CN104974988A - 抗胰腺癌单克隆抗体及其应用 - Google Patents

抗胰腺癌单克隆抗体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了抗胰腺癌单克隆抗体及其应用。一株分泌抗人胰腺癌单克隆抗体的杂交瘤细胞株NM002-1，2011年8月31日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：C201173。杂交瘤细胞株NM002-1分泌的抗人胰腺癌的单克隆抗体NJ002-1。本发明单抗NJ002-1特异性抗原在胰腺癌组织中的表达高于胰腺良性疾病组织；在低分化患者该抗原的阳性表达率高于高分化患者。且单克隆抗体NJ002‐1能够有效抑制胰腺癌细胞SW1990在软琼脂中的克隆形成，单抗NJ002‐1在裸鼠体内能显著抑制人胰腺癌移植瘤的生长。可见单克隆抗体NJ002‐1有望成为治疗胰腺癌的药物或制备成检测胰腺癌的诊断试剂。

Description

抗胰腺癌单克隆抗体及其应用
技术领域
本发明属于医学诊断领域，涉及抗胰腺癌单克隆抗体及其应用。
背景技术
胰腺癌是恶性程度高、发展快和预后差的肿瘤，约占全身各种恶性肿瘤的1％-4％，占消化道恶性肿瘤的8％-10％。由于其发病隐匿，临床症状不典型，造成其早期诊断困难，多数患者就诊时已属中晚期。胰腺组织解剖位置较深，周围毗邻腹腔重要脏器及大血管，侵袭能力强，多数患者失去根治性手术的机会。该肿瘤对放疗和化疗不敏感，容易出现远处转移，并且局部复发早，综合治疗效果差，导致五年生存率不足5％。
糖链抗原19-9(CA19-9)是唾液酸化的乳-N-岩藻戊糖Ⅱ，属于唾液酸化的Lewis a血型抗原，由Koprowski等在1979年通过免疫小鼠获得。它在胰腺癌血清中的阳性率可达70％-85％，目前仍然是临床最常用的血清肿瘤标志物。Ni等报道，CA19-9诊断胰腺癌的敏感性能达80％，其特异性只有43％。尤其在一些良性疾病中(如胆道系统梗阻，胰腺炎和肝硬化等)也可出现CA19-9的升高，其特异性不高给临床工作者带来不少困惑。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供抗胰腺癌单克隆抗体。
本发明的另一目的是提供分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞。
本发明的又一目的是提供该单克隆抗体及其特异性抗原的应用。
本发明的目的可通过以下技术方案实现：
一株分泌抗人胰腺癌单克隆抗体的杂交瘤细胞株NM002-1，于2011年8月31日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：C201173。
由所述的保藏号为CCTCC NO：C201173的杂交瘤细胞株NM002-1分泌的抗人胰腺癌的单克隆抗体NJ002-1。
所述的单克隆抗体NJ002-1在制备胰腺癌诊断试剂中的应用。
所述的单克隆抗体NJ002-1优选在制备胰腺癌早期诊断试剂或辅助诊断试剂中的应用。
所述的诊断试剂优选包括免疫组织化学检测试剂或血清免疫检测试剂。
所述的血清免疫检测试剂进一步优选酶联免疫吸附检测试剂。
所述的单克隆抗体NJ002-1在制备胰腺癌预后诊断试剂中的应用；。
所述的单克隆抗体NJ002-1的特异性抗原作为检测靶标在制备胰腺癌诊断或预后试剂中的应用。
所述的单克隆抗体NJ002-1在制备治疗胰腺癌的药物中的应用。
所述的单克隆抗体NJ002-1的特异性抗原作为靶点在制备治疗胰腺癌的药物中的应用。
有益效果：
本发明以人胰腺癌细胞系SW1990为免疫原，用杂交瘤技术，筛选到一株能够稳定分泌抗人胰腺癌单克隆抗体的杂交瘤细胞株NM002-1(CCTCC NO：C201173)。该杂交瘤(CCTCCNO：C201173)所分泌的单抗NJ002-1产量多、效价高，对胰腺癌细胞系有特异性反应，与正常胰腺细胞、健康人PBMC及其他一些常见的肿瘤细胞系(肺癌、肝癌、乳腺癌及结肠癌)无反应或低反应性。
免疫组织化学结果显示，NJ002-1特异性抗原在胰腺癌组织中的表达高于胰腺良性疾病组织(76.7％vs.17.6％，p<0.001)。进一步分析发现：在低分化患者该抗原的阳性表达率高于高分化患者(82.4％vs.62.2％，p＝0.022)；且在肿瘤浸润程度深，存在淋巴转移的患者中该抗原的阳性表达率分别高于浸润程度低，无淋巴转移者(83.0％vs.60.0％，p＝0.010；91.2％vs.63.9％，p<0.001)；差异有统计学意义。生存分析显示，该抗原表达阳性的患者的生存时间短于表达阴性的患者(p＝0.021)。
双抗体夹心ELISA法结果显示，胰腺癌患者血清中该抗原的表达较健康体检者高(p<0.05)。血清中NJ002-1特异性抗原的ELISA检测对胰腺癌患者诊断的敏感性和特异性分别为50.6％和90.0％。NJ002-1特异性抗原的表达与胰腺癌的分化程度、浸润深度、淋巴结转移及预后密切相关；同时，在胰腺癌患者血清中该抗原的阳性检出率及特异性均较高。
此外，85例胰腺癌患者血清NJ002-1特异性抗原的检出率虽低于CA19-9，但两者联合检测的阳性率86.8％(79/85)明显高于CA19-9单项的阳性率75.8％(69/85)，差异有统计学意义(χ2＝5.221,P＜0.05)，且二者联合检测，可以克服CA19-9特异性较差的缺陷，可见NJ002-1有望作为胰腺癌辅助诊断试剂，进一步提高胰腺癌检测的敏感性和特异性。
综上所述，NJ002-1的特异性抗原有望成为诊断胰腺癌和预测患者预后的新的肿瘤标志物，其单克隆抗体NJ002-1在胰腺癌诊断制剂中应用。
此外，单克隆抗体NJ002-1能够有效抑制胰腺癌细胞SW1990在软琼脂中的克隆形成，并且其抑制程度与抗体的作用浓度呈正相关。单抗NJ002-1在裸鼠体内能显著抑制人胰腺癌移植瘤的生长，并且其抑制程度与抗体的作用浓度呈正相关。表明单克隆抗体NJ002-1有望成为治疗胰腺癌的药物。
附图说明
图1胰腺癌及胰腺良性疾病的NJ002-1特异性抗原的免疫组化结果(×200)
其中A图为胰腺良性疾病-，B-D图为胰腺癌+，++，+++。
图2胰腺癌患者的生存曲线
图3胰腺腺癌患者血清中NJ002-1特异性抗原的ROC曲线
注：曲线下面积为0.831(标准误为0.041，,9％置信区间为0.751-0.912)。
图4SW1990在软琼脂上形成的克隆(×100)
A.对照组 B.200μg/ml Ab C.400μg/ml Ab D.800μg/ml Ab
图5单抗NJ002-1抑制SW1990移植瘤的生长
A图肿瘤生长曲线，B图平均肿瘤重量，C图各组切除肿瘤。
生物材料保藏信息
杂交瘤细胞株NM002-1于2011年8月31日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉，武汉大学，保藏号为CCTCC NO：C201173。
具体实施方式
实施例1杂交瘤的制备
1.1动物免疫取6～8周雌性BALB/c小鼠，每只用2×106SW1990细胞/次腹腔注射免疫4次，每次间隔3周。每次免疫前均进行小鼠内眦采血，间接细胞ELISA法检测小鼠血清抗体效价，待免疫小鼠血清抗体滴度达到最大并不再升高时取鼠脾细胞进行融合，融合前3d加强免疫1次。
1.2间接细胞ELISA试验于96孔板上接种2×105/孔的SW1990细胞，至细胞生长融合达80％，95％乙醇固定，PBS洗3次，0.2％Triton-X-100通透20min，再用50g/L BSA 37℃封闭2h，依次加入不同稀释度的免疫小鼠血清100μL，37℃温育1h，再经PBS洗3次后，加入1：1000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG 100μL，37℃温育45min，经PBS洗涤后，加入TMB显色液，37℃温育10min后终止反应，用酶标仪测定450nm时吸光度(A)值，以未免疫小鼠血清(1:1000)作为阴性对照。
1.3细胞融合取免疫小鼠脾脏研磨制成细胞悬液，与处于对数生长期的骨髓瘤细胞SP2/0进行融合(姚晓玲,柳晓燕,吴强,等.人肺癌相关单克隆抗体的制备及其抗原的纯化[J].中国免疫学杂志,2006,22(12):1140-1145.)，首次融合960孔，融合1周后出现细胞克隆，有800孔生长杂交瘤细胞，融合率约为83％。按照1.2中的方法进行间接细胞ELISA试验筛选阳性杂交瘤细胞(将1.2间接细胞ELISA试验中的免疫小鼠血清替换为杂交瘤细胞培养上清)，进行转种和4次有限稀释法亚克隆，获得稳定分泌抗SW1990单抗且阳性最强的2株杂交瘤细胞株NM002-1及NM002-2。
实施例2单抗腹水的制备及纯化
取8～10周龄雌性BALB/c小鼠腹腔注射0.5mL石蜡油，10d后分别腹腔注射生长良好的杂交瘤细胞NM002-1及NM002-2约1×106/只，1～2周后抽吸腹水，37℃1h后，4℃过夜，次日分别将腹水离心，经Protein G亲和层析柱纯化，得到纯化的单克隆抗体NJ002-1及NJ002-2。
实施例3单抗的鉴定
3.1单抗Ig亚类的鉴定：纯化单抗用PBS 1:10000稀释，按照测定试剂盒说明书操作。单抗NJ002-1及NJ002-2的亚类均为IgG，轻链为κ链。
3.2单抗效价的测定：分别将纯化的单抗NJ002-1及NJ002-2用PBS倍比稀释，分别取100μL加入包被有SW1990细胞的96孔板中，用间接细胞ELISA法测定A450值，能与包被细胞发生免疫反应的单抗最大稀释度即为其效价。单克隆抗体NJ002-1效价为8×106，单克隆抗体NJ002-2效价为4×106。将杂交瘤细胞株NM002-1于2011年8月31日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为武汉，武汉大学，保藏号为CCTCC NO：C201173。
3.3染色体鉴定：将对数生长的杂交瘤细胞NM002-1秋水仙碱处理8h,再收集细胞，经离心甩片在玻片上,用0.075mol/L KCl低渗处理,用甲醇冰醋酸固定液固定,经10％Giemsa染色10min,镜下检测染色体。杂交瘤细胞的染色体数目范围为100～106条，因为小鼠细胞的染色体数目为40条，而SP2/0细胞染色体数目平均为62～68条，证明杂交瘤细胞中的染色体来自免疫小鼠的脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞SP2/0，均属杂交瘤细胞染色体核型。
3.4单抗特异性的鉴定：用纯化的单抗NJ002-1与上述8种细胞系及健康人PBMC分别做间接细胞ELISA分析，观察有无阳性反应。结果显示，单抗NJ002-1仅对胰腺癌细胞(SW1990、Panc-1和BxPC-3)抗原具有较强反应，对其他肿瘤细胞(SPCA1、HepG2、Colo 205、ZR-75-30)抗原、人正常胰腺细胞(HPDE6c7)抗原及健康人PBMC均无反应。
实施例4
1.标本来源
实验标本的组织来源于南京医科大学第一附属医院2009年-2014年行胰腺切除的手术患者(胰腺癌120例，胰腺良性疾病17例)。所有患者在手术前均未接受过放疗或化疗，且经病理检查确诊。查找相应的肿瘤组织石蜡标本，所有标本均经10％福尔马林固定和石蜡包埋，由南京医科大学第一附属医院病理科存档并提供。在120例胰腺癌患者中，男性64例，女性56例，中位年龄为62岁。按照2014版AJCC癌症分期手册的标准进行TNM分期，I期26例，Ⅱ期80例，Ⅲ期5例，Ⅳ期7例，2例无分期资料；T1、T2共30例，T3、T4共88例，2例无浸润深度资料；无淋巴结转移者61例，有淋巴结转移者57例。按照2004年WHO胰腺癌分类标准进行分化程度评估，高分化癌37例，低分化癌68例，无分化程度资料者15例。17例胰腺良性疾病包括12例胰腺浆液性囊腺瘤、2例胰腺假性囊肿和3例胰腺炎。详细资料见表1。
表1胰腺癌病人基本资料
2.免疫组织化学染色
免疫组织化学染色具体流程参考韩月,王芳,徐婷,等.NJ001-1特异性抗原在肺腺癌中的表达及临床意义[J].中华检验医学杂志.2013,36(10):895-898。一抗为单克隆抗体NJ002-1，以1％的PBS缓冲液代替一抗作为阴性对照，确诊胰腺癌切片作为阳性对照。快捷型酶标羊抗鼠/兔IgG聚合物购自福州迈新生物技术开发公司；DAB显色试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。
结果判定：根据肿瘤细胞内棕黄色阳性反应百分率和染色程度进行综合判定分析。阳性百分率为在高倍视野下，每200个肿瘤细胞中阳性细胞所占百分比，随机做5次。阳性率计分标准：0分(阳性百分率0％)，1分(1～33％)，2分(34-66％)，3分(67～100％)。染色程度记分标准：无染色，浅黄色，棕黄色，棕褐色分别计为0，1，2，3分。两种方法得分的乘积为0，1，2，3，4，6，9。将得分结果分为-(0)，+(1，2)，++(3，4)，+++(6，9)四个等级，其中++，+++判定为阳性表达。
3.随访
收集的120例胰腺癌病例通过电话或门诊进行随访，共获得72例患者完整随访资料，随访率60％。生存时间计算以月为单位，以手术日期作为观察起点，从手术日期到由于胰腺癌复发或转移而死亡的日期或随访截止日期为止，非肿瘤死亡病例和完全失访病例按统计学要求以截尾数据处理。
4.统计学方法
应用SPSS16.0统计软件进行数据分析。计数资料采用χ2检验或者Fisher确切概率法。生存分析采用Kaplan-Meier曲线法，两组生存期比较采用log-rank检验。采用逐步引入-剔除法进行多因素Cox比例风险模型分析。p<0.05为差异有统计学意义。
5.结果
5.1NJ002-1特异性抗原在胰腺癌及胰腺良性疾病组织中的表达
本实验组织标本包括120例胰腺癌及17例胰腺良性疾病组织，所有免疫组化检测结果见表2-3。
表2胰腺癌患者石蜡组织切片NJ002-1特异性抗原免疫组化结果一览表
表3胰腺良性疾病患者石蜡组织切片NJ002-1特异性抗原免疫组化结果一览表
NJ002-1特异性抗原的表达以细胞浆为主，与之前的研究结果一致。在绝大部分胰腺良性疾病组织中未见该抗原表达，少量组织呈微弱表达；胰腺癌组织中可见大部分出现较多棕黄色或棕褐色颗粒，显示该抗原的表达明显增强(图1)。
NJ002-1特异性抗原在120例胰腺癌及17例胰腺良性疾病中的阳性率分别为76.7％和17.6％，差异有统计学意义(P<0.001，表4)。
表4NJ002-1特异性抗原在胰腺癌和胰腺良性疾病中的表达
5.2NJ002-1特异性抗原的表达与胰腺癌临床病理特征的关系
NJ002-1特异性抗原表达阳性率在肿瘤低分化及高分化组中分别为82.4％vs.62.2％；浸润深度为T1/T2以及T3/T4组分别为60.0％vs.83.0％；无淋巴结转移及有淋巴结转移组阳性率分别为63.9％vs.91.2％，经χ2检验均存在统计学差异。该抗原的表达情况与胰腺癌患者的年龄、性别、肿瘤直径无明显关系。在12例III/IV期的胰腺癌患者中，该抗原表达的阳性率为100％，但与I/II期相比，无统计学差异(表5)。
表5NJ002-1特异性抗原的表达与胰腺癌患者临床病理特征之间的关系
*采用Fisher确切概率法，其余用χ2检验。
5.3NJ002-1特异性抗原的表达与胰腺癌患者预后的关系
随访至2015年5月31号，随访终点为患者死亡，共有72例资料完整的病例纳入我们的研究。中位随访时间为12.1(3.1-36)个月。NJ002-1特异性抗原表达阴性组有16例，其中3例死亡；阳性组有56例，其中有31例死亡。阳性组(n＝56)的中位生存时间为13.2月，阴性组(n＝16)的平均生存时间为14.6个月。NJ002-1特异性抗原阳性表达组及阴性表达组之间的生存时间有显著差异，即该抗原表达程度越高，生存时间越短(p＝0.021，图2)。
上述实验结果表明：NJ002-1特异性抗原在大部分胰腺癌组织中表达水平较高，而在胰腺良性疾病组织中表达较弱，提示该抗原可能会影响胰腺癌的进展。进一步的分析证实，NJ002-1特异性抗原的表达与胰腺癌的分化程度、浸润深度及淋巴转移有着密切的关系。可见，该抗原的高表达可能提示肿瘤侵袭性与转移能力较强。因此，单克隆抗体NJ002-1可以用于制备免疫组化试剂，用于胰腺癌的诊断、预后以及预示肿瘤侵袭性与转移。
实施例5
1.血样:收集2014年6月至2015年5月南京医科大学第一附属医院收治的胰腺肿瘤患者血清标本107例，包括85例胰腺癌、22例胰腺良性肿瘤，其中22例胰腺良性肿瘤包括4例胰腺(假性)囊肿和18例浆液性囊性肿瘤。所有患者均行根治性手术且经组织病理学确诊，并且所有患者在手术前均未接受过放疗或化疗。同时收集40例健康体检者血清标本。临床病理参数见表6。
表6不同类型胰腺肿瘤和对照组的临床病理参数
2.方法
2.1标本采集及处理:用血清分离胶真空采血管采集胰腺癌患者术前及术后第10天静脉血2ml，室温静置20min后，2100x g离心10min，转移上层血清，再于4℃，16000x g离心10min，吸取上层无细胞血清分装每管130μl，置-70℃保存。
2.2细胞培养：SPC-A1细胞生长于含10％胎牛血清、100U/mL青霉素及100ng/mL链霉素的RPMI 1640培养液中，37℃，5％C02恒温培养箱中培养。
2.3双抗体夹心ELISA方法：以抗SPC-A1兔多克隆抗体(1.782μg/ml)包被96孔酶标板，100μl每孔，4℃过夜，洗板3次；3％BSA每孔300μl，4℃封闭过夜，洗板3次；加人待检血清50μl每孔，37℃孵育2h，洗板6次；加NJ002-1一抗(5mg/ml，l:1000稀释)，每孔100μl(空白孔除外)，37℃孵育1h，洗板6次；加山羊抗小鼠IgG/辣根酶标记(1:2000)，每孔100μl(空白孔除外)，37℃孵育30min，洗板6次；每孔加人新鲜配制的底物显色液100μl，室温避光显色10min，加50μl终止液终止反应。用酶联仪读取吸光度(A)值，读数波长450nm。阳性和阴性对照分别为SPC-A1细胞裂解液、胎牛血清，空白对照为不加任何成分。以本实验室前期检测的300份健康体检者的血清样本结果的P/N值的x±2s即2.1为判断界值(cut-off值)。
2.4电化学发光法检测CA19-9:通过罗氏Cobas e 602电化学发光免疫分析仪对样本进行血清CA19-9的同步检测，试剂、定标液、质控品均由厂家原装提供。CA19-9以39U/mL为cut-off值。
3.统计学处理
采用SPSS19.0软件对本次研究的数据进行分析。各组间及手术前后阳性率比较采用χ2检验或Fisher确切概率法，P<0.05为差异有统计学意义。
4.结果
4.1NJ002-1特异性抗原在胰腺癌患者血清中的表达
NJ002-1特异性抗原在胰腺癌中的阳性率为50.6％(43/85),明显高于胰腺良性肿瘤组以及健康体检组(50.6％vs 18.2％，χ2＝7.451，P＜0.05；50.6％vs,10.0％，χ2＝10.098，P＜0.05)。同时，将85例胰腺癌患者和40例健康体检者检测结果进行ROC曲线分析,如图3，对应曲线下面积AUC＝0.831(标准误0.041；95％可信区间0.751-O.912)。cut-off值为2.1时，对应的灵敏度为50.6％，特异性为90.0％。
4.2NJ002-1特异性抗原在手术前后的应用
85例胰腺癌患者均进行胰腺根治性手术，包括28例胰(头)十二指肠切除术、28例胰体尾切除术、24例保留幽门胰十二指肠切除术和5例联合血管切除的胰十二指肠切除术。根治性手术前、后血清NJ002-1特异性抗原表达阳性率分别为50.6％(43/85)和23.5％(20/85)，差异有统计学意义(χ2＝8.938,P＜0.05)。
4.3胰腺肿瘤常用肿瘤标志物与本方法的比较
85例胰腺癌患者血清NJ002-1特异性抗原的检出率虽低于CA19-9，但两者联合检测的阳性率86.8％(79/85)明显高于CA19-9单项的阳性率75.8％(69/85)，差异有统计学意义(χ2＝5.221,P＜0.05)，见表7。
表785例胰腺腺癌NJ002-1特异性抗原及CA19-9的单项和联合检测结果阳性[n(％)]
上述实验结果表明：NJ002-1特异性抗原不仅在胰腺癌组织中高表达，而且在胰腺癌患者血清中的表达程度高于健康对照，提示富含该抗原的肿瘤细胞可能移行至血管内进入到血液循环中，为该抗原成为胰腺癌诊断的分子靶标提供有力的依据。ROC曲线分析表明该抗原在诊断胰腺癌方面有一定的实用价值，且敏感性和特异性较理想。通过双抗体夹心ELISA法检测血清中NJ002-1特异性抗原，可以为临床诊断胰腺癌提供有力的证据，NJ002-1特异性抗原可以作为新的胰腺癌的血清肿瘤标志物，有望用于该疾病的早期辅助诊断。
实施例6软琼脂克隆形成实验
1、方法
生理盐水制备3％琼脂糖溶液，高压蒸汽灭菌。在6孔细胞培养板中制备双层凝胶琼脂。底层为支持层，将含10％FBS的L 15完全培养基与3％琼脂糖按5：1比例混合，配制成含0.5％琼脂糖的培养基，2ml/孔，加入6孔板中，室温冷却凝固。收集处于对数生长期的胰腺癌SW1990细胞，用完全培养基制成单细胞悬液，37℃保温，取适量的单细胞悬液与3％琼脂糖溶液、不同浓度单克隆抗体NJ002-1溶液充分混合，2ml/孔，铺板制成含0.3％琼脂糖的上层琼脂，每孔含有2×104个细胞，抗体终浓度分别为0、200μg/ml、400μg/ml、800μg/ml、1600μg/ml和2000μg/ml，每剂量设3个平行孔。常温下待琼脂凝固后，将培养板移入37℃、5％CO2培养箱中培养2周。倒置显微镜下计数，将≥50个细胞的集落判定为一个克隆，计算克隆形成率、抑制率。克隆形成率＝(克隆数/接种细胞数)×100％；抑制率＝(1‐实验组克隆形成率/对照组克隆形成率)×100％。
2、结果
在双层琼脂培养基中，对照组SW1990细胞生长旺盛，一般7‐10天可形成细胞集落，2周后观察，集落数量多且明显增大。单抗NJ002-1作用后的细胞形成集落显著减少，且集落远小于对照组，部分细胞不能在软琼脂中生长形成集落，呈单个散在的细胞(图4)。
软琼脂克隆形成实验表明：单克隆抗体NJ002-1能够有效抑制胰腺癌细胞SW1990在软琼脂中的克隆形成，并且其抑制程度与抗体的作用浓度呈正相关。200μg/ml单抗作用2周后克隆抑制率为29.79％，400μg/ml单抗组抑制率达65.96％，而800μg/ml或更高浓度的单抗组几乎无克隆生长(表8)。统计分析发现：200μg/ml和400μg/ml单抗组克隆数与对照组相比显著减少(P<0.001，P<0.001)，200μg/ml单抗组和400μg/ml单抗组克隆数相比也有显著差异(P<0.001)。
表8单抗NJ002-1对SW1990软琼脂克隆形成的影响(n＝3)
注：*P<0.001，与对照组比；^P<0.001，与200μg/ml单抗组比
实施例7裸鼠移植瘤模型实验
1、方法：
25只裸鼠随机分为5组，设为生理盐水组、单抗组(200μg、400μg、800μg 3组)和单抗对照组，每组5只。生理盐水组和单抗组裸鼠经右侧腋部皮下接种SW1990细胞悬液，2×106个细胞/只。单抗组接种当天开始腹腔注射200μl不同浓度的单抗溶液，分别含200μg、400μg、800μg单抗，前5天每天注射1次，之后每隔3天注射1次，连续2周(累计注射9次)。生理盐水组以等体积的生理盐水代替单抗溶液，注射时间和途径相同。单抗对照组5只裸鼠仅在腹腔注射200μl单抗溶液，800μg单抗/只，抗体的注射时间同单抗组。每日观察小鼠活动、精神状况、进食情况及肿块出现时间等并记录。自皮下结节出现起，游标卡尺测量移植瘤长径(a)及短径(b)，移植瘤体积V＝ab2/2。自接种肿瘤细胞3周后，裸鼠颈椎脱臼处死，解剖分离肿瘤并称取瘤重、计算抑瘤率。抑瘤率＝(1–单抗组平均瘤重/生理盐水组平均瘤重)×100％。
2、结果：
接种细胞后第9天，生理盐水组种植区最先出现肉眼可见的小结节，之后2天单抗组出现小结节，成瘤率达100％。从第13天起测量肿瘤体积，观察至第21天。各组小鼠平均肿瘤体积表现为：随着时间延长而增长，第17天起400μg、800μg单抗组与生理盐水组相比，肿瘤体积的增长速度即有明显延缓，至观察结束时，差异持续存在(P<0.001，P<0.001，图5A)。接种细胞3周后处死小鼠，分离肿瘤并称量肿瘤重量。生理盐水组、200μg、400μg、800μg单抗组平均瘤重分别为(1.80±0.35)g，(1.57±0.32)g，(1.23±0.25)g和(1.16±0.21)g。单因素方差分析进行组间比较，四组小鼠肿瘤重量具有统计学差异(F＝5.410,P＝0.009)；两两比较发现400μg、800μg单抗组平均瘤重显著低于生理盐水组(P＝0.018,P＝0.008)；200μg单抗组与800μg单抗组间也存在显著差异(P＝0.044)。200μg、400μg、800μg单抗组抑瘤率由低至高分别为12.78％、31.67％和35.56％(图5B、C)。800μg单抗对照组小鼠观察至实验结束，全部存活，生活状态正常，食欲旺盛，行动自如，始终未见异常改变。
结果表明：单抗NJ002-1在体内能显著抑制人胰腺癌移植瘤的生长。

Claims (10)

1.一株分泌抗人胰腺癌单克隆抗体的杂交瘤细胞株NM002-1，于2011年8月31日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：C201173。
2.由权利要求1所述的保藏号为CCTCC NO：C201173的杂交瘤细胞株NM002-1分泌的抗人胰腺癌的单克隆抗体NJ002-1。
3.权利要求2所述的单克隆抗体NJ002-1在制备胰腺癌诊断试剂中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于权利要求2所述的单克隆抗体NJ002-1在制备胰腺癌早期诊断试剂或辅助诊断试剂中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于所述的诊断试剂包括免疫组织化学检测试剂或血清免疫检测试剂。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于所述的血清免疫检测试剂为酶联免疫吸附检测试剂。
7.权利要求2所述的单克隆抗体NJ002-1在制备胰腺癌预后诊断试剂中的应用；。
8.权利要求2所述的单克隆抗体NJ002-1的特异性抗原作为检测靶标在制备胰腺癌诊断或预后试剂中的应用。
9.权利要求2所述的单克隆抗体NJ002-1在制备治疗胰腺癌的药物中的应用。
10.权利要求2所述的单克隆抗体NJ002-1的特异性抗原作为靶点在制备治疗胰腺癌的药物中的应用。
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