KR20230163121A - Whep 도메인을 포함하는 오량체 기반의 융합 단백질 및 이를 발현하는 시스템 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 목적 단백질의 발현 효율을 증진시키기 위한 융합 단백질에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 목적단백질에 오량체형 독소단백질 및 hEPRS(Glutamyl-prolyl-tRNA synthetase from human)의 WHEP 도메인(EPRS 단백질의 중간 부분에 위치한 WHEP 도메인 TRS-1, TRS-2, TRS-3와 세 도메인을 연결하는 링커를 포함함)을 결합하여 제조된 융합단백질에 관한 것으로, 본 발명에 따른 hEPRS의 WHEP 도메인은 목적 단백질의 대장균에서의 발현을 위한 융합 파트너로 사용될 때, 목적 단백질의 수용성이 향상되었다.

Description

WHEP 도메인을 포함하는 오량체 기반의 융합 단백질 및 이를 발현하는 시스템 {A PENTAMER-BASED FUSION PROTEIN COMPRISING A WHEP DOMAIN AND A SYSTEM FOR EXPRESSING THE SAME}
본 발명은 목적 단백질의 발현 효율을 증진시키기 위한 융합 단백질에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 목적단백질에 WHEP 도메인, 예컨대 hEPRS(Glutamyl-prolyl-tRNA synthetase from human) 및 오량체형 독소단백질을 결합하여 제조된 융합 단백질에 관한 것이다. 본 발명에 따라 제조된 융합 단백질은 오량체 기반의 형태로 이루어지며, 목적 단백질의 수용성을 향상시킨다.
생명공학 기술에 의해 생산되는 단백질에는 일반적으로 면역 조절 및 효소 저해제 및 호르몬 같은 의약 및 연구용 단백질과 진단용 단백질이나 반응 첨가 효소와 같은 산업용 단백질로 대별될 수 있으며, 이 두 가지 단백질들을 중심으로 생산 공정 기술 개발 및 산업화가 추진되고 있다. 특히 재조합 미생물 기술을 이용하여 유용한 재조합 단백질을 생산할 때, 유전정보가 잘 알려져 있으며 다양한 벡터 시스템을 구축하고 있고, 비교적 값싼 배지에서 빠르게 고농도로 배양할 수 있는 장점을 갖는 대장균이 연구 또는 상업적 목적으로 다양하게 사용되고 있다.
대장균에서 재조합 단백질을 생산함에 있어, 강력한 유도성(inducible) 프로모터를 갖춘 다양한 발현벡터가 개발되어 외래단백질의 생산에 이용되어 왔다. 그러나 숙주세포로 대장균을 이용하는 경우 제조하고자 하는 단백질이 대장균 내의 단백질 분해효소에 의해 분해되어 수율이 낮아지는 경우가 많으며, 특히 분자량이 10kDa 이하의 작은 크기의 폴리펩타이드의 발현에서 이러한 경향이 심한 것으로 알려져 있다. 뿐만 아니라 일반적으로 대장균은 단백질의 전사(transcription)와 전이(translation)가 거의 동시에 일어나기 때문에 재조합 단백질의 과다 발현시 불용성 응집체(inclusion body)를 형성하는 경우가 많으며, 응집체로 발현된 폴리펩타이드의 경우 접힘(folding) 중간체가 분자 상호간의 다이설파이드 결합(intermolecular disulfide bond) 또는 소수성 상호작용(hydrophobic interaction)에 의해 숙주세포의 다른 단백질 불순물들[샤페론(chaperon), 라이보좀(ribosome), 초기인자 등]과 비선택적으로 결합함으로써 목적 폴리펩타이드의 응집체 내 순도가 떨어지는 단점이 있다. 또한 이렇게 발현된 단백질을 활성형으로 만들기 위해서는 구아니딘-하이드로클로라이드(Guanidine hychloride)나 우레아(urea) 같은 변성체를 사용하여 용해시킨 후 희석하는 재접힘(refolding) 과정을 거쳐야하는데 이때 단백질이 활성형으로 접히지 않는 등 생산 수율이 감소하는 문제점이 있다 (Marston FA et al., Biochem J 240(1):1-12, 1986).
본 발명자들은 WHEP 도메인의 융합 단백질로서의 수용성 증진 능력을 확인하는 연구를 진행하였다. 우선적으로, 하나의 WHEP 도메인만을 갖는 TRS-1, TRS-2와, 3개의 WHEP 도메인 (TRS-1, TRS-2, TRS-3) 및 링커를 포함하는 다중 WHEP 도메인 (multiple WHEP domain; EPRS라고 칭함)을 제작하였다. 그리고 세 종류의 융합 단 백질들의 목적 단백질 수용성 증진 능력을 확인해 보았다. 세 융합 단백질들 중 다중 WHEP 도메인의 수용성 증진 능력이 가장 월등함을 확인하게 되었고 본 발명을 완성하게 되었다.
기존에 알려진 대장균에서 수용성 발현이 어려운 단백질들을 발현하 기 위하여, 융합 단백질로 TRS-1, TRS-2, EPRS을 사용하고 목적 단백질로 Green Fluorescent Protein (GFP)를 사용하여 수용성을 비교하였다. 확인 결과, hEPRS의 WHEP 도메인을 포함하는 융합 단백질 중에서는 EPRS가 수용성 상승에 가장 크게 기여하는 것으로 확인되었다. EPRS에 의한 수용성 증진 효과는 다른 목적 단백질인 Interferon beta (IFN-b), Tev protease, Heat-labile enterotoxin subunit B (LTB) 을 사용하여 추가적으로 확인되었다.
본 발명의 목적은 WHEP 도메인을 융합파트너로 이용하여 목적 단백질의 수용성 및 접힘을 향상시킬 수 있는 펩타이드, 재조합 단백질 생산용 발현벡터 또는 유전자 구조체(gene construct)를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 목적단백질의 수용성을 유의적으로 증가시킬 수 있는 WHEP 도메인의 구성을 제공함에 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 발현벡터로 형질전환 되거나 또는 유전자 구조체(gene construct)가 삽입된 재조합 미생물 및 이를 이용한 재조합 단백질의 제조방법을 제공하는데 있다.
본 발명은 i) 사람 유래 글루타밀-프롤릴 tRNA 합성효소(hEPRS, human Glutamyl-prolyltRNA synthetase)로부터 분리한 도메인, ⅱ) 오량체형 독소 단백질, 및 ⅲ) 목적 단백질의 상호 융합을 특징으로 하며, 이를 통해 원핵세포에서 정형화된 수용성 오량체를 생산할 수 있을 뿐 아니라 정제된 오량체 단백질이 목적 바이러스에 대해 뛰어난 중화능(neutralization)을 나타내는 것을 검증함으로써 본 발명을 완성하였다.
이에 본 발명은 사람 유래 글루타밀-프롤릴 tRNA 합성효소(hEPRS, human Glutamyl-prolyltRNA synthetase)로부터 분리한 도메인; 오량체형 독소 단백질; 및 목적 단백질;을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 융합단백질 발현 벡터를 제공한다.
본 명세서에서 "목적단백질(target protein)"은 당업자가 대량으로 생산하고자 하는 단백질로서, 재조합 발현벡터에 상기 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 삽입하여 숙주세포에서 발현이 가능한 단백질을 의미하며, 본 발명에서는 면역반응을 유도하는 바이러스 항원단백질이 이에 해당한다. 본 발명의 상기 목적 단백질에는 수족구 바이러스(Enterovirus) 항원 또는 코로나 바이러스(SARS-CoV-2)유래의 항원이 포함될 수 있다.
본 발명에서 상기 바이러스는 구형의 정이십면체(icosahedral) 캡시드 구조를 가지는 바이러스로서 상기 정이십면체는 소단위체인 정삼각형 20개가 모여서 만들어지는 구조이고 12개의 꼭지점은 크게 2배축(two-fold axis), 3배축(three-fold axis), 5배축(five-fold axis)이 존재하고, 축에 따라 소단위체가 오각형 또는 육각형의 조합으로 이루어지는 것일 수 있다.
이에, 본 발명의 상기 목적 단백질은 자가조립 과정에서 소단위체로 오량체 또는 육량체를 형성하는 바이러스 항원단백질 일 수 있다. 이에는 일반적으로 정이십면체를 구성하는 모든 외피형 또는 비외피형 바이러스의 오량체 구성항원에 적용될 수 있다.
지질막을 가지는 외피형 바이러스(enveloped virus)의 예로는 DNA 유전자형을 가지는 헤르페스바이러스속(Herpesviridae), 헤파드나바이러스속(Hepadnaviridae) 바이러스가 포함될 수 있고, RNA 유전자형을 가지는 플라비바이러스속(Flaviviridae)바이러스가 포함될 수 있다. 본 발명의 구체적인 일 실시예에서는 플라비바이러스속에 속하는 뎅기바이러스(Dengue virus; 이하 DV) 및 일본뇌염바이러스(Japanese Encephalitis virus; 이하 JEV)를 이용하여 재조합 벡터 및 재조합 단백질을 제조하고 원핵세포에서의 수용성 발현, 오량체 구조 형성 및 중화항체의 면역능력을 확인하였다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서, 상기 뎅기바이러스의 ED3 (E protein domain 3)는 오량체로 조립되어 숙주 세포의 수용체(receptor)와 직접적으로 결합하며 바이러스 융합(viral fusion) 및 숙주세포로의 바이러스 유전자 전달을 통한 세포 내 감염에 매우 중요한 역할을 한다(Zhang, X., et al. (2017). Structures and functions of the envelope glycoprotein in flavivirus infections. Viruses, 9(11), 338.).
본 발명에서, 지질막이 없이 바이러스 외피 단백질로 구성된 비외피형 바이러스(non-enveloped 또는 naked virus)로는, DNA 유전자형을 가지는 아데노바이러스속 (Adenoviridae), 파보바이러스속(Pavoviridae) 바이러스가 포함될 수 있고, RNA 유전자형을 가지는 레오바이러스속(Reoviridae), 피코르나바이러스속(Picornaviridae), 칼리시바이러스속(Caliciviridae) 바이러스가 포함될 수 있다. 본 발명의 구체적인 일 실시예에서는 피코르나바이러스속(Picornaviridae)에 속하는 구제역바이러스(Foot-and-mouth disease virus; 이하 FMDV)의 캡시드 단백질을 이용하여 재조합 벡터 및 재조합 단백질을 제조한 후 원핵세포에서의 수용성 발현, 오량체 구조 형성 및 중화항체의 면역능력을 확인하였다. 구제역바이러스의 외피단백질은 VP1, VP0 및 VP3단백질 각각 60개가 모여서 총 180개의 단백질로 구성되어 하나의 정이십면체를 이룬다. 3종의 상이한 구성 항원(VP1, VP0, VP3) 중 오량체의 조립에는 VP1단백질로 구성되어 있다.
본 명세서에서 "오량체형 독소 단백질"은 콜레라 독소 B 서브유닛(cholera toxin B subunit, CTB) 단백질, 이열성 장독소 B 서브유닛(heat-labile enterotoxin B subunit, LTB) 및 시가 독소 B 서브유닛(Shiga-toxin B subunit) 단백질 또는 이의 단편으로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있으나, 오량체 구조를 유도하는 활성이 유지되는 한 제한 없이 사용할 수 있다. 상기 CTB는 구조나 독성기작으로 대장균(E.coli)나 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)에서 분비되는 LTB와 매우 유사하다(Sixma, T. K., et al. (1993). Refined structure of Escherichia coli heat-labile enterotoxin, a close relative of cholera toxin. Journal of molecular biology, 230(3), 890-918.). 아울러 이질 원인균인 시겔라 유래 시가 독소 B 서브유닛과도 구조적으로 매우 유사하다(Silva, C. J., et al. (2017). Shiga Toxins: A Review of Structure, Mechanism, and Detection. Springer.). 따라서 본 발명에서의 오량체 형성 항원융합에 CTB, LTB, 시가 독소 B 서브 유닛 및 기타 유사독소의 경우에도 용이하게 적용될 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어 "발현 벡터"는 발현 벡터의 전사에 제공되는 추가단편에 작동 가능하게 연결된 목적단백질을 암호화하는 단편으로 구성되는 선형 또는 원형의 DNA 분자이다. 그와 같은 추가 단편은 프로모터 및 종료암호 서열을 포함한다. 발현 벡터는 하나 이상의 복제 개시점, 하나 이상의 선택 마커 등을 또한 포함한다. 발현 벡터는 일반적으로 플라스미드 또는 바이러스 DNA로부터 유도되거나 또는 둘 다의 요소를 함유한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "작동 가능하게 연결된"은 프로모터에서 전사가 개시하고 암호화 서열을 통해 종료암호로 진행하는데 작용하도록 단편이 배열되는 것을 나타낸다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 있어서 상기 재조합 융합단백질 발현 벡터는 1~6개의 히스티딘을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드; 및 단백질 절단효소 인식 부위를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드;를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 재조합 융합단백질 발현 벡터에 있어서, 상기 단백질 절단효소는 TEV일 수 있다.
본 발명에 따른 발현벡터에 있어서, 상기 발현벡터는 플라스미드, 바이러스 벡터, 파지 입자 또는 게놈 삽입물 일 수 있다. 상기 발현벡터는 숙주세포 내로 형질전환된 후, 숙주세포의 게놈과 무관하게 복제되거나 숙주세포의 게놈 내로 통합될 수 있다.
본 발명은 또한, 사람 유래 글루타밀-프롤릴 tRNA 합성효소(hEPRS, human Glutamyl-prolyltRNA synthetase)로부터 분리한 도메인; 오량체형 독소 단백질; 및 목적 단백질;을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 융합 단백질 발현 벡터가 형질전환 된 숙주세포를 제공한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "형질전환" 또는 "도입"은 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체외 인자로서 또는 염색체 통합 완성에 의해 복제가능하게 되는 것을 의미한다. 본 발명에 따른 발현벡터를 형질전환시키는 방법은 전기천공법(electroporation), 인산칼슘(CaPO4)법, 염화칼슘(CaCl2)법, 미세주입법(microinjection), 폴리에틸렌글리콜(PEG)법, DEAE-덱스트란법, 양이온 리포좀법 또는 초산 리튬-DMSO법을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 숙주세포에 있어서, 상기 숙주세포는 DNA의 도입효율이 높고, 도입된 DNA의 발현 효율이 높은 숙주세포가 바람직하며, 원핵 및 진핵을 포함한 모든 미생물이 사용될 수 있다. 일반적으로 단백질의 폴딩이나 단량체의 자가조립은 진핵세포에 비해 비교적 단순한 원핵세포의 경우 훨씬 어렵다. 특히 백신의 목표대상이 되는 인체, 동물 등을 감염하는 바이러스 유래 항원의 경우 인체, 동물유래 고등세포나 효모와 같은 진핵세포에서 훨씬 폴딩이나 자가조립이 용이하게 이루어진다. 이에 비해 상기한 바와 같이 대장균의 경우 항원의 폴딩/자가조립이 기술적으로 매우 어렵고 따라서 폴딩이 안된 (misfolding) 무정형의 inclusion body의 refolding이 필요한 공정상의 한계점이 존재한다. 따라서 본 발명에서 사용한 원핵세포의 대표적인 예인 대장균에서 기존 기술의 한계를 극복하여 구현된 오량체로의 폴딩, 자가조립은 매우 용이하게 인체, 동물, 곤충세포 및 효모등의 진핵세포에서 구현될 수 있음이 자명하다. 따라서 본 발명에서 사용하는 숙주세포는 세균 {에스케리키아(Escherichia)속 세균; 바실러스 (Bacillus)속 세균; 슈도모나스 (Pseudomonas)속 세균; 유산균 등 포함}뿐 아니라 효모 (Sacharomyceses cerevisiae 등의 bakers yeast, S. pombe; Pichia pastoris와 같은 메탄올 자화기능 methylotrophic yeast 등); 동물세포; 곤충 세포; 식물세포로 이루어진 군에서 선택될 수 있고, 바람직하기는, 상기 숙주세포는 대장균(E. coli)일 수 있다.
본 발명은 또한 수용성 발현 효율이 증진된 재조합 융합단백질의 제조방법을 제공한다. 상기 재조합 융합단백질의 생산방법은
(a) 사람 유래 글루타밀-프롤릴 tRNA 합성효소(hEPRS, human Glutamyl-prolyltRNA synthetase)로부터 분리한 도메인; 오량체형 독소 단백질; 및 목적 단백질;을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 제조하는 단계;
(b) 상기 발현 벡터를 숙주세포에 도입하여 형질전환체를 제조하는 단계; 및
(c) 상기 형질전환체를 배양하여 hEPRS-CTB-목적단백질 융합단백질 발현을 유도하는 단계; 를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 재조합 융합단백질 생산방법에 있어서, 상기 숙주세포는 DNA의 도입효율이 높고, 도입된 DNA의 발현 효율이 높은 숙주세포가 바람직하며, 원핵 및 진핵을 포함한 모든 미생물이 사용될 수 있다. 상기 숙주세포는 에스케리키아(Escherichia)속 세균; 바실러스 바실러스 (Bacillus)속 세균; 슈도모나스 (Pseudomonas)속 세균; 유산균; 효모; 동물세포; 및 곤충 세포로 이루어진 군에서 선택될 수 있고, 바람직하게는, 상기 숙주세포는 대장균(E. coli)일 수 있다.
본 발명은 또한, 사람 유래 글루타밀-프롤릴 tRNA 합성효소(hEPRS, human Glutamyl-prolyltRNA synthetase)로부터 분리한 도메인; 콜레라 독소 B 서브유닛 (cholera toxin B subunit; CTB) 단백질; 및 목적단백질을 포함하는 재조합 융합단백질을 제공한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "융합 단백질(fusion protein)" 또는 "재조합 단백질(recombinant protein)" 은 원래의 목적 단백질 서열의 N-말단 또는 C-말단에 다른 단백질이 연결되거나 다른 아미노산 서열이 부가된 단백질을 의미한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "단백질" 은 "펩타이드(peptide)" 또는 "폴리펩타이드(polypeptide)"와 호환성 있게 사용되며, 예컨대, 자연상태의 단백질에서 일반적으로 발견되는 바와 같이 아미노산 잔기의 중합체를 말한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 재조합 융합단백질은 WHEP-CTB-목적단백질 융합단백질을 의미하며, 상기 재조합 융합단백질은 오량체 형태로 발현될 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 있어서, 상기 재조합 융합단백질은 서열번호 9의 아미노산 서열로 표시될 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 또한, 상기 발현 벡터 또는 재조합 융합단백질을 포함하는 바이러스 감염 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명에서 "진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 진단은 바이러스의 발병 여부 또는 발병 가능성 여부를 확인하는 것이다.
상기 바이러스 감염 진단용 조성물은 바이러스 항원 단백질을 포함하는 상기 재조합 융합단백질뿐만 아니라 면역학적 분석에 사용되는 당 분야에서 일반적으로 사용되는 시약 등이 추가로 포함될 수 있다. 이러한 시약으로는 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지 물질, 용해제, 세정제, 완충제, 안정화제 등이 포함되나, 이에 제한되지 않는다. 표지 물질이 효소인 경우에는 효소 활성을 측정할 수 있는 기질 및 반응 정지제를 포함할 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 발현 벡터 또는 상기 재조합 융합단백질을 포함하는 면역 증강용 백신 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 백신 조성물은 상기 발현 벡터 또는 재조합 융합단백질을 단독으로 함유하거나 약학적으로 허용되는 담체와 함께 적합한 형태로 제형화 될 수 있으며, 부형제 또는 희석제를 추가로 함유할 수 있다. 상기에서 '약학적으로 허용되는'이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증 등과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 비독성의 조성물을 말한다.
약학적으로 허용되는 담체로는 예컨대, 경구 투여용 담체 또는 비경구 투여용 담체를 추가로 포함할 수 있다. 경구 투여용 담체는 락토스, 전분, 셀룰로스 유도체, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 등을 포함할 수 있다. 아울러, 펩티드 제제에 대한 경구투여용으로 사용되는 다양한 약물전달물질을 포함할 수 있다. 또한, 비경구 투여용 담체는 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코오스 및 글리콜 등을 포함할 수 있으며, 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸-또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현택제 등을 추가로 포함할 수 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체 및 제제는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed, Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).
본 발명의 백신 조성물은 인간을 비롯한 포유동물에 어떠한 방법으로도 투여할 수 있다. 예를 들면, 경구 또는 비경구적으로 투여할 수 있다. 비경구적인 투여방법으로는 이에 한정되지는 않으나, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장내 투여일 수 있다.
본 발명의 백신 조성물은 상술한 바와 같은 투여 경로에 따라 경구 투여용 또는 비경구 투여용 제제로 제형화 할 수 있다.
경구 투여용 제제의 경우에 본 발명의 조성물은 분말, 과립, 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 슬러리제, 현탁액 등으로 당업계에 공지된 방법을 이용하여 제형화될 수 있다. 예를 들어, 경구용 제제는 활성성분을 고체 부형제와 배합한 다음 이를 분쇄하고 적합한 보조제를 첨가한 후 과립 혼합물로 가공함으로써 정제 또는 당의정제를 수득할 수 있다. 적합한 부형제의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨 및 말티톨 등을 포함하는 당류와 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분 및 감자 전분 등을 포함하는 전분류, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오즈 및 하이드록시프로필메틸-셀룰로즈 등을 포함하는 셀룰로즈류, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈 등과 같은 충전제가 포함될 수 있다. 또한, 경우에 따라 가교결합 폴리비닐피롤리돈, 한천, 알긴산 또는 나트륨 알기네이트 등을 붕해제로 첨가할 수 있다.
나아가, 본 발명의 백신 조성물은 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다. 비경구 투여용 제제의 경우에는 주사제, 크림제, 로션제, 외용연고제, 오일제, [0206] 보습제, 겔제, 에어로졸 및 비강흡입제의 형태로 당업계에 공지된 방법으로 제형화할 수 있다. 이들 제형은 모든 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서인 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, 19th ed, Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995)에 기재되어 있다.
본 발명의 조성물의 총 유효량은 단일 투여량(single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple dose)으로 장기간 투여되는 분할 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 질환의 정도에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있다. 바람직하게 본 발명의 약학적 조성물의 바람직한 전체 용량은 1일당 환자 체중 1㎏ 당 약 001㎍ 내지 10,000mg, 가장 바람직하게는 0.1 mg 내지 500 mg일 수 있다. 그러나 상기 약학적 조성물의 용량은 제제화 방법, 투여 경로 및 치료 횟수뿐만 아니라 환자의 연령, 체중, 건강 상태, 성별, 질환의 중증도, 식이 및 배설율등 다양한 요인들을 고려하여 환자에 대한 유효 투여량이 결정되는 것이므로, 이러한 점을 고려할 때 당 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 본 발명의 조성물의 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있을 것이다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 본 발명의 효과를 보이는 한 그 제형, 투여 경로 및 투여 방법에 특별히 제한되지 아니한다.
본 발명에서는 단량체간 정형화된 상호작용을 유도할 수 있는 오량체 구조체(scaffold)로서 CTB를 사용하였고 3개의 이종 단백질 융합을 통해 이러한 문제를 모두 해결하였다. 이러한 도메인 조합에 따라 놀랍게도 대장균과 같은 균체내에서도 외래 단백질의 폴딩과 다중구조복합체(multimer)를 유도하여 수용성과 오량체의 생성효율이 크게 향상되었다. 이를 통해 실제로 대장균 시스템에서 발현하였음에도 불구하고 고등세포인 식물세포를 통한 기존 기술 대비 오량체 형성 효율이 200~300% 이상 향상되었다(Kim, T. G., et al. (2010). Cholera toxin B subunit-domain III of dengue virus envelope glycoprotein E fusion protein production in transgenic plants. Protein expression and purification, 74(2), 236-241.). 이뿐 아니라 발현된 단백질을 실험용 쥐에 접종하여 중화항체역가를 분석한 결과 콜레라 독소 B를 융합하지 않은 재조합 단백질 백신에 비하여 200~300% 이상 방어효능이 향상됨을 입증하였다.
본 발명에 따른 WHEP 도메인을 융합파트너로 이용한 재조합 단백질의 제조방법은 오량체 기반의 융합단백질을 형성하며, 목적 단백질의 수용성 및 발현율을 향상시켜, 다양한 목적 단백질의 의료용 및 산업용으로 개발 및 생산하는데 유용하다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따라 수족구 바이러스 항원을 목적 단백질로 하여 제조된 유전자의 재조합 구조체를 도식화한 것이다. 도 1의 상단은 융합 파트너를 삽입하지 않은 구조체를 나타내며, 이는 CTB-EV71.WT (△Fusion partner)으로, 목적 단백질 N-말단에 융합 파트너가 존재하지 않는 구조체 형태이다. 도 1의 융합 파트너로 hRID가 융합된 형태의 구조체이며, 이는 타겟 단백질의 N-말단에 융합파트너로서 hRID가 융합된 형태이다. 도 1의 하단은 WHEP 융합 (EPRS유래)된 형태로, 목적단백질 N-말단에 융합 파트너로서 EPRS를 융합한 형태의 구조체이다.
도 2 및 도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라 Enterovirus A71 (EV71)을 목적단백질로 하여 제조된 융합단백질의 수용성 발현을 확인한 이미지이다. 본 실시예에서는 수용성 세포(Competent Cell)로 Escerichia coli 세포주 Shuffle T7를 이용하였으며, 용해완충액(50mM Tris-Cl(pH7.5), 300mM NaCl, 10mM 이미다졸, 10% 글리세롤, 0.1% Tween-20)을 이용하였다. 도 2의 상단 이미지를 참조하면, 융합파트너가 존재하지 않는 경우 발현되는 단백질이 100% 수준의 불용성을 나타내며, 도 2의 하단을 참조하면, 융합파트너로 hRID가 이용되는 경우 약 10%정도의 수용성을 나타냈으며, 오량체 형성 정도가 약하게 나타났다. 반면 도 3을 참조하면, 융합파트너로 EPRS를 이용하였을 때, 70% 수준의 수용성 발현이 나타났으며, 오량체가 잘 형성됨을 알 수 있다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 Coxsackievirus A16 (CA16) 항원을 목적 단백질로 하여 제조된 유전자의 재조합 구조체를 도식화한 것이다. 도 4의 상단은 목적 단백질의 N-말단에 융합파트너로서 hRID를 융합한 구조체이며, 도 4의 하단은 목적 단백질 N-말단에 융합파트너로서 EPRS를 융합한 구조체의 모식도이다. 여기서, 링커(Linker)는 Flexible linker로서 CTB와 항원 단백질 사이의 거리를 두어 항원 단백질의 구조의 용이한 형성을 위해 삽입되었다.
도 5 및 도 6은 본 발명의 일 실시예에 따라 Coxsackievirus A16 (CA16)을 목적단백질로 하여 제조된 융합단백질의 수용성 발현을 확인한 이미지이다. 도 5를 참조하면, 융합 파트너로서 hRID를 사용했을 때 (hRID-CTB-CA16 VP1 WT), 수용성 발현 효율이 20~40% 수준으로 좋지 않음을 확인할 수 있다. 반면, 도 6을 참조하면, 융합 파트너로서 EPRS를 사용했을 때 (EPRS-CTB-CA16 VP1 WT), 수용성 발현 효율이 80% 수준으로 매우 좋음을 확인할 수 있으며, 이때 수용성의 융합 단백질을 non-DTT, non-Boiling하는 경우, 오량체(pentamer)로 예상되는 band가 뚜렷하게 확인되어, 오량체로 융합단백질이 형성됨을 알 수 있다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따라 코로나 바이러스 항원 ARS-CoV-2(CoV)을 목적 단백질로 하여 제조된 유전자의 재조합 구조체를 도식화한 것이다. 도 7 상단은 목적 단백질의 N-말단에 융합파트너로서 hRID를 융합한 구조체이며, 도 7 하단은 목적 단백질 N-말단에 융합파트너로서 EPRS를 융합한 구조체의 모식도이다. 여기서, 링커(Linker)는 Flexible linker로서 CTB와 항원 단백질 사이의 거리를 두어 항원 단백질의 구조의 용이한 형성을 위해 삽입되었다.
도 8및 도 9는 본 발명의 일 실시예에 따라 코로나 바이러스 항원 ARS-CoV-2(CoV)을 목적단백질로 하여 제조된 융합단백질의 수용성 발현을 확인한 이미지이다. 도 8을 참조하면, 융합파트너로서 hRID를 사용했을 때 (hRID-CTB-CoV.RBD), 수용성 발현 효율이 낮게 나타났으나, 도 9를 참조하면, 융합파트너로서 hRID를 사용했을 때 (EPRS-CTB-CoV.RBD), 제조된 융합단백의 수용성 발현 효율이 높음을 확인할 수 있다.
이하, 본 발명의 도면을 참조하여 실시예를 상세히 설명한다. 본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 후술되어 있는 실시 예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시 예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있으며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 게시가 완전하도록하고, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다. 명세서 전체에 걸쳐 동일 참조 부호는 동일 구성 요소를 지칭한다.
다른 정의가 없다면, 본 명세서에서 사용되는 모든 용어(기술 및 과학적 용어를 포함)는 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 공통적으로 이해될 수 있는 의미로 사용될 수 있을 것이다. 또 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 용어들은 명백하게 특별히 정의되어 있지 않는 한 이상적으로 또는 과도하게 해석되지 않는다. 본 명세서에서 사용된 용어는 실시예들을 설명하기 위한 것이며 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니다. 본 명세서에서, 단수형은 문구에서 특별히 언급하지 않는 한 복수형도 포함한다.
본 발명에서 "벡터(vector)"란, DNA 재조합 실험에 있어서 목적하는 DNA 단편을 숙주균 등에 도입시켜 주고 증식할 수 있는 DNA를 지칭하며, 클로닝 운반체 (cloning vehicle)라고도 하는데, 벡터(vector) DNA는 제한효소 등으로 절단하여 개환하고, 여기에 목적으로 하는 DNA 단편을 삽입하여 연결해 숙주균에 도입시킨다. 목적으로 하는 DNA 단편을 연결한 벡터 DNA는 숙주균이 증식됨에 따라 복제하여 균의 분열과 더불어 각 낭세포로 분배되어 목적으로 하는 DNA 단편을 대대로 유지하여 이어져 나가며, 예를 들어, 플라스미드(plasmid), 파지 염색체를 사용할 수 있다.
상기한 벡터의 선택, 제작, 형질전환 및 재조합 단백질의 발현 등의 방법은, 본원발명이 속하는 기술분야의 당업자라면 용이하게 실시할 수 있으며, 통상의 방법에서 일부의 변형도 본 발명에 포함된다.
본 발명에서 "형질전환(transformation)"이란, 외부로부터 주어진 유전물질인 DNA에 의해 개체 또는 세포의 형질이 유전적으로 변화하는 것을 의미한다.
상기 벡터의 숙주 세포 내로의 운반(도입)은, 당업계에 널리 알려진 운반 방법을 사용할 수 있다. 상기 운반 방법은 예컨대, 미세 주입법, 칼슘 포스페이트 침전법, 전기 천공법, 리포좀-매개 형질감염법, 유전자 밤바드먼트 등을 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.), PEG 등의 화학적 처리 방법, 유전자총(gene gun) 등을 이용할 수 있다.
상기 형질전환체 배양 시의 배양조건은 숙주세포에 따라 관용되는 것을 적당히 선택하여 이용할 수 있다. 배양 시 세포의 생육과 단백질의 대량 생산에 적합하도록 온도, 배지의 pH 및 배양시간 등의 조건들을 적절하게 조절할 수 있다.
본 발명에서 숙주세포는 당업계에서 통상적으로 이용되는 숙주세포를 이용할 수 있으며, 바람직하게는 대장균을 이용할 수 있다.
[실시예 1]
재조합 발현 벡터의 제작
단백질 발현 벡터로 pGE-hEPRS 발현 벡터를 사용하였다(YANG, Seung Won, et al. Harnessing an RNA-mediated chaperone for the assembly of influenza hemagglutinin in an immunologically relevant conformation. The FASEB Journal, 2018, fj. 201700747RR.). pGE- hEPRS는 T7 promoter에 의해 발현이 조절되고, 필요에 의해 융합 파트너 (hEPRS)을 절단하기 위해 TEV(tobacco etch virus) protease site(ENLYFQ)를 삽입하였다. 또한, 니켈-친화성 크로마토그래피를 수행하기 위해 6X His tag를 삽입하였으며, Kpn1-BamH1-EcoRV-Sal1-Hind3으로 구성된 MCS(Multiple Cloning Site)를 Kpn1 및 Hind3으로 절단하여 CTB와 융합한 목적단백질의 서열을 삽입하였다. hEPRS의 유무에 따라 대장균 내 목적단백질의 수용성 발현의 정도를 비교하기 위하여 hEPRS 를 삽입한 벡터, 및 hEPRS 를 제거한 벡터를 사용하였다
구체적으로, pGE-EPRS 플라스미드에 Kpn1과 Hind3 제한효소를 사용하여 CTB를 코딩하는 유전자 서열와 Dengue virus serotype 1(DV1) ED3를 코딩하는 유전자 서열을 삽입하여 EPRS-CTB-DV1ED3 형태의 재조합 벡터를 제작하였으며, 대조군 벡터로는 hEPRS 서열을 제거한 CTB-DV1ED3 형태의 재조합 벡터를 제작하였다. 상기 벡터는 IPTG에 의해서 프로모터 활성화가 조절된다.
[실시예 2]
본 발명의 재조합 단백질의 수용성 발현 확인
실시예 1에서 제조된 단백질 발현 벡터를 SHuffle® T7 competent cell(New England Biolabs #C3026)에 형질전환 시켜 배양하였다. 형질전환된 대장균은 50 μg/ml의 암피실린(Ampicillin)이 포함된 LB 배지에서 배양하였다. 배양 온도는 37℃의 조건에서 배양하였으며, 대장균의 OD600 값이 0.5 이상이 되면 T7 promoter를 활성화시키기 위해서 IPTG를 1 mM 수준으로 넣어주고, 단백질이 충분히 생산될 수 있도록, IPTG를 넣어준 이후부터 20℃에서 5시간 정도를 배양하였다. 충분히 배양된 대장균은 원심분리하여 상등액을 제거한 후에 보관하였다. 그 다음, 대장균 수확물에 A buffer[50mM Tris-Cl(pH7.5), 300mM NaCl, 10% glycerol, 5mM imidazole] 10ml을 넣은 뒤 초음파 분쇄를 하여, 용해물(lysate)을 만들었다. 그 후, 상기 용해물을 SDS-PAGE로 분석하였다.
그 결과, hEPRS 를 융합한 본 발명의 재조합 단백질은 전체 단백질 발현양의 절반가량이 수용성으로 발현되었다. 반면 hEPRS를 융합하지 않은 대조군(CTB-DV1ED3-direct)은 대부분의 단백질이 불용성 형태로 발현되었다.
이를 통해, CTB와 융합시킨 재조합 단백질의 경우에도 hEPRS 융합을 통해 재조합 단백질의 수용성 발현 효율을 크게 증가시킬 수 있음을 알 수 있었다.
[실시예 3]
크기 배제 크로마토그래피를 통한 본 발명의 재조합 단백질의 오량체 구조 검증
본 발명에 따른 재조합 단백질의 오량체 구조 형성을 확실하게 검증하기 위해서 Superdex-200 Increase column(GE Healthcare)를 이용한 크기 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography; SEC)를 진행하였으며, 크기를 알고 있는 4가지 마커 단백질로 calibration을 하였다. 이 때 사용된 버퍼의 조성은 [50mM Tris-Cl(pH 7.5), 300mM NaCl]이며, Superdex-200 analytical gel-filtration column(GE Healthcare)를 통해 분리하였다. 모든 분획은 SDS-PAGE로 분석하여 오량체 크기에 해당하는 단백질을 포함하는 분획만을 모아 사용하였다.
그 결과, calibration으로 사용한 hEPRS 피크 근처에 재조합 단백질의 주요 피크가 나타났다. 이를 elution volume과 partition coefficient(Kav)를 통해 계산한 결과 약 476kDa의 사이즈로 나타났으며, 이는 hEPRS의 size shift 성질 때문이다. 실제로 hEPRS를 절단한 CTB-DV1ED3의 SEC 결과에서는 약 128kDa에서 피크가 나타났으며, 이는 CTB-DV1ED3 단량체(monomer)의 사이즈가 약 25kDa인 것을 미루어보아 정확하게 오량체 구조가 형성되었음을 확인할 수 있다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (11)

  1. 사람 유래 글루타밀-프롤릴 tRNA 합성효소(hEPRS, human Glutamyl-prolyltRNA synthetase)로부터 분리한 도메인;
    오량체형 독소 단백질; 및
    목적단백질;을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 포함하는 재조합 융합단백질 발현 벡터.
  2. 제1 항에 있어서,
    상기 오량체형 독소 단백질은 콜레라 독소 B 서브유닛(cholera toxin B subunit, CTB) 단백질, 대장균 이열성 장독소 B 서브유닛(heat-labile enterotoxin B subunit, LTB) 단백질 및 시가 독소 B 서브유닛(Shiga-toxin B subunit) 단백질로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 벡터.
  3. 제1 항에 있어서,
    상기 도메인은 TRS-1 및 TRS-2을 포함하는, 벡터.
  4. 제3 항에 있어서,
    상기 도메인은, TRS-3을 더 포함하는, 벡터.
  5. 제1 항에 있어서,
    상기 목적 단백질은 면역반응을 유도하는 항원 단백질로서 자가조립(self-assembly) 과정에서 소단위체로 오량체(pentamer)를 형성하는 정이십면체형 바이러스의 캡시드 단백질인, 벡터.
  6. 제1 항에 있어서,
    상기 목적 단백질은 자가조립(self-assembly) 과정에서 소단위체로 오량체(pentamer)를 형성하는 정이십면체형 바이러스의 캡시드 단백질인, 벡터.
  7. 제1 항에 있어서,
    상기 목적 단백질은 수족구 바이러스(Enterovirus) 항원 또는 코로나 바이러스(SARS-CoV-2)유래인, 벡터.
  8. 제1 항에 따른 발현벡터로 형질 전환된 숙주세포.
  9. 제8 항에 있어서,
    상기 숙주세포는 에스케리키아(Escherichia)속 세균, 바실러스 바실러스 (Bacillus)속 세균, 슈도모나스 (Pseudomonas)속 세균, 유산균, 효모, 동물세포, 및 곤충 세포로 이루어진 군에서 선택되는 것인 형질 전환된 숙주세포.
  10. 사람 유래 글루타밀-프롤릴 tRNA 합성효소(hEPRS, human Glutamyl-prolyltRNA synthetase)로부터 분리한 도메인; 콜레라 독소 B 서브유닛 (cholera toxin B subunit; CTB) 단백질; 및 목적단백질;을 포함하는 재조합 융합단백질.
  11. 제10 항에 있어서,
    상기 재조합 융합단백질은 오량체(pentamer) 형태인 것을 특징으로 하는 재조합 융합단백질.
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