 총 285 종의 유전자였다(표 1). 또한 VOC와 PAH 처리를 통한 스크리닝에서는 총 273 유전자가 바이 오마커로 판정되었는데, 이중 VOC와 PAH 둘 다에서 공통적인 발현 특이성을 나타낸 유전자가 112 종(표 2), PAH 특이적 발현을 나타낸 유전자가 83 종(표 3), VOC 특이적 발현을 나타낸 유전자가 78 종(표 4)이다. 한편, 종래에 알려진 환경유해물질 검색 용도가 주지인 유전자 42 종(표 5) 또한 마이크로어레이 제조시 포함시켰다. 도 5에서는 본 발명에 따르는 환경유해물질 계통별 클러스터링 수행 결과를 나타내며, 도 6에서는 발현 양의 배수로 표현하여 유의한 발현량 변화를 보이는 유전자를 선별하는 데이터를 나타낸다.
바이오마커로 선정된 유전자들을 기능적으로 분류하여 도 1에서 나타내었다.
실시예 4: 선정된 유전자프로브를 사용한 검출용 마이크로어레이 제조
4-1 마이크로어레이 제조
상기 실시예 3에서 선별한 유전자 및 발현 대조군 유전자들을 포함한 500여종의 유전자에 대한 프로브를 제작하였다. 이 500여종의 프로브 DNA를 50 pmol 농도로 보정하여 384 웰 플레이트로 옮겨 넣은 후에 Genemachine 핀 타입 어레이어 (pin type arrayer)를 사용하여 수퍼아민(Superamine)으로 코팅된 CMT-GAPS2 슬라이드 글라스 (Corning Ltd., UK) 위에 심었다. 다수의 환경유해물질을 동시에 검색하기 위하여 단일 블록 위에 상기 500 여종 프로브 세트를 동일하게 8 번 반복하여 집적하여, 이러한 블록을 8 종류의 물질에 대하여 사용할 수 있도록 슬라이드에 8 개 블록을 제작하였다(도 2).
4-2 재현성과 신뢰성 검증
상기 4-1절에서 제조한 마이크로 어레이 DNA 칩을 사용하여 특정 환경유해물질에 노출된 세포 샘플의 발현 유전자 조사를 수행함으로써 제조된 DNA 칩의 재현성 및 신뢰성을 검증하였다(도 3). 사용된 화합물은 PAHs(Phenanthrene, Chrysene), VOCs(Ethylbenzene, Dichloromethane, Trichloroethylene), POPs(Chlordane, Toxaphene) 7 종이다. 또한, 대조군 반복 실험을 통하여 제조된 칩의 성능 검증을 수행하였다(도 4). 도 7은 PCA(principle component analysis)를 통한 화학물질 그룹 분석 결과를 나타낸다.
상기 결과는 본 발명의 방법이 VOC, PAH 및 POP를 포함하는 환경유해물질을 유전자 발현 수준에서 검출하는 용도의 바이오마커 유전자 스크리닝에 유용하다는 것과, 상기 유전자들이 환경유해물질 검출의 바이오마커 유전자로 유용하다는 것을 알 수 있다.
도 1은 인간세포주를 사용하여 본 발명에 의하여 휘발성 유기화합물, 잔류성 유기화합물 또는 다환 방향족 탄화수소 검출용으로 선별된 바이오마커 유전자들을 기능적으로 분류한 그래프 및 표이다.
도 2는 본 발명의 마이크로 어레이의 배열 모식도이다.
도 3은 신뢰성 검증 (Normalization box-plot)을 위한 플롯팅 결과이다.
도 4는 마이크로어레이 신뢰도 검증(control spot signal check) 결과이다.
도 5는 PAHs(Phenanthrene, Chrysene), VOCs(Ethylbenzene, Dichloromethane, Trichloroethylene), POPs(Chlordane, Toxaphene)을 이용하여 마이크로 어레이 실험을 수행한 후의 계층적 군집 분석 (Hierarchical clustering) 결과를 나타내는 사진이다.
도 6에서는 발현 양의 배수로 표현하여 유의한 발현량 변화를 보이는 유전자를 선별하는 데이터를 나타낸다.
도 7은 PCA(principle component analysis)를 통한 화학물질 그룹 분석 결과를 나타낸다.

Claims (6)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. (a) 환경유해물질을 포함하는 것으로 의심되는 시험 시료를 인간 전골수성 백혈병 세포주 HL-60에 처리하는 단계;
    (b) 상기 세포주 샘플에서 상기 단계 (a)의 처리 전 후의 아래 표 1의 환경유해물질에 특이적으로 발현하는 285종의 바이오마커, 아래 표 2의 휘발성 유기화합물(VOC) 및 다환 방향족 탄화수소(PAH) 둘 모두에 공통적으로 특이적으로 발현하는 112종의 바이오마커, 아래 표 3의 다환 방향족 탄화수소(PAH)에 특이적으로 발현하는 83종의 바이오마커 및 아래 표 4의 휘발성 유기화합물(VOC)에 특이적으로 발현하는 78종의 바이오마커의 유전자의 발현 프로파일을 검출하는 단계; 및
    (c) 시험 시료를 처리하지 않은 것을 제외하고는 단계 (a) 및 (b)와 동일한 단계를 거친 대조군 세포주 샘플의 바이오마커 유전자 발현 프로파일을 상기 단계 (b)에서 검출된 프로파일과 비교하여 발현에 차이를 보이는 바이오마커를 확인하는 단계;를 포함하는
    벤젠, 에틸벤젠, 디클로로메탄, o-자일렌, 트리클로로에틸렌 및 톨루엔으로 구성된 군으로부터 선택되는 휘발성 유기화합물; 톡사펜, 헥사클로로벤젠, 클로로데인으로 구성된 군으로부터 선택되는 잔류성 유기화합물; 벤조피렌, 벤조안트라센, 벤조플루오란텐, 크라이센, 디벤조안트라센, 인데노(1,2,3,cd)피렌, 3-메틸콜란트렌, 페난트렌, 및 나프탈렌으로 구성된 군으로부터 선택되는 다환 방향족 탄화수소;의 검출방법:
    [표 1]
    Figure 112016041625953-pat00020
    Figure 112016041625953-pat00021
    Figure 112016041625953-pat00022
    Figure 112016041625953-pat00023
    [표 2]
    Figure 112016041625953-pat00024
    Figure 112016041625953-pat00025
    [표 3]
    Figure 112016041625953-pat00026
    Figure 112016041625953-pat00027
    [표 4]
    Figure 112016041625953-pat00028
    Figure 112016041625953-pat00029
    .
  6. 아래 표 1의 환경유해물질에 특이적으로 발현하는 285종의 바이오마커, 아래 표 2의 휘발성 유기화합물(VOC) 및 다환 방향족 탄화수소(PAH) 둘 모두에 공통적으로 특이적으로 발현하는 112종의 바이오마커, 아래 표 3의 다환 방향족 탄화수소(PAH)에 특이적으로 발현하는 83종의 바이오마커 및 아래 표 4의 휘발성 유기화합물(VOC)에 특이적으로 발현하는 78종의 바이오마커 유전자에 상보적으로 결합하는 프로브가 지정된 위치에 배열되어 있는 것을 특징으로 하는,
    [표 1]
    Figure 112016041625953-pat00030
    Figure 112016041625953-pat00031
    Figure 112016041625953-pat00032
    Figure 112016041625953-pat00033
    [표 2]
    Figure 112016041625953-pat00034
    Figure 112016041625953-pat00035
    [표 3]
    Figure 112016041625953-pat00036
    Figure 112016041625953-pat00037
    [표 4]
    Figure 112016041625953-pat00038
    Figure 112016041625953-pat00039
    벤젠, 에틸벤젠, 디클로로메탄, o-자일렌, 트리클로로에틸렌 및 톨루엔으로 구성된 군으로부터 선택되는 휘발성 유기화합물; 톡사펜, 헥사클로로벤젠, 클로로데인으로 구성된 군으로부터 선택되는 잔류성 유기화합물; 벤조피렌, 벤조안트라센, 벤조플루오란텐, 크라이센, 디벤조안트라센, 인데노(1,2,3,cd)피렌, 3-메틸콜란트렌, 페난트렌, 및 나프탈렌으로 구성된 군으로부터 선택되는 다환 방향족 탄화수소;의 검출용 마이크로어레이.
KR1020090011547A 2009-02-12 2009-02-12 환경유해물질 검출용 바이오마커 및 이를 이용한 환경유해물질의 검출 방법 KR101661547B1 (ko)

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