KR101912631B1 - 막 단백질 제조용 융합 단백질, 발현 벡터, 및 이를 이용한 막 단백질 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명의 일 측면에 따르면, MalF(Maltose transport system permease protein) 단백질의 전부 또는 일부; 및 목적하는 막 단백질을 포함하는 막 단백질 제조용 융합 단백질이 제공된다.

Description

막 단백질 제조용 융합 단백질, 발현 벡터, 및 이를 이용한 막 단백질 제조방법{A FUSION PROTEIN FOR PRODUCING A MEMBRANE PROTEIN, A EXPRESSION VECTOR, AND A METHOD FOR PRODUCING A MEMBRANE PROTEIN USING THE SAME}

본 발명은 대장균에서 유래한 MalF 단백질을 융합 파트너로 포함하는 막 단백질 제조용 융합 단백질, 발현 벡터, 및 이를 이용한 막 단백질 제조방법에 관한 것이다.

생체의 단백질 중 세포막에 존재하는 막 단백질은 전체 유전체의 25 내지 30%를 차지하며 신호전달, 물질 수송, 세포 형상 유지 등 중요한 역할을 수행한다. 특히 수용체 또는 이온 채널과 같은 막 단백질은 생체의 신호 전달 과정을 담당하며, 암, 신경계 질환, 면역계 질환, 염증 질환 등 다양한 질환과 연관성이 있을 뿐만 아니라, 현재 개발되는 약물 표적의 60% 이상을 차지하므로 질병의 진단 및 신약 개발에 있어서 매우 중요하다.

따라서, 상기 막 단백질들은 기능의 분석을 위하여 순수하게 정제되어야 하나, 수용체와 같은 막 단백질은 세포에 극미량이 존재하므로 생체에서 직접 분리되기 어려우며 특정 미생물에서 대량으로 발현되어 정제되어야 한다.

그러나, 막 단백질은 유전 공학적인 방법에 의해 형질 전환된 미생물에서 발현될 때 독성을 유발하거나 숙주 세포의 성장을 억제하며, 또는 활성이 없는 형태로서 수득되어 비수용성의 침전물을 형성할 수 있다. 이와 같이 막 단백질이 활성이 없는 형태로 수득되거나, 적정량이 수득되지 않으면, 항체 개발을 위한 항원으로서의 활용이 제한될 수 있다.

한편, 막 단백질은 대장균 등 미생물에서 발현될 때 지질막 환경에서 활성이 있는 구조를 형성할 수 있다. 따라서, 막 단백질을 대장균의 지질막에 발현시키고자, 특정의 단백질을 융합 파트너로 이용하는 기술이 일부 보고되고 있다. 예를 들어, 시스토비루스 phi6의 외피막 단백질(major envelope protein)의 일종인 P9 단백질을 융합 파트너로 이용하여 인간 수용체 단백질들을 대장균의 세포막에서 발현시킨 바 있으나, 상기 P9 단백질은 모든 막 단백질의 발현을 보장하지 않으며, 특히 일부 막 단백질은 P9 단백질과의 융합에도 불구하고 발현되지 않거나 발현 효율이 극히 낮은 것으로 관찰되었다.

따라서, 융합 파트너로서 발현 효율이 우수한 신규의 단백질 및 이를 활용하기 위한 벡터의 개발이 요구되며, 이는 신약 개발의 표적이 될 수 있는 다양한 종류의 인간 막 단백질의 대량 발현에 유용하게 활용될 수 있을 것으로 기대된다.

본 발명자들은 미생물에서의 발현 효율이 우수한 신규의 융합 파트너를 발굴하고자 하였으며, 종래에 효과적으로 발현되지 않는 다양한 종류의 막 단백질을 대량 생산하는 방법을 개발하고 이를 신약 개발 또는 학문적인 연구에 직접적으로 적용하고자 하였다.

본 발명은 전술한 문제점을 해결하기 위한 것으로, 본 발명의 목적은 막 단백질의 효율적인 제조를 위한 막 단백질 제조용 융합 단백질을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 막 단백질을 효율적으로 발현시킬 수 있는 발현 벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 막 단백질 제조용 융합 단백질을 과발현하는 재조합 미생물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 막 단백질을 효율적으로 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 일 측면에 따르면, MalF(Maltose transport system permease protein) 단백질의 전부 또는 일부, 및 목적하는 막 단백질을 포함하는 막 단백질 제조용 융합 단백질이 제공된다.

일 실시예에 있어서, 상기 MalF 단백질의 일부는 막관통 영역일 수 있다.

일 실시예에 있어서, 상기 MalF 단백질의 막관통 영역은 서열번호 3 또는 서열번호 4의 아미노산 서열로 구성될 수 있다.

일 실시예에 있어서, 상기 서열번호 3의 이미노산 서열은 서열번호 1의 핵산 서열에 의해 암호화되고, 상기 서열번호 4의 아미노산 서열은 서열번호 2의 핵산 서열에 의해 암호화될 수 있다.

본 발명의 다른 측면에 따르면, 프로모터 서열, 상기 프로모터 서열과 작동 가능하게 연결된 MalF 단백질의 전부 또는 일부를 암호화하는 핵산 서열, 단백질 분해효소 인식 부위, 및 다중 클로닝 부위(MCS)를 순차적으로 포함하는 막 단백질 제조용 발현 벡터가 제공된다.

일 실시예에 있어서, 상기 MalF 단백질의 일부는 막관통 영역을 포함할 수 있다.

일 실시예에 있어서, 상기 MalF 단백질의 막관통 영역은 서열번호 3 또는 서열번호 4의 아미노산 서열로 구성될 수 있다.

일 실시예에 있어서, 상기 서열번호 3의 이미노산 서열은 서열번호 1의 핵산 서열에 의해 암호화되고, 상기 서열번호 4의 아미노산 서열은 서열번호 2의 핵산 서열에 의해 암호화될 수 있다.

일 실시예에 있어서, 상기 프로모터는 GPD, TEF, ADH, CYC, INU1, PGK1, PHO5, TRP1, GAL1, GAL10, GUT2, tac, T7, T5, nmt, fbp1, AOX1, AOX2, MOX1 및 FMD1 프로모터로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.

일 실시예에 있어서, 상기 단백질 분해효소는 트롬빈(thrombin), 담배식각바이러스 단백질분해효소(Tev) 또는 엔테로키나아제(enterokinase)일 수 있다.

본 발명의 다른 측면에 따르면, 상기 융합 단백질을 암호화하는 외인성의 핵산 서열을 과발현하는 재조합 미생물이 제공된다.

일 실시예에 있어서, 상기 재조합 미생물은 상기 발현 벡터에 의해 형질 전환될 수 있다.

본 발명의 다른 측면에 따르면, 상기 발현 벡터로 미생물을 형질 전환하는 단계; 상기 형질 전환된 미생물을 배양하여 MalF 단백질 및 목적하는 막 단백질을 포함하는 융합 단백질을 발현시키는 단계; 상기 발현된 융합 단백질을 분리하는 단계; 및 상기 융합 단백질을 단백질 분해효소로 처리하여 상기 목적하는 막 단백질을 수득하는 단계를 포함하는 막 단백질의 생산 방법이 제공된다.

본 발명의 일 측면에 따른 막 단백질 제조용 발현 벡터 및 막 단백질의 생산방법은 MalF 단백질의 전부 또는 일부를 융합 파트너로 포함하므로 목적하는 막 단백질을 효과적으로 발현시킬 수 있다.

본 발명의 효과는 상기한 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 특허청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 막 단백질 제조용 발현 벡터(pMF_TM1)의 개열지도이다.
도 2는 MalF 서열(TM1)-링커-히스티딘-태그 서열을 순차적으로 포함하는 도 1의 발현 벡터 서열을 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 막 단백질 제조용 발현 벡터(pMF_TM12)의 개열지도이다.
도 4는 MalF 서열(TM12)-링커-히스티딘-태그 서열을 순차적으로 포함하는 도 3의 발현 벡터 서열을 나타낸 것이다.
도 5는 발현 벡터를 이용하여 인간 GPCR(FPR2 또는 LPA2)을 대장균 Rosetta(DE3)에 도입하고, 웨스턴 블랏을 통해 발현된 단백질을 정량한 것이다. Lane 1 내지 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 발현 벡터의 도입 전후를 비교한 것이고, Lane 7 및 8은 대조군으로서 시스토비루스 phi6의 외피막 단백질 P9를 융합파트너로 하는 발현 벡터의 도입 전후를 비교한 것이다.

이하에서는 첨부한 도면을 참조하여 본 발명을 설명하기로 한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며, 따라서 여기에서 설명하는 실시예로 한정되는 것은 아니다. 그리고 도면에서 본 발명을 명확하게 설명하기 위해서 설명과 관계없는 부분은 생략하였으며, 명세서 전체를 통하여 유사한 부분에 대해서는 유사한 도면 부호를 붙였다.

어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 구비할 수 있다는 것을 의미한다.

달리 정의되지 않는 한, 분자 생물학, 미생물학, 단백질 정제, 단백질 공학, 및 DNA 서열 분석 및 당업자의 능력 범위 안에서 재조합 DNA 분야에서 흔히 사용되는 통상적인 기술에 의해 수행될 수 있다. 상기 기술들은 당업자에게 알려져 있고, 많은 표준화된 교재 및 참고저서에 기술되어 있다.

본 명세서에 달리 정의되어 있지 않으면, 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 당업계에 통상의 기술자가 통상적으로 이해하는 바와 같은 의미를 가진다.

본 명세서에 포함되는 용어를 포함하는 다양한 과학적 사전이 잘 알려져 있고, 당업계에서 이용가능하다. 본 명세서에 설명된 것과 유사 또는 등가인 임의의 방법 및 물질이 본원의 실행 또는 시험에 사용되는 것으로 발견되나, 몇몇 방법 및 물질이 설명되어 있다. 당업자가 사용하는 맥락에 따라, 다양하게 사용될 수 있기 때문에, 특정 방법학, 프로토콜 및 시약으로 본 발명이 제한되는 것은 아니다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 단수형은 문맥이 명확하게 달리 지시하지 않으면 복수의 대상을 포함한다. 또한, 달리 지시된 바가 없으면, 핵산은 각각 왼쪽에서 오른쪽, 5'에서 3' 방향으로 씌여지고, 아미노산 서열은 왼쪽에서 오른쪽, 아미노에서 카르복실 방향으로 씌여진다.

이하 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

본 발명의 일 측면에 따르면, MalF(Maltose transport system permease protein) 단백질의 전부 또는 일부, 및 목적하는 막 단백질을 포함하는 막 단백질 제조용 융합 단백질이 제공된다.

상기 융합 단백질은 상기 MalF 단백질의 전부 또는 일부를 융합 파트너로 포함할 수 있다. 상기 막 단백질은 세포나 세포소기관의 막에 결합된 단백질로서, 지질이중층으로 이입되는 단백질 또는 당 단백질을 지칭한다. 상기 막 단백질은 신약 개발 등 산업적으로 활용도가 높은 단백질임에도 불구하고 수용성 단백질과 달리 유전자 재조합 기술에 의한 발현 또는 분리가 어려울 수 있으며, 특히, 상기 재조합 막 단백질은 대장균의 세포막에서 발현될 때에만 활성이 있는 구조로서 수득될 수 있다.

한편, 상기 막 단백질이 대장균 또는 효모와 같은 통상적인 숙주 세포를 통해 유전 공학적인 방법으로 발현되는 경우, 숙주 세포에 대한 독성을 유발하거나 균체의 성장이 억제될 수 있으며 또는 단백질의 구조가 변형되어 활성이 유지되지 않을 수 있다. 그러나, 상기 막 단백질이 상기 MalF 단백질과 융합된 형태로 숙주 세포의 세포막에서 발현될 때, 상기 막 단백질에 의해 야기되는 난점이 해소될 수 있을 뿐만 아니라, 발현 효율 역시 현저히 증대될 수 있다.

상기 MalF(Maltose transport system permease) 단백질은 대장균(Escherichia coli)의 세포막 표면에 존재하는 막 단백질로서, 말토오스 수송계를 구성하는 내막(inner membrane) 단백질의 일종이다. 즉, 상기 MalF 단백질은 계 외부의 기질을 세포막을 경유하여 수송하는 역할을 하며, 특정 막 단백질과 연결된 융합 단백질 형태로 숙주 세포의 세포막에서 용이하게 발현될 수 있다.

또한, 상기 막 단백질은 세포의 지질막에 존재하는 막 단백질로서 막 수용체(membrane receptors), 이온채널(ion channel), 막 수송체(membrane transporter), 펌프(pump), 막 효소(membrane enzyme), 세포-세포 소통을 위한 리간드와 수용체, 세포-세포를 연결하는 링커, 세포내 물질 수송을 위한 소낭(membrane vesicle)의 리간드와 수용체, 엔도 및 엑소사이토시스(endo- and exocytosis)의 리간드와 수용체 등 생체막 단백질로 이루어진 군에서 하나 이상 선택될 수 있다.

예컨대, 상기 막 단백질은 인간 G-단백질과 연결된 수용체(GPCR)인 리소포스파티딕산 수용체 2(Lysophosphatidic acid receptor 2, Lyso; Genbank Accession No. BC030615), 포밀펩타이드 수용체 2(formylpeptide receptor 2, Genbank Accession No. KJ891194.1)일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며 필요에 따라 목적하는 막 단백질을 달리할 수 있다.

일 실시예에 있어서, 상기 MalF 단백질의 일부는 막관통 영역(transmembrane domain, TM 도메인)을 포함할 수 있다. 상기 막 단백질은 전부 또는 일부가 융합 파트너로서 역할을 수행할 수 있으나 MalF 단백질의 막관통 영역을 융합 파트너로 포함할 때 목적하는 막 단백질의 발현 효율이 상대적으로 증가할 수 있다.

상기 막관통 영역은 MalF 단백질에서 생체막을 관통하는 영역으로서, 상기 MalF 단백질은 8개의 막관통 영역을 포함하는 것으로 알려져 있다(RAINER EHRLE, JOURNAL OF BACTERIOLOGY, Apr. 1996, p. 2255-2262). 특히, 상기 목적하는 막 단백질은 상기 8개의 막관통 영역 중 첫 번째 또는 두 번째 막관통 영역과 융합될 때, 세포막에서의 발현 효율이 현저히 증대될 수 있다.

상기 MalF 단백질의 첫 번째 막관통 영역, 또는 첫 번째 및 두 번째 막관통 영역은 서열번호 3 또는 서열번호 4의 아미노산 서열로 구성될 수 있으며, 상기 서열번호 3의 이미노산 서열은 서열번호 1의 핵산 서열에 의해 암호화되고, 상기 서열번호 4의 아미노산 서열은 서열번호 2의 핵산 서열에 의해 암호화될 수 있다.

한편, 상기 막 단백질 제조용 융합 단백질은 프로모터 서열, 상기 프로모터 서열과 작동 가능하게 연결된 MalF 단백질의 전부 또는 일부를 암호화하는 핵산 서열, 단백질 분해효소 인식 부위, 및 다중 클로닝 부위(MCS)를 순차적으로 포함하는 막 단백질 제조용 발현 벡터에 의해 제조될 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 pMF_TM1의 구조를 나타낸 것이며, 상기 도 3는 본 발명의 일 실시예에 따른 pMF_TM12의 구조를 나타낸 것이다.

도 1 및 도 3을 참조하면, 상기 발현 벡터는 5′에서 3′ 방향으로 프로모터 서열, MalF 단백질의 전부 또는 일부(예컨대, 막관통 영역을 암호화하는 유전자), 단백질 분해효소 인식 부위, 목적하는 막 단백질의 유전자가 삽입될 다중 클로닝 부위, 및 히스티딘 태그 등을 번역 융합(translational fusion)의 형태로 포함할 수 있다.

상기 벡터는 연결되어 있는 핵산 단편을 운반하는 데 이용되는 핵산 분자를 의미한다. 이용 가능한 벡터로는 박테리아, 플라스미드, 파지, 코스미드, 에피솜, 바이러스 및 삽입가능한 DNA 단편(즉, 상동재조합에 의해 숙주 세포 게놈 안으로 삽입 가능한 단편)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 플라스미드는 벡터의 일종으로서 내부에 추가적으로 DNA 단편을 연결시킬 수 있는 환형의 이중 가닥 DNA 루프를 의미한다. 또한, 바이러스 벡터는 추가적인 DNA를 바이러스 게놈 안에 연결시킬 수 있다. 상기 벡터는 작동 가능하도록 연결된 목적 단백질을 암호화하는 유전자의 발현을 지시할 수 있는데, 이러한 벡터를 발현 벡터라고 한다. 일반적으로, 재조합 DNA 기술의 사용에서 발현 벡터는 플라스미드 형태이므로, 용어 플라스미드 및 벡터가 상호 교환적으로 사용될 수 있다. 그러나, 바이러스 벡터와 같이 동일한 기능을 수행하는 다른 형태의 발현 벡터들도 포함할 수 있다.

예컨대, 상기 발현 벡터는 pESC-HIS, pESC-LEU, pESC-TRP, pESC-URA, Gateway pYES-DEST52, pAO815, pGAPZ A, pGAPZ B, pGAPZ C, pGAPα A, pGAPα B, pGAPα C, pPIC3.5K, pPIC6 A, pPIC6 B, pPIC6 C, pPIC6α A, pPIC6α B, pPIC6α C, pPIC9K, pYC2/CT, pYD1 Yeast Display Vector, pYES2, pYES2/CT, pYES2/NT A, pYES2/NT B, pYES2/NT C, pYES2/CT, pYES2.1, pYES-DEST52, pTEF1/Zeo, pFLD1, PichiaPink^TM , p427-TEF, p417-CYC, pGAL-MF, p427-TEF, p417-CYC, PTEF-MF, pBY011, pSGP47, pSGP46, pSGP36, pSGP40, ZM552, pAG303GAL-ccdB, pAG414GAL-ccdB, pAS404, pBridge, pGAD-GH, pGAD T7, pGBK T7, pHIS-2, pOBD2, pRS408, pRS410, pRS418, pRS420, pRS428, yeast micron A form, pRS403, pRS404, pRS405, pRS406, pYJ403, pYJ404, pYJ405 또는 pYJ406일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

한편, 상기 발현 벡터는 숙주 세포 내로 도입되고, 상기 도입된 벡터에 의해 형질 전환된 숙주 세포는 상기 MalF 및 목적하는 막 단백질을 암호화하는 유전자에 의해 융합 단백질을 생산할 수 있다. 이 때, 상기 벡터는 숙주 생물체에 의해 인지되는 프로모터를 포함할 수 있다.

상기 프로모터는 GPD, TEF, ADH, CYC, INU1, PGK1, PHO5, TRP1, GAL1, GAL10, GUT2, tac, T7, T5, nmt, fbp1, AOX1, AOX2, MOX1 및 FMD1 프로모터로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 숙주 세포 또는 발현 조건 등 다양한 변수를 고려하여 달리할 수 있다.

상기 MalF 단백질의 전부 또는 일부를 암호화하는 핵산 서열은 상기 프로모터 서열과 작동 가능하게 연결될(operably linked) 수 있다. 상기 "작동 가능하게 연결된(operably linked)"은 하나의 핵산 단편이 다른 핵산 단편과 결합되어 그의 기능 또는 발현이 다른 핵산 단편에 의해 영향을 받는 것을 의미한다. 즉, 상기 MalF 단백질의 전부 또는 일부를 암호화하는 유전자는 벡터 내에 있는 프로모터와 작동 가능하게 연결되어 발현이 조절될 수 있다.

또한, 상기 MalF 단백질을 암호화하는 핵산 서열은 상기 발현 벡터 내에서 단백질 분해효소 인식 부위 및 다중 클로닝 부위(MCS)와 순차적으로 연결될 수 있다.

상기 단백질 분해효소는 단백질의 펩타이드 결합을 가수 분해하는 효소로서 상기 단백질 분해효소 인식 부위에 작용하여 펩타이드 결합을 절단할 수 있다. 즉, 상기 목적하는 막 단백질은 상기 MalF 단백질과 융합된 형태로 발현되어 수득되므로, 상기 단백질 분해효소에 의해 상기 목적하는 막 단백질이 용이하게 분리될 수 있다. 상기 단백질 분해효소의 종류는 특별히 제한되지 않으며, 예컨대 트롬빈(thrombin), 담배식각바이러스 단백질분해효소(Tev) 또는 엔테로키나아제(enterokinase)일 수 있다.

또한, 상기 다중 클로닝 부위(MCS)는 다양한 제한 효소에 의해 절단될 수 있는 다수의 인식 부위를 포함하므로, 상기 목적하는 막 단백질은 상기 발현 벡터 내로 용이하게 도입될 수 있으며, 따라서, 상기 MalF 단백질 및 상기 목적하는 막 단백질이 융합된 형태로 발현될 수 있다.

한편, 상기 발현 벡터는 추가적인 조절 서열을 더 포함할 수 있다. 상기 조절 서열은 파지 MS-2의 레플리카아제 유전자의 샤인-달가노 서열 및 박테리오파지 람다의 cⅡ의 샤인-달가노 서열일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 상기 발현 벡터는 형질 전환된 숙주 세포를 선별하는데 필요한 적절한 마커 유전자를 포함할 수 있다. 상기 마커 유전자는 항생제 저항성 유전자 또는 형광 단백질 유전자일 수 있으며, 상기 항생제 저항성 유전자는 히그로마이신 저항성 유전자, 카나마이신 저항성 유전자, 클로람페니콜 저항성 유전자 및 테트라사이클린 저항성 유전자로 구성된 군에서 선택될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 형광 단백질 유전자는 효모-강화 녹색 형광 단백질(yeast-enhanced green fluorescent protein; yEGFP) 유전자, 녹색 형광 단백질(green fluorescent protein; GFP) 유전자, 청색 형광 단백질(blue fluorescent protein; BFP) 유전자, 및 적색 형광 단백질(red fluorescent protein; RFP) 유전자로 구성된 군에서 선택될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 다른 측면에 따르면, 상기 융합 단백질을 암호화하는 외인성의 핵산 서열을 과발현하는 재조합 미생물이 제공된다. 일 실시예에 있어서, 상기 재조합 미생물은 상기 발현 벡터에 의해 형질 전환될 수 있다.

상기 재조합 미생물은 형질 전환에 의해 대사 조작된 상기 숙주 세포(host cell)를 의미한다. 상기 숙주 세포는 발현 벡터에 의한 형질 전환이 용이한 세포를 지칭하는 것으로 유전 공학적 방법에 의해 형질 전환되어 특정의 유전자를 효율적으로 발현할 수 있으면 그 종류는 특별히 제한되지 않는다. 상기 적합한 숙주 세포는 자연적으로 발생하거나 또는 야생형 숙주 세포일 수 있고, 또는 변화된 숙주세포일 수 있다. 상기 야생형 숙주 세포(wide-type host cell)는 재조합 방법에 의해 유전적으로 변화되지 않은 숙주 세포일 수 있다.

상기 “대사 조작된(metabolically engineered)" 또는 "대사 조작(metabolic engineering)"은 미생물에서 알코올 또는 단백질과 같은 원하는 대사산물의 생산을 위하여, 생합성 유전자, 오페론과 연관된 유전자, 그리고 이들 핵산 서열의 제어 요소(control elements)의 합리적 경로 디자인과 어셈블리를 수반할 수 있다.

상기 "대사 조작된"은 유전자 조작과 적절한 배양 조건을 이용한 전사(transcription), 번역(translation), 단백질 안정성(protein stability)과 단백질 기능성(protein functionality)의 조절과 최적화에 의한 대사 흐름(metabolic flux)의 최적화를 더욱 포함할 수 있다. 생합성 유전자는 숙주에 외래성이거나, 돌연변이유발(mutagenesis), 재조합(recombination) 또는 내인성 숙주 세포에서 이종 발현 제어 서열과의 연관에 의해 변형됨으로써, 숙주(예컨대, 미생물)에 이종성일 수 있다. 적절한 배양 조건은 배양 배지 pH, 이온 강도, 영양 함량 등의 조건, 온도, 산소, 이산화탄소, 질소 함량, 습도, 및 상기 미생물의 물질대사 작용에 의한 화합물의 생산을 가능하게 하는 기타 배양 조건을 포함할 수 있다. 숙주 세포로서 기능할 수 있는 미생물에 적합한 배양 조건은 당해 기술 분야에 널리 알려져 있다.

따라서, 상기 "대사 조작된(engineered)" 또는 "변형된(modified)" 미생물은 유전 물질을 선택된 숙주 또는 부모 미생물 내로 도입하여 미생물의 세포 생리와 생화학을 변형하거나 변경함으로써 생산될 수 있다. 유전 물질의 도입을 통하여, 부모 미생물은 새로운 성질, 예를 들면, 새로운 세포 내 대사산물 또는 더욱 많은 양의 세포내 대사산물을 생산하는 능력을 획득할 수 있다.

예컨대, 유전 물질의 부모 미생물 내로의 도입은 화학 물질을 생산하는 새롭거나 변형된 능력을 초래할 수 있다. 부모 미생물에 도입된 유전 물질은 화학 물질 생산을 위한 생합성 경로에 관여하는 하나 이상의 효소를 코딩하는 유전자 또는 유전자의 일부를 포함하고, 이들 유전자의 발현 또는 발현 조절을 위한 추가 구성요소, 예를 들면, 프로모터 서열을 포함할 수도 있다.

상기 "변화된 숙주 세포(altered host cell)"는 유전적으로 설계된 숙주 세포를 의미하며, 여기서 목적 단백질은 발현의 수준으로 생성되거나 발현의 수준보다 더 큰 수준으로 생성되거나 본질적으로 동일한 성장 조건 하에서 성장하는 미변화된 또는 야생형 숙주 세포내에서의 목적 단백질의 발현의 수준보다 큰 발현의 수준으로 발현된다. "변형 숙주 세포(modified host cell)"은 목적 단백질을 암호화하는 유전자를 과발현되도록 유전적으로 설계되는 야생형 또는 변화된 숙주 세포를 의미한다. 상기 변형 숙주 세포는 야생형 또는 변화된 모 숙주 세포보다 더 높은 수준으로 목적 단백질을 발현할 수 있다.

한편, 상기 “형질 전환”은 상기 벡터를 미생물 내로 운반하는 방법을 의미하며, 형질 전환 하고자 하는 세포가 원핵세포인 경우에는, CaCl₂ 방법(Cohen, S.N. et al., Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9:2110- 2114(1973)), 하나한 방법(Cohen, S.N. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 9:2110-2114(1973); 및 Hanahan, D., J. Mol. Biol., 166:557-580(1983)) 및 전기 천공 방법(Dower, W.J. et al., Nucleic. Acids Res., 16:6127-6145(1988)) 등에 의해 실시될 수 있다. 형질 전환 하고자 하는 세포가 진핵세포인 경우에는, 미세 주입법(Capecchi, M.R., Cell, 22:479(1980)), 칼슘 포스페이트 침전법(Graham, F.L. et al., Virology, 52:456(1973)), 전기 천공법(Neumann, E. et al., EMBO J., 1:841(1982)), 리포좀-매개 형질감염법(Wong, T.K. et al., Gene, 10:87(1980)), DEAE-덱스트란 처리법(Gopal, Mol. Cell. Biol., 5:1188-1190(1985)), 및 유전자 밤바드먼트(Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87:9568-9572(1990))등을 이용하여 실시할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 효모와 같은 진균의 형질 전환의 경우에는, 일반적으로 리튬 아세테이트(Lithium acetate, R.D. Gietz, Yeast 11, 355360(1995)) 및 열 충격(Keisuke Matsuura, Journal of Bioscience and Bioengineering, Vol. 100, 5;538-544(2005))을 이용한 형질 전환법과 전기천공법(Nina SkoluckaAsian, Pacific Journal of Tropical Biomedicine, 94-98(2011))에 의해 실시될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 다른 측면에 따르면, 상기 발현 벡터로 미생물을 형질 전환하는 단계; 상기 형질 전환된 미생물을 배양하여 MalF 단백질 및 목적하는 막 단백질을 포함하는 융합 단백질을 발현시키는 단계; 상기 발현된 융합 단백질을 분리하는 단계; 및 상기 융합 단백질을 단백질 분해효소로 처리하여 상기 목적하는 막 단백질을 수득하는 단계를 포함하는 막 단백질의 생산 방법이 제공된다.

상기 형질 전환된 미생물은 배치, 공급-배치 또는 연속 발효 조건 하에서 배양될 수 있으며, 상기 미생물은 형질 전환에 의해 막 단백질 제조용 융합 단백질을 발현할 수 있으므로 상기 배양된 미생물로부터 상기 융합 단백질을 분리하여 목적하는 막 단백질을 수득할 수 있다.

이 때, 고전적인 배치 발효 방법은 폐쇄적인 시스템을 사용할 수 있고, 상기 배양 매질은 발효가 실행되기 전에 제조되며, 상기 매질에 유기체를 접종하고, 상기 매질에 어떠한 성분의 첨가도 없이 발효가 일어날 수 있다. 특정한 경우에서, 성장 매질의 상기 탄소원 내용물이 아닌, 상기 pH 및 산소 함량은 배치 방법 동안 변화될 수 있다. 배치 시스템의 상기 대사물 및 세포 바이오매스는 끊임없이 발효가 정지될 때까지 변화할 수 있다. 배치 시스템에서, 세포는 정지된 지체 상에서 고도성장 로그 상에 걸쳐 진척하고, 성장율이 감소되거나 멈춘 최종적으로 정지 상에 이를 수 있다. 일반적인 기간에서, 로그 상의 상기 세포는 대부분의 단백질을 만들 수 있다.

표준 배치 시스템의 변형은 "공급-배치 발효" 시스템이다. 상기 시스템에서, 영양(예를 들면, 탄소원, 질소원, O₂, 및 통상적으로, 다른 영양)은 이들의 배양물의 농도가 한계치 미만으로 떨어질 때 첨가될 수 있다. 공급-배치 시스템은 이화 생성물 억제가 세포의 대사를 억제하고, 매질이 매질 내에서 영양소를 제한된 양으로 갖는 것이 바람직할 때 유용할 수 있다, 공급-배치 시스템에서의 실제 영양 농도의 측정은 pH, 용존 산소 및 CO₂와 같은 폐기가스의 부분압과 같은 측정 가능한 인자의 변화에 기초하여 예측될 수 있다. 배치 및 공급-배치 발효는 일반적인 시스템으로서 당업계에 널리 알려져 있다.

계속적 발효는 정의된 배양 매질이 계속해서 생반응기(bioreactor)에 첨가되고, 조건화된 매질의 동일한 양이 과정 동안 동시에 제거되는 개방 시스템이다. 계속적 발효는 일반적으로 세포가 처음에는 로그 상 성장에 있는 일정한 고 밀도의 배양물을 유지할 수 있다. 계속적 발효는 세포 성장 또는 마지막 생성물 농도에 영향을 미치는 하나의 인자 또는 임의의 수의 인자의 조작이 가능할 수 있다.

예를 들어, 탄소원 또는 질소원과 같은 제한 영양소는 고정된 속도로, 모든 다른 파라미터는 적당하게 유지될 수 있다. 다른 시스템에서, 많은 성장에 영향을 주는 인자는 배지 탁도에 의해 측정되는 세포 농도가 일정하게 유지되는 동안, 계속해서 변화할 수 있다. 계속적 시스템은 일정한 상태의 성장 조건을 유지하려고 한다. 따라서, 매질이 빠져나가는 것에 의한 세포 손실은 발효에서의 세포 성장 속도에 대항하여 균형이 맞을 수 있다. 생성물 형성의 속도를 최대화하는 기술뿐만 아니라, 계속적 발효 과정 동안 영양소 및 성장인자를 유지하는 방법은 당업계에 알려져 있다.

이하, 실시예를 통해 본 발명을 더욱 상세히 기술한다.

제조예 1 : 첫 번째 막관통 영역을 포함하는 발현 벡터의 제조( pMF _TM1)

MalF의 첫 번째 막관통 영역을 과발현하는 발현 벡터를 제조하기 위하여, T7 프로모터, 샤인-달가노 서열, MalF의 첫 번째 막관통 영역(서열번호 1), 단백질 분해효소 인식 부위를 코딩하는 유전자 서열, 다중 클로닝 부위, 히스티딘 tag, 종결 코돈 및 T7 터미네이터를 포함하는 핵산 서열을 합성 한 후(서열번호 5), pUC19의 PvuII/NdeI 위치에 삽입하여 도 1의 구조를 갖는 재조합 벡터를 제조하였으며, 상기 벡터를 pMF_TM1으로 명명하였다. 상기 발현 벡터의 구체적인 서열을 도 2에 명확하게 나타내었다.

제조예 2 : 첫 번째 및 두 번째 막관통 영역을 포함하는 발현 벡터의 제조(pMF_TM12)

MalF의 첫 번째 및 두번째 막관통 영역을 과발현하는 발현 벡터를 제조하기 위하여, T7 프로모터, 샤인-달가노 서열, MalF의 첫 번째부터 두 번째 막관통 영역에 이르는 유전자 서열(서열번호 2), 단백질 분해효소 인식 부위를 코딩하는 유전자 서열, 다중 클로닝 부위, 히스티딘 tag, 종결 코돈 및 T7 터미네이터를 포함하는 핵산 서열을 합성한 후(서열번호 6), pUC19의 PvuII/NdeI 위치에 삽입하여 도 3의 구조를 갖는 재조합 벡터를 제조하였으며, 상기 벡터를 pMF_TM12으로 명명하였다. 상기 발현 벡터의 구체적인 서열을 도 4에 명확하게 나타내었다.

실험예 : 인간 G-단백질과 융합된 수용체 단백질의 발현

인간 GPCR인 리소포스파티딕산 수용체 2 유전자(LPA2, Lysophosphatidic acid receptor 2, Genbank Accession No. BC030615)의 단백질 부위를 코딩하는 cDNA와 포밀펩타이드 수용체 2 유전자(FPR2, Formylpeptide receptor 2; Genbank Accession No. KJ891194.1)의 단백질 부위를 코딩하는 cDNA를 주형으로 하여 PCR(94℃ 3 분 94℃ 0.5 분 55℃ 0.5 분 72℃ 1 분 25 사이클, 다시 72℃ 10 분)을 수행하였다.

이 때, LPA2는 서열번호 7및 8의 프라이머를, FPR2는 서열번호 9 및 10의 프라이머를 각각 사용하여 증폭하였다.

증폭된 DNA는 제한효소 EcoRI과 HindIII로 각각 절단된 pMF_TM1, 또는 pMF-TM12의 제한효소 자리(EcoRI/HindIII)에 각각 삽입하여 인간 GPCR 단백질 발현 플라스미드를 제조하였으며, 상기 플라스미드는 각각 pMF_TM1LPA, pMF_TM1FPR, pMF_TM12FPR로 명명되었다.

상기 발현 벡터를 이용하여 T7 RNA 폴리머라제(polymerase)가 들어있는 대장균 숙주 Rosetta(DE3)를 형질 전환시킨 후, 상기 형질 전환체를 배양하면서 IPTG로 단백질의 발현을 유도하였다.

도 5는 일 실시예에 따른 발현 벡터를 이용하여 인간 GPCR(FPR2 또는 LPA2)을 대장균 Rosetta(DE3)에 도입하고, 웨스턴 블랏을 통해 발현된 단백질을 정량한 것이다.

도 5를 참조하면, 제조예 1 및 제조예 2의 발현 벡터에 의해 형질 전환된 Rosetta(DE3)를 배양하고 His-tag 특이적 항체를 이용하여 막 단백질의 발현 정도를 관찰한 결과(Lane 1 : 발현 유도전 pMF_TM1/FPR2, Lane 2 : 발현 유도후 pMF_TM1/FPR2, Lane 3 : 발현 유도전 pMF_TM12/FPR2, Lane 4 : 발현 유도후 pMF_TM12/FPR2, Lane 5 : 발현 유도전 pMF_TM1/LPA2, Lane 6 : 발현 유도후 pMF_TM1/LPA2), 상기 형질 전환에 의해 막 단백질의 발현량은 현저하게 증대되었다.

또한, 대조군으로서 시스토비루스 phi6의 외피막 단백질(major envelope protein)의 일종인 P9 단백질을 융합 파트너로 포함하는 발현 벡터를 이용하여 Rosetta(DE3)를 형질전환하고 막 단백질의 발현 정도를 관찰한 결과(Lane 7 : 발현 유도전 pRphi6-9_FPR2, Lane 8 : 발현 유도후 pRphi6-9_FPR2), 발현 전후에 따라 막 단백질(FPR2)은 거의 발현되지 않았다.

즉, 본 발명의 일 실시예에 따른 MalF 단백질의 일부를 융합파트너로 포함하는 발현 벡터는 형질 전환에 의해 상기 막 단백질(FPR2 및 LPA2)의 발현을 현저히 증대시켰으나, 시스토비루스 phi6의 외피막 단백질의 일종인 P9 단백질은 FPR2의 발현을 유도하지 못하였다. 상기 막 단백질(인간 GPCR)은 통상적으로 형질 전환에 의해 대장균에서 발현이 거의 이루어지지 않는 인간 유래 막 단백질임에도 불구하고, MalF 단백질을 융합 파트너로 할 때 효과적으로 발현되었다. 따라서, 상기 막 단백질 제조용 융합 단백질 및 막 단백질 제조용 발현 벡터를 통해 목적하는 막 단백질이 효과적으로 수득될 수 있음을 확인하였다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.

본 발명의 범위는 후술하는 특허청구범위에 의해 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

<110> Kookmin University <120> A FUSION PROTEIN FOR PRODUCING A MEMBRANE PROTEIN, A EXPRESSION VECTOR, AND A METHOD FOR PRODUCING A MEMBRANE PROTEIN USING THE SAME <130> 2015-PP-12124 <160> 10 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 117 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> transmembrane domain I(MalF) <400> 1 atggatgtca ttaaaaagaa acattggtgg caaagcgacg cgctgaaatg gtcagtgcta 60 ggtctgctcg gcctgctggt gggttacctt gttgttttaa tgtacgcaca aggggaa 117 <210> 2 <211> 189 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> transmembrane domain I&II(MalF) <400> 2 atggatgtca ttaaaaagaa acattggtgg caaagcgacg cgctgaaatg gtcagtgcta 60 ggtctgctcg gcctgctggt gggttacctt gttgttttaa tgtacgcaca aggggaatac 120 ctgttcgcca ttaccacgct gatattgagt tcagcggggc tgtatatttt cgccaatcgt 180 aaagcctac 189 <210> 3 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> transmembrane domain I(MalF) <400> 3 Met Asp Val Ile Lys Lys Lys His Trp Trp Gln Ser Asp Ala Leu Lys 1 5 10 15 Trp Ser Val Leu Gly Leu Leu Gly Leu Leu Val Gly Tyr Leu Val Val 20 25 30 Leu Met Tyr Ala Gln Gly Glu 35 <210> 4 <211> 63 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> transmembrane domain I&II(MalF) <400> 4 Met Asp Val Ile Lys Lys Lys His Trp Trp Gln Ser Asp Ala Leu Lys 1 5 10 15 Trp Ser Val Leu Gly Leu Leu Gly Leu Leu Val Gly Tyr Leu Val Val 20 25 30 Leu Met Tyr Ala Gln Gly Glu Tyr Leu Phe Ala Ile Thr Thr Leu Ile 35 40 45 Leu Ser Ser Ala Gly Leu Tyr Ile Phe Ala Asn Arg Lys Ala Tyr 50 55 60 <210> 5 <211> 427 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pMF_TM1 <400> 5 cagctgtaat acgactcact atagagccac gttccgttgt atttctaatc aacagagatt 60 aaagaaggag gataaataat ggatgtcatt aaaaagaaac attggtggca aagcgacgcg 120 ctgaaatggt cagtgctagg tctgctcggc ctgctggtgg gttaccttgt tgttttaatg 180 tacgcacaag gggaaagcgc gatctcgctg gtgccgcgcg gctcccgggc taaaaaatca 240 gaaaacctgt attttcagtc aggaattcag acccaagctt ctcaccatca ccatcaccat 300 cactaagtac cgcataagcc aaaaccccgc tgagcaataa ctagcgcgta tttccacttc 360 caggcatcaa ataaaacgaa aggctcagtc gaaagactgg gccttttttt ttatctgttg 420 tcatatg 427 <210> 6 <211> 496 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pMF_TM12 <400> 6 cagctgtaat acgactcact atagagccac gttccgttgt atttctaatc aacagagatt 60 aaagaaggag gataaataat ggatgtcatt aaaaagaaac attggtggca aagcgacgcg 120 ctgaaatggt cagtgctagg tctgctcggc ctgctggtgg gttaccttgt tgttttaatg 180 tacgcacaag gggaatacct gttcgccatt accacgctga tattgagttc agcggggctg 240 tatattttcg ccaatcgtaa agcctacgcg atctcgctgg tgccgcgcgg ctcccgggct 300 aaaaaatcag aaaacctgta ttttcagtca ggaattcaga cccaagcttc tcaccatcac 360 catcaccatc actaagtacc gcataagcca aaaccccgct gagcaataac tagcgcgtat 420 ttccacttcc aggcatcaaa taaaacgaaa ggctcagtcg aaagactggg cctttttttt 480 tatctgttgt catatg 496 <210> 7 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LPA2F_primer <400> 7 ctgtattttc agtcaggaat tcagatggtc atgatgggcc agtgc 45 <210> 8 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LPA2R_primer <400> 8 gtgatggtga tggtgagaag cttgagaagc ttcaagggtg gagtc 45 <210> 9 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FPR2F_primer <400> 9 ctgtattttc agtcaggaat tcaggaaacc aacttctcca ctcct 45 <210> 10 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FPR2R_primer <400> 10 gtgatggtga tggtgagaag cttgcatttg cctgtaactc agtct 45

Claims (13)

1. MalF(Maltose transport system permease protein) 단백질의 막관통 영역, 단백질 분해효소 인식 부위 및 목적하는 막 단백질로 이루어지고,
   상기 MalF 단백질의 막관통 영역은 서열번호 3 또는 서열번호 4의 아미노산 서열로 구성되고,
   상기 목적하는 막 단백질은 LPA2(Lysophosphatidic acid receptor 2) 또는 FPR2(Formylpeptide receptor 2) 단백질인 막 단백질 제조용 융합 단백질.
   
2. 삭제
3. 삭제
4. 제1항에 있어서,
   상기 서열번호 3의 이미노산 서열은 서열번호 1의 핵산 서열에 의해 암호화되고, 상기 서열번호 4의 아미노산 서열은 서열번호 2의 핵산 서열에 의해 암호화되는 막 단백질 제조용 융합 단백질.
   
5. 프로모터 서열, 상기 프로모터 서열과 작동 가능하게 연결된 MalF 단백질의 막관통 영역을 암호화하는 핵산 서열, 단백질 분해효소 인식 부위, 및 다중 클로닝 부위(MCS)로 순차적으로 이루어지고,
   상기 MalF 단백질의 막관통 영역은 서열번호 3 또는 서열번호 4의 아미노산 서열로 구성되고,
   상기 다중 클로닝 부위에 목적하는 막 단백질이 삽입되는 막 단백질 제조용 발현 벡터.
   
6. 삭제
7. 삭제
8. 제5항에 있어서,
   상기 서열번호 3의 이미노산 서열은 서열번호 1의 핵산 서열에 의해 암호화되고, 상기 서열번호 4의 아미노산 서열은 서열번호 2의 핵산 서열에 의해 암호화되는 막 단백질 제조용 발현 벡터.
   
9. 제5항에 있어서,
   상기 프로모터는 GPD, TEF, ADH, CYC, INU1, PGK1, PHO5, TRP1, GAL1, GAL10, GUT2, tac, T7, T5, nmt, fbp1, AOX1, AOX2, MOX1 및 FMD1 프로모터로 이루어진 군에서 선택된 막 단백질 제조용 발현 벡터.
   
10. 제5항에 있어서,
    상기 단백질 분해효소는 트롬빈(thrombin), 담배식각바이러스 단백질분해효소(Tev) 또는 엔테로키나아제(enterokinase)인 막 단백질 제조용 발현 벡터.
    
11. 제1항 또는 제4항의 융합 단백질을 암호화하는 외인성의 핵산 서열을 과발현하는 재조합 미생물.
    
12. 제5항, 및 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항의 발현 벡터에 의해 형질 전환된 재조합 미생물.
    
13. 제5항, 및 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항의 발현 벡터로 미생물을 형질 전환하는 단계;
    상기 형질 전환된 미생물을 배양하여 MalF 단백질 및 목적하는 막 단백질을 포함하는 융합 단백질을 발현시키는 단계;
    상기 발현된 융합 단백질을 분리하는 단계; 및
    상기 융합 단백질을 단백질 분해효소로 처리하여 상기 목적하는 막 단백질을 수득하는 단계를 포함하는 막 단백질의 생산 방법.
    
    

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