JP2013540108A - Ptk2阻害物質での治療に対する感受性についてのがん患者の層別化 - Google Patents
Ptk2阻害物質での治療に対する感受性についてのがん患者の層別化 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2013540108A JP2013540108A JP2013529666A JP2013529666A JP2013540108A JP 2013540108 A JP2013540108 A JP 2013540108A JP 2013529666 A JP2013529666 A JP 2013529666A JP 2013529666 A JP2013529666 A JP 2013529666A JP 2013540108 A JP2013540108 A JP 2013540108A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cancer
- ptk2
- cadherin
- patient
- treatment
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
- G01N33/57492—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites involving compounds localized on the membrane of tumor or cancer cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
- C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
- G01N33/57496—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites involving intracellular compounds
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
- G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
- G01N2333/91—Transferases (2.)
- G01N2333/912—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
- G01N2333/91205—Phosphotransferases in general
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/52—Predicting or monitoring the response to treatment, e.g. for selection of therapy based on assay results in personalised medicine; Prognosis
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Oncology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
Description
したがってPTK2阻害物質での治療から最も恩恵を受けやすい患者の選択に関する予測的バイオマーカーの同定は、緊急に必要とされている。治療効果に関連して現在利用可能であるそのような予測的バイオマーカーまたは遺伝子サインは無い。
ヒトがんの異種移植モデルを使用する本発明者らの前臨床研究において本発明者らは、例えば免疫組織化学的(IHC)方法で評価されうるがん細胞におけるE−カドヘリンタンパク質の発現レベルがPTK2阻害物質に対する感受性を予測するために使用されうることを驚くべきことに見出した。この観点から、本発明者らはがん/がん患者がPTK2阻害物質での治療に対して感受性であるか否かを判定するために、PTK2阻害物質の投与の前にE−カドヘリン発現レベルを検査することを提案する。本発明のさらなる実施形態は、本明細書において特徴付けられ、かつ記載され、特許請求の範囲においても反映される。
当業者は、本明細書に記載の本発明の具体的な実施形態について多数の等価物を認識するまたは日常的実験だけを使用して確認できる。そのような等価物は、本発明によって包含されると意図される。本明細書および続く特許請求の範囲全体を通じて、内容が他を必要とする場合を除いて、用語「含む」ならびに「含む」および「含んでいる」などの変化形は、記述される整数もしくはステップまたは整数もしくはステップの群の含有を意味するが、任意の他の整数もしくはステップまたは整数もしくはステップの群の排除を意味しないと理解される。
第一の態様において本発明は、がんおよび各がん患者がPTK2阻害物質での治療に対して感受性であるかどうかを判定するための方法であって、前記がんまたはがん患者からの(採取された)がん試料におけるE−カドヘリンタンパク質の発現を検出するステップを含み、0〜2、好ましくは0〜1のE−カドヘリンタンパク質免疫反応性スコア(IRS)、より好ましくは1のIRSスコアおよびさらにより好ましくは0のIRSスコアががんおよび各がん患者がタンパク質チロシンキナーゼ2(PTK2)阻害物質での治療に対して感受性であることを示す、方法に関する。
がん試料が、がん患者から好ましくは採取されることは理解されるが、前記患者から前記がん試料を採取するステップが必然的に本発明の範囲に含まれることを意味しない。
したがってE−カドヘリンは、上皮細胞およびほとんどの上皮由来がんに関するバイオマーカーとして役立つ。近年の免疫組織化学的分析は、がん細胞でのE−カドヘリンの膜発現の低下が上皮がんを有する患者における有害な予後特性および全生存の低下に関連することを示している(Saito T,et al;Cancer,2003;97:1002-9)。したがってE−カドヘリンはそのように上皮細胞に関するバイオマーカーであるだけでなく、癌腫進行に関する予後マーカーとしても役立ちうる可能性がある。
上皮がん細胞の膜上のE−カドヘリンのタンパク質発現の低下または発現の欠失は、本発明者らの前臨床研究において、驚くべきことに(ヒトがんの動物モデルにおける顕著ながん増殖阻害およびがん退縮にも翻訳される)PTK2阻害への各がん細胞の感受性と良く相関することが見出された。したがってE−カドヘリン発現レベルは、PTK2阻害物質での治療に関する患者の選択のためのバイオマーカーとして役立ちうる。これらのPTK2阻害物質は、当業者に十分周知であり、本明細書以下にも極めて詳細に記載される。低いE−カドヘリン発現を有するがん(例えば0〜2の、好ましくは0〜1のE−カドヘリンスコア、より好ましくは1のおよびさらにより好ましくは0のIRSスコア(前記スコアは本明細書において詳細に説明される))は、高いE−カドヘリン発現を有するがんよりもPTK2阻害物質での治療により感受性でありやすいことは本発明者らによって実証されうる。
「がん細胞の膜」は、がん細胞の内部からがん細胞の外部を分離する細胞膜を意味する。E−カドヘリンは、上皮細胞の細胞膜上で通常発現されており、組織内の細胞が組織統合性を維持するために相互に確実に付着することを確実にしている。
PTK2阻害物質で治療されうる患者のがん試料が前記PTK2阻害物質での治療前に、治療中におよび/または治療後に採取されることは想定される。好ましくは試料は、本発明の手段および方法に従ってがん患者がPTK2阻害物質での治療に対して感受性でありうるか否か、患者がPTK2阻害物質での治療に有利に応答しうるか否か、または患者がPTK2阻害物質での治療から利益を得うるか否かを判定するために治療前に採取される。
本明細書において使用される用語「がん」は、全ての前がん性およびがん性の細胞および組織を含む悪性細胞成長および増殖を意味する。がんは、場合により本明細書において悪性がんまたは新生物または腫瘍とも記される。がん化した上皮細胞の浸潤性悪性がん、すなわち癌腫は、本発明の実施形態において好ましい。したがって本発明の実施形態において前記がん試料は、本質的に悪性上皮がん細胞からなる/を含むことが想定される。
本明細書において記載されるがんは、転移性(すなわちがん転移)であってもまたは非転移性であってもよい。
好ましくは前記対象は、ヒト、ウマ、ラクダ、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ヤギなど哺乳動物または家禽である。ヒト対象が最も好ましい。本発明の組成物、化合物、使用および方法は、したがってヒトの治療および獣医学的適用の両方に適用可能である。
本検査は、活性PTK2酵素(Invitrogen コードPV3832)およびキナーゼ基質としてポリ−Glu−Tyr(4:1、Sigma P−0275)を使用する。キナーゼ活性は、DELFIA(商標)アッセイで基質のリン酸化の方法によって検出される。リン酸化された基質は、ユーロピウム標識リン酸化チロシン抗体PT66(Perkin Elmer、No.AD0040)で検出される。PTK2阻害物質での濃度−活性曲線を決定するために化合物は10%DMSO/H2O中に系列希釈され、各希釈物10μLは96ウェルマイクロタイタープレート(透明U型底プレート、Greiner No.650101)の各ウェルに入れられ(阻害物質は2回ずつ検査される)、1ウェルあたり10μLのPTK2キナーゼ(1ウェルあたり0.01μg)と混合される。PTK2キナーゼは、キナーゼ希釈緩衝液(新鮮調製BSA(フラクションV、1mg/mL)およびDTT(1mM)が添加された20mM TRIS/HCl pH7.5、0.1mM EDTA、0.1mM EGTA、0.286mMオルトバナジン酸ナトリウム、10%グリセロ−ル)で予め希釈される。被検化合物およびPTK2キナーゼは、室温で1時間、500rpmで振盪して予備インキュベートされる。次いでATP混合物(30mM TRIS/HCl pH7.5、0.02%Brij、0.2mMオルトバナジン酸ナトリウム、10mM酢酸マグネシウム、0.1mM EGTA、1×ホスファターゼ阻害物質カクテル1(Sigma、No.P2850)、50μM ATP(Sigma、No.A3377;15mM stock solution))20μLが添加される。反応は、1ウェルあたり10μLのポリ(Glu、Tyr)基質(250mM TRIS/HCl pH7.5、9mM DTTに溶解された1ウェルあたり25μgのポリ(Glu、Tyr)、1ウェルあたり0.05μgのビオチン化ポリ(Glu、Tyr))の添加によって開始される−DMSO最終濃度は2%。1時間のキナーゼ反応後(プレートは500rpmで振盪される)、反応は1ウェルあたり12μLの100mM EDTA、pH8の添加によって停止される。さらに5分間、室温で振盪される(500U/分)。
次いで時間遅延ユーロピウム蛍光が、マイクロタイタープレートリーダー(Victor、Perkin Elmer)で測定される。陽性対照は、溶媒(検査緩衝液中の2%DMSO)を含み、阻害されていないキナーゼ活性を示すウェルからなる。酵素の代わりに検査緩衝液を含むウェルは、バックグラウンドキナーゼ活性についての対照となる。IC50値は、可変ヒル係数と共にシグモイド曲線分析アルゴリズム(GraphPAD Prism Version3.03に基づくFIFTY)を使用する反復計算による濃度−活性分析から決定される。
この細胞性検査は、ソフトアガー中のPC−3前立腺癌細胞の増殖におけるPTK2阻害物質の影響を判定するために使用される(「足場非依存性増殖」)。2週間のインキュベーション時間の後、細胞の生存能力をAlamar Blue(レザズリン)染色によって実証する。PC−3細胞(ATCC CRL−1435)は、10%ウシ胎児血清(Invitrogen、No.16000−044)を添加したF12カイン培地(Gibco、No.21127)を含む細胞培養フラスコ(175cm2)中で培養される。培養物はインキュベーター中、37℃、5%CO2でインキュベートされ、2週間に1度実施される。検査はマイクロタイタープレート(Greiner、No.655 185)中で実行され、1.2%アガロースを含む培地90μLから作製される下層(Invirogen、4%agarose gel 1×liquid 40mL、No.18300−012)に続く0.3%アガロースを含む60μL培地の細胞層、および最後に被検化合物を含有する30μL培地(アガロースは添加されない)を含む上層からなる。下層を調製するために4%アガロースは10×D−PBS(Gibco、No.14200)およびH2Oと共に加熱され、次いで1×D−PBS中の3%アガロースで予備希釈される。後者は培養培地(F12カイン/10%FCS)およびFCSで10%FCSを含むF12カイン培地中の1.2%アガロース最終希釈に調製される。マイクロタイタープレートの各ウェルは、下層用に懸濁液90μLを添加され、室温まで1時間冷却される。細胞層用に、PC−3細胞はトリプシン(Gibco、0.05%、No.25300)を使用して剥離され、計数され、0.3%アガロースを添加したF12カイン(10%FCS)60μL中に播種される(37℃)。室温まで1時間冷却後、被検化合物(系列希釈から30μL)が四重測定のために加えられる。被検化合物の濃度は10μMから0.3nMの間の検査範囲を通常網羅する。化合物(保存溶液:100%DMSO中10mM)は、1%DMSOの最終濃度を得るために6%DMSOを含むF12カイン培地中に予備希釈される。細胞は、37℃、5%CO2、飽和蒸気雰囲気中で14日間インキュベートされる。次いで生存細胞の代謝活性は、色素Alamar Blue(AbD Serotec、No.BUFO 12B)で実証される。これを実施するためにAlamar Blue懸濁液1ウェルあたり18μLが添加され、全体がインキュベーター中37℃でおよそ8時間インキュベートされる。陽性対照は、加圧滅菌で還元された18μLのAlamar Blueと180μLのF12カイン培地(10%FCS)との混合物で満たされた空のウェルからなる。蛍光強度は、蛍光スペクトロメーター(SpectraMAX GeminiXS、Molecular Devices)の手段によって測定される。励起波長は530nmであり、発光波長は590nmである。
EC50値は、可変ヒル係数と共にシグモイド曲線分析アルゴリズム(GraphPAD Prism Version3.03に基づくFIFTY)を使用する反復計算による濃度−活性分析から決定される。
この細胞検査は、チロシン397でのPTK2リン酸化の状態(pY397)へのPTK2阻害物質の影響を測定するために使用される。
PC−3細胞(前立腺癌、ATCC CRL−1435)は、10%ウシ胎児血清(Invitrogen、No.16000−044)を添加したF12カイン培地(Gibco、No.21127)を含む細胞培養フラスコ(175cm2)中で培養される。培養物はインキュベーター中、37℃、5%CO2でインキュベートされ、2週間に1度実施される。
前記IRSスコアは、IHC法の手段によって好ましくは評価(検出)されるが、他の免疫学的方法は排除されない。
本発明に沿う結合ドメインの好ましい例は、エピトープ結合ドメイン、好ましくは抗体、より好ましくはモノクローナル抗体またはその抗原結合断片であるかまたはこれらを含む。
− E−カドヘリンの細胞外ドメインに対するマウスモノクローナル抗体[HECD−1](Abcam Ab1416)
− E−カドヘリンの120kD成熟形態および82kD断片を認識するE−カドヘリンに対するマウスモノクローナル抗体(Dako M3612)
− ヒトE−カドヘリンの細胞質ドメインと反応する;マウス抗E−カドヘリンモノクローナル抗体(Invitrogen 18−0223)
− E−カドヘリンに対するマウスモノクローナル抗体(Sigma−Aldrich WH0000999M1)
− E−カドヘリンに対するウサギポリクローナル抗体(Cell Signalling 4065)
標識は、本発明の内容において分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的または化学的手段によって検出可能な化合物または組成物を意味する。
標識は、直接的または間接的に検出可能でありうる。
「直接的」は、放射活性、発光性または蛍光性シグナルなどのシグナルを生成する標識を意味する。直接標識は、放射線標識、蛍光標識、高電子密度試薬などを含む。直接標識は、結合した結合ドメインを定量および/または(定性的に)検出するために使用されうる測定可能なシグナルを有するかまたは生成する。
「間接的」は、標識が検出可能になるように例えば他の実体によって結合されることを意味する(検出実体)。間接的検出または間接的標識は、間接的標識への第2の直接的または間接的に検出可能な結合ドメインの結合を含む。例えば、本発明の結合ドメインの間接標識は、(ストレプトアビジンに対する結合パートナーである)ビオチン、または特異的にハイブリダイズできるなどの(相補的配列に対する結合パートナーである)ヌクレオチド配列など結合パートナーのリガンドでありうる。したがって「間接的標識」は、操作(例えばビオチン標識)に対して特異的な二次結合ドメイン(場合により検出実体とも記される)によって検出可能でありうるように一次結合ドメインが操作されることにおいて特徴付けられる。
間接的および直接的標識化が混合されることも想定される。例えば直接標識は既にシグナルを生成することができる(例えばFITCなどの蛍光標識)が、二次結合ドメインは例えば、一次シグナルの標識に結合する標識(抗FITC抗体)に特異的に結合する直接標識でも標識され、検出可能なシグナルを増加させることもできる。そのような手段および方法は、当業者、特に免疫化学の分野の実務家に十分周知である。
他の実施形態において一次結合ドメイン(例えば抗体)はそのように標識されないが、一次結合ドメインに結合する二次結合ドメイン(検出実体)の手段(例えばマウスで産生された一次非標識抗体は、別の種で産生され、マウス抗体に特異的に結合する二次、標識抗体(例えばヤギ抗マウス抗体)によって検出される)によって検出される/検出可能である。次いで二次結合ドメインは、直接的にまたは間接的に標識される。そのような抗体検出サンドイッチは、十分に確立されており、当業者はそのような系を生成/確立または作るために問題を有さない。
「in vitro」と互換的である用語「ex vivo」は、制御された条件下で細胞中において実施される活動を意味する。本発明の方法はex vivoで実施される。
次いでこれらの相互作用は、前述の標識によって可視化される。組織中の抗原の免疫組織化学的(IHC)検出のために使用される主に2つの戦略、直接法および間接法がある。IHCの直接法は、染色される標的に直接結合する1つの直接標識された結合ドメインを使用する。したがって直接法は、1ステップ染色法であり、例えば組織切片中で抗原と直接反応する標識抗体(例えばFITCコンジュゲート抗血清)を含む。この技術は抗体を1つだけ利用し、したがって手順は、簡便かつ迅速である。IHCの間接法は、E−カドヘリンに対する1つの結合ドメインおよび、第一結合ドメインに対する第二の標識された結合ドメインを使用する。第二結合ドメインは、例えば第一抗体が産生された動物種のIgGに対して産生された抗体である。
(a)がん試料を提供してもよい(または代替的にがん試料を含む容器を提供してもよい)ステップ;
(b)前記がん試料の固定ステップ;
(c)がん試料をパラフィン中に包埋してもよいステップ;
(c)固定されたがん試料のE−カドヘリン特異的結合ドメインとのインキュベーションステップ;
(d)結合ドメインおよびそれによりがん細胞上のE−カドヘリン発現を直接的または間接的に検出するステップ
によって特徴付けられることが想定される。
上の予備処置ステップ/測定の全ては用語「固定」の範囲内であり、すなわち具体的に固定はホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒドなどの固定剤での固定;および/もしくは組織試料/細胞のサブセットの低温凍結を含み、ならびに/または組織/細胞のサブセットのパラフィンもしくは同様の薬剤中への包埋も含んでもよい。
a)0.1Mリン酸緩衝液中の4%パラホルムアルデヒド
b)0.1Mリン酸緩衝液中の0.2%ピクリン酸を含む2%パラホルムアルデヒド
c)PLP(パラホルムアルデヒド、リジン、パラホルムアルデヒド)固定剤:例えば0.1Mリン酸緩衝液中の4%パラホルムアルデヒド、0.2%過ヨウ素酸および1.2%リジン
d)0.05%グルタルアルデヒドを含む4%パラホルムアルデヒド
これらの緩衝液は本発明を限定する意図はなく、組織の十分な固定を達成するために通常適用される具体的な条件を単に例示する。標準的固定時間は約5、10、15、20、30分間から一晩である。そのように処置された組織は、続くパラフィン包埋プロトコールにしばしば供され、例えばキシレンおよびエタノール処置などの有機溶媒中でのインキュベーションが続く。次いで試料は、それを95%、70%、50%、30%アルコール(例えばエタノール)中に各数分間置くことによって通常水和される。しかしIHC用の標準的プロトコールはなく、すなわちプロトコールは組織、使用される結合ドメインなどに応じて変更される。これらは全て当業者に周知であり、さらなる労力をかけることなく日常的に扱われる。具体的なプロトコールが、例えばインターネットにおいて開示されている(Googleなどの検索マシンにおいて文字列「IHCプロトコール」で検索可能)。いくつかの抗原は、アルデヒド固定の中程度の量でさえ耐えられない。この条件では組織は液体窒素中にしばしば新鮮凍結され、クリオスタットで切断される。切片は冷アセトンまたはアルコールでの固定まで−20℃またはそれ以下で凍結を維持される。
本発明のIHC法が、さらなるがん関連シグナルおよびまたはがん細胞の他の細胞内シグナルを確認するまたは検出するためにin situハイブリダイゼーション技術(例えば蛍光in situハイブリダイゼーション)などの組織切片に適用できる他の技術と組み合わされることが想定される。
本質的に本発明の主旨は、がん細胞中のE−カドヘリンタンパク質の発現レベルがPTK2阻害物質への各がんの感受性を予測するために使用されうるという驚くべき発見である。この観点から、0〜2のE−カドヘリンタンパク質免疫反応性スコア(IRS)、好ましくは0〜1のIRSスコア、より好ましくは1のIRSスコアおよびさらにより好ましくは0のIRSスコアががん/がん患者がPTK2阻害物質での治療に対して感受性であることを示す、患者由来のがんにおいて/がん試料においてE−カドヘリンタンパク質の発現を検出することが想定される。
各試料由来の切片全体が分析され、検査された組織学的視野全体中のがん細胞の総数に対するE−カドヘリン陽性細胞の数としてE−カドヘリン陽性がん細胞の百分率の平均が決定された。がん細胞における膜E−カドヘリン免疫反応性だけがスコアリングの目的のために陽性とみなされた。病理学分野の当業者は、方法を実施する際に現在の条件下でどの細胞が関連するかを理解し、彼/彼女の全般的知識および本開示の教示に基づいて陽性細胞の画分を決定できる。
本明細書において提案するスコアリングは、半定量的であり;タンパク質発現レベルは0、1、2、3または4(0は実質的にタンパク質発現を検出できない(1%未満)であり、4は最も高く検出されたタンパク質発現(>60%))として記録される。
前述の「対照」「陽性対照」または「対照試料」は、好ましくは、例えば両試料が主に同じ細胞型からなる(例えば両者が上皮細胞からなる)または両試料が異なる供給源由来だが同じ組織由来であることにより、被検試料との比較を可能にする試料(細胞または組織)である。「異なる供給源」は、例えば健康な対象から、好ましくはがんを罹患していない対象から採取された細胞/組織試料、または同じ対象の離れた部分から採取された細胞/組織試料(前記離れた部分はがんの関連する症状を有さないと考えられる)を含む。
0(1%未満)、1(約1〜10%)、2(約11〜30%)、3(約31〜60%)、4(>60%)。それにより「陽性細胞」は本明細書の上に説明の通りのE−カドヘリン発現を示しているがん細胞を意味する。本明細書において述べるスコアリングは、本発明の全ての実施形態に適用される。好ましくは、IRS−0のE−カドヘリンタンパク質免疫反応性スコア(IRS)は、検査された1つまたは複数の組織学的視野におけるがん細胞の総数に対して平均1%未満の膜E−カドヘリン陽性がん細胞によって特徴付けられ;IRS−1は、検査された1つまたは複数の組織学的視野におけるがん細胞の総数に対して平均約1〜10%の膜E−カドヘリン陽性がん細胞によって特徴付けられ;IRS−2は、検査された1つまたは複数の組織学的視野におけるがん細胞の総数に対して平均約11〜30%の膜E−カドヘリン陽性がん細胞によって特徴付けられ;IRS−3は、検査された1つまたは複数の組織学的視野におけるがん細胞の総数に対して平均約31〜60%の膜E−カドヘリン陽性がん細胞によって特徴付けられ;およびIRS−4は、検査された1つまたは複数の組織学的視野におけるがん細胞の総数に対して平均60%を越える膜E−カドヘリン陽性がん細胞によって特徴付けられる。述べられたスコアリングは、好ましい実施形態において、パラホルムアルデヒド固定およびパラフィン包埋組織試料を使用してIHCを介して実施される。
「1つまたは複数」は、この件については分析される(好ましくは1試料あたり)1、2、3、4、5、6、7、8、9またはそれ以上の組織学的視野を条件に応じて含む。少なくとも「3個」の組織学的視野が好ましい。
上のデータは、E−カドヘリンの少量の発現または発現の欠如がPTK2阻害物質への前臨床がんモデルの感受性に対応することを示し、E−カドヘリン発現がん細胞の中程度から高い百分率を有するがんはあまり感受性でないまたは感受性でないと考えられる。この観点からE−カドヘリンタンパク質免疫反応性スコア0〜2、好ましくは0〜1のIRSスコア、およびさらにより好ましくは0のIRSスコアはがん/がん患者がPTK2阻害物質での治療に対して感受性であることを示すことが証明されえた。
「腫瘍増殖阻害」または「TGI」は次の通り定義される:
本発明の実施形態の内容において、E−カドヘリンタンパク質免疫反応性スコアが、上に示すおよび本明細書で例示する通りIHC法の手段で好ましくは評価されることは理解される。本発明はこれらの具体的プロトコールに限定されないが、適切なIHC法は本明細書に記載される。
具体的にはPTK2阻害物質での抗がん治療から「利益を得られる患者」は、PTK2阻害物質が治療効果を有する高い可能性を有する患者である。がんおよび/またはがん患者が好ましく応答しうるか否かの可能性は、本明細書に記載のとおり前記患者の各がん細胞の細胞膜上のE−カドヘリンタンパク質免疫反応性スコアに依存する。
対応して、PTK2阻害物質での抗がん治療から「利益を得られない場合がある患者」は、PTK2阻害物質が治療効果を有する高い可能性を有さない患者である。
前記医薬組成物は、薬学的に許容される担体および/または希釈剤をさらに含みうる。適切な薬学的に許容される担体および/または希釈剤の例は当技術分野において十分周知であり、リン酸緩衝生理食塩水、水、油/水乳濁液などの乳濁液、種々の種類の湿潤剤、滅菌溶液などを含む。そのような担体を含む組成物は、十分周知の従来法によって製剤されうる。
さらに本発明の医薬組成物は、付加的抗がん治療/剤などの薬剤をさらに含みうる。付加的抗がん治療は、抗悪性腫瘍剤、抗血管新生剤、化学療法剤およびペプチドがん治療剤から選択されうる治療をこれだけに限らないが含む。抗悪性腫瘍剤は、抗生物質型薬剤、アルキル化剤、代謝拮抗剤、ホルモン剤、免疫学的薬剤、インターフェロン型薬剤、キナーゼ阻害剤およびこれらの組合せから選択されうる。そのような薬学的に活性な化合物/薬剤は、例えば伝統的な小さな有機化学的分子であるか、またはタンパク質、抗体(その断片を含む)、ペプチボディー、DNA、RNAなどの巨大分子もしくはそのような巨大分子の断片でありうる。そのような治療は当業者に十分周知である。
さらなる実施形態において本発明は、0〜2のE−カドヘリンタンパク質免疫反応性スコア、好ましくは0〜1のIRSスコア、より好ましくは1のIRSスコアおよびさらにより好ましくは0のIRSスコアによって特徴付けられるがんを有するがん患者の治療における使用のための、本明細書に定義のPTK2阻害物質に関する。
E−カドヘリンタンパク質免疫反応性スコア(IRS)が3より大きい患者および/またはがんは、本発明の発見に基づいて、PTK2阻害物質での治療に対して感受性が低いはずである。これらの患者は、付加的にまたは代替的に代替的抗がん治療で治療されうるが、PTK2阻害物質がこれらの患者において有益な効果をいまだ及ぼす場合があることは排除されえない。したがって3以上のE−カドヘリンIRSスコアによって特徴付けられる患者においてさえこれらの化合物を使用することはいまだ可能であるが、2の、好ましくは1およびさらにより好ましくは0のE−カドヘリンIRSによって特徴付けられる患者においてと同様にはこれらの患者において各PTK2阻害物質が効果的ではないことが予測される。したがって本発明の手段により、各E−カドヘリンIRSスコアに応じてより適切な治療形態を選択することが可能であることは理解される。
したがって本発明はさらなる実施形態において、
(a)患者のがん試料のE−カドヘリンタンパク質免疫反応性スコアを判定するステップ;および
(b)(a)において判定されたE−カドヘリンタンパク質免疫反応性スコアが2、1または0である場合(1は好ましく、0はより好ましい)に前記患者のための抗がん治療として好ましくはPTK2阻害物質を選択するステップ;または
(c)(a)において判定されたE−カドヘリンタンパク質免疫反応性スコアが3または4である場合好ましくは代替または付加的抗がん治療を選択するステップ
を含むがん患者のための抗がん治療を選択するための方法に関する。
「抗がん治療として好ましくはPTK2阻害物質を選択するステップ」は、2、1または0(1は好ましく、0はより好ましい)のE−カドヘリンタンパク質免疫反応性スコアを有するがんに対してPTK2阻害物質に基づく治療を使用することが好ましいことを意味する。しかし、高いIRSスコア(3〜4)はPTK2阻害物質で患者に対して治療的利益を達成する可能性が低いことを明確に示すが、これらのPTK2阻害物質の残存する治療効果を排除する必要がないことから、3以上のE−カドヘリンタンパク質免疫反応性スコアを有するがんもPTK2阻害物質で治療されうることが想定される。そのような場合(3以上の高IRSスコア)、PTK2阻害物質は好ましくは単独では使用されない。
(a)2、1または0(1は好ましく、0はさらにより好ましい)のE−カドヘリンタンパク質免疫反応性スコアによって特徴付けられるがん細胞またはがん細胞系を提供するステップと、
(b)(a)のがん細胞またはがん細胞系をPTK2阻害物質に接触させるステップと、
(c)PTK2阻害物質ががん細胞/がん細胞系にネガティブに作用するかどうかを評価するステップと
を含む、方法に関する。
上のスクリーニング法は、好ましくはPTK2阻害物質への応答(さらにこれらの応答はPTK2阻害物質が治療的に有効であるか否かを示す)におけるがん細胞の表現型的に検出可能な変化を使用する「表現型的」スクリーニング法である。用語「表現型的に検出可能な変化」は、がん細胞にネガティブに作用する変化を意味する。これらのネガティブな影響は、いくつか挙げるとアポトーシスまたは壊死などの細胞死、がん細胞/がん細胞系の遊走能力の低下および/またはこれらの細胞の増殖抑制を含む。しかしこの表は、排他的ではなく、すなわち当業者は、被検化合物が実際に各細胞にネガティブに作用することを示すものかもしれないがん細胞のさらなる表現型的変化を認識する。上のスクリーニング法の手段により治療的に有効なPTK2阻害物質を同定することが容易になる。
(a)前記PTK2阻害物質が、2以下のE−カドヘリンタンパク質免疫反応性スコアによって特徴付けられるがんを罹患している患者の治療のために好ましくは使用されることを示す説明書および/もしくは標示;ならびに/または
(b)前記患者が本明細書に記載の方法によって層別化されることを示す説明書および/もしくは標示;ならびに/または
(c)本明細書に定義の方法を実行するための手段
とを含む医薬用パッケージにも関する。
さらなる実施形態において本発明は、PTK2阻害物質を含み、さらにE−カドヘリンIRSの予測のために使用されるE−カドヘリン抗体を含む医薬用キットまたはパッケージに関する。
さらなる態様において本発明は、本発明の手段および方法によりE−カドヘリンタンパク質発現を検出するための手段と、
(a)前記E−カドヘリン検出(スコアリング)を実行するためのパッケージ挿入物および/もしくは説明書;ならびに/または
(b)スコアの検証を可能にする陽性および/または陰性対照
とを含むキット、好ましくは診断キットまたは診断用パッケージに関する。
同様に本発明は、がん患者がタンパク質チロシンキナーゼ2(PTK2)阻害物質での治療に対して感受性であるかどうかを判定するための方法における使用のためのE−カドヘリン抗体に関する。前記方法は、前記がん患者のがん試料におけるE−カドヘリンタンパク質の発現の検出であって、0〜2のE−カドヘリンタンパク質免疫反応性スコア(IRS)が、がん患者がPTK2阻害物質での治療に対して感受性であることを示す検出を含む。
次の例は本発明を例示する。これらの例は本発明の範囲を限定すると解釈されるべきではない。例は、例示の目的で含まれ、本発明は特許請求の範囲によってのみ限定される。
異種移植モデルは、次の通り確立された:胸腺欠損メスBomTac:NMRI−Foxn1nuマウス約6週齢を実験にそれらを使用する前に少なくとも3日間新しい環境に順応させた。動物はMacrolon(登録商標)II型ケージ内に5匹の群で標準化された条件下で飼育した。標準化食餌(PROVIMI KLIBA)および加圧滅菌済水道水を自由に与えられた。皮下腫瘍を樹立するために細胞をトリプシン処理によって回収し、遠心分離し、洗浄し、氷冷PBS+5%FCS中に再懸濁した。細胞5,000,000個を含む細胞懸濁液100μLを次いでヌードマウスの右側腹部に皮下的に注入した(マウス1匹あたり1カ所)。腫瘍が十分に樹立され、直径6〜9mmに達したら、マウスを治療群とビヒクル対照群とに無作為に分配した(細胞注入の10〜14日後)。腫瘍直径は、1週間に3回ノギスで測定した(月曜日、水曜日および金曜日)。各腫瘍の体積[mm3]は、式「腫瘍体積=長さ*直径2*π/6」に従って算出した。治療の副作用をモニターするために、マウスを異常について毎日視診し、体重を1週間に3回測定した(月曜日、水曜日および金曜日)。動物は治療開始から約3週間後の研究終了時に屠殺した。壊死性腫瘍または2000mm3を越える腫瘍サイズを有する動物は、倫理的理由により研究中の早い時期に屠殺した。
ヌードマウスにおいて増殖させたヒト腫瘍異種移植片のPTK2阻害物質での治療に対する感受性は以下の通りであった:
−スライドを1時間、65℃で加熱;
−スライドをキシレン中に5分間×3回、次いで100%EtOH無水、96%EtOH、70%EtOH中に(それぞれ20秒間×3回)、次いで蒸留水中に置く;
−スライドをクエン酸緩衝液中、20分間、121℃/1barのオートクレーブ内に置く;
−スライドを室温で30分間冷却;
−PBSで洗浄;
−スライドをPBS中の3%H2O2で5分間インキュベート;
−PBSで洗浄;
−組織にM.O.M.ブロッキング試薬(2滴=2500μL PBS中の90μL保存液)を添加し、60分間、室温でインキュベート;
−PBSで洗浄;
−組織にM.O.M.希釈液(7500μL PBS中の600μL保存液)を添加し、5分間、室温でインキュベート;
−吸引;
−組織に抗体(M.O.M.希釈液中に希釈)を添加、60分間、室温でインキュベート;
−PBSで洗浄;
−組織にM.O.M.ビオチン化抗マウスIgG試薬(2500μL M.O.M.希釈液中の10μL保存液)を添加、10分間、室温でインキュベート;
−PBSで洗浄;
−組織にVectastain ABC Elite kit(使用30分前に:A 2滴+2500μL PBS、混合、Bを2滴添加、混合;Vector #PK−6200)を添加、10分間、室温でインキュベート;
−PBSで洗浄;
−スライドをPBS/0.5%TritonX−100中4分間;
−DAB溶液中で染色;
−PBSで洗浄;
−スライドを蒸留水中に1分間置く;
−スライドをヘマトキシリン溶液中に1分間置く;
−流水で洗浄;
−スライドをHCl/EtOH中に1秒間置く;
−流水で洗浄;
−スライドをアンモニウム水中に20秒間置く;
−流水で洗浄;
−スライドを70%EtOH、96%EtOH、100%EtOH無水中に(各20秒間3回)置く;
−スライドをキシレン中に1分間、2分間、2分間置く;
クエン酸緩衝液:
800mL蒸留水中にクエン酸1水和物21.01g
pH=6に2M NaOHで調整、次いで蒸留水で1000mLにする。
Tris/EDTA緩衝液:0.01M Tris/0.001M EDTA;pH=8
HCl/EtOH:
175mL EtOH無水
2.5mL 37%HCl
72.5mL蒸留水
アンモニウム水:250mL蒸留水+アンモニウム溶液10滴(32%)
ヘマトキシリン:160mLパパニコロウ溶液 1aハリスのヘマトキシリン溶液、Merck #1.092.530.500+80 mL蒸留水
(使用前に濾過)!
DAB溶液:250mL PBS/0.5% TritonX−100中にDAB 125mg、濾過し、使用前に30%H2O2を25μL添加
マウス抗E−カドヘリン(Abcam #ab1416;1:100)
M.O.M. kit basic:Vector #BMK−2202
ヒトがん細胞をチャンバースライドに播種し、ヒトE−カドヘリンに対する特異的抗体で染色した。抗体結合を蛍光色素(Alexa 488緑色シグナル)で標識した二次抗体で検出した。核DNAをヨウ化プロピジウム(PI、赤色シグナル)で染色した。E−カドヘリンは、欠如していたかまたは細胞の小フラクションにおいて発現されていたかのいずれかであった(細胞系TOV−21GおよびMiaPaca2を参照されたい)。対照的にBxPC−3細胞は、ほとんどの細胞においてE−カドヘリンの強い膜発現を有する上皮表現型を示した。この実験の結果を図1に示す。
−選択した細胞系をコンフルエンシー付近まで4チャンバー組織培養処理済ガラススライドで増殖させる;
−組織培養培地を吸引し、スライドをアセトン/メタノール(1:1 v/v)、10分間、4℃で固定する;
−スライドを5分間、室温で乾燥させ、使用まで−80℃保存;
染色
−スライドを10分間、室温で解凍;
−PBSで洗浄;
−スライドをブロッキング血清10%正常ヤギ血清中で20分間、室温でインキュベート;
−血清を吸引し、洗浄しない;
−2%BSA/PBS中のE−カドヘリン抗体1:200と60分間、室温でインキュベート;
−PBSで洗浄;
−Alexa488コンジュゲートヤギ抗マウス二次抗体(PBS中1:1000)と45分間、室温でインキュベート;
−PBSで洗浄;
−PBS中の0.5μg/mLヨウ化プロピジウムで2分間、室温で染色;
−PBSで洗浄;
−Dako蛍光マウンティングメディウムでカバースリップ;顕微鏡検査まで暗所、4℃で保存;
クエン酸緩衝液:
800mL蒸留水中にクエン酸1水和物21.01g
pH=6に2M NaOHで調整、次いで蒸留水で1000mLにする。
マウス抗ヒトE−カドヘリン(Abcam #ab1416)
正常ヤギ血清(Vector Laboratories #S−1000)
Alexa488コンジュゲートヤギ抗マウス Invitrogen #a−11017
DakoCytomation蛍光マウンティングメディウム#S3023
ヨウ化プロピジウムSigma #P4170
脱パラフィン:
−スライドを1時間、65℃で加熱;
−スライドをキシレン中に5分間×3回、次いでEtOH無水、96%EtOH、70%EtOH中に(それぞれ20秒間×3回)置く;
−蒸留水中で洗浄;
抗原修復:
−スライドをクエン酸緩衝液中、20分間、121℃/1barのオートクレーブ内に置く
−スライドを室温で30分間冷却;
−PBSで洗浄;
−スライドをPBS中の3%H2O2で5分間インキュベート;
−PBSで洗浄;
−ブロッキング血清中でインキュベート:PBS/2%BSA中の10%正常ウマ血清(Vector Laboratories #S−2000)を組織へ、30分間、室温でインキュベート;
−血清を吸引、スライドは洗浄しない;
−組織にマウス抗E−カドヘリン(Abcam #ab1416;PBS/2%BSA中1:200)を添加、60分間、室温でインキュベート;
−PBSで洗浄;
−組織にビオチン化ウマ抗マウスIgG(Vector Laboratories #BA−2000;PBS中1:200)を添加、30分間、室温でインキュベート;
−PBSで洗浄;
−組織にVectastain ABC Standard kit(PBS中1:100;Vector #PK−4000)を添加、30分間、室温でインキュベート;
−PBSで洗浄;
−スライドをPBS/0.5%TritonX−100中に4分間置く;
−DAB溶液中で染色;
−PBSで洗浄;
−スライドを蒸留水中に1分間置く;
−ヘマトキシリン溶液中で1分間染色;
−流水で洗浄;
−スライドをHCl/EtOH中に1秒間置く;
−流水で洗浄;
−スライドをアンモニウム水中に20秒間置く;
−流水で洗浄;
−切片を70%EtOH、96%EtOH、EtOH無水中(3回/各20秒間)で脱水;
−キシレン(×3回)中に1分間、2分間、2分間置く;
−エンテランでカバースリップ;
クエン酸緩衝液:
800mL蒸留水中にクエン酸1水和物21.01g
pH=6に2M NaOHで調整、次いで蒸留水で1000mLにする。
HCl/EtOH:
175mL EtOH無水
2.5mL 37%HCl
72.5mL蒸留水
アンモニウム水:
250mL蒸留水+アンモニウム溶液10滴(32%)
ヘマトキシリン:
160mLパパニコロウ溶液 1aハリスのヘマトキシリン溶液、Merck #1.092.530.500
80mL蒸留水
使用前に濾過!
DAB溶液:
250mL PBS/0.5% TritonX−100中にDAB(Sigma #D5905)125mg、濾過し、使用前に30%H2O2を25μL添加
正常ウマ血清(Vector Laboratories #S−2000)
マウス抗ヒトE−カドヘリン(Abcam #ab1416)
ビオチン化ウマ抗マウスIgG(Vector Laboratories #BA−2000)
Vectastain ABC Standard kit(PBS中1/100;Vector #PK−4000)
エントラン(Merk 1.07961.0100)
Claims (16)
- がん患者がPTK2阻害物質での治療に対して感受性であるかどうかを判定するための方法であって、前記がん患者のがん試料におけるE−カドヘリンタンパク質の発現を検出するステップを含み、0〜2のE−カドヘリンタンパク質免疫反応性スコア(IRS)が、がん患者がタンパク質チロシンキナーゼ2(PTK2)阻害物質での治療に対して感受性であることを示すステップを含む、方法。
- 前記がん患者が哺乳動物である、請求項1に記載の方法。
- 前記哺乳動物がヒトである、請求項2に記載の方法。
- 前記がんが癌腫である、請求項1から3までのいずれか1項に記載の方法。
- 前記がんが、十二指腸、結腸、直腸および肛門の癌腫;膵臓の癌腫;膀胱の癌腫;肺腫瘍(小細胞肺がん(SCLC)、例えば扁平上皮癌、腺癌(腺房、乳頭、細気管支−肺胞)および大細胞気管支癌(巨細胞癌、明細胞癌)などの非小細胞肺がん(NSCLC));管、小葉、粘液性または管状の癌腫などの乳がん、卵巣がん(卵巣癌−粘液性または漿液性嚢胞腺癌、類内膜癌および明細胞腫瘍);頭頸部腫瘍;肝臓細胞癌(肝細胞癌(HCC));例えば(腎明細胞癌、乳頭状腎細胞癌、嫌色素腎細胞癌および集合管癌)などの腎臓がん;前立腺がん;ならびに外陰部のがんからなる群から選択される、請求項1から4までのいずれか1項に記載の方法。
- がん患者のがん試料におけるE−カドヘリンタンパク質の発現の前記検出が免疫組織化学的(IHC)方法によって実施される、請求項1から5までのいずれか1項に記載の方法。
- 前記IHC法がE−カドヘリンに特異的な一次抗体および一次抗体と特異的に反応する二次抗体を使用する、請求項6に記載の方法。
- 0〜2のE−カドヘリンタンパク質免疫反応性スコア(IRS)によって特徴付けられるがんを有するがん患者の治療方法であって、治療的有効量のPTK2阻害物質を患者に投与するステップを含む、方法。
- 0〜2のE−カドヘリンタンパク質免疫反応性スコア(IRS)によって特徴付けられるがんを有するがん患者の治療のための医薬組成物の調製のための、PTK2阻害物質の使用。
- 0〜2のE−カドヘリンタンパク質免疫反応性スコア(IRS)によって特徴付けられるがんを有するがん患者の治療における使用のためのPTK2阻害物質。
- PTK2阻害物質での治療に対するそれらの感受性に関してがん患者を層別化するための方法であって、前記がん患者のがん試料におけるE−カドヘリンIRSスコアを判定するステップを含み、0〜2(すなわち2、1または0)のE−カドヘリンタンパク質免疫反応性スコア(IRS)が、がん患者がPT2阻害物質での治療に対して感受性であることを示すステップを含む、方法。
- 前記がん/がん患者が、請求項1から7までまたは11のいずれか1項に記載の方法で同定、特徴付けおよび/または層別化される、請求項8から10までのいずれか1項に記載の方法、使用および/またはPTK2阻害物質。
- 前記がん患者が、前記治療の前におよび/または前記治療中に同定、特徴付けまたは層別化される、請求項12に記載の方法、使用および/またはPTK2阻害物質。
- 治療的に有効なPTK2阻害物質に関するスクリーニング方法であって、
(a)2、1または0(1は好ましく、さらに0はより好ましい)のE−カドヘリンタンパク質免疫反応性スコアによって特徴付けられるがん細胞またはがん細胞系を提供するステップと、
(b)(a)のがん細胞またはがん細胞系をPTK2阻害物質と接触させるステップと、
(c)PTK2阻害物質ががん細胞/がん細胞系にネガティブに作用するかどうかを評価するステップと
を含む、方法。 - PTK2阻害物質と、
(a)前記PTK2阻害物質が、2、1または0(1は好ましく、0はより好ましい)のE−カドヘリンタンパク質免疫反応性スコアによって特徴付けられるがんを罹患している患者の治療のために使用されるものであることを示す説明書および/もしくは標示;ならびに/または
(b)前記患者が請求項11に記載の方法によって層別化されることを示す説明書および/もしくは標示;ならびに/または
(c)請求項1から14までのいずれか1項に記載の方法を実行するための手段
とを含む医薬用パッケージ。 - PTK2阻害物質での治療に対する感受性に関するがん患者の層別化における使用のためのE−カドヘリン抗体。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP10180981 | 2010-09-28 | ||
EP10180981.2 | 2010-09-28 | ||
PCT/EP2011/066636 WO2012041796A1 (en) | 2010-09-28 | 2011-09-26 | Stratification of cancer patients for susceptibility to therapy with ptk2 inhibitors |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2013540108A true JP2013540108A (ja) | 2013-10-31 |
Family
ID=43085773
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2013529666A Pending JP2013540108A (ja) | 2010-09-28 | 2011-09-26 | Ptk2阻害物質での治療に対する感受性についてのがん患者の層別化 |
Country Status (12)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US20120244141A1 (ja) |
EP (1) | EP2622352B1 (ja) |
JP (1) | JP2013540108A (ja) |
KR (1) | KR20130097196A (ja) |
CN (1) | CN103124905A (ja) |
AU (1) | AU2011310692A1 (ja) |
BR (1) | BR112013007405A2 (ja) |
CA (1) | CA2807250A1 (ja) |
CL (1) | CL2013000595A1 (ja) |
EA (1) | EA201300410A1 (ja) |
MX (1) | MX2013002820A (ja) |
WO (1) | WO2012041796A1 (ja) |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20130324532A1 (en) | 2011-02-17 | 2013-12-05 | Cancer Therapeutics Crc Pty Limited | Fak inhibitors |
US9174946B2 (en) | 2011-02-17 | 2015-11-03 | Cancer Therapeutics Crc Pty Ltd | Selective FAK inhibitors |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2009105498A1 (en) * | 2008-02-19 | 2009-08-27 | Smithkline Beecham Corporation | Anilinopyridines as inhibitors of fak |
JP2010522697A (ja) * | 2007-03-16 | 2010-07-08 | ユニバーシティ オブ フロリダ リサーチ ファウンデーション | キナーゼタンパク質結合阻害剤 |
Family Cites Families (37)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB8607679D0 (en) | 1986-03-27 | 1986-04-30 | Winter G P | Recombinant dna product |
IL162181A (en) | 1988-12-28 | 2006-04-10 | Pdl Biopharma Inc | A method of producing humanized immunoglubulin, and polynucleotides encoding the same |
EP1621554B2 (en) | 1992-08-21 | 2012-08-29 | Vrije Universiteit Brussel | Immunoglobulins devoid of light chains |
EP0739981A1 (en) | 1995-04-25 | 1996-10-30 | Vrije Universiteit Brussel | Variable fragments of immunoglobulins - use for therapeutic or veterinary purposes |
EP0937140B1 (en) | 1996-06-27 | 2007-09-26 | Vlaams Interuniversitair Instituut voor Biotechnologie vzw. | Antibody molecules which interact specifically with the active site or cleft of a target molecule |
US6939670B2 (en) * | 2001-03-12 | 2005-09-06 | Monogen, Inc. | Cell-based detection and differentiation of lung cancer |
WO2004030620A2 (en) | 2002-09-30 | 2004-04-15 | Bristol-Myers Squibb Company | Novel tyrosine kinase inhibitors |
CA2505326A1 (en) | 2002-11-08 | 2004-05-21 | Ablynx N.V. | Camelidae antibodies against immunoglobulin e and use thereof for the treatment of allergic disorders |
EP1558645B1 (en) | 2002-11-08 | 2011-07-27 | Ablynx N.V. | Stabilized single domain antibodies in pharmaceutical composition adapted for inhalation |
UA80767C2 (en) | 2002-12-20 | 2007-10-25 | Pfizer Prod Inc | Pyrimidine derivatives for the treatment of abnormal cell growth |
MXPA06002608A (es) | 2002-12-20 | 2007-01-23 | Pfizer Prod Inc | Derivados de pirimidina para el tratamiento del crecimiento celular anormal. |
MXPA05006043A (es) | 2003-01-10 | 2006-01-30 | Ablynx Nv | Polipeptidos terapeuticos, homologos de los mismos, fragmentos de los mismos y para uso al modular la agregacion mediada de plaquetas. |
US20050241961A1 (en) | 2004-04-29 | 2005-11-03 | Ferguson Patrick J | Synthetic suture card |
CA2566707A1 (en) | 2004-05-14 | 2005-11-24 | Pfizer Products Inc. | Pyrimidine derivatives for the treatment of abnormal cell growth |
EP1751142A1 (en) | 2004-05-14 | 2007-02-14 | Pfizer Products Incorporated | Pyrimidines derivatives for the treatment of abnormal cell growth |
CA2564199A1 (en) | 2004-05-14 | 2005-11-24 | Pfizer Products Inc. | Pyrimidine derivatives for the treatment of abnormal cell growth |
GB0419160D0 (en) | 2004-08-27 | 2004-09-29 | Novartis Ag | Organic compounds |
FR2881742B1 (fr) | 2005-02-10 | 2007-09-07 | Aventis Pharma Sa | Pyrroles substitues, compositions les contenant, procede de fabrication et utilisation |
CA2632149C (en) | 2005-12-01 | 2011-11-15 | Pfizer Products Inc. | Pyrimidine derivatives for the treatment of abnormal cell growth |
BRPI0620324A2 (pt) | 2005-12-21 | 2011-11-08 | Pfizer Prod Inc | derivados de pirimidina, composição farmaceutica e uso dos mesmos |
EP2727909A1 (en) | 2007-03-16 | 2014-05-07 | The Scripps Research Institute | Inhibitors of focal adhesion kinase |
AP2009005010A0 (en) | 2007-04-18 | 2009-10-31 | Pfizer Prod Inc | Sulfonyl amide derivatives for the treatment of abnormal cell growth |
DE102007031988A1 (de) | 2007-07-10 | 2009-01-15 | Continental Aktiengesellschaft | Zuführungseinrichtung für streifenförmige Bauteile |
FR2919061B1 (fr) | 2007-07-19 | 2009-10-02 | Biomerieux Sa | Procede de dosage de la plastine-i pour le diagnostic in vitro du cancer colorectal. |
CN101353695B (zh) * | 2007-07-23 | 2013-05-01 | 上海市肿瘤研究所 | 尿沉淀dna甲基化谱式分析诊断膀胱癌的方法和试剂盒 |
EP2065380A1 (en) | 2007-08-22 | 2009-06-03 | F.Hoffmann-La Roche Ag | Pyridoneamide derivatives as focal adhesion kinase (FAK) inhibitors and their use for the treatment of cancer |
WO2009045389A2 (en) * | 2007-10-03 | 2009-04-09 | Osi Pharmaceuticals, Inc. | Biological markers predictive of anti-cancer response to insulin-like growth factor-1 receptor kinase inhibitors |
EP2047849A1 (en) | 2007-10-08 | 2009-04-15 | KTB Tumorforschungsgesellschaft mbH | Use of indolocarbazole imides as protein kinase inhibitors for the treatment of hematologic and solid tumors |
EP2231620A1 (en) | 2007-12-03 | 2010-09-29 | Boehringer Ingelheim International GmbH | Diaminopyridines for the treatment of diseases which are characterised by excessive or anomal cell proliferation |
CN102124000B (zh) | 2008-06-17 | 2014-09-17 | 阿斯利康(瑞典)有限公司 | 吡啶化合物 |
JO3067B1 (ar) | 2008-10-27 | 2017-03-15 | Glaxosmithkline Llc | بيرميدينات بيرازولو امينو كمثبطات ل fak |
UY32240A (es) | 2008-11-14 | 2010-06-30 | Boeringer Ingelheim Kg | Nuevas 2,4-diaminopirimidinas, sus sales farmacéuticamente aceptables, composiciones conteniéndolas y aplicaciones. |
AR074210A1 (es) | 2008-11-24 | 2010-12-29 | Boehringer Ingelheim Int | Derivados de pirimidina como inhibidores de ptk2-quinasa |
TW201024281A (en) | 2008-11-24 | 2010-07-01 | Boehringer Ingelheim Int | New compounds |
US20110071158A1 (en) | 2009-03-18 | 2011-03-24 | Boehringer Ingelheim International Gmbh | New compounds |
US8410126B2 (en) | 2009-05-29 | 2013-04-02 | Boehringer Ingelheim International Gmbh | Pyrimidine inhibitors of PKTK2 |
US8466155B2 (en) | 2009-10-02 | 2013-06-18 | Boehringer Ingelheim International Gmbh | Pyrimidines |
-
2011
- 2011-09-20 US US13/237,833 patent/US20120244141A1/en not_active Abandoned
- 2011-09-26 MX MX2013002820A patent/MX2013002820A/es not_active Application Discontinuation
- 2011-09-26 CA CA2807250A patent/CA2807250A1/en not_active Abandoned
- 2011-09-26 KR KR1020137007786A patent/KR20130097196A/ko not_active Application Discontinuation
- 2011-09-26 WO PCT/EP2011/066636 patent/WO2012041796A1/en active Application Filing
- 2011-09-26 BR BR112013007405A patent/BR112013007405A2/pt not_active IP Right Cessation
- 2011-09-26 JP JP2013529666A patent/JP2013540108A/ja active Pending
- 2011-09-26 EA EA201300410A patent/EA201300410A1/ru unknown
- 2011-09-26 AU AU2011310692A patent/AU2011310692A1/en not_active Abandoned
- 2011-09-26 EP EP11761079.0A patent/EP2622352B1/en active Active
- 2011-09-26 CN CN2011800467422A patent/CN103124905A/zh active Pending
-
2013
- 2013-03-01 CL CL2013000595A patent/CL2013000595A1/es unknown
-
2014
- 2014-03-21 US US14/221,370 patent/US9274120B2/en active Active
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2010522697A (ja) * | 2007-03-16 | 2010-07-08 | ユニバーシティ オブ フロリダ リサーチ ファウンデーション | キナーゼタンパク質結合阻害剤 |
WO2009105498A1 (en) * | 2008-02-19 | 2009-08-27 | Smithkline Beecham Corporation | Anilinopyridines as inhibitors of fak |
Non-Patent Citations (4)
Title |
---|
JPN5013010662; ALT-HOLLAND A: 'SILENCING OF FAK AND SRC KINASES NORMALIZES HUMAN, 3D TISSUE MODELS OF SQUAMOUS CELL 以下備考' JOURNAL OF INVESTIGATIVE DERMATOLOGY V129 N.SUPPL1, 20090401, P.S31, NATURE PUBLISHING GROUP * |
JPN5013010663; ALT-HOLLAND A: 'E-CADHERIN SUPPRESSION IS COORDINATES WITH ELEVATED FAK EXPRESSION 以下備考' JOURNAL OF INVESTIGATIVE DERMATOLOGY V126 N.SUPPL1, 20060401, P34, NATURE PUBLISHING GROUP * |
JPN5013010665; JIHE ZHAO: 'SIGNAL TRANSDUCTION BY FOCAL ADHESION KINASE IN CANCER' CANCER AND METASTASIS REVIEWS V28 N1-2, 20090124, P35-49, KLUWER ACADEMIC PUBLISHERS * |
JPN5013010666; TSUYOSHI SAITO: 'HYPERMETHYLATION IN PROMOTER REGION OF E-CADHERIN GENE IS ASSOCIATED 以下備考' CANCER V97 N4, 20030215, P1002-1009, AMERICAN CANCER SOCIETY * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
AU2011310692A1 (en) | 2013-01-31 |
US20120244141A1 (en) | 2012-09-27 |
EA201300410A1 (ru) | 2014-01-30 |
WO2012041796A1 (en) | 2012-04-05 |
BR112013007405A2 (pt) | 2016-07-12 |
CA2807250A1 (en) | 2012-04-05 |
CN103124905A (zh) | 2013-05-29 |
EP2622352B1 (en) | 2017-08-09 |
CL2013000595A1 (es) | 2014-05-09 |
US9274120B2 (en) | 2016-03-01 |
US20140205592A1 (en) | 2014-07-24 |
EP2622352A1 (en) | 2013-08-07 |
KR20130097196A (ko) | 2013-09-02 |
MX2013002820A (es) | 2013-04-05 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6875129B2 (ja) | 直接的な免疫組織化学アッセイ | |
JP6599334B2 (ja) | 血中循環腫瘍細胞に関する方法およびアッセイ | |
US9186405B2 (en) | Tumor cell-derived microvesicles | |
Moilanen et al. | Collagen XVII expression correlates with the invasion and metastasis of colorectal cancer | |
Tang et al. | SOX2 overexpression correlates with poor prognosis in laryngeal squamous cell carcinoma | |
Bu et al. | TGF-β1 induces epigenetic silence of TIP30 to promote tumor metastasis in esophageal carcinoma | |
Chahal et al. | O (6)-Methylguanine-DNA methyltransferase is a novel negative effector of invasion in glioblastoma multiforme | |
JP2021533163A (ja) | アネキシンa1を介した心血管石灰化の阻害に関する方法および組成物 | |
Jimenez et al. | Prostaglandin EP2 receptor expression is increased in Barrett’s oesophagus and oesophageal adenocarcinoma | |
Shah et al. | Chimeric antibody targeting unique epitope on onco-mucin16 reduces tumor burden in pancreatic and lung malignancies | |
JP2012531612A (ja) | ヒストンマクロh2aアイソフォームに基づいて癌再発のリスクを予測する診断方法 | |
US9274120B2 (en) | Stratification of pancreatic and ovarian cancer patients for susceptibility to therapy with PTK2 inhibitors | |
US20100160348A1 (en) | Materials and methods for detecting and treating peritoneal ovarian tumor dissemination involving tissue transglutaminase | |
JP2015509186A (ja) | 乳癌の検出及び処置 | |
Lim et al. | Expression of cancer stem cell marker during 4-nitroquinoline 1-oxide-induced rat tongue carcinogenesis | |
Shen et al. | Cytokeratin 15 is an effective indicator for progression and malignancy of esophageal squamous cell carcinomas | |
Ahmad et al. | A cross sectional study of p504s, CD133, and Twist expression in the esophageal metaplasia dysplasia adenocarcinoma sequence | |
JP7012363B2 (ja) | がん患者におけるfstl1阻害剤による治療効果を予測するためのバイオマーカー | |
Zhou et al. | Androgen-regulated stromal complement component 7 (C7) suppresses prostate cancer growth | |
EP3131930B1 (fr) | Anticorps reconnaissant le domaine central de l'adn polymerase pol theta et leurs utilisations pour le diagnostic du cancer | |
CN113687078A (zh) | 一种Shank1通过与MDM2相互作用调节Klotho泛素化的机制研究 | |
CN117836627A (zh) | 从脱石蜡细胞开始的单细胞elisa用于检测感兴趣分子的用途 | |
US20170122949A1 (en) | Diagnosis and treatment of ciliated hepatic foregut cysts | |
US20130130931A1 (en) | Biomarker for the diagnosis, prognosis and monitoring of cancer | |
JP2018513360A (ja) | アンドロゲン受容体スプライス変異体を検出するための材料及び方法並びにその使用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20140630 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20140922 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20140930 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20141031 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20141110 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20141201 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20150610 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20151109 |