KR20230153308A - 항-wars1 항체를 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명의 항-WARS1 항체를 유효성분으로 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 의한 항-WARS1 항체를 만성폐쇄성폐질환, 염증성 장질환, 류마티스 관절염, 아토피 피부염 마우스 모델에 각각 투여한 결과, 각각의 모델 마우스에서 염증 반응을 억제하여 질환에 대한 치료효과를 나타내었다. 따라서, 본 발명에 의한 항-WARS1 항체는 만성폐쇄성폐질환, 염증성 장질환, 류마티스 관절염, 아토피 피부염 등과 같은 염증성 질환의 치료 용도로 효과적으로 사용될 수 있다.

Description

항-WARS1 항체를 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물{PHARMACEUTICAL COMPOSITION COMPRISING ANTI WARS1 ANTIBODY FOR PREVENTING OR TREATING INFLAMMATORY DISEASE}

본 발명은 WARS1 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 유효성분으로 포함하는 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

아미노아실 티알엔에이 합성효소(aminoacyl-tRNA synthetase, ARS)는 아미노산을 특이적으로 tRNA에 결합시키는 반응을 매개하는 효소로서, 단백질 생성에 중추적인 역할을 담당한다. 최근, 상기 ARS가 단백질 생성 외에도 세포사멸(apoptosis), 혈관형성(angiogenesis), 염증반응 등 다양한 생명현상에 관여하고 있음이 알려져 있다. ARS 중 인간 트립토파닐 티알엔에이 합성효소 1(tryptophanyl-tRNA synthetase 1, WARS1)은 트립토판을 인지하는 tRNA와 트립토판을 연결하는 아미노아실 티알엔에이 합성효소로서, 최근에는 감염에 대한 숙주 방어 기전에 있어서의 WARS1의 역할에 대해 관심이 높아지고 있다. 본 발명자들은 이전에, 단핵구가 세균 감염 후 수분 이내에 신규(de novo) 합성 없이 세포 내 존재하는 WARS1을 세포 밖으로 분비한다는 것을 보고하였다(Young Ha Ahn. et al. Nature Microbiology (2016) 2:16191).

분비된 WARS1은 TLR4와 TLR2의 내생 리간드로 기능함으로써, 대식세포를 활성화하여 선천적인 면역의 활성화를 유도한다. 또한, WARS1은 TNF-α, IL-6, MIP-1α, IL-8을 포함하는 전염증성 사이토카인 및 케모카인 생산을 개시하고 호중구의 침윤을 유발한다. 이후 WARS1 유전자의 발현이 IFN-γ에 의해 유도되어 WARS1의 지속적인 분비를 유지한다.

이를 반영하여 세균, 바이러스 및/또는 곰팡이에 의한 감염성 및/또는 염증성 질환의 치료를 위해 항-WARS1 항체를 개발하는 전략을 생각해 볼 수 있다. 그러나, WARS1을 포함하는 ARS들은 단백질 구조상 유사한 점이 많아, 면역반응으로 얻어지는 항체는 다른 ARS에도 교차 반응을 보이는 등 고감도의 항체가 생성되지 않는 경우가 많다.

따라서, 다른 ARS에 대한 교차 반응 없이 WARS1에만 특이적으로 결합하여 WARS1을 효과적으로 중화할 수 있는 항체의 개발이 절실한 상황이다.

Young Ha Ahn. et al. Nature Microbiology (2016) 2:16191.

본 발명자들은 만성폐쇄성폐질환(chronic obstructive pulmonary disease:COPD), 염증성 장질환(inflammatory bowel disease:IBD), 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis:RA), 아토피 피부염(atopic dermatitis:AD) 등과 같은 염증 질환 환자에서 그 발현량이 현저히 증가하는 WARS1에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 단편을 발굴하고자 노력하였다. 그 결과, WARS1에 특이적으로 결합하면서 염증 반응을 억제하는 신규한 항-WARS1 항체를 제조하고, 그의 약리 활성을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 측면은 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 H-CDR1, 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 H-CDR2 및 서열변호 7의 아미노산 서열을 포함하는 H-CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역; 및 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 L-CDR1, 서열번호 14 및 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 L-CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역;으로 이루어진 항체 또는 이의 단편을 유효성분으로 포함하는 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명에 의한 항-WARS1 항체를 만성폐쇄성폐질환(COPD), 염증성 장질환(IBD), 류마티스 관절염(RA), 아토피 피부염(AD) 마우스 모델에 각각 투여한 결과, 각각의 모델 마우스에서 염증 반응을 억제하여 질환에 대한 치료 효과를 나타내었다. 따라서, 본 발명에 의한 항-WARS1 항체는 만성폐쇄성폐질환, 염증성 장질환, 류마티스 관절염, 아토피 피부염 등과 같은 염증성 질환의 치료 용도로 효과적으로 사용될 수 있다.

도 1은 GKB101 항체의 중쇄를 발현시키기 위한 벡터의 모식도이다.
도 2는 GKB101 항체의 경쇄를 발현시키기 위한 벡터의 모식도이다.
도 3은 COPD 마우스 모델에서 생리식염수(COPD_CTL), Dexa(COPD_Dexa), GKB101 항체 또는 Roflumilast를 투여한 뒤, 마우스의 기관지 폐포 세척액(BALF) 내의 BAL세포(A), 폐세포(B), Peyer's patch세포(C) 및 호중구(D)의 총 수를 확인한 결과를 나타낸 그래프이다. 이때, Normal은 무처리군이다.
도 4는 COPD 마우스 모델에서 생리식염수(COPD_CTL), Dexa(COPD_Dexa), GKB101 항체 또는 Roflumilast를 투여한 뒤, 마우스의 기관지 폐포세척액(BALF) 내의 호중구를 cytospin을 이용하여 면역염색한 후 광학 현미경으로 관찰한 결과를 나타낸 도면이다. 이때, 정상군은 무처리군이다.
도 5는 COPD 마우스 모델에서 생리식염수(COPD_CTL), Dexa(COPD_Dexa), GKB101 항체 또는 Roflumilast를 투여한 뒤, 마우스의 혈액 내 백혈구 수를 계수한 결과(A), 호중구 및 림프구를 계수하여 빈도수(%)로 나타낸 결과(B), 및 단핵구, 호중구 및 호산구를 계수하여 빈도수(%)(C)로 나타낸 그래프이다. 이때, Normal은 무처리군이다.
도 6은 COPD 마우스 모델에서 생리식염수(COPD_CTL), Dexa(COPD_Dexa), GKB101 항체 또는 Roflumilast를 투여한 뒤, 마우스의 기관지 폐포세척액 내의 CXCL-1(A), MIP2(B), IL-17(C) 및 TNF-α(D)의 농도를 측정하여 나타낸 그래프이다. 이때, Normal은 무처리군이다.
도 7은 COPD 마우스 모델에서 생리식염수(COPD_CTL), Dexa(COPD_Dexa), GKB101 항체 또는 Roflumilast를 투여한 뒤, 마우스 혈청 내의 SDMA 농도를 측정하여 나타낸 그래프이다. 이때, Normal은 무처리군이다.
도 8a 및 도 8b는 COPD 마우스 모델에서 생리식염수(COPD_CTL), Dexa(COPD_Dexa), GKB101 항체 또는 Roflumilast를 투여한 뒤, 마우스 폐조직 내의 염증성 사이토카인(MUC5AC(A), TRPA1(B), CXCL-1(C), TARC(D), COX-2(E), TNF-α(F), TRPV1(G), NOS-II(H)의 유전자 발현을 q-PCR을 통해 확인한 결과를 나타낸 그래프이다. 이때, Normal은 무처리군이다.
도 9는 COPD 마우스 모델에서 생리식염수(COPD_CTL), Dexa(COPD_Dexa), GKB101 항체 또는 Roflumilast를 투여한 뒤, 마우스 폐조직의 병리학적 형태를 H&E 염색, M-T(Masson's trichrome) 염색 및 PAS(periodic acid-Schiff) 염색 방법을 이용하여 광학 현미경으로 관찰한 결과를 나타낸 도면이다. 이때, Normal은 무처리군이다.
도 10은 COPD 마우스 모델에서 생리식염수(COPD_CTL), Dexa(COPD_Dexa), GKB101 항체 또는 Roflumilast를 투여한 뒤, 마우스 기도조직을 PAS 염색을 이용하여 광학 현미경으로 관찰한 결과를 나타낸 도면이다. 이때, Normal은 무처리군이다.
도 11은 COPD 마우스 모델에서 생리식염수(COPD_CTL), Dexa(COPD_Dexa), GKB101 항체 또는 Roflumilast를 투여한 뒤, 마우스 폐조직에서 CXCL-1의 발현을 면역조직화학염색법(immunohistochemistry)을 이용하여 형광 현미경으로 관찰한 결과를 나타낸 도면이다. 이때, normal(Nr)은 무처리군이다.
도 12는 COPD 마우스 모델에서 생리식염수(COPD_CTL), Dexa(COPD_Dexa), GKB101 항체 또는 Roflumilast를 투여한 뒤, 마우스 폐조직에서 CXCL-1의 발현을 면역조직화학염색법(immunohistochemistry)을 이용하여 형광 현미경으로 관찰한 결과를 정량화하여 나타낸 그래프이다. 이때, Normal은 무처리군이다.
도 13은 COPD 마우스 모델에서 생리식염수(COPD_CTL), Dexa(COPD_Dexa), GKB101 항체 또는 Roflumilast를 투여한 뒤, 마우스 폐조직에서 TNF-α의 발현을 면역조직화학염색법(immunohistochemistry)을 이용하여 형광 현미경으로 관찰한 결과를 나타낸 도면이다. 이때, normal(Nr)은 무처리군이다.
도 14는 COPD 마우스 모델에서 생리식염수(COPD_CTL), Dexa(COPD_Dexa), GKB101 항체 또는 Roflumilast를 투여한 뒤, 마우스 폐조직에서 TNF-α의 발현을 면역조직화학염색법(immunohistochemistry)을 이용하여 형광 현미경으로 관찰한 결과를 정량화하여 나타낸 그래프이다. 이때, Normal은 무처리군이다.
도 15는 COPD 마우스 모델에서 생리식염수(COPD_CTL), Dexa(COPD_Dexa), GKB101 항체 또는 Roflumilast를 투여한 뒤, 마우스 폐조직에서 IRAK-1 단백질의 발현을 면역조직화학염색법(immunohistochemistry)을 이용하여 형광 현미경으로 관찰한 결과를 나타낸 도면이다. 이때, normal(Nr)은 무처리군이다.
도 16은 COPD 마우스 모델에서 생리식염수(COPD_CTL), Dexa(COPD_Dexa), GKB101 항체 또는 Roflumilast를 투여한 뒤, 마우스 폐조직에서 IRAK1 단백질의 발현을 면역조직화학염색법(immunohistochemistry)을 이용하여 형광 현미경으로 관찰한 결과를 정량화하여 나타낸 그래프이다. 이때, Normal은 무처리군이다.
도 17a 및 도 17b는 COPD 마우스 모델에서 생리식염수(COPD_CTL), Dexa(COPD_Dexa), GKB101 항체 또는 Roflumilast를 투여한 뒤, 마우스 기관지 폐포세척액(BALF) 및 폐조직 내의 면역세포(림프구, 호중구, 호산구 및 활성화된 대식세포) 및 면역세포의 절대세포 수를 유세포 분석기를 통해 분석한 결과를 나타낸 도면이다. 이때, Normal은 무처리군이다. A~F: 면역세포 총 수, G~K: 면역세포 절대수(전체 세포의 10⁵ 세포 당 포함된 면역세포의 수)
도 18a 및 도 18b는 COPD 마우스 모델에서 생리식염수(COPD_CTL), Dexa(COPD_Dexa), GKB101 항체 또는 Roflumilast를 투여한 뒤, 마우스 폐조직 내의 면역세포 유형(림프구, 호중구, 호산구 및 활성화된 대식세포) 및 면역세포의 절대세포 수를 유세포 분석기를 통해 분석한 결과를 나타낸 그래프이다. 이때, Normal은 무처리군이다. A~F: 면역세포 총 수, G~L: 면역세포 절대수(전체 세포의 10⁵ 세포 당 포함된 면역세포의 수)
도 19a 및 도 19b는 COPD 마우스 모델에서 생리식염수(COPD_CTL), Dexa(COPD_Dexa), GKB101 항체 또는 Roflumilast를 투여한 뒤, 마우스 Peyer's patch 내의 면역세포(림프구, 호중구, 호산구 및 활성화된 대식세포) 및 면역세포의 절대세포 수를 유세포 분석기를 통해 분석한 결과를 나타낸 도면이다. 이때, Normal은 무처리군이다. A~D: 면역세포 총 수, E~H: 면역세포 절대수(전체 세포의 10⁵ 세포 당 포함된 면역세포의 수)
도 20은 COPD 마우스 모델에서 생리식염수(COPD_CTL), Dexa(COPD_Dexa), GKB101 항체 또는 Roflumilast를 투여한 뒤, 마우스의 말초혈액 세포 내의 면역세포를 유세포 분석기를 통해 분석한 결과를 빈도수(%)로 나타낸 그래프이다. 이때, Normal은 무처리군이다.
도 21은 DSS(dextran sulfate sodium-induced colitis) 마우스 모델을 이용하여 GKB101 항체의 염증성 장질환 개선 효과를 확인하기 위한 실험군 구성을 나타낸 도면이다.
도 22는 DSS 마우스 모델을 이용한 GKB101 항체의 염증성 장질환 개선 효과를 평가하기 위한 임상활성지수(disease activity index: DAI)를 부여하는 임상지표 결정 기준을 나타낸 도면이다.
도 23은 DSS 마우스 모델에서 PBS, Isotype IgG1, GKB101 항체 또는 항-TNF-α 항체 투여 후, 각 투여군의 임상활성지수를 평가한 결과를 나타낸 그래프이다. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 vs IgG1 처리군
도 24는 DSS 마우스 모델에서 PBS, Isotype IgG1, GKB101 항체 또는 항-TNF-α 항체 투여 후, 각 투여군의 임상활성지수를 평가한 결과의 AUC(area under curve)를 나타낸 그래프이다. *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 vs PBS 처리군
도 25는 DSS 마우스 모델에서 PBS, Isotype IgG1, GKB101 항체 또는 항-TNF-α 항체 투여 후, 각 투여군의 체중감소 스코어를 평가한 결과를 나타낸 그래프이다. *P<0.05 vs PBS 처리군
도 26은 DSS 마우스 모델에서 PBS, Isotype IgG1, GKB101 항체 또는 항-TNF-α 항체 투여 후, 각 투여군의 체중감소 스코어를 평가한 결과의 AUC(area under curve)를 나타낸 그래프이다.
도 27은 DSS 마우스 모델에서 PBS, Isotype IgG1, GKB101 항체 또는 항-TNF-α 항체 투여 후, 각 투여군의 대변의 일관성(stool consistency) 스코어를 평가한 결과를 나타낸 그래프이다. *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 vs PBS 처리군
도 28은 DSS 마우스 모델에서 PBS, Isotype IgG1, GKB101 항체 또는 항-TNF-α 항체 투여 후, 각 투여군의 대변의 일관성(stool consistency) 스코어를 평가한 결과의 AUC를 나타낸 그래프이다. *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 vs PBS 처리군
도 29는 DSS 마우스 모델에서 PBS, Isotype IgG1, GKB101 항체 또는 항-TNF-α 항체 투여 후, 각 투여군의 장 출혈(intestinal bleeding) 스코어를 평가한 결과를 나타낸 그래프이다. *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 vs PBS 처리군
도 30은 DSS 마우스 모델에서 PBS, Isotype IgG1, GKB101 항체 또는 항-TNF-α 항체 투여 후, 각 투여군의 장 출혈(intestinal bleeding) 스코어를 평가한 결과의 AUC를 나타낸 그래프이다. *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 vs PBS 처리군
도 31은 DSS 마우스 모델에서 PBS, Isotype IgG1, GKB101 항체 또는 항-TNF-α 항체 투여 후, 각 투여군의 대장 조직의 길이를 측정한 결과를 나타낸 도면이다. 이때, Normal은 무처리군이다.
도 32는 DSS 마우스 모델에서 PBS, Isotype IgG1, GKB101 항체 또는 항-TNF-α 항체 투여 후, 각 투여군의 대장 조직의 길이를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다. 이때, Normal은 무처리군이다. *P<0.05, ***P<0.001 vs PBS 처리군
도 33은 DSS 마우스 모델에서 PBS, Isotype IgG1, GKB101 항체 또는 항-TNF-α 항체 투여 후, 대변이 제거된 각 투여군의 대장 조직의 무게를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다. *P<0.05, **P<0.001, ***P<0.001 vs PBS 처리군
도 34는 DSS 마우스 모델에서 PBS, Isotype IgG1, GKB101 항체 또는 항-TNF-α 항체 투여 후, 각 투여군의 대장 조직의 형태학적 평가를 위한 항목 및 지표 기준을 나타낸 도면이다.
도 35는 DSS 마우스 모델에서 PBS, Isotype IgG1, GKB101 항체 또는 항-TNF-α 항체 투여 후, 각 투여군의 대장 조직의 형태학적 평가를 위해 대장 조직을 H&E로 염색하여 관찰한 결과를 나타낸 도면이다. Scale bars: 1000 μm(X9.2) 및 100 μm(X200).
도 36은 DSS 마우스 모델에서 PBS, Isotype IgG1, GKB101 항체 또는 항-TNF-α 항체 투여 후, 각 투여군의 대장 조직의 형태학적 평가 결과를 나타낸 그래프이다. *P<0.05, **P<0.001, ***P<0.001 vs PBS 처리군
도 37은 DSS 마우스 모델에서 PBS, Isotype IgG1, GKB101 항체 또는 항-TNF-α 항체 투여 후, 각 투여군의 DAI 스코어 또는 DAI 스코어-AUC와 형태학적 평가 결과의 상관 관계를 나타내는 그래프이다.
도 38은 DSS 마우스 모델에서 PBS, Isotype IgG1, GKB101 항체 또는 항-TNF-α 항체 투여 후, 각각의 개별 개체에 대한 DAI 스코어 또는 DAI 스코어-AUC와 형태학적 평가 결과의 상관 관계를 나타내는 그래프이다.
도 39는 DSS 마우스 모델에서 PBS, Isotype IgG1, GKB101 항체 또는 항-TNF-α 항체 투여 후, 각 투여군의 비장 조직의 무게를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 40은 DSS 마우스 모델에서 PBS, Isotype IgG1, GKB101 항체 또는 항-TNF-α 항체 투여 기간 동안, 각 투여군의 체중을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 41a 및 도 41b는 류마티스 관절염(RA) 환자의 활강액 내 WARS1 단백질의 농도 및 병증의 심각도의 상관관계를 분석한 결과를 나타낸 그래프이다. 이때, A는 퇴행성 관절염(osteoarthritis: OA) 및 류마티스 관절염 환자의 활강액 내 WARS1 발현량을 비교한 결과; B는 류마티스 관절염 환자의 활막 안의 섬유조직(pannus) 형성정도 및 활강액 내 WARS1의 발현량을 비교한 결과; C는 류마티스 관절염 환자의 활막 내 신생혈관생성 정도 및 활강액 내 WARS1의 발현량을 비교한 결과; D는 류마티스 관절염 환자 활강액 내 침윤된 백혈구(WBC) 수 및 WARS1 발현정도를 비교한 결과;E는 염증인자(ESR, CRP) 및 WARS1 발현량의 상관관계를 분석한 결과; F는 WARS1의 발현량 및 면역세포(호중구, 림프구)의 침윤과의 상관관계를 분석한 결과; 및 G는 IL-6 및 IL-8, 및 WARS1의 발현량의 상관관계를 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 42는 CIA(collagen-induced arthritis) 마우스 모델을 이용하여 GKB101 항체의 류마티스 관절염 개선 효과를 검증하기 위한 실험 스케쥴을 나타낸 도면이다.
도 43은 CIA 마우스 모델에 Vehicle(PBS), Isotype IgG1 또는 GKB101 항체를 투여한 후, CIA 마우스 족부를 관찰한 결과를 나타낸 도면, 임상 관절염 지수, 임상 관절염 지수 분석 결과에 대한 AUC를 나타낸 그래프이다. ***p<0.001 vs GKB101 항체 투여군
도 44는 CIA 마우스 모델에 Vehicle(PBS), Isotype IgG1 또는 GKB101 항체를 투여한 후, 마우스의 관절 조직을 H&E 염색하여 관찰한 결과를 나타낸 도면(X200, scale bar: 100 um) 및 그래프이다. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 vs GKB101 항체 투여군
도 45는 CIA 마우스 모델에 Vehicle(PBS), Isotype IgG1 또는 GKB101 항체를 투여하는 동안 CIA 마우스의 체중을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다. 이때, Normal은 무처리군이다.
도 46은 CIA 마우스 모델에 Vehicle(PBS), Isotype IgG1 또는 GKB101 항체를 투여한 후, 혈청(plasma) 및 족부 관절 내의 WARS1 및 염증성 사이토카인의 농도를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 vs IgG 투여군
도 47은 CIA 마우스 모델을 이용하여 GKB101 항체의 류마티스 관절염 개선 효과를 검증하기 위한 실험 스케쥴을 나타낸 도면이다.
도 48은 CIA 마우스 모델에 PBS(control, vehicle), Isotype IgG1, MTX, 항-TNF-α 항체, TLR4 억제제(TAK242, TLR4i) 또는 GKB101 항체를 투여한 후, 임상 관절염 지수를 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 49는 CIA 마우스 모델에 PBS(control, vehicle), Isotype IgG1, MTX, 항-TNF-α 항체, TLR4 억제제(TAK242, TLR4i) 또는 GKB101 항체를 투여한 후, CIA 마우스 족부를 관찰한 결과를 나타낸 도면이다.
도 50은 CIA 마우스 모델에 Vehicle(PBS), Isotype IgG1, MTX, 항-TNF-α 항체, TLR4 억제제(TAK242, TLR4i) 또는 GKB101 항체를 투여한 후, 마우스의 족부 관절 내 침윤된 면역세포를 분석하여 나타낸 그래프이다. #: vs control(vehicle), *: vs IgG1 투여군, §: vs 항-TNF-α 항체 투여군
도 51은 CIA 마우스 모델에 Vehicle(PBS), Isotype IgG1, MTX, 항-TNF-α 항체, TLR4 억제제(TAK242, TLR4i) 또는 GKB101 항체를 투여한 후, 마우스의 족부 관절 내에 염증성 사이토카인 및 케모카인의 농도를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다. #: vs Control(vehicle), *: vs IgG1 투여군
도 52는 CIA 마우스 모델에 Vehicle(PBS), Isotype IgG1, MTX, 항-TNF-α 항체, TLR4 억제제(TAK242, TLR4i) 또는 GKB101 항체를 투여한 후, 마우스의 족부 관절 내에 연골파쇄인자(MMP3) 및 파골세포 분화인자(RANKL)의 농도를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다. #: vs Control(vehicle), *: vs IgG1 투여군, §: vs 항-TNF-α 항체 투여군
도 53은 CIA 마우스 모델에 Vehicle(PBS), Isotype IgG1, MTX, 항-TNF-α 항체, TLR4 억제제(TAK242, TLR4i) 또는 GKB101 항체를 투여한 후, 임상적 관절염 심각도(CAI, clinical arthritis index)를 분석하기 위한 임상지표 기준을 나타낸 도면이다.
도 54는 CIA 마우스 모델에 Vehicle(PBS), Isotype IgG1, MTX, 항-TNF-α 항체, TLR4 억제제(TAK242, TLR4i) 또는 GKB101 항체를 투여한 후, 임상적 관절염 발생률(arthritis incidence, %)을 분석한 결과를 나타낸 그래프이다. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001
도 55a 및 도 55b는 아토피 환자의 혈중 WARS1 및 사이토카인의 농도를 측정하여 상관관계를 나타낸 그래프이다.
도 56은 아토피 환자의 혈중 WARS1 및 TARC(thymus and activation-regulated chemokine)의 농도를 측정하여 상관관계를 나타낸 그래프이다.
도 57은 Staphylococcus aureus로 감염시킨 인간 유래 각질 형성 세포주(human keratinocyte)에서 GKB101 항체 처리에 따른 WARS1 및 CXCL-8/IL-8의 발현을 확인한 결과를 나타낸 그래프이다. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001
도 58은 Staphylococcus aureus로 감염시킨 인간 진피 섬유아세포주(human dermal fibroblast)에서 GKB101 항체 처리에 따른 WARS1 및 CXCL-8/IL-8의 발현을 확인한 결과를 나타낸 그래프이다. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001
도 59는 아토피 마우스 모델을 이용한 GKB101 항체의 항염 활성을 평가하기 위한 실험 스케쥴을 나타낸 도면이다.
도 60은 아토피 마우스 모델에 Isotype IgG1 또는 GKB101 항체를 투여한 뒤, 마우스의 등표면의 염증 유발 정도를 관찰한 결과를 나타낸 도면 및 그래프이다. 이때, Naive는 무처리군이다. *p<0.05, ##p<0.01, ###p<0.001 (#: vs naive)
도 61a 및 도 61b는 아토피 마우스 모델에 Isotype IgG1 또는 GKB101 항체를 투여한 뒤, 마우스의 등표면을 H&E 염색하여 표피(epidermis) 및 진피(dermis)에 침윤된 면역세포를 관찰한 결과를 나타낸 도면 및 그래프이다. 이때, Naive는 무처리군이다. *p<0.05, **p<0.01.
도 62는 아토피 마우스 모델에 Isotype IgG1 또는 GKB101 항체를 투여한 뒤, 마우스의 등조직 내 WARS1 및 염증성 사이토카인의 농도를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다. 이때, Naive는 무처리군이다. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001.
도 63은 아토피 마우스 모델에 Isotype IgG1 또는 GKB101 항체를 투여한 뒤, 마우스의 혈청 내 WARS1 및 IgE의 농도를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다. 이때, Naive는 무처리군이다. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001.

항-WARS1 항체를 포함하는 약학 조성물

항-WARS1 항체

본 발명은 WARS1에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 단편을 포함하는 약학 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명의 일 측면은 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 H-CDR1, 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 H-CDR2 및 서열변호 7의 아미노산 서열을 포함하는 H-CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역; 및 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 L-CDR1, 서열번호 14 및 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 L-CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역;으로 이루어진 항-WARS1 항체 또는 이의 단편을 유효성분으로 포함하는 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 명세서에서 사용하는 용어, "항체"는 특정 항원과 면역학적으로 반응하는 면역글로불린 분자로, 항원을 특이적으로 인식하는 단백질 분자를 의미한다. 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄는 각각 불변영역(constant region, C) 및 가변영역(variable region, V)을 포함할 수 있다. 면역글로불린의 경쇄 및 중쇄 가변영역은, 상보성 결정 영역(complementarity determining region, CDR)이라 불리는 3개의 다변가능한 영역 및 4개의 구조 영역(framework region, FR)을 포함한다. 상기 CDR은 주로 항원의 에피토프에 결합하는 항원 결합 부위이다.

본 명세서에서 사용하는 용어, "WARS"는 트립토파닐 티알엔에이 합성효소(tryptophanyl-tRNA synthetase)를 의미하며, 트립토판 티알엔에이 연결효소(tryptophan-tRNA ligase), TrpRS, WRS 등으로도 알려져 있다. WARS는 아미노산 트립토판과 tRNA의 아미노아실레이션(aminoacylation) 반응을 매개하는 효소이다. WARS는 인간에서는 WARS 유전자에 의해 암호화되며, 단백질의 아미노산 서열과 mRNA 염기 서열은 GenBank accession number NP_004175.2(단백질), GenBank accession number NM_004184.3(mRNA 염기서열) 등으로 공지되어 있다. WARS는 cytoplasmic form(WARS1 또는 tryptophanyl-tRNA synthetase 1, cytoplasmic)과 mitochondrial form(WARS2 또는 tryptophanyl-tRNA synthetase 2, mitochondrial)의 두 가지 아형(isoform)이 있다. 본 발명에서 WARS는 WARS1일 수 있다. 상기 WARS1은 제한되지는 않으나, 바람직하게는 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 인간 WARS1인 것일 수 있다.

본 발명의 항-WARS1 항체는 상기 WARS1에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 단편일 수 있다. 또한, 본 발명의 항체의 단편은 Fab, F(ab')₂, Fd, sdFv, Fv, dAb, scFv, sdAb, 테트라머 등일 수 있으며, WARS1에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 부위를 포함하는 것이면 어떠한 형태도 포함할 수 있다.

상기 항체는 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 H-CDR1, 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 H-CDR2 및 서열변호 7의 아미노산 서열을 포함하는 H-CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역; 및 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 L-CDR1, 하기의 서열번호 14로 표현되는 아미노산 서열을 포함하는 L-CDR2 및 하기의 서열번호 16으로 표현되는 아미노산 서열을 포함하는 L-CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역;으로 이루어진 것일 수 있다.

구체적으로, 상기 중쇄 가변영역은 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 또한, 상기 경쇄 가변영역은 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 일 구체예로 상기 항체 또는 이의 단편은 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 영역 및 서열번호 23을 포함하는 경쇄 영역을 포함하는 것일 수 있다.

본 발명에서 상기 항체 또는 이의 단편은 면역글로불린 Fc 영역을 포함할 수 있다. 이때, 상기 면역글로불린의 Fc 영역은 면역글로불린의 중쇄 불변영역 2(CH2) 및 중쇄 불변영역 3(CH3)을 포함하며, 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄의 가변영역 및 경쇄 불변영역(CL)은 포함하지 않는 단백질을 의미한다. 상기 면역글로불린 Fc 영역은 IgG1, IgA, IgE, IgD 또는 IgM 유래 일 수 있다.

또한, 상기 면역글로불린의 Fc 영역은 야생형 Fc 영역 뿐만 아니라, Fc 영역 변이체일 수 있다. 또한, 본 명세서에서 사용하는 용어 "Fc 영역 변이체"는 야생형 Fc 영역의 당쇄 형태(glycosylation pattern)와 다르거나, 야생형 Fc 영역에 비해 증가된 당쇄, 야생형 Fc 영역에 비해 감소한 당쇄, 또는 당쇄가 제거(deglycosylated)된 형태일 수 있다. 또한, 무당쇄(aglycosylated) Fc 영역도 포함된다. Fc 영역 혹은 변이체는 배양조건 혹은 호스트의 유전자 조작을 통해 조정된 숫자의 시알산(sialic acid), 퓨코실화(fucosylation), 당화(glycosylation)를 갖도록 한 것일 수 있다.

또한, 화학적 방법, 효소적 방법 및 미생물을 사용한 유전공학적 엔지니어링 방법 등과 같이 통상적인 방법으로 면역글로불린의 Fc 영역의 당쇄를 변형시킬 수 있다. 또한, 상기 Fc 영역 변이체는 면역글로불린 IgG1, IgA, IgE, IgD 또는 IgM의 Fc 영역이 혼합된 형태일 수 있다. 또한, 상기 Fc 영역 변이체는 상기 Fc 영역의 일부 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 형태일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서 상기 Fc 영역은 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

본 발명의 항체는 항-WARS1 항체의 경쇄 가변영역(VL) 및 경쇄 불변영역(CL)을 포함하는 융합단백질과 항-WARS1 항체의 중쇄 가변영역(VH), 중쇄 불변영역 1(CH1) 및 Fc 영역을 포함하는 융합단백질을 포함할 수 있다.

구체적으로, 상기 항-WARS1 항체는 (I) 및 (II)를 포함하는 것일 수 있다.

N'-X'-[링커]o-Fc 영역 단편 또는 이의 변이체-C' (I); 및

N'-X''-C' (II)

이때, 상기 구조식 (I) 및 (II)에 있어서,

상기 N'은 N 말단이고,

상기 C'는 C 말단이며,

상기 X는 항-WARS1 항체 또는 이의 단편의 항원 결합 부위로서 X' 및 X''으로 이루어지며,

상기 X'는 항-WARS1 항체 또는 이의 단편 중쇄의 항원 결합 부위로 가변영역(VH) 및 CH1 영역을 포함하며,

상기 X''는 항-WARS1 항체 또는 이의 단편의 경쇄 항원 결합 부위로 가변영역(VL) 및 불변영역(CL)을 포함하고,

상기 링커는 펩타이드 링커이며,

상기 o는 O 또는 1이다.

이때, 항-WARS1 항체 또는 이의 단편, 항원 결합 부위, 가변영역 및 불변영역은 상술한 바와 동일하다.

상기 펩타이드 링커는 1 내지 50개의 연속된 아미노산 또는 3 내지 30개의 연속된 아미노산으로 이루어질 수 있다. 일 구체예로 상기 펩타이드 링커는 23개의 아미노산으로 이루어질 수 있다. 또한, 펩타이드 링커는 적어도 하나의 시스테인을 포함할 수 있다. 구체적으로, 하나, 두 개 또는 세 개의 시스테인을 포함할 수 있다. 또한, 상기 펩타이드 링커는 면역글로불린의 힌지에서 유래된 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 힌지는 다양한 IgG1하위 유형 항체의 힌지 영역으로부터 선택될 수 있다. 또한, 상기 힌지는 면역글로불린 유래의 힌지 영역의 일부 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 형태이거나, 일부 아미노산 서열이 추가된 서열일 수 있다. 일 구체예에서는, 상기 펩타이드 링커는 서열번호 20의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 링커일 수 있다.

항-WARS1 항체의 용도

본 발명에서 상기 항-WARS1 항체 또는 이의 단편을 유효성분으로 포함하는 약학 조성물은 염증성 질환과 같은 질환의 예방 또는 치료의 용도로 사용될 수 있다. 여기서, 항-WARS1 항체 또는 이의 단편은 상술한 바와 동일하다.

본 명세서에서 사용하는 용어, "염증"은 유해인자에 대해 생체를 보호하기 위한 반응으로, 면역세포, 혈관 및 염증 매개체들이 관여하여 세포의 손상을 억제하고, 손상된 조직 및 괴사 세포를 제거하며, 조직을 재생하는 일련의 과정을 포함한다. "염증성 질환"은 염증을 주 병변으로 하는 질병을 총칭하는 것이다.

구체적으로 상기 질환은 만성폐쇄성폐질환(chronic obstructive pulmonary disease:COPD), 염증성 장질환(inflammatory bowel disease:IBD), 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis:RA) 및 피부염으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 것일 수 있다. 이때, 상기 피부염은 아토피성 피부염(atopic dermatitis:AD)일 수 있다.

본 명세서에서 사용하는 용어, "만성폐쇄성폐질환(chronic obstructive pulmonary disease:COPD)"은 만성적으로 기류의 상태가 불량한 폐쇄성 폐질환의 한 종류이다. 주요 증상으로는 호흡곤란, 기침, 가래 등이 있으며, 만성기관지염 환자 중 대다수에게서 만성 폐쇄성 폐질환이 나타난다. 만성 폐쇄성 폐질환의 가장 흔한 원인은 흡연이며, 대기오염과 유전과 같은 다른 요소들도 더 적은 비율로 영향을 끼친다. 이러한 자극원들에 의해 폐에 염증반응이 발생해 소기도가 좁아지고 폐조직이 파괴되는 폐기종의 원인이 된다.

본 명세서에서 사용하는 용어, "염증성 장질환(inflammatory bowel disease: IBD)"은 위장관 내에 만성적인 염증을 유발하는 질환으로, 세균성, 바이러스성, 아메바성, 결핵성 장염 등의 감염성 장염과 허혈성 장질환, 방사선 장염 등 모든 장에서 발생하는 염증성 질환을 모두 포함할 수 있다. 염증성 장질환의 원인은 명확히 규명되지 않았으나, 유전적 및 환경적 영향을 받으며, 면역학적 이상에 의해 매개되는 것으로 알려져 있다. 상기 염증성 장질환은 크론병(Crohn's disease), 궤양성 대장염(ulcerative colitis), 장형 베체트병(intestinal Bechet's disease) 등일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.

본 명세서에서 사용하는 용어, "류마티스 관절염(rheumatoid arthritis:RA)"은 관절 주위를 둘러싸고 있는 활막이라는 조직의 염증으로 인해 발생하는 질환이다. 따라서, 활막이 존재하는 모든 관절에서 발생할 수 있다. 초기에는 관절을 싸고 있는 활막에 염증이 발생하지만 점차 주위의 연골과 뼈로 염증이 퍼져 관절의 파괴와 변형을 초래하게 된다. 류마티스 관절염의 발병원인은 정확히 알려져 있지 않으며, 인체 내 면역체계가 자신의 몸을 비정상적으로 공격하여 염증이 발생하는 자가 면역 질환의 일종이다.

본 명세서에서 사용하는 용어, "아토피성 피부염(atopic dermatitis:AD)"은 심한 가려움증을 동반하고 만성적으로 재발하는 피부 습진 질환이다. 천식, 알레르기 비염, 만성 두드러기와 함께 대표적인 알레르기 질환 중 하나로, 보통 태열이라고 부르는 영아기 습진은 아토피 피부염의 시작으로 볼 수 있다. 아토피성 피부염은 유전적인 소인과 환경적인 요인, 면역학적 이상 및 피부 보호막의 이상 등 여러 원인이 복합적으로 작용하여 나타나는 것으로 알려져 있다. 최근에는 인스턴트식품 섭취의 증가, 실내외 공해에 의한 알레르기 물질의 증가 등이 아토피성 피부염 발병과 밀접한 관련이 있는 것으로 알려졌다.

본 명세서에서 사용하는 용어, "치료"는 치료학적 처리 및 예방적 처리를 모두 포함하는 의미로 사용될 수 있으며, 인간을 포함한 포유류에서 질환을 치료하기 위한 적용이나 어떠한 형태의 투약을 모두 포함한다. 또한, 상기 용어는 질환의 진행을 억제하거나 늦추는 것을 포함하며; 손상되거나, 결손된 기능을 회복시키거나, 수리하여, 질환을 부분적이거나 완전하게 완화시키거나; 또는 비효율적인 프로세스를 자극하거나; 심각한 질환을 완화하는 의미를 포함한다. 이때, "예방"은 개체의 병리학적 상태 또는 질환을 완화시키거나 감소시키는 의미로 사용될 수 있다.

상기 약학 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 본 발명의 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물에서 상기 항체 또는 이의 단편은 질환의 치료 효과를 나타낼 수 있는 한, 용도, 제형, 배합 목적 등에 따라 임의의 양(유효량)으로 포함될 수 있는데, 통상적인 유효량은 조성물 전체 중량을 기준으로 할 때 0.001 중량% 내지 20.0 중량% 범위 내에서 결정될 것이다. 여기서 "유효량"이란 질환의 상태 개선 또는 치료(treatment) 효과, 특히 질환의 상태 개선 또는 치료 효과를 유도할 수 있는 유효성분의 양을 말한다. 이러한 유효량은 당업자의 통상의 능력 범위 내에서 실험적으로 결정될 수 있다.

생체이용률과 같은 약동학적 파라미터(pharmacokinetic parameters) 및 클리어런스율(clearance rate)과 같은 기본적인 파라미터(underlying parameters)도 효능에 영향을 줄 수 있다. 따라서, "향상된 효능"(예를 들어, 효능의 개선)은 향상된 약동학적 파라미터 및 향상된 효능에 기인할 수 있으며, 시험 동물 또는 인간 대상체에서 클리어런스율 및 질환 치료 또는 개선과 같은 파라미터를 비교하여 측정될 수 있다.

한편, 본 발명의 약학적 조성물은 "치료학적으로 유효한 양"으로 투여한다.

본 명세서에서 사용하는 용어 "투여"란, 적절한 방법으로 개체에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며, 상기 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여될 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.

본 명세서에서 사용하는 용어 "치료학적으로 유효한 양" 또는 "약학적으로 유효한 양"이란 대상 질환을 예방 또는 치료하는데 유효한 화합물 또는 조성물의 양으로서, 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분하며 부작용을 일으키지 않을 정도의 양을 의미한다. 상기 유효량의 수준은 환자의 건강상태, 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 방법, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 일 구현예에서 치료학적으로 유효한 양은 질환을 치료하는데 효과적인 약물의 양을 의미한다.

이때, 상기 약학 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 더 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용 가능한 담체는 환자에게 전달하기에 적절한 비-독성 물질이면 어떠한 담체라도 가능하다. 증류수, 알코올, 지방, 왁스 및 비활성 고체가 담체로 포함될 수 있다. 약물학적으로 허용되는 애쥬번트(완충제, 분산제) 또한 약학 조성물에 포함될 수 있다.

구체적으로, 상기 약학 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하여 당업계에 공지된 통상의 방법으로 투여 경로에 따라 비경구용 제형으로 제조될 수 있다. 여기서 "약제학적으로 허용되는" 의미는 유효성분의 활성을 억제하지 않으면서 적용(처방) 대상이 적응 가능한 이상의 독성을 지니지 않는다는 의미이다.

상기 약학 조성물이 비경구용 제형으로 제조될 경우, 적합한 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 주사제, 경피 투여제, 비강 흡입제 및 좌제의 형태로 제제화될 수 있다. 주사제로 제제화할 경우 적합한 담체로서는 멸균수, 에탄올, 글리세롤이나 프로필렌 글리콜 등의 폴리올 또는 이들의 혼합물을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 링거 용액, 트리에탄올 아민이 함유된 IgG1(phosphate buffered saline)나 주사용 멸균수, 5% 덱스트로스 같은 등장 용액 등을 사용할 수 있다. 약제학적 조성물의 제제화와 관련하여서는 당업계에 공지되어 있으며, 구체적으로 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed., 1995)] 등을 참조할 수 있다. 상기 문헌은 본 명세서의 일부로서 간주된다.

상기 약학 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태, 체중, 성별, 연령, 환자의 중증도, 투여 경로에 따라 1일 0.01 ㎍/㎏ 내지 10 g/㎏ 범위, 또는 0.01 ㎎/㎏ 내지 1 g/㎏ 범위일 수 있다. 투여는 1일 1회 또는 수회로 나누어 이루어질 수 있다. 이러한 투여량은 어떠한 측면으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 아니 된다.

상기 약학 조성물이 적용(처방)될 수 있는 대상은 포유동물 및 사람이며, 특히 사람인 경우가 바람직하다. 본 발명의 약학 조성물은 질환의 치료 효과를 갖는 것으로 공지된 임의의 화합물이나 천연 추출물을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면은, 질환의 예방 또는 치료용 약제를 제조하기 위한 상기 항-WARS1 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 용도를 제공한다. 여기서, 질환, 예방, 치료, 항-WARS1 항체 또는 이의 단편은 상술한 바와 동일하다.

본 발명의 또 다른 측면은, 상기 항-WARS1 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 질환의 예방 또는 치료용 용도를 제공한다. 여기서, 질환, 예방, 치료, 항-WARS1 항체 또는 이의 단편은 상술한 바와 동일하다.

본 발명의 또 다른 측면은, 상기 항-WARS1 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다. 여기서, 질환, 예방, 치료, 항-WARS1 항체 또는 이의 단편 및 투여는 상술한 바와 동일하다. 상기 개체는 포유동물일 수 있으며, 바람직하게는 인간일 수 있다. 또한, 상기 개체는 질환을 앓는 환자이거나 질환을 앓을 가능성이 큰 개체일 수 있다.

상기 항체 또는 이의 단편의 투여경로, 투여량 및 투여횟수는 환자의 상태 및 부작용의 유무에 따라 다양한 방법 및 양으로 대상에게 투여될 수 있고, 최적의 투여방법, 투여량 및 투여횟수는 통상의 기술자가 적절한 범위로 선택할 수 있다. 상기 항-WARS1 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 바람직한 투여량은 환자의 상태, 체중, 성별, 연령, 환자의 중증도, 투여 경로에 따라 1일 0.01 ㎍/㎏ 내지 10 g/㎏ 범위, 또는 0.01 ㎎/㎏ 내지 1 g/㎏ 범위일 수 있다. 투여는 1일 1회 또는 수회로 나누어 이루어질 수 있다. 이러한 투여량은 어떠한 측면으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 아니 된다.

또한, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 질환의 치료 효과를 갖는 것으로 공지된 임의의 화합물이나 천연 추출물과 병용하여 투여되거나, 다른 약물과의 조합 제제 형태로 제형화 될 수 있다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

I. GKB101 항체 제조

실시예 1. GKB101 항체 제조

WARS1(서열번호 24)에 특이적 결합을 하는 항체를 생산하기 위하여, 시그널 펩타이드(서열번호 1), 항-WARS1 항체 중쇄의 가변영역(서열번호 9)과 불변영역(서열번호 10), 링커(서열번호 20) 및 Fc 영역(서열번호 21)을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 25); 및 시그널 펩타이드(서열번호 1), 항-WARS1 항체 경쇄의 가변영역(서열번호 18)과 불변영역(서열번호 19)을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 26)를 각각 pOptiVEC(Thermo Fisher, 도 1) 및 pcDNA 3.3 벡터(Thermo Fisher, 도 2)에 클로닝하였다. 이때 사용된 항체 정보는 하기 표 1 내지 3과 같다.

상기 벡터를 1:1의 비율로 Expifectamine 293 reagent(Thermo Fisher)를 이용하여 ExpiHEK293 세포에 도입하여 동일 세포 내에서 중쇄 및 경쇄를 함께 발현시켰다. 벡터를 도입 후, 약 5일 동안 진탕 배양한 후, 세포배양액을 원심 분리하고, 상층액을 회수하여 항체를 분리 및 정제하였다.

구체적으로, 회수한 상층액은 Hitrap MabselectSure column(GE Healthcare Life Sciences)에 로딩(loading)하고, IgG1로 세척하여 비특이적 결합을 제거하였다. 100 mM Citrate buffer(pH 3.0) + 300 mM NaCl을 이용하여 컬럼에 특이적으로 결합하는 단백질을 분리하였다. FPLC(fast protein liquid chromatography)로 얻은 용출액은크기 배제 크로마토그래피(GE Healthcare Life Sciences)에 로딩하여 고순도의 항체를 수득하였다. 상기 정제한 항-WARS1 항체를 "GKB101"로 명명하였다(표 4).

	H-CDR1	H-CDR2	H-CDR3	L-CDR1	L-CDR2	L-CDR3
GKB101	SYDMS(서열번호 3)	AISSGGSSIYYADSVKG(서열번호 5)	DVAWDMLGDFDY (서열번호 7)	TGSSSNIGSNYVY (서열번호 12)	ANSHRPS (서열번호 14)	GAWDDSLSAYV (서열번호 16)

	중쇄 가변 영역	경쇄 가변 영역
GKB101	EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYDMSWVRQAPGKGLEWVSAISSGGSSIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDVAWDMLGDFDYWGQGTLVTVSS(서열번호 9)	QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCTGSSSNIGSNYVYWYQQLPGTAPKLLIYANSHRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCGAWDDSLSAYVFGGGTKLTVL(서열번호 18)

영역	FR1	FR2	FR3	FR4
VH-FR	EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS(서열번호 2)	WVRQAPGKGLEWVS(서열번호 4)	RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR(서열번호 6)	WGQGTLVTVSS (서열번호 8)
LH-FR	QSVLTQPPSASGTPGQRVTISC(서열번호 11)	WYQQLPGTAPKLLIY(서열번호 13)	GVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYC(서열번호 15)	FGGGTKLTVL(서열번호 17)

GKB101		아미노산 서열	서열 번호
중쇄영역	신호서열	MGWSYIILFLVATAADVHS	1
	중쇄가변영역	EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS SYDMS WVRQAPGKGLEWVS AISSGGSSIYYADSVKG RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR DVAWDMLGDFDY WGQGTLVTVSS	9
	중쇄불변영역(CH1)	ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVT VPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKV	10
	링커	EPPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGP	20
	Fc 영역 (CH2+CH3)	SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLPGK	21
경쇄영역(kappa)	신호서열	MGWSYIILFLVATAADVHS	1
	경쇄가변영역	QSVLTQPPSASGTPGQRVTISC TGSSSNIGSNYVY WYQQLPGTAPKLLIY ANSHRPS GVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYC GAWDDSLSAYV FGGGTKLTVL	18
	경쇄불변영역	TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSST LTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC	19

II. GKB101 항체의 호흡기 손상 억제 효능 평가

실시예 2. 표준 담배 추출물 조제

실험재료로 표준 담배 CM7(coresta monitoring cigarette 7) 60개피 및 이소프로파놀(isopropanol, Merck), 에탄올(ethanol, Merck), n-heptadecane(Sigma-Aldrich)를 준비하였고, 실험장비는 자동흡연장치(automatic smoking machine, ISO3308 규격품, 모델: RM20, Heinr Borgwaldt)를 사용하였다.

실시예 2.1. 표준 담배연기의 포집

표준 담배 CM7 연기 응축물 포집은 ISO3402 규정에 의거하여 흡연실(온도 22±2℃, 상대습도 60±5%)에서 실시하였다. ISO3308 규정에 의거하여 RM20(Heinr Borgwaldt) 자동흡연장치를 이용하여 흡연부피 35.0±0.3 ㎖, 흡연주기 60±0.5초, 흡연시간 2.00±0.02초 및 꽁초길이 tip paper 길이+3 mm(overwrap+3 mm) ISO 표준 흡연 방법으로 궐련담배를 연소시키고, 92 mm 캠브리지 필터(cambridge filter, ISO3308 규격품)로 담배연기 응축물을 포집하였다.

실시예 2.2. 담배연기 응축물 무게 측정

흡연 전 ISO4387 규정에 의하여 연소 전 캠브리지 필터가 들어있는 담배 홀더의 무게를 측정하고, 실시예 2.1의 방법으로 연소시킨 담배연기 응축물은 연소 후 캠브리지 필터에 의해 담배연기가 포집된 담배 홀더의 무게를 측정하여 TPM(total particulate matter) 함량을 계산하였다(ISO4387, 2000). 표준 담배를 3번 연소시킨 경우, TPM 무게는 19개피에 16.0621 mg, 20개피에 15.9135 mg 및 20개피에 15.5380 mg/cig이었다. 따라서, 총 표준 담배 시료 수는 59개피이고 TPM 무게는 47.5136 mg이었다.

실시예 2.3. 표준 담배연기 응축물 추출

실시예 2.1의 방법으로 담배연기 응축물이 포집된 캠브리지 필터를 담배 홀더에서 분리하여 각각 100 ㎖ 삼각 플라스크에 넣고 추출용매 이소프로판올을 50 ㎖씩 첨가하여 혼합하였다. 상기 혼합물을 실온에서 8시간 이상 방치하여 담배연기 응축물을 추출하였다. 상기 추출물은 추출 후 여과하고 감압여과 농축기로 농축하였고, 3개의 삼각 플라스크에 들어있는 농축액을 scintillation vial에 모아 질소 가스를 이용하여 완전 농축하였다.

상기 방법으로 농축된 담배연기 응축물에서 하기의 수학식 1을 이용하여 총 입자상물질(TPM) 함량의 계산하였다.

<수학식 1>

TPM(mg/cig) = (W_FHA - W_FBH)/N

여기서 TPM : 총 입자상 분진 물질

WFHA : 흡연 후 Filter Holder의 무게

WFHB : 흡연 전 Filer Holder의 무게

N : 한 Trap 당 흡연한 개피 수(cig.)

실시예 3. 만성 폐쇄성 폐질환 마우스 모델을 이용한 GKB101 항체의 호흡기 손상 억제 효과 검증

숫컷 7주령의 SPF(specific pathogen-free) BALB/c 마우스(18 g 내지 20 g)는 오리엔트바이오사에서 공급받았다. 동물은 실험 당일까지 고형사료(항생제 무첨가, 삼양사료 Co.)와 물을 충분히 공급하고 온도 22±2℃, 습도 55±15%, 12시간(light-dark cycle)의 환경에서 1주간 적응시킨 후 실험에 사용하였다. 그리고 동물실험의 윤리적, 과학적 타당성 검토 및 효율적인 관리를 위하여 대전대학교 동물실험윤리위원회(Institutional animal care and use committee: IACUC)의 승인을 받았다.

만성 폐쇄성 폐질환(COPD, chronic obstructive pulmonary disease) 마우스 모델을 확립하기 위한 LPS/CS 혼합물은 100 ㎍/㎖의 LPS(lipopolysaccharide) 및 4 ㎎의 표준 담배 추출물(CSE, cigarette smoking extract)을 각각 1:1로 섞어 준비하였다.

7주령 BALB/c 수컷 마우스를 케타민(ketamine)/럼프(rumph)로 가마취한 후, 상기 LPS/CS 혼합물을 마우스의 코 및 입에 마리 당 총 100 ㎕(각각 50 ㎕)로 주 1회씩 3주간 INT(intra-nazal-trachea) 주사(injection) 방법으로 흡입시켜 COPD 마우스 모델을 제작한다.

이때, 실험군은 (i) 무처리한 정상군(normal, Nr), (ii) LPS/CS 및 생리식염수를 투여한 대조군(COPD-CTRL), (ⅲ)LPS/CS 및 덱사메타손(Dexamethasone, 5 ㎎/㎏, p.o)을 투여한 실험군(COPD-DEXA.), (ⅳ) LPS/CS 및 GKB101 항체(1 ㎎/㎏, i.p)를 투여한 실험군(COPD-GKB101(1 ㎎/㎏, i.p), (ⅴ) LPS/CS 및 GKB101 항체(3 ㎎/㎏, i.p)를 투여한 실험군(COPD-GKB101(3 ㎎/㎏, i.p), (ⅵ) LPS/CS 및 GKB101 항체(9 ㎎/㎏, i.p)를 투여한 실험군(COPD-GKB101, 9 ㎎/㎏, i.p) 및 (ⅶ) LPS/CS 및 Roflumilast(30 ㎎/㎏, p.o)을 투여한 실험군(COPD-Roflumilast)으로 나누어 실시하였다. 실험 종료 후 각 군 생쥐의 혈액, 기관지 폐포세척액 및 폐조직을 분리하여 GKB101 항체의 호흡기 손상 억제 효과를 평가하였다. 각각의 시험물질(생리식염수 포함)은 LPS/CS 처리 1시간 전에 전처리 되었다.

실험 집단간 수치 데이터는 각 실험군 결과값은 평균(mean)±표준 편차(SD)로 나타내었으며, 동물실험에서는 SPSS 11.0 소프트웨어(IBM-SPSS Inc.)를 이용하여 일원배치 분산분석(ANOVA) 후에 Duncan's multiple comparison tests로 유의성을 검증하였다. p 값이 0.05, 0.01 혹은 0.001 보다 작은 경우를 구분하여 분석하였으며(#p<0.05, ##p<0.01, ###p<0.001 vs. COPD_CTL 또는 Nr; **p<0.01, ***p<0.001 vs. COPD-CTL), 각 경우에 해당 시 통계적으로 유의적 차이가 있는 것으로 판정하였다.

실시예 3.1. 기관지 폐포세척액, 폐세포 분리 및 총 세포수 측정

COPD 마우스 모델에서 GKB101 항체의 호흡기 손상 억제 효과를 확인하기 위하여 실시예 3의 실험 마우스에서 수득한 기관지 폐포세척액(BALF, bronchoalveolar lavage(BAL) fluid) 내 존재하는 BAL 세포 및 총 폐세포를 측정하였다.

이때, 각 샘플의 채취는 하기와 같이 수행하였다.

먼저, 폐포세척액은 마우스 기도 삽관을 통해 1 ㎖의 PBS로 기관지 및 폐 조직을 세척한 뒤 수거하였다. 상기 세척액을 폐포세척액(BALF, bronchoalveolar lavage(BAL) fluid)으로 사용하였다.

또한, 폐 조직의 일부를 적출하여 100 ㎍/㎖의 농도가 되도록 단백질 용해 버퍼(protein lysis buffer)를 첨가하고 조직을 용해하였다. 상기 용해물을 13,000 rpm으로 원심분리하여 상층액만 수거하여 폐 조직 샘플로 사용하였다. 폐세포는 Cytospin을 시행하여 Diff-Quick staining을 통하여 계수하였다.

그 결과, 도 3 및 도 4에 나타낸 바와 같이, COPD 마우스 모델에서 총 BAL 세포의 수가 대조군(COPD-CTL)에 비하여 GKB101 항체 투여군에서 유의성 있게 감소하였다. 총 Peyer's patch세포수의 경우 정상군(Balb/c_normal)에 비하여 대조군(COPD-CTL)에서 감소하였고, GKB101 항체 투여군은 대조군(COPD-CTL)과 유사한 결과를 나타내었다. 또한, 기관지 폐포세척에서 Cytospin을 통한 호중구(neutrophil)를 계수한 결과, 대조군(COPD-CTL)에 비하여 GKB101 항체 투여군에서 농도 의존적으로 유의성 있게 호중구의 수가 감소한 것을 확인할 수 있었다.

실시예 3.2. 혈액에서 혈구세포 분석

COPD 마우스 모델에서 GKB101 항체의 호흡기 손상 억제 효과를 확인하기 위하여 실시예 3의 실험 마우스에서 수득한 혈액에서 전혈구 검사(complete blood count:CBC)를 실시하였다.

그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 총 백혈구(WBCs) 수는 대조군(COPD-CTL)과 GKB101 항체 투여군이 모두 유사하게 관찰되었다. 또한, Roflumilast 투여군에서도 유의적인 변화가 관찰되지 않았다. 호중구(neutrophil) 빈도수(%)는 대조군(COPD-CTL)과 비교하여 GKB101 항체 투여군이 감소한 것을 확인할 수 있었다. 반면, 림프구(lymphocyte) 빈도수(%)의 경우, 대조군(COPD-CTL)과 비교하여GKB101 항체 투여군(1 mg/kg 및 3 mg/kg)에서 유의성 있게 증가하였다. 또한, 단핵구(monocyte) 빈도수(%)는 대조군(COPD-CTL)에 비하여 GKB101 항체 투여군이 농도 의존적으로 유의성 있게 감소하였다.

실시예 3.3. 기관지 폐포세척액에서 염증성 사이토카인 농도 분석

COPD 마우스 모델에서 GKB101 항체의 호흡기 손상 억제 효과를 확인하기 위하여 실시예 3의 실험 마우스에서 수득한 기관지 폐포세척액에서 염증성 사이토카인의 농도를 ELISA를 이용하여 측정하였다.

그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, 기관지 폐포세척액 내 CXCL-1, MIP2, IL-17 및 TNF-α의 농도는 모두 대조군(COPD-CTL)에 비하여 GKB101 항체 투여군(9 mg/kg) 및 양성대조군인 Dexa 투여군에서 유의적으로 감소하였다. 특히, MIP2 및 IL-17의 농도는 대조군에 비하여 모든 농도의 GKB101 항체 처리군에서 유의적으로 감소하였다.

실시예 3.4. 혈청에서 기관지 폐기능 지표 분석

COPD 마우스 모델에서 GKB101 항체의 호흡기 손상 억제 효과를 확인하기 위하여 실시예 3의 마우스 실험에서 수득한 혈청에서 SDMA(symmetric dinethylarginine)을 ELISA로 측정하였다.

그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, 대조군(COPD-CTL)에 비하여 GKB101 항체 투여군(3 mg/kg(p<0.05) 및 9 mg/kg(p<0.05)에서 혈청 내 SDMA 농도가 유의적으로 감소하였다. 이때, 양성대조군인 Dexa 투여군(p<0.05) 및 Roflumilast 투여군(p<0.01)도 대조군(COPD-CTL)에 비하여 혈청 내 SDMA 농도가 유의적으로 감소하였다.

실시예 3.5. 폐조직 내의 염증 및 기침 관련 유전자 발현 분석

COPD 마우스 모델에서 GKB101 항체의 호흡기 손상 억제 효과를 확인하기 위하여 실시예 3의 실험 마우스에서 수득한 폐조직에서 염증 및 기침(cough)에 관련된 유전자의 발현을 q-PCR을 통해 확인하였다. 이때 사용된 프라이머는 표 5에 나타낸 바와 같다.

그 결과, 도 8a 및 도 8b에 나타낸 바와 같이, 대조군(COPD-CTL)에 비하여 GKB101 항체 투여군(9 mg/kg)의 폐조직에서 기침 관련 유전자인 MUC5AC 및 TARC, 및 염증 관련 유전자인 CXCL-1 및 Cox-2의 유전자 발현이 유의적으로 감소한 것을 확인할 수 있었다. 반면, 기침 관련 유전자 중 TRPA1 및 TRPV1, 및 염증 관련 유전자 중 TNF-α 및 NOS-II의 발현은 대조군(COPD-CTL)에 비하여 감소하였으나 통계학적 유의성은 없었다.

상기 결과를 통해 GKB101 항체 투여에 의하여 MUC5AC, TARC, CXCL-1 및 Cox-2 등과 같이 면역세포 및 호중구와 관련된 호흡기 염증 활성이 억제되었음을 확인할 수 있었다.

유전자명	프라이머	서열
TGF-β1	정방향	5'-TGGAGCAACATGTGGAACTC-3'(서열번호 27)
	역방향	5'-CTGCCGTACAACTCCAGTGA-3'(서열번호 28)
MUC5AC	정방향	5'-AGAATATCTTTCAGGACCCCTGCT-3'(서열번호 29)
	역방향	5'-ACACCAGTGCTGAGCATACTTTT-3'(서열번호 30)
mTRPV1	정방향	5'-CATCTTCACCACGGCTGCTTAC-3'(서열번호 31)
	역방향	5'-CAGACAGGATCTCTCCAGTGAC-3'(서열번호 32)
mTRPA1	정방향	5'-TGAGATCGACCGGAGT-3'(서열번호 33)
	역방향	5'-TGCTGAAGGCATCTTG-3'(서열번호 34)
CXCL-1	정방향	5’-CCGAAGTCATAGCCACAC-3'(서열번호 35)
	역방향	5'-GTGCCATCAGAGCAGTCT-3'(서열번호 36)
Cox-2	정방향	5'-GGGTGTCCCTTCACTTCTTTCA-3'(서열번호 37)
	역방향	5'-TGGGAGGCACTTGCATTGA-3'(서열번호 38)
TARC	정방향	5'-CCCATGAAGACCTTCACCTC-3'(서열번호 39)
	역방향	5'-ACTCTCGGCCTACATTGGTG-3'(서열번호 40)
NOS II	정방향	5'-CGAAACGCTTCACTTCCAA-3'(서열번호 41)
	역방향	5'-TGAGCCTATATTGCTGTGGCT-3'(서열번호 42)

실시예 3.6. 폐조직의 병리학적 분석

COPD 마우스 모델에서 GKB101 항체의 호흡기 손상 억제 효과를 확인하기 위하여 실시예 3의 실험 마우스에서 수득한 폐조직을 H&E 염색하여 광학 현미경을 통해 관찰하였다.

구체적으로, 투여 종료 후 적출된 기도 조직과 폐조직을 4% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde)에서 하루 동안 반응시켜 고정한 뒤, 파라핀 조직 절편 슬라이드를 제작하였다. 상기 파라핀 조직 절편 슬라이드를 각각 자일렌(xylene) 용액 및 100% 에탄올로 3번 세척하여 파라핀을 제거하였다.

상기 파라핀이 제거된 슬라이드는 하기의 방법으로 수행하여 관찰하였다. 헤마톡실린(hematoxylin) 용액에서 슬라이드를 5분간 반응시킨 뒤, 상기 슬라이드를 흐르는 물 및 1% 염산에 순차적으로 세척하였다. 그 다음으로 흐르는 물에서 상기 슬라이드를 세척한 뒤 1% 암모니아 용액(70% ethanol에 희석함)으로 중화시켰다. 상기 슬라이드를 흐르는 물에 세척하고 에오신(eosin) 용액에서 2분간 반응시켰다. 반응이 끝난 뒤, 슬라이드를 순차적으로 70% 내지 100% 에탄올 용액으로 세척하고, 자일렌 용액에서 3분간 반응시켰다. 이때, 자일렌 용액에서 반응시키는 과정은 총 3번 실시하였다. 마지막으로 커버 슬라이드로 조직 절편 슬라이드를 봉입한 후 광학 현미경으로 조직의 형태를 관찰하였다.

Masson Trichrome 염색 및 관찰은 하기의 방법으로 수행하였다. 파라핀이 제거된 슬라이드를 60℃의 Bouin's 용액에서 반응시킨 뒤, 꺼내어 식힌 다음 Weigert's Hematoxylin 용액, Briebrich Scarlet 용액, Phosphotungstic phosphomolybdic acid 및 Aniline blue 용액에서 순차적으로 반응시켰다. 마지막으로 1% 아세트산 용액에서 반응시킨 뒤, 커버 슬라이드로 폐 조직 절편 슬라이드를 봉입하여 광학 현미경으로 조직 내 콜라겐 침착 정도를 확인하였다.

Periodic acid-Schiff-Alcian Blue 염색은 상기 파라핀이 제거된 슬라이드를 순차적으로 Alcian blue 용액, 0.5% Periocid acid 용액 및 Schiff's 용액에서 반응시켰다. 각 용액과의 반응 후에는 슬라이드를 흐르는 물로 충분히 세척하였다. 상기 과정을 통해 염색된 슬라이드를 헤마톡실린 용액에서 반응시킨 뒤 물로 세척하고 70% 내지 100% 농도의 에탄올 용액에서 순차적으로 반응시켜 탈수시켰다. 상기 조직 절편을 커버 글라스로 봉입한 뒤 광학 현미경으로 관찰하였다.

그 결과, 도 9에 나타낸 바와 같이, 정상군(normal)에 비하여 대조군(COPD-CTL)에서 기도의 두께가 크게 증가하는 것을 관찰할 수 있었다. 또한, 기관지(airway) 주변에 염증성 면역세포의 침윤, 및 과립구(호중구, 호산구(eosinophils) 및 활성화된 대식세포로 인하여 염증이 심화되어 폐포의 파괴가 진행된 것이 관찰되었다.

또한, Masson Trichrome(M-T) 염색을 통해 폐포 파괴 정도를 콜라겐 침착(collagen deposition)으로 확인한 결과, 정상군(normal)에 비하여 대조군(COPD-CTL)에서 폐조직 내의 기도(tracheal), 폐포(alveolar) 및 세포의 염증 부위가 증가하였고, 혈액 세포의 침윤이 증가한 것을 확인할 수 있었다. 더불어, 대조군(COPD-CTL)에서는 기관지 주변에 점액질을 분비하는 배상세포(goblet cell)가 많이 분포하고 있음을 PAS 염색을 통해 확인할 수 있었다.

반면, GKB101 항체 투여군(3 mg/kg 및 9 mg/kg) 및 양성대조군인 Dexa. 3 ㎎/㎏ 투여군 및 Roflumilast 투여군은 대조군(COPD-CTL)과 비교하여 기도의 두께가 정상군(normal)에 가깝게 감소하였으며, 기관지 주변의 염증성 면역세포의 침윤, 및 과립구세포(호중구, 호산구) 및 활성화된 대식세포의 수가 크게 감소한 것을 확인할 수 있었다. 또한, Masson Trichrome(M-T) 염색 결과, 기도, 폐포 및 기관지 주변의 배상세포 및 세포의 염증 부위가 감소하였고, 혈액세포의 침윤정도도 정상군(normal)과 유사한 정도로 감소한 것으로 관찰되었다.

실시예 3.7. 기도 조직의 병리학적 분석

COPD 마우스 모델에서 GKB101 항체의 호흡기 손상 억제 효과를 확인하기 위하여 실시예 3의 마우스 실험에서 수득한 기도 상피세포층을 periodic acid-Schiff(PAS)-Alcian Blue(AB) 염색 방법을 이용하여 염색하고, 기도 조직의 형태를 광학 현미경으로 관찰하였다. PAS-AB 염색은 실시예 3.6과 동일한 방법으로 실시하였다.

그 결과, 도 10에 나타낸 바와 같이, 정상군(normal), 대조군(COPD-CTL)에서 배상세포 내 짙은 보라색으로 염색된 점액(mucin)의 양이 관찰 증가한 것을 확인할 수 있었다. 반면, GKB101 항체 투여군(3 mg/kg, 9 mg/kg)에서는 배상세포 내 점액의 양이 감소하는 것이 관찰되었다. 상기 결과를 통해, GKB101 항체가 COPD 유도에 의해 배상세포 내 점액 함유량 증가를 억제하는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 3.8. 폐조직 내의 CXCL-1 및 TNF-α 발현 확인

COPD 마우스 모델에서 GKB101 항체의 호흡기 손상 억제 효과를 확인하기 위하여 실시예 3의 실험 마우스에서 수득한 폐조직으로 실시예 3.6과 동일한 방법으로 조직 슬라이드를 제작한 뒤, CXCL-1 및 TNF-α의 발현을 면역조직화학염색법(immunohistochemistry, IHC)을 통해 확인하였다. 이때, 핵은 Hoechst를 이용하여 염색하였다.

그 결과, 도 11 내지 도 14에 나타낸 바와 같이, 정상군(Nr, normal)에 비하여 대조군(COPD-CTL)에서 CXCL-1 및 TNF-α 단백질 발현이 증가한 것을 확인할 수 있었다. 반면, GKB101 항체 투여군의 경우 대조군(COPD-CTL)과 비교하여 농도 의존적으로 TNF-α(p<0.001) 및 CXCL-1(p<0.001) 단백질 발현이 유의적으로 감소한 것을 확인할 수 있었다. 이때, 양성대조군인 Dexa. 투여군(p<0.05) 및 Roflumilast 투여군(p<0.01)도 대조군(COPD-CTL)에 비하여 CXCL-1 및 TNF-α의 단백질 발현이 유의적으로 감소하였다.

실시예 3.9. 폐조직 내의 IRAK-1 단백질 발현 확인

COPD 마우스 모델에서 GKB101 항체의 호흡기 손상 억제 효과를 확인하기 위하여 실시예 3의 마우스 실험에서 수득한 폐조직에서 MyD88 관련 기전으로 염증 신호전달 단백질인 IRAK-1 단백질의 발현을 면역조직화학염색법을 통해 확인하였다. 이때, 핵은 hoechst를 이용하여 염색하였다. 이때, IHC는 실시예 3.8과 동일한 방법으로 수행하였다.

그 결과, 도 15 및 도 16에 나타낸 바와 같이, 정상군(Balb/c_Nr)에 비하여 대조군(COPD-CTL)에서 IRAK-1 단백질 발현이 폐기도 주변에서 증가하였고, GKB101 항체 투여군(1 mg/kg, 3 mg/kg, 9 mg/kg)에서는 대조군(COPD_CTL)에 비하여 농도 의존적으로 IRAK-1 단백질 발현이 유의적으로 감소하였다. 이때, 양성대조군인 Dexa. 투여군(p<0.05) 및 Roflumilast 투여군(p<0.01)도 대조군(COPD-CTL)에 비하여 폐조직 내의 IRAK-1 단백질 발현이 유의성 있게 감소하였다.

실시예 3.10. 기관지 폐포세척액 및 폐조직 내의 면역세포 분석

COPD 마우스 모델에서 GKB101 항체의 호흡기 손상 억제 효과를 확인하기 위하여 실시예 3의 실험 마우스에서 수득한 기관지 폐포세척액 및 폐조직 내의 면역세포를 유세포 분석을 통해 분석하였다.

구체적으로, 분리한 PBMCs, BAL 세포, 폐 세포 및 Peyer's patch 세포를 5×10⁵ 세포의 농도로 희석하여 4℃에서 면역 형광염색(immunofluorescence staining)을 실시하였다. 이때 사용한 항체는 PE-항-CD3e 항체(553064, BD Pharmingen), FITC-항-CD8 항체(553031, BD Pharmingen), PE-항-CD4 항체(553047, BD Pharmingen), PE-항-Gr-1 항체(553128, BD Pharmingen), FITC-항-CD69 항체(55732, BD Pharmingen), FITC-항-CD11b 항체(553310, BD Pharmingen) 및 PE-항-B220 항체(561878, BD Pharmingen)이다. 상기 항체를 각각의 세포에 처리하고 30 분간 얼음에서 반응시켰다. 반응 후 3회 이상 인산 완충 생리식염수로 수세한 후, 유세포 분석기로 분석하였다. 상기 분석값은 FlowJo 프로그램(FlowJo™ v7 Software, BD Biosciences)을 이용하여 CD62L^-CD44^+high&CD21/CD35⁺B220⁺ 및 SiglecF^-Gr-1⁺호중구 세포빈도를 백분율(%)로 분석한 후, 총 세포수(total cells)를 적용하여 각 조직에서의 절대 총 세포수(absolute number)를 산출하였다.

실시예 3.10.1. 기관지 폐포세척액 내의 염증세포 분석

COPD 마우스 모델에서 GKB101 항체의 호흡기 손상 억제 효과를 확인하기 위하여 실시예 3의 실험 마우스에서 수득한 기관지 폐포세척액 내의 염증세포를 실시예 3.10과 동일한 방법으로 유세포 분석하였다.

그 결과, 도 17a 및 도 17b에 나타낸 바와 같이, 대조군(COPD-CTL)에 비하여 GKB101 항체 투여군의 BAL에 침윤된 염증활성 CD4+ 및 CD8+ 절대세포수가 농도 의존적으로 유의성 있게 감소하였다. 또한, 대조군(COPD-CTL)에 비하여 GKB101 항체 투여군의 BAL에 침윤된 호중구(Gr-1⁺SiglecF^-호중구) 절대세포 수가 농도 의존적으로 유의성 있게 감소하였다.

실시예 3.10.2. 폐조직 내의 염증세포 분석

COPD 마우스 모델에서 GKB101 항체의 호흡기 손상 억제 효과를 확인하기 위하여 실시예 3의 마우스 실험에서 수득한 기관지 폐조직 내의 염증세포를 실시예 3.10과 동일한 방법으로 유세포 분석하였다.

그 결과, 도 18a 및 도 18b에 나타낸 바와 같이, 대조군(COPD-CTL)에 비하여 GKB101 항체 투여군의 폐에 침윤된 염증성 림프구(inflammation lymphocytes)(CD4⁺CD44^high+CD62L^-, B220⁺CD21⁺/CD35⁺: iBALT 형성 림프구)의 절대세포 수가 농도 의존적으로 유의성 있게 감소하였다. 특히 도 18의 L은 폐에 침윤된 호중구(Gr-1⁺SiglecF^-호중구)의 절대세포 수를 나타낸 것으로 대조군(COPD-CTL)에 비하여 GKB101 항체 투여군이 감소하고 고농도군에서 통계학적 유의성이 나타났다. 이때, 양성대조군 Dexa. 투여군(p<0.05) 및 Roflumilast 투여군(p<0.01)은 대조군(COPD-CTL)에 비하여 염증성 림프구(CD4⁺CD44^high+CD62L^-, B220⁺CD21⁺/CD35⁺: iBALT 형성 림프구)의 절대세포수가 통계학적으로 유의성 있게 감소하였다.

실시예 3.10.3. Peyer's patch에서 면역세포 분석

COPD 마우스 모델에서 GKB101 항체의 호흡기 손상 억제 효과를 확인하기 위하여 실시예 3의 마우스 실험에서 수득한 Peyer's patch에서의 면역세포를 실시예 3.10과 동일한 방법으로 유세포 분석을 통해 분석하였다. 이때, Peyer's patch는 소장 점막 면역조직으로 장관강에서 침입한 항원에 대한 국소면역을 담당하고 있다. 또한, 장내 유산균의 활성, T 세포, B 세포, 수지상세포, 그리고 M2 대식세포 활성 및 IgA 생산 전구세포의 분화 성숙에 관여하는 면역기관으로 알려져 있다.

그 결과, 도 19a 내지 도 20에 나타낸 바와 같이, COPD에 의한 염증반응으로 증가된 대조군(COPD-CTL)에 비하여 CD4⁺, CD4⁺CD69⁺ 및 B220⁺CD69⁺의 빈도수(%)는 대조군(COPD-CTL)에 비하여 GKB101 항체 투여군이 농도 의존적으로 유의성 있게 감소하였다. 이때, 양성대조군인 Roflumilast 투여군도 대조군(COPD-CTL)에 비하여 CD4⁺, CD4⁺CD69⁺ 및 B220⁺CD69⁺의 빈도수(%)가 통계학적으로 유의성 있게 감소하였다. 또한, B220^-CD11c⁺는 수지상세포 빈도수(%)를 나타낸 것으로 대조군(COPD-CTL)에 비하여 GKB101 항체 투여군에서 농도 의존적으로 증가하였다.

III. GKB101 항체의 염증성 장질환 개선 효과 검증

실시예 4. 염증성 장질환 마우스 모델을 이용한 GKB101 항체의 염증성 장질환 개선 효과 검증

염증성 장질환의 마우스 모델로 DSS 마우스 모델(dextran sulfate sodium-induced colitis model)을 사용하였다. 마우스는 6~10주령의 암컷 B57BL/6 마우스(오리엔트바이오)를 사용하였고, 온도 21~23℃, 상대습도 40~45%로 항온 항습이 유지되는 SPF(specific pathogen free) 실험동물실에서 사육되었다. 또한, 케이지 별 실험동물 개체수는 4마리 이하로 수용하며 주 3회 케이지 교환 및 사료를 공급하였다.

DSS(MP biomedical, reagent-grade, MW 36-50 KDa, cat no. 160110)를 멸균수에 2.5%의 농도로 녹인 뒤, 마우스 케이지당 100 ㎖의 2.5% DSS 용액을 2일에 1회 교체하여 공급하였다. 실험 종료일까지 정기적으로 임상적 검사를 수행하여 염증진행 정도를 확인하고 체중을 측정하였다. 이때, 시험 시작일 체중으로부터 25% 이상 감소하는 경우 윤리적 차원에서 안락사를 시행하였다. 실험은 실험 시작일로부터 7 내지 8일에 대조군의 임상지수가 최대에 도달하였다고 판단될 때 종료하였다.

시험군은 총 7군으로 나누어 진행하였다(도 21). DSS는 0일부터 투여를 시작하였으며, 1일, 3일, 5일째부터 PBS(대조군), Isotype IgG1(5 mg/kg, Bio X cell, BP0297), 양성대조군 항-TNF-α항체(5 mg/kg, Bio X cell, BP0058) 및 GKB101 항체를 각각 복강투여 하였다. 이때, vehicle인 PBS는 경구투여 하였다.

실험 시작일부터 실험 종료일까지 매일 1회 염증 발생 및 염증 정도를 관찰하여 도 22의 기준에 따라 0~4점의 점수를 부여하여 그 합계를 임상활성지수(disease activity index: DAI)로 사용하였다. 또한, 체중을 매일 1회 측정하여 도 22의 기준에 따라 0-4점의 점수를 부여하여 DAI 측정에 사용하였다.

각각의 평가 지표에 대한 암맹평가 자료를 기반으로 대조군과 시험군 또는 두 시험군 간의 통계분석을 SPSS(IBM Corporation)를 통해 수행하였다. 양 군 간의 비교를 위해 Student's t-test 또는 Mann Whitney U test를 사용하였다. 수준은 p값이 0.05 이하이면 유의성이 있는 것으로 하였다.

실시예 4.1. 임상지표 평가

실시예 4.1.1. 임상활성지수 평가

DSS 마우스 모델에서 GKB101 항체의 염증성 장질환의 개선 효과를 확인하기 위하여, 실시예 4의 실험 마우스에서 염증 증상 발생 및 체중 변화를 기반으로 임상활성지수(disease activity index: DAI)를 정량적으로 평가하였다(도 22).

그 결과, 도 23에 나타낸 바와 같이, 양성대조군인 항-TNF-α 항체 투여군 및 GKB101 항체 투여군(2.5 mg/kg, 10 mg/kg, 15 mg/kg)에서 모두 대조군(PBS)과 비교하여 유의적으로 임상활성지수가 감소하였다. 특히, GKB101 항체 투여군에서는 투여 농도 의존적으로 장질환 개선 효과를 나타내었다. Isotype IgG1과 비교하였을 때, 양성대조군(항-TNF-α 항체)에서는 통계적 유의성이 없었으나, GKB101 항체 투여군(10 mg/kg 및 15 mg/kg)에서는 유의성 있는 감소 효과를 나타내었다.

임상지표의 AUC(area under the curve)를 분석한 결과에서도 임상지표의 time course 결과와 유사한 양상을 보였다. 양성대조군(항-TNF-α 항체) 및 GKB101 항체 투여군(2.5 mg/kg, 10 mg/kg, 15 mg/kg)에서 모두 PBS 투여군과 비교하여 유의적으로 감소하였다. 특히, GKB101 항체 투여군(10 mg/kg, 15 mg/kg)에서는 양성대조군보다 더 뚜렷한 감소 효과를 관찰할 수 있었다(도 24).

상기 결과를 통해, GKB101 항체는 10 mg/kg 이상의 농도에서 임상에서 표준치료제로 널리 사용되고 있는 항-TNF-α 항체보다 더 좋은 임상지표의 감소효과를 나타내었음을 확인할 수 있었다.

실시예 4.1.2. 체중감소 스코어 평가

또한, DAI를 평가 항목 중 하나인 체중감소 스코어(body weight loss score)를 평가한 결과, 도 25에 나타낸 바와 같이, 정상군에 비하여 체중감소가 뚜렷하였지만 대조군과 비교하였을 시, GKB101 항체 투여군 및 양성대조군(항-TNF-α 항체) 모두에서 통계적으로 유의한 차이를 관찰할 수 없었다. 상기 결과에 대해 체중감소 스코어의 AUC를 분석한 결과에서도 상기와 동일한 결과를 나타내었다(도 26).

실시예 4.1.3. 대변의 일관성 스코어 평가

DSS 마우스 모델에서 GKB101 항체의 염증성 장질환의 개선 효과를 확인하기 위하여, 실시예 4의 실험 마우스에서 대변의 일관성(stool consistency) 스코어를 평가하였다.

그 결과, 도 27에 나타낸 바와 같이, 대조군에 비해 양성대조군(항-TNF-α 항체)에서 통계적으로 유의한 감소를 나타내었다. GKB101 항체 투여군의 경우, 2.5 mg/kg, 10 mg/kg, 및 15 mg/kg 투여군에서 모두 유의성 있는 감소 효과가 관찰되었고, 특히 GKB101 항체 10 mg/kg 및 15 mg/kg 투여군에서는 훨씬 더 뚜렷한 감소 효과가 관찰되었다. 대변의 일관성 스코어의 AUC를 분석한 결과에서도 GKB101 항체 투여군에서 모두 대조군에 비해 통계적으로 유의한 감소 효과를 나타내었다(도 28).

실시예 4.1.4. 장 출혈 스코어 평가

DSS 마우스 모델에서 GKB101 항체의 염증성 장질환의 개선 효과를 확인하기 위하여, 실시예 4의 실험 마우스에서 장 출혈(intestinal bleeding) 스코어를 평가하였다.

그 결과, 도 29에 나타낸 바와 같이, 대조군에 비해 양성대조군(항-TNF-α 항체) 및 GKB101 투여군에서 모두 유의적인 감소 효과가 관찰되었다. 장 출혈 스코어의 AUC를 분석한 결과에서도, 양성대조군(항-TNF-α 항체) 및 GKB101 항체 투여군에서 모두 대조군에 비해 통계적으로 유의한 감소 효과를 나타내었다(도 30).

실시예 4.1.5. 장 길이 측정

DSS 마우스 모델에서 GKB101 항체의 염증성 장질환의 개선 효과를 확인하기 위하여, 실시예 4의 실험 마우스에서 대장 조직을 적출하여 장 길이 및 중량을 측정하였다.

그 결과, 도 31 내지 도 33에 나타낸 바와 같이, 대조군에서는 정상군에 비해 대장 길이가 약 44.5% 감소되었으나, 양성대조군(항-TNF-α 항체) 및 GKB101 항체 투여군(10 mg/kg, 15 mg/kg)에서는 대조군과 비교하여 유의적으로 대장 길이의 손상이 감소된 것을 확인할 수 있었다. 특히, GKB101 투여군(10 mg/kg, 15 mg/kg)의 대장 길이는 양성대조군(항-TNF-α 항체)에 비해 더 길게 유지된 것을 확인할 수 있었다. 대장의 무게는 GKB101 항체 투여군(15 mg/kg)에서만 대조군에 비해 통계적으로 유의한 증가가 관찰되었다.

상기 결과를 통해, GKB101 항체는 농도 의존적으로 대장의 손상을 억제하는 것을 확인할 수 있었으며, 특히 10 mg/kg 이상의 농도로 투여할 시 월등한 억제 효과를 나타낼 수 있음을 확인하였다.

실시예 4.2. 대장염 조직의 조직병리 분석을 통한 조직 형태학적 평가

DSS 마우스 모델에서 GKB101 항체의 염증성 장질환의 개선 효과를 확인하기 위하여, 실시예 4의 실험 마우스에서 대장 조직을 적출하여 H&E로 염색하여 대장조직의 형태를 관찰하였다(200X 배율). 관찰된 결과는 도 34의 항목 및 지표 기준에 따라 점수를 부여하고 평가항목에 대한 점수를 합산하여 최종적으로 조직의 형태를 평가하였다(도 34). 이때, H&E 염색은 실시예 3.6과 동일한 방법으로 수행하였다.

그 결과, 도 35 내지 도 38에 나타낸 바와 같이, 대장 조직의 염증활성도 및 조직손상평가에서 GKB101 항체 투여군은 대조군(PBS) 또는 항체 음성대조군(Isotype IgG1)에 비해 농도 의존적으로 유의성 있는 치료효과를 나타내었다. 또한, 임상적으로 광범위하게 사용 중인 궤양성 대장염 치료제인 항-TNF-α 항체와 비교하여 통계적으로 유의성 있는 우수한 치료효과를 나타내었다. DSS 마우스 모델에서 처리군별 및 개별 마우스별로 임상활성지수(DAI, clinical disease activity index) 및 총 형태학적 스코어(total histological score)간의 상관관계를 확인한 결과를 통해 GKB101 항체 투여군 및 양성대조군(항-TNF-α 항체)의 DAI는 조직형태학적 정량평가지표에 의해 잘 반영되는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 4.3. 비장 무게 평가

DSS 마우스 모델에서 GKB101 항체의 염증성 장질환의 개선 효과를 확인하기 위하여, 실시예 4의 실험 마우스에서 비장조직을 적출하여 무게를 측정하였다.

그 결과, 도 39에 나타낸 바와 같이, Isotype IgG1에 비하여 양성대조군(항-TNF-α 항체) 및 GKB101 항체 투여군에서 모두 통계적으로 유의한 차이를 보이지는 않았다.

실시예 4.4. GKB101 항체의 반복 투여에 따른 in vivo 안전성 평가

DSS 마우스 모델에서 GKB101 항체의 안전성 평가를 위하여, 투여 시작일(0일)부터 투여 종료 직전(7일)까지 매일 마우스 체중을 측정하였다.

그 결과, 도 40에 나타낸 바와 같이, 투여기간 동안 정상군을 제외하고 모든 대장염 유도군에서 유사한 정도의 체중감소가 일어났음을 확인하였다.

IV. GKB101 항체의 류마티스 관절염 개선 효과 검증

실시예 5. 류마티스 관절염에 대한 WARS1의 임상적 상관성 확인

류마티스 관절염(RA)과 WARS1과의 상관성을 확인하기 위하여, 류마티스 관절염 환자의 활강액 내 WARS1 단백질의 농도 및 류마티스 관절염 질환의 심각도와의 상관성을 확인하였다. 이때, 활강액 내의 WARS1의 농도는 ELISA를 이용하여 측정하였다.

구체적으로, WARS1 측정은 GKB101 항체를 1 ㎍/㎖ 농도로 96웰 플레이트(Maxisorp, Thermo fisher)에 코팅한 뒤, 1% BSA가 포함되어 있는 PBS로 상온에서 1시간 동안 블로킹하였다. 활강액은 1/2로 희석하여 코팅된 웰에 각각 첨가하고 상온에서 1시간 동안 반응시킨 뒤, PBST(PBS+ Tween20)로 4번 세척하였다. 이때, 재조합 WARS1 단백질은 0.1 내지 50 ng/㎖의 농도 내에서 1/2씩 단계적으로 희석하여(serial dilution) 표준 농도 물질로 사용하였다. 각 웰에 항-WARS1 항체(항-WARS 항체, abFrontier)를 첨가하여 상온에서 1시간 동안 반응시킨 뒤, PBST로 4번 세척하였다. HRP가 붙어있는 2차 항체로(항-인간 IgG1 항체, cell signaling) 1시간 동안 반응시킨 뒤, PBST로 세척하고 TMB 기질(BD)로 발색시켜 490 nm에서 OD값을 측정하였다(VersaMax Microplate reader).

도 41a 및 도 41b에 나타낸 바와 같이, 먼저 퇴행성 관절염(OA) 환자 및 류마티스 관절염(RA) 환자의 활강내 WARS1의 농도를 비교한 결과, 퇴행성 관절염 환자 대비 류마티스 관절염 환자에서 통계 유의적으로 WARS1의 농도가 증가한 것을 확인할 수 있었다. 또한, 류마티스 관절염 환자의 활막 내 형성된 섬유조직(pannus) 또는 신생혈관생성 형성 정도를 GSUS(greyscale ultrasound)를 통해 측정하여 상기 WARS1의 농도와 비교한 결과, WARS1의 농도가 높을수록 섬유조직 및 신생혈관의 형성이 유의적으로 증가한 것을 확인할 수 있었다. 뿐만 아니라, 상기 WARS1의 농도는 활강액 내 침윤된 백혈구 및 각종 면역세포(호중구, 림프구), 염증인자(ESR, CRP) 및 염증성 사이토카인(IL-6) 및 케모카인(IL-8)의 농도와 양의 상관관계(positive correlation)를 나타내었다.

실시예 6. 류마티스 관절염 마우스 모델을 이용한 GKB101 항체의 류마티스 관절염 개선 효과 검증

류마티스 관절염 모델인 CIA(collagen-induced arthritis) 마우스 모델을 이용하여 GKB101 항체의 류마티스 관절염(RA)에 대한 개선 효과를 확인하였다.

마우스는 6~10주령의 수컷 DBA/1J 마우스를 사용하였고, 온도 21~23℃, 상대습도 40~45%로 항온 항습이 유지되는 SPF실험동물실에서 사육되었다. 또한, 케이지 별 실험동물 개체수는 6마리 이하로 수용하며 주 2회 케이지 교환 및 사료를 공급하였다.

먼저, CIA 마우스 모델을 제작하기 위하여, 관절염 유도를 위한 자극제는 10 mM 아세트산(acetic acid)에 2 mg/㎖이 되도록 2형 콜라겐(bovine type II collagen)을 녹인 뒤, Complete Freund's adjuvant(CFA, 2 mg/㎖)과 1:1(v/v)로 혼합하여 준비하였다. 상기 방법으로 준비한 콜라겐을 마우스의 꼬리에 마리 당 100 ㎕씩 피내주사 하여 1차 면역화를 수행하였다. 1차 면역화를 진행한 21일 후, IFA(incomplete Freund's adjuvant) 및 2형 콜라겐을 1:1(v/v)로 섞어 에멀전화한 후, 마우스 꼬리에 마리 당 100 ㎕씩 피내주사 하여 2차 면역화를 진행하였다. 2차 면역화를 수행한 마우스는 무작위로 실험군을 나누어 실험을 수행하였다.

실험은 총 2회 실시하였고, 1회 실험에서는 실험군당 총 4마리의 마우스를 사용하였다. 상기 실험군은 대조군(vehicle, PBS), 항체 음성대조군(Isotype IgG1, 15 mg/kg) 및 GKB101 항체(15 mg/kg) 투여군으로 나누어 진행하였다(도 42). 2회 실험에서는 군당 5마리의 마우스를 사용하였으며, 대조군(vehicle, PBS), 항체 음성대조군(Isotype IgG1, 15 mg/kg), 양성대조군으로 항-TNF-α 항체(15 mg/kg), TLR4 억제제(TAK242, 5 mg/kg) 및 MTX(2 mg/kg), 및 GKB101 항체(15 mg/kg) 투여군으로 나누어 진행하였다. 투여는 2차 면역화 수행일(21일)부터 3일에 1회(총 4회) 실시하였고, 투여경로는 복강투여로 진행하였다(도 47).

실시예 6.1. 관절염 임상 지수 평가

CIA 마우스 모델을 이용하여 GKB101 항체의 류마티스 관절염(RA)에 대한 개선 효과를 확인하기 위하여, 실시예 6(1차 실험)과 동일한 방법으로 마우스 실험을 수행하였다. 마우스에 실험 물질을 투여하기 시작한 후부터 네 발에서의 관절염 발생 및 중증도의 임상적 평가를 도 53에 나타낸 바와 같이 임상지표 기준에 따라 평가하였다.

그 결과, 도 43에 나타낸 바와 같이, Isotype IgG1 투여군에서 대조군(vehicle)과 비슷한 수준의 염증활성도를 확인하였다(대조군 vs Isotype IgG1 투여군, 10.30±1.20 vs 11.25±2.21). GKB101 항체 투여군의 경우, 대조군 또는 Isotype IgG1 투여군에 비해 유의적으로 감소하였다(Isotype IgG1 투여군 vs GKB101 항체 투여군, 11.15±2.21 vs 6.95±2.09, p<0.001, 대조군 vs GKB101 항체 투여군, 10.30±1.20 vs 6.95±2.09, p<0.001). CAI의 AUC를 분석한 결과에서도 투여 기간 동안의 결과와 유사한 양상을 나타냈다. 대조군 및 Isotype IgG1 투여군은 유사한 수준의 염증 활성도를 나타내었으며 GKB101 항체 투여군에서 대조군 또는 Isotype IgG1 투여군에 비해 유의적으로 감소하였다(대조군 vs GKB101 항체 투여군, 98.7±6.5 vs 59.4±16.9, p<0.001; Isotype IgG1 투여군 vs GKB101 항체 투여군, 90.2±13.3 vs 59.4±16.9, p<0.001).

상기 결과 중, CAI가 2점 이상인 관절염이 발생한 발의 빈도(%)를 확인한 결과 CAI 증가와 유사한 패턴을 보였으며, Isotype IgG1 투여군의 경우, 관절염 발생빈도가 대조군과 비슷한 수준으로 진행된 것을 확인할 수 있었다. GKB101 항체 투여군에서는 대조군 또는 Isotype IgG1 투여군과 비교하였을 때 통계적으로 유의하게 감소한 것을 확인할 수 있었다(Isotype IgG1 투여군 vs GKB101 투여군, 67.50±16.87 vs 27.50±18.45, p<0.05, 대조군 vs GKB101 항체 투여군, 75.00±17.8 vs 27.50±18.45, p<0.01). 관절염 발생률(arthritis incidence)의 AUC 분석결과에서도 대조군 및 Isotype IgG1 투여군에 비하여 GKB101 항체 투여군에서 유의적으로 감소한 것을 확인하였다(대조군 vs GKB101 항체 투여군, 542.5±112.0 vs 208.8±182.8, p<0.01; Isotype IgG1 투여군 vs GKB101 항체 투여군, 423.8±148.9 vs 208.8±182.8, p<0.01)(도 54).

상기 결과를 통해, GKB101 항체 투여 시, 염증성 관절염 모델에서 치료 효과가 있음을 확인할 수 있었다.

실시예 6.2. 족부 관절 조직의 조직학적 분석

CIA 마우스 모델을 이용하여 GKB101 항체의 류마티스 관절염(RA)에 대한 개선 효과를 확인하기 위하여, 실시예 6(1차 실험, 도 42)의 실험 마우스의 족부 관절을 H&E 염색하여 관찰하였다. 총 4가지 항목(synovial hyperplasia, pannus formation, cartilage destruction 및 bone erosion)의 조직학적 평가 기준을 바탕으로 조직학적 스코어(histological score)를 측정하였다. 이때, H&E 염색은 실시예 3.6과 동일한 방법으로 수행하였다.

그 결과, 도 44에 나타낸 바와 같이, 대조군 및 Isotype IgG1 투여군에서는 활막세포의 과증식과 함께 판누스 조직의 증가로 연골파괴 및 뼈 미란이 관찰되었다. 반면, GKB101 항체 투여군에서는 대조군 또는 Isotype IgG1 투여군과 비교하여 활막세포의 증식량이 뚜렷하게 감소된 양상을 나타냈다. 또한, 연골 및 뼈의 파괴정도도 감소하였다. 각 파라미터(parameter)의 스코어링 결과를 살펴보면 GKB101 항체 투여군에서 Isotype IgG1 투여군 대비 hyperplasia가 60% 이상 감소하였음을 확인할 수 있었고, 연골파괴(cartilage destruction)는 78.5%, 섬유조직(판누스 형성, pannus formation) 및 골 파괴(bone erosion)은 90% 이상의 뚜렷한 억제 효과를 나타내었다.

실시예 6.3. GKB101 항체의 안정성 평가

CIA 마우스 모델을 이용하여 GKB101 항체의 안정성을 확인하기 위하여, 실시예 6(1차 실험, 도 42)의 실험 마우스의 체중을 측정하였다.

그 결과, 관절염을 유도하기 않은 정상군(normal)에 비하여 관절염 발생군에서 전반적으로 체중이 다소 감소한 경향을 보였다. 하지만, Isotype IgG1 투여군 및 GKB101 항체 투여군 간에는 유의적인 차이가 나타나지 않았다(도 45).

실시예 6.4. 혈청 및 족부 관절 내의 염증성 사이토카인 및 케모카인 농도 분석

CIA 마우스 모델을 이용하여 GKB101 항체의 류마티스 관절염(RA)에 대한 개선 효과를 확인하기 위하여, 실시예 6(1차 실험, 도 42)의 실험 마우스의 혈청 및 족부 관절을 수득하여 염증성 사이토카인 및 케모카인의 농도를 측정하였다.

구체적으로, 관절조직에서 피부조직을 제거한 뒤, 측정하고 단백질 용해 버퍼(protein lysis buffer)를 첨가하여 용해하였다. 상기 용해물을 13,000 rpm으로 원심분리하여 상층액만을 수득한 뒤, 정량하여 족부 관절 단백질로 사용하였다. 혈청 및 족부 관절 내 WARS1, 염증성 사이토카인 및 케모카인은 ELISA를 통해 측정하였다. 이때, WARS1은 실시예 5의 방법으로 측정하였다. mCXCL2/MIP-2, mIL-6, mMIP1α의 농도는 mouse CXCL2/MIP-2 ELISA(R&D systems), mouse IL-6 ELISA(BioLegend), mouse MIP1-α ELISA(R&D systems) 키트를 이용하여 측정하였고, 방법은 제조사의 방법 따라 진행하였다.

그 결과, 도 46에 나타낸 바와 같이, 대조군, Isotype IgG1 투여군 및 GKB101 항체 투여군의 혈청 내에서는 WARS1, 염증성 사이토카인 및 케모카인의 농도가 유사하게 관찰되었다. 족부 관절의 경우 대조군 및 Isotype IgG1 투여군에서 WARS1, mCXCL2/MIP-2(IL-8 homologue), IL-6 및 MIP1α의 농도가 증가된 반면, GKR101 항체 투여군에서는 유의적으로 감소하는 것을 관찰할 수 있었다. 상기 결과는 ANOVA 통계 프로그램을 사용하여 분석하였으며, #p<0.05, ##p<0.01, ###p<0.001이다.

실시예 6.5. 관절염 임상 지수 평가

CIA 마우스 모델을 이용하여 GKB101 항체의 류마티스 관절염(RA)에 대한 개선 효과를 확인하기 위하여, 실시예 6(2차 실험, 도 47)과 동일한 방법으로 마우스 실험을 수행하였다. 마우스에 실험 물질을 투여하기 시작한 후부터 네 발에서의 관절염 발생 및 중증도의 임상적 평가를 도 53에 나타낸 바와 같이 임상지표 기준에 따라 평가하였다.

그 결과, Isotype IgG1 투여군에서 대조군과 비슷한 수준의 염증 활성도를 확인하였다. GKB101 항체 투여군의 경우, 양성대조군인 TLR4i 또는 MTX 투여군과 유사한 수준으로 CAI가 감소하는 것을 확인할 수 있었다(도 48 및 도 49).

실시예 6.6. 족부 관절 내 침윤된 면역세포 분석

CIA 마우스 모델을 이용하여 GKB101 항체의 관절염 치료 효과를 확인하기 위하여, 실시예 6(2차 실험, 도 47)의 실험 마우스의 족부 관절을 수득하여 관절 내 침윤된 면역세포를 유세포 분석을 통해 확인하였다.

구체적으로, 유세포 측정을 위하여 마우스의 족부 관절을 자른 뒤 1 mg/㎖의 콜라겐 분해효소 용액(in 2% FBS+RPMI1640 배지)을 첨가하여 37℃ 진탕 배양기(180 rpm, 20 분)에서 반응시켰다.

반응 후에는 상층액만 회수하였다. 상기 과정을 4회 반복하여 족부 관절 내 세포를 수득하였다. 상기 방법으로 수득된 세포를 유세포 분석기에서 분석하여 백분율(%)로 분석한 후, 총 세포수를 적용하여 각 조직에서의 절대세포수(absolute number)를 산출하였다. 상기 수득된 세포에 APC-항-CD45 항체(Invitrogen, 47-0451-82), PE-cy5-항 CD11b 항체(Invitrogen, 15-0112-82), APC-항-F4/80 항체(Invitrogen, 17-4801-82), APC-항-CD4 항체(Invitrogen, 17-0042-82) 및 eFluorscence450-항 CD3e 항체(Invitrogen, 48-0031-82)를 각각 샘플 튜브에 처리하여 반응시킨 뒤, FACS 버퍼로 세척하였다. 이후 fix/perm buffer(Invitrogen, 00-5523-00)을 사용하여 샘플을 고정/투과시키고, 다시 해당 샘플튜브에 Alexa488-항-iNos 항체(Invitrogen, 53-5920-82), PE-Cy7-항-CD206 항체(Invitrogen, 25-2061-82), PE-Cy7-항-IL-17a 항체(Invitrogen, 25-7177-82) 및 FITC-항-IFNγ 항체(Invitrogen, 11-7311-82)를 각각 처리하여 반응시켰다. 반응이 끝난 뒤, FACS 버퍼로 세척하고 유세포 분석을 수행하여 백분율(%)로 분석하였다. 상기 분석 결과에 총 세포를 적용하여, Paw joint에서의 절대 세포수(absolute number)를 산출하였다.

그 결과, 총 면역세포의 수 및 M1/M2 대식세포의 분극화는 Isotype IgG1 투여군에서 대조군과 비슷한 수준으로 확인되었으며, GKB101 항체 투여군의 경우 양성대조군인 TLR4i 또는 MTX 투여군과 유사한 수준으로 감소한 것을 확인할 수 있었다. 이때, Th1 및 Th2 세포는 항-TNF-α 항체 또는 MTX 투여군과 유사한 수준으로 감소하였다(도 50). 상기 결과는 모두 표준편차(SEM)으로 표기되었으며, ANOVA 통계 프로그램을 사용하여 분석하였다. #p<0.05, ##p<0.01, ###p<0.001, #: vs 대조군, *: vs IgG1 투여군, §: vs 항-TNF-α 항체 투여군

실시예 6.7. 족부 관절 내 염증성 사이토카인 및 케모카인의 농도 분석

CIA 마우스 모델을 이용하여 GKB101 항체의 류마티스 관절염(RA)에 대한 개선 효과를 확인하기 위하여, 실시예 6(실험 2, 도 47)의 실험 마우스의 족부 관절 내 염증성 사이토카인 및 케모카인의 농도를 ELISA를 이용하여 측정하였다. 이때, 족부 관절 내의 단백질 수득은 실시예 6.7과 동일한 방법으로 수행하였다.

염증성 사이토카인 및 케모카인의 농도는 mouse IL-17 DuoSet ELISA(R&D Systems) 및 mouse IL-17F DuoSet ELISA(R&D Systems) 키트를 사용하여 측정하였다. 또한, TNF-α, IL-6, CCL3/MIP-α 및 CXCL2/MIP-2α의 측정은 Milliplex MAP Mouse Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel, Milliplex, MCYTOMAG-70K(Millipore)을 이용하여 측정하였다. 모든 측정은 제조사에서 제공하는 측정방법에 따라 진행하였다.

그 결과, GKB101 항체 투여군의 TNF-α, IL-6, IL-17F, CXCL2/MIP-2α 및 CCL3(MIP-1α)의 농도는 양성대조군인 MTX 또는 TLR4i 투여군과 유사한 수준으로 감소하였으며, 항-TNF-α 항체보다 더 유의적으로 염증성 사이토카인 및 케모카인의 농도가 감소하였다(도 51). 모든 데이터는 표준편차(SEM)으로 표기되었고 ANOVA 통계 프로그램을 사용하여 분석하였다. #p<0.05, ##p<0.01, ###p<0.001, #: vs 대조군, *: vs IgG1 투여군

실시예 6.8. 족부 관절 내 연골파쇄인자 및 파골세포 분화인자의 농도 분석

CIA 마우스 모델을 이용하여 GKB101 항체의 류마티스 관절염(RA)에 대한 개선 효과를 확인하기 위하여, 실시예 6(실험 2, 도 47)의 실험 마우스의 족부 관절 내 연골파쇄인자 및 파골세포 분화인자의 농도를 ELISA를 이용하여 측정하였다. 이때, 족부 관절 내의 단백질 수득은 IgG1과 동일한 방법으로 수행하였다.

연골파쇄인자 및 파골세포 분화인자의 농도는 mouse total MMP-3 DuoSet ELISA(R&D Systems) 및 mouse TRANCE/RANKL/TNFSF11 DuoSet ELISA(R&D Systems) 키트를 이용하여 측정하였다. 모든 측정은 제조사에서 제공하는 측정방법에 따라 진행하였다.

그 결과, 연골파쇄인자인 MMP3 및 파골세포 분화인자인 RANKL의 농도는 Isotype IgG1 투여군에서 대조군과 비슷한 수준으로 확인되었고, 양성대조군인 MTX 또는 항-TNF-α 항체 투여군의 경우 MMP3의 농도는 감소시켰지만 RANKL의 농도는 감소시키지 못하였다. 반면, GKB101 항체 또는 TLR4i 투여군의 경우, MMP3 및 RANKL의 농도를 모두 유의적으로 감소시켰다(도 52). 모든 데이터는 표준편차(SEM)으로 표기되었고 ANOVA 통계 프로그램을 사용하여 분석하였다. #p<0.05, ##p<0.01, ###p<0.001, #: vs 대조군, *: vs IgG1 투여군, §: vs 항-TNF-α 항체 투여군

V. GKB101 항체의 피부염 개선 효과 검증

실시예 7. 아토피에 대한 WARS1의 임상적 상관성 유의성 확인

아토피 질환 및 WARS1의 상관관계를 확인하기 위하여, 아토피 환자의 혈중 WARS1의 농도, 사이토카인 및 TARC(thymus and activation-regulated chemokine)의 농도를 측정하여 이들의 상관성을 분석하였다.

평가는 아토피 환자군 14명, 정상군 54명을 대상으로 대상군의 혈액 내 WARS1 및 염증성 사이토카인(IL-6, IL-8, TNF-α, IFN-γ, MIP-1α)의 농도를 측정하였다. 이때, WARS1은 실시예 5와 동일한 방법으로 측정하였다.

그 결과, 도 55a 및 도 55b에 나타낸 바와 같이 정상군(HC)에 비하여 아토피 환자(AD)의 혈액 내 WARS1 농도가 유의적으로 증가하였다. 또한, IL-6, IL-8, TNF-α, IFN-γ 및 MIP-1α의 농도도 유의적으로 증가하였다.

상기 결과를 바탕으로, WARS1 및 사이토카인의 상관관계를 분석한 결과, 혈중 WARS1의 농도 및 사이토카인의 농도는 양의 상관관계(positive correlation)을 나타내었다.

다음으로, 혈중 WARS1 및 TARC 농도를 측정하고 이의 상관관계를 분석하였다. 이때 평가는 아토피 환자군 30명 및 정상군 30명을 대상으로 실시하였다.

그 결과, TARC의 혈중 농도는 정상군에 비하여 아토피 환자군에서 증가하였으며, WARS1의 혈중 농도와도 양의 상관관계(r=0.4411, p=0.0147)를 나타내었다(도 56).

먼저, 피부 세포주에 염증 반응을 유도하기 위하여 감염원으로 Staphylococcus aureus를 사용하였다. 상기 Staphylococcus aureus는 사용 3일 전에 BHI 아가 플레이트에서 배양하고, 1차 및 2차 배양하여 준비하였다. 인간 피부 세포주로는 각질세포(keratinocyte) 및 진피 섬유아세포(dermal fibroblast)를 사용하였다. 상기 세포주를 각각 48웰 플레이트에 1×10⁵ 세포/웰의 농도로 접종하여 10% FBS가 포함된 배지에서 페니실린-스트렙토마이신 없이 24시간 배양하였다. 감염 당일 상기 세포의 배지를 DMEM 배지로 교체하면서, 0, 0.1, 1 또는 10 moi(multiplicity of infection)의 Staphylococcus aureus로 감염시켰다. 또한, 동시에 각 웰에 GKB101 항체를 0 ㎍, 2.5 ㎍ 또는 5 ㎍의 농도로 처리하였다. 24시간 뒤, 세포 배양액 내의 WARS1 및 CXCL-8/IL-8의 농도를 ELISA 방법으로 측정하였다. WARS1의 농도는 실시예 5와 동일한 방법으로 측정하였고, CXCL-8/IL-8는 CXCL2/MIP-2 ELISA 키트(R&D)를 이용하여 측정하였다. 상기에 따른 측정 결과 모두 ANOVA 통계 프로그램을 사용하여 분석하였다. ***p<0.001, **p<0.01, ***p<0.001.

그 결과, 두 종류의 인간 피부 세포주에서 모두 staphylococcus aureus의 감염에 의해 증가되었던 배양액 내의 WARS1 및 CXCL8/IL-8 농도가 GKB101 항체 처리에 의해 농도 의존적으로 감소하였다(도 57 및 도 58).

실시예 8. 아토피 마우스 모델에서 GKB101 항체의 아토피 개선 효과 검증

GKB101 항체의 피부염 개선 효과를 확인하기 위하여, 아토피 마우스 모델에서 GKB101의 항염 활성을 평가하였다.

마우스는 6~10주령의 수컷 NC/Nga 마우스를 사용하였고, 온도 21~23℃, 상대습도 40~45%로 항온 항습이 유지되는 SPF 실험동물실에서 사육되었다. 또한, 케이지 별 실험동물 개체수는 3마리 이하로 수용하며 주 1회 케이지 교환 및 사료를 공급하였다.

먼저, 아토피 마우스 모델을 제작하기 위하여, 실험 시작 1일 전 NC/Nga 마우스의 등쪽 윗쪽 부분까지 최대한 제모기로 제모하고, 도포할 부위에 4％ SDS 수용액을 분무하여 피부의 지방 성분을 제거하였다. 약 1시간 동안 완전히 건조시킨 후 편편한 스틱을 이용하여 Biostir AD(아토피 피부염 유발 시약, 집먼지진드기) 연고 100 mg을 등쪽에 균일하게 도포하였다. Biostir AD 연고 도포는 주 2회로 6주간 총 13회 실시하였고, Stapylococcus aureus는 21일째부터 마리 당 4×10⁷ CFU/100 ㎕씩 총 7회 등쪽에 도포하였다. GKB101 항체(5 mg/kg) 또는 Isotype IgG1(5 mg/kg)는 1주에 2회로 총 11회 복강투여 하였다(도 59).

실시예 8.1. 등조직의 염증 정도 및 두께 비교

아토피 마우스 모델에서 GKB101 항체의 피부염 개선 효과를 확인하기 위하여, 실시예 8의 실험 마우스 등조직의 염증정도 및 피부의 두께를 관찰하였다. 이때, 등조직의 피부 두께는 염증이 유발된 부위를 칼리퍼(caliper)로 총 3회 측정하여 평균값으로 제시하였다.

아토피 유발 39일 후 피부염이 유발된 부위를 관찰한 결과 Isotype IgG1 투여에 비하여 GKB101 항체 투여군에서 염증 유발 진행 정도가 감소한 경향을 보였다. 또한, 아토피 유발 35일째 등피부 두께 측정의 결과의 경우 정상군(naive)에 비해 Isotype IgG1 투여군에서 2배 이상 두께가 증가하였다(p<0.001). GKB101 항체 투여군에서는 정상군(naive)에 비하여 등조직의 두께가 유의적으로 증가하였지만(p<0.001), Isotype IgG1 투여군에 비하여 표피의 두께가 유의적으로 감소하였음을 확인할 수 있었다(p<0.05)(도 60).

실시예 8.2. 등조직의 병리학적 분석

아토피 마우스 모델에서 GKB101 항체의 피부염 개선 효과를 확인하기 위하여, 실시예 8의 실험 마우스 등조직을 H&E로 염색하고 조직의 병리학적 형태를 관찰하였다.

구체적으로, 적출한 등조직에서 피부조직을 소량 취하여 4% 파라포름알데하이드에 24시간 동안 고정 후, 6시간 동안 흐르는 물에서 수세하고 에탄올(ethanol)에서 자일렌(xylene)에 이르는 탈수 과정을 진행하여 조직 슬라이드을 제작하였다. 상기 과정을 통해 제작된 파라핀 블록을 microtome을 이용하여 10 um의 두께로 박절하였다. 조직 슬라이드는 일반적인 조직처리 과정을 거쳐 H&E로 염색한 후 광학현미경으로 조직의 변화를 관찰하였다. H&E 염색은 실시예 3.6과 동일한 방법으로 수행하였다.

그 결과, 아토피 염증 유발 후 39일째에 표피 두께를 비교한 결과, 정상군(naive)에 비해 Isotype IgG1 투여군(대조군)에서 유의하게 두꺼워져 있는 것을 확인하였다(p<0.01). 특히 아토피 유발 후 GKB101 항체 투여군의 등조직 두께는 정상군에 비하여 유의하게 증가하였으나(p<0.01), Isotype IgG1 투여군(대조군)에 비해서는 유의하게 감소하였다(p<0.001). 또한, 등조직 내의 림프구 및 단핵구의 침윤을 관찰한 결과, 대조군과 비교하여 GKB101 항체 투여군에서는 침윤된 면역세포가 감소하는 것을 확인할 수 있었다(p<0.01)(도 61a 및 도 61b).

실시예 8.3. 등조직 및 혈중 WARS1 및 염증성 사이토카인 발현 분석

아토피 마우스 모델에서 GKB101 항체의 피부염 개선 효과를 확인하기 위하여, 실시예 8의 실험 마우스 등조직 및 혈액을 채취하여 WARS1 및 염증성 사이토카인의 농도를 측정하였다.

등조직 내의 단백질 발현은 먼저 등조직의 피부조직 단백질을 추출한 뒤, 피부 내 상기 단백질 발현을 측정하였다. WARS1의 농도는 실시예 5의 방법과 동일한 방법으로 측정하였고, IgE 및 CXCL2/MIP-2(IL-8 homologue)는 각각 mouse IgE ELISA 키트(BioLegend) 및 mCXCL2/MIP-2 ELISA 키트(R&D systems)를 이용하여 측정하였다.

그 결과, 등조직 내의 WARS1의 발현은 Isotype IgG1 투여군과 정상군(naive)에서는 차이를 보이지 않았고, GKB101 항체 투여군에서는 유의적으로 감소하였다(p<0.01). 염증성 사이토카인인 CXCL-8/IL-8, IL-6 및 IL-17은 정상군에 비하여 Isotype IgG1 투여군에서 유의적으로 증가(p<0.01)하였고, GKB101 항체 투여군에서는 감소하는 경향을 나타냈다. 혈청 내 WARS1의 발현은 정상군(naive)에 비하여 Isotype IgG1 투여군에서 증가한 것이 관찰되었고, GKB101 항체 투여군에서 유의적으로 감소하는 것을 확인할 수 있었다(p<0.01)(도 62).

비만세포의 매개하여 심각한 면역반응과 과민반응을 일으키는 혈청 내 IgE 항체 농도를 측정한 결과, Isotype IgG1 투여군에서 정상군(naive)보다 유의적으로 IgE의 농도가 증가하였고(p<0.001). GKB101 항체 투여군도 Isotype IgG1 투여군과 유사한 수준의 IgE 농도를 나타내었다(도 63).

Claims (4)

1. 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 H-CDR1, 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 H-CDR2 및 서열변호 7의 아미노산 서열을 포함하는 H-CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역; 및
   서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 L-CDR1, 서열번호 14 및 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 L-CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역;
   으로 이루어진 항-WARS1 항체 또는 이의 단편을 유효성분으로 포함하는 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
2. 제1항에 있어서,
   상기 항체 또는 이의 단편의 중쇄 가변영역은 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 가변영역은 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
3. 제1항에 있어서,
   상기 항체 또는 이의 단편의 중쇄 영역은 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 영역은 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
4. 제1항에 있어서,
   상기 질환은 만성폐쇄성폐질환, 염증성 장질환, 류마티스 관절염 및 피부염으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 것인, 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.