CN103124905A - 癌症患者对ptk2抑制剂治疗的敏感性分级 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于确定癌症患者是否对蛋白酪氨酸激酶2(PTK2)抑制剂治疗敏感的方法，包括检测所述癌症患者的癌症样本中E-钙粘蛋白的表达，其中E-钙粘蛋白免疫反应评分(IRS)为0-2表明癌症患者对PTK2抑制剂治疗敏感。癌症患者的癌症样本中E-钙粘蛋白表达的所述检测优选地通过免疫组织化学(IHC)法的方式进行。所述IHC法优选采用E-钙粘蛋白特异性的第一抗体和与所述第一抗体特异性反应的第二抗体。本发明还涉及一种治疗癌症患者的方法，所述患者的癌症的特征为E-钙粘蛋白免疫反应评分(IRS)为0-2，该方法包括对患者施用治疗有效量的PTK2抑制剂。在另一方面中，本发明涉及PTK2抑制剂用于治疗癌症患者的用途，所述患者的癌症的特征为E-钙粘蛋白免疫反应评分(IRS)为0-2。本发明还提供一种筛选治疗有效的PTK2抑制剂的方法，包括步骤(a)提供癌细胞或癌细胞系，其特征在于E-钙粘蛋白免疫反应评分为2、1、或0(优选是1和进一步更优选是0)；(b)将步骤(a)的癌细胞或癌细胞系与PTK2抑制剂接触；和(c)评估该PTK2抑制剂是否对癌细胞/癌细胞系产生不利影响。在另一方面中，本发明涉及一种分级对PTK2抑制剂治疗敏感的癌症患者的方法，包括确定所述患者的癌症样品中E-钙粘蛋白的IRS评分，其中所述E-钙粘蛋白免疫反应评分(IRS)为0-2(即2、1、或0)表示癌症患者对PTK2抑制剂治疗敏感。本发明还涉及一种药物包装，其包括PTK2抑制剂，和(a)表明所述PTK2抑制剂是用于治疗癌症患者的指示和/或说明书，所述患者患有以E-钙粘蛋白免疫反应评分2、1、或0(优选是1和更优选是0)为特征的癌症；和/或(b)表明所述患者是由本发明的方法进行分级的指示和/或说明书；和/或(c)进行本文所述方法的装置。

Description

癌症患者对PTK2抑制剂治疗的敏感性分级
本发明涉及一种用于确定癌症(cancer)患者是否对蛋白酪氨酸激酶2(PTK2)抑制剂治疗敏感的方法，包括检测所述癌症患者的癌症样本中E-钙粘蛋白的表达，其中0-2的E-钙粘蛋白免疫反应性评分(IRS)表明癌症患者对PTK2抑制剂治疗敏感。癌症患者的癌症样本中E-钙粘蛋白表达的所述检测优选地通过免疫组织化学(IHC)法的方式进行。所述IHC法优选采用E-钙粘蛋白特异性的第一抗体和与该第一抗体特异性反应的第二抗体。本发明还涉及一种治疗癌症患者的方法，所述患者的癌症的特征为E-钙粘蛋白免疫反应评分(IRS)为0-2，该方法包括对患者施用治疗有效量的PTK2抑制剂。在另一方面中，本发明涉及PTK2抑制剂用于治疗癌症患者的用途，所述患者的癌症的特征为E-钙粘蛋白免疫反应评分(IRS)为0-2。本发明还提供一种筛选治疗有效的PTK2抑制剂的方法，包括以下步骤：(a)提供癌细胞或癌细胞系，其特征在于E-钙粘蛋白免疫反应评分为2、1、或0(优选是1和进一步更优选是0)；(b)将步骤(a)的癌细胞或癌细胞系与PTK2抑制剂接触；和(c)评估该PTK2抑制剂是否对癌细胞/癌细胞系产生不利影响。在另一方面中，本发明涉及一种分级对PTK2抑制剂治疗敏感的癌症患者的方法，包括确定所述患者的癌症样品中E-钙粘蛋白的IRS评分，其中所述E-钙粘蛋白免疫反应评分(IRS)为0-2(即2、1、或0)表示癌症患者对PTK2抑制剂治疗敏感。本发明还涉及一种药物包装，包括PTK2抑制剂和(a)表明所述PTK2抑制剂是用于治疗癌症患者的指示和/或说明书，所述癌症特征在于E-钙粘蛋白免疫反应评分为2、1、或0(优选是1和更优选是0)；和/或(b)表明所述患者是由本发明的方法进行分级的指示和/或说明书；和/或(c)进行本文所述方法的装置。
酪氨酸蛋白激酶2(PTK2)，也称为粘着斑激酶1(FAK1)，是一种主要定位于粘着斑的非受体酪氨酸激酶。PTK2作为通过整合素和生长因子受体传递的细胞外信号和细胞内的信号传感器之间的连接体。活化的PTK2表现为参与调节细胞存活、增殖和活力。因此，对PTK2的抑制可能抑制癌症的生长和转移的形成。之前已经描述了PTK2抑制剂而且几种化合物目前正在早期临床试验中研究。
PTK2激酶抑制剂在各种癌症实验模型中显示是有效的，特别是在免疫缺陷小鼠中的人肿瘤异种移植模型中。然而，在不同的癌症模型中其效果变化很大：在某些模型中可以实现肿瘤消退或生长的完全抑制，对其他癌症类型的治疗导致生长的部分抑制，和对某些癌症根本没有影响。已经描述了大量基因(例如EGFR、HER2或BRAF)的致癌基因突变或基因扩增(amplifications)。它们的存在确定了特定的癌症对相应的激酶抑制剂治疗的敏感性，而且通过癌细胞DNA序列或基因拷贝数的分析可以容易地确定使用这类抑制剂治疗的患者的资格。然而对于PTK2基因，在人类癌症或在对PTK2抑制敏感的预临床模型肿瘤中，目前仍没有描述任何突变或扩增。
因此，对选择最有可能受益于PTK2抑制剂治疗的患者的预测性生物标志物的鉴定是迫切需要的。目前没有这样的预测性生物标志物或治疗效果相关的遗传特征。
因此，本发明潜在的技术问题是提供用于选择对PTK2抑制剂治疗敏感的癌症患者和/或癌症类型的方式和方法。
本发明满足了这种需求并提供了细胞标志物和方法，这将允许选择对PTK2抑制剂治疗敏感的癌症患者。
在我们使用人类癌症的异种移植模型的预临床研究中，我们已惊奇地发现癌症细胞中E-钙粘蛋白的表达水平可以用来预测对PTK2抑制剂的敏感性，其可以例如用免疫组织化学(IHC)方法评估。鉴于此，我们计划在给药PTK2抑制剂前检查E-钙粘蛋白表达水平以确定癌症/癌症患者对PTK2抑制剂治疗是否敏感。本文表征并描述了本发明的另一实施方案，并反映在权利要求中。
必须指出，如本文使用的，单数形式“一”、“一个”和“一种”包括复数的指代，除非上下文另外清楚地指出。因此，例如，提及“一种试剂”包括一种或多种这样的不同试剂，提及“一种方法”包括引用那些本领域普通技术人员已知的可以进行修改或者代替本文描述的方法的等同步骤和方法。除非另有说明，一系列要素前的术语“至少”应被理解为指该系列中的每一个要素。例如“至少一个”包括一个、两个、三个、四个、五个或甚至更多个。
本领域技术人员将会认识到，或可以使用不超过常规实验确定，本文描述的本发明的具体实施方案的许多等同方式。这样的等同方式旨在被包括在本发明中。在整个说明书和下面的权利要求中，除非上下文另有要求，词语“包含”及其变体，例如“包括”和“含有”，将被理解为意指包括所述的整数或步骤或整数或步骤的组合，但不排除任何其他整数或步骤或整数或步骤的组合。
本文内容中引用了一些文献。本文引用的每一篇文献(包括所有专利、专利申请、科学出版物、制造商的手册、指导等)，无论是上文或下文，其全部内容通过引用方式并入本文。此处任何内容不应解释为承认本发明无权早于因先前发明所作的此类披露。
在第一方面中，本发明涉及一种用于确定癌症和各癌症患者是否对蛋白酪氨酸激酶2(PTK2)抑制剂治疗敏感的方法，包括检测获得自所述癌症或癌症患者的癌症样本中E-钙粘蛋白的表达，其中所述E–钙粘蛋白免疫反应评分(IRS)0-2，优选0-1，更优选IRS评分1和进一步更优选IRS评分0，表明癌症和各癌症患者对PTK2抑制剂治疗是敏感的。
“0-2”的IRS评分(或IRS)是指IRS为0、1、或2。同样，“0-1”的IRS评分是指IRS评分为0或1。本文其他地方解释了允许本领域技术人员评价在给定的肿瘤/癌症样本中评价所述IRS评分的方法。本文使用的术语“IRS”表示本文中所公开的E-钙粘蛋白的免疫反应评分。
在一个优选的实施方案中，所述检测是通过免疫组织化学(IHC)的方式进行。
可以理解的是，癌症样品优选地获得自癌症患者，但是这并不意味着从所述患者获取所述癌症样品的步骤必然包含在本发明的范围中。
“E-钙粘蛋白(E-cadherin)”或“E-钙粘素(E-cadherin protein)”，也被称为CD324、LCAM或ECAD，属于“钙粘素”(钙-依赖粘附分子)，钙粘素是一类1型跨膜蛋白。它们在细胞粘附中发挥重要作用，确保组织内的细胞结合在一起。钙粘蛋白依赖于钙离子(Ca2+)发挥功能，因此而得名。由CDH1基因编码的E-钙粘蛋白，是由五个细胞外钙粘蛋白重复、一个跨膜区、和一个高度保守的细胞质尾部组成的，可以在所有上皮组织中发现。通过细胞内附着蛋白，连接素(catenins),胞质结构域结合到肌动蛋白细胞骨架上。肌动蛋白细胞骨架形成一个介导细胞结构完整性及其极性的跨细胞网络，并且对于上皮细胞形态是重要的。
因此，E-钙粘蛋白作为上皮细胞和大多数上皮源癌症的生物标志物。最近的免疫组织化学分析表明，癌细胞上降低的E-钙粘蛋白膜表达与上皮性癌患者不良的预后特点和较低的总生存期相关(Saito T等；Cancer,2003;97:1002-9)。因此表明E-钙粘蛋白不仅如上所述是上皮细胞的生物标志物，而且也可以作为一种癌症进程的预后标志物。
最令我们惊讶的是，我们的预临床研究发现，上皮癌细胞的膜上E-钙粘蛋白降低的蛋白表达或缺乏表达，与人类癌症的动物模型中各癌症细胞对PTK2抑制的敏感性、翻译成显著的癌症生长抑制和癌症的衰退密切相关。因此，E-钙粘蛋白表达水平可以作为选择用PTK2抑制剂治疗的患者的生物标志物。这些PTK2抑制剂是本领域技术人员公知的，并且也详细描述于下文中。本发明可以证明，低表达E-钙粘蛋白的癌症，例如E-钙粘蛋白评分0-2，优选0-1，更优选IRS评分为1，进一步更优选为0(所述评分在本文中详细说明)，将比高表达E-钙粘蛋白的癌症更有可能对PTK2抑制剂治疗敏感。
“癌细胞膜”是指分离癌细胞的内部和癌细胞的外部的细胞膜。E-钙粘蛋白规律地表达于上皮细胞的细胞膜上，确保组织的细胞彼此相连以维持组织的完整性。
本文使用的术语“对PTK2抑制剂治疗敏感”，是指PTK2抑制剂可能在给药和/或将给药PTK2抑制剂的患者体内具有治疗效果。本文使用的所述术语与术语“对PTK2抑制剂治疗敏感”或“对PTK2抑制剂治疗响应”是等同的。
所谓“治疗作用”或“治疗有效”是指PTK2抑制剂可能会对于给药对象产生治疗效果。优选地，治疗效果包括由癌症的存在和/或进展造成/相关的癌症相关症状(如肿瘤的大小、转移的数量或其他症状)的进程的消退、稳定或抑制。该响应包括完全响应，部分响应，稳定的疾病(没有恶化或复发)，和/或对患者晚期复发的响应。优选地，如本文所描述的，假如所述癌细胞表达PTK2蛋白，PTK2抑制剂可能影响将经受细胞死亡的癌细胞，从而改善和/或治疗癌症患者的癌症。本发明的各方法或方法步骤的治疗效果可通过所有已建立的将指示治疗效果的方法和方式检测。另外，还可以设想，可检测患者血清中的癌症标记物(如果存在的话)，以诊断治疗方法是否有效。本领域技术人员知晓可使他或她能够观察PTK2抑制剂的治疗效果的大量其他方法。
据设想，用PTK2抑制剂治疗的患者的癌症样品是在所述PTK2抑制剂治疗之前，治疗期间和/或治疗之后获得。优选地，样品是在治疗之前获得的，以根据本发明的方式和方法确定癌症患者是否对PTK2抑制剂治疗敏感，患者是否可对PTK2抑制剂治疗作出有利的响应，或者患者是否可能从PTK2抑制剂治疗中受益。
当术语“潜在的”在治疗效果的上下文中使用时，意味着一种PTK2抑制剂(尽管基于本发明的方法的结果，认为这种抑制剂具有治疗效果)不一定必然是治疗有效的。这是因为(这是不言而喻的)本发明的方法不能对病人是否可能对PTK2抑制剂敏感提供100%安全的预测，因为，除了E-钙粘蛋白的表达，个人因素，例如年龄、体重、一般健康状况、性别、饮食、药物相互作用等可能对病人是否将对PTK2抑制剂敏感有一定的影响。
如本文使用的“治疗”或“疗法”，意味着癌症的存在和/或进展造成/相关的症状(如肿瘤的大小、转移的数量或其他症状)的进程的消退、稳定或抑制。
如本文使用的术语“癌症(cancer)”，是指恶性细胞生长和增殖，包括所有癌前期和癌细胞的细胞和组织。癌症，本文中有时也表示为恶性癌症或赘生(neoplasias)或肿瘤。转化的上皮细胞的侵入性恶性癌症，即癌瘤(carcinoma)，在本发明的实施方案中是优选的。因此，设想在本发明的实施例中，所述癌症样本基本上是由恶性上皮癌细胞组成/包括恶性上皮癌细胞。
本文所描述的癌症可以是转移性(即癌转移)或非转移性的。
可以理解的是，根据本发明的实施例，PTK2抑制剂所治疗的癌症表达PTK2蛋白。正如已经讨论的那样，本发明本质上涉及一种用于确定一位癌症患者是否对PTK2抑制剂治疗敏感的方法。因此不用说，待治疗的癌症患者是带有表达PTK2多肽的癌细胞的患者。“表达PTK2多肽的癌症”是一种包含存在有PTK2多肽的细胞的癌症。“表达PTK2多肽的癌症”任选地在其细胞中产生足够水平的PTK2多肽，使得PTK2抑制剂可以与其相互反应。可以通过不同的方式来确定PTK2多肽，即本领域技术人员清楚地知道如何测试癌症/肿瘤细胞是否为PTK2阳性。可以理解的是，在癌细胞中PTK2多肽的评价不是强制性的，即本发明的实施例不必然包括此步骤。目前，认为几乎所有相关的上皮癌表达PTK2。即便如此，正如之前所述的，PTK2激酶抑制剂的疗效在不同的癌症模型之间变化很大：在一些模型中可以实现癌症的消退或生长的完全抑制，而其他癌症类型的治疗导致部分的生长抑制，且一些癌症不会受到任何影响。因此，PTK2如此的表达显然对于PTK-2抑制剂治疗癌症的敏感性是不可预测的。本发明关闭了该间隙，其首次提供了一种合适的生物标志物，该生物标志物允许识别对PTK2抑制剂治疗敏感的癌症/肿瘤患者：如整个说明书中解释的，所述的生物标志物是E-钙粘蛋白的表达。
在本发明的上下文中，术语“癌症患者”(有时也记作“患者”或“受试者”)指具有本文描述的癌症的受试者(包括诊断为患有癌症的受试者)，但还包括进行辅助治疗，例如切除原发癌后的受试者。
优选地，所述受试者是一种哺乳动物，比如人、马、骆驼、狗、猫、猪、牛、羊或家禽。最优选的是人类受试者。因此，本发明的组合物、化合物，用途及方法适用于人类治疗和兽医应用。
“组织样本”(有时也记作“癌症样本”或“癌症的样本”等)是衍生自或获得自受试者(癌症患者)，并可以通过活检如活检针、手术活检、骨髓活检等获得。癌症样品包括肿瘤的标本、肿瘤的一部分，取自肿瘤的肿瘤细胞(包括衍生自肿瘤并在细胞培养基中生长的肿瘤细胞系)和作为整体的癌块，以及这样的肿瘤细胞系，以及来自受试者和被怀疑患癌或被怀疑含有癌细胞的细胞和/或组织。因此可以设想，癌症样本还可以包括非癌细胞。例如癌细胞和/或(微)转移瘤经常由健康的、即非癌组织包围，然后癌细胞可以在健康组织内形成细胞的亚群。因此癌症样本可以包括健康(非癌)细胞的集合和癌细胞亚群。术语“样本”与“标本”是可以互换的。
可以用PTK2抑制剂治疗的癌症的一个非限制性示例性列表包括，但不限于，以下一种或多种：肠癌包括十二指肠癌、结肠癌、直肠癌和肛门癌；胰脏癌(如胰腺癌)、膀胱癌、肺部肿瘤(小细胞肺癌(SCLC)、非小细胞肺癌(NSCLC)，例如鳞状细胞癌、腺癌(腺泡癌、乳头癌、细支气管肺泡癌)和大细胞支气管癌(巨型细胞癌、透明细胞癌)；乳腺癌，如导管癌、小叶癌、粘液癌或管状癌、Paget氏癌；子宫癌(子宫体癌或子宫内膜癌)；CUP综合征(原发不明的癌症)、卵巢癌(卵巢癌-粘液性或浆液性细胞腺癌、子宫内膜癌、透明细胞瘤、Brenner氏瘤)；胆囊癌、胆管细胞癌例如Klatskin肿瘤；睾丸癌(生发或非生发生殖细胞肿瘤)；喉癌，例如声带的声门上、声门及声门下肿瘤；头部和颈部肿瘤(HNO肿瘤)，例如嘴唇的肿瘤、和口腔肿瘤(唇、舌、口腔癌)、鼻咽癌(鼻癌、淋巴上皮瘤)，咽癌、口咽癌、扁桃体癌(扁桃体恶性肿瘤)和舌(基底)癌、下咽癌、喉癌(喉的癌症)、鼻旁窦和鼻腔内的肿瘤、唾液腺和耳朵的肿瘤；眼睑肿瘤(基底细胞癌或眼睑部位腺癌)；肝细胞癌(肝细胞癌症(HCC)；胃癌(乳突、小管或粘液腺癌、腺鳞状细胞癌、鳞状癌或未分化癌；肾癌如肾透明细胞癌、乳头状肾细胞癌，嫌色肾细胞癌和集合管癌；食道癌；阴茎癌；前列腺癌(如激素难治性前列腺癌)；阴道癌或阴道癌症；甲状腺癌，如乳头状、滤泡状、髓样或退行性甲状腺癌；尿道癌(尿道癌、尿路上皮癌)和外阴癌。
十二指肠癌、结肠癌、直肠癌和肛门癌；胰脏癌(如胰腺癌)、泌尿膀胱癌、肺部肿瘤(小细胞肺癌(SCLC)、非小细胞肺癌(NSCLC)，例如鳞状细胞癌、腺癌(腺泡癌、乳头癌、细支气管肺泡癌)和大细胞支气管癌(巨型细胞癌、透明细胞癌)；乳腺癌，如导管癌、小叶癌、粘液癌或管状癌、卵巢癌(卵巢癌-粘液性或浆液性细胞腺癌、子宫内膜癌、透明细胞瘤)；头颈部肿瘤；肝细胞癌(肝细胞癌症(HCC))；肾癌(如肾透明细胞癌、乳头状肾细胞癌，嫌色肾细胞癌和集合管癌)；前列腺癌(如激素难治性前列腺癌)；和外阴癌是非常重要的并因此优选。
蛋白酪氨酸激酶2(PTK2)，也被称为FAK、FADK、FAK1、pp125FAK、EC2.7.10.2)是一种细胞质蛋白酪氨酸激酶，发现其浓缩于粘着斑中，粘着斑是在生长于存在细胞外基质成分的环境的细胞的细胞膜上形成的。所编码的蛋白是蛋白酪氨酸激酶FAK亚家族成员，但与其他亚家族激酶缺乏显著的序列相似性。PTK2有三个功能结构域：(1)粘着定位(FAT)结构域，这对于将FAK定位于粘着斑和结合整合素相关蛋白，如桩蛋白(paxillin)和踝蛋白(talin)是非常重要的；(2)具有酪氨酸激酶活性的催化结构域；(3)N-端结构域，对于与整合素和生长因子受体相互作用是重要的(Parson,J.T.(2003).Focaladhesion kinase:The first ten years.J.Cell Sci.116,1409-1416)。PTK2具有多个与含有SH2结构域的接头蛋白结合所必需的磷酸化位点。一个重要的磷酸化位点是Tyr397，其似乎对于PTK2与下游信号分子，如Rho激酶相互作用是重要的。
令人信服的证据表明，PTK2在细胞-基质的信号转导途径中发挥着至关重要的作用(Clark和Brugge1995,Science268:233-239)而且它的异常活化是与癌症转移潜能的增加相关联的(Owens等，1995,Cancer Research55:2752-2755)。PTK2最初被认定为一种在v-Src转化的细胞中高度酪氨酸-磷酸化的125kDa的蛋白。随后发现PTK2是一种定位于粘着斑的酪氨酸激酶，粘着斑是培养的细胞和其相关的基质之间的接触点和强烈的酪氨酸磷酸化位点。PTK2响应细胞外基质(ECM)与整合素的结合而被磷酸化，并因此而活化。最近，有研究表明，PTK2mRNA水平的增加与癌症的更侵入性的行为相关，且PTK2表达的降低(通过使用反义寡核苷酸)在肿瘤细胞中诱导凋亡(Xu等,1996,Cell Growth and Diff.7:413-418)。除了在大多数组织类型中表达，人们发现PTK2在大多数人类癌症中，特别是在高侵入性和转移性癌症中的水平较高。即便如此，如之前提到的，PTK2激酶抑制剂的疗效在不同癌症模型之间变化很大。因此，PTK2如此的表达显然对于PTK-2抑制剂治疗癌症的敏感性是不可预测的。本发明关闭了该间隙，其首次提供了一种合适的生物标志物，该生物标志物允许识别对PTK2抑制剂治疗敏感的癌症/肿瘤患者：如整个说明书中解释的，所述的生物标志物是E-钙粘蛋白的表达。
术语“PTK2抑制剂”在本发明的上下文中定义的是与PTK2(优选人类PTK2)相互作用使得该激酶活性降低的一种化合物或多种化合物。适于检测这样的抑制剂的分析在下文中更详细地解释。术语“多种化合物”应被理解为可能相同或可能不相同的多种物质。多种化合物优选地可以相加或协同地作用。所述的化合物或多种化合物可以是化学合成的或微生物产生的和/或例如包括在样本中，例如，来自例如植物、动物或微生物的细胞提取物。
本文使用的术语“减少的PTK2激酶活性”或“减少PTK2激酶活性”定义的是PTK2的激酶活性的减少，优选减少至与可比较的对照细胞/受试者的正常/自然状态相比在大约相同的水平。在此上下文中，术语“可比较的对照细胞/受试者的正常/自然状态”是指在对照细胞中的PTK2激酶活性，对照细胞优选与测试细胞是相同性质(例如，两种细胞均是上皮细胞)但是来自不同的来源。“不同来源”包括例如获得自健康受试者(优选未遭受癌症的受试者)的细胞/组织样本，或者获得自同一受试者的不同部分的细胞/组织样本，其中所述不同部分似乎不具有与癌症相关的症状。然而，即使在PTK2抑制剂不能将PTK2激酶活性降低到大约为可比较的对照细胞/受试者的正常/自然状态，但与加入所述抑制剂之前的PTK2激酶活性相比，确实降低了PTK2激酶活性的情况下，也会被理解为所述抑制剂具有有益的效果。
因此，可以设想，当与未加入所述抑制剂而实现的PTK2激酶活性相比时，PTK2抑制剂至少降低约5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或甚至100%的PTK2激酶活性。本文中公开了合适的测量PTK2激酶活性的测试系统。因此，优选的是，例如在本文公开的测试系统(例如PTK2酶测试)相似或相同的条件下，本发明的抑制剂降低约5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或甚至100%的PTK2激酶活性。
PTK2酶测试
此测试使用活性PTK2酶(Invitrogen Code PV3832)和聚-Glu-Tyr(4:1，Sigma P-0275)作为激酶底物。通过在DELFIATM分析中检测底物的磷酸化的方式检测激酶活性。用铕标记的磷酸酪氨酸抗体PT66(PerkinElmer,No.:AD0040)检测磷酸化的底物。为了确定PTK2抑制剂的浓度-活性曲线，化合物在10%DMSO/H2O中连续稀释并将10μL各稀释液分配在96-孔微量滴定板的每孔中(透明U形底板，Greiner No.650101)(抑制剂一式两份测试)，并与10μL/孔的PTK2激酶混合(0.01μg/孔)。PTK2激酶预先相应地用激酶稀释缓冲液(20mM TRIS/HCl pH7.5，0.1mM EDTA，0.1mM EGTA，0.286mM原钒酸钠，加入新鲜制备的BSA(组分V1mg/mL)和DTT(1mM)的10%甘油)稀释。将测试化合物和PTK2激酶在室温和500rpm振荡下预先孵育1小时。然后加入20μL ATP混合物(30mM TRIS/HCl pH7.5，0.02%Brij，0.2mM原钒酸钠，10mM醋酸镁，0.1mM EGTA，1×磷酸酶抑制剂鸡尾酒1(Sigma，No.：P2850)，50μM ATP(Sigma，No.：A3377;15mM原液))。通过加入10μL/孔的聚(Glu，Tyr)底物(25μg/孔聚(Glu，Tyr)，0.05μg/孔生物素化聚(Glu，Tyr)溶解于250mM TRIS/HCl pH7.5，9mM DTT)-DMSO终浓度为2%开始反应。激酶反应1小时后(将板以500rpm振荡)，通过加入12μL/孔100mM EDTA，pH8终止反应。并在室温进一步振荡5分钟(500U/分钟)。
将55μL的反应混合物转移到Roche公司制的链霉亲和素板(Strepta WellHigh Bind(透明的，96孔)，No.：11989685001)，并在室温(500rpm振荡)温育1小时。然后用200μL/孔D-PBS(Invitrogen，No.：14190)洗涤微量滴定板3次。然后加入100μL1:2000稀释的DELFIA Eu-NI抗-磷酸酪氨酸PT66抗体(Perkin Elmer，No.：AD0040，1:2000稀释于DELFIA测试缓冲液(PerkinElmer，No.：1244-111))，并在室温(500rpm振荡)温育1小时。然后用200μL/孔DELFIA洗涤缓冲液(Perkin Elmer，No.：1244-114)洗板3次，加入200μL/孔增强液(Perkin Elmer，No.：1244-105)，并全部在室温(300rpm振荡)温育10分钟。
然后在微量滴定板读数器(Victor，Perkin Elmer)上测量时间延迟的铕荧光。阳性对照由含有溶剂(在测试缓冲液中的2%DMSO)的孔组成并显示不受抑制的激酶活性。通过S型曲线分析算法(FIFTY，基于GraphPAD Prism第3.03版)以可变希尔系数(Hill coefficient)进行迭代计算，自浓度活性分析测得IC50值。
可用来识别PTK2抑制剂的进一步测试是本领域技术人员所公知的，除尤其是包括PTK2软琼脂测试或磷酸化-PTK2(pY397)测试。这两种测试在下文中详细说明。
PTK2软琼脂测试
使用此细胞测试用于确定PTK2抑制剂对PC-3前列腺癌细胞在软琼脂中生长(“锚定不依赖性生长(anchorage-independent growth)”)的影响。在2周培育时间后，通过Alamar Blue(刃天青(resazurin))染色证实细胞活力。
PC-3细胞(ATCC CRL-1435)在含有补充有10%胎牛血清(Invitrogen，编号：16000-044)的F12Kaighn培养基(Gibco，编号：21127)的细胞培养瓶(175cm2)中生长。在培育箱中于37℃及5%CO2下培育培养物，且每周传代2次。该测试在微量滴定板(Greiner，编号：655185)中进行，且由以下组成：由90μL含有1.2%琼脂糖(Invitrogen，4%琼脂糖胶1x液体40mL，编号：18300-012)的培养基组成的下层，然后于60μL培养基及0.3%琼脂糖中的细胞层，及最后包含30μL含有测试化合物的培养基(未添加琼脂糖)的顶层。为了制备下层，将4%琼脂糖与10x D-PBS(Gibco，编号：14200)及H2O一起煎煮，且因此预稀释为1x D-PBS中的3%琼脂糖。后者用培养基(F12Kaighn培养基/10%FCS)及FCS调至在F12Kaighn培养基中琼脂糖的1.2%最终稀释液(含有10%FCS)。向微量滴定板的各孔提供90μL下层悬浮液且冷却至环境温度，持续1小时。对于细胞层，使用胰蛋白酶(Gibco，0.05%；编号：25300)分离PC-3细胞，计数，且在各情况下每孔接种400个细胞于60μL添加有0.3%琼脂糖的F12Kaighn培养基(10%FCS)中(37℃)。在冷却至环境温度2小时后，添加测试化合物(30μL连续稀释液)以一式四份测量。测试化合物的浓度通常覆盖10μM至0.3nM的测试范围。化合物(储备溶液：10mM的100%DMSO)用F12Kaighn培养基+6%DMSO预稀释，以获得1%DMSO的最终浓度。在37℃及5%CO2下在蒸汽饱和氛围中培育细胞14天。接着用染料Alamar Blue(AbDSerotec，编号：BUF012B)证明存活细胞的代谢活性。为此，添加每孔18μLAlamar Blue悬浮液，且整体在培育箱中于37℃培育约8小时。阳性对照组由填有18μL经热压处理还原的Alamar Blue与180μL F12Kaighn培养基(10%FCS)的混合物的空孔组成。通过荧光分光计(SpectraMAX GeminiXS，Molecular Devices)确定荧光强度。激发波长为530nm，发射波长为590nm。
通过使用S型曲线分析算法(FIFTY，基于GraphPAD Prism第3.03版)以可变希尔系数进行迭代计算，自浓度-活性分析测得EC50值。
磷酸化PTK2(pY397)测试
使用此细胞测试来确定PTK2抑制剂对酪氨酸397位PTK2磷酸化(pY397)状态的影响。
PC-3细胞(前列腺癌，ATCC CRL-1435)在含有添加有10%胎牛血清(Invitrogen，编号：16000-044)的F12Kaighn培养基(Gibco，编号：21127)的细胞培养瓶(175cm2)中生长。在培育箱中于37℃及5%CO2下培育培养物，且每周传代2次。
测试时，将每孔2×104个细胞/90μL培养基点板于96孔微量滴定板(Costar，编号：3598)中，且在培育箱中于37℃及5%CO2下培育过夜。第二天，添加测试化合物(10μL来自连续稀释液)。测试化合物的浓度通常涵盖50μM至0.8nM的范围。测试化合物(储备溶液：10mM的100%DMSO溶液)用培养基/培养基10%DMSO稀释，使最终浓度为1%DMSO。接着在培育箱中于37℃及5%CO2下培育细胞2小时。接着移除培养物上清液，且在环境温度用150μL4%甲醛的D-PBS溶液固定细胞，持续20分钟。用0.1%Triton X-100的D-PBS溶液200μl洗涤细胞坪(cell lawn)5次，每次5分钟，接着用阻断缓冲液(于TBST(25mM Tris/HCl pH8.0、150mM NaCl、0.05%Tween20中，含5%脱脂奶粉(Maresi Fixmilch))培养90分钟。用50μL经阻断缓冲液稀释1:200倍的抗磷酸化PTK2[pY397]兔单克隆第一抗体(Invitrogen/Biosource，编号：44-625G)替换阻断缓冲液。为对照目的，改用经阻断缓冲液稀释1:400倍的PTK2[总]抗体(克隆4.47小鼠单克隆，Upstate，编号：05-537)。在4℃培育过夜。接着用0.1%Tween的D-PBS溶液100μL洗涤细胞坪五次，每次5分钟，且每次每孔添加50μL第二抗体。为检测已结合的磷酸化PTK2[pY397]抗体，使用与辣根过氧化酶偶联的山羊-抗-兔抗体(Dako，编号：P0448；用阻断缓冲液稀释1:500倍)。为检测已结合的PTK2[总]抗体，使用也与辣根过氧化酶偶联的兔-抗-小鼠抗体(Dako，编号：PO161；用阻断缓冲液稀释1:1000倍)。在温和振荡下，在环境温度培育1小时。接着再用0.1%Tween的D-PBS溶液100μL洗涤细胞坪五次，每次5分钟。通过吸滤来移除PBS，并通过添加100μL染色溶液(TMB过氧化酶底物(KPL，编号：50-76-02)与过氧化酶溶液B(H2O2)(KPL，编号：50-65-02)的1:1混合物)进行过氧化酶染色。染色剂在暗处经10-30分钟显色。通过添加每孔100μL1M磷酸溶液停止反应。在450nm下使用吸光测量装置(VICTOR3PerkinElmer)确定吸光度。使用抗磷酸化PTK2[pY397]免疫染色的抑制性来确定EC50值。抗-PTK2[总]抗体的染色用于对照目的，且在抑制剂影响下应保持恒定。通过S型曲线分析算法(FIFTY，基于GraphPAD Prism第3.03版)，采用可变希尔系数进行迭代计算，自浓度-活性分析测得EC50值。
使细胞中、在包含所述细胞的组织中、或包含所述组织或细胞的受试者中的活性PTK2量的降低的化合物也同样设想为PTK2抑制剂，并包括，例如，适体、抗体或其能够结合并从而抑制PTK2的功能性片段；特异性结合编码PTK2的核苷酸序列并从而降低细胞或组织中活性PTK2量的反义寡核苷酸、iRNA、miRNA或siRNA。这种抗体和干扰核酸序列是本领域技术人员公知的；其中大部分甚至是市售的。
虽然本发明决不限于此，本发明中所设想的PTK2抑制剂的实例是在WO2010/106097，WO2010/136559，WO2011/039344，WO2007/063384，WO2010/058032，WO2010/058030，WO2010/055117，WO2009/07153，WO2005/1110245，WO2008/129380，WO2007/072158，WO2005/111022，WO2005/111023，WO2005/111016，WO2004/056807，WO2009/071535，WO2004/056786，WO2010/062578，EP2047849，WO2008/115369，WO2009/024332，WO2008/129380，WO2007/072158，WO2004/056807，WO2006/021457，WO2010/062578，WO2009/105498，WO2004/030620，WO2008/115443，US2008/167368，和/或WO2009/153589中示例的化合物。上述文件以整体引用的方式并入本文。
在本发明中，术语“PTK2抑制剂”与术语“PTK2拮抗剂”等是互换使用的。
PTK2激酶抑制剂在各种癌症实验模型中显示出效果，特别是在免疫缺陷小鼠的人类肿瘤异种移植模型中。然而，在不同的癌症模型中其效果变化很大：在某些模型中可以实现肿瘤消退或生长的完全抑制，对其他癌症类型的治疗导致生长的部分抑制，和对某些癌症根本没有影响。本发明本质上是基于令人惊讶的发现，当通过本发明建立的评分体系评分时，在来自上皮癌的癌细胞中E-钙粘蛋白的表达水平可以用来预测各自癌症对PTK2抑制剂的敏感性。鉴于此，设想检测来自癌症患者的癌症样本中E-钙粘蛋白的表达，其中E-钙粘蛋白的免疫反应评分(IRS)0-2，优选0-1，更优选IRS评分1，和进一步更优选0，表明癌症/癌症患者对PTK2抑制剂治疗是敏感的。
虽然不排除其他的免疫学方法，但所述IRS评分优选地通过免疫组织化学方法的方式评价(检测)。
“IHC方法”是指通过目标-结合结构域的相互作用(其由于标签而可视化)，使用结合结构域作为特定试剂对组织切片中的目标(例如抗原)的检测。据设想，所述组织切片(例如约2-5μm厚)取自已经优选地包埋，例如在石蜡中的组织样本。描述该检测方法细节的IHC程序和E-钙粘蛋白抗体的来源如下所述。实施例中使用的IHC方法是使用DAB作为反应底物的间接亲和素-生物素复合物(ABC)免疫过氧化物酶方法。进一步在下文中更详细地解释IHC方法。
在本发明中，术语“结合结构域”特指一种特异性识别E-钙粘蛋白的多肽的结构域。根据本发明，术语“特异性识别E-钙粘蛋白”或“E-钙粘蛋白特异”指结合结构域，例如抗体，能够特异地与E-钙粘蛋白相互作用和/或结合E-钙粘蛋白。如本文所用的，在E-钙粘蛋白和结合结构域之间的相互作用中的术语“结合”是指与一般蛋白(即，非特异性结合)的缔合相比，结合结构域与E-钙粘蛋白的结合(例如，相互作用或组成复合物)达到统计学上的显著程度。因此，术语“结合域”也被理解为是指与E-钙粘蛋白具有统计学上显著的相关或结合的结构域。
本发明的结合结构域的一个优选的例子是或包含表位结合结构域，优选抗体，更优选单克隆抗体或其抗原结合片段。
术语“抗体”是指与目标结合的单克隆或多克隆抗体(参见Harlow和Lane，“Antibodies，A laboratory Manual”，CSH Press，Cold Spring Harbor，USA，1988)，或者是保留或基本上保留其结合特异性的所述抗体的衍生物。这样的抗体优选的衍生物是包括，例如，小鼠或大鼠可变区和人类恒定区的嵌合抗体。术语“抗体”还包括双官能(双特异性)抗体和抗体构建体，如单链Fvs(scFv)或抗体融合蛋白。术语“scFv片段”(单链Fv片段)在本领域中是公知的并优选的由于其尺寸小并且可能以重组方式产生这样的片段。所述抗体或抗体结合部分是，例如大鼠、小鼠、骆驼、山羊、绵羊、鸡、马、或人抗体或人源化抗体。根据本发明，术语“人源化抗体”是指非人类来源的抗体，其中可变区中的至少一个互补决定区(CDR，例如CDR3)且优选所有6个CDR已被替换成具有所期望的特异性的人源抗体的CDR。任选地，抗体的非人类恒定区已被人抗体的恒定区替换。生产人源化抗体的方法在，例如，EP-A10239400和WO90/07861中描述。术语抗体或其功能性片段还包括重链抗体及其可变域，其在WO94/04678，WO96/34103和WO97/49805，WO04/062551，WO04/041863，WO04/041865，WO04/041862和WO04/041867中提到；以及结构域抗体或“dAb”，其是基于或衍生自传统4链抗体分子(参见，例如，Ward等，Nature1989，341，544-546)的重链可变域(VH)或轻链可变域(VL)。
本文所用的术语“抗原结合片段”是指本文指定的抗体片段，其保留或基本上保留了抗体的结合特异性，像分离的轻链和重链、Fab、Fab/c、Fv、Fab'、F(ab')2。抗原结合片段可以包括抗体的轻链可变区(VL)和重链可变区(VR)，但是，它并不一定包括两者。例如，Fd片段具有两个VH区并通常保留完整抗原结合片段的抗原结合功能。
下面的示例性抗体可以在本发明的实施方案中采用。然而，本发明并不限于这些特定的抗体：
-针对E-钙粘蛋白的胞外结构域的小鼠单克隆抗体[HECD-1](AbcamAb1416)。
-识别E-钙粘蛋白的120kD成熟形式和82kD片段的针对E-钙粘蛋白的小鼠单克隆抗体(Dako M3612)
-小鼠抗E-钙粘蛋白单克隆抗体(Invitrogen18-0223)；与人E-钙粘蛋白的胞浆结构域反应。
-针对E-钙粘蛋白的小鼠单克隆抗体(Sigma-Aldrich WH0000999M1)
-针对E-钙粘蛋白的兔多克隆抗体(Cell Signalling4065)
除了抗体或其抗原结合片段(有时也表示为“功能性片段”)，术语“表位结合结构域”包括结合(特异性结合)蛋白性目标，例如E-钙粘蛋白的其他结合体。术语“表位结合结构域”包括，例如，域抗体(dAb)，例如人、骆驼或鲨鱼的免疫球蛋白的单一可变域，或者它可能是选择下组的支架(scaffold)的衍生物的结构域：CTLA-4(Evibody)；载脂蛋白；蛋白A衍生分子，如蛋白A的Z-域(Affibody，SpA)，A-域(Avimer/Maxibody)；热休克蛋白，如GroEI和GroES；转铁蛋白(trans-body)，锚蛋白重复蛋白(DARPin)；肽适体；C-型凝集素结构域(Tetranectin)；人γ-晶体蛋白和人类泛素(affilins)；PDZ结构域；人类蛋白酶抑制剂的蝎毒素kunitz型结构域；和纤连蛋白(adnectin)；其已进入蛋白质工程以获得与天然配体以外配体的结合。CTLA-4(细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4)是一种主要表达在CD4+T细胞上的CD28家族受体。它的胞外结构域具有可变域样Ig折叠。可以用异源序列替代与抗体的CDR对应的环以赋予不同的结合特性。被工程化以具有不同结合特异性的CTLA-4分子也被称为Evibodies。相关进一步细节参见Journal ofImmunological Methods248(1-2)，31-45(2001)。
本发明的结合结构域或者是标记的或者是未标记的。
在本发明中，标记是指通过光谱、光化学、生物化学、免疫化学或化学手段可检测到的化合物或组合物。
标记可以直接或间接地检测。
“直接地”是指产生信号，如放射性、显色、或荧光信号这样的标记。直接标记包括放射性标记、荧光标记、电子密度试剂等。直接标记具有或产生可用于量化和/或检测(定性)结合的结合结构域的可测量的信号。
“间接地”是指标记是例如与另一实体结合，然后方可检测(检测实体)。间接检测或间接标记涉及第二个直接或间接可检测结合结构域与间接标记的结合。例如，本发明的间接标记的结合结构域可以是结合配偶体的配体，如生物素(其是抗生蛋白链菌素的结合配体)，或者是核苷酸序列(其是它可以特异性杂交等的互补序列的结合配偶体)。因此“间接标记”特征在于主结合结构域被操作使其可以被对该操作(例如生物素标记)具特异性的第二结合结构域(有时也称为检测实体)检测到。
在一个优选的实施方案中，所述结合结构域是一种抗体(第一抗体)且所述检测实体是与这样的第一抗体或第一抗体的标记特异性反应的第二抗体。
此外，还设想混合直接和间接标记。例如，直接标记已经能够产生信号(例如类似FITC的荧光标记)，但第二结合结构域(其也可被标记，例如用特异性结合与主信号的标记结合的标记(抗FITC抗体)的直接标记)可能会增加可检测的信号。这样的方式和方法是本领域技术人员所公知的，特别是对免疫化学领域的技术人员。
在另一实施方案中，主结合结构域(例如抗体)没有如上所述地标记，但是可通过与主结合结构域的方式被检测到/是可检测的(例如，通过在另一物种中产生并特异性结合小鼠抗体(如山羊抗-小鼠)的标记的第二抗体，可检测小鼠中产生的主要非标记抗体)结合的第二结合结构域(检测实体)。然后第二结合结构域直接或间接地标记。这种抗体检测三明治法是已为大家接受的并且本领域技术人员生成/建立或创建这样的系统完全没有问题。
体外发生的“检测”(有时也称为“测定”及其语法变体)是通过本领域技术人员公知的标准的检测技术进行的，且包括但不限于，任何种类的合适的IHC检测技术，例如基于光和荧光的显微镜，包括基于近红外的显微镜和共焦显微镜。
术语“离体(ex vivo)”，可以与“体外(in vitro)”互换，是指在受控环境中的细胞中进行的活动。本发明的方法在体外进行。
如前所述，免疫组织化学(IHC)是通过使用直接标记(直接IHC)或间接标记(间接IHC)的结合结构域，对目标(在本发明中例如E-钙粘蛋白)和/或在组织切片中存在所述目标的细胞亚群进行检测，其中结合结构域通过特异性目标-结合结构域相互作用与它们的目标发生反应。在本发明中，所述目标是E-钙粘蛋白。
然后，这些相互作用通过所述标记可视化。主要有直接法和间接法两种策略用于组织中抗原的免疫组织化学(IHC)检测。IHC的直接法使用一种直接标记结合结构域，其直接与被染色的目标结合。因此，直接法是一步染色的方法，并且涉及例如直接与组织切片中的抗原反应的标记的抗体(例如，FITC接合的抗血清)。这种技术仅利用一种抗体，且因此该程序简单快速。IHC的间接法使用针对E-钙粘蛋白的结合结构域，和针对第一结合结构域的第二标记的结合结构域。第二结合结构域例如是针对已经产生第一抗体的动物物种的IgG的抗体而产生。
据设想，在本发明的方法的一些实施方案中，所述IHC方法特征在于以下步骤：
(a)任选地提供癌症样本(或者任选提供包含癌症样本的容器)；
(b)固定所述癌症样本；
(c)任选地在石蜡中包埋癌症样本；
(c)将E-钙粘蛋白特异性结合结构域与固定的癌症样本孵育；
(d)直接或间接地检测结合结构域并进而检测癌细胞上E-钙粘蛋白的表达。
“固定(Fixing)”或“固定(fixation)”是指适于制备用于随后的IHC检测程序的癌症样本的固定程序。“固定”特别地进行以确保组织结构和细胞形态的保存。合适的固定条件是众所周知的并且还在本发明中公开。另外，也可以设想通过深度冷冻(例如，在液氮中)保存组织/亚群。
所有上述的前处理步骤/措施都在术语“固定”的范围内，即固定具体包括用固定试剂如甲醛、多聚甲醛固定；和/或组织样本/细胞亚群的深度冷冻，和/或任选地也在石蜡或类似试剂中组织/细胞子集的包埋。
将不同的IHC程序应用到实践的手段和方法是本领域技术人员公知的。例如参见在文献中或在互联网上(例如www.ihcworld.com)的各种程序。
用于免疫组织化学的最常见的固定剂是多聚甲醛，其经常在含有约1-5%多聚甲醛的各种缓冲液中使用。基于多聚甲醛的特定的缓冲液举例如下：
a)在0.1M磷酸盐缓冲液中的4%多聚甲醛
b)在0.1M磷酸盐缓冲液中含0.2%苦味酸的2%多聚甲醛
c)PLP(多聚甲醛、赖氨酸、多聚甲醛)固定液：例如在0.1M磷酸盐缓冲液中含4%多聚甲醛、0.2%高碘酸盐和1.2%赖氨酸
d)含0.05%戊二醛的4%多聚甲醛。
这些缓冲液不旨在限制本发明，而是简单地示出通常用于实现组织足够的固定的特定条件。标准的固定时间约为5、10、15、20、30分钟至过夜。如此处理的组织通常随后进行石蜡包埋程序，接着在有机溶剂(例如二甲苯和乙醇)的处理下孵育。然后，通常是通过将样本在95%、70%、50%、30%的醇(如乙醇)中各放置几分钟进行水合。然而，对于IHC没有标准的程序，即程序将根据组织、所用的结合结构域等的不同而变化。所有这些是本领域技术人员已知的，并且是不需要费力的常规手段。特定的程序是公开的，例如在互联网上(在搜索引擎如Google等中用字符串“IHC程序”可检索到)。在适量的醛的固定下，某些抗原甚至都无法保存。在此条件下，通常将组织在液氮中新鲜冷冻，并用低温恒温器切片。切片冷冻保存在-20℃或更低的温度直到用冷丙酮或乙醇固定。
一旦获得“信号”，证明信号真实地反映了目标的分布仍然是有些困难的事。最简单的阴性对照是已知不表达E-钙粘蛋白的RNA的组织中表达缺失的情况。一种替代的阴性对照是用跟它一起提取的过量的结合结构域的肽或蛋白预孵育对信号的消除。
也可以设想，本发明的IHC方法与可应用在组织切片上的其他技术，例如原位杂交技术(例如荧光原位杂交)相结合，以验证或检测其他癌症相关信号和或其他癌症细胞的细胞内信号。
可用于本发明的方法，例如IHC方法，在本文中公开并在所附的实施例中例举。
本发明的要点在本质上是令人惊奇的发现，在癌症细胞中E-钙粘蛋白的表达水平可以用来预测各自癌症对PTK2抑制剂的敏感性。鉴于这种情况，设想检测一种癌症/患者的癌症样本中E-钙粘蛋白的表达，其中E-钙粘蛋白的免疫反应评分(IRS)为0-2，优选IRS评分为0-1，更优选IRS评分为1，和进一步更优选IRS评分为0表明癌症/癌症患者是对PTK2抑制剂治疗敏感的。
本发明的IRS评分按如下建立。我们使用多聚甲醛-固定和石蜡包埋的组织样本评估了膜结合的E-钙粘蛋白阳性癌细胞的数量。使用的癌症来自生长在裸鼠(BomTac：NMRI-Foxnlnu)的人类肿瘤细胞系的异种移植模型，包括胰腺癌细胞系MiaPaCa-2和BxPC-3；前列腺癌细胞PC-3和卵巢癌细胞TOV-21G。
分析从每个样本的整体切片，并将E-钙粘蛋白阳性癌症细胞的百分比平均值确定为E-钙粘蛋白阳性细胞的数目对检测的所有的组织区域中癌症细胞的总数的比值。出于评分目的，仅仅将癌细胞中的膜E-钙粘蛋白免疫活性认定为阳性。病理学领域内的技术人员理解在进行该方法时存在的条件下何种细胞是相关的，并可以基于他/她的一般知识和本公开的教导确定阳性细胞所占的分数。
本文所提出的评分是半定量的；将蛋白表达水平记录为0、1、2、3或4，0即为基本上没有可检测的蛋白表达(小于1%)和4是检测到最高的蛋白表达(>60%)。
作为阳性对照，可以包括正常结肠黏膜和/或已知表达E-钙粘蛋白的结肠直肠癌样本的组织切片。存在于任何给定组织(正常组织和肿瘤组织)中的结缔组织可以作为这些检测中的阴性对照。
所提及的“对照”、“阳性对照”或“对照样品”优选地是允许与测试样品相比较的样品(细胞或组织)，例如，因为两种样品均主要由相同的细胞类型组成(例如，两者均由上皮细胞组成)，或者两种样品衍生自相同的组织但来自不同的来源。“不同的来源”，包括例如获得自健康受试者的细胞/组织样品，优选来自未遭受癌症的受试者或获得自相同受试者的不同部分的细胞/组织样本，其中所述不同部分似乎不存在癌症的相关症状。
E-钙粘蛋白阳性癌细胞的数量按如下评分：
0(小于1%)、1(约1-10%)、2(约11-30%)、3(约31-60%)、4(>60%)。“阳性细胞”是指展示上文所解释的E-钙粘蛋白的表达的癌症细胞。本文提及的评分适用于本发明的所有实施方案。优选地，E-钙粘蛋白免疫反应评分(IRS)IRS-0的特征在于膜E-钙粘蛋白阳性癌症细胞对在一个或多个检测的组织学区域内癌细胞总数的比值平均小于1%；IRS-1特征在于膜E-钙粘蛋白阳性癌症细胞对在一个或多个检测的组织学区域内癌细胞总数的比值的平均约为1-10%；IRS-2特征在于膜E-钙粘蛋白阳性癌症细胞对在一个或多个检测的组织学区域内癌细胞总数的比值的平均约为11-30%；IRS-3特征在于膜E-钙粘蛋白阳性癌症细胞对在一个或多个检测的组织学区域内癌细胞总数的比值的平均约为31-60%；IRS-4特征在于膜E-钙粘蛋白阳性癌症细胞对在一个或多个检测的组织学区域内癌细胞总数的比值的平均高于60%。
上面提及的评分，在一个优选的实施方案中，通过使用多聚甲醛固定和石蜡包埋组织样品的IHC进行。
“一个或多个”，在这方面包括1、2、3、4、5、6、7、8、9或进一步更多个所分析的组织学区域(优选每个样品)，视情况而定。优选至少“3”个组织学区域。
当检测上面提到的生长在裸鼠体内的人类肿瘤细胞系的异种移植模型时，我们可以证明在某些模型中PTK2抑制剂是高度有效的，而在其他模型中响应是相当低的。异种移植模型建立如下：在用于实验前，允许约6周龄的无胸腺雌性BomTac:NMRI-Foxn1nu鼠适应新环境至少3天。在标准条件下在
Figure BDA00002977210600201
II型笼中5只一组安置动物。提供标准饮食(PROVIMI KLIBA)和自由采食的蒸压自来水。为建立皮下肿瘤，通过胰蛋白酶消化、离心、洗涤并重新混悬于冰冷的PBS+5%FCS收获细胞。然后将100μL包含5,000,000个细胞的细胞混悬液皮下注射到裸鼠的右侧(每只鼠1个位点)。当肿瘤已经建立并已达到直径6-9mm时，将小鼠在治疗组和载体对照组间随机分配(细胞注射后10-14天)。每周用游标卡尺测量肿瘤直径3次(周一、周三、周五)。根据公式“肿瘤体积=长*直径2*π/6”计算每个肿瘤的体积[以mm3计]。为监测治疗的副作用，每天检查老鼠的异常情况，并每周3次测量体重(周一、周三、周五)。在开始治疗约三个星期后研究结束时处死动物。出于道德原因在研究中将具有坏死肿瘤或肿瘤大小超过2000mm3的动物提前处死。
当检测上面提到的生长在裸鼠体内的人类肿瘤细胞系的异种移植模型时，我们可以证明在某些模型中PTK2抑制剂是高度有效的，而其他模型中的响应则相当低。例如来源于MiaPaCa-2的细胞系的人胰腺癌模型对PTK2抑制剂治疗是高度响应的，导致较强的癌生长抑制(即“肿瘤生长抑制”或TGI)，由114%TGI和发生癌的复发所示。从这种癌症制备了组织切片并通过E-钙粘蛋白抗体的免疫组织化学进行染色。在这些癌症切片中E-钙粘蛋白的表达是完全不存在的，对应IRS“0”（E-钙粘蛋白阳性细胞<1%）。TGI如下文定义。
相比之下，其他两种来源于BxPC-3或AsPC-1细胞系的胰腺癌模型表明只有微弱的或根本没有灵敏度(PTK2抑制剂治疗TGI分别为49%(BxPC-3)和13%(AsPC-1)和完全没有癌症复发)。来自这些癌症模型的组织切片用E-钙粘蛋白抗体的免疫组织化学证明在这些癌症中E-钙粘蛋白强烈的表达，对应BxPC-3的IRS为“4”(阳性细胞>60%)和对应AsPC-1为“3”(31-60%阳性细胞)(参见图2作进一步的说明)。因此设想，这些腺癌模型可以作为评估和/或调整本发明的IRS评分的参考/参考样品。可将BxPC-3异种移植看作IRS评分“4”的参考而将ASPC-1异种移植作为IRS评分“3”的参考。同样“MiaPaCa-2”可以作为E-钙粘蛋白IRS“0”的参考。这类异种移植物的产生如本文所述。
上述数据表明，E-钙粘蛋白表达很少或不表达与预临床肿瘤模型对PTK2抑制剂的敏感性相对应，而具有中等-高百分比E-钙粘蛋白表达癌细胞的癌症似乎是较不敏感或不敏感的。鉴于此情况，可以建立E-钙粘蛋白的免疫反应评分0-2，优选IRS评分为0-1，和进一步更优选IRS评分为0表明癌症/癌症患者对PTK2抑制剂治疗敏感。
“肿瘤生长抑制”或“TGI”定义如下：
TGI = 100 * ( C d - C 1 ) - ( T d - T 1 ) ( C d - C 1 ) ,
其中“C1”和“T1”指开始实验第1天在对照组和治疗组中的平均肿瘤体积，和“Cd”和“Td”指在第D天实验结束时对照组和治疗组中的平均肿瘤体积。
在另一实施方案中，本发明涉及一种治疗癌症患者的方法，所述患者具有E-钙粘蛋白免疫反应评分0-2，优选IRS评分0-1，更优选IRS评分1和进一步更优选IRS评分为0，该方法包括对患者施用治疗有效量的PTK2抑制剂。
可以理解，在本发明的实施方案的内容中，E-钙粘蛋白免疫反应评分优选地通过如本文上面所指出和举例的IHC方法的方式评估。合适的IHC方法如本文所述，但本发明并不限于这些特定的程序。
“治疗有效量”或“治疗活性”是指对使给药对象产生治疗效果的PTK2抑制剂的剂量。药物的治疗有效量可以降低癌细胞的数量、减少肿瘤的大小、抑制(即减慢至一定程度和优选地终止)癌细胞到外周器官的浸润、抑制(即减慢至一定程度和优选地终止)癌转移、至少在一定程度上，抑制癌细胞的生长，和/或将与疾病相关的一种或多种症状减轻到一定程度。确切的剂量将由本领域技术人员使用已知的技术确定。正如在本领域中已知的，针对年龄、体重、一般健康状况、性别、饮食、药物相互作用和病情的严重程度进行调整可能是必要的，并且将由本领域技术人员通过常规实验确定。
本发明人首次展示了癌症样品的E-钙粘蛋白免疫反应评分与各自癌症对PTK2抑制剂治疗的敏感性相关。基于这些发现，现在对PTK2抑制剂治疗敏感的癌症患者或癌症(或肿瘤细胞系)进行分级是可能的。基于本发明的发现，现在清楚，显示E-钙粘蛋白免疫反应评分(IRS)为0、1或2的癌症患者应优先用PTK2抑制剂治疗，因这些患者获得治疗效果的概率将会高于那些IRS为3或4的患者。然而，据设想，E-钙粘蛋白免疫反应评分为3或3以上的癌症也可以用PTK2抑制剂治疗，因为虽然清楚表明对这些患者使用PTK2抑制剂获得治疗效果的概率较低，但高IRS评分(3-4)不一定必然排除这些PTK2残留的治疗效果。这类患者也可用替代剂(PTK2抑制剂的替代剂)或其他抗癌疗法(即不基于PTK2抑制剂的治疗)治疗。其他的或替代的抗癌 疗法包括但不限于，可以使用选自抗赘生剂(antineoplastic agent)、抗血管生成剂、化学治疗剂和肽类的癌症治疗剂的治疗。抗赘生剂可以选自抗生素型试剂、烷化剂、抗代谢试剂、激素制剂、免疫抑制剂、干扰素型试剂、激酶抑制剂及其组合。这样的药学活性化合物/剂是例如，传统的小的有机化学分子或者可以是大分子，如蛋白、抗体(包括其片段)、肽体(peptibody)、DNA、RNA或这些大分子的片段。
本发明还涉及一种对PTK2抑制剂治疗敏感的癌症患者进行分级的方法，包括确定所述患者的癌症样品中E-钙粘蛋白IRS评分，其中E-钙粘蛋白免疫反应评分(IRS)为0-2(即2、1或0)表示癌症患者对PTK2抑制剂治疗敏感。E-钙粘蛋白免疫反应评分(IRS)为3-4(即3或4)表示患者对PTK2抑制剂治疗不敏感，或至少这些患者使用PTK2抑制剂达到治疗效果的概率相当低。
术语“分级(stratify)”或“分级(stratifying)”是指对患者进行分选以确定谁可能比其他人更多(或更少)地受益于基于PTK2抑制剂的抗癌治疗。因此本发明的的方法可用于根据对PTK2抑制剂治疗的敏感性将癌症患者分级。正如所提到的，显示E-钙粘蛋白免疫反应评分IRS为0-2，优选IRS评分为0-1，更优选IRS评分为1和进一步更优选IRS评分为0的这些患者的癌症更有可能受益于所述基于PTK2抑制剂的治疗，而那些E-钙粘蛋白免疫反应评分(IRS)为3或更大的癌症不太可能受益于这种疗法。
具体而言，从PTK2抑制剂的抗癌疗法“可能受益的患者”是PTK2抑制剂具有更高的有治疗效果的可能性的患者。如本文所述，癌症和/或癌症患者可能会或可能不会积极响应的可能性依赖于所述患者的各种癌细胞的细胞膜的E-钙粘蛋白免疫反应评分。
相应地，从PTK2抑制剂的抗癌疗法“可能不会受益的患者”是PTK2抑制剂不具有更高的有治疗效果的可能性的患者。
本发明还涉及如本文所定义的PTK2抑制剂用于制备治疗癌症患者的药物组合物的用途，所述患者的癌症特征在于E-钙粘蛋白免疫反应评分为0-2，优选IRS评分为0-1，和进一步更优选IRS评分为0。
所述药物组合物可以进一步包括药学上可接受的载体和/或稀释剂。合适的药学上可接受的载体和/或稀释剂的例子是本领域公知的并包括磷酸缓冲盐溶液、水、乳液如油/水乳液、各种类型的润湿剂、无菌溶液等。包括这样的载体的组合物可以通过众所周知的常规方法配制。
本发明的这些药物组合物可以以合适的剂量施用给受试者。给药方案将由主治医生和临床因素决定。如在医学领域众所周知的，任何一位患者的剂量取决于许多因素，包括病人的体型大小、体表面积、年龄、要施用的具体化合物、性别、给药时间和途径、一般健康状况，和同时施用的其他药物。肠外施用的制剂包括无菌水溶剂或非水溶剂、混悬液、和乳剂。非水溶剂的例子是丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油、和可注射的有机酯如油酸乙酯。含水载体包括水、醇/水溶液、乳剂或混悬液(包括生理盐水和缓冲介质)。肠外载体包括氯化钠溶液、葡萄糖林格氏液、葡萄糖和氯化钠、乳酸林格氏液、或固定油。静脉载体包括流体和营养补充剂、电解质补充剂(如基于葡萄糖林格氏液的那些)，等等。
此外，本发明的药物组合物可以包括其他试剂，如其他抗癌疗法/剂。其 他抗癌疗法包括但不局限于选自抗赘生剂、抗血管生成剂、化疗剂、和肽类的癌症治疗剂的治疗。抗赘生剂可以选自抗生素型试剂、烷化剂、抗代谢试剂、激素制剂、免疫抑制剂、干扰素型试剂、激酶抑制剂及其组合。这样的药学活性化合物/剂是例如，传统的小的有机化学分子或者可以是大分子，如蛋白、抗体(包括其片段)、肽体、DNA、RNA或这些大分子的片段。
本文描述的PTK2抑制剂或本发明的药物组合物的给药途径取决于具体情况，并且包括(但不限于)口服给药、肠胃外给药(例如静脉给药、肌肉给药、腹腔给药)等，皮下给药、经皮给药、吸入给药、栓剂等。
在另一实施方案中，本发明涉及用于治疗癌症患者的癌症的如本文定义的PTK2抑制剂，所述患者的癌症特征在于E-钙粘蛋白免疫反应评分为0-2，优选IRS评分为0-1，更优选IRS评分为1和进一步更优选IRS评分为0。
优选的在本发明的内容中，癌症患者由或已由本文中所定义的方法(表征或分级)，优选用本文描述的IHC方法确定。所述的确定或分级方法可以在使用所述PTK2抑制剂的所述治疗之前和/或过程中进行。
本发明确立了癌症样品的E-钙粘蛋白免疫反应评分与各自的癌症对PTK2抑制剂治疗的敏感性很好地相关。基于此发现，现在可以基于各自的E-钙粘蛋白IRS选择合适的抗癌治疗，所述治疗对于患癌症的癌症患者，和尤其是患有癌瘤(carcinoma)的癌症患者是潜在治疗有效的。
基于本发明的发现，E-钙粘蛋白免疫反应评分(IRS)大于3的患者和/或癌症应该对PTK2抑制剂治疗不易感。这些患者可以另外地或可选地用替代的抗癌疗法治疗，虽然不能排除PTK2抑制剂在这些患者中仍然有产生有益效果的可能性。因此，虽然预期各自PTK2抑制剂不会像在这些特征在于E-钙粘蛋白IRS为2、优选为1和进一步更优选为0的患者中那样有效，但仍然可以在IRS为3或大于3的病人中施用这些化合物。因此，可以理解，通过本发明的方式根据各自的E-钙粘蛋白IRS评分可以选择更合适的治疗形式。
因此，本发明在另一实施方案中涉及一种为癌症患者选择抗癌治疗的方法，包括以下步骤：
(a)确定所述患者的癌症样本的E-钙粘蛋白免疫反应评分；并且
(b)如果步骤(a)确定的E-钙粘蛋白免疫反应评分为2、1或0(优选1和更优选0)，优选地选择一种PTK2抑制剂作为所述患者的抗癌治疗，或
(c)如果步骤(a)确定的E-钙粘蛋白免疫反应评分为3或4，优选地选择替代或其他抗癌疗法。
“优选地选择一种PTK2抑制剂作为抗癌治疗”是指为具有E-钙粘蛋白免疫反应评分2、1或0(优选1和更优选0)的癌症优选使用基于PTK2抑制剂的治疗。然而，据设想，E-钙粘蛋白免疫反应评分为3或3以上的癌症也可以用PTK2抑制剂治疗，因为虽然清楚表明对这些患者使用PTK2抑制剂获得治疗效果的概率较低，但高IRS评分(3-4)不一定必然排除这些PTK2残留的治疗效果。在这种情况下(3或3以上的高IRS评分)，优选不单独使用PTK2抑制剂。
基于本发明的新发现，即特征在于E-钙粘蛋白免疫反应评分为2、1或0(优选1和更优选0)的癌症对PTK2抑制剂敏感，也可以设想提供一种筛选方法，
其应用E-钙粘蛋白免疫反应评分为2、1或0(优选1和更优选0)表征的癌细胞筛选PTK2抑制剂，因为这些癌细胞对PTK2抑制剂(更)敏感，并从而能够使新的PTK2抑制剂的鉴定为阳性(否则，当应用特征在于E-钙粘蛋白免疫反应评分为3或3以上的癌细胞时可能会将其弃用)。
因此，在另一实施方案中，本发明涉及一种治疗有效的PTK2抑制剂的筛选方法，包括以下步骤：
(a)提供特征在于E-钙粘蛋白免疫反应评分为2、1或0(优选1和更优选0)的癌细胞或癌细胞系
(b)将步骤(a)的癌细胞或癌细胞系与PTK2抑制剂接触；并
(c)评估PTK2抑制剂是否对癌细胞/癌细胞系产生不利影响。
上述筛选方法优选是一种“表型”的筛选方法，该方法应用癌细胞响应PTK2抑制剂产生的表型上可检测的变化(然后这些响应表明PTK2抑制剂是否治疗有效)。术语“表型上可检测的变化”是指对癌细胞有负面影响的变化。这些负面影响，包括例如细胞死亡(如凋亡或坏死)、降低癌细胞/癌细胞系的迁移能力和/或抑制这些细胞的增殖。然而，这个列表不是排他的，即本领域技术人员知晓癌细胞其他可能表明试验化合物实际上对各细胞产生了负面影响的表型上的变化。通过上述筛选方法的方式确定治疗有效的PTK2抑制剂会更容易。
本发明还涉及一种药物包装，其包括至少一种PTK2抑制剂，和：
(a)指导和/或印刷品表明所述PTK2抑制剂优选地用于治疗患有癌症的患者，所述癌症特征在于E-钙粘蛋白免疫反应评分为2或小于2；和/或
(b)指导和/或印刷品表明所述患者通过本文描述的方法进行分级；和/或
(c)进行本文所定义的方法的装置。
“进行本文所定义的方法的装置”特别地包括E-钙粘蛋白的特异性抗体，如本文其他地方所述的阳性和/或阴性对照，可用于为IHC方法的缓冲液，和/或可用于本发明的检测方法的其它方式，例如对照抗体、二次抗体、用于IHC的玻璃或塑料载片等。
在另一实施方案中，本发明涉及包含一种PTK2抑制剂和进一步包含用于预测E-钙粘蛋白IRS的E-钙粘蛋白抗体的药物试剂盒或包装。
在另一实施方式中，本发明涉及包含用于预测E-钙粘蛋白IRS的E-钙粘蛋白抗体和PTK2抑制剂的诊断试剂盒或包装，所述PTK2抑制剂用于治疗已经确定、表征、鉴定或根据本发明的方法分级的患者。
在另一方面中，本发明涉及一种试剂盒，优选一种诊断试剂盒或诊断包装，包含根据本发明的手段和方法检测E-钙粘蛋白表达的手段：
(a)进行E-钙粘蛋白检测(评分)的包装说明书和/或指导；和/或
(b)允许验证评分的阳性和/或阴性对照。
术语“包装说明书和/或指导”是用于指包括在诊断产品的商业包装中的习惯指令，所述诊断产品包含关于方法、使用、存储、处理和/或关于该诊断产品的使用警告的信息。“阳性对照”包括表达E-钙粘蛋白的癌症细胞或癌症样本，或可用于如本文所述的标准免疫学方法的E-钙粘蛋白(蛋白对照)。“阴性对照”，包括在蛋白水平上不表达E-钙粘蛋白的参考细胞或参考样本。阳性及阴性对照两者均可用表示各自评分从而协助实践者的图片替换。“检测E-钙粘蛋白表达的手段”特别包括E-钙粘蛋白特异性抗体(即结合E-钙粘蛋白的抗体)。
本发明在另一实施例中涉及E-钙粘蛋白的抗体根据他们对PTK2抑制剂治疗的敏感性在癌症患者分级中的用途。可根据本发明的方法进行分级。
同样地，本发明涉及E-钙粘蛋白抗体在用于确定癌症患者是否对蛋白酪氨酸激酶2(PTK2)抑制剂治疗敏感的方法中的用途。所述方法包括所述癌症患者的癌症样本中E-钙粘蛋白表达的检测，其中E-钙粘蛋白免疫反应评分(IRS)为0-2表明癌症患者对PTK2抑制剂治疗敏感。
本发明人确认了例如通过如本文所述的蛋白免疫反应评分方式评估的E-钙粘蛋白的表达，与各自癌症对PTK2抑制剂治疗的敏感性很好地相关联。然而，可以假定，评估各自的癌细胞时E-钙粘蛋白的mRNA的表达概况同样可预测各自的癌症/癌症患者对PTK2抑制剂治疗的敏感性。因此，必须理解，本发明的主旨可延伸到的E-钙粘蛋白mRNA的评估。因此，本文公开和描述的本发明所有的实施方案同样适用于在癌细胞中E-钙粘蛋白mRNA表达水平的检测。特别假定的是E-钙粘蛋白mRNA下降的表达或不表达E-钙粘蛋白mRNA表明各自的癌/癌症患者对PTK2抑制剂治疗的敏感性增加。允许本领域技术人员评估表达E-钙粘蛋白的癌细胞的表达谱的方法是本领域技术人员公知的，并包括例如Northern杂交、mRNA谱分析技术(包括基于核酸阵列的检测技术)、聚合酶链反应(PCR)技术(例如实时定量PCR或“Q-PCR”)等。可以理解，本发明并不限于这些技术，这仅仅是举例说明一些本领域技术人员已知的技术。术语“定量PCR”或“Q-PCR”是指各种用于量化特定核酸序列的聚合酶链反应的结果的方法。这类方法通常被归入基于动力学的系统，该系统通常确定或比较扩增因子，例如确定阈值循环(Ct)，或作为通常比较目标和标准模板同时扩增产生的产物的量的共同扩增方法。许多Q-PCR技术包括报告探针、嵌入剂、或两者均有。例如但并不限于
Figure BDA00002977210600271
探针(Applied Biosystems)、i-探针、分子信标、Eclipse探针、蝎引物、LuxTM引物、FRET引物、溴化乙锭、
Figure BDA00002977210600272
Green I(Molecular Probes)，和(Molecular Probes)。本领域技术人员知道如何测量各E-钙粘蛋白mRNA的表达水平。
结合附图可以最好地理解本公开的内容，附图通过引用并入本文中。此外，从下面以说明的方式给出的实施例将会更好地理解本发明以及它的许多优点，但并不意欲作为限制。
附图说明：
图1：E-钙粘蛋白在培养的细胞上的表达
将人类肿瘤细胞接种于分室玻片上并用人类E-钙粘蛋白的特异性抗体染色。用荧光染料(Alexa488，绿色信号)标记的第二抗体检测抗体结合。用碘化丙啶(PI，红色信号)染色核DNA。E-钙粘蛋白不存在或在一小部分细胞中表达(参见MiaPaca2和TOV-21G细胞系)。与此相反，BxPC-3细胞以E-钙粘蛋白的强表达显示了上皮细胞表型。
图2：异种移植癌中E-钙粘蛋白的表达
从MiaPaCa-2、As-PC-1和BxPC3细胞衍生的异种移植的肿瘤获得5μm厚的石蜡切片，并使用ABC免疫过氧化物酶方法接苏木精复染对E-钙粘蛋白进行染色。肿瘤细胞的膜的棕色染色表明标记物蛋白的存在(MiaPaca2中没有染色；As-PC-1(30%)和BxPC-3(>60%)中棕色染色)。
实施例：
下面的实施例说明本发明。不应该将这些实施例解释为限制本发明的范围。包括实施例用于说明目的，而本发明仅由权利要求限制。
实施例1：人类肿瘤异种移植对PTK2抑制剂的敏感性
异种移植模型建立如下：在用于实验前，允许约6周龄的无胸腺雌性BomTac:NMRI-Foxn1nu裸鼠适应新环境至少3天。在标准条件下在
Figure BDA00002977210600281
II型笼中5只一组安置动物。提供标准饮食(PROVIMI KLIBA)和自由采食的蒸压自来水。为建立皮下肿瘤，通过胰蛋白酶消化、离心、洗涤并重新混悬于冰冷的PBS+5%FCS收获细胞。然后将100μL包含5,000,000个细胞的细胞混悬液皮下注射到裸鼠的右侧(每只鼠1个位点)。当肿瘤已经建立并已达到直径6-9mm时，将小鼠在治疗组和载体对照组间随机分配(细胞注射后10-14天)。每周用游标卡尺测量肿瘤直径3次(周一、周三、周五)。根据公式“肿瘤体积=长*直径2*π/6”计算每个肿瘤的体积[以mm3计]。为监测治疗的副作用，每天检查老鼠的异常情况，并每周3次测量体重(周一、周三、周五)。在开始治疗约三个星期后研究结束时处死动物。出于道德原因在研究中将具有坏死肿瘤或肿瘤大小超过2000mm3的动物提前处死。
生长在裸鼠体内的人类肿瘤异种移植物对PTK2抑制剂治疗的敏感性如下：
Figure BDA00002977210600282
实施例2：确定异种移植模型中E-钙粘蛋白表达的免疫组织化学程序(ABC法)
脱蜡：
-在65℃加热载片1小时；
-将载片在二甲苯中放置3×5分钟，然后在100%无水乙醇，96%乙醇，70%乙醇中(各3×20秒)，然后在蒸馏水；
抗原修复：
-将载片在121℃/1bar在高压釜中在柠檬酸盐缓冲液中放置20分钟；
-允许载片在室温冷却30分钟；
-用PBS洗；
染色：
-在含3%H2O2的PBS中孵育载片5分钟；
-用PBS洗；
-向组织加入M.O.M.封闭剂(2滴=在2500μL PBS中90μL原液)，在室温孵育60分钟；
-用PBS洗；
-向组织加入M.O.M.稀释剂(在7500μL PBS中600μL原液)，室温下孵育5分钟；
-吸干；
-向组织加入抗体(在M.O.M稀释剂中稀释的抗体)，室温下孵育60分钟；
-用PBS洗；
-向组织加入M.O.M.生物素标记的抗小鼠IgG试剂(在2500μL M.O.M.稀释剂中10μL原液)，室温下孵育10分钟；
-用PBS洗；
-向组织加入Vectastain ABC Elite Kit(使用前30分钟：2滴A+2500μLPBS，混合，加2滴B，混合；Vector#PK-6200)，室温下孵育10分钟；
-用PBS洗；
-载片在PBS/0.5%Triton X-100中4分钟；
-在DAB溶液中染色；
-用PBS洗；
-载片在蒸馏水中放置1分钟；
复染：
-载片在苏木精溶液中放置1分钟；
-自来水冲洗；
-载片在HCl/乙醇中放置1秒；
-自来水冲洗；
-载片在氨水(ammonium water)中放置20秒；
-自来水冲洗；
-载片在70%乙醇，96%乙醇，100%乙醇(3次/20秒每次)；
-载片在二甲苯中1分钟，2分钟，2分钟；
缓冲液和试剂：
柠檬酸缓冲液：
21.01克一水柠檬酸在800mL蒸馏水中
用2M NaOH调节pH=6，然后加蒸馏水至1000mL
Tris/EDTA缓冲液：0.01M Tris/0.001M EDTA；pH=8
HCl/乙醇：
175mL无水乙醇
2.5mL HCl37%
72.5mL蒸馏水
氨水：250mL蒸馏水+10滴氨溶液(32%)
苏木精：160mL巴氏(Papanicolaou)溶液1a Harris氏苏木精溶液，Merck＃1.092.530.500+80mL蒸馏水
(使用前过滤)！
DAB溶液：125mgDAB在250mL PBS/0.5%Triton X-100中，过滤并在使用前加入25μL30%H2O2
小鼠抗E-钙粘蛋白(Abcam＃ab1416；1：100)
M.O.M.kit basic:Vector#BMK-2202
实施例3：E-钙粘蛋白在培养的细胞上的表达
将人类肿瘤细胞接种于分室玻片上并用人类E-钙粘蛋白的特异性抗体染色。用荧光染料(Alexa488，绿色信号)标记的第二抗体检测抗体结合。用碘化丙啶(PI，红色信号)染色核DNA。E-钙粘蛋白不存在或在一小部分细胞中表达(参见MiaPaca2和TOV-21G细胞系)。与此相反，BxPC-3细胞以E-钙粘蛋白的强表达显示了上皮细胞表型。本实验的结果如图1所示。
实施例4：确定培养的肿瘤细胞上E-钙粘蛋白表达的免疫荧光程序
-在4室组织培养处理的玻璃载片上使选择的细胞系生长，直到接近融合；-吸出组织培养基并用丙酮/甲醇(1:1v/v)在4℃时固定载片10分钟；
-允许载片在室温干燥5分钟并冻存在-80℃直至使用；
染色：
-在室温下解冻载片10分钟；
-用PBS洗；
-室温下在封闭血清10%正常山羊血清中孵育载片10分钟；
-吸干血清而不洗载片；
-在室温在2%BSA/PBS中1:200稀释的E-钙粘蛋白抗体中孵育60分钟；
-用PBS洗；
-室温下用Alexa488接合的山羊抗小鼠第二抗体(在PBS中1:1000稀释)孵育45分钟；
-用PBS洗；
-室温下用含0.5μg/mL碘化丙啶的PBS染色2分钟；
-用PBS洗；
-用Dako荧光封固培养基盖片；在4℃储存在黑暗中直到显微镜检查；
缓冲液和试剂：
柠檬酸缓冲液：
21.01克一水柠檬酸在800mL蒸馏水中
用2M NaOH调节pH=6，然后加蒸馏水至1000mL
小鼠抗人E-钙粘蛋白(Abcam＃ab1416)
正常山羊血清(Vector Laboratories＃S-1000)
Alexa488标记的山羊抗小鼠Invitrogen＃A-11017
DakoCytomation荧光封固培养基#S3023
碘化丙啶Sigma#P4170
实施例5：确定人体组织样品中E-钙粘蛋白表达的免疫组织化学程序(ABC法)
脱蜡：
-在65℃加热载片1小时；
-将载片在二甲苯中放置3×5分钟，然后在无水乙醇，96%乙醇，70%乙醇中(各3×20秒)；
-在蒸馏水中洗；
抗原修复：
-将载片在121℃/1bar在高压釜中在柠檬酸盐缓冲液中放置20分钟；
-允许载片在室温冷却30分钟；
-用PBS洗；
染色：
-在含3%H2O2的PBS中孵育载片5分钟；
-用PBS洗；
-向组织加入封闭血清：在PBS/2%BSA中10%正常马血清(VectorLaboratories#S-2000)，室温下孵育30分钟；
-吸干血清而不洗载片；
-向组织加入小鼠抗E-钙粘蛋白(Abcam#ab1416；在PBS/2%BSA中1:200稀释)，室温下孵育60分钟；
-用PBS洗；
-向组织加入生物素标记的马抗小鼠IgG(Vector Laboratories#BA-2000；在PBS中1:200稀释)，室温下孵育30分钟；
-用PBS洗；
-向组织加入Vectastain ABC标准试剂盒(在PBS中1:100稀释；Vector#PK-4000)，室温下孵育30分钟；
-用PBS洗；
-载片在PBS/0.5%Triton X-100中放置4分钟；
-在DAB溶液中染色；
-用PBS洗；
-载片在蒸馏水中放置1分钟；
复染：
-载片在苏木精溶液中放置1分钟；
-自来水冲洗；
-载片在HCl/EtOH中放置1秒；
-自来水冲洗；
-载片在氨水中放置20秒；
-自来水冲洗；
-在70%乙醇，96%乙醇，无水乙醇中脱水切片(3次/20秒每次)；
-二甲苯(×3)中1分钟，2分钟，2分钟；
-无水甲醇(entellan)盖片；
缓冲液和试剂：
柠檬酸缓冲液：
21.01克一水柠檬酸在800mL蒸馏水中
用2M NaOH调节pH=6，然后加蒸馏水至1000mL
HCl/乙醇：
175mL无水乙醇
2.5mL HCl37%
72.5mL蒸馏水
氨水：
250mL蒸馏水+10滴氨溶液(32%)
苏木精：
160mL巴氏溶液1a Harris氏苏木精溶液，Merck＃1.092.530.500
80mL蒸馏水
使用前过滤！
DAB溶液：
125mgDAB(Sigma#D5905)在250mL PBS/0.5%Triton X-100中，过滤并在使用前加入25μL30%H2O2
正常马血清(Vector Laboratories#S-2000)
小鼠抗人E-钙粘蛋白(Abcam＃ab1416)
生物素化马抗小鼠IgG(Vector Laboratories＃BA-2000)
Vectastain ABC标准试剂盒(1/100在PBS中，Vector＃PK-4000)
无水甲醇(Merk1.07961.0100)
虽然本发明可以以不同于前面说明书和实施例中特别描述的方法实践。鉴于上述教导，本发明的许多修改和变化是可能的并因此是在所附权利要求的范围内的。
在本发明的背景技术、详细说明和实施例中引用的每篇文献(包括专利、专利申请、期刊文章、摘要、实验手册、书籍或其他披露)的全部公开内容以整体引用的方式并入本文。

Claims (16)

1.一种用于确定癌症患者是否对蛋白酪氨酸激酶2(PTK2)抑制剂治疗敏感的方法，该方法包括检测所述癌症患者的癌症样本中E-钙粘蛋白的表达，其中E-钙粘蛋白免疫反应评分(IRS)为0-2表明癌症患者对PTK2抑制剂治疗敏感。
2.依照权利要求1所述的方法，其中所述癌症患者是哺乳动物。
3.依照权利要求2所述的方法，其中所述哺乳动物是人。
4.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述癌症是癌瘤。
5.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述癌症选自：十二指肠癌、结肠癌、直肠癌和肛门癌；胰腺癌；膀胱癌；肺部肿瘤(小细胞肺癌(SCLC)、非小细胞肺癌(NSCLC)例如鳞状细胞癌、腺癌(腺泡癌、乳头癌、细支气管肺泡癌)和大细胞支气管癌(巨型细胞癌、透明细胞癌))；乳腺癌例如导管癌、小叶癌、粘液癌或管状癌；卵巢癌(卵巢癌瘤-粘液性或浆液性细胞腺癌、子宫内膜癌和透明细胞瘤)；头部和颈部肿瘤；肝脏细胞癌(肝细胞癌(HCC)；肾癌例如(肾透明细胞癌、乳头状肾细胞癌，嫌色肾细胞癌和集合管癌)；前列腺癌和外阴癌。
6.前述权利要求中任一项所述的方法，其中癌症患者的癌症样本中E-钙粘蛋白表达的所述检测通过免疫组织化学(IHC)方法进行。
7.权利要求6所述的方法，其中所述IHC方法采用E-钙粘蛋白特异性的第一抗体和与所述第一抗体特异性反应的第二抗体。
8.一种治疗癌症患者的方法，所述患者的癌症的特征为E-钙粘蛋白免疫反应评分(IRS)为0-2，该方法包括对患者施用治疗有效量的PTK2抑制剂。
9.PTK2抑制剂在制备用于治疗癌症患者的药物组合物的用途，所述患者的癌症的特征为E-钙粘蛋白免疫反应评分(IRS)为0-2。
10.PTK2抑制剂，其用于治疗癌症患者，所述患者的癌症的特征为E-钙粘蛋白免疫反应评分(IRS)为0-2。
11.一种分级对PTK2抑制剂治疗敏感的癌症患者的方法，该方法包括确定所述患者的癌组织样品中E-钙粘蛋白的IRS评分，其中所述E-钙粘蛋白免疫反应评分(IRS)为0-2(即2、1、或0)表示癌症患者对PTK2抑制剂治疗敏感。
12.权利要求8-10任一项所述的方法、用途和/或PTK2抑制剂，其中所述癌症/癌症患者已经通过权利要求1-7或11中任一项所述的方法进行了鉴定、表征和/或分级。
13.权利要求12所述的方法、用途和/或PTK2抑制剂，其中在所述治疗之前和/或期间，已经对所述癌症患者进行了鉴定、表征或分级。
14.一种筛选治疗有效的PTK2抑制剂的方法，该方法包括以下步骤：
(a)提供癌细胞或癌细胞系，其特征为E-钙粘蛋白免疫反应评分为2、1、或0(优选是1和进一步更优选是0)；
(b)将步骤(a)的癌细胞或癌细胞系与PTK2抑制剂接触；和
(c)评估该PTK2抑制剂是否对癌细胞/癌细胞系产生不利影响。
15.一种药物包装，其包括PTK2抑制剂，以及：
(a)表明所述PTK2抑制剂是用于治疗癌症患者的指示和/或说明书，所述患者患有以E-钙粘蛋白免疫反应评分2、1、或0(优选是1和更优选是0)为特征的癌症；和/或
(b)表明所述患者是由权利要求11所述的方法进行分级的指示和/或说明书；和/或
(c)进行前述权利要求任一项所述方法的装置。
16.E-钙粘蛋白抗体，其用于根据癌症患者对PTK2抑制剂治疗的敏感性对其进行分级。
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