KR20130097196A - Ｐｔｋ２ 억제제를 이용한 치료요법에 대한 감수성에 관해 암 환자를 분류하는 방법 - Google Patents

Ｐｔｋ２ 억제제를 이용한 치료요법에 대한 감수성에 관해 암 환자를 분류하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 암 환자의 암 시료에서 E-캐드헤린 단백질의 발현을 검출하는 것을 포함하는, 단백질 티로신 키나제 2 (PTK2) 억제제를 이용한 치료에 암 환자가 감수성인지의 여부를 결정하는 방법으로서, 0 내지 2의 E-캐드헤린 단백질 면역반응성 점수(IRS)가, 상기 암 환자가 PTK2 억제제를 이용한 치료에 감수성임을 가리키는 것인, 방법에 관한 것이다. 상기 암 환자의 암 시료에서의 E-캐드헤린 단백질 발현의 검출은 바람직하게는 면역조직화학(IHC) 방법에 의해 수행한다. 상기 IHC 방법은 바람직하게는 E-캐드헤린에 특이적인 일차 항체 및 상기 일차 항체와 특이적으로 반응하는 이차 항체를 사용한다. 또한, 본 발명은, 0 내지 2의 E-캐드헤린 단백질 면역반응성 점수(IRS)로 확인된 암을 갖는 암 환자를 치료하는 방법으로서, 상기 암 환자에게 치료학적 유효량의 PTK2 억제제를 투여하는 것을 포함하는, 암 환자를 치료하는 방법에 관한 것이다. 추가의 관점에서, 본 발명은, 0 내지 2의 E-캐드헤린 단백질 면역반응성 점수(IRS)로 확인된 암을 갖는 암 환자의 치료에 사용하기 위한 PTK2 억제제에 관한 것이다. 또한, 본 발명은, (a) 2, 1 또는 0의 E-캐드헤린 단백질 면역반응성 점수 (1이 바람직하고 0은 훨씬 더 바람직하다)로 확인된 암 세포 또는 암 세포주를 제공하는 단계, (b) (a)의 암 세포 또는 암 세포주를 PTK2 억제제와 접촉시키는 단계, 및 (c) PTK2 억제제가 암 세포/암 세포주에 음성적으로 영향을 미치는지의 여부를 평가하는 단계를 포함하여, 치료학적으로 유효한 PTK2 억제제를 선발하는 방법을 제공한다. 추가의 관점에서, 본 발명은, 암 환자의 암 시료에서 E-캐드헤린 IRS 점수를 결정하는 것을 포함하여, PTK2 억제제를 이용한 치료에 감수성인 암 환자를 분류하는 방법으로서, 0 내지 2 (즉, 2, 1 또는 0)의 E-캐드헤린 단백질 면역반응성 점수(IRS)가, 상기 암 환자가 PTK2 억제제를 이용한 치료에 감수성임을 가리키는 것인, 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은, PTK2 억제제 및 (a) 상기 PTK2 억제제가 2, 1 또는 0의 E-캐드헤린 단백질 면역반응성 점수 (1이 바람직하고 0은 훨씬 더 바람직하다)로 확인된 암을 앓고 있는 환자의 치료에 사용된다는 것을 가리키는 지침서 및/또는 인쇄물; 및/또는 (b) 상기 환자가 본 발명의 방법에 의해 분류된다는 것을 가리키는 지침서 및/또는 인쇄물; 및/또는 (c) 본원에 정의된 방법을 수행하는 수단을 포함하는 약제학적 패키지에 관한 것이다.

Description

ＰＴＫ２ 억제제를 이용한 치료요법에 대한 감수성에 관해 암 환자를 분류하는 방법{STRATIFICATION OF CANCER PATIENTS FOR SUSCEPTIBILITY TO THERAPY WITH PTK2 INHIBITORS}
본 발명은, 암 환자의 암 시료에서 E-캐드헤린(cadherin) 단백질의 발현을 검출하는 것을 포함하여, 단백질 티로신 키나제 2 (PTK2) 억제제를 이용한 치료에 암 환자가 감수성인지의 여부를 결정하는 방법으로서, 0 내지 2의 E-캐드헤린 단백질 면역반응성 점수(IRS)가, 상기 암 환자가 PTK2 억제제를 이용한 치료에 감수성임을 가리키는 것인, 방법에 관한 것이다. 상기 암 환자의 암 시료에서 E-캐드헤린 단백질 발현의 검출은 바람직하게는 면역조직화학(IHC) 방법에 의해 수행된다. IHC 방법은 바람직하게는 E-캐드헤린에 특이적인 일차 항체와 이러한 일차 항체와 특이적으로 반응하는 이차 항체를 사용한다. 또한, 본 발명은 암이 특징적으로 0 내지 2의 E-캐드헤린 단백질 면역반응성 점수(IRS)로 나타나는 암 환자에게 치료학적 유효량의 PTK2 억제제를 투여하는 것을 포함하여, 암 환자를 치료하는 방법에 관한 것이다. 추가의 관점에서, 본 발명은 암이 특징적으로 0 내지 2의 E-캐드헤린 단백질 면역반응성 점수(IRS)로 나타나는 암 환자의 치료에 사용하기 위한 PTK2 억제제에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 (a) 2, 1 또는 0의 E-캐드헤린 단백질 면역반응성 점수 (1이 바람직하고 0은 훨씬 더 바람직하다)로 확인되는 암 세포 또는 암 세포주를 제공하고, (b) (a)의 암 세포 또는 암 세포주를 PTK2 억제제와 접촉시키며, (c) PTK2 억제제가 암 세포/암 세포주에 음성적으로 영향을 미치는지의 여부를 평가하는 단계를 포함하여, 치료학적으로 유효한 PTK2 억제제를 선발(screening)하는 방법을 제공한다. 추가의 관점에서, 본 발명은, 암 환자의 암 시료에서 E-캐드헤린 IRS 점수를 결정하는 것을 포함하여, PTK2 억제제를 이용한 치료에 감수성인 암 환자들을 분류하는 방법으로서, 0 내지 2(즉, 2, 1 또는 0)의 E-캐드헤린 단백질 면역반응성 점수(IRS)가, 상기 암 환자가 PTK2 억제제를 이용한 치료에 감수성임을 가리키는 것인, 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 PTK2 억제제, 및 (a) 상기 PTK2 억제제가 2, 1 또는 0의 E-캐드헤린 단백질 면역반응성 점수 (1이 바람직하고 0은 훨씬 더 바람직하다)로 확인된 암을 앓고 있는 환자의 치료에 사용된다는 것을 가리키는 지침서 및/또는 인쇄물; 및/또는 (b) 상기 환자가 본 발명의 방법에 의해 분류된다는 것을 가리키는 지침서 및/또는 인쇄물; 및/또는 (c) 본원에 정의된 방법을 수행하는 수단을 포함하는 약제학적 패키지에 관한 것이다.
단백질 티로신 키나제 2 (PTK2)는 또한 초점 접착 키나제 1 (FAK1)으로도 알려져 있으며 초점접착역에 주로 위치하는 비-수용체 티로신 키나제이다. PTK2는 인테그린과 성장인자 수용체를 통해 전송된 세포외 신호와 세포내 신호전달물질사이의 링커로서 작용한다. 활성화된 PTK2는 세포 생존, 증식 및 사멸의 조절에 관여하는 듯하다. 따라서, PTK2의 억제는 암성장 및 전이형성을 억제할 수 있다. PTK2 억제제는 본 발명이 이전에 공개된 것으로 몇몇 화합물이 현재 초기 임상 시험하에 연구중에 있다.
PTK2 키나제 억제제는 다양한 암 실험모델에서 효능을 나타내고 있고, 특히 면역결핍 마우스의 인간 암 이종이식 모델에서 효능을 보여주고 있다. 그러나, 상기 PTK2 키나제 억제제의 효능은 상이한 암 모델들 사이에서 광범위하게 변한다: 암퇴행 또는 완전한 성장억제는 일부 모델에서 달성될 수 있는 한편, 다른 암 종류의 치료는 부분적인 성장억제를 유도하고 일부 암에 대해서는 전혀 효과가 없다. 발암성 돌연변이 또는 유전자 증폭이 많은 유전자들(예를 들어, EGFR, HER2 또는 BRAF)에 대해 공개되었다. 이들의 존재는 상응하는 키나제 억제제를 이용한 치료에 대한 해당 암의 민감도를 결정하고 그와 같은 억제제를 이용한 치료요법에 대한 환자의 적격성은 암 DNA 서열 또는 유전자 복제수를 분석함으로써 간단하게 결정할 수 있다. 그러나, PTK2 유전자의 경우, 지금까지 인간 암 또는 PTK2 억제에 반응하는 전임상 모델 종양에서 돌연변이 또는 증폭이 공개된 바는 없다.
따라서, PTK2 억제제를 이용한 치료요법에 절대적으로 유익할 수 있는 환자선별용 예측바이오마커의 동정이 시급히 요구된다. 치료 이익과 연관된 그와 같은 예측 바이오마커 또는 유전자 표지자는 현재 입수할 수 없다.
그러므로, 본 발명의 근간이 되는 기술적 문제는 PTK2 억제제를 이용한 치료에 감수성인 암 환자 및/또는 암 종류를 선별하는 수단 및 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 그러한 요구를 해결하고 PTK2 억제제를 이용한 치료에 반응하는 암 환자의 선별을 가능케 하는 세포 마커 및 방법을 제공한다.
인간 암의 이종이식 모델을 사용한 본 전-임상 연구에서 본 발명자들은 놀랍게도 예를 들어 면역조직화학(IHC) 방법으로 평가할 수 있는 암 세포내 E-캐드헤린 단백질의 발현 수준이 PTK2 억제제에 대한 민감도를 예측하는데 사용될 수 있음을 발견하였다. 이를 근거로 본 발명자들은 암/암 환자가 PTK2 억제제를 이용한 치료에 감수성인지 아닌지에 대한 여부를 결정하기 위해 PTK2 억제제의 투여전에 E-캐드헤린 발현 수준을 검사할 것을 제안한다. 본 발명의 추가의 양태들은 본원 명세서에서 확인되고 기재되며, 또한 본 특허청구범위에 반영된다.
본원에서 사용된 단수 형태는 달리 명확하게 기술되지 않는 한 복수 표현을 포함한다는 것을 주지해야 한다. 따라서, 예를 들면, 단수 표현 "시약"은 그와 같은 상이한 시약들 중 하나 이상을 포함하며, 단수 표현 "방법"은 본원에 기재된 방법을 변형 또는 대체할 수 있는 것으로 본 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 알려져 있는 균등 단계 또는 방법들의 표현을 포함한다. 일련의 요소들 앞에 사용되는 용어 "적어도"는 달리 기술되지 않는 한 일련의 요소 모든 것을 가리키는 것으로 이해되어야 한다. "적어도 하나"는 예를 들어 하나, 둘, 셋, 넷, 또는 다섯 또는 그 이상의 것을 포함한다.
본 분야의 전문가는 단지 통상적인 실험에 불과한 것이나 본원에 기재된 본 발명의 특정 양태에 대한 많은 균등 양태를 인지하고 있거나 사용하여 알아낼 수 있다. 이러한 균등 양태는 본 발명에 속하는 것이다. 아래에 기술되는 명세서 및 특허청구범위 전반에 걸쳐 사용된 용어 "포함하는"은 문맥상 달리 기술되지 않는 한 기재된 하나의 정수 또는 단계 또는 여러 정수들 또는 단계들의 그룹을 포함하지만 임의의 다른 정수들 또는 단계 또는 여러 정수 또는 단계들의 그룹을 배제하는 것이 아님을 내포한다.
몇 가지 문서들이 본원 명세서의 내용중에 인용되고 있다. 본원에 상기 또는 하기에 인용된 문서들(특허, 특허원, 과학 관련 문헌, 제조사의 설명서, 지침서 등을 포함) 각각은 그들의 전문이 본원에 참고로 인용된다. 그러나, 어느 문서도, 본 발명이 이전 발명으로 인해 인용 내용보다 시기적으로 선행하는 권리를 누리지 못하는 것을 인정하는 것으로 해석해서는 안된다.
제1 국면에서, 본 발명은 암 또는 암 환자로부터(수득한)의 암 시료에서 E-캐드헤린 단백질의 발현을 검출하는 것을 포함하여, 단백질 티로신 키나제 2 (PTK2) 억제제를 이용한 치료에 암 및 각각의 암 환자가 감수성인지의 여부를 결정하는 방법으로서, E-캐드헤린 단백질 면역반응성 점수(IRS) 0 내지 2, 바람직하게는 0 내지 1, 더 바람직하게는 IRS 점수 1, 훨씬 더 바람직하게 IRS 점수 0은 암 및 각각의 암 환자가 PTK2 억제제를 이용한 치료에 감수성임을 가리키는 것인, 방법에 관한 것이다.
"0 내지 2"의 IRS 점수 (또는 IRS)는 0, 1 또는 2의 IRS를 의미한다. 마찬가지로, "0 내지 1"의 IRS 점수는 0 또는 1의 IRS 점수를 의미한다. 전문가가 해당 암/암 시료에서 IRS 점수를 평가할 수 있는 방법은 본원에 설명되어 있다. 본원에서 사용된 용어 "IRS"는 본원에 기재된 E-캐드헤린의 면역반응성 점수를 나타낸다.
바람직한 양태로서, 상기된 검출은 면역조직화학 방법 (IHC)에 의해 실시된다.
암 시료는 바람직하게는 암 환자로부터 수득된 것이지만, 그 환자로부터 암 시료를 수득하는 단계가 반드시 본 발명의 범위에 속한다는 것을 의미하지 않음은 이해될 것이다.
CD324, LCAM 또는 ECAD로도 알려진 "E-캐드헤린" 또는 "E-캐드헤린 단백질"은 1형 막관통단백질 부류인 "캐드헤린" (칼슘-의존 부착 분자)에 속한다. 이들은 조직내의 세포들이 함께 결합되도록 하는 세포 부착에 중대한 역할을 한다. 캐드헤린은 그 작용이 칼슘 (Ca2 +) 이온에 의해 좌우되기 때문에 이와 같이 명명된 것이다. CDH1 유전자에 의해 암호화되는 E-캐드헤린 단백질은 5개의 세포외 캐드헤린 반복체, 막관통 영역 및 고도로 보존된 세포질 꼬리로 구성되며 모든 상피 조직에서 발견될 수 있다. 세포질 도메인은 세포내 결합 단백질인 카테닌을 통해 액틴 세포골격에 결합된다. 액틴 세포골격은 세포와 이의 극성의 구조적 짜임새를 조정하고 상피 세포 형태발생에 중요한 세포횡단 네트워크를 형성한다.
따라서, E-캐드헤린은 상피 세포 및 대부분의 상피-유래 암에 대한 바이오마커로서 작용한다. 최근의 면역조직화학 분석은 암 세포상에서 E-캐드헤린의 감소된 막 발현이 상피암 환자의 유해한 예후 특징 및 총 생존율 저하와 연관이 있음을 보여주었다[참조: 문헌(Saito T, et al., Cancer, 2003;97:1002-9)]. 따라서, E-캐드헤린은 상피세포에 대한 바이오마커일뿐만 아니라 암종 진행에 대한 예후 마커로서 작용할 수 있는 것으로 나타난다.
놀랍게도, 본 발명자들의 전임상 연구에서 상피암 세포의 막상에 감소된 단백질 발현 또는 E-캐드헤린의 발현 결핍이 PTK2 억제에 대한 각각의 암 세포의 민감도와 상관성이 있고 인간암의 동물 모델에서 유의적인 암성장 억제 및 암 퇴행으로 해석될 수 있음이 밝혀졌다. 따라서, E-캐드헤린 발현 수준은 PTK2 억제제를 이용한 치료에 대한 환자의 선택을 위한 바이오마커로서 역할을 할 수 있다. 이들 PTK2 억제제는 전문가에게 잘 알려져 있으며 또한 아래에서 상세히 기재된다. 본 발명자들은 낮은 E-캐드헤린 발현, 예를 들어 E-캐드헤린 점수 0 내지 2, 바람직하게는 0 내지 1, 더 바람직하게는 IRS 점수 1, 훨씬 더 바람직하게는 0 (이들 점수는 본원에 상세히 설명되어 있다)을 갖는 암이 고도의 E-캐드헤린 발현을 갖는 암보다 PTK2 억제제를 이용한 치료에 십중팔구 더 감수성일 것임을 증명할 수 있었다.
"암 세포의 막"은 암 세포의 외부를 암 세포의 내부로부터 분리하는 세포막을 의미한다. E-캐드헤린은 상피세포의 세포 막에서 일정하게 발현되며 이것은 조직내의 세포들이 서로 결합하여 조직 짜임새를 유지하도록 해 준다.
본원에 사용된 용어 "PTK2 억제제를 이용한 치료에 감수성이다"는 PTK2 억제제가 이를 투여받고 있거나 투여받을 예정인 환자에게 잠재적으로 치료효과를 나타낼 수 있음을 의미한다. 본원에 사용된 이 용어는 "PTK2 억제제를 이용한 치료에 민감성이다" 또는 "PTK2 억제제를 이용한 치료에 반응성이다"는 용어와 의미가 동일하다.
용어 "치료 효과" 또는 "치료학적으로 유효한"은 PTK2 억제제를 투여한 경우 PTK2 억제제가 치료 효과를 발생할 수 있음을 의미한다. 바람직한 치료 효과는 암 크기, 전이 횟수 또는 암의 존재 및/또는 진행에 의해 유발되거나 그와 연관된 다른 증세와 같은 암-연관된 증세의 진행 감소, 안정화 또는 억제를 포함한다. 반응은 완전한 반응, 부분적 반응, 안정 질환(진행 또는 재발되지 않음) 및/또는 환자의 차후 재발을 동반하는 반응을 포함한다. 바람직하게는, 본원에 기재된 바와 같이 PTK2 억제제는 암 세포가 PTK2 단백질을 발현하는 전제하에 환자의 암 세포 사멸을 유도하여 암을 완화 및/또는 치료하는 효과를 나타낼 수 있다. 본 발명의 각 방법 또는 방법 단계의 치료 효과는 치료 효과를 가리킬 수 있는 것으로 확립된 모든 방법 및 접근에 의해 검출가능하다. 다른 방법으로는, 존재하는 경우 환자의 혈청중에서 암 마커를 검출하여 치료 접근이 효과적인지의 여부를 진단하는 것도 고려할 수 있다. 전문가는 PTK2 억제제의 치료 효과를 관찰할 수 있는 많은 다른 방법들을 잘 알고 있다.
PTK2 억제제로 치료받을 수 있는 환자의 암 시료는 PTK2 억제제로 치료하기 전, 치료 동안 및/또는 치료 후에 채취할 수 있다. 바람직하게는 시료는 본 발명의 수단 및 방법에 따라 암 환자가 PTK2 억제제를 이용한 치료에 감수성일 수 있는지의 여부, 환자가 PTK2 억제제를 이용한 치료에 유리하게 반응할 수 있는지의 여부 또는 환자가 PTK2 억제제를 이용한 치료로부터 유익할 수 있는지의 여부를 결정하기 위해 치료 전에 채취한다.
치료효과와 관련하여 사용되는 용어 "잠재적으로"는 비록 PTK2 억제제가 본 발명의 방법의 결과를 기준으로 치료효과를 나타낸다고 하지만 PTK2 억제제가 반드시 치료학적으로 효과적이어야 하는 것이 아님을 의미한다. 이것은 굳이 설명을 하지 않더라고 E-캐드헤린 단백질의 발현과 별개로 연령, 체중, 건강상태, 성별, 식습관, 약물 상호작용 등과 같은 개인적 요소가 PTK2 억제제에 대한 환자의 감수성이 있는지의 여부에 영향을 미칠 수 있기 때문에 본 발명의 방법이 PTK2 억제제에 대한 환자의 감수성일 수 있는지 대해 100% 안전한 예측을 제공할 수 없기 때문이다.
본원에 사용된 용어 "치료하다" 또는 "치료"는 암 크기, 전이 횟수 또는 암의 존재 및/또는 진행에 의해 유발되고 이와 연관되는 다른 증세와 같은 증세의 진행을 저하, 안정화 또는 억제시킨다는 것을 의미한다.
본원에 사용된 용어 "암"은 암발병전 세포와 암 세포 및 암 발병 전 조직과 암 조직을 포함한 악성 세포 성장 및 증식을 가리킨다. 또한, 암은 때때로 악성 암 또는 신생물 또는 종양으로서 본원에서 표기된다. 형질전환된 상피세포의 침윤성 악성 암, 즉, 암종이 본 발명의 양태에서 바람직하다. 따라서, 본 발명의 양태에서 암 시료는 악성 상피 암 세포로 필수적으로 구성되고/그러한 세포를 포함할 수 있다.
본원에 기재된 암은 전이성이거나(즉, 암의 전이) 비전이성일 수 있다.
본 발명의 양태에 따라 PTK2 억제제로 치료되는 암은 PTK2 단백질을 발현하는 것으로 이해될 것이다. 앞서 이미 논의된 바와 같이, 본 발명은 본질적으로 암 환자가 PTK2 억제제를 이용한 치료에 감수성인지의 여부를 결정하는 방법에 관한 것이다. 따라서, 치료받을 암 환자가 PTK2 폴리펩타이드 발현 암 세포를 가진 환자라는 것은 당연한 것이다. "PTK2 폴리펩타이드 발현 암"은 PTK2 폴리펩타이드가 존재하는 세포를 포함한 암이다. "PTK2 폴리펩타이드 발현 암"은 임의로 PTK2 억제제가 PTK2 폴리펩타이드와 상호작용할 수 있는 충분한 수준의 PTK2 폴리펩타이드를 세포내에 생성한다. PTK2 폴리펩타이드는 다양한 방법으로 결정할 수 있다(즉, 전문가는 암/암 세포가 PTK2-양성인지의 여부를 시험하는 방법을 잘 알고 있다). 암 세포내의 PTK2 폴리펩타이드를 평가하는 것은 의무적인 절차가 아님이 이해될 것이다(즉, 본 발명의 양태는 이 단계를 포함할 필요는 없다). 현재 거의 모든 관련된 상피 암은 PTK2를 발현하는 것으로 추정된다. 그러나 앞서 언급한 바와 같이 PTK2 키나제 억제제의 효능은 상이한 암 모델들 사이에서 폭넓게 다양하다. 일부 모델에서 암 퇴행 또는 완전한 성장 억제가 달성될 수 있는 반면, 다른 암 종류의 치료는 부분적인 성장 억제를 유도하며 일부 암은 전혀 영향을 받지않는다. 따라서, 그와 같은 경우에서 PTK2 발현은 PTK-2 억제제를 이용한 치료에 대한 암의 감수성을 명백히 예측해 주지 못한다. 이러한 차이는 PTK2-억제제를 이용한 치료에 감수성인 암/암 환자의 동정을 가능케 하는 적합한 바이오마커를 처음으로 제공하는 본 발명에 의해 해소되었다: 언급된 바이오마커는 명세서 전반에 걸쳐 설명되는 E-캐드헤린 발현이다.
본 발명과 관련하여 사용된 용어 "암 환자" (때때로 "환자" 또는 "대상자"로 표기되기도 한다)는 본원에 기재된 암을 가진 대상자 (암을 앓고 있는 것으로 진단된 대상자를 포함)를 의미하며, 또한 보조 치료요법중에 있는 대상자, 예를 들어 1기 암의 절제를 받은 대상자를 포함한다.
바람직하게는, 상기 대상자는 예를 들어 인간, 말, 낙타, 개, 고양이, 돼지, 소, 염소 또는 가금과 같은 포유동물이다. 인간 대상자가 가장 바람직하다. 따라서, 본 발명의 조성물, 화합물, 용도 및 방법은 인간 치료요법 및 수의 적용 둘 다에 적용된다.
"조직 시료" (때때로 "암 시료" 등으로도 표기됨)는 대상자 (암 환자)로부터 유래 또는 수득되며 바늘생검, 외과적생검, 골수생검 등과 같은 생검을 통해 채취할 수 있다. 암 시료는 암표본, 암절편, 암으로부터 유래된 암 세포 (암으로부터 파생될 수 있고 세포배양으로 성장되는 암 세포주를 포함) 및 암덩어리 전체를 포함할 뿐만 아니라 대상자로부터 유래되고 암인 것으로 추정되거나 암 세포를 포함하는 것으로 추정되는 세포 및/또는 조직과 같은 암 세포주를 포함한다. 따라서, 암 시료는 비암성 세포를 포함할 수도 있음을 고려해야 한다. 예를 들어, 암 세포 및/또는 (마이크로) 전이세포는 흔히 건강한, 즉 비암성 조직에 둘러싸여 있다(즉, 암 세포는 건강한 조직내에서 세포의 서브세트(subset)를 형성할 수 있다). 이에 따라 암 시료는 건강한(비암성) 세포의 서브세트와 암성 세포의 서브세트를 포함할 수 있다. 용어 "시료"는 "표본"과 교환될 수 있다.
PTK2 억제제로 치료될 수 있는 암의 예로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 다음의 것중 하나 이상을 포함한다: 십이지장, 결장, 직장 및 항문의 암종을 포함한 장암; 췌장 암종 (예를 들어, 췌장 선암종); 방광 암종; 폐 종양 (소세포폐암 (SCLC), 비소세포폐암 (NSCLC)(예를 들어, 편평상피세포암종, 선암종 (세엽세포암종, 유두암종, 기관지폐포암종) 및 대세포 기관지 암종 (거대세포암종, 투명세포암종)); 유방암 (예를 들어, 유관암종, 소엽암종, 점액암종 또는 관상암종, 파젯 암종); 자궁암 (자궁체부암종 또는 자궁내막암종); CUP 증후군 (미지원발성암); 난소암 (난소 암종 - 점액성 또는 장액성 낭선암종, 자궁내막양암종, 투명세포종양, 브레너종양); 담낭암; 담관암 (예를 들어, 간문맥담관암); 고환암 (생식 또는 비생식 세포 종양); 후두암 (예를 들어, 성대의 성문상부, 성문 및 성문하부 종양); 두경부종양 (HNO 종양)(예를 들어, 구순 및 구강 종양 (구순암종, 설암종, 구강 암종), 비인두암종 (비종양(tumour of the nose), 림프상피종), 인두암종, 구강인두암종, 편도암종(편도 악성종양) 및 설기저부암종, 하인두암종, 후두암종(후두암), 부비강종양 및 비강종양, 타액선종양 및 이종양); 안검종양(안검 기관의 기전세포종 또는 선암종); 간세포암종(간세포성의 암종(HCC)); 위암 (유두상선암종, 관상선암종 또는 점액선암종, 선편평세포암종, 편평세포암종 또는 미분화암종); 신장암 (예를 들어, 투명세포 신장세포암종, 유두신장세포암종, 혐색소성세포형 신장세포암종 및 집합관암종); 식도암; 음경암; 전립선암 (예를 들어, 호르몬 불응성 전립선암); 질암 또는 질암종; 갑상선암종 (예를 들어, 유두, 여포, 수질 또는 미분화 갑상선암종); 요도암 (요도암종, 요로상피암종) 및 외음암.
십이지장, 결장, 직장 및 항문의 암종; 췌장암종 (예를 들어, 췌장 선암종); 방광 암종; 폐 종양 (소세포폐암 (SCLC), 비소세포폐암 (NSCLC)(예를 들어, 편평상피세포암종, 선암종 (세엽세포암종, 유두암종, 기관지폐포암종) 및 대세포 기관지암종 (거대세포암종, 투명세포암종)); 유방암 (예를 들어, 유관암종, 소엽암종, 점액암종 또는 관상암종, 난소암 (난소 암종 - 점액성 또는 장액성 낭선암종, 자궁내막양암종 및 투명세포종양)); 두경부종양; 간세포암종(간세포성의 암종(HCC)); 신장암 (예를 들어, 투명세포 신장세포암종, 유두신장세포암종, 혐색소성세포형 신장세포암종 및 집합관암종); 전립선암(예를 들어, 호르몬 불응성 전립선암); 및 외음암이 상당히 중요하고 따라서 바람직하다.
단백질 티로신 키나제 2 (PTK2)는 또한 FAK, FADK, FAK1, pp125FAK, EC2.7.10.2로도 알려져 있고 세포외 매트릭스 성분의 존재하에서 성장하는 세포의 세포막에서 형성되는 초점접착역에 고농도로 발견되는 세포질 단백질 티로신 키나제이다. 암호화된 단백질은 단백질 티로신 키나제의 FAK 아계열의 일원이지만 다른 아계열로부터의 키나제와 유의적인 서열 유사성을 없다. PTK2는 3개의 기능성 도메인들을 갖는다: (1) FAK를 초점접착역으로 집합시키고 팍실린 및 탈린과 같은 인테그린-연계된 단백질에 결합하는데 중요한 초점접착역 표적 (FAT) 도메인; (2) 티로신 키나제 활성을 갖는 촉매 도메인; 및 (3) 인테그린과 성장인자 수용체와의 상호작용에 중요한 N-말단 도메인[참조: 문헌(Parsons, J. T. (2003). Focal adhesion kinase: The first ten years. J. Cell Sci. 116, 1409-1416)]. PTK2는 SH2 도메인을 함유한 어뎁터 단백질과 결합하는데 필요한 다수의 인산화 부위를 갖는다. 중요한 인산화 부위는 Rho 키나제와 같은 하향신호전달 분자와 PTK2의 상호작용에 중요한 것으로 나타나는 Tyr397이다.
PTK2가 세포-매트릭스 신호 전달 경로에 핵심적인 역할을 한다는 점 (Clark and Brugge 1995, Science 268: 233-239)과 PTK2의 비정상적인 활성화가 암의 전이 잠재성이 증가하는 것과 연관이 있다는 점[참조: 문헌(Owens et al., 1995, Cancer Research 55: 2752-2755)]은 명백한 증거에 의해 입증된다. 처음에 PTK2는 v-Src에 의해 형질전환된 세포에서 고도로 티로신-인산화된 125 kDa 단백질로서 동정되었다. 이후 PTK2는 배양 세포와 이의 기층사이의 접점이고 고도의 티로신 인산화 부위인 초점접착역에 위치하는 티로신 키나제인 것으로 밝혀졌다. PTK2는 인테그린과의 세포외 매트릭스 (ECM)-결합에 반응하여 인산화하고 그에 따라 활성화된다. 최근 연구에서, PTK2 mRNA 양의 증가는 암의 보다 더 강한 침습 행동을 수반하고 PTK2의 발현 약독화 (안티센스 올리고뉴클레오타이드의 사용을 통해서)는 암 세포의 아폽토시스를 유도하는 것으로 입증되었다[참조: 문헌(Xu et al., 1996, Cell Growth and Diff. 7: 413-418)]. PTK2는 대부분의 조직 유형에서 발현될뿐만 아니라 대부분의 인간암에서, 특히 고도의 침습 및 전이 암에서 증가된 양으로 발견된다. 그러나 앞서 언급한 바와 같이 PTK2 키나제 억제제의 효능은 상이한 암 모델간에 폭넓게 다양하다. 따라서, PTK2 발현이 PTK-2 억제제를 이용한 치료에 대한 암의 감수성을 뚜렷하게 예측하는 것은 아니다. 이러한 오차는 처음으로 PTK2 억제제를 이용한 치료에 감수성인 암/암 환자의 동정을 가능케 하는데 적합한 바이오마커를 제공하는 본 발명에 의해 극복되었다: 상기 바이오마커는 본원 명세서 전반에 걸쳐 설명되는 E-캐드헤린 발현이다.
용어 "PTK2 억제제"는 본 발명의 맥락에서 PTK2 (바람직하게는 인간 PTK2)와 상호작용하여 키나제 활성을 감소시키는 화합물 또는 복수의 화합물로서 정의된다. 그와 같은 억제제를 검출하는데 적합한 검사는 아래에서 상세히 설명된다. 용어 "복수의 화합물"은 동일하거나 상이할 수 있는 다수의 물질로서 이해되어야 한다. 복수의 화합물은 바람직하게는 부가적으로 또는 상승적으로 작용할 수 있다. 그와 같은 화합물 또는 복수의 화합물은 화학적 합성에 의해 제조하거나 미생물을 통해 생성하고/하거나 예를 들어 식물, 동물 또는 미생물의 예를 들어, 세포 추출물과 같은 시료에서 내포될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "감소된 PTK2 키나제 활성" 또는 "PTK2 키나제 활성의 감소"는 PTK2의 키나제 활성이 바람직하게는 비교가능한 대조 세포/대상자의 정상/자연 상태와 비교하여 적어도 약 동일한 수준으로 감소된 것으로 정의된다. 이와 관련하여, 용어 비교가능한 "대조 세포/대상자의 정상/자연 상태"는 바람직하게는 피검 세포와 동일한 성질을 갖지만 (예를 들어, 세포 모두 상피 세포이다) 상이한 근원으로부터 유래된 대조 세포에서의 PTK2 키나제 활성을 의미한다. "상이한 근원"은 예를 들어 건강한 대상자로부터, 바람직하게는 암종을 앓고 있지 않은 대상자로부터 수득된 세포/조직 시료 또는 암종의 연관 증세와 상관이 없어 보이는 동일 대상자의 별개 부위로부터 수득된 세포/조직 시료를 포함한다. 그러나, PTK2 억제제가 PTK2의 키나제 활성을 비교가능한 대조 세포/대상자의 대략 정상/자연 상태로 감소시키지 못하지만 PTK2 억제제의 첨가전에 PTK2 키나제 활성과 비교했을 때 PTK2 키나제 활성을 실질적으로 감소시킨 경우, PTK2 억제제는 유익한 효과가 있는 것으로 평가된다.
따라서, PTK2 억제제는 이를 첨가하지 않고 달성되는 PTK2 키나제 활성과 비교했을 때 PTK2의 키나제 활성을 적어도 약 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 심지어 100% 감소시키는 것으로 고려해야 한다. PTK2 키나제 활성을 측정하는데 적합한 시험 시스템은 본원에 기술되어 있다. 따라서, 본 발명의 억제제가 예를 들어 본원에 기재된 시험 시스템 (예를 들어, PTK2 효소 시험)과 유사하거나 동일한 조건하에서 PTK2의 키나제 활성을 약 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 심지어 100% 감소시키는 것이 바람직하다.
PTK2 효소 시험
이 시험은 활성 PTK2 효소 (Invitrogen Code PV3832) 및 폴리-Glu-Tyr (4:1, Sigma P-0275)를 키나제 기질로서 사용한다. 키나제 활성은 DELFIATM 검사에서 기질의 인산화 수단에 의해 검출한다. 인산화 기질은 유로퓸-표지된 포스포티로신 항체 PT66 (Perkin Elmer, No.:AD0040)으로 검출한다. PTK2 억제제로 농도-활성 곡선을 결정하기 위해, 화합물을 10% DMSO/H2O중에 연속 희석한 후 각 희석물 10 μL를 96-웰 미세역가 평판 (투명 U-모양 베이스 평판, Greiner No. 650101)의 각 웰에 분배하고(억제제는 2회 중복하여 시험한다) 10 μL/웰의 PTK2 키나제 (0.01 μg/웰)과 혼합한다. 따라서, PTK2 키나제를 사전에 키나제 희석 완충액 (20 mM TRIS/HCl pH 7.5, 0.1 mM EDTA, 0.1 mM EGTA, 0.286 mM 나트륨 오르쏘바나데이트, 10% 글리세롤에 새롭게 제조된 BSA(분액 V 1 mg/mL) 및 DTT(1 mM)가 첨가됨)로 희석한다. 시험 화합물과 PTK2 키나제를 실온에서 1시간 동안 예비 항온처리하고 500 rpm으로 진탕한다. 이어서, 20 μL ATP Mix (30 mM TRIS/HCl pH 7.5, 0.02% Brij, 0.2 mM 나트륨 오르쏘바나데이트, 10 mM 마그네슘 아세테이트, 0.1 mM EGTA, 1x포스파타제 억제제 칵테일 1(Sigma, No.: P2850), 50 μM ATP (Sigma, No.: A3377; 15 mM 원액)을 첨가한다. 10 μL/웰의 폴리(Glu, Tyr) 기질 (25 μg/웰 폴리(Glu, Tyr), 0.05 μg/웰 바이오티닐화 폴리(Glu, Tyr)를 250 mM TRIS/HCl pH 7.5, 9 mM DTT중에 용해시킴)을 첨가하여 반응을 개시한다-DMSO의 최종 농도는 2%이다. 1시간의 키나제 반응 후 (평판을 500 rpm으로 진탕시킴), 12 μL/웰의 100 mM EDTA, pH 8을 첨가하여 반응을 정지시키고 실온에서 추가로 5분 동안 진탕한다 (500 U/분).
55 μL의 반응 혼합물을 스트렙타비딘 평판 (Roche 제품인 Strepta Well High Bind (투명, 96-웰)-제품번호 11989685001)에 옮기고 실온에서 1시간 동안 항온처리한다 (500 rpm으로 진탕). 이어서, 미세역가 평판을 200 μL/웰의 D-PBS (Invitrogen 제품번호 14190)으로 3회 세척한다. 그런 다음, 100 μL의 1:2000 희석된 DELFIA Eu-Nl 항-포스포티로신 PT66 항체 (Perkin Elmer 제품번호 AD0040, DELFIA 시험 완충액 (Perkin Elmer 제품번호 1244-111)중에 1:2000으로 희석)를 첨가하고 실온에서 1시간 동안 항온처리한다 (500 rpm으로 진탕). 평판을 200 μL/웰의 DELFIA 세척 완충액(Perkin Elmer, 제품번호 1244-114)으로 3회 세척하고, 200 μL/웰의 증강용액(Perkin Elmer, 제품번호 1244-105)을 첨가하고 전체를 실온에서 10분 동안 항온처리한다 (300 rpm으로 진탕).
이어서, 미세역가 평판 판독기 (Victor, Perkin Elmer)로 시간-지연된 유로품 형광을 측정한다. 양성 대조군은 용매 (시험 완충액중의 2% DMSO)를 함유하고 비억제된 키나제 활성을 나타내는 웰로 구성된다. 효소 대신에 시험 완충액을 함유하는 웰은 배경 키나제 활성의 대조군으로 작용한다. 가변 Hill 계수와 함께 S자 곡선 분석 알고리즘 (FIFTY, GraphPAD 프리즘 버젼 3.03 기준)을 사용한 반복계산에 의해 농도-활성 분석으로부터 IC50 값을 결정한다.
PTK2 억제제를 동정하는데 사용할 수 있는 추가의 검사는 전문가들에게 잘 알려져 있으며 특히 PTK2 연질 한천 검사 또는 포스포-PTK2 (pY397) 검사가 포함된다. 두 검사 모두 아래에서 상세히 설명된다.
PTK2 연질-한천 검사
이러한 세포 시험은 연질 한천에서 PC-3 전립선 암종 세포의 성장("부착-의존성 성장")에 미치는 PTK2 억제제의 영향을 측정하는데 사용한다. 2주의 항온배양 시간 후 알라마르 블루 (레자주린) 염색으로 세포 생존성을 증명한다. 10% 태아 송아지 혈청(Invitrogen, 제품번호 16000-044)이 보충된 F12 Kaighn 배지 (Gibco, 제품번호 21127)가 함유된 세포 배양 플라스크 (175 cm2)에서 PC-3 세포 (ATCC CRL-1435)를 성장시킨다. 배양물을 37℃ 및 5% CO2의 항온배양기에서 항온배양시키고 주 2회 가동한다. 시험은 미세역가 평판 (Greiner, 제품번호 655 185)에서 실시하며 1.2% 아가로즈 (Invitrogen, 4% 아가로즈 겔 1 x 액체 40 mL, 제품번호 18300-012)와 함께 90 μL 배지로 구성된 하층, 60 μL 배지와 0.3% 아가로즈중의 세포층 및 마지막으로 피검 화합물을 함유한 30 μL 배지를 포함하는 (아가로즈 첨가되지 않음) 상층으로 구성된다. 하층을 제조하기 위해, 4% 아가로즈를 10x D-PBS (Gibco, 제품번호 14200) 및 H2O와 함께 달이며 이에 따라 1x D-PBS중에 3% 아가로즈가 예비희석된다. 후자는 배양 배지 (F12 Kaighn 배지/10% FCS) 및 FCS로 조절하여 10% FCS를 함유한 F12 Kaighn 배지에 1.2% 아가로즈로 최종 희석한다. 미세역가 평판의 각 웰에 하층을 위한 현탁액 90 μL를 공급하고 1시간 동안 실온으로 냉각시킨다. 세포층의 경우, PC-3 세포를 트립신(Gibco, 0.05%; 제품번호 25300)을 사용하여 분리하고, 계수한 다음 0.3% 아가로즈 (37℃)가 첨가된 60 μL의 F12 Kaighn 배지 (10% FCS)에 접종한다. 1시간 동안 실온으로 냉각한 후 피검 화합물 (단계 희석물로부터 30 μL)을 4회 중복 측정을 위해 첨가한다. 피검 화합물의 농도는 보통 10 μM 내지 0.3 nM의 시험 범위에 해당한다. 화합물 (원액: 100% DMSO중의 10 mM)을 F12 Kaighn 배지 + 6% DMSO중에 예비희석하여 1% DMSO의 최종 농도를 수득한다. 세포를 증기-포화 대기하에 37℃ 및 5% CO2에서 14일 동안 항온배양한다. 그런 다음, 염료 알라마르 블루(AbD Serotec, 제품번호 BUFO 12B)로 생존 세포의 대사 활성을 증명한다. 이를 수행하기 위해, 18 μL/웰의 알라마르 블루 현탁액을 첨가하고 전체를 37℃ 항온배양기에서 약 8시간 동안 항온배양한다. 양성 대조군은 고압살균에 의해 환원된 알라마르 블루 18 μL과 F12 Kaighn 배지 (10% FCS) 180 μL의 혼합물로 채워지는 빈 웰로 구성된다. 형광 분광분석기 (SpectraMAX GeminiXS, Molecular Devices)를 이용하여 형광 세기를 측정한다. 여기(excitation) 파장은 530 nm이고, 방출 파장은 590 nm이다.
가변 Hill 계수와 함께 S자 곡선 분석 알고리즘 (FIFTY, GraphPAD 프리즘 버젼 3.03 기준)을 사용한 반복계산에 의해 농도-활성 분석으로부터 EC50 값을 결정한다.
포스포 - PTK2 ( pY397 ) 검사
이 세포 시험을 사용하여 티로신 397에 PTK2 인산화 (pY397) 상태에 미치는 PTK2 억제제의 영향을 측정한다.
PC-3 세포 (전립선 암종, ATCC CRL-1435)를 10% 태아 송아지 혈청 (Invitrogen, 제품번호 16000-044)과 함께 F12 Kaighn 배지(Gibco, 제품번호 21127)를 함유한 세포 배양 플라스크 (175 cm2)에서 성장시킨다. 배양물을 37℃ 및 5% CO2의 항온배양기에서 항온배양시키고 주 2회 가동한다.
시험을 위해 2 x 104 세포 프로 웰/90 μL 배지를 96-웰 미세역가 평판 (Costar, 제품번호 3598)에 도말하고 37℃ 및 5% CO2의 항온배양기에서 밤새 항온배양한다. 다음날 피검 화합물 (단계 희석물로부터 10 μL)을 첨가한다. 피검 화합물의 농도는 보통 50 μM 내지 0.8 nM의 범위이다. 피검 화합물 (원액: 100% DMSO중의 10 mM)을 배지/배지 10% DMSO중에 희석시켜 최종 농도를 1% DMSO로 만든다. 이어서, 세포를 37℃ 및 5% CO2의 항온배양기에서 2시간 동안 항온배양한다. 그런 다음, 배양 상청액을 제거하고 세포를 D-PBS중의 4% 포름알데하이드 150 μL로 실온에서 20분 동안 고정한다. 세포층을 D-PBS중의 0.1% 트리톤 X-100 200 μL로 매회 5분 동안 5회 세척한 다음 TBST(25 mM Tris/HCl, pH 8.0, 150 mM NaCl, 0.05% 트윈 20)중의 블로킹 완충액 (5% 탈지분유 (Maresi Fixmilch))과 함께 90분 동안 항온배양한다. 블로킹 완충액을, 블로킹 완충액에 1:200으로 희석된 일차 항체 항-포스포 PTK2 [pY397] 토끼 모노클로날(Invitrogen/Biosource, 제품번호 44-625G) 50 μL으로 교체한다. 대조 목적을 위해, 다른 방법으로서 블로킹 완충액에 1:400으로 희석된 PTK2 [총] 항체 (클론 4.47 마우스 모노클로날, Upstate 제품번호 05-537)를 사용한다. 상기 항온배양은 4℃에서 밤새 수행된다. 이어서, 세포층을 D-PBS중의 0.1% 트윈 100 μL로 매회 5분 동안 5회 세척하고 50 μL/웰의 이차 항체를 첨가한다. 결합된 포스포-PTK2 [pY397] 항체를 검출하기 위해 서양고추냉이 퍼옥시다제 (Dako, 제품번호 P0448; 블로킹 완충액중의 1:500 희석)와 결합된 염소-항토끼 항체를 사용한다. 결합된 PTK2 [총]-항체를 검출하기 위해 서양고추냉이 퍼옥시다제 (Dako, 제품번호 PO161; 블로킹 완충액중의 1:1000 희석)와 또한 결합된 토끼-항-마우스 항체를 사용한다. 이 항온배양은 유연한 진탕과 함께 실온에서 1시간 동안 실시한다. 그런 다음, 세포층을 D-PBS중의 0.1% 트윈 100 μL로 다시 매회 5분 동안 5회 세척한다. 100 μL 염색 용액(TMB 퍼옥시다제 기질(KPL, 제품번호 50-76-02)과 퍼옥시다제 용액 B(H2O2)(KPL, 제품번호 50-65-02)의 1:1 혼합물)를 첨가하여 퍼옥시다제 염색을 실시한다. 염색 현상은 암실에서 10 내지 30분 동안 진행한다. 반응은 100 μL/웰의 1 M 인산용액을 첨가하여 정지시킨다. 흡광 측정 장치(VICTOR PerkinElmer)로 450nm에서 광도 측정으로 흡광도를 측정한다. 항-포스포 PTK2 [pY397] 면역 염색의 억제를 사용하여 EC50 값을 결정한다. 항-PTK2 [총]-항체를 이용한 염색은 대조 목적을 위한 것이고 억제제의 영향하에 일정해야 한다. 가변 Hill 계수와 함께 S자 곡선 분석 알고리즘 (FIFTY, GraphPAD 프리즘 버젼 3.03 기준)을 사용한 반복계산에 의해 농도-활성 분석으로부터 EC50 값을 결정한다.
세포내, 이들 세포를 포함한 조직내 또는 그들 세포 또는 조직을 포함한 대상자에서 활성 PTK2의 양의 감소에 영향을 미치는 화합물은 PTK2 억제제로서 간주되며, 예를 들어 PTK2와 결합하여 이를 억제할 수 있는 압타머, 항체 또는 이의 기능성 단편; PTK2를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열과 특이적으로 결합하여 세포 또는 조직내에서 활성 PTK2의 양을 감소시키는 안티센스 올리고뉴클레오타이드, iRNA, miRNA 또는 siRNA를 포함한다. 그러한 항체 및 간섭 핵산 서열은 전문가에게 잘 알려져 있으며 많은 것들이 시판중에 있다.
본 발명과 관련하여 고려되는 PTK2 억제제의 예는 본 발명이 이로써 한정되는 것은 아니지만 국제 특허 출원 공보 제WO 2010/106097호, 제WO 2010/136559호, 제WO 2011/039344호, 제WO 2007/063384호, 제WO 2010/058032호, 제WO 2010/058030호, 제WO 2010/055117호, 제WO 2009/07153호, 제WO 2005/1110245호, 제WO 2008/129380호, 제WO 2007/072158호, 제WO 2005/111022호, 제WO 2005/111023호, 제WO 2005/111016호, 제WO 2004/056807호, 제WO 2009/071535호, 제WO 2004/056786호, 제WO 2010/062578호, 유럽 특허 공보 제EP 2047849호, 국제 특허 출원 공보 제WO 2008/115369호, 제WO 2009/024332호, 제WO 2008/129380호, 제WO 2007/072158호, 제WO 2004/056807호, 제WO 2006/021457호, 제WO 2010/062578호, 제WO 2009/105498호, 제WO 2004/030620호, 제WO 2008/115443호, 미국 특허 출원 공보 제US 2008/167368 및/또는 국제 특허 출원 공보 제WO 2009/153589호에 예시된 화합물이다. 상기된 문헌의 전문은 본원에 참고로 포함된다.
본 발명과 관련하여 용어 "PTK2 억제제"는 용어 "PTK2 길항제" 등과 상호 사용가능하다.
PTK2 억제제는 다양한 암 실험 모델, 특히 면역결핍 마우스의 인간 암 이종이식 모델에서 효능을 보인다. 그러나, 이들의 효능은 상이한 암 모델들간에 폭넓게 다양한 반면, 암의 퇴행 또는 완전한 성장 억제는 일부 모델에서 달성될 수 있고 다른 암 유형의 치료는 부분적인 성장 억제를 유도하며 일부 암은 전혀 영향을 받지 않는다. 본 발명은 상피 암의 암 세포에서 E-캐드헤린 단백질의 발현 수준을 사용하여 본 발명에 의해 설정된 점수 체계를 이용하여 점수를 부여함으로써 PTK2 억제제에 대한 개별 암의 민감도를 예측할 수 있다는 뜻밖의 발견에 근간을 두고 있다. 이러한 측면에서, 환자의 암 시료에서 E-캐드헤린 단백질의 발현을 검출하는 것이 고려되며, 여기서 0 내지 2, 바람직하게는 0 내지 1, 더 바람직하게는 1, 더 더욱 바람직하게는 0의 E-캐드헤린 단백질 면역반응성 점수(IRS)가 암/암 환자가 PTK2 억제제를 이용한 치료에 감수성임을 가리킨다.
상기 IRS 점수는 바람직하게는 IHC 방법에 의해 평가 (검출)되지만 다른 면역학적 방법들이 배제되는 것은 아니다.
"IHC 방법"은 표지에 의해 시각적으로 나타나는 표적-결합 도메인 상호작용을 통해 특이적 시약으로서 결합 도메인을 사용함으로써 조직 절편내 표적 (예를 들어, 항원)을 검출하는 방법을 의미한다. 상기 조직 절편 (예를 들어, 두께 약 2 내지 5μm)은 바람직하게는 포매된, 예를 들어 파라핀에 포매된 조직 시료로부터 채취한다. 검출 방법을 상세히 설명한 IHC 프로토콜 및 E-캐드헤린 항체의 근원은 아래에 기재된다. 실시예에 사용된 IHC 방법은 반응의 기질로서 DAB를 사용하는 간접 아비딘-바이오틴 복합체 (ABC) 면역퍼옥시다제 방법이었다. 추가의 IHC 방법이 아래에 보다 상세히 설명된다.
본 발명과 관련하여 사용된 용어 "결합 도메인"은 E-캐드헤린을 특이적으로 인지하는 폴리펩타이드의 도메인을 가리킨다. 본 발명에 따라 사용된 용어 "E-캐드헤린을 특이적으로 인지하는" 또는 "E-캐드헤린에 특이적인"은 결합 도메인 (예를 들어, 항체)가 E-캐드헤린과 특이적으로 상호작용하고/하거나 결합할 수 있음을 의미한다. E-캐드헤린과 결합 도메인사이에서 본 발명과 관련하여 사용되는 용어 "결합하는"은 결합 도메인이 일반적으로 단백질과 결합하는 정도 (즉, 비특이적 결합)와 비교하여 E-캐드헤린과 통계학적으로 유의적인 정도로 결합하는 것(예를 들어, 상호작용함 또는 착체를 형성함)을 가리킨다. 따라서, 용어 "결합 도메인"은 또한 E-캐드헤린과의 통계학상 유의적인 결합(association or binding)을 갖는 도메인을 가리키는 것으로 이해되어야 한다.
본 발명과 관련하여 결합 도메인의 바람직한 예는 에피토프 결합 도메인, 바람직하게는 항체, 더 바람직하게는 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합 단편이거나 이들을 포함한다.
용어 "항체"는 표적과 결합하는 모노클로날 또는 폴리클로날 항체[참조: 문헌(Harlow and Lane, "Antibodies, A Laboratory Manual", CSH Press, Cold Spring Harbor, USA, 1988)] 또는 그러한 결합 특이성을 유지하거나 필수적으로 유지하는 상기 항체의 유도체를 가리킨다. 상기 항체의 바람직한 유도체는 예를 들어 마우스 또는 랫트 가변 영역 및 인간 불변 영역을 포함하는 키메라 항체이다. 또한, 용어 "항체"는 이작용성 (이특이성) 항체 및 항체 작제물 (예를 들어, 단일쇄 Fvs (scFv) 또는 항체-융합 단백질)을 포함한다. 용어 "scFv 단편" (단일쇄 Fv 단편)은 본 분야에 잘 알려져 있고 크기가 작고 그러한 단편을 재조합적으로 제조할 수 있는 가능성으로 인해 바람직하다. 상기 항체 또는 항체 결합 부분은 예를 들어, 랫트, 마우스, 낙타, 염소, 양, 닭, 말 또는 인간 항체 또는 인간화 항체이다. 본 발명에 있어서 용어 "인간화 항체"는 CDR3과 같이 가변영역의 상보성 결정 영역(CDR) 중 적어도 하나, 및 바람직하게는 모든 6개 CDR이 목적하는 특이성을 갖는 인간 기원의 항체의 CDR로 치환된, 비인간 기원의 항체를 의미한다. 임의로, 항체의 비인간 불변영역(들)은 인간 항체의 불변영역(들)으로 치환된다. 인간화 항체의 제조 방법은 예를 들어 유럽 특허 공보 제EP-A1 0 239 400호 및 국제 특허 공보 제WO 90/07861호에 기재되어 있다. 또한, 용어 항체 또는 이의 작용성 단편은 국제 특허 공보 제WO 94/04678호, 제WO 96/34103호 및 제WO 97/49805호, 제WO 04/062551호, 제WO 04/041863호, 제WO 04/041865호, 제WO 04/041862호 및 제WO 04/041867호에 기재된 중쇄 항체 및 이의 가변 도메인뿐만 아니라 전통적인 4개 쇄 항체 분자의 중쇄 가변 도메인(VH) 또는 경쇄 가변 도메인(VL)을 기반으로 하는 또는 그로부터 유래한 도메인 항체 또는 "dAb"(참조: 문헌(Ward et al. 1989 Nature 341, 544-546))를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "항원 결합 단편"은 분리된 경쇄 및 중쇄 Fab, Fab/c, Fv, Fab', F(ab')2와 같이 항체의 결합 특이성을 유지하거나 필수적으로 유지하는 것으로 본원에 특정된 항체의 단편을 가리킨다. 항체-결합 단편은 항체의 경쇄 가변 영역 (VL) 및 중쇄 가변 영역 (VR)을 포함할 수 있지만, 둘 다를 포함하지 않는다. 예를 들어, Fd 단편은 2개의 VH 영역을 갖고, 흔히 완전한 항원-결합 단편의 항원-결합 기능을 유지한다.
다음의 항체 예시들이 본 발명의 양태에서 사용될 수 있다. 그러나, 본 발명은 이들의 특정 항체로 한정되지 않는다:
- E-캐드헤린의 세포외 도메인에 대한 마우스 모노클로날 항체 [HECD-1] (Abcam Ab1416).
- E-캐드헤린의 120 kD 성숙 형태 및 82 kD 단편을 인지하는 E-캐드헤린에 대한 마우스 모노클로날 항체(Dako M3612).
- 인간 E-캐드헤린의 세포질 도메인과 반응하는 마우스 항-E-캐드헤린 모노클로날 항체(Invitrogen 18-0223).
- E-캐드헤린에 대한 마우스 모노클로날 항체(Sigma-Aldrich WH0000999M1).
- E-캐드헤린에 대한 토끼 폴리클로날 항체(Cell Signalling 4065).
용어 "에피토프 결합 도메인"은 항체 또는 이의 항원 결합 단편 (때때로 "작용성 단편"으로도 표기됨)이외에 E-캐드헤린과 같은 단백질성 표적과 결합하는 (특이적으로 결합하는) 다른 결합 독립체를 포함한다. 용어 "에피토프 결합 도메인"은 예를 들어 도메인 항체 (dAb) (예를 들어, 인간, 낙타 또는 상어 면역글로불린 단일 가변 도메인)을 포함하거나, CTLA-4 (Evibody); 리포칼린; 프로테인 A 유도 분자(예를 들어, 프로테인 A의 Z-도메인 (Affibody, SpA), A-도메인 (Avimer/Maxibody); 열쇼크 단백질 (예를 들어, GroEI 및 GroES); 트랜스페린 (trans-body); 안키린 반복 단백질 (DARPin); 펩타이드 압타머; C-형 렉틴 도메인 (Tetranectin); 인간 γ-크리스탈린 및 인간 유비퀴틴 (아필린); PDZ 도메인; 인간 프로테아제 억제제의 전갈 독소 쿠니츠 형 도메인; 및 피브로넥틴 (아드넥틴)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 골격의 유도체인 도메인 또는 천연 리간드외의 리간드와의 결합을 얻기 위해 단백질 유전자조작된 도메인일 수 있다. CTLA-4 (세포독성 T 림프구-결합된 항원 4)는 주로 CD4+ T-세포에서 발현되는 CD28 계열 수용체이다. 이의 세포외 도메인은 가변 도메인-유사 Ig 폴딩을 갖는다. 항체의 CDR에 상응하는 루프는 상이한 결합 특성들을 제공하는 이종 서열로 치환될 수 있다. 상이한 결합 특성들을 갖도록 유전자조작된 CTLA-4 분자가 또한 에비바디(Evibody)로서 알려져 있다. 추가의 설명은 문헌(Journal of Immunological Methods 248 (1-2), 31-45 (2001))을 참조한다.
본 발명의 결합 도메인은 표지되거나 비표지된다.
본 발명과 관련하여 표지는 분광학, 광화학, 생화학, 면역화학 또는 화학 수단에 의해 검출될 수 있는 화합물 또는 조성물을 가리킨다.
표지는 직접적으로 또는 간접적으로 검출될 수 있다.
"직접적으로"는 표지가 방사성, 발색성 또는 형광성 신호와 같은 신호를 발생함을 의미한다. 직접적인 표지는 방사성표지, 형광표지, 고전자밀도 시약 등을 포함한다. 직접적인 표지는 결합된 결합 도메인을 정량하고/하거나 정성적으로 검출하는데 사용할 수 있는 측정가능한 신호를 갖거나 발생시킨다.
"간접적으로"는 표지가 예를 들어 검출가능한 다른 독립체(검출 독립체)에 의해 결합됨을 의미한다. 간접적인 검출 또는 간접적인 표지는 간접적인 표지에 제2의 직접적인 또는 간접적인 검출가능한 결합 도메인의 결합을 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 결합 도메인의 간접적인 표지는 결합 파트너의 리간드 (예를 들어, 스트렙타비딘의 결합 파트너인 바이오틴 또는 상보서열의 결합 파트너와 특이적으로 하이브리드화할 수 있는 뉴클레오타이드 서열 등)일 수 있다. 따라서, "간접적인 표지"는 일차 결합 도메인이 조작에 대해 특이적인 제2 결합 도메인(때때로 검출 독립체로 표기됨) (예를 들어, 바이오틴 표지)에 의해 검출될 수 있도록 조작된다는 점에서 특징적이다.
바람직한 양태로서, 상기 결합 도메인은 항체 (일차 항체)이고 상기 검출 독립체는 그러한 일차 항체 또는 이의 표지와 특이적으로 반응하는 이차 항체이다.
또한, 간접적인 표지와 직접적인 표지가 혼합되는 것이 고려된다. 예를 들어, 이미 직접적인 표지가 신호 (예를 들어, FITC와 같은 형광 표지)를 발생할 수 있지만 또한 예를 들어, 직접적인 표지로 표지되는(그 표지 (항 FITC 항체)와 특이적으로 결합하는) 제2 결합 도메인이 제1 신호의 표지와 결합함으로써 검출 신호를 증가시킬 수 있다. 이와 같은 수단 및 방법은 전문가, 특히 면역화학 분야의 전문가에게 잘 알려져 있다.
다른 양태로서, 제1 결합 도메인 (예를 들어, 항체)는 표지되지 않지만 제1 결합 도메인과 결합하는 제2 결합 도메인 (검출 독립체)에 의해 검출되거나 검출가능하다 (예를 들면, 마우스에서 발생된 제1 비표지 항체는 다른 종에서 발생되고 마우스 항체와 특이적으로 결합하는 제2 표지 항체 (예를 들어, 염소 항-마우스)에 의해 검출된다). 이때 제2 결합 도메인은 직접적으로 또는 간접적으로 표지된다. 그와 같은 항체 검출 샌드위치는 잘 확립되어 있고 전문가가 그러한 체계를 재생/설정하거나 제조하는데 어려움이 없을 것이다.
생체외에서 진행되는 "검출" (때때로 "결정" 및 이의 문법적 변형으로도 표기됨)은 전문가에게 잘 알려진 표준 검출 기술에 의해 실시되며 이로써 한정되는 것은 아니지만 적합한 IHC 검출 기술중 임의의 기술, 예를 들어 근적외선 현미경을 포함한 광학 및 형광 현미경 및 공초점 현미경이 포함된다.
"생체내"와 상호교환적으로 사용되는 용어 "생체외"는 조절된 환경하에 세포내에서 실시되는 활성을 가리킨다. 본 발명의 방법은 생체외에서 수행된다.
상기된 면역조직화학(IHC)는 직접적으로 표지되거나 (직접적인 IHC) 간접적으로 표지되는 (간접적인 IHC) 결합 도메인을 사용하여 표적 (본 발명의 경우 예를 들면 E-캐드헤린) 및/또는 조직 절편에서 상기 표적을 발현하는 세포의 서브세트를 검출하는 것으로, 결합 도메인은 이의 표적과 특이적 표적-결합 도메인 상호작용을 통해 반응한다. 본 발명과 관련하여 상기 표적은 E-캐드헤린이다.
이후에, 이들 상호작용은 상기된 표지에 의해 가시화된다. 조직내 항원의 면역조직화학(IHC) 검출에 사용되는 주요 전략은 두 가지, 즉 직접 방법과 간접 방법이다. IHC의 직접 방법은 염색되는 표적과 직접적으로 결합하는 한 개의 직접 표지된 결합 도메인을 사용한다. 따라서, 직접 방법은 한 단계 염색 방법이며 예를 들어 조직 절편내 항원과 직접적으로 반응하는 표지된 항체(예를 들어, FITC 접합된 항혈청)를 포함한다. 이 기술은 단지 하나의 항체만을 사용하며 이에 따라 이 과정은 간단하고 신속하다. IHC의 간접 방법은 E-캐드헤린에 대한 하나의 결합 도메인과 제1 결합 도메인에 대한 제2 표지된 결합 도메인을 사용한다. 제2 결합 도메인은 예를 들어 일차 항체를 발생하는 동물 종의 IgG에 대해 발생하는 항체이다.
본 발명에 따른 방법의 일부 양태에서, 상기 IHC 방법은 다음의 단계들로 확인된다:
(a) 임의로 암 시료를 제공하는 단계(또는, 다른 방법으로서 임의로 암 시료를 포함한 용기를 제공하는 단계;
(b) 상기 암 시료를 고정하는 단계;
(c) 임의로 암 시료를 파라핀에 포매하는 단계;
(d) 고정된 암 시료를 E-캐드헤린 특이적 결합 도메인과 함께 항온처리하는 단계;
(e) 결합 도메인을 직접적으로 또는 간접적으로 검출하고, 이로써 암 세포상에서의 E-캐드헤린 발현을 검출하는 단계.
"고정하는" 또는 "고정"은 후속되는 IHC 검출 과정을 위해 암 시료를 제조하는데 적합한 고정 과정을 의미한다. 특히 "고정"은 조직 구조 및 세포 형태의 보존을 확실하게 유지하기 위해 실시한다. 적합한 고정 조건은 잘 알려져 있고 또한 본원에 기재된다. 또한, 다른 방법으로는 조직/서브세트를 급속냉동(예를 들어, 액체 질소에서)으로 보존하는 것이 고려된다.
상기 모든 예비처리 단계/측정은 용어 "고정"의 범위에 속하며, 즉, 고정은 특별히 포름알데하이드, 파라포름알데하이드와 같은 고정제를 이용한 고정 및/또는 조직 시료/세포의 서브세트의 급속 냉동, 및/또는 임의로 파라핀 또는 유사한 제제로의 조직/세포 서브세트의 포매를 포함한다.
상이한 IHC 프로토콜을 실행하는 수단 및 방법은 전문가에게 잘 알려져 있다. 예를 들면 문헌이나 인터넷 (예를 들어, www.ihcworld.com)을 통해 개별 프로토콜을 참조한다.
면역조직화학에서 가장 많이 사용되는 고정제는 파라포름알데이드이며, 이것은 다양한 완충액에 흔히 약 1 내지 5% 파라포름알데이드로 함유되어 사용된다. 파라포름알데하이드가 기본이 된 특정 완충액의 예로는 다음과 같다:
a) 0.1 M 포스페이트 완충액중의 4% 파라포름알데하이드
b) 0.1 M 포스페이트 완충액중의 2% 파라포름알데하이드 + 0.2% 피크르산
c) PLP (파라포름알데하이드, 라이신, 파라포름알데하이드) 고정제; 예를 들어, 0.1 M 포스페이트 완충액중의 4% 파라포름알데하이드, 0.2% 페리오데이트 및 1.2% 라이신
d) 4% 파라포름알데하이드 + 0.05% 글루타르알데하이드.
이들 완충액은 본 발명을 한정하는 것으로 의도되지 않으며 조직의 충분한 고정을 달성하기 위해 보통 적용되는 특정 조건을 설명한 것이다. 표준 고정 시간은 약 5분, 10분, 15분, 20분, 30분 내지 하룻밤의 기간이다. 이렇게 처리된 조직은 흔히 파라핀 포매 후속 프로토콜에 적용된 후 예를 들어 자일렌 및 에탄올 처리와 같은 유기 용매에서 항온처리한다. 그런 후 시료를 95%, 70%, 50%, 30% 알코올 (예를 들어, 에탄올)중에 각각 수분간 넣어 수화시키는 것이 보통이다. 그러나, IHC에 대한 표준 프로토콜은 없으며, 즉, 프로토콜은 조직, 사용된 결합 도메인 등에 따라 다양할 수 있다. 이러한 모든 것은 전문가에게 잘 알려져 있으며 별도의 수고없이 통상적으로 수행할 수 있는 것이다. 특정 프로토콜들이 예를 들어 인터넷에 공개되어 있다 (구글 등과 같은 검색 엔진에서 "IHC 프로토콜"의 검색어로 검색가능함). 일부 항원의 경우 적정량의 알데하이드 고정에서 파손될 수 있다. 이러한 조건하에서는 흔히 조직을 액체 질소에 신선 동결하고 크라이오스탯으로 절단한다. 절편은 냉 아세톤 또는 알코올로 고정할때까지 -20℃ 이하로 동결시켜 둔다.
일단 "신호"가 획득되었을때 이 신호가 표적의 분포를 사실로 반영한다는 것을 제공하는 것은 약간 어려움을 수반하는 문제이다. 가장 간단한 음성 대조군은 E-캐드헤린에 대한 RNA가 발현되지 않는 것으로 알려진 조직에서의 발현 부재에 해당한다. 또 다른 음성 대조군은 결합 도메인을 과량의 그의 유도 펩타이드 또는 단백질과 함께 예비 항온처리함으로써 신호를 제거하는 것이다.
또한, 추가의 암 연관된 신호 및/또는 암 세포의 다른 세포내 신호를 증명 또는 검출하기 위하여, 본 발명의 IHC 방법은 현장하이브리드화(in situ hybridization) 기술 (예를 들어, 형광 현장하이브리드화)와 같이 조직 절편에 적용될 수 있는 다른 기술과 조합하는 것이 고려된다.
본 발명과 관련하여 사용될 수 있는 IHC 방법과 같은 방법들은 본원에 기재되어 있고 첨부된 실시예를 통해 예시되고 있다.
근본적으로, 본 발명의 요지는 암 세포내에서의 E-캐드헤린 단백질의 발현 수준을 사용하여 PTK2 억제제에 대한 각각의 암의 민감도를 예측할 수 있다는 놀라운 발견에 있다. 이러한 측면에서, E-캐드헤린 단백질 면역반응성 점수(IRS) 0 내지 2, 바람직하게는 0 내지 1, 더 바람직하게는 IRS 점수 1, 더 더욱 바람직하게는 IRS 점수 0이, 암/암 환자가 PTK2 억제제를 이용한 치료에 감수성임을 가리키는 것인, 환자의 암/암 시료에서 E-캐드헤린 단백질의 발현을 검출하는 것이 고려된다.
본 발명의 IRS 점수는 다음과 같이 설정한다. 본 발명자들은 파라포름알데하이드-고정되고 파라핀-포매된 조직 시료를 사용하여 막-결합된 E-캐드헤린 양성 암 세포의 수를 산정하였다. 사용된 암은 췌장 암 세포주 MiaPaCa-2 및 BxPC-3; 전립선 암 세포 PC-3 및 난소 암 세포 TOV-21G를 포함하여 누드 마우스 (BomTac:NMRI-Foxn1nu)에서 성장된 인간 암 세포주의 이종이식편 모델로부터 유래되었다.
각 시료의 전체 절편을 분석하고, 검사한 모든 조직 필드에서 암 세포의 총 수에 대한 E-캐드헤린 양성 세포의 수로서 E-캐드헤린 양성 암 세포의 평균 백분율을 측정하였다. 암 세포에서 단지 막 E-캐드헤린 면역반응성만이 점수 목적상 양성으로 고려되었다. 병리학 분야 전문가는 그 방법을 수행했을 때 존재하는 조건하에서 어느 세포가 관련이 있지를 이해하고 전문가의 일반적인 지식 및 본 교시내용의 교시를 기초로 양성 세포의 부분을 결정할 수 있다.
본원에 제시된 점수는 반정량적이다. 단백질 발현 수준은 0, 1, 2, 3 또는 4로 기록되며 0은 단백질 발현이 실질적으로 검출되지 않은 것이고 (1% 미만) 4는 단백질 발현이 최고로 검출된 것이다 (>60%).
양성 대조군으로서, E-캐드헤린을 발현하는 것으로 알려진 정상적인 결장 점막 및/또는 결장직장암 시료로부터의 조직 절편이 포함될 수 있다. 임의의 해당 조직 (정상 및 종양)에 존재하는 연결 조직은 이들 검사에서 음성 대조군으로서 역할을 할 수 있다.
상기 "대조군", "양성 대조군" 또는 "대조군 시료"는 시험 시료와 비교가 가능한 시료(세포 또는 조직)가 바람직하며, 그 이유는 예를 들어 두 시료들이 주로 동일한 세포 종류로 구성되거나(예를 들어, 둘 다 상피 세포로 구성됨) 두 시료들이 동일한 조직이지만 상이한 근원들로부터 유래된 것이기 때문이다. "상이한 근원"은 예를 들어 건강한 대상자로부터, 바람직하게는 암을 앓고 있지 않은 대상자로부터 수득된 세포/조직 시료 또는 암의 연관된 증세와 상관이 없는 것으로 보이는 동일한 대상자의 구분되는 부분으로부터 수득된 세포/조직 시료를 포함한다.
E- 캐드헤린 양성 암 세포의 수는 다음과 같이 점수를 매겼다:
0 (1% 미만), 1 (약 1 내지 10%), 2 (약 11 내지 30%), 3 (약 31 내지 60%), 4 (>60%). 따라서, "양성 세포"는 앞서 설명된 바와 같이 E-캐드헤린 발현을 보이는 암 세포를 의미한다. 본원에 언급된 점수는 본 발명의 모든 양태에 적용된다. 바람직하게는, IRS-0의 E-캐드헤린 단백질 면역반응성 점수(IRS)는 검사한 하나 이상의 조직 필드(들)에서 암 세포의 총 수에 대하여 평균 1% 미만의 막 E-캐드헤린 양성 암 세포로서 확인되고; IRS-1은 검사한 하나 이상의 조직 필드(들)에서 암 세포의 총 수에 대하여 평균 약 1 내지 10%의 막 E-캐드헤린 양성 암 세포로서 확인되며; IRS-2는 검사한 하나 이상의 조직 필드(들)에서 암 세포의 총 수에 대하여 평균 약 11 내지 30%의 막 E-캐드헤린 양성 암 세포로서 확인되며; IRS-3은 검사한 하나 이상의 조직 필드(들)에서 암 세포의 총 수에 대하여 평균 약 31 내지 60%의 막 E-캐드헤린 양성 암 세포로서 확인되고; IRS-4는 검사한 하나 이상의 조직 필드(들)에서 암 세포의 총 수에 대하여 평균 60% 초과의 막 E-캐드헤린 양성 암 세포로서 확인된다. 상기 점수는 바람직한 양태에서 파라포름알데하이드-고정되고 파라핀-포매된 조직 시료를 사용한 IHC를 통해 매겨진 것이다.
이와 관련하여 "하나 이상"은 환경에 따라(바람직하게는 시료 당) 분석되는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9개 또는 그 이상의 조직 필드를 포함한다. 적어도 "3"개의 조직 필드가 바람직하다.
누드 마우스에서 성장한 인간 암 세포주의 상기 이종이식편 모델을 시험할때 본 발명자들은 PTK2 억제제가 특정 모델에서는 고도의 효능을 나타낸 반면 다른 모델에서는 상대적으로 낮은 반응을 나타냄을 증명할 수 있었다. 이종이식편 모델은 다음과 같이 설정하였다: 약 6주령된 무흉선 암컷 BomTac:NMRI-Foxn1nu 마우스를 실험에 사용하기 적어도 3일전에 새로운 환경에 적응시켰다. 동물은 Macrolon® II형 케이지에서 5 마리씩 표준 조건으로 사육하였다. 표준 급식 (PROVIMI KLIBA) 및 자동 급수를 자유롭게 제공하였다. 피하 종양을 설정하기 위하여 트립신처리로 세포를 수확하고, 원심분리한 다음, 세척하고 빙냉 PBS + 5% FCS에 재현탁시켰다. 이어서, 5,000,000개 세포를 함유한 100 μL의 세포 현탁액을 누드 마우스의 우측 옆구리 (마우스 당 1군데)에 피하주사였다. 종양이 잘 설정되어 직경이 6 내지 9 mm에 도달했을 때 처리군과 비히클 대조군사이에 마우스를 무작위로 분포시켰다 (세포 주사 후 10 내지 14일). 종양 직경은 캘리퍼스를 이용하여 매주 3회 (월요일, 수요일 및 금요일) 측정하였다. 각 종양의 체적(mm3)은 수학식 "종양 체적" = 길이*직경2*π/6"에 따라 계산하였다. 처치 부작용을 모니터링하기 위하여, 마우스를 매일 기형에 대해 검사하고 체중을 매주 3회 (월요일, 수요일 및 금요일) 측정하였다. 처치 시작 후 약 3주 경과하여 연구 말미에 동물을 희생시켰다. 괴사성 종양 또는 2000 mm3 초과의 종양 크기를 갖는 동물은 윤리적 이유로 연구중 조기에 희생시켰다.
누드 마우스에서 성장한 인간 암 세포주의 상기 이종이식편 모델을 시험했을 때 본 발명자들은 PTK2 억제제가 특정 모델에서 고도의 효능을 나타낸 반면 다른 모델에서는 반응이 상대적으로 낮았음을 증명할 수 있었다. 예를 들어 세포주 MiaPaCa-2로부터 유래된 인간 췌장 선암종 모델은 PTK2 억제제를 이용한 치료에 고도의 반응성을 나타내어 강력한 암성장 억제 (즉, 종양 성장 억제 또는 TGI)(114%의 TGI로 나타남)를 유도하고 암 퇴행을 발생하였다. 상기 암에서 조직 절편을 제조하고 E-캐드헤린에 대한 항체를 이용하여 면역조직화학으로 염색하였다. 이들 암 절편에서 E-캐드헤린의 단백질 발현은 완전히 존재하지 않았으며 이것은 0의 IRS (<1% E-캐드헤린 양성 세포)에 해당한다. TGI는 아래에서 정의된다.
대조적으로, 세포주 BxPC-3 또는 AsPC-1로부터 유래된 2종의 추가의 췌장 선암종 모델은 PTK2 억제제로 처리한 후 단지 미미한 민감성을 나타내거나 민감성을 전혀 나타내지 않았고 TGI는 49% (BxPC-3) 및 13% (AsPC-1) 였고 암 퇴행을 전혀 없었다. 이들 암 모델의 조직 절편을 E-캐드헤린에 대한 항체의 면역조직화학법의 결과 이들 암에서 E-캐드헤린의 강한 발현이 증명되었고 BxPC-3의 경우 IRS는 "4" (>60% 양성 세포)였고 AsPC-1의 경우 IRS는 "3" (31 내지 60% 양성 세포)였다 (추가의 설명은 도 2를 참조한다). 따라서, 이들 선암종 모델은 본 발명의 IRS 점수의 평가 및/또는 조정을 위한 참조물/참조시료로서 역할을 할 수 있을 것으로 고려된다. BxPC-3 이종이식편은 IRS 점수 "4"에 대한 참조물로서 고려될 수 있는 한편, AsPC-1 이종이식편은 IRS 점수 "3"에 대한 참조물로서 고려될 수 있다. 마찬가지로, MiaPaCa-2는 E-캐드헤린 IRS 점수 "0"에 대한 참조물로서 작용할 수 있다. 이와 같은 이종이식편의 생성은 본원에 기재되어 있다.
상기 데이터는 E-캐드헤린의 소량 발현 또는 발현 부재가 PTK2 억제제에 대한 임상전 암 모델의 민감도에 대응하는 반면, E-캐드헤린 발현 암 세포의 중간 내지 고 비율을 갖는 암은 민감성이 떨어지거나 민감성이 없는 것으로 나타난다는 것을 증명한다. 이러한 측면에서, E-캐드헤린 단백질 면역반응성 점수 0 내지 2, 바람직하게는 0 내지 1의 IRS 점수, 더 더욱 바람직하게는 0의 IRS 점수는 암/암 환자가 PTK2 억제제를 이용한 치료에 감수성임을 나타내는 지표로 설정될 수 있었다.
"종양 성장 억제" 또는 "TGI"는 다음과 같이 정의된다:
Figure pct00001
상기식에서, "C1" 및 "T1"은 실험 개시 1일째에 대조군 및 처리군에서의 중간 종양 체적을 의미하고, "Cd" 및 "Td"는 실험 개시 d일째 말에 대조군 및 처리군에서의 중간 종양 체적을 의미한다.
추가의 양태로서, 본 발명은 E-캐드헤린 단백질 면역반응성 점수 0 내지 2, 바람직하게는 IRS 점수 0 내지 1, 더 바람직하게는 IRS 점수 1, 훨씬 더 바람직하게는 IRS 점수 0을 갖는 암 환자에게 치료학적 유효량의 PTK2 억제제를 투여하는 것을 포함하는 암 환자를 치료하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 양태와 관련하여, E-캐드헤린 단백질 면역반응성 점수는 상기되고 본원에 예시된 IHC 방법으로 평가하는 것이 바람직한 것으로 이해될 것이다. 적합한 IHC 방법이 본원에 기재되어 있으나 이들 특정 프로토콜로 본 발명을 한정하는 것은 아니다.
"치료학적 유효량" 또는 "치료학적 활성인"은 PTK2 억제제를 투여했을 때 치료 효과를 발생하는 PTK2 억제제의 용량을 의미한다. 이 약물의 치료학적 유효량은 암 세포의 수를 감소, 암 크기를 감소, 주변 기관으로의 암 세포 침윤을 억제 (즉, 어느 정도 속도를 늦추거나 바람직하게는 정지시킴), 암 전이를 억제 (즉, 어느 정도 속도를 늦추거나 바람직하게는 정지시킴), 적어도 어느 정도 암 성장을 억제 및/또는 어느 정도 암과 연관된 증세중 하나 이상을 완화시킬 수 있다. 본 분야의 전문가는 공지 기술을 사용하여 정확한 용량을 설정할 수 있다. 본 분야에 알려진 바와 같이 연령, 체중, 건강상태, 성별, 식이, 약물 상호작용 및 병태의 중증도에 따라 조정이 필요할 수 있으며 본 분야의 전문가는 통상적인 실험으로 설정할 수 있다.
암 시료의 E-캐드헤린 단백질 면역반응성 점수가 PTK2 억제제 치료에 대한 각각의 암의 감수성과 상관성이 있다는 것은 본 발명자들에 의해 처음으로 입증되었다. 이러한 발견을 근거로, 본 발명에 이르러 PTK2 억제제를 이용한 치료에 감수성인 암 환자 또는 암 (또는 암 세포주)를 분류할 수 있다. 본 발명의 발견을 기초로, 0, 1 또는 2의 E-캐드헤린 단백질 면역반응성 점수(IRS)를 나타내는 암을 갖는 환자는 PTK2 억제제로 우선적으로 치료되어야 한다는 것은 명백하며, 그 이유는 이들 환자에 대하여 치료 효과를 달성할 수 있는 가능성이 IRS 3 또는 4의 환자에 대한 가능성보다 더 높을 수 있기 때문이다. 그러나, 높은 IRS 점수 (3-4)가 PTK2 억제제에 의한 환자의 치료 효과 달성 가능성이 보다 낮음을 가리키다는 것은 명백하지만 상기 PTK2 억제제의 잔여 치료 효과를 반드시 배제하는 것은 아니므로, 3 또는 그 이상의 E-캐드헤린 단백질 면역반응성 점수를 갖는 암 또한 PTK2 억제제로 치료할 수 있음은 고려되어야 한다. 이와 같은 환자는 또한 대안적인 (PTK2 억제제에 대한 대안) 또는 추가적인 항암치료요법(즉, PTK2 억제제를 기초로 하지 않는 치료요법)으로 치료될 수 있다. 추가적인 또는 대안적인 항암치료요법은 이들로 한정되는 것은 아니지만 항종양제, 항혈관형성제, 화학치료요법제 및 펩타이드 암 치료요법제로부터 선택될 수 있는 치료요법을 포함한다. 항종양제는 유사항생제, 알킬화제, 항대사제, 호르몬제, 면역제, 유사인터페론제, 키나제 억제제 및 이의 조합물로부터 선택될 수 있다. 이와 같은 약제학적 활성 화합물/제제는 예를 들면 전통적인 유기화학 소분자이거나 단백질, 항체 (이의 단편을 포함), 펩티바디, DNA, RNA와 같은 거대분자 또는 이의 단편일 수 있다.
추가로 본 발명은 암 환자의 암 시료에서 E-캐드헤린 IRS 점수를 결정하는 것을 포함하여, PTK2 억제제를 이용한 치료에 감수성인 암 환자를 분류하는 방법으로서, 0 내지 2의 E-캐드헤린 단백질 면역반응성 점수(IRS)가, 상기 암 환자가 PTK2 억제제를 이용한 치료에 감수성임을 가리키는 것인, 방법에 관한 것이다. 3-4 (즉, 3 또는 4)의 E-캐드헤린 단백질 면역반응성 점수(IRS)는 환자가 PTK2 억제제에 의한 치료에 감수성이지 않거나 적어도 PTK2 억제제에 의한 환자의 치료 효과가 달성될 가능성이 낮다는 것을 가리킨다.
용어 "분류하다" 또는 "분류하는"은 환자들로부터 PTK2 억제제를 기초로 한 항암치료요법에서 효과가 다른 환자들에 비하여 더 나타나는(또는 덜 나타나는) 환자를 선별함을 가리킨다. 따라서, 본 발명의 방법은 PTK2 억제제를 이용한 치료에 대한 암 환자의 감수성에 관해 암 환자를 분류하는데 사용할 수 있다. 상기된 바와 같이, 0 내지 2의 E-캐드헤린 단백질 면역반응성 점수 IRS, 바람직하게는 0 내지 1의 IRS 점수, 더 바람직하게는 1의 IRS 점수, 및 더 더욱 바람직하게는 0의 IRS 점수를 나타내는 암을 갖는 환자는 PTK2 억제제 기반 치료요법으로부터 효과를 더 나타내는 한편, 암의 E-캐드헤린 단백질 면역반응성 점수(IRS)가 3 이상인 환자는 PTK2 억제제 기반 치료요법으로부터 효과를 덜 나타낸다.
구체적으로, PTK2 억제제에 의한 항암치료요법으로부터 "효과를 나타낼 수 있는 환자"는 PTK2 억제제에 의한 치료 효과가 나타날 가능성이 더 높은 환자이다. 암 및/또는 암 환자가 유리하게 반응할 수 있거나 반응하지 않을 수 있는 가능성은 본원에 기재된 바와 같이 암 환자의 각각의 암 세포의 세포막상에서 나타나는 E-캐드헤린 단백질 면역반응성 점수에 의해 좌우된다.
상응하게, PTK2 억제제에 의한 항암치료요법으로부터 "효과를 나타내지 않을 수 있는 환자"는 PTK2 억제제에 의한 치료 효과가 더 높게 나타날 가능성이 없는 환자이다.
추가로, 본 발명은 0 내지 2의 E-캐드헤린 단백질 면역반응성 점수, 바람직하게는 0 내지 1의 IRS 점수, 및 훨씬 더 바람직하게는 0의 IRS 점수로 확인되는 암을 갖는 암 환자의 치료용 약제학적 조성물을 제조하는데 사용하기 위한 본원에 정의된 PTK2 억제제의 용도에 관한 것이다.
상기 약제학적 조성물은 추가로 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 희석제를 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 희석제의 예는 본 분야에 잘 알려져 있고 인산염 완충 염수 용액, 물, 에멀젼 (예를 들어, 오일/물 에멀젼), 여러 유형의 습윤제, 멸균 용액 등을 포함한다. 그러한 담체를 포함한 조성물은 잘 알려진 통상의 방법에 의해 제형될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 적합한 용량으로 대상자에게 투여될 수 있다. 투여 계획은 주치의 및 임상인자에 의해 결정될 것이다. 의료 분야에서 잘 알려져 있는 바와 같이 임의의 한 환자에 대한 투여는 환자의 체구, 신체표면적, 연령, 특정 투여 화합물, 성별, 투여 시간 및 투여 경로, 일반건강상태 및 동시에 투여되는 기타 약물을 포함한 많은 요인들에 의해 좌우된다. 비경구 투여 제제는 멸균 수성 또는 비수성 용액, 현탁액 및 에멀젼을 포함한다. 비수성 용매의 예는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식물성유 (예를 들어, 올리브유) 및 주사용 유기 에스테르 (예를 들어, 에틸 올레에이트)이다. 수성 담체는 염수 및 완충 매질을 포함하여 물, 알콜성/수성 용액, 에멀젼 또는 현탁액을 포함한다. 비경구 비히클은 염화나트륨 용액, 링거 덱스트로즈, 덱스트로즈와 염화나트륨, 젖산링거 또는 불휘발성유를 포함한다. 정맥내 비히클은 유액 및 영양 보충액, 전해질 보충액 (예를 들어, 링거 덱스트로즈 기반 전해질 보충액) 등을 포함한다. 또한, 보존제 및 다른 첨가제가 존재할 수 있으며, 예로는 항균제, 항산화제, 킬레이트화제 및 불활성가스 등을 들 수 있다.
또한, 본 발명의 약제학적 조성물은 추가적인 항암치료요법/제제와 같은 추가의 제제를 포함할 수 있다. 추가의 항암치료요법은 이들로 한정하는 것은 아니지만 항종양제, 항혈관형성제, 화학치료요법제 및 펩타이드 암 치료요법제로부터 선택될 수 있다. 항종양제는 유사항생제, 알킬화제, 항대사제, 호르몬제, 면역제, 유사인터페론제, 키나제 억제제 및 이의 조합물로부터 선택될 수 있다. 이와 같은 약제학적 활성 화합물/제제는 예를 들면 전통적인 유기화학 소분자이거나 단백질, 항체 (이의 단편을 포함), 펩티바디, DNA, RNA와 같은 거대분자 또는 이의 단편일 수 있다. 이러한 치료요법은 숙련가에게 익히 공지되어 있다.
본원에 기재된 PTK2 억제제 또는 본 발명의 약제학적 조성물의 투여 경로는 환경에 의해 결정되며 이로써 한정하는 것은 아니지만 경구 투여, 비경구 투여 (예를 들어, 정맥내, 근육내, 복강내 등), 피하 투여, 경피 투여, 흡입 투여, 좌제 등을 포함한다.
추가의 양태로서, 본 발명은 E-캐드헤린 단백질 면역반응성 점수 0 내지 2, 바람직하게는 IRS 점수 0 내지 1, 더 바람직하게는 IRS 점수 1, 및 훨씬 더 바람직하게는 IRS 점수 0으로 확인되는 암을 갖는 암 환자의 치료에 사용하기 위한 본원에 정의된 PTK2 억제제에 관한 것이다.
본 발명과 관련하여 암 환자는 본원에 정의된 방법, 바람직하게는 본원에 기재된 IHC 방법에 의해 동정되거나 동정된(확인된 또는 분류된) 암 환자가 바람직하다. 상기 동정 또는 분류 방법은 상기 PTK2 억제제를 이용한 상기 치료 이전에 및/또는 치료 중에 실시할 수 있다.
본 발명자들은 암 시료의 E-캐드헤린 단백질 면역반응성 점수가 PTK2 억제제 치료에 대한 각각의 암의 감수성과 상당한 상관성이 있음을 증명하였다. 이러한 발견을 기초로, 이제는 각각의 E-캐드헤린 IRS를 기준으로 암을 앓고 있는 암 환자, 및 특히 암종을 앓고 있는 암 환자에게 잠재적으로 치료 효과를 나타내는 적절한 항암치료요법을 선택하는 것이 가능하다.
E-캐드헤린 단백질 면역반응성 점수(IRS)가 3 초과인 환자 및/또는 암은 본 발명의 발견을 기초로 PTK2 억제제를 이용한 치료에 감수성이 적어야 한다. 비록 이들 환자에 PTK2 억제제가 유익한 효과를 나타낼 수 있음을 배제할 수 없지만, 이들 환자를 다른 항암치료요법에 의해 추가로 또는 대안적으로 치료할 수 있다. 따라서, 3 이상의 E-캐드헤린 IRS 점수로 확인된 환자에게는, 각각의 PTK2 억제제가 E-캐드헤린 IRS 2, 바람직하게는 1, 및 훨씬 더 바람직하게는 0으로 확인된 환자에서와 같이 효과적이지는 않을 것으로 예상되지만 그들 화합물은 3 이상의 E-캐드헤린 IRS 점수로 확인된 환자에게도 사용하는 것이 또한 가능할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따라 각각의 E-캐드헤린 IRS 점수에 따라 더 적합한 치료요법 형태를 선택할 수 있다는 것이 이해되어야 한다.
따라서, 본 발명은 추가의 양태로서 (a) 환자의 암 시료에 대해 E-캐드헤린 단백질 면역반응성 점수를 결정하는 단계; 및 (b) (a)에서 결정된 E-캐드헤린 단백질 면역반응성 점수가 2, 1 또는 0 (1이 바람직하고 0은 더 바람직하다)인 경우 환자를 위한 항암치료로서 바람직하게는 PTK2 억제제를 선택하는 단계; 또는 (c) (a)에서 결정된 E-캐드헤린 단백질 면역반응성 점수가 3 또는 4인 경우 바람직하게는 대안적인 또는 추가적인 항암치료를 선택하는 단계를 포함하는, 암 환자를 위한 항암치료를 선택하는 방법에 관한 것이다.
"항암치료로서 바람직하게는 PTK2 억제제를 선택하는"은 2, 1 또는 0 (1이 바람직하고 0은 더 바람직하다)의 E-캐드헤린 단백질 면역반응성 점수를 갖는 암에 대해 PTK2 억제제 기반 치료요법을 사용하는 것이 바람직함을 의미한다. 그러나, 3 또는 그 이상의 E-캐드헤린 단백질 면역반응성 점수를 갖는 암 또한 PTK2 억제제로 치료될 수 있음이 고려되며, 그 이유는 높은 IRS 점수 (3-4)가 비록 PTK2 억제제의 환자에 대한 치료 효과 달성 가능성이 보다 더 낮음을 명백히 가리킬지라도 이러한 PTK2 억제제의 잔여 치료 효과를 반드시 배제하지 않기 때문이다. 이러한 경우에 (3 이상의 높은 IRS 점수), PTK2 억제제는 단독으로 사용하지 않는 것이 바람직하다.
본 발명의 신규한 발견을 기초로, 즉 2, 1 또는 0 (1이 바람직하고 0은 더 바람직하다)의 E-캐드헤린 단백질 면역반응성 점수로 확인되는 암이 PTK2 억제제에 감수성이라는 발견을 기초로, 또한 2, 1 또는 0 (1이 바람직하고 0은 더 바람직하다)의 E-캐드헤린 단백질 면역반응성 점수로 확인된 암 세포는 PTK2 억제제에 (보다 더) 감수성을 나타냄으로써, 달리 선별되어 왔던(즉, 3 이상의 E-캐드헤린 단백질 면역반응성 점수로 확인된 암 세포를 사용한 경우) 신규 PTK2 억제제의 양성 동정을 가능케할 수 있기때문에, 이들 암 세포를 사용하여 PTK2 억제제를 선발하는 선발 방법이 제공된다.
따라서, 추가의 양태로서, 본 발명은 (a) 2, 1 또는 0 (1이 바람직하고 0은 더 바람직하다)의 E-캐드헤린 단백질 면역반응성 점수로 확인된 암 세포 또는 암 세포주를 제공하는 단계, (b) (a)의 암 세포 또는 암 세포주를 PTK2 억제제와 접촉시키는 단계, 및 (c) PTK2 억제제가 암 세포/암 세포주에 음성적으로 영향을 미치는지를 평가하는 단계를 포함하는, 치료학적으로 유효한 PTK2 억제제를 선발하는 방법에 관한 것이다.
상기 선발 방법은 바람직하게는 PTK2 억제제에 반응하여 나타나는 암 세포의 검출가능한 표현형 변화를 사용하는 "표현형" 선발 방법이다 (상기 반응은 PTK2 억제제가 치료학적으로 유효한지 유효하지 않은지의 여부를 가리킨다). 용어 "검출가능한 표현형 변화"는 암 세포에 음성적으로 영향을 미치는 변화를 의미한다. 이러한 음성 영향은, 일부만 예를 들자면, 아폽토시스 또는 괴사와 같은 세포 사멸, 암 세포/암 세포주의 이동능 감소 및/또는 암 세포의 증식 억제를 포함한다. 그러나, 이들 영향으로 한정되는 것은 아니며 전문가는 피검 화합물이 각각의 세포에 실질적으로 미친 음성적 영향을 나타내는 것을 가리킬 수 있는, 암 세포의 추가의 표현형 변화를 잘 알고 있다. 상기 선발 방법을 이용함으로써 치료학적으로 유효한 PTK2 억제제를 보다 더 용이하게 동정할 수 있다.
또한, 본 발명은 적어도 하나의 PTK2 억제제, 및 (a) 상기 PTK2 억제제가 바람직하게는 2 또는 그 이하의 E-캐드헤린 단백질 면역반응성 점수로 확인된 암을 앓고 있는 환자의 치료에 사용된다는 것을 가리키는 지침서 및/또는 인쇄물; 및/또는 (b) 상기 환자가 본원에 기재된 방법에 의해 분류될 수 있음을 가리키는 지침서 및/또는 인쇄물; 및/또는 (c) 본원에 정의된 방법을 수행하는 수단을 포함하는 약제학적 패키지에 관한 것이다.
"본원에 정의된 방법을 수행하는 수단"은 특히 E-캐드헤린 특이적 항체, 본원에 기재된 양성 및/또는 음성 대조군, IHC 방법에 사용될 수 있는 완충액 및/또는 본 발명의 검출 방법에 사용될 수 있는 다른 수단 (예를 들어, 대조 항체, 이차 항체, IHC를 위한 유리 또는 플라스틱 슬라이드 등)을 포함한다.
추가의 양태로서, 본 발명은 PTK2 억제제를 포함하고 추가로 E-캐드헤린 IRS를 예측하기 위해 사용되는 E-캐드헤린 항체를 포함하는 약제학적 키트 또는 패키지에 관한 것이다.
다른 양태로서, 본 발명은 E-캐드헤린 IRS의 예측을 위한 E-캐드헤린 항체 및 본 발명의 방법에 따라 결정, 확인, 동정 또는 분류된 환자의 치료를 위해 사용되는 PTK2 억제제를 포함하는 진단 키트 또는 패키지에 관한 것이다.
추가의 관점에서 본 발명은 E-캐드헤린 단백질 발현을 본 발명의 수단 및 방법에 따라 검출하기 위한 수단 및 (a) 상기 E-캐드헤린 검출 (점수 매김)의 실시에 관한 패키지 사용설명서 및/또는 지침서; 및/또는 (b) 점수를 확증해 주는 양성 및/또는 음성 대조군을 포함하는 키트, 바람직하게는 진단 키트 또는 진단 패키지에 관한 것이다.
사용된 용어 "패키지 사용설명서 및/또는 지침서"는 해당 진단제품의 사용에 관한 방법, 용법, 저장, 취급 및/또는 주의에 관한 정보를 함유하는 진단제품의 패키지 상품에 관례상 포함되는 지침서를 가리킨다. "양성 대조군"은 E-캐드헤린을 발현하는 암 세포 또는 암 시료 또는 본원에 기재된 표준 면역학적 방법에 사용될 수 있는 것과 같은 E-캐드헤린(단백질 대조군)을 포함한다. "음성 대조군"은 단백질 수준에서 E-캐드헤린을 발현하지 않는 참조 세포 또는 참조 시료를 포함한다. 양성 대조군 및 음성 대조군 둘 다는 각각의 점수를 나타냄으로써 사용자에게 도움을 주는 그림으로 또한 대체될 수 있다. "E-캐드헤린 단백질 발현을 검출하는 수단"은 특히 E-캐드헤린 특이적 항체 (즉, E-캐드헤린과 결합하는 항체)를 포함한다.
추가의 양태로서, 본 발명은 PTK2 억제제를 이용한 치료에 대한 감수성에 관해 암 환자를 분류하는데 사용하기 위한 E-캐드헤린 항체에 관한 것이다. 분류는 본 발명의 방법에 따라 수행할 수 있다.
또한, 본 발명은 암 환자가 단백질 티로신 키나제 2 (PTK2) 억제제를 이용한 치료에 감수성인지를 결정하는 방법에 사용하기 위한 E-캐드헤린 항체에 관한 것이다. 상기 방법은 0 내지 2의 E-캐드헤린 단백질 면역반응성 점수(IRS)가 암 환자는 PTK2 억제제를 이용한 치료에 감수성이 있음을 가리키는 것인, 상기 암 환자의 암 시료에서 E-캐드헤린 단백질의 발현을 검출하는 것을 포함한다.
본 발명자들은 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같이 단백질 면역반응성 점수에 의해 평가되는 E-캐드헤린 단백질 발현이 PTK2 억제제 치료에 대한 각각의 암의 감수성과 밀접한 상관성이 있음을 확립하였다. 그러나, 각각의 암 세포에서 평가되는 경우 E-캐드헤린 mRNA의 발현 프로파일도 PTK2 억제제 치료에 대한 각각의 암/암 환자의 감수성을 예측할 수 있는 것으로 추정된다. 따라서, 본 발명의 요지는 E-캐드헤린 mRNA의 평가로도 확장한다는 것을 이해해야한다. 따라서, 본원에 기재된 본 발명의 모든 양태는 암 세포내 E-캐드헤린 mRNA의 발현 수준 측정에도 동등하게 적용된다. 특히, E-캐드헤린 mRNA의 발현 감소 또는 E-캐드헤린 mRNA의 무발현은 PTK2 억제제(들)를 이용한 치료에 대한 각각의 암/암 환자의 감수성 증가를 나타내는 것으로 추정된다. 전문가가 E-캐드헤린 발현 암 세포의 발현 프로파일을 평가할 수 있는 방법은 전문가에게 잘 알려져 있으며 예로는 노썬 블롯팅, 핵산 어레이를 기초로 한 검출기술을 포함한 mRNA 프로파일링 기술, 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 기술 (예를 들어, 실시간 정량 PCR 또는 "Q-PCR") 등이 포함된다. 본 발명은 이들 기술로 한정되는 것은 아니며 이러한 기술들은 전문가들에게 알려져 있는 기술의 일부를 설명할 목적으로 단지 예시된 것임이 이해될 것이다. 용어 "정량 PCR" 또는 "Q-PCR"은 특정 핵산 서열에 대한 중합효소 연쇄 반응의 결과를 정량하는데 사용되는 다양한 방법을 가리킨다. 전형적으로 이러한 방법들은 역치 주기 (Ct)를 결정하는 것과 같이 일반적으로 증폭인자를 결정하거나 비교하는 역학-기반 시스템 또는 일반적으로 표적과 표준 주형의 동시 증폭으로부터 발생된 생성물의 양을 비교하는 동시증폭방법으로 분류된다. 많은 Q-PCR 기술은 리포터 프로브, 인터칼레이팅 제제(intercalating agent) 또는 이들 둘 다를 포함한다. 이로써 한정하는 것은 아니지만 예로는 TaqMan® 프로브 (Applied Biosystems), i-프로브, 분자 비콘, 이클립스 프로브, 스콜피온 프라이머, LuxTM 프라이머, FRET 프라이머, 에티듐 브로마이드, SYBR® Green I(Molecular Probes) 및 PicoGreen®(Molecular Probes)를 들 수 있다. 전문가는 각종 E-캐드헤린 mRNA의 발현 수준을 측정하는 방법을 잘 알고 있다.
본 교시내용은 본원에 참조로 포함된 도면을 참고로 하면 가장 이해될 수 있다. 또한, 본 발명 및 이의 많은 장점들은 이하의 실시예를 통해 보다 더 잘 이해될 수 있으며, 이들 실시예는 본 발명을 좀더 상세히 설명하기 위한 것으로 본 발명을 한정하고자 하는 것은 아니다.
[도면의 간단한 설명]
도 1: 배양세포 상의 E-캐드헤린 발현
인간 종양 세포를 챔버 슬라이드에 도말하고 인간 E-캐드헤린에 대한 특이적 항체로 염색하였다. 형광 염료 (Alexa 488, 그린 신호)로 표지된 이차 항체로 항체 결합을 검출하였다. 핵 DNA는 프로피듐 요오다이드 (PI, 레드 신호)로 염색하였다. E-캐드헤린은 세포 소분획에서 존재하지 않거나 발현되었다 (참조: MiaPaca2 및 TOV-21G 세포주). 대조적으로, BxPC-3 세포는 E-캐드헤린이 강하게 발현된 상피 표현형을 나타냈다.
도 2: 이종이식편 암에서의 E-캐드헤린 발현
MiaPaCa-2, As-PC-1 및 BxPC3 세포로부터의 이종이식편 암으로부터 두께 5 μm의 파라핀 절편을 수득하고 ABC 면역퍼옥시다제 방법으로 E-캐드헤린을 염색한 다음 헤마톡실린으로 대비염색하였다. 종양 세포의 막에 갈색 염색은 마커 단백질의 존재를 가리킨다 (MiaPaca2에는 무염색; As-PC-1(30%) 및 BxPC3(>60%)에는 갈색 염색).
실시예:
아래 실시예는 본 발명을 예시한다. 이들 실시예는 본 발명의 범위를 한정하는 것으로 해석되어서는 안된다. 실시예는 예시의 목적으로 포함되며 본 발명은 단지 청구범위에 의해서만 한정된다.
실시예 1: PTK2 억제제에 대한 인간 종양 이종이식편의 민감도
이종이식편 모델은 다음과 같이 설정하였다: 약 6주령의 무흉선 암컷 BomTac:NMRI-Foxn1nu 마우스를 적어도 3일 동안 새로운 환경에 적응시킨 후 실험에 사용하였다. 동물은 Macrolon® II형 케이지에서 5 마리씩의 그룹으로 표준 조건으로 사육하였다. 표준 급식 (PROVIMI KLIBA) 및 자동 급수를 자유롭게 제공하였다. 피하 종양을 설정하기 위하여 트립신처리로 세포를 수집하고, 원심분리한 다음, 세척하고 빙냉 PBS + 5% FCS에 재현탁시켰다. 이어서, 5,000,000개 세포를 함유한 100 μL의 세포 현탁액을 누드 마우스의 우측 옆구리 (마우스 당 1 부위)에 피하주사였다. 종양이 잘 설정되어 직경이 6 내지 9 mm에 도달했을 때 처리군과 비히클 대조군사이에 마우스를 무작위로 분포시켰다 (세포 주사 후 10 내지 14일). 종양 직경은 캘리퍼스를 이용하여 매주 3회 (월요일, 수요일 및 금요일) 측정하였다. 각 종양의 체적(mm3)은 수학식 "종양 체적" = 길이*직경2*π/6"에 따라 계산하였다. 처치 부작용을 모니터링하기 위하여, 마우스를 매일 기형에 대해 검사하고 체중을 매주 3회 (월요일, 수요일 및 금요일) 측정하였다. 처치 시작 후 약 3주 경과하여 연구 말미에 동물을 희생시켰다. 괴사성 종양 또는 2000 mm3 초과의 종양 크기를 갖는 동물은 윤리적 이유로 연구중 조기에 희생시켰다.
PTK2 억제제를 이용한 치료에 대한 누드 마우스에서 성장하는 인간 종양 이종이식편의 민감도 결과는 다음과 같다:
Figure pct00002

실시예 2: 이종이식편 모델에서 E-캐드헤린 발현을 측정하기 위한 면역조직화학 프로토콜 (ABC 방법)
탈파라핀화:
- 슬라이드를 65℃로 1시간 동안 가열한다.
- 슬라이드를 자일렌에 3 x 5분 동안 넣고, 이어서 100% EtOH abs., 96% EtOH, 70% EtOH (각각 3 x 20초) 및 증류수에 차례로 넣는다.
항원회수:
- 슬라이드를 시트레이트 완충액중에 넣고 121℃/1 bar로 20분 동안 가압멸균한다.
- 슬라이드를 실온으로 30분 동안 냉각시킨다.
- PBS로 세척한다.
염색:
- 슬라이드를 PBS중의 3% H2O2에서 5분간 항온처리한다.
- PBS로 세척한다.
- M.O.M. 차단시약 (2 방울 = 2500 μL PBS중의 원액 90 μL)을 조직에 첨가하고 실온에서 60분간 항온처리한다.
- PBS로 세척한다.
- M.O.M. 희석제 (7500 μL PBS중의 원액 600 μL)를 조직에 첨가하고 실온에서 5분간 항온처리한다.
- 흡인한다.
- 항체 (M.O.M. 희석제중에 희석)를 조직에 첨가하고, 실온에서 60분간 항온처리한다.
- PBS로 세척한다.
- M.O.M. 바이오티닐화 항-마우스 IgG 시약 (2500 μL M.O.M. 희석제중의 10 μL 원액)을 조직에 첨가하고 실온에서 10분간 항온처리한다.
- PBS로 세척한다.
- Vectastain ABC Elite 키트 (사용전 30분: 2 방울 A + 2500 μL PBS, 혼합, 2 방울 B 첨가, 혼합; Vector #PK-6200)를 조직에 첨가하고, 실온에서 10분간 항온처리한다.
- PBS로 세척한다.
- 슬라이드를 PBS/0.5% 트리톤 X-100중에 4분간 넣는다.
- DAB 용액에서 염색한다.
- PBS로 세척한다.
- 슬라이드를 증류수에 1분간 넣는다.
대비염색:
- 슬라이드를 헤마톡실린 용액중에 1분간 넣는다.
- 유수에서 세척한다.
- 슬라이드를 HCl/EtOH에 1초간 넣는다.
- 유수에서 세척한다.
- 슬라이드를 암모늄-수에 20초간 넣는다.
- 유수에서 세척한다.
- 슬라이드를 70% EtOH, 96% EtOH, 100% EtOH
abs. (각각 3회/20초)에 넣는다.
- 슬라이드를 자일렌에 1분, 2분, 2분 동안 넣는다.
완충액 및 시약:
시트레이트 완충액:
800 mL 증류수중의 21.01g 시트르산 수화물
2M NaOH로 pH를 6으로 조절한 다음 증류수를 첨가하여 1000 mL으로 만든다.
Tris/EDTA 완충액: 0.01M Tris/0.001M EDTA; pH=8
HCl/EtOH:
175 mL EtOH abs.
2.5 mL HCl 37%
72.5 mL 증류수
암모늄수: 250 mL 증류수 + 10방울의 암모늄용액 (32%)
헤마톡실린: 160 mL Papanicolaou 용액 1a Harris 헤마톡실린 용액, Merck #1.092.530.500 + 80 mL 증류수 (사용전 여과)!
DAB 용액: 250 mL PBS/0.5% 트리톤 X-100중의 125 mg DAB, 사용전에 여과하고 25 μL의 30% H2O2를 첨가한다.
마우스 항-E-캐드헤린 (Abcam #ab1416; 1:100)
M.O.M. 키트 베이직: Vector #BMK-2202
실시예 3: 배양세포상의 E-캐드헤린 발현
인간 암 세포를 챔버 슬라이드에 도말하고 인간 E-캐드헤린에 대한 특이 항체로 염색하였다. 형광 염료 (Alexa 488, 그린 신호)로 표지된 이차 항체로 항체 결합을 검출하였다. 핵 DNA는 프로피듐 요오다이드 (PI, 레드 신호)로 염색하였다. E-캐드헤린은 세포 소분획에서 존재하지 않거나 발현되었다 (참조: TOV-21G 및 MiaPaca2 세포주). 대조적으로, BxPC-3 세포는 대부분 세포에서 E-캐드헤린의 강하게 막(membrane) 발현된 상피 표현형을 나타냈다. 이 실험의 결과는 도 1에 도시한다.
실시예 4: 배양된 종양세포에서 E-캐드헤린 발현을 측정하기 위한 면역형광 프로토콜
- 4개 챔버 조직-배양-처리된 유리 슬라이드에 선택한 세포주를 거의 컨플루언시(confluency)가 될때까지 성장시킨다.
- 조직 배양 배지를 흡인하고 슬라이드를 4℃에서 10분 동안 아세톤/메탄올 (1:1 v/v)로 고정한다.
- 슬라이드를 실온에서 5분 동안 건조시키고 사용시까지 -80℃에서 저장한다.
염색:
- 슬라이드를 실온에서 10분 동안 해동한다.
- PBS로 세척한다.
- 슬라이드를 실온에서 20분간 차단 혈청 10% 정상 염소 혈청에서 항온처리한다.
- 혈청을 흡인하고 세척하지 않는다.
- 실온에서 60분 동안 2% BSA/PBS중의 E-캐드헤린 항체 1:200으로 항온처리한다.
- PBS로 세척한다.
- 실온에서 45분 동안 이차 항체 Alexa 488 접합된 염소 항-마우스(PBS중의 1:1000)로 항온처리한다.
- PBS로 세척한다.
- 실온에서 2분 동안 PBS중의 0.5 μg/mL 프로피듐 요오다이드로 염색한다.
- PBS로 세척한다.
- Dako 형광 마운팅 매질로 커버슬립을 씌우고 현미경 검사시까지 4℃에서 암실에 저장한다.
완충액 및 시약:
시트레이트 완충액:
800 mL 증류수중의 21.01g 시트르산 수화물
2M NaOH로 pH를 6으로 조절한 다음 증류수를 첨가하여 1000 mL로 만든다.
마우스 항-인간 E-캐드헤린 (Abcam #ab1416)
정상 염소 혈청 (Vector Laboratories #S-1000)
Alexa 488 접합된 염소 항-마우스 Invitrogen #a-11017
DakoCytomation 형광 마운팅 매질 #S3023
프로피듐 요오다이드 Sigma #P4170
실시예 5: 인간 조직 시료에서의 E-캐드헤린 발현을 측정하기 위한 면역조직화학 프로토콜 (ABC 방법)
탈파라핀화:
- 슬라이드를 65℃에서 1시간 동안 가열한다.
- 슬라이드를 자일렌에 3 x 5분 동안 넣고, 이어서 abs. EtOH, 96% EtOH, 70% EtOH (각각 3 x 20초)에 넣는다.
- 증류수로 세척한다.
항원회수:
- 슬라이드를 시트레이트 완충액중에 20분 동안 넣고 121℃/1 bar로 가압멸균한다.
- 슬라이드를 실온에서 30분 동안 냉각시킨다.
- PBS로 세척한다.
염색:
- 슬라이드를 PBS중의 3% H2O2에서 5분 동안 항온처리한다.
- PBS로 세척한다.
- 차단 혈청에서 항온처리: PBS/2% BSA중의 10% 정상 말 혈청 (Vector Laboratories #S-2000)을 조직에 첨가하고 실온에서 30분간 항온처리한다.
- 혈청을 흡인하고 슬라이드를 세척하지 않는다.
- 마우스 항-E-캐드헤린 (Abcam #ab1416, PBS/2% BSA중의 1:200)을 조직에 첨가하고, 실온에서 60분간 항온처리한다.
- PBS로 세척한다.
- 바이오티닐화 말 항-마우스 IgG (Vector Laboratories #BA-2000, PBS중의 1:200)을 조직에 첨가하고 실온에서 30분간 항온처리한다.
- PBS로 세척한다.
- Vectastain ABC Standard 키트 (PBS중의 1:100, Vector #PK-4000)를 조직에 첨가하고, 실온에서 30분간 항온처리한다.
- PBS로 세척한다.
- 슬라이드를 PBS/0.5% 트리톤 X-100중에 4분간 넣는다.
- DAB 용액에서 염색한다.
- PBS로 세척한다.
- 슬라이드를 증류수에 1분간 넣는다.
대비염색:
- 헤마톡실린 용액중에서 1분간 염색시킨다.
- 유수에서 세척한다.
- 슬라이드를 HCl/EtOH에 1초 넣는다.
- 유수에서 세척한다.
- 슬라이드를 암모늄-수중에 20초 넣는다.
- 유수에서 세척한다.
- 절편을 70% EtOH, 96% EtOH, abs. EtOH (각각 3회/20초)에서 탈수한다.
- 자일렌에(x3) 1분, 2분, 2분 넣는다.
- Entellan으로 커버슬립을 씌운다.
완충액 및 시약:
시트레이트 완충액:
800 mL 증류수중의 21.01g 시트르산 수화물
2M NaOH로 pH를 6으로 조절한 다음 증류수를 첨가하여 1000 mL으로 만든다.
HCl/EtOH:
175 mL abs.EtOH
2.5 mL HCl 37%
72.5 mL 증류수
암모늄수: 250 mL 증류수 + 10방울의 암모늄용액 (32%)
헤마톡실린: 160 mL Papanicolaou 용액 1a Harris 헤마톡실린 용액, Merck #1.092.530.500 + 80 mL 증류수 (사용전 여과)!
DAB 용액: 250 mL PBS/0.5% 트리톤 X-100중의 125 mg DAB (Sigma #D5905), 사용전에 여과하고 25 μL의 30% H2O2를 첨가한다.
정상 말 혈청 (Vector Laboratories #S-2000)
마우스 항-인간 E-캐드헤린 (Abcam #ab1416)
바이오티닐화 말 항-마우스 IgG (Vector Laboratories #BA-2000)
Vectastain ABC Standard 키트 (PBS중의 1/100; Vector #PK-4000)
Entellan (Merck 1.07961.0100)
본 발명을 상기 설명 및 실시예에 특정적으로 기재된 바와 다르게 실시할 수 있음은 명백할 것이다. 상기 교시를 기초로 본 발명의 많은 변형 및 변화가 가능하며, 따라서 이들은 첨부된 청구범위에 속한다.
본 발명의 배경, 상세한 설명 및 실시예에 인용된 각 문헌(특허, 특허원, 논문, 초록, 실험 매뉴얼, 서적 또는 기타 교시내용을 포함)의 전체 교시내용은 본원에 참고로 포함된다.

Claims (16)

  1. 암 환자의 암 시료에서 E-캐드헤린(cadherin) 단백질의 발현을 검출하는 것을 포함하는, 단백질 티로신 키나제 2(PTK2) 억제제를 이용한 치료에 암 환자가 감수성인지의 여부를 결정하는 방법으로서, 0 내지 2의 E-캐드헤린 단백질 면역반응성 점수(IRS)가, 상기 암 환자가 PTK2 억제제를 이용한 치료에 감수성임을 가리키는 것인, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 암 환자가 포유동물인, 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 포유동물이 인간인, 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암이 암종인, 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암이 십이지장, 결장, 직장 및 항문의 암종; 췌장암종; 방광 암종; 폐 종양 (소세포폐암 (SCLC), 비소세포폐암 (NSCLC)(예를 들어, 편평상피세포암종, 선암종 (세엽세포암종, 유두암종, 기관지폐포암종) 및 대세포 기관지 암종 (거대세포암종, 투명세포암종)); 유방암(예를 들어, 유관암종, 소엽암종, 점액암종 또는 관상암종, 난소암 (난소 암종 - 점액성 또는 장액성 낭선암종, 자궁내막양암종 및 투명세포종양)); 두경부종양; 간세포암종 (간세포성의 암종(HCC)); 신장암 (예를 들어, 투명세포 신장세포암종, 유두신장세포암종, 혐색소성세포형 신장세포암종 및 집합관암종); 전립선암; 및 외음암으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암 환자의 암 시료에서의 E-캐드헤린 단백질 발현의 검출을 면역조직화학(IHC) 방법에 의해 실시하는, 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 IHC 방법이 E-캐드헤린에 대해 특이적인 일차 항체 및 상기 일차 항체와 특이적으로 반응하는 이차 항체를 사용하는, 방법.
  8. 0 내지 2의 E-캐드헤린 단백질 면역반응성 점수(IRS)로 확인된 암을 갖는 암 환자를 치료하는 방법으로서, 상기 암 환자에게 치료학적 유효량의 PTK2 억제제를 투여하는 것을 포함하는, 암 환자를 치료하는 방법.
  9. 0 내지 2의 E-캐드헤린 단백질 면역반응성 점수(IRS)로 확인된 암을 갖는 암 환자 치료용 약제학적 조성물을 제조하기 위한 PTK2 억제제의 용도.
  10. 0 내지 2의 E-캐드헤린 단백질 면역반응성 점수(IRS)로 확인된 암을 갖는 암 환자의 치료에 사용하기 위한 PTK2 억제제.
  11. 암 환자의 암 시료에서 E-캐드헤린 IRS 점수를 결정하는 것을 포함하는, PTK2 억제제를 이용한 치료에 대한 감수성에 관해 암 환자들을 분류하는 방법으로서, 0 내지 2(즉, 2, 1 또는 0)의 E-캐드헤린 단백질 면역반응성 점수(IRS)가, 상기 암 환자가 PTK2 억제제를 이용한 치료에 감수성임을 가리키는 것인, 방법.
  12. 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암/암 환자가 제1항 내지 7항 또는 11항중 어느 한 항에 정의된 방법에 의해 동정, 확인 및/또는 분류되는, 방법, 용도 및/또는 PTK2 억제제.
  13. 제12항에 있어서, 상기 암 환자가 상기 치료 전에 및/또는 치료 중에 동정, 확인 및/또는 분류되는, 방법, 용도 및/또는 PTK2 억제제.
  14. (a) 2, 1 또는 0의 E-캐드헤린 단백질 면역반응성 점수 (1이 바람직하고 0은 훨씬 더 바람직하다)로 확인된 암 세포 또는 암 세포주를 제공하는 단계,
    (b) (a)의 암 세포 또는 암 세포주를 PTK2 억제제와 접촉시키는 단계,
    (c) PTK2 억제제가 암 세포/암 세포주에 음성적으로 영향을 미치는지의 여부를 평가하는 단계를 포함하는,
    치료학적으로 유효한 PTK2 억제제를 선발(screening)하는 방법.
  15. PTK2 억제제 및
    (a) 상기 PTK2 억제제가 2, 1 또는 0의 E-캐드헤린 단백질 면역반응성 점수 (1이 바람직하고 0은 훨씬 더 바람직하다)로 확인된 암을 앓고 있는 환자의 치료에 사용된다는 것을 가리키는 지침서 및/또는 인쇄물; 및/또는
    (b) 상기 환자가 제11항에 기재된 방법에 의해 분류된다는 것을 가리키는 지침서 및/또는 인쇄물; 및/또는
    (c) 제1항 내지 제14항중 어느 한 항에 정의된 방법을 수행하는 수단을 포함하는, 약제학적 패키지.
  16. PTK2 억제제를 이용한 치료에 대한 암 환자의 감수성에 관해 암 환자를 분류하는데 사용하기 위한 E-캐드헤린 항체.
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