KR101886415B1 - 트립토파닐-tRNA 합성효소 유전자를 포함하는 재조합 벡터 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 돼지 유래의 트립토파닐-tRNA 합성효소 유전자를 포함하는 재조합 벡터 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명의 재조합 벡터는 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질을 융합파트너(fusion partner)로 사용하여 숙주세포 내에서 목적 단백질의 수용성을 증가시켜, 재조합 단백질 생산에 유용하게 이용될 수 있을 것이다.

Description

트립토파닐-tRNA 합성효소 유전자를 포함하는 재조합 벡터 및 이의 용도{Recombinant vector comprising tryptophanyl-tRNA synthetase gene and uses thereof}

본 발명은 트립토파닐-tRNA 합성효소 유전자를 포함하는 재조합 벡터 및 이의 용도에 관한 것이다.

유전자 재조합 기술이 발달되면서 동물세포, 효모 및 대장균과 같은 원핵생물(prokaryote) 등을 이용하여 유용한 목적 단백질이 많이 생산되고 있으며, 이들 단백질이 의약품 등의 생물공학 산업에 널리 이용되고 있다. 특히 대장균은 세포의 성장 속도가 빠르고 그의 유전자에 대한 규명이 다른 생물체에 비해 잘 연구되어 있으므로, 유전자 재조합 기술에서 목적 단백질을 생산하기 위한 숙주세포로 많이 이용되고 있다.

대장균에서 재조합 단백질을 생산하기 위한, 강력한 유도성(inducible) 프로모터를 갖춘 다양한 발현벡터가 개발되어 왔다. 그러나 숙주세포로 대장균을 사용할 경우 제조하고자 하는 단백질이 대장균 내의 단백질 분해효소에 의해 분해되어 수율이 낮아지는 경우가 많으며, 특히 분자량 10 kDa 이하의 작은 크기의 폴리펩타이드의 발현에서 이러한 경향이 심한 것으로 알려져 있다. 또한 재조합 단백질이 대장균에서 과다 발현되면 불용성 응집체(insoluble aggregate)의 형태로 세포질 내에 축적되는 경우가 많으며, 이러한 단백질을 활성형으로 만들기 위해서는 고농도의 우레아(urea) 또는 구아니딘-하이드로클로라이드(guanidine hydrochloride)와 같은 변성제(denaturant)를 사용하여 응집체를 녹여 1차 구조로 풀어주어야 하고, 상기에서 사용한 시약을 제거한 후 풀어진 단백질을 정확히 재접힘(refolding)시켜야만 한다. 그러나 단백질마다 재접힘 조건이 다르기 때문에 효율적인 재접힘 조건을 알아내는데 많은 시간과 비용이 요구된다.

목적 단백질이 응집체 형태로 생산될 때 유발되는 상기와 같은 문제점을 개선하기 위하여, 대장균에서 목적 단백질을 수용성 단백질 형태로 발현시키는 것은 중요하다. 목적 단백질을 효과적으로 발현시키기 위한 방법으로는, 첫번째, 목적 단백질의 아미노 말단에 신호 서열(signal sequence)을 연결함으로써 목적 단백질이 대장균의 주변세포질(periplasm)로 분비되도록 하여 수용성 형태로 얻는 방법이 있으나, 이 방법은 단백질의 발현 효율이 낮아 산업적으로는 그 효용이 떨어진다. 두번째, 목적 단백질을 단백질의 접힘(folding)에 관여하는 샤페론(chaperones) 유전자와 함께 발현시킴으로써 수용성 단백질을 얻는 방법이 있지만, 이러한 방법은 특정한 단백질의 경우에만 효과가 있으므로 응집체가 형성되는 것을 억제할 수 있는 효과적인 방법이 아니다. 세번째, 대장균에서 발현이 잘되는 단백질을 융합파트너(fusion partner)로 선택하고, 상기 융합파트너 단백질의 카르복실 말단에 목적 단백질을 융합하여 수용성 단백질을 얻는 방법이 있다. 이때 융합파트너 단백질의 카르복실 말단에 목적 단백질을 연결하면 융합파트너 단백질의 초기 합성 신호(translation initiation signals)를 효과적으로 이용할 수 있고, 융합파트너 단백질과 결합한 목적 단백질의 수용성이 증가되어 대장균에서 목적 단백질이 수용성 단백질 형태로 다량 발현될 수 있다.

상기의 재조합 단백질을 수용성으로 발현하기 위하여 시도된 방법 중에서 가장 효과적인 방법은 대장균에서 발현이 잘되는 수용성의 융합파트너 단백질을 이용하여 목적 단백질의 수용성을 증가시키는 것이다. 지금까지 대장균에서 목적 단백질을 생산하기 위해 Lac Z 또는 Trp E 단백질 등이 융합파트너 단백질로 사용되었으나, 이로부터 발현된 목적 단백질은 대부분 응집체 형태로 생산되어 활성형의 단백질을 얻는데 어려움이 있었다. 따라서 활성을 갖는 목적 단백질을 용이하게 발현시킬 수 있는 새로운 융합파트너 단백질을 발견하고자 하는 많은 시도들이 이루어졌다.

트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(tryptophanyl-tRNA synthethase, WRS)은 병원성 세균 및 바이러스 침입시 면역세포에서 분비되어 선천면역을 활성화시키는 물질로써 대장균에서 수용성 단백질 형태로 발현된다.

이에 본 발명에서는 융합파트너 단백질로 트립토파닐-tRNA 합성효소 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 개발하였고, 상기 재조합 벡터를 사용할 경우 숙주세포 내에서 목적 단백질의 수용성이 증가되는 것을 확인하였다.

한편, 한국등록특허 제1252835호에는 '아미노아실-tRNA 합성효소의 조성물 및 그것의 용도'가 개시되어 있고, 한국공개특허 제2017-0027258호에는 '트립토파닐 티알엔에이 합성효소를 이용한 패혈증의 진단용 조성물과 진단 마커 검출 방법'이 개시되어 있으나, 본 발명의 트립토파닐-tRNA 합성효소 유전자를 포함하는 재조합 벡터 및 이의 용도에 대해서는 기재된 바가 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명에서는 융합파트너로서의 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 트립토파닐-tRNA 합성효소 유전자와 목적 단백질을 코딩하는 유전자가 순차적으로 연결된 재조합 벡터를 제작하고, 상기 재조합 벡터로 대장균 균주를 형질전환하여 발현시킨 결과, 트립토파닐-tRNA 합성효소 유전자가 융합파트너로 사용되지 않은 군에 비해서, 본 발명의 재조합 벡터로 형질전환된 대장균에서 목적 단백질의 수용성이 증가되는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 트립토파닐-tRNA 합성효소 유전자와 목적 단백질을 코딩하는 유전자가 순차적으로 연결된 것을 특징으로 하는 재조합 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포 및 상기 숙주세포를 형질전환하여 목적 단백질 코딩 유전자를 발현하는 단계를 포함하는, 목적 단백질의 수용성을 증가시키는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터를 숙주세포에 형질전환하는 단계; 및 상기 형질전환된 숙주세포를 배양하여 목적 단백질을 발현시키는 단계를 포함하는 숙주세포 내에서 수용성이 증가된 목적 단백질의 생산 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터를 유효성분으로 포함하는, 수용성이 증가된 목적 단백질의 생산용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 수용성이 증가된 목적 단백질 및 상기 목적 단백질을 유효성분으로 함유하는 식중독 또는 대장균증 예방용 백신 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 트립토파닐-tRNA 합성효소(WRS) 유전자를 융합파트너로 이용한 재조합 벡터는 대장균에서 수용성으로 발현되지 않는 목적 단백질을 수용성 형태의 단백질로 발현시킬 수 있고, 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질은 동물 유래 단백질로써 독성 및 부작용에 대한 위험이 적으므로, 트립토파닐-tRNA 합성효소 유전자를 포함하는 본 발명의 재조합 벡터를 이용하면 백신, 사료첨가제, 또는 의약 조성물 등에 활용될 수 있는 유용 목적 단백질의 생산에 활용될 수 있을 것이다.

도 1은 돼지 유래 트립토파닐-tRNA 합성효소 유전자(pWRS)와 목적 단백질(Gene of interest)을 코딩하는 유전자가 순차적으로 연결된 본 발명의 제조합 벡터의 모식도이다.
도 2는 pWRS 유전자가 포함되지 않은 재조합 벡터(A) 또는 pWRS 유전자가 포함된 재조합 벡터(B)로 형질전환된 세포에서 클로스트리듐 퍼프린겐스(Clostridium perfringens)의 베타 독소(beta toxin) 단백질의 발현 경향을 확인한 SDS-PAGE 및 면역블롯(immunoblot)의 결과이다. NC; mock 벡터로 형질전환된 대장균의 전세포 용해물, WCL; 전세포 용해물(whole cell lysate), SOL; 수용성 단백질(soluble protein), INSOL; 비수용성 단백질(insoluble protein).
도 3은 pWRS 유전자가 포함되지 않은 재조합 벡터(A) 또는 pWRS 유전자가 포함된 재조합 벡터(B)로 형질전환된 세포에서 장독소형대장균(ETEC, Enterotoxigenic Escherichia coli)의 섬모 독소(pili toxin) K88 단백질의 발현 경향을 확인한 SDS-PAGE 및 면역블롯의 결과이다.
도 4는 pWRS 유전자가 포함되지 않은 재조합 벡터(A) 또는 pWRS 유전자가 포함된 재조합 벡터(B)로 형질전환된 세포에서 ETEC의 섬모 독소 K99 단백질의 발현 경향을 확인한 SDS-PAGE 및 면역블롯의 결과이다.
도 5는 pWRS 유전자가 포함되지 않은 재조합 벡터(A) 또는 pWRS 유전자가 포함된 재조합 벡터(B)로 형질전환된 세포에서 ETEC의 섬모 독소 987P 단백질의 발현 경향을 확인한 SDS-PAGE 및 면역블롯의 결과이다.
도 6은 pWRS 유전자가 포함되지 않은 재조합 벡터(A) 또는 pWRS 유전자가 포함된 재조합 벡터(B)로 형질전환된 세포에서 ETEC의 섬모 독소 F18ac 단백질의 발현을 확인한 SDS-PAGE 및 면역블롯의 결과이다.
도 7은 pWRS 유전자가 포함되지 않은 재조합 벡터(A) 또는 pWRS 유전자가 포함된 재조합 벡터(B)로 형질전환된 세포에서 ETEC의 이열성 장내독소 서브유닛 B(heat-labile enterotoxin subunit B, LTB) 단백질의 발현 경향을 확인한 SDS-PAGE 및 면역블롯의 결과이다.
도 8은 pWRS 유전자가 포함되지 않은 재조합 벡터(A) 또는 pWRS 유전자가 포함된 재조합 벡터(B)로 형질전환된 세포에서 ETEC의 Stx2eB(shiga toxin subunit B) 단백질의 발현 경향을 확인한 SDS-PAGE 및 면역블롯의 결과이다.
도 9는 pWRS 유전자가 포함되지 않은 재조합 벡터(A) 또는 pWRS 유전자가 포함된 재조합 벡터(B)로 형질전환된 세포에서 ETEC의 LTB-Stx2eB 단백질의 발현 경향을 확인한 SDS-PAGE 및 면역블롯의 결과이다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 트립토파닐-tRNA 합성효소 유전자와 목적 단백질을 코딩하는 유전자가 순차적으로 연결된 것을 특징으로 하는 재조합 벡터를 제공한다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 재조합 벡터에서, 상기 트립토파닐-tRNA 합성효소 유전자는 돼지 유래일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명에 따른 상기 돼지 유래 트립토파닐-tRNA 합성효소 유전자는 대장균의 코돈 사용빈도(codon usage)에 맞춰 코돈 최적화한 서열번호 1의 염기서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한 상기 염기서열의 상동체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기 서열과 각각 70% 이상, 더 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열 (추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제 (즉, 갭)를 포함할 수 있다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 재조합 벡터에 있어서, 상기 목적 단백질을 코딩하는 유전자는 숙주세포의 코돈 사용빈도에 맞춰 코돈 최적화된 서열일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 재조합 벡터는 T7 프로모터 및 6x히스-태그(6xHis-tag) 코딩 유전자, 돼지 유래 트립토파닐-tRNA 합성효소 유전자 및 목적 단백질을 코딩하는 유전자가 순차적으로 연결된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 재조합 벡터에 있어서, 상기 목적 단백질은 숙주세포 내에서 수용성으로 발현되지 않는 난발현성의 특성을 가진 단백질일 수 있고, 이에 한정되지 않으나, 독소, 항원, 항체, 효소 등의 단백질일 수 있다. 상기 목적 단백질은 예를 들면, 클로스트리듐 퍼프린겐스(Clostridium perfringens) 베타 독소(beta toxin), 장독소형대장균(Enterotoxigenic Escherichia coli , ETEC) 섬모 독소(pili toxin) K88, K99, 987P, 및 F18ac, ETEC의 이열성 장내독소 서브유닛 B(heat-labile enterotoxin subunit B, LTB), ETEC의 Stx2eB(shiga toxin subunit B) 및 ETEC의 LTB-Stx2eB 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 용어 "목적 단백질(target protein)"은 당업자가 대량으로 생산하고자 하는 단백질로서, 재조합 발현 벡터에 상기 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 삽입하여 형질전환체에서 발현이 가능한 모든 단백질을 의미한다.

본 발명의 용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 코딩된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 단편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.

본 발명의 용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다.

본 발명의 벡터는 전형적으로 발현 또는 클로닝을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 원핵세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터 (예를 들면, pLλ 프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, T7 프로모터, tac 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 리보솜 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 숙주 세포로서 대장균(Escherichia coli)이 이용되는 경우, E. coli 트립토판 생합성 경로의 프로모터 및 오퍼레이터 부위, 그리고 파아지 λ의 좌향 프로모터 (pLλ 프로모터)가 조절 부위로서 이용될 수 있다.

본 발명의 재조합 벡터는 당업자에 주지된 방법에 의해 구축될 수 있다. 상기 방법은 시험관 내 재조합 DNA 기술, DNA 합성 기술 및 생체 내 재조합 기술 등을 포함한다. 상기 DNA 서열은 mRNA 합성을 이끌기 위해 발현 벡터 내의 적당한 프로모터에 효과적으로 연결될 수 있다. 또한 벡터는 번역 개시 부위로서 리보솜 결합 부위 및 전사 터미네이터를 포함할 수 있다.

재조합 발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 수 있다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 상기 마커 유전자는 항생제 내성 유전자(dominant drug resistance gene) 또는 영양요구 마커 유전자(auxotrophic marker gene)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다.

본 발명의 벡터를 원핵세포에 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주세포는 당업계에 공지된 어떠한 숙주세포도 이용할 수 있으며, 예컨대, E. coli Rosetta, E. coli BL21, E. coli JM109, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포는 E. coli Rosetta-gami(DE3)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 벡터를 숙주세포 내로 운반하는 방법은, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl₂ 방법, 하나한 방법(Hanahan, D., 1983 J. Mol. Biol. 166, 557-580) 및 전기천공 방법 등에 의해 실시될 수 있다. 또한, 숙주세포가 진핵세포인 경우에는, 미세주입법, 칼슘포스페이트 침전법, 전기천공법, 리포좀-매개 형질감염법, DEAE-덱스트란 처리법, 및 유전자 밤바드먼트 등에 의해 벡터를 숙주세포 내로 주입할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 숙주세포를 형질전환하여 목적 단백질 코딩 유전자를 발현하는 단계를 포함하는, 목적 단백질의 수용성을 증가시키는 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 숙주세포는 E. coli Rosetta-gami(DE3)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명은

상기 재조합 벡터를 숙주세포에 형질전환하는 단계; 및

상기 형질전환된 숙주세포를 배양하여 목적 단백질을 발현시키는 단계를 포함하는 숙주세포 내에서 수용성이 증가된 목적 단백질의 생산 방법을 제공한다.

본 발명의 목적 단백질의 생산 방법에 있어서, 상기 형질전환된 숙주세포의 배양은 공지된 기술을 이용하여 목적 단백질의 생산에 적합한 배지에서 이루어질 수 있다. 적합한 배양 배지는 상업적으로 입수하거나 예를 들면, American Type Culture Collection의 카탈로그와 같은 간행물에 기재된 성분 및 조성비에 따라 제조할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명의 목적 단백질의 생산 방법은, 목적 단백질이 발현된 숙주세포로부터 목적 단백질을 분리 및 정제하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 분리 방법은 예를 들어 원심분리, 여과, 추출, 분무 건조, 증발 또는 침전을 포함하는 통상적인 방법에 의해서 배지로부터 분리될 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 더 나아가 분리된 단백질은 크로마토그래피 (예를 들면 이온 교환, 친화성, 소수성 및 크기별 배제), 전기영동, 분별 용해 (예를 들면 암모늄 설페이트 침전), SDS-PAGE 또는 추출을 포함하는 공지된 다양한 방법을 통해서 정제될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터를 유효성분으로 포함하는, 수용성이 증가된 목적 단백질의 생산용 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물은, 융합된 목적 단백질의 수용성을 증가시키는 트립토파닐-tRNA 합성효소 유전자를 포함하는 재조합 벡터가 유효성분으로 포함되어 있어, 수용성이 증가된 목적 단백질의 생산성을 증가시킬 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 수용성이 증가된 목적 단백질 및 상기 목적 단백질을 유효성분으로 함유하는 식중독 또는 대장균증 예방용 백신 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 목적 단백질은 트립토파닐-tRNA 합성효소가 융합된 형태의 재조합 단백질로, 본 발명의 일 구현 예에 따른 상기 목적 단백질은 항원으로서 사용될 수 있으나 기존에는 불용성의 응집체 형태로 생산되었던 단백질로, 바람직하게는 클로스트리듐 퍼프린겐스(Clostridium perfringens) 베타 독소(beta toxin); 장독소형대장균(Enterotoxigenic Escherichia coli, ETEC) 섬모 독소(pili toxin) K88, K99, 987P, 또는 F18ac; ETEC의 LTB(heat-labile enterotoxin subunit B); ETEC의 Stx2eB(shiga toxin subunit B); 또는 ETEC의 LTB-Stx2eB일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 따른 상기 트립토파닐-tRNA 합성효소가 융합된 형태의 목적 단백질은 수용성 형태로 생산되므로, 재접힘 과정 등의 추가 공정이 필요없으며, 효과적으로 면역 반응을 유도할 수 있고, 면역증강제로서 기능하는 트립토파닐-tRNA 합성효소가 융합되어 있으므로, 백신 조성물의 유효성분으로서 사용될 수 있다.

본 발명에서 용어, "예방"이란, 조성물의 투여로 식중독 또는 대장균증의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에서 용어 "백신"은 생체에 면역을 주는 항원을 함유한 생물학적인 제제로서, 감염증의 예방을 위하여 사람이나 동물에 주사하거나 경구 투여함으로써 생체에 면역이 생기게 하는 면역원 또는 항원성 물질을 말한다. 생체 내 면역은 병원균의 감염 후에 생체 내 면역력이 자동으로 얻어지는 자동 면역과 외부에서 주입한 백신에 의하여 얻어지는 수동 면역으로 크게 나누어진다. 자동 면역은 면역에 관계하는 항체의 생성기간이 길고 지속적인 면역력의 특징이 있는 반면, 백신에 의한 수동 면역은 감염증 치료에 즉시 작용하나 지속력이 떨어지는 단점이 있다.

본 발명의 백신 조성물은 식중독의 원인이 되는 클로스트리듐 퍼프린겐스(Clostridium perfringens) 베타 독소(beta toxin)의 융합단백질을 포함할 수 있거나, 또는 장독소형대장균(Enterotoxigenic Escherichia coli, ETEC)의 다양한 항원의 융합단백질을 포함할 수 있으므로, 식중독 또는 대장균증에 대한 백신 조성물로 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 백신 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여(예를 들어, 근육 내, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 바람직하게는 경구 또는 피하 투여할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한 상기 조성물의 투여량은 사람이나 동물의 무게, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다.

상기 백신 조성물은 안정제, 유화제, 수산화알루미늄, 인산알루미늄, pH 조정제, 계면활성제, 리포솜, 이스콤(iscom) 보조제, 합성 글리코펩티드, 증량제, 카복시폴리메틸렌, 서브바이랄(subviral) 입자 보조제, 콜레라 독소, N,N-디옥타데실-N',N'-비스(2-하이드록시에틸)-프로판디아민, 모노포스포릴 지질 A, 디메틸디옥타데실-암모늄 브로마이드 및 이의 혼합물로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상의 제 2 보조제를 추가로 함유할 수 있다.

또한, 상기 백신 조성물은 수의학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 본 발명에서 용어 "수의학적으로 허용 가능한 담체"란 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 항원 보강제, 안정제, 희석제, 보존제, 항균제 및 항진균제, 등장성 작용제, 흡착 지연제 등을 포함한다. 백신용 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제, 희석제로는 락토즈, 덱스트로스, 슈크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 말티톨, 전분, 글리세린, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘포스페이트, 칼슘실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 들 수 있다.

또한, 상기 백신용 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형 및 드립(drip) 또는 스프레이 등의 비강용 제형 그리고 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용되는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제할 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 레시틴 유사 유화제에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제할 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용할 수 있다. 경구 투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등을 사용할 수 있으며, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수용성제, 현탁제, 유제, 동결건조제제가 포함된다. 비수용성제제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리 에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 비강내 투여를 위한 제제에 적합한 침투제는 일반적으로 당업자에게 공지되어 있다. 그러한 적합한 제형물은 안정성과 순응도를 위해 바람직하게 무균, 등장 및 완충되도록 제형화된다. 비강내 투여를 위한 제제는 또한 정상적인 섬모 작용을 유지시키기 위해 점액 분비를 여러 측면에서 자극하도록 제조되며, 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, 18th Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA(1990))에 기술된 바와 같이, 적합한 제형이 바람직하게 등장성의, pH 5.5 내지 6.5를 유지하는 약간 완충된 제형이며, 가장 바람직하게 항미생물 방부제 및 적합한 약물 안정화제를 포함한다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

제조예 1. 재조합 벡터의 제조

융합파트너(fusion partner)로 사용된 돼지 유래 트립토파닐-tRNA 합성효소(pWRS) 유전자를 대장균의 코돈 사용빈도(codon usage)에 적합하게 합성을 한 후(서열번호 1), 합성된 염기서열의 5'- 및 3'- 부위에 제한효소 NcoI 및 EcoRI를 처리하여 선별하였다. 상기 선별된 유전자는 동일한 제한효소로 처리된 벡터의 다클론부위(multicloning site)에 삽입하였다. 상기 벡터는 T7 프로모터 및 6x히스-태그(6xHis-tag)를 가지고 있는 pHis parallel 벡터로서, pWRS 유전자와 목적 단백질인 클로스트리듐 퍼프린겐스(Clostridium perfringens) 베타 독소(beta toxin), 장독소형대장균(Enterotoxigenic Escherichia coli, ETEC) 섬모 독소(pili toxin) K88, K99, 987P, 및 F18ac, ETEC의 이열성 장내독소 서브유닛 B(heat-labile enterotoxin subunit B, LTB), ETEC의 Stx2eB(shiga toxin subunit B) 및 ETEC의 LTB-Stx2eB를 코딩하는 유전자를 순차적으로 연결하여 재조합 벡터를 제작하였다.

실시예 1. 형질전환체에서 목적 단백질의 발현 경향 분석

상기 제조예 1의 방법으로 제조된, pWRS 유전자와 목적 단백질을 코딩하는 유전자가 순차적으로 연결된 재조합 벡터와 pWRS 유전자가 포함되어 있지 않고 목적 단백질을 코딩하는 유전자만 포함되어 있는 재조합 벡터로 E. coli Rosetta-gami(DE3) Competent Cells(Novagen)을 각각 형질전환하였다. 상기 형질전환된 콜로니를 5 ㎖의 LB 액체배지에 접종하고 밤새 배양한 후, 새로운 200 ㎖의 LB 액체배지에 상기 배양된 배양액을 2 ㎖ 넣어 다시 배양하였다. 배양 1~2시간 후에 배양액의 흡광도(optical density, OD)값이 0.5~0.6에 도달하였을 때 1M의 이소프로필-β-D-1-티오갈락토피라노시드(isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside, IPTG)를 첨가한 후 각각의 조건으로 배양하였다. 베타독소는 30℃에서 4 및 22시간, 섬모독소 K88은 30℃에서 4 및 22시간, 섬모독소 K99는 30℃에서 4, 6 및 22시간, 섬모독소 987P는 30℃에서 9 및 22시간, 섬모독소 F18ac는 30℃에서 4, 6 및 22시간, LTB는 30℃에서 10, 20 및 22시간, Stx2eB는 30℃에서 12, 20 및 22시간, LTB-Stx2eB는 30℃에서 12, 20 및 22시간 동안 배양하였다.

형질전환된 세포를 배양한 배양액을 4,000 rpm으로 7분간 원심분리하여 세포 펠렛(cell pellet)을 회수하였고, 세포 펠렛을 5 ㎖의 인산완충식염수(phosphate buffered saline, PBS)로 부유시킨 후, 이 중 500 ㎕만 취하여 초음파 분쇄기로 세포를 파쇄하였으며 상기 세포 파쇄액을 다시 원심분리하여, 수용성 단백질이 존재하는 상층액과 비수용성 단백질이 존재하는 세포 펠렛을 10% SDS-PAGE 겔에 각각 로딩(loading)하여 전기영동을 수행하였다.

전기영동이 끝난 후, 쿠마시-블루(coomassie-blue) 용액으로 겔을 염색시키고, 탈염색(destaining) 용액(glacial acetic acid 100 ㎖, Methanol 450 ㎖, H₂O 450 ㎖)을 사용하여 겔의 탈색 과정을 거친 다음, 겔에서 단백질 발현을 확인하였다. 면역블롯(immunoblot)의 경우 겔을 PVDF계 멤브레인에 트랜스퍼(transfer)하고 1:1,000의 비율로 희석된 anti-His 항체를 1:1,000를 사용하여 단백질의 발현을 확인하였다.

그 결과, pWRS 유전자가 포함되어 있지 않은 재조합 벡터로 형질전환된 세포에서는 목적 단백질이 수용성 형태로 발현되지 않는 것으로 관찰되었다(도 2A, 도 3A, 도 4A, 도 5A, 도 6A, 도 7A, 도 8A 및 도 9A). 반면에 pWRS 유전자가 포함되어 있는 재조합 벡터로 형질전환된 세포에서는 목적 단백질이 수용성 형태로 발현되는 것을 관찰하였다(도 2B, 도 3B, 도 4B, 도 5B, 도 6B, 도 7B, 도 8B 및 도 9B).

이를 통해, 돼지 유래 트립토파닐-tRNA 합성효소(pWRS) 유전자는, 상기 유전자의 카르복실 말단에 융합된 목적 단백질의 수용성 형태의 단백질로의 생산성을 증가시킬 수 있음을 확인하였다.

<110> The Industry & Academic Cooperation in Chungnam National University (IAC) <120> Recombinant vector comprising tryptophanyl-tRNA synthetase gene and uses thereof <130> PN17269 <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1428 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> tryptophanyl-tRNA synthetase <400> 1 gcggatgtgc cgaacggcga acagggctgc agcagcccgc tggaactgtt taacagcatt 60 gcggcgcagg gcgaactggt gcgtagcctg aaagcgcgtc atgcggcgaa agatgaaatt 120 gatagcgcgg tgaaaatgct gctgagcctg aaaatgagct ataaagcggc gatgggcgaa 180 gattataaag cggattgccc gccgggcaac cgtgcgccgg gcattgatag cggcctggat 240 gcgaccgaag cgggcgatga ttttgtggat ccgtggaccg tgcagaccag cagcgcgaaa 300 ggcattgatt atgataaact gattgtgcgt tttggcagca gcaaaattga taaagaactg 360 attgatcgta ttgaacgtgc gaccggccag cgtccgcatc gttttctgcg tcgtggcatt 420 ttttttagcc atcgtgatat gaaccaggtg ctggatgcgt atgaaaacaa aaaaccgttt 480 tatctgtata ccggccgtgg cccgagcagc gaagcgatgc atgtgggcca tctgattccg 540 tttattttta ccaaatggct gcaggatgtg tttaacgtgc cgctggtgat tcagatgacc 600 gatgatgaaa aatatctgtg gaaagaactg accctggaac aggcgcatgg ctatgcggtg 660 gaaaacgcga aagatattat tgcgtgcggc tttgatgtga acaaaacctt tatttttagc 720 gatctggatt atatgggcat gagcccgggc ttttataaaa acgtggtgaa aattcagaaa 780 catgtgacct ttaaccaggt gaaaggcatt tttggcttta ccgatagcga ttgcattggc 840 aaaattagct ttccggcgat tcaggcggcg ccgagcttta gcagcagctt tccgcagatt 900 tttcgtgatc gtaccgatat tcagtgcctg attccgtgcg cgattgatca ggatccgtat 960 tttcgtatga cccgtgatgt ggcgccgcgt attggctatc cgaaaccggc gctgctgcat 1020 agcacctttt ttccggcgct gcagggcgcg cagaccaaaa tgagcgcgag cgatccgaac 1080 agcagcattt ttctgaccga taccgcgaaa cagattaaaa ccaaagtgaa caaacatgcg 1140 tttagcggcg gccgtgatac cattgaagaa catcgtcagt ttggcggcaa ctgcgatgtg 1200 gatgtgagct ttatgtatct gacctttttt ctggaagatg atgatcgtct ggaacagatt 1260 cgtaaagatt atagcagcgg cgcgatgctg accggcgaac tgaaaaaagt gctgattgaa 1320 gtgctgcagc cgctgattgc ggaacatcag gcgcgtcgta aagaagtgac cgatgaagtg 1380 gtgaaagaat ttatgacccc gcgtaaactg agctatgatt ttgaataa 1428

Claims (11)

1. 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 트립토파닐-tRNA 합성효소 유전자와 목적 단백질을 코딩하는 유전자가 순차적으로 연결된 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
2. 제1항에 있어서, T7 프로모터 및 6x히스-태그(6xHis-tag) 코딩 유전자, 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 트립토파닐-tRNA 합성효소 유전자 및 목적 단백질을 코딩하는 유전자가 순차적으로 연결된 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
3. 삭제
4. 제1항에 있어서, 상기 목적 단백질은 난발현성의 단백질인 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
5. 제1항 내지 제2항 및 제4항 중 어느 한 항의 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포.
6. 제1항 내지 제2항 및 제4항 중 어느 한 항의 재조합 벡터로 숙주세포를 형질전환하여 목적 단백질 코딩 유전자를 발현하는 단계를 포함하는, 목적 단백질의 수용성을 증가시키는 방법.
7. 제1항 내지 제2항 및 제4항 중 어느 한 항의 재조합 벡터를 숙주세포에 형질전환하는 단계; 및
   상기 형질전환된 숙주세포를 배양하여 목적 단백질을 발현시키는 단계를 포함하는 숙주세포 내에서 수용성이 증가된 목적 단백질의 생산 방법.
8. 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 트립토파닐-tRNA 합성효소 유전자와 목적 단백질을 코딩하는 유전자 순차적으로 연결된 재조합 벡터를 유효성분으로 포함하는, 수용성이 증가된 목적 단백질의 생산용 조성물.
9. 삭제
10. 삭제
11. 삭제

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