CN101514230B - Ard1的单克隆抗体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及ARD1的单克隆抗体及其应用。具体地说，本发明涉及由保藏号为CGMCC NO.2354或CGMCC NO.2355的杂交瘤细胞分泌的针对ARD1蛋白质的单克隆抗体以及分泌该抗体的杂交瘤细胞系。本发明的单克隆抗体具有特异性强、灵敏度高的特点，能够用于免疫组化、免疫细胞化学、免疫沉淀、免疫印迹和酶联免疫吸附实验等免疫学检测，从而可检测结肠癌、胃癌、食管癌等肿瘤及多种肿瘤细胞系的ARD1表达水平，进而用于对上述多种肿瘤的辅助诊断和相关的实验研究，以及指导临床治疗。

Description

ARD1的单克隆抗体及其应用

技术领域

本发明涉及免疫学领域，具体地涉及针对ARD1的单克隆抗体及其制备方法、分泌该抗体的杂交瘤细胞系、所述单克隆抗体或其生物活性片段的应用。本发明还涉及利用所述单克隆抗体检测样品ARD1水平的试剂盒以及抗肿瘤药物。

背景技术

恶性肿瘤的发病率近年来在全球范围内继续呈上升之势。由于恶性肿瘤的发病大多较为隐匿，早期没有明显症状，病人就诊时往往已经到了晚期，并且许多在临床传统病理及TNM分期表现相近的病人，其预后也差异很大，反映出恶性肿瘤发生、发展的复杂性。目前尚缺乏能用于诊断或预后判断的理想肿瘤标志物。如几十年来作为消化道肿瘤的标志物CEA，在一些非肿瘤性疾病如胃炎、肝硬化、溃疡性结肠炎中也可有升高，其特异性并不理想。因此，寻找与恶性肿瘤发生、发展相关的肿瘤标志物和(或)肿瘤抗原，对恶性肿瘤的临床诊断、监视病情发展及判断预后均有重要意义，同时对肿瘤发生的分子机制也有重要意义。

蛋白质乙酰化和去乙酰化是细胞内重要的转录后修饰过程，这一过程调节细胞凋亡、细胞周期和肿瘤形成(Fu M，Wang C，Wang J，ZafonteB T，Lisanti MP，Pestell RG.Acetylation in hormone signaling and thecell cycle.Cytokine Growth Factor Rev 2002；13：259-76)。蛋白氨基乙酰化作为一种重要的修饰过程影响着多种生物学行为。蛋白去乙酰酶抑制剂可提高组蛋白的乙酰化水平，初步临床研究提示这类抑制剂有望成为潜在的抗肿瘤药物。

Arrest defective 1 protein(阻滞缺陷蛋白1，Ard1p)最初是在酵母中发现的，它参与酵母细胞的细胞周期、生长、孢子形成等过程(WhitewayM.Szostak JW.The ARD1  gene of yeast functions in the switchbetween the mitotic cell cycle and alternative devel

研究发现ARD1可与缺氧诱导因子1α(hypoxia-inducible factor 1α，HIF-1α)相互作用，在体外可乙酰化HIF-1α532位赖氨酸，从而对其起到负调控作用。同时，小鼠ARD1可变剪切体(mARD1²²⁵)对HIF-1α的乙酰化在HIF-1α降解过程中发挥重要作用(Jeong JW，Bae MK，Ahn MY，et al.Regulation and destabilization of HIF-1alpha by ARD1-mediatedacetylation.Cell 2002；111：709-20.)。然而，在人类细胞中没有观察到类似的ARD1对HIF-1α的调节作用。

尽管哺乳动物细胞中ARD1的生物学功能尚未完全阐明，研究结果初步提示ARD1与细胞增殖和生长直接相关。Lim等人研究发现ARD1通过激活β-catenin参与细胞增殖，而β-catenin可以进一步诱导参与细胞周期调控的cyclin D1(Lim JH，Park JW，Chun YS.Human arrestdefective 1 acetylates and activates beta-catenin，promoting lungcancer cell proliferation.Cancer Res 2006；66：10677-82.)。此外，ARD1干扰RNA可抑制细胞增殖，并使细胞周期阻滞于G1期，这一过程调节了参与细胞增殖的多种基因。此外，干扰NATH和ARD1的表达，可诱导细胞凋亡，并促使细胞对柔红霉素诱导的细胞凋亡更加敏感(Arnesen T，Gromyko D，Pendino F，Ryningen A，Varhaug JE，Lillehaug JR.Induction of apoptosis in human cells by RNAi-mediated knockdown ofhARD1 and NATH，components of the proteinN-alpha-acetyltransferase complex.Oncogene 2006；25：4350-60.)。越来越多的研究表明，ARD1是一个参与细胞功能调节，和肿瘤发生发展的重要分子。它也有望成为肿瘤治疗的一个新靶点。

通过应用抗ARD1兔多抗、以及Northern blot的研究结果表明，ARD1稳定表达于多种组织、肿瘤细胞系和内皮细胞(Bilton R，Mazure N，Trottier E，et al.Arrest-defective-1 protein，an acetyltransferase，doesnot alter stability of hypoxia-inducible factor(HIF)-1alpha and is notinduced by hypoxia or HIF.J Biol Chem 2005；280：31132-40.)。目前对肿瘤组织ARD1蛋白水平检测的相关报道很少。最近的研究表明，ARD1相互作用蛋白NATH在乳头状甲状腺癌和胃癌中高表达。因此，对ARD1表达的检测有望成为肿瘤诊断和评估预后的重要临床指标。

但目前国内外关于ARD1的研究均是利用ARD1的多克隆抗体进行，未见ARD1单克隆抗体的报道。多克隆抗体的特异性差，用于免疫组化时显色背景高，质量不易控制，难以在临床应用推广。而用PCR方法检测ARD1的基因表达又存在易被污染产生假阳性的缺点，同时不能准确反映蛋白质的实际水平，从而极大地限制了ARD1检测在临床中的应用。单克隆抗体具有特异性强、敏感性高的优点，在临床检测中应用广泛，可以在免疫组化、ELISA等多种方法中使用。Abnova公司(中国台湾)提供一种商品化抗ARD1单抗(M01；4B7-H4)，但其不能用于检测哺乳动物细胞中的ARD1、或在免疫组化中应用。

目前临床迫切需要能满足上述要求的ARD1单克隆抗体，以及能够分泌高效价上述单克隆抗体的杂交瘤细胞，以便有助于肿瘤的临床诊断、预后判断，并指导临床治疗。同时，单克隆抗体可作为ARD1生物学功能研究的重要工具，用于Western blot、免疫沉淀、免疫细胞化学等实验。

发明内容

本发明的一个目的是提供针对ARD1蛋白质的单克隆抗体或者来源于该抗体的能够特异性结合ARD1的生物活性片段。

本发明的一个目的是提供分泌针对ARD1蛋白质的单克隆抗体的杂交瘤细胞系。

本发明的另一目的是提供ARD1蛋白质的单克隆抗体的制备方法。

本发明的另一目的是提供一种检测ARD1蛋白质水平的试剂盒。

本发明的另一目的是提供一种抗肿瘤药物。

本发明的另一目的是提供本发明的单克隆抗体或其生物活性片段在体外检测样品中ARD1蛋白质表达水平中的应用。

本发明的另一目的是提供本发明的单克隆抗体或其生物活性片段在制备用于辅助诊断和/或监测肿瘤的试剂中的应用。

一方面，本发明提供一种针对ARD1蛋白质的单克隆抗体，或者来源于该抗体的能够特异性结合ARD1的生物活性片段，所述单克隆抗体由保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏号为CGMCC NO.2354或CGMCC NO.2355的杂交瘤细胞分泌。经鉴定，所述单克隆抗体的亚类分别是IgG2a、IgG1。此外，ELISA、Western bolt结果提示当加入抗体浓度相同时，单抗14D4与原核重组蛋白GST-ARD1的反应性较已有的ARD1单克隆抗体(单抗4B7-H4)强；Western Blot结果提示单抗4B7-H4不能检测真核细胞内源性的ARD1，或转染的外源性myc-ARD1；免疫沉淀实验提示，与单抗4B7-H4相比，单抗10C12与LoVo细胞中天然的ARD1蛋白有更强的相互作用；同时单抗14D4可用于免疫组化检测，而单抗4B7-H4则不能用于组化检测。所以本发明的单克隆抗体具有特异性强、灵敏度高的特点，能够用于免疫组化、免疫细胞化学、免疫沉淀、免疫印迹(蛋白质印迹，Western Blot)和酶联免疫吸附实验等免疫学的检测，从而可检测结肠癌、胃癌、食管癌等肿瘤及多种肿瘤细胞系的ARD1表达水平，进而用于对上述多种肿瘤的辅助诊断和相关的实验研究，以及指导临床治疗。本发明单克隆抗体可以在普通培养基中传代培养或者在液氮长时间保存。

另一方面，本发明还提供分泌针对ARD1蛋白质的单克隆抗体的杂交瘤细胞系其以保藏号CGMCC NO.2354或CGMCC NO.2355被保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所)。本发明的杂交瘤细胞系具有较强的分泌本发明的单克隆抗体的能力，能稳定、大量分泌本发明的单克隆抗体。从杂交瘤细胞收集本发明的单克隆抗体时，可以从杂交瘤细胞体外培养上清液中获得抗体，或者将杂交瘤细胞注入适宜的哺乳动物并从动物腹水中获取抗体。前一种方法适于获得高纯度的抗体，后一种方法适于大量获取抗体。通过上述方法获得的抗体，可以用常规方法纯化，例如盐析、凝胶过滤、亲合色谱层析等方法。

另一方面，本领域普通技术人员已知，可以直接采用ARD1蛋白质作为抗原，获得本发明的单克隆抗体。也可以将本发明ARD1蛋白质与已知的标签形成重组蛋白作为抗原，获得本发明的单克隆抗体。所述的标签选自，但不限于，组氨酸标签(His标签)、谷胱苷肽巯基转移酶标签(GST标签)、HA标签、HSV标签、Myc标签或VSV-G-标签等。在本发明的一个实施方式中，本发明通过原核表达获得纯化的GST-ARD1融合蛋白，并通过杂交瘤技术获得ARD1的单克隆抗体。因此，本发明还提供本发明单克隆抗体的制备方法，该方法包括：用融合蛋白GST-ARD1免疫小鼠，取小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞融合，筛选出能够分泌对ARD1有反应性、对谷胱苷肽巯基转移酶(GST)没有反应性的单克隆抗体的杂交瘤细胞，从杂交瘤上清液中或从注射杂交瘤细胞后的动物腹水中获取单克隆抗体。上述方法仅是示例性的，例如可以用同样的方法免疫其他哺乳动物，大鼠、兔子、豚鼠或仓鼠等。

在本发明的一个实施方式中，以ARD1基因(GenBank AccessionNo.NM_003491)的cDNA为模板，从起始密码子处设计正义引物，从终止密码子处设计反义引物，用PCR方法扩增ARD1基因的cDNA片段。将PCR扩增产物定向克隆到原核表达载体pGEX-5X-3上，构建原核重组质粒pGEX-5X-3-ARD1，并在大肠杆菌中表达。挑选单克隆阳性菌，大量诱导表达GST-ARD1蛋白并纯化。

参照Kohler和Milstein建立的B淋巴细胞杂交瘤技术(Kohler G，Milstein C，Continuous cultures of fused cells secreting antibody ofpredefined specificity.Nature.1975Aug 7；256(5517)：495-7.)，本发明用纯化的GST-ARD1蛋白免疫BALB/c小鼠。将免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合，制备杂交瘤细胞。用ELISA方法筛选阳性细胞克隆。本发明人经过多次试验，获得了多株阳性细胞克隆。对这些阳性克隆所分泌的单克隆抗体进行分析鉴定，发现一株杂交瘤细胞株，其分泌的ARD1单克隆抗体14D4在免疫组化试验中呈阳性。该杂交瘤细胞株已于2008年1月24日以保藏号CGMCC NO.2354被保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所)。在天然状态下，抗原决定簇的构象保持较好，抗原容易与抗体结合。因此，在ELISA、免疫沉淀、冰冻切片等抗原为天然状态的检测实验中，对单克隆抗体的要求相对不高。但在临床最常用的石蜡切片免疫组织(细胞)化学(简称免疫组化)检测中，组织经福尔马林固定、石蜡包埋以及酒精脱水等处理后，由于蛋白质变性而使抗原决定簇的空间构象被部分破坏，因此对单克隆抗体的特异性识别和结合能力要求高。同样的原因，在石蜡切片免疫组化中需要较高的抗体效价。而本发明的单克隆抗体14D4经实验验证，能很好地满足免疫组化试验要求。免疫组化是在保持组织和细胞原有形态和结构的基础上，用特定抗原的抗体与其反应，然后通过示踪的方法使抗原抗体反应得以显现的一项专门技术。由于该方法不仅能直观地显示某种特定抗原在受检的组织或细胞中是否存在，更重要的是能直观地显示抗原在组织或细胞中存在的部位以及相对含量。因此免疫组化在医学研究领域中得到广泛的应用。经鉴定，单克隆抗体14D4的亚类是IgG2a。

还发现一株杂交瘤细胞株，其分泌的ARD1单克隆抗体10C12可用于ELISA、免疫印迹、免疫沉淀等免疫学检测。该杂交瘤细胞株已于2008年1月24日以保藏号CGMCC NO.2355被保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所)。经鉴定，单克隆抗体10C12的亚类是IgG1。

另一方面，本发明提供一种检测ARD1蛋白质水平的试剂盒，其含有本发明的单克隆抗体。该试剂盒除了含有本发明的单克隆抗体外，还可进一步含有合适的试剂和/或缓冲液。本发明的单克隆抗体可以用任何已知的方法与检测信号结合，作为检测信号的标记物可以是放射性同位素、荧光化合物、生物素和酶等。所述酶包括，但不限于，辣根过氧化物酶(horseradish Peroxidase，HRP)、碱性磷酸酶(alkalinephosphatease，AP)、葡萄糖氧化酶、β-D-半乳糖苷酶和脲酶等，优选辣根过氧化物酶和/或碱性磷酸酶。本领域普通技术人员已知，针对不同的酶，可使用不同的底物，HRP作用的底物包括，但不限于，邻苯二胺(OPD)、四甲基联苯胺(TMB)、ABTS、二氨基联苯胺(diaminobenzidine，DAB)、等。碱性磷酸酶的底物一般采用对硝基苯磷酸酯(p-NPP)、碱性磷酸酶红(alkaline phosphatase-red，AP-Red，又称FastRed，快红)，AP也有发荧光底物(磷酸4-甲基伞酮)。本发明的试剂盒可用于检测结肠癌、胃癌、食管癌等肿瘤及多种肿瘤细胞系及血清中的ARD1表达水平，进而用于对上述多种肿瘤的辅助诊断和相关的实验研究以及指导临床治疗。

在本发明的一个具体实施方式中，本发明的试剂盒除了所述单克隆抗体外，还含有第二抗体、显色系统、或可被检测的荧光和/或放射标记，以及适宜的缓冲液。优选其中第二抗体上标记有生物素，并进一步含有结合辣根过氧化物酶和/或碱性磷酸酶的链霉亲和素，显色底物为邻苯二胺(OPD)和/或碱性磷酸酶红；或优选其中第二抗体上直接标有辣根过氧化物酶和/或碱性磷酸酶，显色底物为邻苯二胺和/或碱性磷酸酶红。标记的第二抗体，现已有商品出售，可以直接商购获得。

在本发明的一个具体实施方式中，本发明的试剂盒含有用纯化的ARD1多克隆抗体包被的微量滴定板、ARD1标准抗原、本发明单克隆抗体、标记有生物素的能够与ARD1单克隆抗体结合的第二抗体、辣根过氧化物酶和/或碱性磷酸酶标记的链霉亲和素、辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶的相应显色底物，以及适宜的缓冲液。上述ARD1多克隆抗体可以利用本领域已知技术获得，例如通过用ARD1蛋白质或其与标签的融合蛋白免疫动物，取血，分出抗血清并纯化制得。上述ARD1标准抗原可以利用本领域已知技术获得，例如利用聚合酶链式反应(PCR)方法。

在本发明的另一个具体实施方式中，本发明的试剂盒含有用纯化的ARD1多克隆抗体包被的微量滴定板、ARD1标准抗原、本发明单克隆抗体、直接标记有辣根过氧化物酶或的能够与ARD1单克隆抗体结合的第二抗体、辣根过氧化物酶和/或碱碱性磷酸酶性磷酸酶的相应显色底物，以及适宜的缓冲液。

在本发明的另一个具体实施方式中，本发明的试剂盒含有本发明单克隆抗体、直接标记有辣根过氧化物酶或的能够与ARD1单克隆抗体结合的第二抗体、辣根过氧化物酶和/或碱碱性磷酸酶性磷酸酶的相应显色底物，以及适宜的缓冲液。

在微量滴定板用于作标准抗原曲线的各孔中依次加入不同浓度的标准抗原溶液，在样品孔中加入待测血清样品，温育一段时间以使ARD1蛋白与ARD1多克隆抗体充分结合。洗涤微量滴定板，加入第一抗体，温育一段时间，以使ARD1单克隆抗体与固定于微量滴定板上的ARD1蛋白充分结合。洗涤微量滴定板，加入第二抗体，温育一段时间，以使第二抗体与固定于微量滴定板上的ARD1单克隆抗体充分结合。洗涤微量滴定板，加入辣根过氧化物酶/碱性磷酸酶标记的链霉亲和素，温育一段时间，以使链霉亲和素与生物素充分结合。洗涤微量滴定板，加入邻苯二胺，室温避光显色。用酶标仪读取每个反应孔的OD₄₉₂值。绘制标准曲线，计算待测样品中ARD1的浓度。

在本发明一个具体实施方式中，采用免疫组化方法利用本发明的试剂盒检测组织或细胞ARD1的表达。所用试剂盒包括所述ARD1单克隆抗体，生物素标记的山羊抗小鼠IgG的抗体或兔抗小鼠IgG的抗体，结合辣根过氧化物酶/碱性磷酸酶的链霉亲和素，酶相应的显色底物邻苯二胺/碱性磷酸酶红，以及适用于免疫组化的缓冲液。

制备结肠癌细胞株LoVo的细胞爬片，固定细胞后，滴加分泌14D4抗体的杂交瘤上清液，温育。用缓冲液冲洗爬片，然后滴加生物素标记的山羊抗小鼠IgG的抗体(第二抗体)，温育。用缓冲液冲洗爬片，然后滴加结合辣根过氧化物酶/碱性磷酸酶的链霉亲和素，温育。或者第二抗体上直接标记有辣根过氧化物酶/碱性磷酸酶，而不再滴加结合辣根过氧化物酶/碱性磷酸酶的链霉亲和素。然后用DAB/AP-red进行显色反应。如果细胞表达ARD1，则显色反应结果为细胞浆呈现棕黄色/红色，否则不显色。

另一方面，本发明提供一种抗肿瘤药物，该抗肿瘤药物含有本发明所述的单克隆抗体或其生物活性片段。如下述附图和实施例中所证实的，本发明的ARD1单克隆抗体能够与ARD1特异性、高效结合。因此，给予肿瘤患者本发明的单克隆抗体或该抗体的能够与ARD1蛋白特异性结合的生物活性片段，可能抑制肿瘤细胞内ARD1的活性，从而起到抑制肿瘤浸润、转移的作用。因此，本发明还提供一种治疗动物(包括人)肿瘤的方法，包括给予需要治疗的动物治疗有效量的本发明单克隆抗体或其生物活性片段。对此处所用“肿瘤”没有特别限制，只要与ARD1的过表达相关即可，但优选为结肠癌、食管癌、直肠癌或肺癌。

所述药物的制备方法可以是本领域技术人员熟知的任何方法，例如将本发明的单克隆抗体或其生物活性片段与适当的赋形剂混合。所述赋形剂是本领域常规用于抗体药物制备的赋形剂，如水、盐水、缓冲剂等。所述药物的给药途径可以是任何抗体药物的常规给药途径，例如，静脉内注射、皮下注射、肿瘤内注射等。

另一方面，本发明提供本发明的单克隆抗体或其生物活性片段在体外检测样品中ARD1蛋白质表达水平中的应用。所用检测方法包括可以使用本发明抗体的所有免疫方法，例如ELISA、Western Blot、免疫沉淀、免疫组化、免疫荧光等，优选为免疫组化。优选所述样品可为来自受试个体的生物流体(例如血液、组织液)和组织样品(例如结肠癌组织、食管癌组织、直肠癌组织、肺癌组织)，更优选所述样品为血清。所述组织样品经福尔马林固定、酒精脱水、石蜡包埋，制成3～5μm的切片。实验方法同上述检测细胞株ARD1表达的方法。

另一方面，本发明提供本发明的单克隆抗体或其生物活性片段在制备用于辅助诊断和/或监测肿瘤的试剂中的应用。通过本发明的单克隆抗体或其生物活性片段体外检测组织样品中ARD1蛋白质的表达水平和/或监测肿瘤患者样本中ARD1蛋白质水平的动态变化，可用于辅助诊断和/或监测肿瘤。

在本发明的一个具体实施方案中，如上所述用本发明单克隆抗体对取自患者的可能为肿瘤的组织进行免疫组化染色，在显微镜下观察组织染色结果来确定是否表达ARD1蛋白质，从而对组织是否为肿瘤作出诊断。通过判断ARD1阳性细胞占肿瘤细胞的比例以及表达的多少(阳性信号的强弱)可以进一步协助肿瘤的分期。例如在结肠直肠癌、食管癌、肺癌中，大部分癌细胞表达ARD1，染色结果通常为强阳性。

在本发明的一个具体实施例中，如上所述，用纯化的ARD1多克隆抗体及本发明ARD1单克隆抗体进行夹心ELISA对取自肿瘤患者的血清进行常规ELISA实验等免疫学实验，从而可监测样本中尤其是血清中ARD1蛋白质的动态变化水平。

下面结合附图和具体实施例进一步阐明本发明，但本发明的范围并不受这些附图和实施例的限制。

附图说明

图1：12％SDS-PAGE电泳鉴定14D4抗体的纯度。其中第1，2，3道电泳为66KD的蛋白质分子量Marker(BSA，1μg；BSA，2μg；BSA，3μg)。4，5道为纯化单抗14D4(1μg；2μg)；6，7道为纯化单抗10C12(1μg；2μg)。电泳方向为从上到下。电泳速度快的条带(下面的条带)为分子量较小的单克隆抗体轻链，电泳速度慢的条带(上面的条带)为分子量较大的单克隆抗体重链。结果显示，筛选出的阳性杂交瘤细胞株所分泌的抗体纯度高，无杂带。

图2：用包被GST-ARD1重组蛋白的微量滴定板以ELISA方法分析14D4抗体的效价。用包被GST的微量滴定板为阴性对照。将浓度分别为0、0.18、0.37、0.625、1.25、2.5、5μg/ml的纯化抗体14D4加到微量滴定板中。纵坐标为OD₄₉₂处的吸光度数值，横坐标为14D4抗体浓度。结果显示14D4只特异结合GST-ARD1，与其它蛋白如GST无交叉反应。

图3A和图3B：用Western-Blot的方法检测原核蛋白GST-ARD1以及结肠癌细胞系LoVo中内源性ARD1的表达，其中，1：10C12；2：14D4；3：阳性对照(+)；4：IgG。12％SDS-PAGE电泳，GST-ARD1每孔上样量为100ng(GST纯化蛋白每孔100ng为阴性对照)，LoVo细胞总蛋白上样量50μg，一抗为14D4、10C12浓度2.5μg/ml(正常小鼠血清纯化IgG为阴性对照)检测。结果显示14D4、10C12可与GST-ARD1结合，而不结合GST(图3A)。同时应用14D4、10C12可检测到LoVo细胞中内源性ARD1的表达(图3B)。

图4：免疫沉淀(IP)检测LoVo细胞中ARD1的表达，其中，1：10C12；2：14D4；3：阳性对照(+)；4：IgG。结果提示，抗体10C12可用于免疫沉淀反应，而单抗14D4则不能进行免疫沉淀反应。

图5：用14D4抗体或10C12抗体进行免疫细胞化学方法以检测结肠癌细胞株LoVo中ARD1的表达。结果显示LoVo的细胞浆显色为棕黄色，说明LoVo细胞株表达ARD1。

图6：用免疫荧光的方法检测结肠癌细胞株LoVo中ARD1的定位。一抗为14D4或10C12，二抗为FITC标记的荧光二抗，同时应用Hoechest染料染细胞核。结果绿色荧光主要分布于细胞浆中，少量分布于细胞核。从而提示ARD1主要定位于细胞浆，少量定位于细胞核。

图7：夹心ELISA检测LoVo细胞中的ARD1。结果显示：抗ARD1兔多抗与单抗10C12配对的夹心ELISA，可用于检测样品，如血清中的ARD1。

图8：用免疫组化方法检测结肠癌和结肠良性病变中ARD1的表达。结果显示结肠癌癌旁正常组织(图8C)及结肠良性病变中不表达ARD1(图8D)，而结肠癌组织中可检测到ARD1表达(图8A、8B)。

图9：用免疫组化方法检测食管癌、直肠癌和肺癌中ARD1的表达。结果显示癌组织中可检测到ARD1表达(癌)，而癌旁正常组织中不表达ARD1(癌旁)。

图10：应用ELISA对单抗14D4与商品化单抗4B7-H4进行比较。分别以GST-ARD1和GST包被96孔板。以不同浓度的单抗14D4、4B7-H4(0、0.18、0.37、0.625、1.25、2.5、5μg/ml)为一抗、进行常规ELISA检测。图中纵坐标为OD₄₉₂处的吸光度数值，横坐标为抗体浓度。结果显示2种单抗均可特异结合GST-ARD1，而与GST无交叉反应；同时单抗14D4与原核重组蛋白GST-ARD1的反应性明显强于4B7-H4同GST-ARD1的反应性。

图11：应用Western Blot和免疫沉淀对单抗14D4、10C12与商品化单抗4B7-H4进行比较。12％SDS-PAGE电泳，GST-ARD1每孔上样量为100ng，瞬时转染pCMV-myc-ARD1质粒的Hela细胞总蛋白上样量100μg，常规SDS-PAGE电泳、转膜、封闭后，加入一抗，分别为14D4、4B7-H4、正常小鼠血清纯化IgG、或抗myc抗体进行常规WesternBlot检测。结果显示单抗14D4、4B7-H4均可特异结合GST-ARD1，而单抗14D4与原核重组蛋白GST-ARD1的反应性较4B7-H4强(图11A)；应用14D4可检测到Hela细胞中内源性ARD1的表达(图11B)。单抗4B7-H4不能检测真核细胞内源性的ARD1，或转染的外源性myc-ARD1(图11B)。免疫沉淀实验提示，与单抗4B7-H4相比，单抗10C12与LoVo细胞中天然的ARD1蛋白有更强的相互作用(图11C)。

图12：用不同抗体进行免疫组化，检测结肠癌中ARD1的表达。结果显示单抗14D4可检测到结肠癌组织中ARD1表达，而商品化单抗4B7-H4不能用于组化检测。

用于专利程序的生物材料保藏信息：

抗ARD1(Human arrest defective 1)的杂交瘤细胞株

(分泌本发明单克隆抗体14D4)

保藏单位全称及简称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)

保藏编号：CGMCC NO.2354；保藏日期：2008年1月24日

抗ARD1(Human arrest defective 1)的杂交瘤细胞株

(分泌本发明单克隆抗体10C12)

保藏单位全称及简称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)

保藏编号：CGMCC NO.2355；保藏日期：2008年1月24日

具体实施方式

实施例1抗人ARD1单克隆抗体的制备

1、ARD1抗原的制备

分别设计ARD1基因(GenBank Accession No.NM_003491)cDNA片段的5’端正义引物5’-ATTGGATCCTCGCCACCATGAACATCCGCAATGCG-3’(SEQ ID No.1)和3’端反义引物5’-AATGAATTCTAGGAGG CTGAGTCGGAG-3’(SEQ ID No.2)(引物由上海生工生物工程公司合成)，并于引物两端分别引入BamH I和EcoR I酶切位点。用Trizol(购自Invitrogen公司)提取人结肠癌细胞LoVo(ATCC编号：CCL-229)总RNA，逆转录成cDNA，并应用上述引物进行PCR扩增ARD1 cDNA片段，产物长度为712bp。

将PCR产物和pGEX-5X-3载体(购自Amersham Biosciences公司)分别都用BamH I和EcoR I酶切后进行连接，将该连接产物转化入大肠杆菌BL21菌株并挑取单克隆进行酶切鉴定，同时送测序。原核表达载体pGEX-5X-3的SD序列下游就是谷胱甘肽巯基转移酶(GST)基因，而克隆的外源ARD1基因则与GST基因相连。当基因表达时，表达产物为GST和ARD1基因产物的融合体GST-ARD1，以方便ARD1的纯化。

挑选测序正确阳性克隆的BL21菌株进行GST-ARD1重组蛋白的小量诱导表达。取小量诱导表达鉴定为阳性的菌株进行GST-ARD1重组蛋白的大量诱导表达。发明人对ARD1的诱导表达条件进行了探索，使用大肠杆菌BL21菌株，温度为27℃，诱导剂IPTG的浓度为0.2mmol/L，诱导时间为3小时。在此条件下，GST-ARD1的表达量最高，而且表达的蛋白主要是分泌型蛋白。用能够吸附GST融合蛋白的谷胱甘肽珠子(Glutathione Sepharose 4B，购自Amersham Biosciences公司)纯化GST-ARD1重组蛋白，并回收、鉴定。

2、ARD1单克隆抗体的制备

用纯化的GST-ARD1重组蛋白免疫6～8周龄的BALB/c小鼠，6周后强化免疫。将免疫好的小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合。用ELISA方法筛选分泌抗ARD1单克隆抗体的杂交瘤细胞。再用有限稀释法对阳性的杂交瘤细胞进行多次亚克隆。选取强阳性的克隆扩大培养、建株，其中一株所分泌的抗ARD1单克隆抗体命名为14D4，而该杂交瘤细胞株即为14D4细胞株。该杂交瘤细胞株已于2008年1月24日以保藏号CGMCC NO.2354被保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所)；另一株所分泌的抗ARD1单克隆抗体命名为10C12，而该杂交瘤细胞株即为10C12细胞株。该杂交瘤细胞株已于2008年1月24日以保藏号CGMCCNO.2355被保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所)。将14D4细胞或10C12细胞接种于10周龄BALB/C小鼠的腹腔中，至腹水形成增多腹部特别膨隆时处死小鼠取腹水，其内含大量14D4或10C12抗体。

实施例2鉴定14D4抗体或10C12抗体的纯度

用常规ELISA方法鉴定14D4抗体或10C12抗体的亚类，证实其分别为IgG2a、IgG1，因此选用Pro.A Sepharose-4B柱进行纯化，并用12％SDS-PAGE电泳鉴定其纯度。结果见图1，显示14D4抗体或10C12抗体纯度高、无杂带。

实施例3测定14D4抗体的效价

用PBS缓冲液透析纯化的14D4抗体，用紫外线分光光度计在280nm处测定抗体的浓度。

1、在GST-ARD1蛋白包被的微量滴定板中分别加入浓度为0、0.18、0.37、0.625、1.25、2.5、5μg/ml的14D4抗体。并将同样浓度的14D4抗体加入GST蛋白包被的微量滴定板中作为阴性对照。室温温育1小时。

2、0.05％Tween-20/PBS洗涤反应孔3次，PBS洗涤反应孔2次。

3、加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG的抗体，室温温育1小时。

4、0.05％Tween-20/PBS洗涤反应孔3次，PBS洗涤反应孔2次。

5、向反应孔中加入辣根过氧化物酶底物OPD，室温显色30分钟后，加入终止液(12.5％H₂SO₄)。用酶标仪测量OD₄₉₂处的吸光度值。结果见图2，14D4抗体特异结合GST-ARD1，并且与GST无交叉反应。

对10C12抗体进行类似的效价实验，结果未显示。

实施例4Western-Blot检测ARD1的表达。

1、Western-Blot检测GST-ARD1

1)取纯化的GST-ARD1和GST蛋白行12％的SDS-PAGE电泳，每孔蛋白上样量为100ng。

2)至溴酚蓝达到胶的最下缘时停止，进行电转移。

3)转膜结束后，丽春红染色，检测转膜效果以及做好标记。

4)5％脱脂奶粉封闭，4℃过夜。

5)加一抗14D4或10C12抗体，浓度为2.5μg/ml，正鼠IgG为阴性对照，室温1小时。

6)0.1％Tween-20/PBS洗涤7次。

7)加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG的抗体，室温温育40分钟。

8)0.1％Tween-20/PBS洗涤7次，PBS洗涤1次。

9)发光显影。结果见图3A，14D4抗体或10C12抗体特异结合GST-ARD1，并且与GST无交叉反应。

2、Western-Blot检测LoVo细胞中内源性ARD1表达。

细胞裂解液RIPA(Tris(pH7.4)，150mM NaCI，1％Triton X-100，1％sodium deoxycholate，0.1％SDS)裂解LoVo细胞，提取细胞总蛋白，行12％的SDS-PAGE电泳，每孔蛋白上样量为50μg。其余步骤同前。结果显示14D4抗体、10C12抗体能检测到人结肠癌细胞系LoVo中内源性ARD1(图3B)。

实施例5免疫沉淀(IP)检测LoVo细胞中ARD1的表达

1、细胞裂解液RIPA裂解LoVo细胞，提取细胞总蛋白。

2、取200μg细胞总蛋白分别与单抗10C12或14D4杂交瘤上清0.5ml 4℃孵育2h。

3、加入Protein G Sepharose 4Fast Flow(GE Healthcare，Uppsala，Sweden)，4℃孵育2h。

4、反应混合物用PBST洗涤3遍后，行常规12％的SDS-PAGE电泳。

5、转膜封闭后，以单抗14D4为一抗进行常规Western blot检测。结果见图4，10C12可与LoVo细胞中天然构象的ARD1反应，而单抗14D4则不能进行免疫沉淀反应。

实施例6免疫细胞化学检测结肠癌细胞株LoVo中ARD1的表达

1、常规方法制备结肠癌细胞株LoVo的细胞爬片，冷丙酮/甲醇(体积比1∶1)固定。

2、将爬片浸泡于3％H₂O₂(PBS稀释)内10分钟，以去除内源性过氧化物酶。

3、PBS洗涤爬片2次。然后用1％BSA(PBS稀释)在37℃下封闭30分钟。滴加适宜浓度的14D4抗体或10C12抗体，在37℃下反应1小时。

4、PBS洗涤爬片3次，滴加辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG的抗体工作液(DAKO ENVISION^TM+System HRP Mouse)，在37℃下反应1小时。

5、用PBS洗涤爬片3次，在辣根过氧化物酶底物DAB的溶液中显色20分钟。

6、用PBS终止显色，将爬片反盖在载玻片上，显微镜下观察，以细胞浆内出现棕黄色颗粒状为阳性。结果见图5，显示LOVO细胞浆为棕黄色，说明LOVO细胞株表达ARD1。

实施例7免疫荧光检测ARD1在结肠癌细胞LoVo中的定位。

1、常规方法制备结肠癌细胞株LoVo的细胞爬片，冷丙酮/甲醇(体积比1∶1)固定。

2、将爬片浸泡于3％H₂O₂(PBS稀释)内10分钟，以去除内源性过氧化物酶。

3、PBS洗涤爬片2次。然后用1％BSA(PBS稀释)在37℃下封闭30分钟。滴加适宜浓度的14D4抗体或10C12抗体在37℃下反应1小时。

4、用PBS洗涤爬片3次。

5、50％甘油封片，荧光显微镜下观察照相。如图，LoVo细胞浆可见大量绿色荧光，胞核中隐约可见少量绿色荧光，蓝色荧光为Hoechest着染的细胞核。结果显示ARD1主要定位于细胞浆中，小部分定位于细胞核中(图6)。

实施例8夹心ELISA方法检测结肠癌细胞中ARD1的表达

1、以抗ARD1纯化兔多抗10μg/ml包被96孔板，4℃包被过夜。

2、封闭后加入LoVo细胞裂解液50μg，室温反应1h。同时以25ng纯化的His-ARD1蛋白作为阳性对照，PBS作为阴性对照(Control)。

3、PBST洗涤5遍后，加入1μg/ml的抗ARD1单抗10C12，室温反应1h。

4、PBST洗涤5遍后，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG的抗体，室温孵育1h。

5、PBST洗涤5遍后，常规OPD现色，并测定OD₄₉₂处的吸光度值。结果见图7，应用夹心ELISA可检测到LoVo细胞中的ARD1。

实施例9免疫组化检测结肠癌和结肠良性病变、食管癌、直肠癌和肺癌中ARD1的表达

1、选取结肠癌和结肠良性病变组织进行常规福尔马林固定、酒精脱水、石蜡包埋，切成4μm厚的切片。在60℃烘烤4小时，以使切片牢固地附着于载玻片上。

2、用二甲苯对切片进行脱蜡处理，梯度酒精使切片水化，用PBS洗涤切片2次。

3、将切片浸泡于3％H₂O₂(PBS稀释)内10分钟，以去除内源性过氧化物酶。然后用PBS洗涤切片3次。

4、将切片浸泡于pH6.0的0.1M枸橼酸钠缓冲液中，在92℃～100℃煮10分钟，进行抗原修复。待切片自然冷却至室温后，用去离子水洗涤切片2次，再用PBS洗涤切片2次。

5、将5％脱脂奶粉(PBS稀释)滴加于切片上，在37℃下温育1小时，进行抗原封闭。

6、在切片上滴加适宜浓度的14D4抗体，4℃孵育过夜。然后用PBS洗涤切片3次。

7、在切片上滴加辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG的抗体工作液(DAKO ENVISION^TM+System HRP Mouse)，在37℃下温育1小时。

8、用PBS洗涤切片2次，将切片浸泡于在辣根过氧化物酶底物DAB的溶液中显色20分钟。

9、用PBS终止显色，用苏木精对切片进行复染。用1％盐酸酒精分化切片，梯度酒精脱水，二甲苯透明，然后将盖玻片盖在组织切片上，显微镜下观察。结果见图8，显示癌旁正常组织(图8C)结肠良性病变中不表达ARD1(图8D)，而结肠癌组织中有ARD1的高表达(图8A，8B)。

用与上述类似的步骤采用免疫组化方法检测食管癌、直肠癌和肺癌中ARD1的表达。结果显示癌组织中可检测到ARD1表达(癌)，而癌旁正常组织中不表达ARD1(癌旁)。(结果具体参见图9)。

实施例10单抗14D4、10C12与Abnova公司商品化抗ARD1单抗(M01；4B7-H4)的比较

分别应用ELISA、Western blot、免疫沉淀、免疫组化对抗体进行比较，具体方法同实施例3，4，5，9。ELISA、Western bolt结果提示当加入抗体浓度相同时，单抗14D4与原核重组蛋白GST-ARD1的反应性较4B7-H4强(图10、图11A)；Western Blot结果提示单抗4B7-H4不能检测真核细胞内源性的ARD1，或转染的外源性myc-ARD1(图11B)；免疫沉淀实验提示，与单抗4B7-H4相比，单抗10C12与LoVo细胞中天然的ARD1蛋白有更强的相互作用(图11C)；同时单抗14D4可用于免疫组化检测，而单抗4B7-H4则不能用于组化检测(图12)。因此本发明的单抗在应用方面优于商品化的单抗。

实施例11ARD1表达与多种肿瘤临床病理特征的相关分析

本发明人利用本发明的单抗14D4对收集的50对临床结肠癌，及20例肠炎组织进行石蜡切片免疫组化分析。结果，50例结肠癌组织中有41例表达ARD1(82％)；50例癌旁正常组织中有12例表达ARD1(24％)；而20例良性病变(肠炎组织)中，均无ARD1表达(0％)。经Pearson X²检验，ARD1在结肠良性病变和结肠癌组织中的表达具有显著性差异(P＜0.001)(表1)。结果提示ARD1在结肠癌组织中高表达的比例很高，因此它为一个新的结肠癌肿瘤标志物。

同时我们对食管癌、直肠癌、肺癌中ARD1的表达进行分析，结果提示ARD1在这三种肿瘤的癌组织和癌旁正常组织的表达具有显著性差异(P＜0.001)(表2、3、4)。

表1.免疫组化检测ARD1在结肠组织中的表达。

分类	病例(n)	ARD1的表达		阳性率(％)	P
						-	+
		良性病变1结肠癌原发灶2癌旁正常组织3	205050					20938	04112	08224	＜0.001a＜0.001b

a显示1与2之间的差异，b显示2与3之间的差异

表2.免疫组化检测ARD1在食管癌组织中的表达。

分类	病例(n)	ARD1的表达		阳性率(％)	P
						-	+
		癌癌旁正常组织	4040					1040	300	750	＜0.001

表3.免疫组化检测ARD1在直肠癌组织中的表达。

分类	病例(n)	ARD1的表达		阳性率(％)	P
						-	+
		癌癌旁正常组织	3935					922	3013	76.937.1	＜0.001

表4.免疫组化检测ARD1在肺癌组织中的表达。

分类	病例(n)	ARD1的表达		阳性率(％)	P
						-	+
		癌癌旁正常组织	1818					718	110	61.10	＜0.001

序列表

<110>北京市肿瘤防治研究所

<120>ARD1的单克隆抗体及其应用

<130>GAl08CN0224C

<160>2

<170>Patentln version 3.3

<210>1

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>1

attggatcct cgccaccatg aacatccgca atgcg    35

<210>2

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>2

aatgaattct aggaggctga gtcggag             27

Claims (8)

1.针对ARD1蛋白质的单克隆抗体，所述单克隆抗体由保藏号为CGMCC NO.2354的杂交瘤细胞分泌。

2.分泌权利要求1所述的单克隆抗体的杂交瘤细胞系，其保藏号为CGMCC NO.2354。

3.一种检测人ARD1蛋白质水平的试剂盒，其含有权利要求1的单克隆抗体。

4.权利要求3的试剂盒，其还含有第二抗体、显色底物、或可被检测的荧光和/或放射标记，以及适宜的缓冲液。

5.权利要求4的试剂盒，其中第二抗体上标记有生物素，并进一步含有结合辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶的链霉亲和素，显色底物为邻苯二胺或碱性磷酸酶红；或其中第二抗体上直接标有辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶，显色底物为邻苯二胺或碱性磷酸酶红。

6.权利要求3的试剂盒，该试剂盒含有用纯化的ARD1多克隆抗体包被的微量滴定板、ARD1标准抗原、权利要求1所述单克隆抗体、标记有生物素的能够与ARD1单克隆抗体结合的第二抗体、辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶标记的链霉亲和素、辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶的相应显色底物，以及适宜的缓冲液；或该试剂盒含有用纯化的ARD1多克隆抗体包被的微量滴定板、ARD1标准抗原、权利要求1所述单克隆抗体、直接标记有辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶的能够与ARD1单克隆抗体结合的第二抗体、辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶的相应显色底物，以及适宜的缓冲液；或该试剂盒含有ARD1标准抗原、权利要求1所述单克隆抗体、直接标记有辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶的能够与ARD1单克隆抗体结合的第二抗体、辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶的相应显色底物，以及适宜的缓冲液。

7.权利要求1的单克隆抗体在制备用于辅助诊断和/或监测肿瘤的试剂中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其中，所述的肿瘤为结肠癌、食管癌、直肠癌或肺癌。

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