CN114502732A

CN114502732A - 特异性结合wrs蛋白的抗体及其用途

Info

Publication number: CN114502732A
Application number: CN202080065087.4A
Authority: CN
Inventors: 裵秀美; 孙成和; 金闰善; 朴智恩; 朴敃哲; 姜遂眹
Original assignee: Therapy Co ltd; Jw Bioscience
Current assignee: Therapy Co ltd; Jw Bioscience
Priority date: 2019-07-18
Filing date: 2020-07-17
Publication date: 2022-05-13
Also published as: EP4029882A4; WO2021010800A1; JP2022541303A; JP7302093B2; EP4029882A1; KR20210010411A; US20220268787A1; KR102478445B1

Abstract

本发明涉及与色氨酰‑tRNA合成酶(WRS)蛋白特异性结合的抗体，并且更具体地涉及与WRS蛋白中的具有由SEQ ID NO:2表示的氨基酸序列的多肽特异性结合的抗体或所述抗体的片段；编码所述抗体的多核苷酸和包含所述多核苷酸的载体；使用所述载体转化的细胞；及其用途。

Description

特异性结合WRS蛋白的抗体及其用途

技术领域

本申请要求2019年7月18日提交的韩国专利申请号10-2019-0087233的优先权，将其全部内容通过引用并入本文。

本发明涉及与WRS(色氨酰-tRNA合成酶)蛋白特异性结合的抗体及其用途，并且更具体地涉及与WRS(色氨酰-tRNA合成酶)蛋白中的具有由SEQ ID NO:2表示的氨基酸序列的多肽特异性结合的抗体或其片段、编码所述抗体的多核苷酸、包含所述多核苷酸的载体、使用所述载体转化的细胞、及其用途。

背景技术

氨酰-tRNA合成酶(ARS)是功能在于将特定氨基酸附接至相应tRNA的酶。高等生物含23种酶，包括如下：根据氨基酸类型的20种酶和参与多合成酶复合物形成的3种其他类型的酶，如AIMP1(p43)、(AIMP2)p38和(AIMP3)p18，并且除了参与多合成酶复合物的酶外，一些酶以游离形式存在。然而，最近有报道称，ARS除了其基本功能外，在特定环境中还具有各种其他活性功能，WRS(色氨酰-tRNA合成酶)就是其中之一。

WRS首次在细胞分泌的ARS中被报道并展现细胞因子活性，并且迄今为止，许多论文已经发表了关于WRS作为包括结直肠癌在内的各种类型癌症的重要生物标记物的潜力(Ghanipour A.等人The prognostic significance of tryptophanyl-tRNA synthetasein colorectal cancer(2009)Cancer Epidemiol.Biomarkers Prev.18(11),2949-2955)。此外，据报道，WRS的水平可按如下方式用作快速准确诊断感染性疾病及其并发症的标记物：当发生由细菌、病毒或真菌感染引起的感染性疾病时，体内WRS的水平从感染初期开始迅速增加，并且特别是患上感染性炎性疾病时，WRS的水平与正常人的水平相比大大增加，并且在非感染性炎性疾病的情况下，WRS水平与此无关(韩国专利申请公开号10-2017-0027313)。

这些结果表明WRS可存在于患有癌症和感染性疾病的患者的血清中，并且WRS可用作这些疾病的重要诊断生物标记物。

然而，尽管包括WRS在内的ARS作为生物标记物很重要，但ARS在蛋白质结构方面有许多相似之处，因此从动物免疫应答中获得的抗体显示出交叉反应性，即能够结合其他ARS，并且在很多情况下根本不产生高灵敏性抗体。

发明内容

技术问题

因此，诸位发明人进行了深入研究以开发与WRS特异性结合的抗体，并且发现与包括WRS蛋白中的特定氨基酸序列的多肽特异性结合并且具有特定CDR(互补决定区)序列的抗体对WRS展现出非常高的结合特异性和结合亲和力，因此其效用非常高，由此最终形成本发明。

因此，本发明的目的是提供与WRS(色氨酰-tRNA合成酶)蛋白中的具有由SEQ IDNO:2表示的氨基酸序列的多肽特异性结合的抗体或其片段。

本发明的另一个目的是提供一种编码所述抗体或其片段的多核苷酸、一种包含所述多核苷酸的载体、以及一种用所述载体转化的细胞。

本发明的再另一个目的是提供一种产生与人WRS结合的抗体或其片段的方法，所述方法包括通过在使多核苷酸表达的条件下培养细胞产生包含轻链和重链可变区的多肽，并且从所述细胞或培养所述细胞的培养基回收所述多肽。

本发明的又另一个目的是提供一种用于诊断癌症或感染性疾病或感染并发症的组合物，所述组合物包含所述抗体或其片段。

此外，本发明的又另一个目的是提供一种用于诊断癌症或感染性疾病或感染并发症的组合物，所述组合物由所述抗体或其片段组成。

此外，本发明的又另一个目的是提供一种用于诊断癌症或感染性疾病或感染并发症的组合物，所述组合物基本上由所述抗体或其片段组成。

本发明的再又另一个目的是提供所述抗体或其片段在制造用于诊断癌症的药剂中的用途。

本发明的另外的目的是提供一种诊断癌症的方法，所述方法包括：

a)从受试者获得样品；

b)使用所述抗体或其片段测量所述样品中的WRS蛋白表达水平；以及

c)当步骤b)中测量的蛋白质表达水平增加时确定所述受试者患有癌症。

本发明的再另外的目的是提供所述抗体或其片段在制造用于诊断感染性疾病或感染并发症的药剂中的用途。

本发明的又另外的目的是提供一种诊断感染性疾病或感染并发症的方法，所述方法包括：

a)从受试者获得样品；

c)当步骤b)中测量的蛋白质表达水平增加时确定所述受试者患有感染性疾病或感染并发症。

技术方案

为了实现本发明的上述目的，本发明提供了一种与WRS(色氨酰-tRNA合成酶)蛋白中的具有由SEQ ID NO:2表示的氨基酸序列的多肽特异性结合的抗体或其片段。

为了实现本发明的另一个目的，本发明提供了一种编码所述抗体或其片段的多核苷酸、一种包含所述多核苷酸的载体、以及一种用所述载体转化的细胞。

为了实现本发明的再另一个目的，本发明提供了一种产生与人WRS结合的抗体或其片段的方法，所述方法包括通过在使多核苷酸表达的条件下培养细胞产生包含轻链和重链可变区的多肽，并且从所述细胞或培养所述细胞的培养基回收所述多肽。

为了实现本发明的又另一个目的，本发明提供了一种用于诊断癌症或感染性疾病或感染并发症的组合物，所述组合物包含所述抗体或其片段。

此外，本发明提供了一种用于诊断癌症或感染性疾病或感染并发症的组合物，所述组合物由所述抗体或其片段组成。

本发明提供了一种用于诊断癌症或感染性疾病或感染并发症的组合物，所述组合物基本上由所述抗体或其片段组成。

为了实现本发明的再又另一个目的，本发明提供了所述抗体或其片段在制造用于诊断癌症的药剂中的用途。

为了实现本发明的另外的目的，本发明提供了一种诊断癌症的方法，所述方法包括：

a)从受试者获得样品；

为了实现本发明的再另外的目的，本发明提供了所述抗体或其片段在制造用于诊断感染性疾病或感染并发症的药剂中的用途。

为了实现本发明的又另外的目的，本发明提供了一种诊断感染性疾病或感染并发症的方法，所述方法包括：

a)从受试者获得样品；

在下文中，将给出本发明的详细描述。

本发明提供了与WRS(色氨酰-tRNA合成酶)蛋白中的具有由SEQ ID NO:2表示的氨基酸序列的多肽特异性结合的抗体或其片段。

在本发明中，术语“WRS”是指色氨酰-tRNA合成酶，也称为色氨酸-tRNA连接酶、TrpRS、WARS等。WRS是一种介导氨基酸色氨酸与tRNA之间的氨酰化的酶。WRS在人体内由WARS基因编码，并且该蛋白质的氨基酸序列和mRNA核苷酸序列以GenBank登录号NP_004175.2(蛋白质)、GenBank登录号NM_004184.3(mRNA核苷酸序列)等已知。WRS有两种亚型：细胞质形式(WARS或细胞质色氨酰-tRNA合成酶)和线粒体形式(WARS2或线粒体色氨酰-tRNA合成酶)。本发明中的WRS优选采用细胞质形式。

在本发明中，术语“抗体”是指免疫球蛋白(Ig)，并且是选择性作用于抗原并参与体内免疫的蛋白质总称。自然界中发现的完整抗体通常由两对轻链(LC)和一条重链(HC)(它们是由若干个结构域组成的多肽)组成，或者HC/LC的这两对结构作为基本单元构成。构成哺乳动物抗体的重链有五种类型，由希腊字母α、δ、ε、γ和μ表示，并且根据重链类型的不同，形成不同类型的抗体，如IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。有两种类型的构成哺乳动物抗体的轻链，由λ和κ表示。

根据氨基酸序列的变异性，抗体的重链和轻链在结构上分为可变区和恒定区。重链恒定区根据抗体类型包括3或4个重链恒定区，即CH1、CH2和CH3(IgA、IgD和IgG抗体)和CH4(IgE和IgM抗体)，并且轻链包括作为一个恒定区的CL。重链和轻链各自的可变区由重链可变区(VH)或轻链可变区(VL)的一个结构域组成。在轻链和重链的每一个中，可变区和恒定区并排排列并通过一个共价二硫键连接，并且与轻链结合的两个分子的重链通过两个共价二硫键连接，以形成一个完整抗体。完整抗体通过重链和轻链的可变区与抗原特异性结合，并且由于完整抗体包括两对重链和轻链(HC/LC)，一个分子的完整抗体具有二价单特异性，即能够通过两个可变区与相同的两个抗原结合。与抗原结合的抗体可变区称为抗体的抗原结合位点，并且抗原表面上的被抗体识别的部分称为表位。

包含抗原结合位点的抗体的可变区被细分为具有低序列变异性的框架区(FR)和作为具有高序列变异性的高变区的互补决定区(CDR)。在VH和VL的每一个中，三个CDR和四个FR在从N末端到C末端的方向上以FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4的顺序排列。在抗体可变区内具有最高序列变异性的CDR直接与抗原结合，并且在确定抗体的抗原特异性方面是最重要的。

在本发明中，所述抗体或其片段是特异性结合WRS蛋白或其变体蛋白的抗体或其片段，并且特异性结合包含由SEQ ID NO:1表示的WRS蛋白的第48至104个氨基酸的序列(SEQ ID NO:2)的多肽。

本发明的“抗体”也可以称为“抗WRS抗体”、“人源化抗WRS抗体”或“修饰的人源化抗WRS抗体”，并在本说明书中以最广泛的意义使用。特别地，所述抗体包括单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)和抗体片段(例如可变区和抗体的展现出期望生物活性(例如与WRS结合)的其他位点)。

本发明的抗体是在轻链和重链CDR中包含特定的氨基酸序列从而使得所述抗体能够选择性地结合WRS的抗体，并且包括单克隆抗体和多克隆抗体，优选单克隆抗体。此外，本发明的抗体包括嵌合抗体、人源化抗体和人抗体中的全部，并且优选是人抗体。

本发明的单克隆抗体是从基本上同质的抗体的群体获得的抗体，其中构成所述群体的各个抗体是相同的，但可能以少量存在的天然存在的突变除外。单克隆抗体非常特异性地结合单一表位。

在本发明中，术语“单克隆”是指从基本上同质的抗体群体中获得的抗体的特性，并且不一定意味着该抗体必须通过任何特定方法产生。例如，本发明的单克隆抗体可以通过Kohler等人首次描述的杂交瘤方法(1975,Nature 256:495)或通过重组DNA方法(美国专利号4,816,567)产生。也可以使用例如文献(Clackson等人(1991)Nature 352:624-628，和Marks等人(1991)J.Mol.Biol.222:581-597，和Presta(2005)J.AllergyClin.Immunol.116:731)中描述的技术从噬菌体抗体文库分离。

本发明的抗体特别包括嵌合抗体，在所述嵌合抗体中重链和/或轻链的一部分与源自特定物种或属于特定抗体类别的抗体中的相应序列相同或同源，而所述重链和/或轻链的其余部分与源自另一物种或属于另一抗体类别的抗体中的相应序列相同或同源，只要本发明的抗体展现出所需的生物活性(例如选择性结合NRS)即可(美国专利号4,816,567和Morrison等人(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6851-6855)。

人源化抗体是包含人和非人(例如小鼠、大鼠)抗体序列的抗体。通常，除了与表位结合的区域(CDR)之外，其余部分属于人抗体，并且与表位结合的区域(CDR)可以包含非人来源的序列。全人抗体是仅包含人免疫球蛋白蛋白质序列的抗体，并且可以从小鼠、小鼠细胞或源自小鼠细胞的杂交瘤产生，或者可以通过噬菌体展示方法产生。

根据本发明的抗体或其片段优选包含如下抗体轻链可变区(VL)和抗体重链可变区(VH)的抗体或其片段，所述抗体轻链可变区(VL)包含含有由SEQ ID NO:3表示的氨基酸序列的互补决定区(CDR)L1、含有由SEQ ID NO:4表示的氨基酸序列的互补决定区(CDR)L2、含有由SEQ ID NO:5表示的氨基酸序列的互补决定区(CDR)L3，所述抗体重链可变区(VH)包含含有由SEQ ID NO:6表示的氨基酸序列的互补决定区(CDR)H1、含有由SEQ ID NO:7表示的氨基酸序列的互补决定区(CDR)H2和含有由SEQ ID NO:8表示的氨基酸序列的互补决定区(CDR)H3。

此外，包含上述轻链和重链CDR的根据本发明的抗体或其片段可以包含如下轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)，所述轻链可变区包含由SEQ ID NO:9表示的氨基酸序列，所述重链可变区包含由SEQ ID NO:10表示的氨基酸序列。

根据本发明的抗体或其片段在其类型方面不受限制，只要它具有上述CDR、VH和VL，或轻链和重链即可，并且所述抗体可以是IgG、IgA、IgM、IgE或IgD抗体。优选地，所述抗体是IgG抗体。

在本发明中，所述抗体的片段是保持WRS特异性结合亲和力的抗体片段，并且优选地，所述片段具有亲本抗体对WRS蛋白的至少20％、50％、70％、80％、90％、95％、100％或更高的亲和力。具体而言，所述片段可以采取诸如Fab、F(ab)2、Fab’、F(ab’)2、Fv、双抗体、scFv等形式。

Fab(抗原结合片段)是抗体的抗原结合片段，并且包括重链和轻链各自的一个可变结构域和一个恒定结构域。F(ab’)2是通过用胃蛋白酶水解抗体产生的片段，并采取其中两个Fab通过重链铰链处的二硫键连接的形式。F(ab’)是单体抗体片段，其具有其中通过还原F(ab’)2片段的二硫键而将重链铰链添加到分离的Fab上的形式。Fv(可变片段)是仅包含重链和轻链各自的可变区的抗体片段。ScFv(单链可变片段)是重组抗体片段，其中重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)通过柔性肽接头连接。双抗体是一种如下形式的片段，其中scFv的VH和VL通过非常短的接头连接并且不能彼此结合，但通过分别与相同类型的另一scFv的VL和VH结合而形成二聚体。

根据本发明的抗体或其片段可以包括基本上不改变其生物活性的保守氨基酸取代(称为抗体的保守变体)。

此外，如上所述的根据本发明的抗体或其片段可以与酶、荧光物质、放射性物质、蛋白质等缀合，但本发明不限于此。此外，将上述材料与抗体缀合的方法在本领域中是熟知的。

本发明的抗体可以源自任何动物，包括哺乳动物，包括人、鸟类等。优选地，所述抗体是人、小鼠、驴、绵羊、兔、山羊、豚鼠、骆驼、马或鸡抗体，最优选人或小鼠抗体。

可以使用本领域已知的方法产生杂交瘤细胞。具体地，杂交瘤细胞可以通过用具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的多肽作为免疫原对动物进行免疫，并将作为源自免疫动物的抗体产生细胞的B细胞与骨髓瘤细胞融合以形成杂交瘤，然后从中选择产生与具有SEQID NO:2的氨基酸序列的多肽特异性结合的单克隆抗体的杂交瘤。待免疫动物除了小鼠之外，还可以包括诸如山羊、绵羊、豚鼠、大鼠、或兔等动物。

对待免疫动物进行免疫的方法可以通过本领域已知的方法进行。例如，通过以下方式对小鼠进行免疫：将1至100μg免疫原用相同量的盐水和/或诸如弗氏佐剂等抗原佐剂一次乳化，并且每2-5周将免疫原皮下或腹膜内接种到动物腹部2-6次。动物免疫后，在最后一次免疫后3-5天从中取出脾脏或淋巴结，并在融合促进剂的存在下，根据本领域已知的细胞融合方法将这些组织中所含的B细胞与骨髓瘤细胞融合。所使用的融合促进剂的例子可以为诸如聚乙二醇(PEG)等材料。骨髓瘤细胞的例子可以包括诸如P3U1、NS-1、P3x63Ag8.653和Sp2/0-Ag14等源自小鼠的细胞，以及诸如AG1和AG2等源自大鼠的细胞。在本领域已知的细胞融合方法中，例如，将B细胞和骨髓瘤细胞以1:1-10:1的比率混合，并以10％-80％的浓度向其中添加分子量为1,000-6,000的PEG，随后在30℃-37℃培养1-10分钟。此外，产生与具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的多肽特异性结合的单克隆抗体的杂交瘤可以通过以下方式来选择：在只有杂交瘤细胞能够存活的选择培养基(如HAT培养基等)中培养，并使用诸如ELISA等方法测量杂交瘤培养上清液中的抗体活性。最后，产生与具有SEQ IDNO:2的氨基酸序列的多肽特异性结合的单克隆抗体的杂交瘤可以通过以下方式来选择：通过诸如限制性稀释等方法对产生与具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的多肽特异性结合的单克隆抗体的杂交瘤进行重复克隆。

此外，本发明提供了一种编码所述抗体或其片段的多核苷酸。

在本发明中，“多核苷酸”可以是寡核苷酸或核酸，并且包括DNA分子(例如cDNA或基因组DNA)、RNA分子(例如mRNA)、使用核苷酸类似物(例如肽核酸和非天然存在的核苷酸类似物)产生的DNA或RNA类似物、及其杂合体。所述多核苷酸可以是单链或双链的。所述多核苷酸指示编码由重链和轻链组成的抗体的核苷酸序列，所述重链和轻链具有对氨基酸序列为SEQ ID NO:2的多肽特异的CDR构型或者VH和VL构型。

编码根据本发明的抗体或其片段的多核苷酸可以通过本领域熟知的方法获得。例如，可以使用本领域熟知的寡核苷酸合成技术，如聚合酶链式反应(PCR)方法等，基于编码部分或全部抗体重链和轻链的DNA序列或相应氨基酸序列来合成。

此外，本发明提供了包含所述多核苷酸的载体。

本发明的“载体”用于本发明的多核苷酸的复制或表达以重组产生根据本发明的抗体或其片段的目的，并且通常包括选自以下的至少一种：信号序列、复制起点、至少一个标记基因、增强子元件、启动子和转录终止序列。本发明的载体优选为表达载体，并且更优选为包含与调节序列例如启动子可操作地连接的本发明的多核苷酸的载体。

作为一种载体的质粒是外部多核苷酸片段能够与之结合的线性或环状双链DNA分子。另一种形式的载体是病毒载体(例如复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)，其中将另外的DNA片段引入病毒基因组中。某些载体能够在引入它们的宿主细胞中自主复制(例如细菌来源的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。其他载体(例如，非附加型哺乳动物载体)通过引入宿主细胞中整合至宿主细胞的基因组中，并由此与宿主基因组一起复制。

在本发明中，“载体”可以理解为与“表达载体”具有相同的含义，表示能够表达多核苷酸的载体的形式。当调节序列影响多核苷酸序列的表达(例如表达的水平、时间安排或位置)时，所述多核苷酸序列被称为“可操作地连接”至调节序列。调节序列是影响与其可操作连接的核酸的表达(例如表达的水平、时间安排或位置)的序列。对于受调节的核酸，调节序列可以直接或通过一种或多种其他分子(例如，与所述调节序列和/或所述核酸结合的多肽)的作用产生影响。调节序列包括启动子、增强子和其他表达控制元件。本发明的载体优选包括pOptiVEC^TM-TOPO和pcDNA^TM3.3-TOPO。

此外，本发明提供了用所述载体转化的细胞。

本发明的细胞在其类型方面不受特别限定，只要其能够用于表达本发明的表达载体中所含的编码所述抗体或其片段的多核苷酸即可。用根据本发明的表达载体转化的细胞(宿主细胞)的例子可以包括原核生物(例如大肠杆菌)、真核生物(例如酵母或其他真菌)、植物细胞(例如烟草或番茄植物细胞)和动物细胞(例如人细胞、猴细胞、仓鼠细胞、大鼠细胞、小鼠细胞、昆虫细胞、或从它们产生的杂交瘤)。优选地，所述细胞是源自包括人在内的哺乳动物的细胞。

适用于其的原核生物包括革兰氏阴性或革兰氏阳性生物，例如肠杆菌科，包括埃希氏杆菌属(如大肠杆菌)、肠杆菌属、欧文氏菌属、克雷伯氏菌属、变形杆菌属、沙门氏菌属(如鼠伤寒沙门氏菌)、沙雷氏菌属(如粘质沙雷氏菌)、志贺氏菌属，芽孢杆菌属(如枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌)，假单胞菌属(如铜绿假单胞菌)，和链霉菌属。本发明的细胞不受特别限制，只要其能够表达本发明的载体即可，但优选大肠杆菌。

作为本发明的细胞，最常见的真核生物例子是酿酒酵母。然而，可以使用许多其他属、种和菌株，其例子包括但不限于粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)宿主，如乳酸克鲁维酵母(K.lactis)、脆壁克鲁维酵母(K.fragilis)(ATCC 12,424)、保加利亚克鲁维酵母(K.bulgaricus)(ATCC 16,045)、威克海姆克鲁维酵母(K.wickerhamii)(ATCC 24,178)、瓦尔特克鲁维酵母(K.waltii)(ATCC56,500)、果蝇克鲁维酵母(K.drosophilarum)(ATCC 36,906)、耐热克鲁维酵母(K.thermotolerans)和马克斯克鲁维酵母(K.marxianus)；耶氏酵母属(Yarrowia)(EP402,226)；巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)(EP 183,070)；假丝酵母属(Candida)；里氏木霉(Trichoderma reesei)(EP 244,234)；粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)；许旺酵母属(Schwanniomyces)，如西方许旺酵母(Schwanniomyces occidentalis)；和丝状真菌，如脉孢菌属(Neurospora)、青霉属(Penicillium)、弯颈霉属(Tolypocladium)和曲霉属(Aspergillus)宿主(包括构巢曲霉(A.nidulans)和黑曲霉(A.niger))。

术语“转化”是指由于引入外源多核苷酸而引起的宿主细胞基因型的变化，并且表示将外源多核苷酸引入宿主细胞，而与用于转化的方法无关。引入宿主细胞中的外源多核苷酸可以在整合到宿主细胞的基因组中后维持，或者可以不整合而维持，并且本发明包括这两种情况。

能够表达根据本发明的与WRS蛋白特异性结合的抗体或其片段的重组表达载体可以通过本领域已知的方法被引入用于产生抗体或其片段的细胞中，从而通过本领域已知的方法转化细胞，所述方法的例子包括但不限于瞬时转染、显微注射、转导、细胞融合、磷酸钙沉淀、脂质体介导的转染、DEAE葡聚糖介导的转染、聚凝胺介导的转染、电穿孔、基因枪和其他已知的将核酸引入细胞中的方法。

此外，本发明的细胞是可以用随后可以在宿主细胞中表达的本发明的多核苷酸或包含所述多核苷酸的载体转化或转染的培养细胞。重组细胞是用待表达的多核苷酸转化或转染的细胞。本发明的细胞也可以是包含本发明的多核苷酸但其中所述多核苷酸不表达至所需水平(除非将调节序列引入细胞中以使所述调节序列与所述多核苷酸可操作地连接)的细胞。

本发明的细胞可以在各种培养基中培养。市售培养基，如Ham's F10(Sigma-Aldrich Co.，圣路易斯，密苏里州)、极限必需培养基(MEM，Sigma-Aldrich Co.)、RPMI-1640(Sigma-Aldrich Co.)和杜尔贝科改良伊格尔培养基(DMEM，Sigma-Aldrich Co.)适合用于细胞培养。必要时，培养基中可补充激素和/或其他生长因子、盐、缓冲液、核苷酸、抗生素、微量元素和葡萄糖或等效能量来源。

此外，本发明提供了一种产生与WRS结合的抗体或其片段的方法，所述方法包括通过在使多核苷酸表达的条件下培养细胞产生包含轻链和重链可变区的多肽，并且从所述细胞或培养所述细胞的培养基回收所述多肽。

根据本发明的产生方法中的细胞如上所述，并且包含编码本发明的抗体的多核苷酸。上述产生方法中的多肽可以是根据本发明的抗体或其片段，或者可以被配置为包含根据本发明的抗体或其片段和另外的氨基酸序列。

因此，根据本发明的抗体或其片段可以使用本领域技术人员熟知的方法来回收。对于培养，培养基组成和培养条件可以根据细胞的类型而有所不同，并且可以由本领域技术人员适当地选择和控制。

抗体分子可以在细胞的细胞质中积累，可以从细胞分泌，或者可以通过适当的信号序列靶向周质或上清液，并且优选靶向周质或上清液。另外，优选的是使用本领域技术人员熟知的方法将产生的抗体分子重折叠并将其组装成功能构象。根据所产生的多肽的特性和细胞的特性，可以通过各种方法回收多肽，所述方法可以由本领域技术人员适当地选择和控制。

多肽可以在细胞或周质空间中产生，或者可以直接分泌到培养基中。如果多肽是在细胞中产生的，则作为第一步，可以破坏细胞从而释放蛋白质。通过例如离心或超滤去除微粒碎片、宿主细胞或裂解的片段。当抗体分泌到培养基中时，通常首先使用市售蛋白质浓缩过滤器(如Amicon或Millipore Pellicon超滤单元)浓缩来自表达系统的上清液。可在任何前述步骤中包括蛋白酶抑制剂如PMSF以抑制蛋白水解，并且可包括抗生素以防止外来污染物的生长。由细胞产生的抗体可以使用例如羟基磷灰石色谱、凝胶电泳、透析、和亲和色谱进行纯化，并且本发明的抗体优选通过亲和色谱进行纯化。

由于根据本发明的抗体或其片段特异性结合WRS，它可用于检测和定量WRS蛋白(例如检测某种细胞、组织或血清中的WRS表达)的诊断测定中。

因此，本发明提供了一种WRS特异性检测方法，所述方法包括使所述抗体或其片段与样品接触，以及检测所述抗体或其片段。为了“检测”所述抗体或其片段，所述抗体或其片段通常可以用可检测部分标记。

例如，可以使用文献[Current Protocols in Immunology,第1和2卷,1991,Coligen等人,编Wiley-Interscience,纽约,纽约州,Pubs]中描述的技术进行用放射性同位素或荧光标记的标记。可以通过例如闪烁计数来测量放射性，并且可以使用荧光计来量化荧光。可替代地，各种酶-底物标记是可获得的，并且酶标记的例子包括萤光素酶(如果蝇荧光素酶和细菌荧光素酶(美国专利号4,737,456))、荧光素、2,3-二氢酞嗪二酮、苹果酸脱氢酶、脲酶、过氧化物酶(如辣根过氧化物酶(HRPO))、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖淀粉酶、溶菌酶、糖类氧化酶(例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)、杂环氧化酶(例如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶)、乳过氧化物酶、微过氧化物酶等。用于将酶缀合至抗体的技术描述于例如O’Sullivan等人[1981,Methods for the Preparation ofEnzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay,in Methods in Enzym.(J.Langone和H.Van Vunakis,编),Academic press,纽约州,73:147-166]。

可以使用各种已知技术将标记间接缀合至抗体。例如，抗体可以与生物素缀合，并且属于上述三大类的任何标记都可以与抗生物素蛋白缀合，反之亦然。生物素选择性地结合抗生物素蛋白，因此该标记可以按间接方式与抗体缀合。可替代地，为了实现标记与抗体的间接缀合，可以将抗体与小半抗原(例如地高辛)缀合，并且上述任何一种不同类型的标记都可以缀合至抗半抗原抗体(例如抗地高辛抗体)。由此，可以实现标记与抗体的间接缀合。

根据本发明的抗体或其片段可以用于任何已知的测定方法中，如竞争结合测定、直接和间接夹心测定以及免疫沉淀测定。

根据本发明的抗体或其片段可用于诊断试剂盒，即用于进行诊断测定的诊断试剂盒，所述诊断试剂盒包括使用说明书和预定量的试剂的包装组合。当将抗体用酶标记时，所述试剂盒可包括酶所需的底物和辅因子作为提供生色团或荧光团的底物前体。另外，可以包括其他添加剂，如稳定剂、缓冲液(例如封闭缓冲液或裂解缓冲液)等。各种试剂的相对量可以广泛变化，以便提供适合用于优化测定灵敏度的试剂溶液浓度。试剂可以以通常冷冻干燥的干粉形式提供，所述干粉形式包含在溶解时将提供具有适当浓度的试剂溶液的赋形剂。

通过本发明的抗体检测的WRS首次在细胞分泌的ARS中被报道并展现细胞因子活性，并且迄今为止，许多论文已经发表了关于WRS作为包括结直肠癌在内的各种类型癌症中的重要生物标记物的潜力(Ghanipour A.等人The prognostic significance oftryptophanyl-tRNA synthetase in colorectal cancer(2009)Cancer EpidemiolBiomarkers Prev.18(11),2949-2955)。

因此，WRS可被检测并用作诊断某些类型的癌症、疾病进展和治疗前后评价预后的诊断标记物。根据本发明的癌症诊断及其预后评价可以通过检测生物样品中的WRS蛋白来进行。

因此，本发明提供了一种用于诊断癌症的组合物，所述组合物包含根据本发明的抗体或其片段作为活性成分。

癌症类型不受特别限制，并且其例子可以包括乳腺癌、结直肠癌、肺癌、小细胞肺癌、骨癌、肝癌、血液癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头颈癌、皮肤或眼内黑素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛门癌、结肠癌、乳腺癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、外阴癌、霍奇金病、食道癌、小肠癌、内分泌腺癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、前列腺癌、慢性或急性白血病、淋巴细胞性淋巴瘤、膀胱癌、肾脏或输尿管癌、肾细胞癌、肾盂癌、CNS肿瘤、原发性CNS淋巴瘤、脊髓肿瘤、脑干胶质瘤、和垂体腺瘤，癌症类型的优选例子包括结直肠癌或胰腺癌。

同时，已有报道称，在细菌、病毒或真菌感染后，WRS的表达水平从感染初期迅速增加，并且另外与正常对照相比，当肺炎或脓毒症等症状作为感染并发症出现时，WRS水平大大增加。另外，在脓毒症患者中，WRS的表达水平与脓毒症的严重程度和预后具有高度相关性，并且由于WRS水平仅在感染性炎症的情况下增加，因此可以快速且准确地将感染性炎性疾病与非感染性炎性疾病彼此区分，因此作为诊断标记物用于治疗新型感染性疾病和感染并发症具有很高的价值。特别是患有由细菌或真菌感染引起的脓毒症或脓毒性休克的患者血清中WRS水平与健康正常对照的血清相比大大升高，并且在患有由革兰氏阴性细菌、革兰氏阳性细菌或真菌感染引起的脓毒症的患者中WRS升高趋势无统计学显著差异，因此WRS可用于诊断所有革兰氏阴性细菌、革兰氏阳性细菌和真菌感染引起的脓毒症。特别是，已知患有自身免疫病如全身炎症反应症状(SIRS)、非感染性慢性炎性疾病(如哮喘和类风湿性关节炎)和舍格伦综合征的患者的血清中WRS水平与正常对照相比没有统计学上显著的差异。因此，WRS的表达水平不会在所有炎症反应中增加，而是仅特异性地在由细菌、病毒或真菌感染诱导的炎症反应中增加。另外，脓毒性休克患者的WRS水平比脓毒症患者的WRS水平升高更多，因此WRS的表达水平还与脓毒症的严重程度相关。可以确定WRS的表达水平越高，脓毒症症状越严重(韩国专利申请公开号10-2017-0027313)。通过检测生物样品中WRS的表达水平，可以诊断感染性疾病或感染并发症并预测它们的预后。

因此，本发明提供了一种用于诊断感染性疾病或感染并发症的组合物，所述组合物包含根据本发明的抗体或其片段作为活性成分。

所述生物样品包括生物来源的血液和其他液体样品、活检样品、固体组织样品(如组织培养物)、或源自它们的细胞。更具体的例子可包括但不限于组织、提取物、细胞裂解物、全血、血浆、血清、唾液、眼液、脑脊液、汗液、尿液、乳汁、腹水、滑液、腹膜液等等。所述样品可以从受试者获得。所述受试者包括动物，优选哺乳动物，最优选人。样品的预处理可以在用于检测之前进行。其例子可以包括过滤、蒸馏、萃取、浓缩、干扰组分的灭活、试剂的添加等。此外，可以将核酸和蛋白质从样品中分离出来并用于检测。

检测如上文所述。

在本发明中，感染意指一种或多种类型的外源性细菌(所有细菌，包括革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌)、病毒和真菌进入体内并定居、繁殖和寄生。感染性疾病可以是由于病原体感染而在活体中引起反应而发生的任何疾病。感染性疾病的反应可以包括炎症、疼痛、发烧、疲劳、水肿、血压降低等。优选地，本发明的感染性疾病包括沙门氏菌病、食物中毒、伤寒、副伤寒、肺炎、肺结核、结核病、脓毒症、脓毒性休克、尿路感染、膀胱炎、肾盂肾炎、尿道炎、前列腺炎、上呼吸道感染、和中耳炎，更优选沙门氏菌病、食物中毒、肺炎、脓毒症和脓毒性休克，并且最优选脓毒症或脓毒性休克。

在本发明中，脓毒症是作为感染性疾病的并发症出现的全身炎症反应综合征。在无法及时且准确地早期诊断脓毒症病因的情况下，脓毒症是一种致命疾病，其由于进展为严重脓毒症或脓毒性休克、多器官功能障碍综合征(MODS)(其导致肺、肾脏、肝脏、循环系统等的功能障碍)、弥散性血管内凝血综合征(DIC)、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)或急性肾衰竭(AKI)而导致死亡。

如本文所用的脓毒症包括但不限于与脓毒症的最后阶段相关的脓毒症、严重脓毒症、脓毒性休克和脓毒症并发症(如多器官功能障碍综合征(MODS)、弥散性血管内凝血综合征(DIC)、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)或急性肾衰竭(AKI))，并且包括任何阶段的脓毒症。

此外，本发明提供了所述抗体或其片段在制造用于诊断癌症的药剂中的用途。

此外，本发明提供了一种诊断癌症的方法，所述方法包括：

a)从受试者获得样品；

在一个实施方案中，本发明提供了一种诊断和治疗受试者(待测试)的癌症的方法，所述方法包括：

i)从受试者获得样品；

ii)测量所述样品中所述WRS蛋白的表达水平；

iii)当步骤ii)中测量的蛋白质完全表达时确定所述受试者患有癌症；以及iv)通过向确定的受试者施用用于治疗癌症的治疗药物(抗癌药等)、放射疗法或手术来治疗癌症。

包括步骤i)至iv)的方法应基于包括上述步骤a)至c)的方法来理解。

步骤iv)是通过向在步骤iii)中诊断患有疾病的受试者施用治疗药物(如抗癌药)、放射疗法或手术来进行疾病的治疗。

此外，本发明提供了所述抗体或其片段在制造用于诊断感染性疾病或感染并发症的药剂中的用途。

此外，本发明提供了一种诊断感染性疾病或感染并发症的方法，所述方法包括：

a)从受试者获得样品；

在一个实施方案中，本发明提供了一种诊断和治疗受试者(待测试)的感染性疾病或感染并发症的方法，所述方法包括：

i)从受试者获得样品；

ii)测量所述样品中所述WRS蛋白的表达水平；

iii)当步骤ii)中测量的蛋白质完全表达时确定所述受试者患有感染性疾病或感染并发症；以及

iv)通过向确定的受试者施用用于治疗感染性疾病或感染并发症的治疗药物或手术来治疗感染性疾病或感染并发症。

步骤iv)是通过向在步骤iii)中诊断患有疾病的受试者施用治疗药物、手术等来进行疾病的治疗。

本发明的“治疗”一般是指改善癌症或癌症症状、或者感染性疾病或感染并发症或其症状，并且可以包括消除、基本上预防或改善疾病的状况以及减轻、消除或预防由疾病引起的一种症状或大多数症状，但本发明不限于此。

在本发明中，术语“包含”或“包括”与“含有”或“特征在于”同义使用，并且意为在组合物或方法中，不排除未提及的其他构成要素或方法步骤。术语“由……组成”排除未提及的其他要素、步骤或成分。术语“基本上由……组成”意为在组合物或方法的范围内，包括所描述的构成要素或步骤，以及对其基本特性没有实质影响的构成要素或步骤。

有利效果

根据本发明的抗体或其片段特异性结合WRS，并且与包括在同一ARS家族中的其他蛋白质没有交叉反应性，因此可以检测和抑制WRS。根据本发明的抗体或其片段可以有效地用于检测WRS和诊断WRS相关疾病，如癌症、炎性疾病或感染性疾病。

附图说明

图1示出本发明中选择的特异性结合WRS的单克隆抗体的轻链可变区和重链可变区的氨基酸序列，和编码所述氨基酸序列的核苷酸序列；

图2示出在构建由SEQ ID NO:1的氨基酸序列表示的WRS蛋白(1-471)及其片段肽(48-471、1-104、1-154和48-154)后，通过电泳确认大致分子量和条带位置的结果；

图3示出使用本发明的抗体通过蛋白质印迹检测WRS蛋白(1-471)及其片段肽(48-471、1-104、1-154和48-154)的结果，以鉴定由本发明实施例中产生的单克隆抗体特异性识别的在WRS中的多肽序列；

图4示意性示出基于在图3的实验结果中确认的蛋白质印迹结果，由本发明实施例中产生的单克隆抗体特异性识别的在WRS中的多肽；

图5示出比较本发明实施例中产生的单克隆抗体与两种商业抗体的WRS结合特异性的结果；以及

图6示出关于本发明实施例中产生的单克隆抗体的交叉反应性的间接ELISA测定结果。

具体实施方式

通过以下实施例可以更好地理解本发明。这些实施例仅用于说明本发明，而不应解释为限制本发明的范围。

实施例1：单克隆抗体的产生

(1)杂交瘤细胞的产生

1)动物免疫和细胞融合

-免疫原的制备：1.5至2mg WRS蛋白(纯度>75％，浓度>0.4mg/ml)

-动物免疫：通过将免疫原接种到Balb/c小鼠中来诱导抗体产生。

-细胞融合：通过小鼠B细胞和小鼠骨髓瘤细胞的电融合获得至少10,000个杂交瘤细胞。

2)杂交瘤细胞的选择

-初级选择：通过间接ELISA来选择产生抗原结合抗体的杂交瘤细胞。

-二级选择：使用在初级选择中获得的阳性克隆通过蛋白质印迹选择与抗原结合的一种杂交瘤细胞系，并且从选择的杂交瘤细胞系产生的抗体命名为4D10G6。

-分型：对在选择过程中具有最佳结果的五种克隆进行分型。

3)亚克隆、细胞扩增、冷冻保存和抗体产生

-亚克隆、细胞扩增、和冷冻保存：对结果良好的克隆进行亚克隆、细胞扩增、和冷冻保存。

-抗体产生：从在选择过程中具有最佳结果的杂交瘤细胞系产生至少2mg的量的抗体。

2.腹水的形成

1)在小鼠适应至少3天后，以100μl/小鼠的量向小鼠施用姥鲛烷佐剂。培养杂交瘤细胞系，使其可以在施用姥鲛烷佐剂后5至7天注射。

2)将培养的杂交瘤细胞系收集在50ml管中，用10ml PBS洗涤三次，并离心。

3)离心后吸去上清，之后计算每100μl所需的细胞数量，添加1X PBS，混合均匀，并然后转移至1.5ml管中。

4)将上述溶液置于1ml注射器中，并通过向上转动注射器针头以除去注射器中的空气。

5)每只Balb/c小鼠腹膜内注射100μl溶液，之后将小鼠置于笼中，并观察有无腹水。

6)从将杂交瘤细胞系注射到小鼠体内后5天起，每天观察腹胀。

7)当注意到腹胀时，使用具有23G或更小的注射针的产品(使用3ml或5ml注射器)从小鼠的腹腔收集腹水。

8)将收集并置于管中的腹水在室温下孵育10min以使红细胞聚集，随后离心。

9)离心后，仅将上清液置于新的1.5ml管中，并在-70℃储存。

3.抗体的产生

1)取出产生的-70℃下的腹水，并在4℃下解冻，并通过确认待纯化的抗体的亚型来确定待使用的珠的类型。使用的珠的量是腹水体积的0.5倍。

2)将混合均匀的蛋白A珠或G珠以计算量置于5ml色谱柱中，并通过使5ml的1X PBS流入柱中进行珠洗涤。

3)洗涤完成后，将解冻的腹水置于柱中，并将柱封盖。

4)在4℃下旋转结合1小时，使珠和抗体彼此结合。

5)旋转结合后，对整个溶液进行流通过程。

6)使用100ml的1X PBS进行柱洗涤。

7)将100μl中和缓冲液添加至1.5ml管中，并且向柱中添加1ml的IgG洗脱缓冲液，以使得在IgG洗脱后能够立即进行中和。在相同条件下共获得10种级分。

8)将每种级分的一部分上样到12％SDS-PAGE凝胶上，并通过凝胶染色确认条带。在染色过程中，将级分在4℃储存。

9)收集具有明显条带的级分，置于透析管件中，并用夹子密封以防止泄漏。将透析管件和搅拌棒置于含有1L 1X PBS的烧杯中，并使用搅拌器在4℃下进行透析1小时。

10)在与上述9)相同的条件下，使用1L新鲜的1X PBS进行透析过夜(15小时)。

11)第二天，从透析管件中收集溶液并立即使用BCA测定试剂盒进行定量。

实施例2：测序

根据TRIzol试剂的技术手册从杂交瘤细胞中分离总RNA。根据PrimeScript第1链cDNA合成试剂盒的技术手册，使用通用引物将总RNA逆转录为cDNA。将重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的抗体片段通过RACD(cDNA末端快速扩增)扩增。将扩增的抗体片段单独克隆到标准克隆载体中。进行菌落PCR以筛选具有正确大小插入物的克隆。对于每个片段，至少对5个具有正确大小的插入物的菌落进行测序。比对不同克隆的序列，并提供这些克隆的共有序列。

本发明的测序单克隆抗体的轻链和重链可变区氨基酸序列和编码所述氨基酸序列的多核苷酸序列展示于图1中。

实施例3：由单克隆抗体特异性结合的在WRS中的多肽的鉴定

为了鉴定由在实施例1中产生的单克隆抗体识别的多肽区域，制备由471个氨基酸组成的SEQ ID NO:1的WRS蛋白(1-471)和蛋白片段(48-471、1-104、1-154和45-154)。

1)为了纯化重组WRS蛋白及其片段肽，将用于蛋白质表达的感受态细胞用WRS蛋白和其片段基因克隆到pET28a载体中的质粒转化。

2)将经转化的细胞涂布在LB(+卡那霉素)板上，随后在37℃培养15小时。

3)第二天，将单菌落接种到3ml LB(+Kan)中，随后在200rpm和37℃下培养3小时。

4)将所有小培养的细胞置于500ml LB(+Kan)中，随后在37℃和200rpm下培养4小时。

5)当测量到0.8<OD值<1时，向其中添加250μl 1M IPTG原液(最终0.5mM IPTG)，随后在18℃和200rpm下诱导过夜(15小时)。

6)第二天，将诱导处理的细胞在4,000rpm下离心10min。

7)去除上清液，并将沉淀悬浮在10ml洗涤缓冲液1中。

8)使用超声波仪裂解细胞。用35％AMPL处理2秒并在冰上储存1min。该过程重复14次(总共15次超声处理)。

9)在15,000rpm和4℃下离心30min以将沉淀和上清液彼此分离。

10)将200μl Ni-NTA珠置于poly-prep色谱柱中，并添加5ml洗涤缓冲液1以达到平衡。

11)离心后，使用0.45μm过滤器在50ml管中过滤上清液，并使其流入含有珠的柱中。再次进行该程序。

12)使用洗涤缓冲液1进行洗涤。

13)使用洗涤缓冲液2进行洗涤。

14)使用洗涤缓冲液3进行洗涤。

15)使用洗涤缓冲液4进行洗涤。

16)将经洗涤的柱置于1.5ml管中，并然后使洗脱缓冲液通过其中，并由此收集洗脱物。

17)将5X样品缓冲液和DW置于5ml管中并进行流过过程，并向其中添加洗涤缓冲液和洗脱物，然后在加热块中煮沸5min。

18)将预制的15孔梳和15％SDS-PAGE凝胶组装在盒中，将盒置于槽中，并将凝胶和槽用1X运行缓冲液填充。

19)依序上样蛋白质标记和样品。

20)在凝胶上样过程中，将透析管件在DW浴中在100℃加热10min。用新鲜的DW替换DW，并再重复两次DW浴中的加热过程，随后使用200ml冷的1X PBS冷却。

21)上样后，将凝胶从盒分离，并通过倒入速蓝进行染色，直到凝胶被淹没(图2)。

使用通过上述方法产生的WRS蛋白、其片段和在实施例1中产生的单克隆抗体作为一抗，根据典型方法进行蛋白质印迹。

结果如图3中所示，确认了单克隆抗体特异性识别由在由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成的WRS蛋白的第1-471个氨基酸中的第48至104个氨基酸组成的片段(SEQ ID NO:2)。实施例4：抗体结合亲和力分析

为了评价实施例1中产生的单克隆抗体和两种商业抗体(Abnova，抗WRS抗体(目录号H00007453-M02)和Novus biological，抗WRS抗体(目录号NBP2-32186))对SEQ ID NO:1的全长WRS蛋白的结合亲和力，进行间接ELISA测定。

简而言之，根据以下方法评价抗体的结合亲和力。

1)将WRS蛋白在PBS中稀释至1μg/ml，以100μl/孔的量加载到96孔板中，并在室温下反应1小时，由此用所述蛋白包被孔。

2)包被完成后，用PBST(0.05％Tween-20)缓冲液进行洗涤一次，并分配3％BSA和PBST(0.1％Tween-20)，随后在室温下封闭反应1小时。

3)根据每个浓度用封闭缓冲液稀释生物素附着的抗体，然后在室温下反应1小时。

4)用PBST(0.05％Tween-20)进行洗涤。

5)用封闭缓冲液稀释链霉亲和素-HRP，随后在室温下反应1小时。

6)用PBST(0.05％Tween-20)进行洗涤五次，以除去所有未附着的残余物。

7)向其中添加50μl/孔的TMB，随后在室温下反应5min，之后添加相同量的2M H₂SO₄以终止反应。

8)使用分光光度计(Sunrise，Tecan)(450nm)测量吸光度。

9)EC₅₀值由上述8)的结果计算。

其结果示于下表1中。

[表1]

	4D10G6	Abnova	Novus
				EC<sub>50</sub>	40.5	1655.6	532.8

如从表1中明显的，确认了与两种商业抗体相比，根据本发明的抗体展现出对WRS蛋白非常高的亲和力。

实施例5：抗体结合特异性分析

为了评价实施例1中产生的单克隆抗体和两种商业抗体(Abnova，抗WRS抗体(目录号H00007453-M02)和Novus biological，抗WRS抗体(目录号NBP2-32186))的结合特异性，将20μg HCT116细胞裂解物在以下条件下用一抗和二抗各自进行处理，并且根据典型方法进行蛋白质印迹。

*一抗(室温，1小时)

4D10G6：1μg/ml

Abnova Ab：1:5,000稀释

Novus Ab：1:10,000稀释

*二抗(室温，1小时)

抗小鼠HRP(Millipore，AP181P)：1:10,000稀释:Abnova，4D10G6

抗兔HRP(Millipore，AP187P)：1:10,000稀释:Novus

其结果示于图5中。

如图5中所示，确认了根据本发明的抗体都显示出单个条带，而在两种商业抗体中出现了几个条带。

因此，确认了根据本发明的抗体与商业抗体相比展现出非常高的结合特异性。

实施例6：交叉反应性的验证

为了评价实施例1中产生的单克隆抗体是否展现出与除WRS之外的由细胞分泌的其他ARS(氨酰-tRNA合成酶)蛋白CRS(半胱氨酰-tRNA合成酶)、AIMP1(氨酰tRNA合成酶复合多功能相互作用蛋白1)、GRS(甘氨酰tRNA合成酶)和KRS(赖氨酰tRNA合成酶)的交叉反应性，根据以下方法进行间接ELISA测定。

1)抗原包被：在PBS中1μg/ml，100μl/孔，4℃，过夜包被

2)洗涤：0.05％PBST(0.05％Tween 20)，200μl/孔，3次

3)封闭：0.05％PBST中的0.5％BSA，200μl/孔，RT，1小时

4)一抗结合：在0.05％PBST中500ng/ml，100μl/孔，RT，1小时

5)二抗结合：抗小鼠HRP(AP160P)1:10,000于0.05％PBST中，100μl/孔，RT，1小时6)TMB检测

7)反应终止(2M H₂SO₄)

8)吸光度测量：450nm

其结果示于图6中。

如图6中所示，确认了根据本发明的抗体不与WRS以外的ARS蛋白结合。

实用性

根据本发明的抗体或其片段特异性结合WRS，并且与在同一ARS家族中包括的其他蛋白质无交叉反应性，从而可以检测并抑制WRS，并且因此可有效用于检测WRS和诊断WRS相关疾病(如癌症、炎性疾病或感染性疾病)，由此展现出很高的工业实用性。

<110> JW生物科学股份有限公司

疗法株式会社

<120> 特异性结合WRS蛋白的抗体及其用途

<130> OP20-0032/PCT

<150> KR 10-2019-0087233

<151> 2019-07-18

<160> 10

<170> KoPatentIn 3.0

<210> 1

<211> 471

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人色氨酰-tRNA合成酶 (WRS)全长

<400> 1

Met Pro Asn Ser Glu Pro Ala Ser Leu Leu Glu Leu Phe Asn Ser Ile

1 5 10 15

Ala Thr Gln Gly Glu Leu Val Arg Ser Leu Lys Ala Gly Asn Ala Ser

20 25 30

Lys Asp Glu Ile Asp Ser Ala Val Lys Met Leu Val Ser Leu Lys Met

35 40 45

Ser Tyr Lys Ala Ala Ala Gly Glu Asp Tyr Lys Ala Asp Cys Pro Pro

50 55 60

Gly Asn Pro Ala Pro Thr Ser Asn His Gly Pro Asp Ala Thr Glu Ala

65 70 75 80

Glu Glu Asp Phe Val Asp Pro Trp Thr Val Gln Thr Ser Ser Ala Lys

85 90 95

Gly Ile Asp Tyr Asp Lys Leu Ile Val Arg Phe Gly Ser Ser Lys Ile

100 105 110

Asp Lys Glu Leu Ile Asn Arg Ile Glu Arg Ala Thr Gly Gln Arg Pro

115 120 125

His His Phe Leu Arg Arg Gly Ile Phe Phe Ser His Arg Asp Met Asn

130 135 140

Gln Val Leu Asp Ala Tyr Glu Asn Lys Lys Pro Phe Tyr Leu Tyr Thr

145 150 155 160

Gly Arg Gly Pro Ser Ser Glu Ala Met His Val Gly His Leu Ile Pro

165 170 175

Phe Ile Phe Thr Lys Trp Leu Gln Asp Val Phe Asn Val Pro Leu Val

180 185 190

Ile Gln Met Thr Asp Asp Glu Lys Tyr Leu Trp Lys Asp Leu Thr Leu

195 200 205

Asp Gln Ala Tyr Ser Tyr Ala Val Glu Asn Ala Lys Asp Ile Ile Ala

210 215 220

Cys Gly Phe Asp Ile Asn Lys Thr Phe Ile Phe Ser Asp Leu Asp Tyr

225 230 235 240

Met Gly Met Ser Ser Gly Phe Tyr Lys Asn Val Val Lys Ile Gln Lys

245 250 255

His Val Thr Phe Asn Gln Val Lys Gly Ile Phe Gly Phe Thr Asp Ser

260 265 270

Asp Cys Ile Gly Lys Ile Ser Phe Pro Ala Ile Gln Ala Ala Pro Ser

275 280 285

Phe Ser Asn Ser Phe Pro Gln Ile Phe Arg Asp Arg Thr Asp Ile Gln

290 295 300

Cys Leu Ile Pro Cys Ala Ile Asp Gln Asp Pro Tyr Phe Arg Met Thr

305 310 315 320

Arg Asp Val Ala Pro Arg Ile Gly Tyr Pro Lys Pro Ala Leu Leu His

325 330 335

Ser Thr Phe Phe Pro Ala Leu Gln Gly Ala Gln Thr Lys Met Ser Ala

340 345 350

Ser Asp Pro Asn Ser Ser Ile Phe Leu Thr Asp Thr Ala Lys Gln Ile

355 360 365

Lys Thr Lys Val Asn Lys His Ala Phe Ser Gly Gly Arg Asp Thr Ile

370 375 380

Glu Glu His Arg Gln Phe Gly Gly Asn Cys Asp Val Asp Val Ser Phe

385 390 395 400

Met Tyr Leu Thr Phe Phe Leu Glu Asp Asp Asp Lys Leu Glu Gln Ile

405 410 415

Arg Lys Asp Tyr Thr Ser Gly Ala Met Leu Thr Gly Glu Leu Lys Lys

420 425 430

Ala Leu Ile Glu Val Leu Gln Pro Leu Ile Ala Glu His Gln Ala Arg

435 440 445

Arg Lys Glu Val Thr Asp Glu Ile Val Lys Glu Phe Met Thr Pro Arg

450 455 460

Lys Leu Ser Phe Asp Phe Gln

465 470

<210> 2

<211> 57

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人色氨酰-tRNA合成酶的肽片段

<400> 2

Met Ser Tyr Lys Ala Ala Ala Gly Glu Asp Tyr Lys Ala Asp Cys Pro

1 5 10 15

Pro Gly Asn Pro Ala Pro Thr Ser Asn His Gly Pro Asp Ala Thr Glu

20 25 30

Ala Glu Glu Asp Phe Val Asp Pro Trp Thr Val Gln Thr Ser Ser Ala

35 40 45

Lys Gly Ile Asp Tyr Asp Lys Leu Ile

50 55

<210> 3

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 抗-WRS单抗抗体轻链CDR1

<400> 3

Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn

1 5 10

<210> 4

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 抗-WRS单抗抗体轻链CDR2

<400> 4

Gly Thr Asn Asn Arg Ala Pro

1 5

<210> 5

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 抗-WRS单抗抗体轻链CDR3

<400> 5

Val Leu Trp Tyr Ser Asn His Trp Val

1 5

<210> 6

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 抗-WRS单抗抗体重链CDR1

<400> 6

Asp Tyr Asn Met Asn

1 5

<210> 7

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 抗-WRS单抗抗体重链CDR2

<400> 7

Val Ile Asn Pro Asn Tyr Gly Thr Ile Arg Tyr Asn Gln Lys Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 8

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 抗-WRS单抗抗体重链CDR3

<400> 8

Leu Leu Arg Gly Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr

1 5 10

<210> 9

<211> 128

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 抗-WRS单抗抗体轻链可变区

<400> 9

Met Ala Trp Ile Ser Leu Ile Leu Ser Leu Leu Ala Leu Ser Ser Gly

1 5 10 15

Ala Ile Ser Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Ser Ala Leu Thr Thr Ser

20 25 30

Pro Gly Glu Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val

35 40 45

Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Asp His Leu

50 55 60

Phe Thr Gly Leu Ile Gly Gly Thr Asn Asn Arg Ala Pro Gly Val Pro

65 70 75 80

Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Ile Gly Asp Lys Ala Ala Leu Thr Ile

85 90 95

Thr Gly Ala Gln Thr Glu Asp Glu Ala Ile Tyr Phe Cys Val Leu Trp

100 105 110

Tyr Ser Asn His Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

115 120 125

<210> 10

<211> 138

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 抗-WRS单抗抗体重链可变区

<400> 10

Met Gly Trp Ser Trp Ile Phe Leu Leu Leu Leu Ser Gly Thr Ala Gly

1 5 10 15

Val His Ser Glu Phe Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys

20 25 30

Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe

35 40 45

Ile Asp Tyr Asn Met Asn Trp Val Lys Gln Ser Asn Gly Lys Ser Leu

50 55 60

Glu Trp Ile Gly Val Ile Asn Pro Asn Tyr Gly Thr Ile Arg Tyr Asn

65 70 75 80

Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Gln Ser Ser Ser

85 90 95

Thr Ala Tyr Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val

100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Gly Leu Leu Arg Gly Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp

115 120 125

Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

130 135

Claims

1.一种与WRS(色氨酰-tRNA合成酶)蛋白中的包含由SEQ ID NO:2表示的氨基酸序列的多肽特异性结合的抗体或其片段。

2.根据权利要求1所述的抗体或其片段，其中所述抗体包含如下抗体轻链可变区(VL)和抗体重链可变区(VH)，所述抗体轻链可变区(VL)包含含有由SEQ ID NO:3表示的氨基酸序列的互补决定区(CDR)L1、含有由SEQ ID NO:4表示的氨基酸序列的互补决定区(CDR)L2、含有由SEQ ID NO:5表示的氨基酸序列的互补决定区(CDR)L3，所述抗体重链可变区(VH)包含含有由SEQ ID NO:6表示的氨基酸序列的互补决定区(CDR)H1、含有由SEQ ID NO:7表示的氨基酸序列的互补决定区(CDR)H2和含有由SEQ ID NO:8表示的氨基酸序列的互补决定区(CDR)H3。

3.根据权利要求1所述的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段包含如下轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区包含由SEQ ID NO:9表示的氨基酸序列，所述重链可变区包含由SEQ ID NO:10表示的氨基酸序列。

4.根据权利要求1所述的抗体或其片段，其中所述抗体是单克隆抗体。

5.根据权利要求1所述的抗体或其片段，其中所述抗体选自IgG、IgA、IgM、IgE和IgD。

6.根据权利要求1所述的抗体或其片段，其中所述抗体的片段选自双抗体、Fab、Fab’、F(ab)2、F(ab’)2、Fv和scFv。

7.一种编码根据权利要求1至6中任一项所述的抗体或其片段的多核苷酸。

8.一种包含根据权利要求7所述的多核苷酸的载体。

9.一种用根据权利要求8所述的载体转化的细胞。

10.一种产生与WRS结合的抗体或其片段的方法，所述方法包括：

通过在使多核苷酸表达的条件下培养根据权利要求9所述的细胞来产生包含轻链可变区和重链可变区的多肽；以及

从所述细胞或培养所述细胞的培养基中回收所述多肽。

11.一种用于诊断癌症的组合物，所述组合物包含根据权利要求1至6中任一项所述的抗体或其片段。

12.一种用于诊断感染性疾病或感染并发症的组合物，所述组合物包含根据权利要求1至6中任一项所述的抗体或其片段。

13.根据权利要求12所述的组合物，其中所述感染性疾病是感染性炎性疾病。

14.根据权利要求13所述的组合物，其中所述感染性炎性疾病是脓毒症或脓毒性休克。

15.根据权利要求1至6中任一项所述的抗体或其片段在制造用于诊断癌症的药剂中的用途。

16.一种诊断癌症的方法，所述方法包括：

a)从受试者获得样品；

b)使用根据权利要求1至6中任一项所述的抗体或其片段测量所述样品中的WRS蛋白表达水平；以及

17.根据权利要求1至6中任一项所述的抗体或其片段在制造用于诊断感染性疾病或感染并发症的药剂中的用途。

18.一种诊断感染性疾病或感染并发症的方法，所述方法包括：

a)从受试者获得样品；