WO2019054699A1 - 트립토파닐-ｔRNA 합성효소 유전자를 포함하는 재조합 벡터 및 이의 용도 - Google Patents

트립토파닐-ｔRNA 합성효소 유전자를 포함하는 재조합 벡터 및 이의 용도 Download PDF

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WO2019054699A1
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recombinant vector
gene
protein
tryptophanyl
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이종수
김재훈
이현철
이은서
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충남대학교산학협력단
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    • C12Y601/01—Ligases forming aminoacyl-tRNA and related compounds (6.1.1)
    • C12Y601/01002—Tryptophan-tRNA ligase (6.1.1.2)

Definitions

  • the present invention relates to a recombinant vector comprising a tryptophanyl-tRNA synthetase gene and its use.
  • the target protein is linked to the carboxyl terminus of the fusion partner protein, the translation initiation signals of the fusion partner protein can be effectively used, and the solubility of the target protein bound to the fusion partner protein is increased.
  • the most effective method is to increase the water-solubility of a target protein by using a soluble fusion partner protein expressed in E. coli.
  • Lac Z or Trp E proteins have been used as fusion partner proteins in Escherichia coli to produce the desired protein, but most of the expressed target proteins have been produced in the form of agglomerates, making it difficult to obtain active proteins. Therefore, many attempts have been made to discover new fusion partner proteins that can easily express a target protein having activity.
  • Tryptophanyl-tRNA synthetase is a substance that activates innate immune cells secreted by immune cells upon pathogenic bacteria and virus invasion. It is expressed in the form of a water-soluble protein in E. coli.
  • the present invention has developed a recombinant vector containing tryptophanyl-tRNA synthetase gene as a fusion partner protein, and confirmed that the solubility of the target protein in the host cell is increased when the recombinant vector is used.
  • Korean Patent No. 1252835 discloses a composition of " aminoacyl-tRNA synthetase and its use "
  • Korean Patent Laid-Open Publication No. 2017-0027258 discloses the use of 'tryptophanyl thiourea synthetase Diagnostic composition and diagnostic marker detection method ', but the recombinant vector containing the tryptophanyl-tRNA synthetase gene of the present invention and its use have not been described.
  • the present invention has been made in view of the above-described needs.
  • a recombinant vector in which a tryptophanyl-tRNA synthetase gene comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 as a fusion partner and a gene encoding a target protein are sequentially connected is produced as a result of the transformation and expression of the E. coli strain with the recombinant vector, the expression of the tryptophanyl-tRNA synthetase gene in the E. coli transformed with the recombinant vector of the present invention , The present invention has been completed.
  • the present invention provides a recombinant vector characterized in that a tryptophanyl-tRNA synthetase gene and a gene encoding a target protein are sequentially linked.
  • the present invention provides a method for increasing the water solubility of a target protein, comprising transforming the host cell transformed with the recombinant vector and the host cell to express a target protein coding gene.
  • the present invention also provides a method for producing a recombinant vector, comprising: transforming the recombinant vector into a host cell; And culturing the transformed host cell to express a target protein.
  • the present invention also provides a method for producing a target protein having increased water solubility in a host cell.
  • the present invention also provides a composition for the production of a target protein having increased water solubility, comprising the recombinant vector as an active ingredient.
  • the present invention provides a vaccine composition for preventing food poisoning or coliform bacterium containing the target protein having increased water solubility and the target protein prepared by the above method as an active ingredient.
  • the recombinant vector using the tryptophanyl-tRNA synthetase (WRS) gene according to the present invention as a fusion partner can express a target protein that is not expressed as water-soluble in E. coli as a soluble protein, and the tryptophanyl-tRNA synthetase Since the protein is an animal-derived protein, there is little risk of toxicity and side effects. Therefore, when the recombinant vector of the present invention containing the tryptophanyl-tRNA synthetase gene is used, it can be used for vaccine, feed additive, It can be used for the production of protein.
  • WLS tryptophanyl-tRNA synthetase
  • FIG. 1 is a schematic diagram of a combination vector of the present invention in which a pig-derived tryptophanyl-tRNA synthetase gene (pWRS) and a gene encoding a gene of interest are sequentially connected.
  • pWRS pig-derived tryptophanyl-tRNA synthetase gene
  • FIG. 2 is a graph showing the expression of the beta toxin protein of Clostridium perfringens in a cell transformed with a recombinant vector (A) containing no pWRS gene or a recombinant vector (B) containing a pWRS gene
  • NC whole cell lysate of Escherichia coli transformed with mock vector, WCL; Whole cell lysate, SOL; Soluble protein, INSOL; Insoluble protein.
  • Figure 3 shows the expression of the pili toxin K88 protein of Enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC) in cells transformed with the recombinant vector (A) without the pWRS gene or with the recombinant vector (B) containing the pWRS gene And SDS-PAGE and immunoblot results.
  • ETEC Enterotoxigenic Escherichia coli
  • Figure 4 shows the results of SDS-PAGE and immunoblot analysis of the expression pattern of the ciliate toxin K99 protein of ETEC in the cells transformed with the recombinant vector (A) containing no pWRS gene or the recombinant vector (B) containing the pWRS gene to be.
  • FIG. 5 shows the results of SDS-PAGE and immunoblot analysis of the expression pattern of the ciliomotoxin 987P protein of ETEC in the cells transformed with the recombinant vector (A) containing no pWRS gene or the recombinant vector (B) containing the pWRS gene to be.
  • Figure 6 shows the result of SDS-PAGE and immunoblotting of the expression of the ciliotoxin F18ac protein of ETEC in the cells transformed with the recombinant vector (A) containing no pWRS gene or the recombinant vector (B) containing the pWRS gene .
  • FIG. 7 shows the heat-labile enterotoxin subunit B (LTB) of ETEC in cells transformed with a recombinant vector (A) without the pWRS gene or with a recombinant vector (B) containing the pWRS gene.
  • LTB heat-labile enterotoxin subunit B
  • FIG. 8 shows SDS-PAGE showing the tendency of the expression of Stx2eB (shiga toxin subunit B) protein of ETEC in cells transformed with a recombinant vector (A) containing no pWRS gene or a recombinant vector (B) containing a pWRS gene and Immunoblot results.
  • Stx2eB shiga toxin subunit B
  • FIG. 9 shows the results of SDS-PAGE and immunoblot analysis of the expression tendency of LTB-Stx2eB protein of ETEC in the cells transformed with the recombinant vector (A) containing no pWRS gene or the recombinant vector (B) containing the pWRS gene to be.
  • a recombinant vector characterized in that a tryptophanyl-tRNA synthetase gene and a gene encoding a target protein are sequentially linked.
  • the tryptophanyl-tRNA synthetase gene may be derived from pigs, but is not limited thereto.
  • the pig-derived tryptophanyl-tRNA synthetase gene according to the present invention may be a codon-optimized nucleotide sequence according to the codon usage of E. coli, but is not limited thereto. Also, homologues of the nucleotide sequences are included within the scope of the present invention.
  • the gene includes a nucleotide sequence having a sequence homology of 70% or more, more preferably 80% or more, more preferably 90% or more, and most preferably 95% or more, with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 can do.
  • &Quot;% of sequence homology to polynucleotides is ascertained by comparing the comparison region with two optimally aligned sequences, and a portion of the polynucleotide sequence in the comparison region is the reference sequence for the optimal alignment of the two sequences (I. E., A gap) relative to the < / RTI >
  • the gene encoding the target protein may be a codon-optimized sequence according to the frequency of use of the codon of the host cell, but is not limited thereto.
  • the recombinant vector according to an embodiment of the present invention may be one in which a T7 promoter and a 6xHis-tag coding gene, a pig-derived tryptophanyl-tRNA synthetase gene, and a gene encoding a target protein are sequentially connected to each other , but is not limited thereto.
  • the target protein may be a protein having a hysteresis characteristic that is not expressed in a host cell in a water-soluble manner, but may be a protein such as a toxin, an antigen, an antibody or an enzyme .
  • target proteins include, for example, Clostridium perfringens beta toxin, Enterotoxigenic Escherichia coli ( ETEC) , pili toxin K88, K99, 987P, and F18ac, But are not limited to, heat-labile enterotoxin subunit B, LTB of ETEC, Stx2eB (shiga toxin subunit B) of ETEC, and LTB-Stx2eB of ETEC.
  • ETEC Enterotoxigenic Escherichia coli
  • pili toxin K88, K99, 987P, and F18ac But are not limited to, heat-labile enterotoxin subunit B, LTB of ETEC, Stx2eB (shiga toxin subunit B) of ETEC, and LTB-Stx2eB of ETEC.
  • target protein of the present invention means a protein which a person skilled in the art intends to produce in large quantities and which is capable of expressing in a transformant by inserting a polynucleotide encoding the desired protein into a recombinant expression vector .
  • recombinant of the present invention refers to a cell in which a cell replicates a heterologous nucleic acid, expresses the nucleic acid, or expresses a protein encoded by a peptide, heterologous peptide or heterologous nucleic acid.
  • Recombinant cells can express a gene or a gene fragment that is not found in the natural form of the cell, either in a sense or in an antisense form.
  • the recombinant cell can express a gene found in a cell in its natural state, but the gene has been modified and reintroduced intracellularly by an artificial means.
  • vector of the present invention is used to refer to a DNA fragment (s), nucleic acid molecule, which is transferred into a cell.
  • the vector replicates the DNA and can be independently regenerated in the host cell.
  • carrier is often used interchangeably with " vector ".
  • the vector of the present invention can typically be constructed as a vector for expression or cloning.
  • the vector of the present invention can be constructed by using prokaryotic cells or eukaryotic cells as hosts.
  • a strong promoter capable of promoting transcription for example, pL? Promoter, trp promoter, lac promoter, T7 promoter, tac promoter, etc.
  • a ribosome binding site for initiation of translation and a transcription / translation termination sequence for example, pL? Promoter, trp promoter, lac promoter, T7 promoter, tac promoter, etc.
  • Escherichia coli is used as the host cell, the promoter and operator site of the E. coli tryptophan biosynthesis pathway and the left promoter of the phage lambda (pL ⁇ promoter) can be used as a regulatory region.
  • the recombinant vectors of the present invention can be constructed by methods known to those skilled in the art. Such methods include in vitro recombinant DNA technology, DNA synthesis techniques, and in vivo recombination techniques.
  • the DNA sequence can be effectively linked to appropriate promoters in the expression vector to drive mRNA synthesis.
  • the vector may also include a ribosome binding site and a transcription terminator as a translation initiation site.
  • the recombinant expression vector may preferably comprise one or more selectable markers.
  • the marker is typically a nucleic acid sequence having a property that can be selected by a chemical method, and includes all genes capable of distinguishing a transformed cell from a non-transformed cell.
  • the marker gene may be, but is not limited to, an antibiotic resistance gene or an auxotrophic marker gene.
  • the present invention also provides a host cell transformed with the recombinant vector.
  • Any host cell known in the art may be used as the host cell capable of continuously cloning and expressing the vector of the present invention in a stable and prokaryotic cell, for example, E. coli Rosetta, E. coli BL21, E. coli JM109 , E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X1776, E. coli W3110, Bacillus subtilis, Bacillus strains, and Salmonella typhimurium, ≪ / RTI > marcesensis, and various enterococci and strains such as various Pseudomonas species.
  • E. coli Rosetta E. coli BL21, E. coli JM109 , E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X1776, E. coli W3110, Bacillus subtilis, Bacillus strains, and Salmonella typhimurium, &
  • the host cell transformed with the recombinant vector according to one embodiment of the present invention may be, but is not limited to, E. coli Rosetta-gami (DE3).
  • the method of delivering the vector of the present invention into a host cell can be carried out by a CaCl 2 method, a single method (Hanahan, D., 1983 J. Mol. Biol. 166, 557-580) Method or the like.
  • the host cell is a eukaryotic cell
  • the vector is injected into the host cell by microinjection, calcium phosphate precipitation, electroporation, liposome-mediated transfection, DEAE-dextran treatment, and gene bombardment .
  • the present invention provides a method for increasing the water solubility of a target protein, comprising the step of transforming a host cell with the recombinant vector to express a gene encoding a target protein.
  • the host cell may be, but is not limited to, E. coli Rosetta-gami (DE3).
  • the present invention also provides a method for producing a target protein having increased water solubility in a host cell.
  • the transformed host cells can be cultured in a medium suitable for the production of a target protein using known techniques.
  • Suitable culture media are commercially available or can be prepared according to the ingredients and composition ratios described in publications such as, for example, catalogs of the American Type Culture Collection, but are not limited thereto.
  • the method for producing a target protein of the present invention may further comprise the step of isolating and purifying the target protein from the host cell expressing the target protein.
  • the separation method may be separated from the culture medium by conventional methods including, but not limited to, centrifugation, filtration, extraction, spray drying, evaporation, or precipitation.
  • the separated proteins can be purified by various known methods including chromatography (e.g. ion exchange, affinity, hydrophobicity and size exclusion), electrophoresis, fractional dissolution (e.g. ammonium sulfate precipitation), SDS- ≪ / RTI >
  • the present invention also provides a composition for the production of a target protein having increased water solubility, comprising the recombinant vector as an active ingredient.
  • the composition of the present invention includes a recombinant vector containing a tryptophanyl-tRNA synthetase gene that increases the water solubility of the fused target protein as an active ingredient, thereby increasing the productivity of the target protein with increased water solubility.
  • the present invention provides a vaccine composition for preventing food poisoning or coliform bacterium containing the target protein having increased water solubility and the target protein prepared by the above method as an active ingredient.
  • ETEC heat-labile enterotoxin subunit B
  • Stx2eB shiga toxin subunit
  • the target protein in the form of fusion of the tryptophanyl-tRNA synthetase according to the present invention is produced in a water-soluble form, there is no need for an additional step such as a refolding process, and it is possible to effectively induce an immune response, And the tryptophanyl-tRNA synthetase is fused with the tryptophan-tRNA synthetase, and thus can be used as an effective ingredient of the vaccine composition.
  • prevention in the present invention means any action that inhibits or delays the onset of food poisoning or E. coli infection upon administration of the composition.
  • vaccine in the present invention refers to a biological agent containing an antigen that immunizes a living body.
  • In vivo immunity is largely divided into autoimmunity, which is obtained automatically in vivo after infection with pathogenic bacteria, and passive immunization, which is obtained by externally injected vaccine. While autoimmunity has a long period of immune-related antibody production and is characterized by persistent immunity, passive immunization by vaccine acts immediately for the treatment of infectious diseases but has a disadvantage that its persistence is poor.
  • the vaccine composition of the present invention may contain a fusion protein of Clostridium perfringens beta toxin which causes food poisoning or may contain various antigens of enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC) And may be used as a vaccine composition against food poisoning or E. coli, but is not limited thereto.
  • ETEC enterotoxigenic Escherichia coli
  • the vaccine composition of the present invention can be administered orally or parenterally (for example, intramuscularly, intravenously, subcutaneously, intraperitoneally or topically), preferably orally or subcutaneously But is not limited thereto.
  • the dosage of the composition may vary depending on the weight and age of the human being, the sex, the health condition, the diet, the administration time, the administration method, the excretion rate, and the severity of the disease.
  • the vaccine composition may contain one or more of a stabilizer, an emulsifier, aluminum hydroxide, an aluminum phosphate, a pH adjuster, a surfactant, a liposome, an iscom adjuvant, a synthetic glycopeptide, an extender, a carboxy polymethylene, a subviral particle adjuvant, , N, N-dioctadecyl-N ', N'-bis (2-hydroxyethyl) -propanediamine, monophosphoryl lipid A, dimethyl dioctadecyl- ammonium bromide,
  • the second auxiliary agent may be further contained.
  • the vaccine composition may comprise a veterinarily acceptable carrier.
  • veterinarily acceptable carrier includes any and all solvents, dispersion media, coatings, adjuvants, stabilizers, diluents, preservatives, antibacterial and antifungal agents, isotonic agents.
  • the carrier, excipient and diluent which can be contained in the composition include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, maltitol, starch, glycerin, starch, acacia rubber, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, Cellulose, methylcellulose, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil.
  • each of the above-mentioned compositions for the vaccine may be formulated into oral formulations such as powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups and aerosols, and nasal formulations such as drips or sprays, And the like.
  • oral formulations such as powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups and aerosols
  • nasal formulations such as drips or sprays, And the like.
  • solid formulations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules and the like, which may contain at least one excipient such as starch, calcium carbonate, sucrose, Or lactose, gelatin, and the like.
  • lubricants such as magnesium stearate talc may also be used.
  • liquid preparation for oral administration suspensions, solutions, emulsions, syrups and the like may be used.
  • various excipients such as wetting agents, sweeteners, .
  • Formulations for parenteral administration include sterilized aqueous solutions, non-aqueous agents, suspensions, emulsions, and freeze-drying agents.
  • the suspending agent include propylene glycol, polyethyleneglycol, vegetable oil such as olive oil, injectable ester such as ethylolate, and the like, but the present invention is not limited thereto.
  • Penetrants suitable for formulation for intranasal administration are generally known to those skilled in the art. Such suitable formulations are preferably formulated to be sterile, emollient and buffered for stability and compliance. Formulations for intranasal administration are also prepared to stimulate mucus secretion in various respects to maintain normal ciliary action, and suitable formulations are preferably isotonic, slightly buffered formulations that maintain a pH of from 5.5 to 6.5, Antimicrobial preservatives and suitable drug stabilizers.
  • the tryptophanyl-tRNA synthetase (pWRS) gene derived from porcine used as a fusion partner was synthesized in accordance with the codon usage of E. coli (SEQ ID NO: 1), and the nucleotide sequence of the synthesized nucleotide sequence The 5'- and 3'- sites were treated by restriction enzymes Nco I and EcoR I.
  • the selected gene was inserted into a multicloning site of a vector treated with the same restriction enzyme.
  • the vector is a pHis parallel vector having a T7 promoter and a 6xHis-tag.
  • the vector is composed of the pWRS gene and the target protein Clostridium perfringens beta toxin, Enterotoxigenic Escherichia coli, ETEC) Heat-labile enterotoxin subunit B, LTB of pili toxins K88, K99, 987P and F18ac, ETEC, Stx2eB (shiga toxin subunit B) of ETEC, And the gene encoding LTB-Stx2eB of ETEC were sequentially linked to construct a recombinant vector.
  • the transformed colonies were inoculated into 5 ml of LB broth and incubated overnight. Then, 2 ml of the cultured broth was added to a fresh 200 ml of LB broth and then re-cultured.
  • the transformed cells were cultured and centrifuged at 4,000 rpm for 7 minutes to recover the cell pellet.
  • the cell pellet was suspended in 5 ml of phosphate buffered saline (PBS)
  • PBS phosphate buffered saline
  • the cell lysate was centrifuged again, and the supernatant containing the water-soluble protein and the cell pellet containing the non-water-soluble protein were loaded on a 10% SDS-PAGE gel, And electrophoresis was performed.
  • the gel was stained with a coomassie-blue solution and the gel was stained with destaining solution (100 ml of glacial acetic acid, 450 ml of methanol, 450 ml of H 2 O) After decolorization, protein expression was confirmed in the gel.
  • destaining solution 100 ml of glacial acetic acid, 450 ml of methanol, 450 ml of H 2 O
  • protein expression was confirmed in the gel.
  • the gel was transferred to a PVDF-based membrane and protein expression was confirmed using 1: 1,000 diluted anti-His antibody at a ratio of 1: 1,000.
  • tryptophanyl-tRNA synthetase (pWRS) gene derived from pigs can increase the productivity of the target protein fused to the carboxyl terminal of the gene to a water-soluble form of the protein.

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Abstract

본 발명은 돼지 유래의 트립토파닐-tRNA 합성효소 유전자를 포함하는 재조합 벡터 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명의 재조합 벡터는 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질을 융합파트너(fusion partner)로 사용하여 숙주세포 내에서 목적 단백질의 수용성을 증가시켜, 재조합 단백질 생산에 유용하게 이용될 수 있을 것이다.

Description

트립토파닐-ｔRNA 합성효소 유전자를 포함하는 재조합 벡터 및 이의 용도
본 발명은 트립토파닐-tRNA 합성효소 유전자를 포함하는 재조합 벡터 및 이의 용도에 관한 것이다.
유전자 재조합 기술이 발달되면서 동물세포, 효모 및 대장균과 같은 원핵생물(prokaryote) 등을 이용하여 유용한 목적 단백질이 많이 생산되고 있으며, 이들 단백질이 의약품 등의 생물공학 산업에 널리 이용되고 있다. 특히 대장균은 세포의 성장 속도가 빠르고 그의 유전자에 대한 규명이 다른 생물체에 비해 잘 연구되어 있으므로, 유전자 재조합 기술에서 목적 단백질을 생산하기 위한 숙주세포로 많이 이용되고 있다.
대장균에서 재조합 단백질을 생산하기 위한, 강력한 유도성(inducible) 프로모터를 갖춘 다양한 발현벡터가 개발되어 왔다. 그러나 숙주세포로 대장균을 사용할 경우 제조하고자 하는 단백질이 대장균 내의 단백질 분해효소에 의해 분해되어 수율이 낮아지는 경우가 많으며, 특히 분자량 10 kDa 이하의 작은 크기의 폴리펩타이드의 발현에서 이러한 경향이 심한 것으로 알려져 있다. 또한 재조합 단백질이 대장균에서 과다 발현되면 불용성 응집체(insoluble aggregate)의 형태로 세포질 내에 축적되는 경우가 많으며, 이러한 단백질을 활성형으로 만들기 위해서는 고농도의 우레아(urea) 또는 구아니딘-하이드로클로라이드(guanidine hydrochloride)와 같은 변성제(denaturant)를 사용하여 응집체를 녹여 1차 구조로 풀어주어야 하고, 상기에서 사용한 시약을 제거한 후 풀어진 단백질을 정확히 재접힘(refolding)시켜야만 한다. 그러나 단백질마다 재접힘 조건이 다르기 때문에 효율적인 재접힘 조건을 알아내는데 많은 시간과 비용이 요구된다.
목적 단백질이 응집체 형태로 생산될 때 유발되는 상기와 같은 문제점을 개선하기 위하여, 대장균에서 목적 단백질을 수용성 단백질 형태로 발현시키는 것은 중요하다. 목적 단백질을 효과적으로 발현시키기 위한 방법으로는, 첫번째, 목적 단백질의 아미노 말단에 신호 서열(signal sequence)을 연결함으로써 목적 단백질이 대장균의 주변세포질(periplasm)로 분비되도록 하여 수용성 형태로 얻는 방법이 있으나, 이 방법은 단백질의 발현 효율이 낮아 산업적으로는 그 효용이 떨어진다. 두번째, 목적 단백질을 단백질의 접힘(folding)에 관여하는 샤페론(chaperones) 유전자와 함께 발현시킴으로써 수용성 단백질을 얻는 방법이 있지만, 이러한 방법은 특정한 단백질의 경우에만 효과가 있으므로 응집체가 형성되는 것을 억제할 수 있는 효과적인 방법이 아니다. 세번째, 대장균에서 발현이 잘되는 단백질을 융합파트너(fusion partner)로 선택하고, 상기 융합파트너 단백질의 카르복실 말단에 목적 단백질을 융합하여 수용성 단백질을 얻는 방법이 있다. 이때 융합파트너 단백질의 카르복실 말단에 목적 단백질을 연결하면 융합파트너 단백질의 초기 합성 신호(translation initiation signals)를 효과적으로 이용할 수 있고, 융합파트너 단백질과 결합한 목적 단백질의 수용성이 증가되어 대장균에서 목적 단백질이 수용성 단백질 형태로 다량 발현될 수 있다.
상기의 재조합 단백질을 수용성으로 발현하기 위하여 시도된 방법 중에서 가장 효과적인 방법은 대장균에서 발현이 잘되는 수용성의 융합파트너 단백질을 이용하여 목적 단백질의 수용성을 증가시키는 것이다. 지금까지 대장균에서 목적 단백질을 생산하기 위해 Lac Z 또는 Trp E 단백질 등이 융합파트너 단백질로 사용되었으나, 이로부터 발현된 목적 단백질은 대부분 응집체 형태로 생산되어 활성형의 단백질을 얻는데 어려움이 있었다. 따라서 활성을 갖는 목적 단백질을 용이하게 발현시킬 수 있는 새로운 융합파트너 단백질을 발견하고자 하는 많은 시도들이 이루어졌다.
트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질(tryptophanyl-tRNA synthethase, WRS)은 병원성 세균 및 바이러스 침입시 면역세포에서 분비되어 선천면역을 활성화시키는 물질로써 대장균에서 수용성 단백질 형태로 발현된다.
이에 본 발명에서는 융합파트너 단백질로 트립토파닐-tRNA 합성효소 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 개발하였고, 상기 재조합 벡터를 사용할 경우 숙주세포 내에서 목적 단백질의 수용성이 증가되는 것을 확인하였다.
한편, 한국등록특허 제1252835호에는 '아미노아실-tRNA 합성효소의 조성물 및 그것의 용도'가 개시되어 있고, 한국공개특허 제2017-0027258호에는 '트립토파닐 티알엔에이 합성효소를 이용한 패혈증의 진단용 조성물과 진단 마커 검출 방법'이 개시되어 있으나, 본 발명의 트립토파닐-tRNA 합성효소 유전자를 포함하는 재조합 벡터 및 이의 용도에 대해서는 기재된 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명에서는 융합파트너로서의 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 트립토파닐-tRNA 합성효소 유전자와 목적 단백질을 코딩하는 유전자가 순차적으로 연결된 재조합 벡터를 제작하고, 상기 재조합 벡터로 대장균 균주를 형질전환하여 발현시킨 결과, 트립토파닐-tRNA 합성효소 유전자가 융합파트너로 사용되지 않은 군에 비해서, 본 발명의 재조합 벡터로 형질전환된 대장균에서 목적 단백질의 수용성이 증가되는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 트립토파닐-tRNA 합성효소 유전자와 목적 단백질을 코딩하는 유전자가 순차적으로 연결된 것을 특징으로 하는 재조합 벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포 및 상기 숙주세포를 형질전환하여 목적 단백질 코딩 유전자를 발현하는 단계를 포함하는, 목적 단백질의 수용성을 증가시키는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터를 숙주세포에 형질전환하는 단계; 및 상기 형질전환된 숙주세포를 배양하여 목적 단백질을 발현시키는 단계를 포함하는 숙주세포 내에서 수용성이 증가된 목적 단백질의 생산 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터를 유효성분으로 포함하는, 수용성이 증가된 목적 단백질의 생산용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 수용성이 증가된 목적 단백질 및 상기 목적 단백질을 유효성분으로 함유하는 식중독 또는 대장균증 예방용 백신 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 트립토파닐-tRNA 합성효소(WRS) 유전자를 융합파트너로 이용한 재조합 벡터는 대장균에서 수용성으로 발현되지 않는 목적 단백질을 수용성 형태의 단백질로 발현시킬 수 있고, 트립토파닐-tRNA 합성효소 단백질은 동물 유래 단백질로써 독성 및 부작용에 대한 위험이 적으므로, 트립토파닐-tRNA 합성효소 유전자를 포함하는 본 발명의 재조합 벡터를 이용하면 백신, 사료첨가제, 또는 의약 조성물 등에 활용될 수 있는 유용 목적 단백질의 생산에 활용될 수 있을 것이다.
도 1은 돼지 유래 트립토파닐-tRNA 합성효소 유전자(pWRS)와 목적 단백질(Gene of interest)을 코딩하는 유전자가 순차적으로 연결된 본 발명의 제조합 벡터의 모식도이다.
도 2는 pWRS 유전자가 포함되지 않은 재조합 벡터(A) 또는 pWRS 유전자가 포함된 재조합 벡터(B)로 형질전환된 세포에서 클로스트리듐 퍼프린겐스(Clostridium perfringens)의 베타 독소(beta toxin) 단백질의 발현 경향을 확인한 SDS-PAGE 및 면역블롯(immunoblot)의 결과이다. NC; mock 벡터로 형질전환된 대장균의 전세포 용해물, WCL; 전세포 용해물(whole cell lysate), SOL; 수용성 단백질(soluble protein), INSOL; 비수용성 단백질(insoluble protein).
도 3은 pWRS 유전자가 포함되지 않은 재조합 벡터(A) 또는 pWRS 유전자가 포함된 재조합 벡터(B)로 형질전환된 세포에서 장독소형대장균(ETEC, Enterotoxigenic Escherichia coli)의 섬모 독소(pili toxin) K88 단백질의 발현 경향을 확인한 SDS-PAGE 및 면역블롯의 결과이다.
도 4는 pWRS 유전자가 포함되지 않은 재조합 벡터(A) 또는 pWRS 유전자가 포함된 재조합 벡터(B)로 형질전환된 세포에서 ETEC의 섬모 독소 K99 단백질의 발현 경향을 확인한 SDS-PAGE 및 면역블롯의 결과이다.
도 5는 pWRS 유전자가 포함되지 않은 재조합 벡터(A) 또는 pWRS 유전자가 포함된 재조합 벡터(B)로 형질전환된 세포에서 ETEC의 섬모 독소 987P 단백질의 발현 경향을 확인한 SDS-PAGE 및 면역블롯의 결과이다.
도 6은 pWRS 유전자가 포함되지 않은 재조합 벡터(A) 또는 pWRS 유전자가 포함된 재조합 벡터(B)로 형질전환된 세포에서 ETEC의 섬모 독소 F18ac 단백질의 발현을 확인한 SDS-PAGE 및 면역블롯의 결과이다.
도 7은 pWRS 유전자가 포함되지 않은 재조합 벡터(A) 또는 pWRS 유전자가 포함된 재조합 벡터(B)로 형질전환된 세포에서 ETEC의 이열성 장내독소 서브유닛 B(heat-labile enterotoxin subunit B, LTB) 단백질의 발현 경향을 확인한 SDS-PAGE 및 면역블롯의 결과이다.
도 8은 pWRS 유전자가 포함되지 않은 재조합 벡터(A) 또는 pWRS 유전자가 포함된 재조합 벡터(B)로 형질전환된 세포에서 ETEC의 Stx2eB(shiga toxin subunit B) 단백질의 발현 경향을 확인한 SDS-PAGE 및 면역블롯의 결과이다.
도 9는 pWRS 유전자가 포함되지 않은 재조합 벡터(A) 또는 pWRS 유전자가 포함된 재조합 벡터(B)로 형질전환된 세포에서 ETEC의 LTB-Stx2eB 단백질의 발현 경향을 확인한 SDS-PAGE 및 면역블롯의 결과이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 트립토파닐-tRNA 합성효소 유전자와 목적 단백질을 코딩하는 유전자가 순차적으로 연결된 것을 특징으로 하는 재조합 벡터를 제공한다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 재조합 벡터에서, 상기 트립토파닐-tRNA 합성효소 유전자는 돼지 유래일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명에 따른 상기 돼지 유래 트립토파닐-tRNA 합성효소 유전자는 대장균의 코돈 사용빈도(codon usage)에 맞춰 코돈 최적화한 서열번호 1의 염기서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한 상기 염기서열의 상동체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기 서열과 각각 70% 이상, 더 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열 (추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제 (즉, 갭)를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 재조합 벡터에 있어서, 상기 목적 단백질을 코딩하는 유전자는 숙주세포의 코돈 사용빈도에 맞춰 코돈 최적화된 서열일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 재조합 벡터는 T7 프로모터 및 6x히스-태그(6xHis-tag) 코딩 유전자, 돼지 유래 트립토파닐-tRNA 합성효소 유전자 및 목적 단백질을 코딩하는 유전자가 순차적으로 연결된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 재조합 벡터에 있어서, 상기 목적 단백질은 숙주세포 내에서 수용성으로 발현되지 않는 난발현성의 특성을 가진 단백질일 수 있고, 이에 한정되지 않으나, 독소, 항원, 항체, 효소 등의 단백질일 수 있다. 상기 목적 단백질은 예를 들면, 클로스트리듐 퍼프린겐스(Clostridium perfringens) 베타 독소(beta toxin), 장독소형대장균(Enterotoxigenic Escherichia coli, ETEC) 섬모 독소(pili toxin) K88, K99, 987P, 및 F18ac, ETEC의 이열성 장내독소 서브유닛 B(heat-labile enterotoxin subunit B, LTB), ETEC의 Stx2eB(shiga toxin subunit B) 및 ETEC의 LTB-Stx2eB 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 용어 "목적 단백질(target protein)"은 당업자가 대량으로 생산하고자 하는 단백질로서, 재조합 발현 벡터에 상기 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 삽입하여 형질전환체에서 발현이 가능한 모든 단백질을 의미한다.
본 발명의 용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 코딩된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 단편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.
본 발명의 용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다.
본 발명의 벡터는 전형적으로 발현 또는 클로닝을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 원핵세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터 (예를 들면, pLλ 프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, T7 프로모터, tac 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 리보솜 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 숙주 세포로서 대장균(Escherichia coli)이 이용되는 경우, E. coli 트립토판 생합성 경로의 프로모터 및 오퍼레이터 부위, 그리고 파아지 λ의 좌향 프로모터 (pLλ 프로모터)가 조절 부위로서 이용될 수 있다.
본 발명의 재조합 벡터는 당업자에 주지된 방법에 의해 구축될 수 있다. 상기 방법은 시험관 내 재조합 DNA 기술, DNA 합성 기술 및 생체 내 재조합 기술 등을 포함한다. 상기 DNA 서열은 mRNA 합성을 이끌기 위해 발현 벡터 내의 적당한 프로모터에 효과적으로 연결될 수 있다. 또한 벡터는 번역 개시 부위로서 리보솜 결합 부위 및 전사 터미네이터를 포함할 수 있다.
재조합 발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 수 있다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 상기 마커 유전자는 항생제 내성 유전자(dominant drug resistance gene) 또는 영양요구 마커 유전자(auxotrophic marker gene)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다.
본 발명의 벡터를 원핵세포에 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주세포는 당업계에 공지된 어떠한 숙주세포도 이용할 수 있으며, 예컨대, E. coli Rosetta, E. coli BL21, E. coli JM109, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포는 E. coli Rosetta-gami(DE3)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 벡터를 숙주세포 내로 운반하는 방법은, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl2 방법, 하나한 방법(Hanahan, D., 1983 J. Mol. Biol. 166, 557-580) 및 전기천공 방법 등에 의해 실시될 수 있다. 또한, 숙주세포가 진핵세포인 경우에는, 미세주입법, 칼슘포스페이트 침전법, 전기천공법, 리포좀-매개 형질감염법, DEAE-덱스트란 처리법, 및 유전자 밤바드먼트 등에 의해 벡터를 숙주세포 내로 주입할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 숙주세포를 형질전환하여 목적 단백질 코딩 유전자를 발현하는 단계를 포함하는, 목적 단백질의 수용성을 증가시키는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 숙주세포는 E. coli Rosetta-gami(DE3)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은
상기 재조합 벡터를 숙주세포에 형질전환하는 단계; 및
상기 형질전환된 숙주세포를 배양하여 목적 단백질을 발현시키는 단계를 포함하는 숙주세포 내에서 수용성이 증가된 목적 단백질의 생산 방법을 제공한다.
본 발명의 목적 단백질의 생산 방법에 있어서, 상기 형질전환된 숙주세포의 배양은 공지된 기술을 이용하여 목적 단백질의 생산에 적합한 배지에서 이루어질 수 있다. 적합한 배양 배지는 상업적으로 입수하거나 예를 들면, American Type Culture Collection의 카탈로그와 같은 간행물에 기재된 성분 및 조성비에 따라 제조할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명의 목적 단백질의 생산 방법은, 목적 단백질이 발현된 숙주세포로부터 목적 단백질을 분리 및 정제하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 분리 방법은 예를 들어 원심분리, 여과, 추출, 분무 건조, 증발 또는 침전을 포함하는 통상적인 방법에 의해서 배지로부터 분리될 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 더 나아가 분리된 단백질은 크로마토그래피 (예를 들면 이온 교환, 친화성, 소수성 및 크기별 배제), 전기영동, 분별 용해 (예를 들면 암모늄 설페이트 침전), SDS-PAGE 또는 추출을 포함하는 공지된 다양한 방법을 통해서 정제될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터를 유효성분으로 포함하는, 수용성이 증가된 목적 단백질의 생산용 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물은, 융합된 목적 단백질의 수용성을 증가시키는 트립토파닐-tRNA 합성효소 유전자를 포함하는 재조합 벡터가 유효성분으로 포함되어 있어, 수용성이 증가된 목적 단백질의 생산성을 증가시킬 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 수용성이 증가된 목적 단백질 및 상기 목적 단백질을 유효성분으로 함유하는 식중독 또는 대장균증 예방용 백신 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 목적 단백질은 트립토파닐-tRNA 합성효소가 융합된 형태의 재조합 단백질로, 본 발명의 일 구현 예에 따른 상기 목적 단백질은 항원으로서 사용될 수 있으나 기존에는 불용성의 응집체 형태로 생산되었던 단백질로, 바람직하게는 클로스트리듐 퍼프린겐스(Clostridium perfringens) 베타 독소(beta toxin); 장독소형대장균(Enterotoxigenic Escherichia coli, ETEC) 섬모 독소(pili toxin) K88, K99, 987P, 또는 F18ac; ETEC의 LTB(heat-labile enterotoxin subunit B); ETEC의 Stx2eB(shiga toxin subunit B); 또는 ETEC의 LTB-Stx2eB일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 따른 상기 트립토파닐-tRNA 합성효소가 융합된 형태의 목적 단백질은 수용성 형태로 생산되므로, 재접힘 과정 등의 추가 공정이 필요없으며, 효과적으로 면역 반응을 유도할 수 있고, 면역증강제로서 기능하는 트립토파닐-tRNA 합성효소가 융합되어 있으므로, 백신 조성물의 유효성분으로서 사용될 수 있다.
본 발명에서 용어, "예방"이란, 조성물의 투여로 식중독 또는 대장균증의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 용어 "백신"은 생체에 면역을 주는 항원을 함유한 생물학적인 제제로서, 감염증의 예방을 위하여 사람이나 동물에 주사하거나 경구 투여함으로써 생체에 면역이 생기게 하는 면역원 또는 항원성 물질을 말한다. 생체 내 면역은 병원균의 감염 후에 생체 내 면역력이 자동으로 얻어지는 자동 면역과 외부에서 주입한 백신에 의하여 얻어지는 수동 면역으로 크게 나누어진다. 자동 면역은 면역에 관계하는 항체의 생성기간이 길고 지속적인 면역력의 특징이 있는 반면, 백신에 의한 수동 면역은 감염증 치료에 즉시 작용하나 지속력이 떨어지는 단점이 있다.
본 발명의 백신 조성물은 식중독의 원인이 되는 클로스트리듐 퍼프린겐스(Clostridium perfringens) 베타 독소(beta toxin)의 융합단백질을 포함할 수 있거나, 또는 장독소형대장균(Enterotoxigenic Escherichia coli, ETEC)의 다양한 항원의 융합단백질을 포함할 수 있으므로, 식중독 또는 대장균증에 대한 백신 조성물로 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 백신 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여(예를 들어, 근육 내, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 바람직하게는 경구 또는 피하 투여할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한 상기 조성물의 투여량은 사람이나 동물의 무게, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다.
상기 백신 조성물은 안정제, 유화제, 수산화알루미늄, 인산알루미늄, pH 조정제, 계면활성제, 리포솜, 이스콤(iscom) 보조제, 합성 글리코펩티드, 증량제, 카복시폴리메틸렌, 서브바이랄(subviral) 입자 보조제, 콜레라 독소, N,N-디옥타데실-N',N'-비스(2-하이드록시에틸)-프로판디아민, 모노포스포릴 지질 A, 디메틸디옥타데실-암모늄 브로마이드 및 이의 혼합물로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상의 제 2 보조제를 추가로 함유할 수 있다.
또한, 상기 백신 조성물은 수의학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 본 발명에서 용어 "수의학적으로 허용 가능한 담체"란 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 항원 보강제, 안정제, 희석제, 보존제, 항균제 및 항진균제, 등장성 작용제, 흡착 지연제 등을 포함한다. 백신용 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제, 희석제로는 락토즈, 덱스트로스, 슈크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 말티톨, 전분, 글리세린, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘포스페이트, 칼슘실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 들 수 있다.
또한, 상기 백신용 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형 및 드립(drip) 또는 스프레이 등의 비강용 제형 그리고 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용되는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제할 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 레시틴 유사 유화제에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제할 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용할 수 있다. 경구 투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등을 사용할 수 있으며, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수용성제, 현탁제, 유제, 동결건조제제가 포함된다. 비수용성제제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리 에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 비강내 투여를 위한 제제에 적합한 침투제는 일반적으로 당업자에게 공지되어 있다. 그러한 적합한 제형물은 안정성과 순응도를 위해 바람직하게 무균, 등장 및 완충되도록 제형화된다. 비강내 투여를 위한 제제는 또한 정상적인 섬모 작용을 유지시키기 위해 점액 분비를 여러 측면에서 자극하도록 제조되며, 적합한 제형이 바람직하게 등장성의, pH 5.5 내지 6.5를 유지하는 약간 완충된 제형이며, 가장 바람직하게 항미생물 방부제 및 적합한 약물 안정화제를 포함한다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
제조예 1. 재조합 벡터의 제조
융합파트너(fusion partner)로 사용된 돼지 유래 트립토파닐-tRNA 합성효소(pWRS) 유전자를 대장균의 코돈 사용빈도(codon usage)에 적합하게 합성을 한 후(서열번호 1), 합성된 염기서열의 5'- 및 3'- 부위에 제한효소 NcoI 및 EcoRI를 처리하여 선별하였다. 상기 선별된 유전자는 동일한 제한효소로 처리된 벡터의 다클론부위(multicloning site)에 삽입하였다. 상기 벡터는 T7 프로모터 및 6x히스-태그(6xHis-tag)를 가지고 있는 pHis parallel 벡터로서, pWRS 유전자와 목적 단백질인 클로스트리듐 퍼프린겐스(Clostridium perfringens) 베타 독소(beta toxin), 장독소형대장균(Enterotoxigenic Escherichia coli, ETEC) 섬모 독소(pili toxin) K88, K99, 987P, 및 F18ac, ETEC의 이열성 장내독소 서브유닛 B(heat-labile enterotoxin subunit B, LTB), ETEC의 Stx2eB(shiga toxin subunit B) 및 ETEC의 LTB-Stx2eB를 코딩하는 유전자를 순차적으로 연결하여 재조합 벡터를 제작하였다.
실시예 1. 형질전환체에서 목적 단백질의 발현 경향 분석
상기 제조예 1의 방법으로 제조된, pWRS 유전자와 목적 단백질을 코딩하는 유전자가 순차적으로 연결된 재조합 벡터와 pWRS 유전자가 포함되어 있지 않고 목적 단백질을 코딩하는 유전자만 포함되어 있는 재조합 벡터로 E. coli Rosetta-gami(DE3) Competent Cells(Novagen)을 각각 형질전환하였다. 상기 형질전환된 콜로니를 5 ㎖의 LB 액체배지에 접종하고 밤새 배양한 후, 새로운 200 ㎖의 LB 액체배지에 상기 배양된 배양액을 2 ㎖ 넣어 다시 배양하였다. 배양 1~2시간 후에 배양액의 흡광도(optical density, OD)값이 0.5~0.6에 도달하였을 때 1M의 이소프로필-β-D-1-티오갈락토피라노시드(isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside, IPTG)를 첨가한 후 각각의 조건으로 배양하였다. 베타독소는 30℃에서 4 및 22시간, 섬모독소 K88은 30℃에서 4 및 22시간, 섬모독소 K99는 30℃에서 4, 6 및 22시간, 섬모독소 987P는 30℃에서 9 및 22시간, 섬모독소 F18ac는 30℃에서 4, 6 및 22시간, LTB는 30℃에서 10, 20 및 22시간, Stx2eB는 30℃에서 12, 20 및 22시간, LTB-Stx2eB는 30℃에서 12, 20 및 22시간 동안 배양하였다.
형질전환된 세포를 배양한 배양액을 4,000 rpm으로 7분간 원심분리하여 세포 펠렛(cell pellet)을 회수하였고, 세포 펠렛을 5 ㎖의 인산완충식염수(phosphate buffered saline, PBS)로 부유시킨 후, 이 중 500 ㎕만 취하여 초음파 분쇄기로 세포를 파쇄하였으며 상기 세포 파쇄액을 다시 원심분리하여, 수용성 단백질이 존재하는 상층액과 비수용성 단백질이 존재하는 세포 펠렛을 10% SDS-PAGE 겔에 각각 로딩(loading)하여 전기영동을 수행하였다.
전기영동이 끝난 후, 쿠마시-블루(coomassie-blue) 용액으로 겔을 염색시키고, 탈염색(destaining) 용액(glacial acetic acid 100 ㎖, Methanol 450 ㎖, H2O 450 ㎖)을 사용하여 겔의 탈색 과정을 거친 다음, 겔에서 단백질 발현을 확인하였다. 면역블롯(immunoblot)의 경우 겔을 PVDF계 멤브레인에 트랜스퍼(transfer)하고 1:1,000의 비율로 희석된 anti-His 항체를 1:1,000를 사용하여 단백질의 발현을 확인하였다.
그 결과, pWRS 유전자가 포함되어 있지 않은 재조합 벡터로 형질전환된 세포에서는 목적 단백질이 수용성 형태로 발현되지 않는 것으로 관찰되었다(도 2A, 도 3A, 도 4A, 도 5A, 도 6A, 도 7A, 도 8A 및 도 9A). 반면에 pWRS 유전자가 포함되어 있는 재조합 벡터로 형질전환된 세포에서는 목적 단백질이 수용성 형태로 발현되는 것을 관찰하였다(도 2B, 도 3B, 도 4B, 도 5B, 도 6B, 도 7B, 도 8B 및 도 9B).
이를 통해, 돼지 유래 트립토파닐-tRNA 합성효소(pWRS) 유전자는, 상기 유전자의 카르복실 말단에 융합된 목적 단백질의 수용성 형태의 단백질로의 생산성을 증가시킬 수 있음을 확인하였다.

Claims (11)

  1. 트립토파닐-tRNA 합성효소 유전자와 목적 단백질을 코딩하는 유전자가 순차적으로 연결된 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
  2. 제1항에 있어서, T7 프로모터 및 6x히스-태그(6xHis-tag) 코딩 유전자, 트립토파닐-tRNA 합성효소 유전자 및 목적 단백질을 코딩하는 유전자가 순차적으로 연결된 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
  3. 제1항에 있어서, 상기 트립토파닐-tRNA 합성효소 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
  4. 제1항에 있어서, 상기 목적 단백질은 난발현성의 단백질인 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포.
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 재조합 벡터로 숙주세포를 형질전환하여 목적 단백질 코딩 유전자를 발현하는 단계를 포함하는, 목적 단백질의 수용성을 증가시키는 방법.
  7. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 재조합 벡터를 숙주세포에 형질전환하는 단계; 및
    상기 형질전환된 숙주세포를 배양하여 목적 단백질을 발현시키는 단계를 포함하는 숙주세포 내에서 수용성이 증가된 목적 단백질의 생산 방법.
  8. 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 트립토파닐-tRNA 합성효소 유전자와 목적 단백질을 코딩하는 유전자 순차적으로 연결된 재조합 벡터를 유효성분으로 포함하는, 수용성이 증가된 목적 단백질의 생산용 조성물.
  9. 제7항의 방법에 의해 생산된 수용성이 증가된 목적 단백질.
  10. 제9항의 수용성이 증가된 목적 단백질을 유효성분으로 함유하는 식중독 또는 대장균증 예방용 백신 조성물.
  11. 제10항에 있어서, 상기 목적 단백질은 클로스트리듐 퍼프린겐스(Clostridium perfringens) 베타 독소(beta toxin); 장독소형대장균(Enterotoxigenic Escherichia coli, ETEC) 섬모 독소(pili toxin) K88, K99, 987P, 또는 F18ac; ETEC의 LTB(heat-labile enterotoxin subunit B); ETEC의 Stx2eB(shiga toxin subunit B); 또는 ETEC의 LTB-Stx2eB인 것을 특징으로 하는 식중독 또는 대장균증 예방용 백신 조성물.
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