KR20170023303A

KR20170023303A - 페리플라즘으로 분비되는 지방산 이중결합 수화효소를 이용한 히드록시지방산 제조방법

Info

Publication number: KR20170023303A
Application number: KR1020150117367A
Authority: KR
Inventors: 박진병; 정상민; 이정후
Original assignee: 이화여자대학교 산학협력단
Priority date: 2015-08-20
Filing date: 2015-08-20
Publication date: 2017-03-03
Also published as: KR101775226B1

Abstract

본 발명은 페리플라즘으로 분비되는 지방산 이중결합 수화효소 및 이를 이용한 히드록시지방산 제조방법에 관한 것으로, 구체적으로 본 발명은 페리플라즘으로 분비되는 지방산 이중결합 수화효소의 일종인 올레산 수화효소를 이용하여 불포화지방산으로부터 히드록시지방산을 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에서 제공하는 페리플라즘(periplasm)으로 분비되는 지방산 이중결합 수화효소는 종래의 세포질에서 존재하는 지방산 이중결합 수화효소보다 동일한 시간에 많은 양의 히드록시지방산을 제조할 수 있으므로, 히드록시 지방산을 사용하고 있는 화학물질, 연료, 플라스틱, 락톤, 향료, 계면 활성제 및 가소제 등을 제조하는데 필요한 비용 및 단가를 절감할 수 있을 것이다.

Description

페리플라즘으로 분비되는 지방산 이중결합 수화효소를 이용한 히드록시지방산 제조방법{Fatty acid double bond hydratases acting in periplasm and process for producing hydroxy fatty acids using thereof}

본 발명은 페리플라즘으로 분비되는 지방산 이중결합 수화효소를 이용한 히드록시지방산 제조방법에 관한 것으로, 구체적으로 본 발명은 페리플라즘으로 분비되는 지방산 이중결합 수화효소의 일종인 올레산 수화효소를 이용하여 불포화지방산으로부터 히드록시지방산을 제조하는 방법에 관한 것이다.

히드록시 지방산(예를 들어, 10- 또는 12-히드록시스테아르산 및 12-히디록시올레산)은 자연계에 존재하는 물질로서 트리글리세롤, 왁스, 세레브로시드, 그밖에 식물이나 곤충 그리고 미생물에 존재하는 지질 등에서 발견되고 있다. 또한, 이러한 히드록시 지방산은 화학물질, 연료, 플라스틱, 락톤, 향료, 계면활성제 및 가소제 등을 제조하기 위해 널리 사용되고 있다. 이외에도 C9-C13 오메가-히드록시카복실산(C9-C13 ω-hydroxycarboxylic acids), 알파,오메가 디카르복실산(α,ω-dicarboxylic acids), 및 오메가-아미노카르복실산(ω-aminocarboxylic acids)은 장쇄 히드록시 지방산으로부터 제조될 수 있기 때문에 히드록시 지방산의 수요가 점점 증가하고 있다.

이처럼 다양한 분야에서 사용되고 있는 히드록시 지방산을 제조하기 위하여 보통 지방산 이중결합 수화효소를 포함하는 생물 촉매를 이용하고 있다. 지방산 이중결합 수화효소는 일반적으로 올레산 및 리놀레산과 같은 지방산의 시스-9- 및 시스-12-이중결합에 대하여 트랜스-배열 없이 수화를 촉매시키는 역할을 하고 있다. 예를 들어, 지방산 이중결합 수화효소인 올레산 수화효소를 발현하는 재조합 대장균(Escherichia coli)을 이용하여 올레산으로부터 약 46 g/L의 10-히드록시스테아릭산(10-hydroxystearic acid, 10-HSA)를 제조할 수 있다.

그러나, 히드록시지방산을 제조하기 위한 지방산 이중결합 수화효소를 포함하는 생물 촉매의 문제점은 대부분의 효소의 생리적 환경과 유사한 수용액 환경에서 기질의 분산성 및 낮은 용해도이다. 수성 매질에서 매우 낮은 용해도는 기질을 효소 활성화 자리로 수송시키는데 영향을 미치게 된다. 그러므로 생물전환 속도를 개선하기 위해 지방산을 촉매 효소로 수송하는 효율을 증가시키는 것이 중요하다.

지방산을 촉매 효소로 수송하는 효율을 증가시키기 위해, 대부분은 효소로 소수성 분자를 수송하는 효율을 증가시키는 방법을 이용한다(Joo, Y. C., et al., J Biotechnol 2012, 158, 17-23). 이 중 하나의 방법은 반응 배지에 소수성 기질을 분산시키는 계면활성제를 사용하는 것이다. 다른 하나의 방법은 비수용성인 기질과 상호작용하는 기질 결합 도메인을 삽입하는 것이다. 예를 들어, 막-고정 도메인을 가지는 에스터라제를 제작하여 이를 이용하는 경우, 지방산 유도체에 대하여 kcat 수치가 6배 증가하였다(Lee, Y.-A., et al, Process Biochem 2014, 49, 2101-2106). 그러나 히드록시지방산 및 이를 통해 얻어진 부산물을 대량 제조하기 위해서, 지방산을 촉매 효소로 수송하는 효율을 증가시키는 방법에 대한 지속적인 연구가 필요한 실정이다.

이러한 배경 하에, 본 발명자들은 지방산을 촉매 효소로 수송하는 효율을 증가시키는 방법을 개발하고자 예의 연구노력한 결과, 페리플라즘으로 분비되는 지방산 이중결합 수화효소를 사용할 경우, 지방산을 촉매 효소로 수송하는 효율을 증가시킬 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 페리플라즘으로 분비되는 지방산 이중결합 수화효소를 이용하여 불포화지방산으로부터 히드록시지방산을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명자들은 미생물을 이용하여 불포화 지방산으로부터 히드록시지방산을 생성하는 생물전환 공정에서, 생성되는 히드록시 지방산의 생산성을 높일 수 있는 방법을 개발하고자, 페리플라즘으로 분비되는 지방산 이중결합 효소를 사용하는 방법을 개발하였다.

기존의 생물전환 공정에서 지방산 이중결합 수화효소는 세포질에서 발현되고, 세포 바깥에 존재하는 불포화 지방산 기질이 세포 내로 이동하여 수화효소와 반응한다. 그러나, 본 발명에서 제공하는 방법에 의하면, 지방산 이중결합 수화효소는 세포내에서 발현된 후, 페리플라즘으로 이동하고, 세포 바깥에 존재하는 불포화 지방산 기질 역시 페리플라즘으로 이동하여, 페리플라즘에서 반응하므로, 기존의 생물전환 공정에서 지방산 이중결합 수화효소에서의 이동 경로를 보다 단축하였고, 이를 통해 불포화 지방산 기질이 지방산 이중결합 수화효소로의 접근성을 높임으로서 전체적인 불포화 지방산의 지방산 이중결합 수화효소 속도를 향상시킬 수 있었다.

상술한 목적을 달성하기 위해, 본 발명의 하나의 양태는 페리플라즘으로 분비되는 지방산 이중결합 수화효소를 이용한 히드록시 지방산의 제조방법을 제공한다.

구체적으로, 본 발명의 히드록시 지방산의 제조방법은 (a) 지방산 이중결합 수화효소를 페리플라즘으로 분비할 수 있는 형질전환체를 수득하는 단계; 및 (b) 상기 형질전환체에 불포화 지방산을 처리하여 히드록시 지방산(hydroxyfatty acid)을 제조하는 단계를 포함한다.

본 발명에서 사용된 용어 "페리플라즘(periplasm)"은 세포내막과 세포외막 사이의 공간에 존재하는 젤(gel)과 유사한 물질로 이루어진 부분을 말한다. 대장균(E. coli)은 세포내막(inner membrane)과 외막(outer membrane)의 2개의 막으로 둘러싸여 있으며, 이 2개의 막을 기준으로 세포내막의 내부 공간은 세포질(cytoplasm), 세포내막과 세포외막 사이의 공간은 페리플라즘(periplasm), 세포외막의 외부 공간은 세포외 영역(extracellular space)으로 분류한다.

본 발명의 목적상 상기 페리플라즘은 상기 형질전환체로부터 발현된 지방산 이중결합 수화효소가 분비되어 불포화 지방산의 절단 또는 분해를 수행하는 장소가 될 수 있다.

본 발명에서 사용된 용어 "지방산 이중결합 수화효소"는 탄소이중결합에 물을 가하여 하이드록시 화합물을 가역적으로 생성하는 효소를 의미하는데, 역반응에 의하여 하이드록시 화합물로부터 물을 제거할 수도 있으므로 "탈수효소(dehydratase)"라고 할 수 도 있다. 구체적으로, 상기 지방산 이중결합 수화효소는 스테노트로포모나스 말토필리아(Stenotrophomonas maltophilia), 스테노트로포모나스 니트리티레두센스(Stenotrophomonas nitritireducens), 리시니바실러스 후시포르미스(Lysinibacillus fusiformis), 마크로코코스 카제올리티쿠스(Macrococcus caseolyticus), 프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes) 등의 균주로부터 유래된 것을 사용할 수 있고, 보다 구체적으로 상기 지방산 이중결합 수화효소는 스테노트로포모나스 말토필리아(Stenotrophomonas maltophilia)의 균주로부터 유래된 것을 사용할 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다. 본 발명에 있어서, 상기 지방산 이중결합 수화효소는 스테노트로포모나스 말토필리아(Stenotrophomonas maltophilia) 유래된 올레산 수화효소일 수 있다.

상기 지방산 이중결합 수화효소는 아미노산 서열의 N-말단 또는 C-말단에 다양한 아미노산 서열이 부가된 모든 펩타이드를 포함할 수 있다. 뿐만 아니라, 표적화 서열, 태그(tag), 표지된 잔기, 반감기 또는 펩타이드의 안정성을 증가시키기 위한 특정 목적으로 고안된 아미노산 서열을 추가로 포함할 수 있다.

또한, 상기 지방산 이중결합 수화효소는 구체적으로 올레산 수화효소, 리놀레산 수화효소 등 일 수 있고, 보다 구체적으로 올레산 수화효소 일 수 있다. 가장 구체적으로, 스테노트로포모나스 말토필리아(Stenotrophomonas maltophilia) 유래된 올레산 수화효소일 수 있다.

본 발명의 목적상 상기 지방산 이중결합 수화효소는 형질전환체에서 발현되어 페리플라즘으로 분비되는데, 이러한 지방산 이중결합 수화효소를 페리플라즘으로 분비시키는 방법은 상기 지방산 이중결합 수화효소가 페리플라즘에서 불포화 지방산을 하이드록시 지방산으로 변환시킬 수 있는 효소활성을 나타내는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서 신호서열을 사용하는 방법이 될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에서는 신호서열의 일종인 PelB 신호서열이 올레산 수화효소와 결합된 형태로 세포내에서 발현되어 올레산 수화효소를 페리플라즘으로 분비시키는 방법을 사용하였다.

상기 PelB 신호서열은 PelB를 페리플라즘으로 분비시키는 서열로서, 일반적인 분비 경로를 이용하는 분비서열(A.P. Pugsley, 1993, Microbiology review, 57, 50-108; M. Sandkvist 등, 1996, Current opinion in biotechnology, 7, 505-511; P.N. Danese 등, 1998, Annual review of genetics, 32, 59-94) 중 하나이다. 본 발명에 있어서, 상기 PelB 신호서열은 지방산 이중결합 수화효소와 융합된 형태로 세포질에서 발현되고 세포 내막을 통과하면서 잘려지게 되어, 페리플라즘에서는 PelB 신호서열이 제거된 형태도로 지방산 이중결합 수화효소가 존재하게 된다.

본 발명의 일 실시예에서 PelB 신호서열-올레산 수화효소(PelB SS-OhyA)와 기존의 올레산 수화효소를 이용하여 0.5 내지 2.0 mM의 올레산 농도에서 올레산 수화효소의 생성물 생성 속도를 비교한 결과, 유사함을 확인하였고 이를 통해서 세포질에 존재하는 올레산 수화효소와 페리플라즘으로 분비되는 올레산 수화효소가 유사한 활성을 가짐을 알 수 있었다.

본 발명의 다른 일 실시예에서 PelB 신호서열-올레산 수화효소(PelB SS-OhyA)와 기존의 올레산 수화효소에 대한 FAD 어세이를 수행하여, FAD의 신호가 유사함을 확인하였고, 이를 통해서 세포질에 존재하는 올레산 수화효소와 페리플라즘으로 분비되는 올레산 수화효소가 유사한 구조와 활성을 가짐을 알 수 있었다.

본 발명의 또 다른 일 실시예에서는 PelB 신호서열-올레산 수화효소(PelB SS-OhyA)와 기존의 올레산 수화효소의 발현 수준을 SDS-PAGE로 비교하여, 상기 발현수준이 유사함을 확인하였고 이를 통해서 세포질에 존재하는 올레산 수화효소와 페리플라즘으로 분비되는 올레산 수화효소가 유사한 활성을 가짐을 알 수 있었다.

그러므로 상기 일 실시예를 종합할 때 올레산 수화효소를 페리플라즘으로 분비할 수 있는 대장균의 수화반응 속도가 증가하는 것은 올레산 수화효소의 활성 차이보다 올레산 수화효소의 기질 수송 속도의 증가로 설명될 수 있다.

본 발명에서 사용된 용어 "형질전환체"는 숙주세포에 본 발명의 지방산 이중결합 수화효소를 코딩하는 유전자와 신호서열을 코딩하는 유전자를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 도입하여 제조된 것이 될 수 있고, 본 발명의 페리플라즘으로 분비되는 지방산 이중결합 수화효소를 제조하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 상기 지방산 이중결합 수화효소를 코딩하는 유전자 및 신호서열을 코딩하는 유전자는 서열번호 5 및 6으로 기재된 것 일 수 있다.

본 발명에서 제공하는 상기 숙주세포는 상기 발현벡터를 도입하여 상기 지방산 이중결합 수화효소인 올레산 수화효소를 제조할 수 있는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 대장균, 코리네박테륨, 스트렙토마이세스, 살모넬라 티피뮤리움 등의 박테리아 세포; 사카로마이세스 세레비지애, 스키조사카로마이세스 폼베 등의 효모세포; 피치아 파스토리스 등의 균류 세포; 드로소필라, 스포도프테라 Sf9 세포 등의곤충 세포; CHO, COS, NSO, 293, 보우 멜라노마 세포 등의 동물 세포; 또는 식물세포가 될 수 있다. 구체적으로, 대장균일 수 있고, 보다 구체적으로, 대장균 BL21(DE3)일 수 있다.

또한, 상기 형질전환은 다양한 방법에 의하여 수행될 수 있는데, 다양한 세포활성을 높은 수준으로 향상시킬 수 있는 효과를 나타내는 본 발명의 페리플라즘으로 분비되는 올레산 수화효소를 제조할 수 있는 한, 특별히 이에 제한되지 않으나, CaCl2 침전법, CaCl2 침전법에 DMSO(dimethyl sulfoxide)라는 환원물질을 사용함으로써 효율을 높인 Hanahan 방법, 전기천공법(electroporation), 인산칼슘 침전법, 원형질 융합법, 실리콘 카바이드 섬유를 이용한 교반법, 아그로박테리아 매개된 형질전환법, PEG를 이용한 형질전환법, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민 및 건조/억제 매개된 형질전환 방법 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 발현벡터는 적절한 숙주세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있도록 유전자 삽입물을 포함하고, 상기 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 의미한다. 상기 발현벡터는 개시코돈, 종결코돈, 프로모터, 오퍼레이터 등의 발현조절 요소들을 포함하는데, 상기 개시코돈 및 종결코돈은 일반적으로 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 일부로 간주되며, 유전자 제작물이 투여되었을 때 개체에서 반드시 작용을 나타내야 하며 코딩 서열과 인프레임(in frame)에 있어야 한다. 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다. 본 발명에서는 대장균으로부터 올레산 수화효소의 배출을 촉진하기 위해, PelB 신호서열을 사용하였다.

상기 발현벡터는 PelB 신호서열과 올레산 수화효소 유전자를 결합시킨 폴리뉴클레오티드를 발현시켜서 본 발명에서 제공하는 올레산 수화효소를 제조할 수 있는 한 특별히 제한되지 않는데, 포유류 세포(예를 들어, 사람, 원숭이, 토끼, 래트, 햄스터, 마우스 세포 등), 식물 세포, 효모 세포, 곤충 세포 또는 박테리아 세포(예를 들어, 대장균 등)를 포함하는 진핵 또는 원핵세포에서 상기 폴리뉴클레오티드를 복제 및/또는 발현할 수 있는 벡터가 될 수 있고, 구체적으로 숙주세포에서 상기 폴리뉴클레오티드가 발현될 수 있도록 적절한 프로모터에 작동가능하도록 연결되며, 적어도 하나의 선별마커를 포함하는 벡터가 될 수 있으며, 보다 구체적으로 상업적으로 개발된 플라스미드(pUC18, pBAD, pIDTSAMRT-AMP 등), 대장균 유래 플라스미드(pYG601BR322, pBR325, pUC118 및 pUC119), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)-유래 플라스미드(pUB110 및 pTP5), 효모-유래 플라스미드(YEp13, YEp24 및 YCp50), λ-파아지(Charon4A, Charon21A, EMBL3, EMBL4, λgt10, λgt11 및 λZAP), 레트로바이러스(retrovirus), 아데노바이러스(adenovirus), 백시니아 바이러스(vaccinia virus), 배큘로바이러스(baculovirus) 등이 될 수 있다. 상기 발현벡터는 숙주 세포에 따라서 단백질의 발현량과 수식 등이 다르게 나타나므로, 목적에 가장 적합한 숙주세포를 선택하여 사용함이 바람직하다.

본 발명에서 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드를 구성하는 염기서열은 지방산 이중결합 수화효소를 대량을 제조하는 효소활성을 나타낼 수 있는 단백질을 코딩할 수 있는 한, 상기 염기서열과 상동성을 나타내는 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 역시 본 발명에서 제공하는 폴리뉴클레오티드의 범주에 포함될 수 있는데, 구체적으로 80 % 이상의 상동성을 나타내는 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 될 수 있고, 보다 구체적으로 90 % 이상의 상동성을 나타내는 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 될 수 있으며, 가장 구체적으로, 95 % 이상의 상동성을 나타내는 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 될 수 있다.

한편, 상기 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 염기가 치환, 결실, 삽입 또는 이들의 조합에 의해 변이된 것 일 수 있다. 뉴클레오티드 서열을 화학적으로 합성하여 제조하는 경우, 당업계에 널리 공지된 합성법, 예를 들어 문헌(Engels and Uhlmann Angew Chem IntEd Engl., 37:73-127, 1988)에 기술된 방법을 이용할 수 있으며, 트리에스테르, 포스파이트, 포스포르아미다이트 및 H-포스페이트 방법, PCR 및 기타 오토프라이머 방법, 고체 지지체상의 올리고뉴클레오타이드 합성법 등을 들 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는 상기 폴리뉴클레오티드를 제작하기 위해 서열번호 3 및 4의 프라이머를 제작하고 스테노트로포모나스 말토필리아(Stenotrophomonas maltophilia)에서 상기 프라이머로 PCR을 수행하여 올레산 수화효소 유전자를 분리하였다.

본 발명에서 사용된 용어 “불포화지방산”은 분자 내에 이중결합을 갖고 있는 지방산으로, 포화지방산에 비해 화학적으로 불안정하고, 산화되기 쉬우며, 융점이 낮다. 체내에서 합성되지 않은 필수지방산도 포함되어 있고, 영양적으로 중요한 지방산이다. 이중결합을 1개 갖는 것을 모노엔산(monoenoic acid)이라고 하며 천연에는 디엔산, 트리엔산, 테트라엔산, 펜타엔산, 헥사엔산이 존재한다. 디엔산 이상을 총칭하여 폴리엔산이라고 하며, 어유에 많은 테트라엔산 이상의 산을 과불포화지방산이라고 한다. 이중결합의 위치는 카르복시기로부터 몇 번째의 탄소에 붙어 있느냐로 나타내지만, 천연에 존재하는 지방산은 일정한 배치를 나타낸다. 식용유지의 대표적 지방산인 올레산, 리놀레산은 각각 9 및 9, 12의 위치에 이중결합을 갖는다. 또한, 상기 불포화지방산은 구체적으로 올레산, 리놀레산 일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 있어서, 형질전환체에 상기 불포화 지방산을 처리하는 방법은 상기 형질전환체를 올레산 또는 리놀레산을 포함하는 배지에서 배양하여 배양물을 수득하는 단계를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 형질전환체에서 제조되는 지방산 이중결합 수화효소는 형질전환체의 내부에서 제조되고, 제조된 효소가 페리플라즘으로 이동하여 불포화 지방산을 수화시키는 효소활성을 나타낼 수 있다. 예를 들어, 상기 형질전환체를 불포화지방산을 포함하는 배지에서 배양하면서, 상기 형질전환체로부터 제조된 올레산 수화효소가 페리플라즘으로 분비되어 불포화 지방산을 절단 또는 분해시켜서 히드록시 지방산을 제조하는 방식으로 수행할 수도 있고; 상기 형질전환체를 불포화 지방산을 포함하는 반응완충액에 넣고, 페리플라즘으로 분비된 올레산 수화효소들을 이용하여 불포화 지방산을 절단 또는 분해시켜서 히드록시 지방산을 제조하는 방식으로 수행될 수도 있다.

상기 배양은 미생물을 적당히 인공적으로 조절한 환경조건에서 생육시키는 방법을 의미한다. 본 발명에 있어서, 상기 형질전환체를 배양하는 방법은 당업계에 널리 알려져 있는 방법을 이용하여 수행할 수 있다. 구체적으로 상기 배양은 본 발명의 페리플라즘으로 분비되는 올레산 수화효소를 발현시켜서 제조할 수 있는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 배치 공정 또는 주입 배치 또는 반복 주입 배치 공정(fed batch or repeated fed batch process)에서 연속식으로 배양할 수 있다.

배양에 사용되는 배지는 적당한 탄소원, 질소원, 아미노산, 비타민 등을 함유한 통상의 배지 내에서 호기성 조건 하에서 온도, pH 등을 조절하면서 적절한 방식으로 특정 균주의 요건을 충족시킬 수 있다. 사용될 수 있는 탄소원으로는 글루코즈 및 자일로즈의 혼합당을 주 탄소원으로 사용하며 이외에 수크로즈, 락토즈, 프락토즈, 말토즈, 전분, 셀룰로즈와 같은 당 및 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유 등과 같은 오일 및 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤, 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산이 포함된다. 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 질소원으로는 암모니아, 황산암모늄, 염화암모늄, 초산암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄, 및 질산암모늄과 같은 무기질소원; 글루탐산, 메티오닌, 글루타민과 같은 아미노산 및 펩톤, NZ-아민, 육류 추출물, 효모 추출물, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 카세인 가수분해물, 어류 또는 그의 분해생성물, 탈지 대두 케이크 또는 그의 분해 생성물 등 유기질소원이 사용될 수 있다. 이들 질소원은 단독 또는 조합되어 사용될 수 있다. 상기 배지에는 인원으로서 인산 제1칼륨, 인산 제2칼륨 및 대응되는 소듐-함유 염이 포함될 수 있다. 사용될 수 있는 인원으로는 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨-함유 염이 포함된다. 또한, 무기화합물로는 염화나트륨, 염화칼슘, 염화철, 황산마그네슘, 황산철, 황산망간 및 탄산칼슘 등이 사용될 수 있다. 마지막으로, 상기 물질에 더하여 아미노산 및 비타민과 같은 필수 성장 물질이 사용될 수 있다.

또한, 배양 배지에 적절한 전구체들이 사용될 수 있다. 상기된 원료들은 배양과정에서 배양물에 적절한 방식에 의해 회분식, 유가식 또는 연속식으로 첨가될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다. 수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아와 같은 기초 화합물 또는 인산 또는 황산과 같은 산 화합물을 적절한 방식으로 사용하여 배양물의 pH를 조절할 수 있다.

또한, 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 호기 상태를 유지하기 위해 배양물 내로 산소 또는 산소-함유 기체(예, 공기)를 주입한다. 배양물의 온도는 보통 27 ℃ 내지 37 ℃, 구체적으로 30 ℃ 내지 35 ℃이다.

본 발명에서 사용된 용어 “히드록시지방산”은 분자 내에 수산기를 갖는 지방족 모노카르복시산을 의미하는 것으로, 상기 히드록시지방산은 10-히드록시스테아르산(10-hydroxystearic acid, 10-HSA) 또는 10-히드록시-시스12-옥타데세노익산(10-hydroxy-cis-12-octadecenoic acid, 10-HOA)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 10-히드록시스테아르 산은 윤활제로 사용되고, 가소체 그리고 레진을 합성하는데 사용되는 세바스산을 제조하는 중요한 물질이다. 10-히드록시스테아르 산과 같은 히드록시 지방산은 이스트 (yeast)에 의하여 감마-데카락톤(γ-decalactone)으로 전환된다. 감마-데카락톤은 복숭아나 살구향을 내는 특징이 있으며, 식품공정에 필수적인 물질이고 식품산업에서 사용이 증가되고 있다.

본 발명의 일 실시예에서는 페리플라즘으로 분비되는 올레산 수화효소를 올레산과 반응시켜 10-히드록시스테아르산을 제조하였다. 10-히드록시스테아르산 제조에 있어서, 페리플라즘으로 분비되는 올레산 수화효소가 반응 기질에 대한 기질 수송 효율을 증가시키는지 확인하기 위해 올레산 수화효소의 위치에 따른 수화 활성을 확인하였다. 그 결과, 페리플라즘으로 분비되는 올레산 수화효소에 의해 생성되는 10-히드록시스테아르산이 세포질에 존재하는 올레산 수화효소에 의해 생성되는 10-히드록시스테아르산보다 현저히 증가함을 확인하였고(도 1), 이를 통해 올레산 수화효소의 작용위치가 전세포 촉매 기반 수화효소의 생산성 및 속도에 중요한 것임을 알 수 있었다.

본 발명의 다른 일 실시예에서는 페리플라즘으로 분비되는 올레산 수화효소를 리놀레산과 반응시켜 10-히드록시-시스12-옥타데세노익산을 제조하였다. 히드록시지방산 제조에 있어서, 화학구조에 의해 영향을 받는지 알아보기 위하여, 상기 리놀레산과 올레산 수화효소와 반응시켰다. 그 결과, 리놀레산의 생물전환 속도는 올레산의 생물전환 속도보다 낮았고 그 이유로 리놀레산의 낮은 활성을 가지고 있기 때문이었다. 그러나 페리플라즘으로 분비되는 올레산 수화효소를 이용하였을 때의 리놀레산 수화 속도는 세포질에 존재하는 올레산 수화효소를 이용하였을 때의 리놀레산 수화 속도보다 증가함을 확인하였다 (도 3).

본 발명의 하나의 양태는 지방산 이중결합 수화효소를 페리플라즘으로 분비할 수 있는 형질전환체를 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 형질전환체는 PelB 신호서열을 코딩하는 유전자와 스테노트로포모나스 말토필리아(Stenotrophomonas maltophilia) 유래의 올레산 수화효소 유전자를 포함하는 대장균일 수 있다.

본 발명의 다른 하나의 양태는 형질전환체를 포함하는 히드록시 지방산 제조용 조성물을 제공한다.

본 발명에서 제공하는 페리플라즘(periplasm)으로 분비되는 지방산 이중결합 수화효소는 종래의 세포질에 존재하는 지방산 이중결합 수화효소보다 동일한 시간에 많은 양의 히드록시지방산을 제조할 수 있으므로, 히드록시 지방산을 사용하고 있는 화학물질, 연료, 플라스틱, 락톤, 향료, 계면 활성제 및 가소제 등을 제조하는데 필요한 비용 및 단가를 절감할 수 있을 것이다.

도 1은 지방산 이중결합 수화효소가 세포질에 존재하는 재조합 대장균(E. coli pET28a-OhyA) 또는 지방산 이중결합 수화효소를 페리플라즘으로 분비할 수 있는 재조합 대장균(E. coli pET26b-OhyA)에 의한 올레산 수화 반응을 비교한 도이다.
도 2의 A 및 B는 지방산 이중결합 수화효소가 세포질에 존재하는 재조합 대장균(E. coli pET28a-OhyA) 또는 지방산 이중결합 수화효소를 페리플라즘으로 분비할 수 있는 재조합 대장균(E. coli pET26b-OhyA)을 이용하여 기질 농도 변화에 따른 올레산 수화 반응을 비교한 도이다.
도 3은 지방산 이중결합 수화효소가 세포질에 존재하는 재조합 대장균(E. coli pET28a-OhyA) 또는 지방산 이중결합 수화효소를 페리플라즘으로 분비할 수 있는 재조합 대장균(E. coli pET26b-OhyA)을 이용하여 리놀레산에 대해 수화 반응을 비교한 도이다.
도 4는 PelB 신호서열-올레산 수화효소(PelB SS-OhyA)와 기존의 올레산 수화효소의 활성을 비교한 도이다.
도 5는 PelB 신호서열-올레산 수화효소(PelB SS-OhyA) 및 기존의 올레산 수화효소의 FAD 함량에 대한 분광광도법적 분석을 나타낸 도이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

실시예 1. 형질전환체를 이용한 올레산으로부터 10- 히드록시스테아르산의 제조

실시예 1-1: 올레산 수화효소 유전자의 분리

본 발명의 세포질에 존재하는 올레산 수화효소 유전자 및 페리플라즘으로 분비되는 올레산 수화효소 유전자를 포함하는 pET28a-OhyA(세포질에 존재하는 올레산 수화효소) 및 pET26b-OhyA(페리플라즘으로 분비되는 올레산 수화효소) 발현벡터를 제작하기 위해, 스테노트로포모나스 말토필라(S. maltophilia)의 지노믹(genomic) DNA를 기초로 중합효소 연쇄반응(PCR)을 수행하여 올레산 수화효소 유전자를 증폭시켰다.

pET28a-OhyA의 경우, 5'-CTAGCTACGATGTACTACAGCAGTGGCAATT-3'(서열번호 1, NheⅠ) 및 3'-CCGCTCGAGGTCCTCCTGCACCAGCTTGAAC-5'(서열번호 2, XhoⅠ)의 프라이머를, pET26b-OhyA의 경우, 5'-CATGCCATGGCCGATGATGATGATGATATGTACTACAGCAGTGGCAATT-3'(서열번호 3, NcoⅠ), 3'-CCGCTCGAGGTCCTCCTGCACCAGCTTGAAC-5'(서열번호 4, XhoⅠ)의 프라이머를 제작하여 올레산 수화효소 유전자를 증폭하였다.

실시예 1-2: 올레산 수화효소를 포함하는 재조합 발현벡터 및 형질전환체의 제조

올레산 수화효소가 세포질에 존재하는 형질전환체 또는 지방산 이중결합 수화효소를 페리플라즘으로 분비할 수 있는 형질전환체를 제작하기 위해, 증폭시킨 올레산 수화효소 유전자를 플라스미드 벡터 pET-28a(+) 및 pET-26b(+)에 삽입하여, 각각 대장균(E. coli)의 세포질에 존재하는 올레산 수화효소 유전자 및 페리플라즘으로 분비되는 올레산 수화효소 유전자를 포함하는 pET26b-OhyA 및 pET28a-OhyA 벡터를 제작하였다. 플라스미드 벡터 pET-26b(+) 는 페리플라즘으로 분비하게 하는 N-말단의 PelB 신호 서열 및 정제를 위한 his 태그를 포함하고 있다.

상기 서열번호 1 내지 4에 밑줄로 그어진 부분에 해당하는 제한효소를 이용하여 DNA의 절편을 얻었고, 증폭된 DNA 절편은 PCR 정제 키트(QIAGEN, Hilden, Germany)를 이용하여 정제하였다. 정제된 PCR 생성물은 T4 DNA 리가아제(Ligase (Takara, Tokyo, Japan)를 사용하여 플라스미드 벡터 pET-28a(+) 및 pET-26b(+)에 삽입하였다.

상기의 방법으로 제작된 발현 벡터 pET28a-OhyA 및 pET26b-OhyA는 대장균 BL21(DE3)을 형질전환시키기 위해 사용하였고, 형질전환된 세포들은 20 μg/mL의 카나마이신(kanamycin)을 포함하는 LB 배지에서 자라게 하였다.

실시예 1-3. 형질전환체를 이용한 생물전환

실시예 1-3-1. 올레산 수화효소가 분비하는 위치에 따른 수화반응

상기 제작된 올레산 수화효소가 세포질에 존재하는 형질전환체 또는 지방산 이중결합 수화효소를 페리플라즘으로 분비할 수 있는 형질전환체를 이용하여 페리플라즘으로 분비되는 올레산 수화효소가 세포내 효소로 향하는 반응 기질의 기질 수송 효율을 증가시키는지 확인하기 위해, 재조합 대장균 기반 전세포 촉매의 수화활성에 있어서, 올레산 수화효소가 분비되는 위치에 따른 효과를 확인하였다.

형질전환체를 이용한 지방산 수화반응을 위해서, 올레산 수화효소 유전자를 발현하는 재조합 대장균을 25 ℃에서 리젠벅 배지에서 배양하였다. 생물전환은 1 - 15 g/L 올레산 또는 리놀레산, 및 0.5 g/L 트윈 80을 배양액에 첨가한 다음, IPTG로 유전자 발현을 유발한 후 8 - 10 시간에 시작하였다. 배양 및 생물전환은 진탕배양기(shaking incubator)안에 플라스크에서 200 rpm 및 35 ℃의 조건으로 수행하였다. 전체 세포 활성의 단위인 유닛(U)은 30 ℃에서 1.0g 의 건조 세포를 사용하여 1분 동안 생성되는 히드록시 지방산의 μmol로서 정의하였다.

그 결과, 대장균 세포에서 PelB 신호 서열-OhyA 수화효소(PelB SS-OhyA)가 발현하였을 때 성장은 다소 억제되었다. 올레산 수화효소를 페리플라즘으로 분비할 수 있는 재조합 대장균(E. coli pET26b-OhyA) 배지의 OD₆₀₀ 값은 정지 성장 단계동안 6.0 이었고, 이는 올레산 수화효소가 세포질에 존재하는 재조합 대장균(E. coli pET28a-OhyA)보다 약 25 % 낮았다.

비록 올레산 수화효소를 페리플라즘으로 분비할 수 있는 재조합 대장균(E. coli pET26b-OhyA)은 올레산 수화효소가 세포질에 존재하는 재조합 대장균(E. coli pET28a-OhyA)보다 감소된 성장을 나타내었지만, 10-히드록시스테아르산제조의 경우, 올레산 수화효소가 세포질에 존재하는 재조합 대장균(E. coli pET28a-OhyA)보다 상당한 증가율을 나타내었다(도 1). 페리플라즘으로 분비할 수 있는 재조합 대장균(E. coli pET26b-OhyA)의 초기 수화 속도는 400 μmol/g dry cells/min (400 U/g dry cells)이상이었고, 이는 올레산 수화효소가 세포질에 존재하는 재조합 대장균(E. coli pET28a-OhyA)의 초기 수화 속도의 10배 이상이었다.

이러한 결과는 올레산 수화효소의 분비 위치(targeting)가 재조합 대장균 기반 전세포 촉매(recombinant E. coli-based biocatalysts)의 수화 속도에 매우 중요한 것임을 알 수 있었다.

실시예 1-3-2. 올레산 농도에 따른 수화반응

실시예 1-3-1에서 올레산 수화효소가 분비되는 위치에 따른 효과를 확인하였으므로, 다음으로 기질의 농도가 세포 내 효소로의 기질 수송 속도에 미치는 영향을 알아보기 위해, 올레산 농도에 따른 재조합 대장균의 수화반응를 확인하였다.

형질전환체를 이용한 지방산 수화반응은 실시예 1-3-1에서 기술한 것과 동일한 방법으로 수행하였다.

그 결과, 올레산 수화효소가 세포질에 존재하는 재조합 대장균(E. coli pET28a-OhyA)은 도 1에서 보여준 실험으로부터 예상한 바와 같이, 시험한 모든 올레산 농도에서, 올레산 수화효소를 페리플라즘으로 분비할 수 있는 재조합 대장균(E. coli pET26b-OhyA)의 반응속도보다 훨씬 낮았다(도 2의 A 및 B).

실시예 1-3-3. 화학구조에 따른 수화반응

세포 내 효소로의 기질 수송 속도가 화학구조에 의해 영향을 받는지 알아보기 위하여, 다른 불포화 지방산인 리놀레산(즉, (9Z,12Z)-9,12-octadecadienoic acid)에 대한 수화반응을 확인하였다.

리놀레산의 화학구조는 탄소 골격의 이중결합 수를 제외하고 올레산과 동일하다. 리놀레산의 C9 이중 결합은 도 1에서 보여준 올레산 수화반응과 동일한 조건 아래, 지방산 이중결합 수화효소가 세포질에 존재하는 재조합 대장균(E. coli) 또는 지방산 이중결합 수화효소를 페리플라즘으로 분비할 수 있는 재조합 대장균을 이용하여 수행하였다.

그 결과, 생성물 형성 속도는 올레산의 생물전환 속도보다 낮았는데, 그 이유로 올레산 수화효소가 올레산 보다 리놀레산에 낮은 활성을 가지고 있기 때문이다. 그럼에도 불구하고, 10-히드록시-시스12-옥타데세노익산(10-hydroxy-cis-12-octadecenoic acid, 10-HOA)을 제조하는 올레산 수화효소를 페리플라즘으로 분비할 수 있는 재조합 대장균(E. coli pET26b-OhyA)의 리놀레산 수화 속도는 61 U/g dry cells까지 증가하였고, 이는 올레산 수화효소가 세포질에 존재하는 재조합 대장균(E. coli pET28a-OhyA)보다 약 40배 이상 높았다(도 3).

따라서, 상기 결과를 통해 페리플라즘으로 분비되는(targeted) 올레산 수화효소는 재조합 대장균 기반 전세포 촉매의 리놀레산 수화 속도에서 중요한 역할을 하는 것을 알 수 있었다.

실시예 2. 올레산 수화효소의 활성 분석

실시예 2-1: in vitro 실험을 통한 올레산 수화효소의 활성 분석

올레산 수화효소가 세포질에 존재하는 재조합 대장균(E. coli pET28a-OhyA)과 비교하여 올레산 수화효소를 페리플라즘으로 분비할 수 있는 재조합 대장균(E. coli pET26b-OhyA)의 보다 빠른 생물전환 속도가 PelB 신호서열-올레산 수화효소(PelB SS-OhyA)의 보다 높은 활성 때문인지 알아보기 위하여, 정제 후 in vitro 실험으로 PelB 신호서열-올레산 수화효소(PelB SS-OhyA)와 기존의 올레산 수화효소의 활성을 비교하였다.

이를 위해, 올레산은 균질기(IKA, Kuala Lumpur, Malaysia)를 사용하여 10000 rpm으로 10초 동안 4% (v/v) 에탄올에서 균질화하였다. 1.0 - 4.0 mM의 올레산을 포함하는 기질 용액은 1.0 mg/mL 효소 및 0.4 mM FAD를 1:1(v/v)비율로 포함하는 효소 용액과 함께 섞었다. 효소 반응은 10분 동안 25 ℃에서 수행하였다. 반응은 6 M HCl을 첨가하여 용액의 pH를 2.0으로 조절하여 종료시켰다. 효소 활성의 단위인 유닛(U)은 25 ℃에서 1 mg의 효소를 사용하여 1분 동안 생성되는 10-히드록시스테아르산의 μmol로서 정의하였다.

도 4에서 볼 수 있듯이, PelB 신호서열-올레산 수화효소(PelB SS-OhyA)의 생성물 형성 속도는 0.5 - 2.0 mM의 올레산 농도에서 올레산 수화효소의 생성물 형성 속도와 유사하였다.

따라서 상기 결과를 통해 세포질에 존재하는 올레산 수화효소 및 페리플라즘으로 분비되는(targeted) 올레산 수화효소는 올레산에 대해 유사한 활성을 가짐을 알 수 있었다.

실시예 2-2: FAD 어세이를 통한 올레산 수화효소의 활성 분석

또한, 올레산 수화효소가 플라빈 효소로 알려져 있기 때문에 올레산 수화효소에 대한 FAD 어세이를 수행하여 PelB 신호서열-올레산 수화효소(PelB SS-OhyA)와 기존의 올레산 수화효소의 활성을 비교하였다.

FAD 어세이는 1 mg/mL 단백질 용액의 1 mL를 100 ℃에서 15분 동안 열을 가하여 수행하였다. 열에 의해 변형된 단백질은 13000 x g로 10분 동안 원심분리하여 제거하였다. UV 흡수 스펙트럼은 300 - 600 nm에서 Beckman Coulter DU 800 UV-visible spectrophotometer (Brea, CA, USA)을 이용하여 상등액에서 측정하였다.

PelB 신호서열-올레산 수화효소(PelB SS-OhyA) 및 기존의 올레산 수화효소는 375 nm 및 445 nm에서 특징적인 FAD 피크를 보여주었다(도 5). 올레산 수화효소의 FAD 함량을 비교하여, 올레산 수화효소의 FAD 신호가 유사함을 알 수 있었다.

이러한 결과는 세포질에 존재하는 올레산 수화효소 및 페리플라즘으로 분비되는(targeted) 올레산 수화효소의 활성이 유사함을 뒷받침한다. 또한, PelB 신호서열-올레산 수화효소(PelB SS-OhyA)의 올레산 수화효소 폴리펩타이드가 FAD와 결합하여 세포질 밖으로 수송되는 것을 뒷받침한다.

실시예 2-3: SDS-PAGE를 통한 올레산 수화효소의 활성 분석

마지막으로, 대장균 세포에서 PelB 신호서열-올레산 수화효소(PelB SS-OhyA) 및 기존의 올레산 수화효소(native OhyA)의 발현 수준을 SDS-PAGE를 이용하여 비교하였다.

그 결과, 상기 올레산 수화효소의 발현 수준은 유사하였다. 전체적으로 모든 결과들은 올레산에 대해서 올레산 수화효소를 페리플라즘으로 분비할 수 있는 재조합 대장균(E. coli pET26b-OhyA)의 보다 빠른 생물전환 속도는 특정 효소의 활성차이보다 올레산 수화효소의 기질 수송 속도의 증가로 설명될 수 있다.

<110> Ewha University - Industry Collaboration Foundation <120> Fatty acid double bond hydratases acting in periplasm and process for producing hydroxy fatty acids using thereof <130> KPA150771-KR <160> 6 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pET28a-OhyA forward primer <400> 1 ctagctacga tgtactacag cagtggcaat t 31 <210> 2 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pET28a-OhyA backward primer <400> 2 ccgctcgagg tcctcctgca ccagcttgaa c 31 <210> 3 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pET26b-OhyA forward primer <400> 3 catgccatgg ccgatgatga tgatgatatg tactacagca gtggcaatt 49 <210> 4 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pET26b-OhyA backward primer <400> 4 ccgctcgagg tcctcctgca ccagcttgaa c 31 <210> 5 <211> 1770 <212> DNA <213> hydratase (ohyA) sequence <400> 5 atgtactaca gcagtggcaa ttacgaagcc ttcgcgcgcc cgcgcaagcc cgccggtgtg 60 gatggcaagc gtgcatggtt cgtcggttcg ggcctggcct cgttggccgg tgccgcgttc 120 ctggtgcgcg acggccacat ggccggtgag tgcatcacca tccttgagca gcagcagatt 180 ccgggcggcg cgctggacgg cctgaaagtg ccggaaaagg gtttcgtgat ccgtggtggc 240 cgcgagatgg aagatcattt cgagtgcctg tgggacctgt tccgctcgat accgtcgctg 300 gagatcgaag atgccagcgt gctggacgag ttctactggt tgaacaagga cgacccgaac 360 tattcgctgc agcgcgccac catcaatcgc ggcgaggatg cacacaccga tggcctgttc 420 acgctgaccg agcaggcaca gagggacatc gtcgcgctgt tcctggccac ccgtcaggag 480 atggagaaca agcgcatcaa cgaagtactg ggccgtgatt tcctggacag caacttctgg 540 ctgtactggc gaaccatgtt cgcgttcgaa gagtggcatt cggcgctgga gatgaagctg 600 tacctgcatc gcttcatcca ccatatcggc ggcctgccgg atttctcggc gctgaagttc 660 acgaagtaca accagtacga atcgctggtg ctgccgctgg tgaagtggtt gcaggaccag 720 ggcgtggtgt tccagtacgg taccgaggtg accgacgtcg actttgatct gcagccggac 780 cgcaagcagg ccacgcgcat ccattggatg catgacggtg tagccggtgg cgtggaactc 840 ggcgcggatg atctgctgtt catgaccatc ggttcgctga ccgagaactc ggataatggc 900 gaccaccaca ctgcggcacg cctgaacgaa ggcccggcgc ctgcctggga cctgtggcgc 960 cgcattgccg cgaaggatga cgcgttcggg cgtccggatg tgttcggcgc gcacattcca 1020 gaaaccaagt gggaatcggc aacggtgacc acgctggatg cgcgcattcc ggcctacatc 1080 cagaagatcg ccaagcgcga tcccttcagc ggcaaagtgg tgaccggcgg catcgtcagc 1140 gtgcgcgact cgcgctggct gatgagctgg acggtgaatc gccagccaca tttcaagaac 1200 cagcccaagg accagatcgt ggtctgggtg tattcgttgt tcgtggatac gcccggcgac 1260 tacgtgaaga agccgatgca ggactgcacc ggcgaggaga tcacgcgcga atggctgtat 1320 cacctgggcg tgccggtgga agagatcgat gagctggccg cgaccggcgc gaagacagtg 1380 ccggtgatga tgccgtacat cacggcgttc ttcatgccac gccaggcagg tgaccgcccg 1440 gacgtggtgc cggaaggtgc ggtgaacttc gctttcatcg gccagttcgc cgaatcgaag 1500 cagcgcgact gcatcttcac caccgagtac tcggtgcgca cgccgatgga ggcggtgtac 1560 accttgctgg ggatcgagcg tggcgtgccg gaggtgttca attccacgta tgacgtgcgc 1620 tcgctgctgg ccgcgaccgg gcgcctgcgt gatggcaagg aactggacat tcccgggcca 1680 gcgttcctgc gcaacctgct gatgaacaag ctggacaaga cccagatcgg tggtctgctg 1740 cgcgagttca agctggtgca ggaggactga 1770 <210> 6 <211> 66 <212> DNA <213> PelB sequence <400> 6 atgaaatacc tgctgccgac cgctgctgct ggtctgctgc tcctcgctgc ccagccggcg 60 atggcc 66

Claims

(a) 지방산 이중결합 수화효소를 페리플라즘으로 분비할 수 있는 형질전환체를 수득하는 단계; 및
(b) 상기 형질전환체에 불포화 지방산을 처리하여 히드록시지방산(hydroxyfatty acid)을 제조하는 단계를 포함하는 히드록시 지방산의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 (b) 단계는 페리플라즘에서 수행되는 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 지방산 이중결합 수화효소는 신호서열이 결합된 형태로 발현되어 페리플라즘으로 분비된 후, 신호서열이 제거되는 것인 방법.
제3항에 있어서, 상기 신호서열은 PelB 신호서열인 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 지방산 이중결합 수화효소는 올레산 수화효소(oleate hydratase)인 것인 방법.
제5항에 있어서, 상기 올레산 수화효소는 스테노트로포모나스 말토필리아(Stenotrophomonas maltophilia), 스테노트로포모나스 니트리티레두센스(Stenotrophomonas nitritireducens), 리시나바실러스 후시포르미스(Lysinibacillus fusiformis), 마크로코코스 카제올리티쿠스(Macrococcus caseolyticus), 프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나의 균주로부터 유래된 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 (a) 단계는 숙주세포에 지방산 이중결합 수화효소를 코딩하는 유전자와 신호서열을 코딩하는 유전자를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 도입하여 수행되는 것인 방법.
제7항에 있어서, 상기 지방산 이중결합 수화효소를 코딩하는 유전자는 서열번호 5로 기재된 것인 방법.
제7항에 있어서, 상기 신호서열을 코딩하는 유전자는 서열번호 6으로 기재된 것인 방법.
제7항에 있어서, 상기 숙주세포는 대장균인 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 (b) 단계는 상기 형질전환체를 올레산 또는 리놀레산을 포함하는 배지에서 배양하여 수행되는 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 불포화 지방산은 올레산(oleic acid) 또는 리놀레산(linoleic acid)인 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 히드록시지방산은 10-히드록시스테아르산(10-hydroxystearic acid) 또는 10-히드록시-시스12-옥타데세노익산(10-hydroxy-cis-12-octadecenoic acid, 10-HOA)인 것인 방법.
지방산 이중결합 수화효소를 페리플라즘으로 분비할 수 있는 형질전환체.
제14항에 있어서, 상기 형질전환체는 PelB 신호서열을 코딩하는 유전자와 스테노트로포모나스 말토필리아(Stenotrophomonas maltophilia) 유래의 올레산 수화효소 유전자를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 발현시키는 재조합 대장균인 것인 형질전환체.
제14항 또는 제15항의 형질전환체를 포함하는 히드록시지방산 제조용 조성물.