WO2012064162A9 - 시스토바이러스 phi12의 외피막 단백질 p9을 융합파트너로 포함하는 막 단백질 발현벡터 및 이를 이용한 막 단백질 제조 방법 - Google Patents

시스토바이러스 phi12의 외피막 단백질 p9을 융합파트너로 포함하는 막 단백질 발현벡터 및 이를 이용한 막 단백질 제조 방법 Download PDF

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    • C12N2720/00022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Definitions

  • the present invention relates to a membrane protein expression vector comprising the envelope protein P9 of cystovirus phi12 as a fusion partner, and a method for producing membrane protein using the same. More specifically, the present invention provides a membrane protein comprising the envelope protein P9 gene of the cystovirus phi12, a multicloning site for inserting a target membrane protein, and a protease recognition site located between the P9 gene and the multicloning site. An expression vector, a cell transformed with the expression vector, and a membrane protein production method using the cell.
  • GPCRs G-protein coupled receptors
  • membrane proteins are an economically important protein group, their function or structure studies lag far behind soluble proteins. This is because, unlike water-soluble proteins, membrane proteins, especially multipass transmembranes, which cross several membranes, were nearly impossible to produce using recombinant DNA technology (Mancia F. and Hendrickson W. A, Mol. BioSyst . 3). : 723-734, 2007).
  • E. coli when E. coli is used to induce the expression of foreign membrane proteins, the host dies before the expression of the target protein is observed.
  • mutant Escherichia coli C41 and C43 were developed that did not die after inducing the expression of membrane protein (Miroux, B. and Walker, JE J. Mol. Biol . 260: 289). -298, 1996), E. coli C41 (DE3) and C43 (DE3) were also used to express membrane proteins (Korepanova, A., et. Al, Protein Science 14: 148-158, 2005).
  • the present inventors have repeatedly studied to efficiently express eukaryotic or prokaryotic membrane proteins, and effectively combine the target membrane protein with the major envelope protein P9 of the cystovirus phi12, a fusion partner.
  • the present invention was completed by confirming that it can be expressed.
  • a basic object of the present invention is a membrane protein expression vector comprising an envelope protein P9 gene of a cystovirus phi12, a multicloning site for inserting a target membrane protein, and a protease recognition site located between the P9 gene and the multicloning site.
  • Still another object of the present invention is to provide a cell transformed with the membrane protein expression vector of the present invention.
  • Still another object of the present invention includes inserting a gene encoding a target membrane protein into multiple cloning sites of the membrane protein expression vector of the present invention, transforming the cells into cells, and then culturing the transformed cells. It is an object of the present invention to provide a membrane protein production method.
  • the above-mentioned basic object of the present invention is a membrane protein comprising the envelope protein P9 gene of the cystovirus phi12, a multicloning site for inserting a target membrane protein, and a protease recognition site located between the P9 gene and the multicloning site.
  • the expression vector according to the present invention is characterized by overexpressing a desired membrane protein using the envelope protein P9 of the cystovirus phi12 as a fusion partner, and the 5'-terminal or 3'- of the gene encoding the P9 protein.
  • the fusion protein in which the target protein is fused to the N-terminus or C-terminus of the P9 protein is expressed.
  • pRphi12 may be used as the expression vector.
  • the gene encoding the target membrane protein is included at the 5'-terminus or 3'-terminus of the fusion protein, thereby containing N Expresses a fusion protein in which the target protein is fused at the terminal or C-terminus.
  • the envelope protein P9 may have an amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 (P9) or SEQ ID NO: 2 (P9 + TM), but in the amino acid sequence of the protein, the substitution of amino acids within a range that does not affect the function of the protein, Additions or deletions may be made, and depending on the purpose, only a portion of the protein may be used or certain domains may be used in duplicate . Such modified amino acid sequences are also within the scope of the present invention. Accordingly, in the present invention, polypeptides and fragments thereof having substantially the same amino acid sequence as the protein may be used, and substantially identical polypeptides are preferably 80% or more, more preferably 90% or more, and most preferably 95% or more. By those having sequence homology.
  • the gene encoding the envelope protein P9 includes a nucleotide sequence inferred from the amino acid sequence of the protein P9 according to a genetic code, and can optimize codons to be well expressed in a selected host cell.
  • Representative examples of the gene include the nucleotide sequence of SEQ ID 3 (P9) or 4 (P9 + TM).
  • the base sequences of SEQ ID NOs: 3 and 4 encode the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 1 and 2, respectively.
  • the expression vector of the present invention may include a protease recognition site and an appropriate linker DNA between the envelope protein P9 and the site where the target protein is to be inserted.
  • the expression vector of the present invention is a multicloning site into which a promoter, a gene encoding the envelope protein P9 of the cystovirus phi12, a protease recognition site, and a gene of the target protein are inserted in the 5 'to 3' direction. , MCS) and histidine tags in the order of translational fusion.
  • antibiotic resistance genes may be further included as necessary.
  • the expression vector of the present invention may further include an extra transmembrane domain (TM domain) between the envelope protein P9 gene and the protease recognition site.
  • TM domain an extra transmembrane domain
  • any TM domain known in the art for example, the P9 protein of cystovirus, the P10 protein of cystovirus, the coat protein of Pseudomonas phage Pf3, or the bacteriophage
  • the TM domain of the major coat protein of M13 can be used.
  • pRphi12TM69 using the TM domain of the P9 protein of cystovirus phi6 can be used as the expression vector.
  • the promoter is T7, It may be a T5 or tac promoter, but it will be apparent to those skilled in the art that other suitable promoters may be used that will produce the desired membrane protein well in the host cell of choice.
  • the protease may be thrombin, Thev (TEV) or Enterokinase.
  • the present invention provides a gene produced so that the target membrane protein is expressed as a single polypeptide with a cystovirus derived fusion partner.
  • the engineered fusion gene may be introduced into a bacterium in the form of an episome or inserted into a chromosome to produce a target protein, or a target protein may be produced through a cell-free protein production method in vitro without introduction into a cell. have.
  • the membrane protein may be membrane receptors, ion channels, membrane transporters, pumps, membrane enzymes, ligands and receptors for cell-cell communication, and cell-cells.
  • Linkers that link cells, ligands and receptors in membrane vesicles for intracellular material transport, ligands and receptors in endo- and exocytosis, and biomembrane proteins involved in the viral life cycle It may be any one selected from the group consisting of an antibody or a portion thereof and a toxin protein.
  • the membrane protein is A3 adenosine receptor (ACR; Genbank Accession No.
  • GCR endothelin receptor type A
  • GPCR endothelin receptor type A
  • NM_002386 prostaglandin E receptor 3, Prostag; Genbank Accession no BC024229, Neuropeptide Y receptor Y1 (Neuroptide Y receptor, neuro; Genbank Accession No. BC036657) and Thiamine transporter, Th, a type of solute carrier iaT; Genbank Accession No. BC018514) and glucose transporter (Facilitated glucose transporter member 4, Glut4; Genbank Accession No. BC014282), and serotonin receptor (5-Hydroxytryptamine receptor 3A, Sero; a type of gated ion channel); Genbank Accession No. BC004453), Muscarinic acetylcholine receptor, Musc; Genbank Accession No.
  • Another object of the present invention described above can be achieved by providing a cell transformed with the membrane protein expression vector of the present invention.
  • the cells may be microorganisms or animal cells such as bacteria or yeast such as Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa and Bacillus subtilis.
  • Another object of the present invention described above is to insert a gene encoding the target membrane protein in the multiple cloning site of the membrane protein expression vector of the present invention, transforming the cells, and then culturing the transformed cells It can be achieved by providing a method for producing a target membrane protein comprising a.
  • the present invention is a membrane protein comprising the step of inserting the DNA encoding the target membrane protein in the multiple cloning site of the expression vector according to the invention, transforming it into cells, and then culturing the transformed cells It provides a production method of
  • a mild solvent such as lauryldimethylamine-oxide (LDAO) and purified using a Ni-NTA column or the like (FIG. 15), using an expression vector according to the present invention. It was confirmed that various membrane proteins can be effectively expressed and purified.
  • LDAO lauryldimethylamine-oxide
  • the embodiment of the present invention was carried out on the protein of the bacteriophage phi12, it is known in the art that these results can be applied to the envelope protein P9, such as other bacteriophages belonging to the cystovirus, for example, phi8, phi13, etc. It is self-evident.
  • the embodiment of the present invention uses E. coli as a host cell, it is also clear that other bacteria such as Bacillus subtilis and Pseudomonas aeruginosa may be used as the host.
  • the cells prepared by the method of the present invention and the protein of interest is expressed on the membrane can be used for measuring the activity of the membrane protein, the development of a ligand-receptor binding detection system, etc. characterized by using such cells.
  • the fusion protein or the target protein of the P9 protein-target protein expressed in the biological membrane by the expression vector of the present invention is administered to a vertebrate as an antigen to induce an immune response, and the antibody is recovered by recovering the antibody produced by the immune response. It can also produce.
  • the membrane protein expression vector of the present invention comprising the envelope protein P9 of the cytovirus phi12 as a fusion partner can effectively overexpress the membrane protein.
  • drug agents using the membrane protein as a functioning point or antibody production against the membrane protein can be overexpressed. It can be usefully used for bioconversion using membrane enzymes.
  • Figure 1 shows the structure of the membrane protein expression vector pRphi12 according to the present invention.
  • Figure 2 shows the structure of the membrane protein expression vector pRphi12TM69 according to the present invention.
  • Figure 3 shows the nucleotide sequence and amino acid sequence of the portion inserted into the P9 protein and linker in the expression vector pRphi12.
  • Figure 4 shows the nucleotide sequence and amino acid sequence of the P9 protein, P9-derived extracellular transmembrane domain (extra TM) of the phi6 and the linker is inserted in the expression vector pRphi12TM69.
  • coli BL21 (DE3) (left) and Rosetta (DE3) (right) of prostaglandin E synthase (mPGES), glucose carrier (GLUT4) and purinergic receptor (P2X) were confirmed using the dot blot method. to be.
  • FIG. 13 and FIG. 14 show that the P9-TM-membrane protein- is expressed using the fluorescence of GFP (FIG. 11), the GFP antibody (FIG. 14A), and the P9 antibody (FIG. 12B) after insertion of the membrane protein and the GFP gene into the expression vector pRphi12TM69. It is the result of detecting a GFP fusion protein.
  • Figure 15 shows the purification of Adora, Endo, Lyso, Neuro, ThiaT, Sero, Leuko, Melano, Prostag, and P2X proteins overexpressed using the expression vector pRphi12TM69 using a Ni-NTA column, and then purified proteins were purified by SDS-. Results confirmed by PAGE and immunoblot.
  • a recombinant vector overexpressing P9 of cystovirus phi12 the entire gene of SEQ ID NO: 3 encoding the envelope protein P9 (SEQ ID NO: 1) of phage phi12 was synthesized.
  • the codon of the synthetic gene was optimized for Escherichia coli, and the recognition sequence of restriction enzyme XhoI was inserted into the restriction enzyme NdeI and the termination codon was removed around the initiation codon.
  • DNA fragments were synthesized such that a base sequence encoding a thrombin recognition site, a multiple cloning site, six His codons (6 ⁇ His), and a stop codon are sequentially located (see SEQ ID NO: 5).
  • the recombinant vector having the structure of FIG. 1 was prepared by inserting it into the NdeI / HindIII position of the commercial expression vector pRSET A (Invitrogen), which was named pRphi12.
  • DNA corresponding to the transmembrane domain portion of the P9 protein of the cytovirus phi6 was synthesized and inserted into the XhoI site of the pRphi12 to prepare a vector pRphi12TM69 having the structure of FIG. 2 (SEQ ID NOs: 2 and 4).
  • Escherichia coli BL21 (DE3) was transformed with the recombinant vector pRphi12TM69 and named XL1blue / pRphi12TM69, which was deposited with the Korean Gene Bank under Accession No. KCTC11769BP dated October 1, 2010.
  • Membrane protein eluted with LDAO was Ni-NTA affinity chromatography (NTA affinity chromatography; column: His Trap TM HP (GE Healthcare); mobile phase: buffer-20 mM Tris-HCl pH7 containing 39 mM LDAO). .5; imidazole concentration gradient-20 to 500 mM and Superose 6 gel filtration; column: Superdex TM 75 10/300 GL (GE Healthcare; mobile phase: 20 mM Tris-HCl with 13 mM LDAO P9 protein containing a histidine tag (His-tag) and a thrombin recognition site was purified through a pH 7.5 buffer solution (Fig. 5), and the purified protein was injected into mice to prepare an antibody against P9.
  • the immunoblot results show that the fusion partners produced by pRphi12 and pRphi12TM69 are present in the cell membrane using the antibodies thus prepared and extracted with LDAO and Triton X100.
  • Example 3 Preparation of human membrane protein expression plasmid using expression vectors pRphi12 and pRphi12TM69
  • PCR reaction (Adora, Endo, Lyso). As a template, cDNA encoding human GPCR A3 adenosine receptor, Endothelin receptor A and Lysophosphatidic acid receptor 2 were used as templates. 7, Endo using PCR primers SEQ ID NO: 8 and 9, Lyso SEQ ID NO: 10 and 11, respectively, PCR reaction (Adora 94 °C 3 minutes 94 °C 1 minutes 55 °C 1 minutes 72 °C 1 minute 25 cycles, again 72 °C Endo and Lyso were 94 °C 3 minutes, 94 °C 1 minute 60 °C 1 minute 72 °C 1 minute 25 cycles, again 72 °C 10 minutes) was performed.
  • the amplified DNA was digested with Adora for restriction enzymes EcoRV and EcoRI, Endo for PvuII and HindIII, Lyso for PvuII and HindIII, and restriction sites for pRphi12 and pRphi12TM69 (Adora for SmaI / EcoRI, Endo and Lyso for SmaI / Human GPCR protein expression plasmids were prepared by inserting each into HindIII).
  • Dopa Leuko, Melano, Prostag
  • Dopamine receptor D2 Dopamine receptor D2, Dopa; Genbank Accession no. BC021195), cysteinyl leukotriene receptor 1 (Leuko; Genbank Accession no. BC035750), a type of GPCR, a human multi-membrane protein, melanocortin 1
  • An oligomer Dopa with a suitable restriction enzyme site as a template, a cDNA encoding the receptor (melanocortin 1 receptor, Melano; Genbank Accession no. NM_002386), prostaglandin E receptor 3, Prostag; Genbank Accession no. BC024229) PCR was performed using SEQ ID NOs.
  • Neuropeptide Y receptor Y1 a kind of human multi-membrane protein GPCR (Neuropeptide Y receptor Y1, Neuro; Genbank Accession No. BC036657), Thiamine transporter, ThiaT; Genbank Accession No. BC018514) and cDNA encoding serotonin receptor 3A, Sero (Genbank Accession No. BC004453), a type of gated ion channel, Neuro has SEQ ID NOs: 20 and 21, ThiaT SEQ ID NOs: 22, 23, and Sero performed PCR reactions (94 ° C. 3 min, 94 ° C. 1 min, 63 min. 1 min, 72 min. 1 min, 72 min.
  • the amplified DNA was digested with Neuro into SspI / HindIII, ThiaT into PvuII / HindIII, and Sero into PvuII / HindIII, respectively, and inserted into the restriction enzyme sites SmaI / HindIII of pRphi12 and pRphi12TM69, respectively, to prepare human multilayer membrane expression plasmids. It was.
  • Glut4, mPGES Facilitated glucose transporter member 4, GLUT4; Genbank Accession No. BC014282, a type of solute carrier, a multi-membrane protein, and Prostaglandin E synthase, mPGES; Genbank Accession No. NM_004878 PCR was carried out using the primers of SEQ ID NOs: 26 and 27, and mPGES SEQ ID NOs: 28 and 29, respectively, for GLUT4 (94 ° C for 3 minutes, 94 ° C for 1 minute, 60 ° C for 1 minute, and 72 ° C for GLUT4). 1 minute 25 cycles, 72 ° C. 10 minutes; mPGES was 94 ° C. 3 minutes, 94 ° C.
  • the amplified DNA was digested with GLUT4 as EcoRV / HindIII and mPGES as PvuII / HindIII, and then inserted into restriction sites SmaI / HindIII of pRphi12 and pRphi12TM69, respectively, to prepare multi-membrane protein expression plasmids.
  • a type of ion channel Musc is a PCR reaction using primers SEQ ID NO: 29 and 30, P2X SEQ ID NO: 31 and 32, respectively (GLUT4 is 94 °C 3 minutes, 94 °C 1 minute 60 °C 1 minute 72 °C 1 minute 25 cycles, 72 ° C. 10 minutes).
  • the amplified DNA was digested with EcoRV / HindIII, and then inserted into restriction enzyme positions Smal / HindIII of pRphi12 and pRphi12TM69, respectively, to prepare a multi-membrane protein expression plasmid.
  • E. coli hosts BL21 (DE3) and Rosetta (DE3) containing T7 RNA polymerase were transformed using the membrane protein expression plasmid prepared in Example 3, followed by inducing the expression of the protein by IPTG while culturing the transformant.
  • the degree of expression of each target protein was quantified as follows using a dot blot.
  • P9 protein of phage phi12 purified in Example 2 starting from 100 ng to make a solution diluted repeatedly by 1/2, 1 ⁇ l from each dilution solution was taken and dropped on the nylon membrane.
  • each cell from which the membrane protein was induced was collected and disrupted by ultrasonication, and then diluted to a protein concentration of 1 ⁇ g / ⁇ l.
  • 1 ⁇ l was taken from this total protein extract and diluted twice, and 1 ⁇ l of each diluted solution was dropped onto the nylon membrane.
  • the antibody prepared in Example 2 on this nylon membrane At a concentration of 1: 10,000 After binding, the bound antibody was detected by chemiluminescence, and the results are shown in FIGS. 7 to 7.
  • Samples for each target protein were obtained from BL21 (DE3) on the left and Rosetta (DE3) on the right.
  • FIGS. 7 to 7 a large amount of target proteins were detected in 10 except for four (Sero, Dopa, mPGES, Glut) among 14 multi-membrane proteins that attempted expression. Considering that these are human-derived multimembrane proteins, the results of FIGS. 7-7 show great progress in membrane protein expression techniques.
  • the dot blot method used in Example 4 is convenient for measuring the expression quantity, but is not suitable for measuring the quality of the expressed protein, such as whether the expressed protein is completely decomposed or fragmented. Therefore, the expression vectors were transformed into Escherichia coli hosts BL21 (DE3) and Rosetta (DE3) in order to confirm that the overexpressed protein is intact, followed by inducing the expression of the protein with IPTG while culturing the transformant and the target protein. Expression was carried out according to a conventional method. The detection of the target protein was directly observed by Coomassie staining or immunoblot using an antibody against the P9 protein prepared in Example 2, and the results are shown in FIGS. 10 to 10.
  • 11 shows immunoblot results of proteins expressed when pRphi12TM69 is used as a vector.
  • 12 Adora, Endo, Lyso, Neuro, ThiT, SeroR, P2X, Dopa, Musc, Leuko, Melano, Prostag
  • 12 Adora, Endo, Lyso, Neuro, ThiT, SeroR, P2X, Dopa, Musc, Leuko, Melano, Prostag
  • FIG. 12 shows the results of detecting the protein which appeared when pRphi12TM69 was used as a vector by Coomassie staining after SDS-PAGE.
  • FIG. 12 shows the results of detecting the protein which appeared when pRphi12TM69 was used as a vector by Coomassie staining after SDS-PAGE.
  • FIG. 12 shows the results of detecting the protein which appeared when pRphi12TM69 was used as a vector by Coomassie staining after SDS-PAGE.
  • FIG. 12 shows the results of detecting the protein which appeared when pRphi12TM69 was used as a vector by Coomassie staining after SDS-PAGE.
  • FIG. 12 shows the results of detecting the protein which appeared when pRphi12TM69 was used as a vector by Coomassie staining after SDS-PAGE.
  • FIG. 12 shows the results of detecting the protein which appeared when pRphi12TM69 was used as a vector by Coomassie stain
  • the GFP gene was inserted into the C-terminus of the membrane protein inserted into pRphi12TM69 to make a fusion protein linked to P9-TM-membrane protein-GFP. After inducing the T7 promoter to generate this protein, the cells were crushed and subjected to SDS PAGE, followed by UV irradiation, and fluorescence by GFP was observed. Referring to FIG. 13, it can be seen that most of the membrane proteins to be tested form fluorescent bands.
  • Fig. 14 shows the results of Western blot using the GFP antibody and the P9 antibody on the same sample to confirm that the fluorescence band and the membrane protein band match.
  • Sonication buffer 20 mM Tris-cl pH8.0, 0.3M NaCl, 10% glycerol
  • the precipitate was dissolved in a cell disruption buffer solution containing 39 mM LDAO and centrifuged again at 100,000 g for 1 hour to obtain a supernatant from which the target protein was extracted. After imidazole was added to the supernatant to a concentration of 10 mM, it was hung on a Ni-NTA column. After washing the column with a loading buffer (20 mM Tris-cl pH8.0, 0.3 M NaCl, 10% glycerol, 5 mM Imidazole), the target protein was removed from the column using an imidazole concentration gradient (10 mM to 500 mM). Separated. The separated protein was confirmed by SDS-PAGE and immunoblot, and the results are shown in FIG. 11.
  • ten target proteins were extracted with LDAO, a mild solvent, and then purified using a Ni-NTA column.

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Abstract

본 발명은 시스토바이러스 phi12의 외피막 단백질 P9을 융합파트너로 포함하는 막 단백질 발현벡터 및 이를 이용한 막 단백질 제조 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 시스토바이러스 phi12의 외피막 단백질 P9 유전자, 목적 막 단백질을 삽입하기 위한 다중클로닝부위 및 상기 P9 유전자와 상기 다중클로닝부위 사이에 위치하는 프로테아제 인식부위를 포함하는 막 단백질 발현벡터, 상기 발현벡터로 형질전환된 세포, 및 상기 세포를 이용하는 막 단백질 제조 방법에 대한 것이다.

Description

[규칙 제26조에 의한 보정 21.03.2012]　시스토바이러스 phi12의 외피막 단백질 P9을 융합파트너로 포함하는 막 단백질 발현벡터 및 이를 이용한 막 단백질 제조 방법
본 발명은 시스토바이러스 phi12의 외피막 단백질 P9을 융합파트너로 포함하는 막 단백질 발현벡터 및 이를 이용한 막 단백질 제조 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 시스토바이러스 phi12의 외피막 단백질 P9 유전자, 목적 막 단백질을 삽입하기 위한 다중클로닝부위 및 상기 P9 유전자와 상기 다중클로닝부위 사이에 위치하는 프로테아제 인식부위를 포함하는 막 단백질 발현벡터, 상기 발현벡터로 형질전환된 세포, 및 상기 세포를 이용하는 막 단백질 제조 방법에 대한 것이다.
막 단백질은 생물체 프로테옴의 약 25-30% 정도를 차지하는데, 호흡이나 광합성과 같은 기초적인 에너지 대사, 세포와 세포간 또는 세포와 외부간 커뮤니케이션, 물질 수송 및 지질 대사 등에 관여한다. 또한, 시판중인 약제의 약 50% 정도가 막 단백질의 일종인 G-단백질과 연결된 수용체(G-protein coupled receptor, GPCR)를 작용점으로 한다고 보고된 바 있으며(Lundstrom, K., Bioorg. Med. Chem. Lett., 15:3654, 2005), 가장 많이 팔리는 약 100개 중의 1/4은 GPCR이 작용점이라는 보고도 있다(Klabunde, T. 및 Hessler, G., ChemBioChem. 3:928-944, 2002).
그러나, 막 단백질은 경제적으로 중요한 단백질군임에도 불구하고 이의 기능 또는 구조 연구가 수용성 단백질에 비해 많이 뒤져 있다. 그 이유는 수용성 단백질과 달리 막 단백질, 특히 여러 번 막을 가로지르는 다층막 단백질(multipass transmembrane)은 재조합 DNA 기술을 이용한 생산이 거의 불가능했기 때문이다(Mancia F. 및 Hendrickson W. A, Mol. BioSyst. 3:723-734, 2007).
따라서, 수용성 단백질과 달리 미생물을 이용한 막 단백질의 발현 사례는 매우 드물며, 그 발현량도 매우 적다(Marullo, S. et al., Proc. Natl. Acd. Sci. USA., 85:7551, 1988; 및 Grisshammer et al. Biochem J., 295:571, 1993). 특별히 성공적인 경우라 할 수 있는 뉴로텐신 수용체(neurotensin receptor)와 맥아당 결합 단백질(maltose binding protein)의 융합 형태의 발현을 통해 대장균 세포 100 g 당 약 3 ㎎의 단백질을 얻은 사례가 있다(White, J. F., et al. FEBS Lett. 564:289, 2004).
그러나, 대장균을 이용하여 외래 막 단백질의 발현을 유도할 경우, 목적 단백질의 발현이 관찰되기 이전에 숙주가 사멸해 버린다. 이 문제를 해결하기 위하여 막 단백질 발현벡터를 도입한 후 막 단백질의 발현을 유도해도 죽지 않는 돌연변이체 대장균 C41과 C43을 개발하였으며(Miroux, B. 및 Walker, J. E. J. Mol. Biol. 260:289-298, 1996), 막 단백질의 발현에 대장균 C41(DE3)과 C43(DE3)을 사용하기도 했다(Korepanova, A., et. Al, Protein Science 14:148-158, 2005).
한편, 미스틱(Mistic)이라 불리는 고초균(Bacillus subtilus) 단백질을 융합파트너로 사용하면 진핵세포 다중막 단백질을 발현시킬 수 있다는 보고가 있었으나, 막 단백질의 발현에 효과적이지는 못했다(Roosild T. P. et al., Science, 307:1317-1321, 2005 및 Wagner et al., Trends in Biotech. 24:364-371, 2006).
최근에는 대장균 GlpF(glycerol-conducting channel protein)를 융합파트너로 사용하여 오클루딘(occludin), 클로딘4(claudin 4), 철환원효소(ferric reductase) 및 칼륨 채널(potassium channel)과 같은 인간 막 단백질을 발현시켰으나 이 방법은 목적 단백질의 아미노 말단이 세포막 밖에 있는 경우 적용이 불가능하고, 발현량도 매우 적었다(Neophytou, I. et al., Appl Microbiol Biotechnol 77:375-381, 2007).
또한, 세포내 막 시스템이 발달된 효모를 이용한 발현시스템의 개발이 시도되고 있다. 녹색 형광 단백질(Green fluorescent protein, GFP)을 발현 보고체로 사용하여 목적 막 단백질을 GFP와의 융합 단백질 형태로 효모 발현 벡터에 삽입한 후 GFP에서 나오는 형광의 유무를 따져 막 단백질의 발현 유무를 판단하는 방법이 최근에 개발되었다(Osterberg M., et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 103:11148-11153, 2006; 및 Newstead S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 104:13936-13941, 2007). 이 경우 효모 유래 단백질은 발현 성공 비율이 높은 반면, 인간을 포함하는 동물 유래 단백질의 경우 발현 성공률이 매우 낮고, 발현량도 매우 적었다.
이에 본 발명자들은 진핵세포 또는 원핵세포 유래의 막 단백질을 효율적으로 발현시키기 위해 연구를 거듭하던 중, 목적 막 단백질을 융합파트너인 시스토바이러스 phi12의 외피막 단백질(major envelope protein) P9과 결합시켜 효과적으로 발현시킬 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 기본적인 목적은 시스토바이러스 phi12의 외피막 단백질 P9 유전자, 목적 막 단백질을 삽입하기 위한 다중클로닝부위 및 상기 P9 유전자와 상기 다중클로닝부위 사이에 위치하는 프로테아제 인식부위를 포함하는 막 단백질 발현벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 막 단백질 발현벡터로 형질전환된 세포를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 막 단백질 발현벡터의 다중 클로닝 부위에 목적 막 단백질을 코딩하는 유전자를 삽입한 후, 이를 세포에 형질전환시킨 다음, 상기 형질전환된 세포를 배양하는 단계를 포함하는 목적 막 단백질 제조 방법을 제공하는 것이다.
전술한 본 발명의 기본적인 목적은 시스토바이러스 phi12의 외피막 단백질 P9 유전자, 목적 막 단백질을 삽입하기 위한 다중클로닝부위 및 상기 P9 유전자와 상기 다중클로닝부위 사이에 위치하는 프로테아제 인식부위를 포함하는 막 단백질 발현벡터를 제공함으로써 달성될 수 있다.
본 발명에 따른 발현벡터는 시스토바이러스 phi12의 외피막 단백질 P9을 융합파트너로 사용하여 목적하는 막 단백질을 과발현시키는 것을 특징으로 하며, 상기 P9 단백질을 코딩하는 유전자의 5'-말단 또는 3'-말단에 목적 막 단백질을 코딩하는 유전자를 연결하여 포함함으로써 P9 단백질의 N-말단 또는 C-말단에 목적 단백질이 융합된 융합단백질을 발현시킨다. 바람직하게는, pRphi12가 상기 발현벡터로서 사용될 수 있다.
상기 P9 단백질의 C-말단에 타 단백질의 막통과 도메인을 가외로 첨가한 후 이 융합단백질의 5'-말단 또는 3'-말단에 목적 막 단백질을 코딩하는 유전자를 연결하여 포함함으로써 P9 단백질의 N-말단 또는 C-말단에 목적 단백질이 융합된 융합단백질을 발현시킨다.
상기 외피막 단백질 P9은 서열번호 1(P9) 또는 서열번호 2(P9+TM)의 아미노산 서열을 가질 수 있으나, 상기 단백질의 아미노산 서열에서 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 아미노산의 치환, 부가 또는 결실이 이루어질 수 있으며, 목적에 따라 단백질의 일부만이 사용되거나 특정 도메인이 중복되어 사용될 수도 있다. 그러한 변형된 아미노산 서열 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서 본 발명에서는 상기 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 이의 단편도 사용할 수 있으며, 실질적으로 동일한 폴리펩티드란 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.
상기 외피막 단백질 P9을 코딩하는 유전자는 유전자 코드(genetic code)에 따라 상기 단백질 P9의 아미노산 서열로부터 유추된 염기서열을 포함하고, 선택된 숙주세포에서 잘 발현될 수 있도록 코돈을 최적화할 수 있으며, 이러한 유전자의 대표적인 예로서 서열번호 3(P9) 또는 4(P9+TM)의 염기서열을 들 수 있다. 서열번호 3 및 4의 염기서열은 상기 서열번호 1 및 2의 아미노산 서열을 각각 코딩한다.
본 발명의 발현벡터는 상기 외피막 단백질 P9과, 목적 단백질이 삽입될 부위 사이에 프로테아제 인식부위 및 적절한 링커 DNA를 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 발현벡터는 5'에서 3' 방향으로 프로모터, 시스토바이러스 phi12의 외피막 단백질 P9을 코딩하는 유전자, 프로테아제 인식부위, 목적 단백질의 유전자가 삽입될 다중 클로닝 부위(multicloning site, MCS) 및 히스티딘 태그의 순서로 번역 융합(translational fusion)의 형태로 연결된 것을 포함할 수 있다. 또한, 필요에 따라 항생제 내성 유전자 등을 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 발현 벡터는 상기 외피막 단백질 P9 유전자와 상기 프로테아제 인식부위 사이에 가외의 막통과 도메인(transmenbrane domain; TM 도메인)을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 벡터에 추가될 수 있는 TM 도메인으로서, 당 분야에 공지된 임의의 TM 도메인, 예를 들어, 시스토바이러스의 P9 단백질, 시스토바이러스의 P10 단백질, 슈도모나스 파지 Pf3의 코트단백질, 또는 박테리오파지 M13의 주코트 단백질(major coat protein)의 TM 도메인이 사용될 수 있다. 바람직하게는, 시스토바이러스 phi6의 P9 단백질의 TM 도메인이 사용된 pRphi12TM69가 발현벡터로서 사용될 수 있다.
본 발명의 발현 벡터에서, 상기 프로모터는 T7, T5 또는 tac 프로모터일 수 있으나, 선택한 숙주세포에서 목적 막 단백질을 잘 생산할 수 있는 적절한 다른 프로모터가 이용될 수 있음은 당업자에게 자명하다. 또한, 상기 프로테아제는 트롬빈, 테브(TEV) 또는 엔테로키나제(Enterokinase)일 수 있다.
또한, 본 발명은 목적 막 단백질이 시스토비루스 유래 융합파트너와 하나의 폴리펩타이드로 발현되도록 제조된 유전자를 제공한다. 상기 조작된 융합유전자는 에피좀(episome) 형태로, 또는 염색체 내에 삽입된 형태로 박테리아에 도입되어 목적 단백질을 생산하거나, 세포내 도입 없이 시험관 내에서 무세포 단백질 생산 방법을 통하여 목적 단백질을 생산할 수도 있다.
본 발명에 있어서 상기 막 단백질은 막 수용체(membrane receptors), 이온채널, 막 수송체(membrane transporter), 펌프(pump), 막 효소(membrane enzyme), 세포-세포 소통을 위한 리간드와 수용체, 세포-세포를 연결하는 링커, 세포내 물질 수송을 위한 소낭(membrane vesicle)의 리간드와 수용체, 엔도 및 엑소사이토시스 (endo- and exocytosis)의 리간드와 수용체, 바이러스 생활사(viral life cycle)에 관여하는 생체막 단백질, 항체 또는 그 일부분 및 독소단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다. 예시적으로, 상기 막 단백질은 인간 다중막 단백질인 G-단백질과 연결된 수용체(GPCR)인 A3 아데노신수용체(A3 adenosine receptor, Adora; Genbank Accession No. NM_000677), 엔도텔린 수용체 A(Endothelin receptor type A, Endo; Genbank Accession No. BC022511), 리소포스파티딕산 수용체 2(Lysophosphatidic acid receptor 2, Lyso; Genbank Accession No. BC030615), 도파민 수용체 D2(dopamine receptor D2, Dopa; Genbank Accession no. BC021195), 시스테이닐 류코트리엔 수용체 1(cysteinyl leukotriene receptor 1, Leuko; Genbank Accession no. BC035750), 멜라노코틴 1 수용체 (melanocortin 1 receptor, Melano; Genbank Accession no. NM_002386), 프로스타글란딘 E 수용체(prostaglandin E receptor 3, Prostag; Genbank Accession no. BC024229, 뉴로펩타이드 Y 수용체 Y1(Neuropeptide Y receptor Y1, neuro; Genbank Accession No. BC036657)와 용질운반체(Solute carrier)의 일종인 티아민 운반체(Thiamine transporter, ThiaT; Genbank Accession No. BC018514)와 포도당운반체(Facilitated glucose transporter member 4, Glut4; Genbank Accession No. BC014282), 그리고 여닫이 이온 채널(gated ion channel)의 일종인 세로토닌 수용체(5-Hydroxytryptamine receptor 3A, Sero; Genbank Accession No. BC004453), 아세틸콜린 수용체(Muscarinic acetylcholine receptor, Musc; Genbank Accession No. NM000738), 퓨리너직 수용체(Purinergic receptor P2X4, P2X4; Genbank Accession No. BC033826), 생체막효소의 일종인 프로스타글란딘 E 합성효소(Prostaglandin E synthase, mPGES; Genbank Accession No. NM_004878)일 수 있다.
전술한 본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 막 단백질 발현벡터로 형질전환된 세포를 제공함으로써 달성될 수 있다.
상기 세포는 대장균, 녹농균, 고초균 등의 박테리아나 효모 같은 미생물 또는 동물세포일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 융합파트너로서 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 시스토바이러스 phi12의 외피막 단백질 P9에 phi6 P9의 막통과 도메인을 하나 더 가외로 포함하는 발현벡터 pRphi12TM69를 제조한 후(도 1 및 2 참조), 이를 이용하여 대장균 BL21(DE3)를 형질전환시키고, 상기 형질전환된 대장균을 XL1blue/pRphi12TM69로 명명하였으며, 이를 한국생명공학연구원에 2010년 10월 1일자 수탁번호 제 KCTC 11769BP 호로 기탁하였다.
전술한 본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 막 단백질 발현벡터의 다중 클로닝 부위에 목적 막 단백질을 코딩하는 유전자를 삽입한 후, 이를 세포에 형질전환시킨 다음, 상기 형질전환된 세포를 배양하는 단계를 포함하는 목적 막 단백질 제조 방법을 제공함으로써 달성될 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 발현벡터의 다중 클로닝 부위에 목적 막 단백질을 코딩하는 DNA를 삽입한 후, 이를 세포에 형질전환시킨 다음, 상기 형질전환된 세포를 배양하는 단계를 포함하는 막 단백질의 생산방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에서는 발현벡터 pRphi12TM69의 MCS에 진핵세포 유래의 다양한 목적 막 단백질들을 삽입한 후 대장균에서 과발현을 유도하였고(도 8 내지 도 9), 과발현된 단백질이 정상적으로 폴딩하였음을 GFP 융합으로 확인하였다(도 13 및 도 14). 상기 과발현된 단백질들을 라우릴다이메틸아민-옥사이드(Lauryldimethylamine-oxide, LDAO)와 같은 순한 용제로 추출하여 Ni-NTA 컬럼 등을 사용하여 정제함으로써(도 15), 본 발명에 따른 발현벡터를 사용하여 다양한 막 단백질을 효과적으로 발현 정제할 수 있음을 확인하였다.
본 발명의 실시예에서는 박테리오파지 phi12의 단백질을 대상으로 실시되었으나, 이들 결과가 시스토바이러스에 속하는 다른 박테리오파지, 예를 들어, phi8, phi13 등의 외피막 단백질 P9에도 적용될 수 있으리라는 것은 당 기술분야에서 자명한 것이다. 또한, 본 발명의 실시예에서는 대장균을 숙주세포로 사용하고 있으나, 고초균 및 녹농균과 같은 다른 박테리아가 숙주로 사용될 수 있다는 것 또한 자명하다.
또한, 본 발명의 방법에 의해 제조되고 목적 단백질이 막에 발현된 세포는 이러한 세포를 이용하는 것을 특징으로 하는 막 단백질의 활성측정 방법, 리간드-수용체 결합 검출 시스템의 개발 등에 이용될 수 있다.
또한, 본 발명의 발현벡터에 의해 생체막에 발현된 P9 단백질-목적 단백질의 융합 단백질 혹은 목적 단백질만을 항원으로서 척추동물에 투여하여 면역반응을 유도하고, 상기 면역반응에 의해 생성된 항체를 회수함으로써 항체를 생산할 수도 있다.
시스토바이러스 phi12의 외피막 단백질 P9을 융합파트너로 포함하는 본 발명의 막 단백질 발현벡터를 사용하면 막 단백질을 효과적으로 과발현시킬 수 있으므로, 막 단백질을 작용점으로 하는 약제 개발이나, 막 단백질에 대한 항체 생산, 막효소를 이용한 생물전환 등에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 막 단백질 발현용 벡터 pRphi12의 구조를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명에 따른 막 단백질 발현용 벡터 pRphi12TM69의 구조를 나타낸 것이다.
도 3은 상기 발현벡터 pRphi12에서 P9 단백질 및 링커가 삽입된 부분의 염기서열 및 아미노산 서열을 나타낸 것이다.
도 4는 상기 발현벡터 pRphi12TM69에서 P9 단백질, phi6의 P9 유래 가외 막투과 도메인(extra TM) 및 링커가 삽입된 부분의 염기서열 및 아미노산 서열을 나타낸 것이다.
도 5는 상기 발현벡터 pRphi12를 이용하여 phi12의 P9을 정제한 결과를 나타낸다.
도 6은 상기 발현벡터 pRphi12와 pRphi12TM69가 생산하는 P9 및 P9-TM 융합체가 세포막에 존재하며 이들이 LDAO와 Triton X100으로 추출된다는 사실을 보여 준다.
도 7 내지 도 9는 발현벡터 pRphi12TM69에 삽입된 A3 아데노신수용체(Adora), 엔도텔린 수용체 A(Endo), 리소포스파티딕산 수용체 2(Lyso), 뉴로펩타이드 Y 수용체 Y1(Neuro), 세로토닌 수용체(Sero), 티아민 운반체(ThiaT), 시스테이닐 류코트리엔 수용체 1(Leuko), 멜라노코틴 1 수용체 (Melano), 프로스타글란딘 E 수용체(Prostag), 도파민 수용체 D2(Dopa), 머스카리닉 아세틸콜린 수용체(Musc), 프로스타글란딘 E 합성효소(mPGES), 포도당 운반체(GLUT4) 및 퓨리너직 수용체(P2X)의 대장균 BL21(DE3)(왼쪽) 및 Rosetta(DE3)(오른쪽)에서의 발현량을 돗블랏 방법을 이용하여 확인한 결과이다.
도 10은 상기 14종의 단백질을 발현벡터 pRphi12를 이용하여 발현을 유도한 후 발현양을 P9 항체를 이용한 웨스턴블랏 방법으로 확인한 결과이다.
도 11 및 도 12는 상기 14종의 단백질을 발현벡터 pRphi12TM69를 이용하여 발현을 유도한 후 SDS PAGE를 하고 단백질을 P9 항체를 이용한 웨스턴블랏(도 11)과 쿠마시 염색(도 10) 방법으로 검출한 결과이다.
도 13 및 도 14는 발현벡터 pRphi12TM69에 막백질과 GFP 유전자를 삽입한 후 GFP의 형광(도11), GFP 항체 (도 14A), P9항체(도12B)를 이용하여 P9-TM-막단백질-GFP 융합 단백질을 검출한 결과이다.
도 15는 발현벡터 pRphi12TM69를 이용하여 과발현한 Adora, Endo, Lyso, Neuro, ThiaT, Sero, Leuko, Melano, Prostag, 및 P2X 단백질을 Ni-NTA 컬럼을 이용하여 정제한 후, 정제된 단백질을 SDS-PAGE와 면역블랏으로 확인한 결과이다.
이하, 다음의 실시예를 들어 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다. 그러나 다음의 실시예에 대한 설명은 본 발명의 구체적인 실시 태양을 특정하여 설명하고자 하는 것일 뿐이며, 본 발명의 권리범위를 이들에 기재된 내용으로 한정하거나 제한해석하고자 의도하는 것은 아니다.
실시예 1: 시스토바이러스 phi12의 P9을 과발현하는 재조합 벡터의 제조
시스토바이러스 phi12의 P9을 과발현하는 재조합 벡터를 제조하기 위하여, 파지 phi12의 외피막 단백질 P9(서열번호 1)을 코딩하는 서열번호 3의 전체 유전자를 합성하였다. 이때, 합성유전자의 코돈은 대장균용으로 최적화하였으며, 개시코돈 주변에는 제한효소 NdeI, 종결코돈을 제거한 부위에는 제한효소 XhoI의 인식 서열을 각각 삽입하였다. 또한, XhoI 다음에는 트롬빈 인식부위를 코드하는 염기 서열, 다중 클로닝 부위, 6개의 His 코돈(6×His) 및 종결코돈이 차례로 위치하도록 DNA 조각을 합성한 다음(서열번호 5의 염기서열 참조), 상업용 발현벡터인 pRSET A(Invitrogen)의 NdeI/HindIII 위치에 삽입하여 도 1의 구조를 갖는 재조합 벡터를 제조하였으며, 이 벡터를 pRphi12로 명명하였다.
또한 시스토바이러스 phi6의 P9 단백질 중 막통과 도메인 부분에 해당하는 DNA를 합성하여 상기 pRphi12의 XhoI자리에 삽입하여, 도 2의 구조를 갖는 벡터 pRphi12TM69를 제조하였다(서열번호 2와 4). 대장균 BL21(DE3)을 상기 재조합벡터 pRphi12TM69로 형질전환하여 XL1blue/pRphi12TM69로 명명하였으며, 이를 한국 유전자 은행에 2010년 10월 1일자 기탁번호 제 KCTC11769BP 호로 기탁하였다.
실시예 2: 파지 phi12의 P9 단백질의 정제 및 항체 제조
상기 실시예 1에서 제조한 대장균 형질전환체를 초음파로 파쇄한 후, 12,000 rpm(high speed centrifuge)으로 원심분리하여 상등액을 얻고, 이를 다시 50,000 rpm(ultracentrifuge, 100,000g)의 속도로 원심분리하여 세포막 조각이 포함된 침전물을 얻었다. 39 mM LDAO를 함유하는 Tris-HCl pH7.5 완충용액을 가하여 침전물을 분산 시킨 후 재차 50,000 rpm으로 원심분리하여 막단백질이 용해된 상등액을 얻었다. LDAO로 용출된 막단백질은 통상의 방법에 따라 Ni-NTA 친화크로마토그래피(NTA affinity chromatography; 컬럼: His TrapTM HP(GE Healthcare); 이동상: 완충용액 - 39 mM LDAO를 포함하는 20mM Tris-HCl pH7.5; 이미다졸 농도 구배- 20 ~ 500 mM)와 슈퍼로스 6 겔 여과(Superose 6 gel filtration; 컬럼: SuperdexTM 75 10/300 GL(GE Healthcare; 이동상: 13 mM LDAO를 포함하는 20mM Tris-HCl pH 7.5 완충용액)를 차례로 거쳐 히스티딘 태그(His-tag)와 트롬빈 인식부위를 포함하는 P9 단백질을 정제하였다(도 5). 이렇게 정제한 단백질을 생쥐에 주사하여 P9에 대한 항체를 만들었다. 도 6은 이렇게 제조한 항체를 이용하여 pRphi12와 pRphi12TM69가 생산하는 융합파트너가 세포막에 존재하며 이들은 LDAO와 Triton X100으로 추출됨을 보여주는 면역블롯 결과이다.
실시예 3: 발현 벡터 pRphi12와 pRphi12TM69를 이용한 인간 막단백질 발현 플라스미드의 제조
(Adora, Endo, Lyso). 인간 GPCR인 A3 아데노신수용체(A3 adenosine receptor), 엔도텔린 수용체 A(Endothelin receptor type A) 및 리소포스파티딕산 수용체 2(Lysophosphatidic acid receptor 2)를 코딩하는 cDNA를 주형으로 하고, Adora는 서열번호 6과 7, Endo는 서열번호 8과 9, Lyso는 서열번호 10과 11의 프라이머를 각각 사용하여 PCR 반응(Adora는 94℃ 3 분 94℃ 1 분 55℃ 1 분 72℃ 1 분 25 사이클, 다시 72℃ 10 분; Endo와 Lyso는 94℃ 3 분 후, 94℃ 1 분 60℃ 1 분 72℃ 1 분 25 사이클, 다시 72℃ 10 분)을 수행하였다. 증폭된 DNA를 Adora는 제한효소 EcoRV 및 EcoRI로, Endo는 PvuII 및 HindIII로, Lyso는 PvuII 및 HindIII로 각각 절단한 후 pRphi12와 pRphi12TM69의 제한효소 자리(Adora는 SmaI/EcoRI, Endo와 Lyso는 SmaI/HindIII)에 각각 삽입하여 인간 GPCR 단백질 발현 플라스미드를 제조하였다.
(Dopa, Leuko, Melano, Prostag). 인간 다중막 단백질인 GPCR의 일종인 도파민 수용체 D2(dopamine receptor D2, Dopa; Genbank Accession no. BC021195), 시스테이닐 류코트리엔 수용체 1(cysteinyl leukotriene receptor 1, Leuko; Genbank Accession no. BC035750), 멜라노코틴 1 수용체(melanocortin 1 receptor, Melano; Genbank Accession no. NM_002386), 프로스타글란딘 E 수용체(prostaglandin E receptor 3, Prostag; Genbank Accession no. BC024229)를 코딩하는 cDNA를 주형으로, 적절한 제한효소 자리를 넣어준 올리고머(Dopa는 서열번호 12와 13, Leuko는 서열번호 14와 15, MC1R은 서열번호 16과 17, Prost는 서열번호 18과 19)를 프라이머로 사용하여 PCR 반응(94`C 3 분, 94`C 1 분 60`C 1 분 72`C 1 분 28 사이클 후 72`C 10 분)을 수행하였다. 증폭된 DNA를 적절한 제한효소(Dopa와 Leuko는 SmaI/HindIII, Melano와 Prostag는 EcoRV/HindIII)로 절단하여 pRphi12와 pRphi12TM69의 제한효소 자리 SmaI/HindIII에 각각 삽입하여 인간 다중막 단백질 발현 플라스미드를 제조하였다.
(Neuro,ThiaT,Sero). 인간 다중막 단백질인 GPCR의 일종인 뉴로펩타이드 Y 수용체 Y1(Neuropeptide Y receptor Y1, Neuro; Genbank Accession No. BC036657), 용질운반체(Solute carrier)의 일종인 티아민 운반체(Thiamine transporter, ThiaT; Genbank Accession No. BC018514) 및 여닫이 이온 채널(gated ion channel)의 일종인 세로토닌 수용체(5-Hydroxytryptamine receptor 3A, Sero; Genbank Accession No. BC004453)를 코딩하는 cDNA를 주형으로 하고, Neuro는 서열번호 20과 21, ThiaT는 서열번호 22와 23, Sero는 서열번호 24와 25의 프라이머를 사용하여 PCR 반응(94℃ 3 분, 94℃ 1 분 63℃ 1 분 72℃ 1 분 25 사이클 후 72℃ 10 분)을 수행하였다. 증폭된 DNA를 Neuro는 SspI/HindIII로, ThiaT는 PvuII/HindIII로, Sero는 PvuII/HindIII로 각각 절단한 후 pRphi12와 pRphi12TM69의 제한효소 자리 SmaI/HindIII에 각각 삽입하여 인간 다중막 단백질 발현 플라스미드를 제조하였다.
(Glut4,mPGES). 다중막 단백질인 용질운반체의 일종인 포도당운반체(Facilitated glucose transporter member 4, GLUT4; Genbank Accession No. BC014282), 및 생체막효소의 일종인 프로스타글란딘 E 합성효소(Prostaglandin E synthase, mPGES; Genbank Accession No. NM_004878)를 코딩하는 cDNA를 주형으로 하고, GLUT4는 서열번호 26과 27, mPGES는 서열번호 28과 29의 프라이머를 각각 사용하여 PCR 반응(GLUT4는 94℃ 3 분, 94℃ 1 분 60℃ 1 분 72℃ 1 분 25사이클 후, 72℃ 10 분; mPGES는 94℃ 3 분, 94℃ 1 분 65℃ 1 분 72℃ 1 분 25 사이클 후 72℃ 10 분)을 수행하였다. 증폭된 DNA를 GLUT4는 EcoRV/HindIII로, mPGES는 PvuII/HindIII로 각각 절단한 후 pRphi12와 pRphi12TM69의 제한효소 자리 SmaI/HindIII에 각각 삽입하여 다중막 단백질 발현 플라스미드를 제조하였다.
다중막 단백질이며 이온채널의 일종인 콜리너직 수용체(Muscarinic Acetylcholine receptor, Muscm Genbank Accession No. NM_00738)와 퓨리너직 수용체 P2X4(purinergic receptor P2X type 4, P2X, Genbank Accession No. BC033826)를 코딩하는 cDNA를 주형으로 하고, Musc는 서열번호 29 및 30, P2X는 서열번호 31 및 32의 프라이머를 각각 사용하여 PCR 반응(GLUT4는 94℃ 3분, 94℃ 1분 60℃ 1분 72℃ 1분 25 싸이클 후, 72℃ 10분)을 수행하였다. 증폭된 DNA를 EcoRV/HindIII로 각각 절단한 후, pRphi12와 pRphi12TM69의 제한효소 위치 Smal/HindIII에 각각 삽입하여 다중막 단백질 발현 플라스미드를 제조하였다.
실시예 4: 발현 벡터 pRphi12와 pRphi12TM69를 이용한 막단백질 발현 및 돗 블랏에 의한 검출
실시에 3에서 제조한 막단백질 발현 플라스미드를 이용하여 T7 RNA 폴리머라제가 들어있는 대장균 숙주 BL21(DE3) 및 Rosetta(DE3)를 형질전환시킨 후, 형질전환체를 배양하면서 IPTG로 단백질의 발현을 유도하고 각 목적 단백질의 발현 정도를 돗블랏(dot blot)을 이용하여 다음과 같이 정량하였다.
구체적으로, 실시예 2에서 정제한 파지 phi12의 P9 단백질을 100 ng 부터 출발하여 1/2씩 반복 희석한 용액들을 만든 후, 각 희석 용액으로부터 1 ㎕ 씩 취하여 나일론 막에 떨어뜨렸다. 다음으로 막 단백질을 유도한 각각의 세포를 수거하여 초음파로 파쇄한 후, 단백질 농도가 1 ㎍/㎕가 되도록 희석하였다. 이 전체 단백질 추출액으로부터 1 ㎕를 취하여 1/2씩 반복 희석한 후, 각 희석 용액 1 ㎕를 나일론 막에 떨어뜨렸다. 이 나일론 막에 실시예 2에서 제조한 항체를 1:10,000의 농도로 결합시킨 후, 화학발광법(chemiluminescence)으로 결합된 항체를 검출하였으며, 그 결과를 도 7 내지 7에 나타내었다. 각 목적 단백질에 대한 시료는 왼쪽은 BL21(DE3)로부터, 오른쪽은 Rosetta(DE3)로부터 얻은 것이다.
도 7 내지 7에서 보듯이 발현을 시도한 14개의 다중 막 단백질 중에서 4개(Sero, Dopa, mPGES, Glut)를 제외한 10개에서 많은 양의 목표 단백질이 검출되었다. 이들이 인간 유래 다중막단백질임을 고려할 때, 도 7 내지 7의 결과는 막 단백질 발현 기술에서 대단한 진전을 이루었음을 보여준다.
실시예 5: 발현된 막 단백질의 SDS-PAGE와 면역블랏
상기의 실시예 4에서 사용한 돗블랏 방법은 발현량(quantity)을 측정하기에는 편리하나 발현된 단백질이 완전한지 분해되어 조각이 됐는지 등 발현된 단백질의 질(quality)을 측정하기에는 적절치 않다. 따라서, 과발현된 단백질이 완전한 상태로 존재하는지 확인하기 위해 발현벡터들을 대장균 숙주 BL21(DE3)와 Rosetta(DE3)에 형질전환시킨 후 형질전환체를 배양하면서 IPTG로 단백질의 발현을 유도하고 각 목적 단백질의 발현을 통상의 방법에 따라 SDS-PAGE를 수행하였다. 목적 단백질의 검출은 쿠마시염색 후 단백질 밴드를 직접 관찰하거나 실시예 2에서 제조된 P9 단백질에 대한 항체를 이용하여 면역블랏으로 관찰하였으며, 그 결과를 도 10내지 10에 나타내었다.
도 10은 pRphi12을 벡터로 사용했을 때 발현되는 단백질의 면역블랏 결과이다. Sero, Endo, Lyso, Neuro, Leuko, Melano, ThiaT와 Prostag는 선명한 밴드를 보였고, Musc는 두 개의 밴드를 형성하였다. 이들의 크기는 각각의 아미노산 서열에서 추론하는 크기에 상응하는 것으로 보아 완전한 형태의 단백질임을 확인할 수 있었다.
도 11은 pRphi12TM69를 벡터로 사용했을 때 발현되는 단백질의 면역블랏 결과이다. 우리가 시도한 14개의 막단백질 중에서 12개(Adora, Endo, Lyso, Neuro, ThiT, SeroR, P2X, Dopa, Musc, Leuko, Melano, Prostag)에서 만족할 만한 발현을 보여주였다.
도 12는 pRphi12TM69를 벡터로 사용했을 때 나타나는 단백질을 SDS-PAGE 후 쿠마시 염색으로 검출한 결과이다. 이 그림에서 보듯이 pRphi12TM69를 벡터로 사용하여 발현을 시도한 14개의 다중막단백질 중에서 11개가 선명히 구별되는 밴드를 형성하였다.
실시예 6: GFP 융합을 이용한 막 단백질의 접힘 검사
대장균에서 과발현된 단백질들은 종종 폴리펩타이드가 잘못 접혀져 기능을 잃은 응집체(inclusion body) 형태로 존재하는 문제가 있음은 잘 알려져 있다. 이에 본 발명에 따라 발현된 막 단백질이 자연 상태에서와 같이 세포막에 존재하는지 또는 잘못된 접힘(folding) 형태로 있는지 여부를 GFP 융합을 이용하여 검사하였다. 검사하고자하는 시료단백질의 C-말단에 GFP를 융합시킬 경우 시료 단백질이 올바로 접히면 GFP가 형광을 보이나 잘못 접힐 경우 GFP 형광은 나타나지 않는다.
pRphi12TM69에 삽입된 막단백질의 C-말단에 GFP 유전자를 삽입하여 P9-TM-막단백질-GFP가 연결된 융합 단백질을 만들도록 하였다. 이 단백질이 생성되도록 T7 프로모터를 유도한 후 세포를 분쇄하고 SDS PAGE를 한 후 UV를 조사하면서 GFP에 의한 형광을 관찰하였다. 도 13을 보면 우리가 검사하고자하는 대부분의 막단백질에서 형광 밴드를 형성함을 알 수 있다. 이 형광을 보이는 밴드와 막단백질의 밴드가 일치함을 확인하기 위해 같은 시료에 대하여 GFP 항체와 P9항체를 이용한 웨스턴블랏을 한 결과가 도 14이다.
실시예 7. 발현된 단백질의 정제
본 발명의 벡터를 이용하여 Adora, Endo, Lyso, Neuro, ThiaT, Sero, Leuko, Melano, Prostag, P2X 단백질을 과발현한 후 정제를 시도하였다.
구체적으로, 실시예 3에서 제조된, 상기 단백질들의 발현 플라스미드를 보유한 BL21(DE3) 혹은 Rosetta(DE3) 세포를 25℃에서 광학밀도 (OD)=0.8이 될 때까지 영양배지(Difco LB broth)에서 배양한 후, IPTG를 넣고 6시간 더 배양하였다. 세포를 수거하여 세포 파쇄 완충용액(Sonication buffer; 20 mM Tris-cl pH8.0, 0.3M NaCl, 10% glycerol)에 녹인 후 초음파 분쇄하였다. 분쇄액을 100,000 g에서 1시간 동안 초고속 원심분리한 후 침전물을 모았다. 상기 침전물을 39 mM LDAO가 첨가된 세포 파쇄 완충용액에 녹인 후 재차 100,000 g에서 1시간 동안 초고속 원심분리하여 목적단백질이 추출된 상등액을 얻었다. 상기 상등액에 이미다졸을 가하여 농도가 10 mM이 되게 맞춘 후, Ni-NTA 컬럼에 걸었다. 컬럼을 로딩버퍼(20 mM Tris-cl pH8.0, 0.3 M NaCl, 10% glycerol, 5 mM Imidazole)로 충분히 씻어준 후 이미다졸 농도 구배(10 mM 내지 500 mM)를 이용하여 목적 단백질을 컬럼에서 분리하였다. 분리된 단백질을 SDS-PAGE와 면역블랏으로 확인하였으며, 그 결과를 도 11에 나타내었다.
도 15에 나타난 바와 같이, 10개의 목적 단백질은 순한 용제인 LDAO로 추출한 후 Ni-NTA 컬럼을 사용함으로써 상당한 정도의 정제가 가능하였다.
[규칙 제91조에 의한 정정 21.03.2012]　
Figure WO-DOC-FIGURE-79

Claims (15)

  1. 시스토바이러스 phi12의 외피막 단백질 P9 유전자, 목적 막 단백질을 삽입하기 위한 다중클로닝부위 및 상기 P9 유전자와 상기 다중클로닝부위 사이에 위치하는 프로테아제 인식부위를 포함하는 막 단백질 발현벡터.
  2. 제1항에 있어서, 상기 외피막 단백질 P9이 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는, 막 단백질 발현벡터.
  3. 제1항에 있어서, 상기 외피막 단백질 P9 유전자가 서열번호 3 또는 서열번호 4의 염기 서열을 갖는 것을 특징으로 하는, 막 단백질 발현벡터.
  4. 제1항에 있어서, 상기 막 단백질 발현벡터가 5'에서 3' 방향으로 프로모터, 시스토바이러스 phi12의 외피막 단백질 P9 유전자, 프로테아제 인식부위 및 히스티딘 태그의 순서로 번역 융합의 형태로 연결되어 있는 것을 특징으로 하는, 막 단백질 발현벡터.
  5. 제4항에 있어서, 상기 외피막 단백질 P9 유전자와 상기 프로테아제 인식부위 사이에 가외 TM 도메인을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 막 단백질 발현벡터.
  6. 제5항에 있어서, 상기 가외 TM 도메인이 시스토바이러스 P9 단백질, 시스토바이러스 P10 단백질, 슈도모나스 파지 Pf3의 코트단백질, 및 박테리오파지 M13의 주코트 단백질로 이루어진 군에서 선택되는 TM 도메인-함유 단백질에서 유래한 것을 특징으로 하는, 발현벡터.
  7. 제4항에 있어서, 상기 프로모터가 T7, T5 및 tac 프로모터로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 발현벡터.
  8. 제4항에 있어서, 상기 프로테아제가 트롬빈, 테브 및 엔테로키나아제로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 발현벡터.
  9. 제1항에 있어서, 상기 발현벡터가 pRphi12인 것을 특징으로 하는 발현벡터.
  10. 제5항에 있어서, 상기 발현벡터가 pRphi12TM69인 것을 특징으로 하는 발현벡터.
  11. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 발현벡터로 형질전환된 세포.
  12. 제11항에 있어서, 상기 세포가 미생물 또는 동물 세포인 것을 특징으로 하는 세포.
  13. 제11항에 있어서, 상기 세포가 대장균 XL1blue/pRphi12TM69(수탁번호 제KCTC11769BP호)인 것을 특징으로 하는 세포.
  14. 제1항의 발현벡터의 다중 클로닝 부위에 목적 막 단백질을 코딩하는 유전자를 삽입한 후, 이를 세포에 형질전환시킨 다음, 상기 형질전환된 세포를 배양하는 단계를 포함하는 목적 막 단백질 제조 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 막 단백질이 막 수용체(membrane receptors), 이온채널, 물질수송체(membrane transporter), 펌프(pump), 막 효소(membrane enzyme), 세포-세포 소통을 위한 리간드와 수용체, 세포-세포를 연결하는 링커, 세포내 물질 수송을 위한 소낭(membrane vesicle)의 리간드와 수용체, 엔도 및 엑소사이토시스(endo- and exocytosis)의 리간드와 수용체, 바이러스 생활사(viral life cycle)에 관여하는 생체막 단백질, 항체 또는 그 일부분, 및 독소단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 목적 막 단백질 제조 방법.
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