ES2358086T3 - Promotores aox1 mutantes. - Google Patents
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Abstract
Un promotor de alcohol oxidasa 1 (AOX1) de Pichia pastoris mutante del promotor de AOX1 de Pichia pastoris de tipo salvaje (SEQ ID No. 1) que comprende al menos una mutación en los nucleótidos 694 a 723 (-260 a -231) del Seq ID No. 1 para su expresión elevada en condiciones de des-represión en relación con el promotor de AOX1 de tipo salvaje.
Description
Promotores AOX1 mutantes.
La presente invención se refiere a promotores de
AOX1 de Pichia pastoris mutantes.
S. cerevisiae ha dominado (y todavía
domina) el uso científico y biotecnológico como modelo de organismo
y sistema de producción eucariótico. En el último siglo, ha
aumentado sumamente el atractivo de otra levadura: la levadura de
fisión Schizosaccharomyces pombe. Por su atributo para
reproducirse solamente por medio de fisión S. pombe adquirió
una atención excepcional como organismo modelo y hoy en día es la
especie de levadura más intensamente estudiada en términos de
genética molecular y biología celular, junto con S.
cerevisiae. Entre las más de 700 especies de levadura diferentes
conocidas hasta la fecha, las dos levaduras mencionadas antes pueden
proporcionar solamente un conjunto limitado de atributos
interesantes para aplicaciones tecnológicas y científicas. Desde los
años 70 u 80 se han investigado más y más especies de levadura con
características excepcionales para la biotecnología y la
investigación. Estas levaduras denominadas no convencionales (NCY) o
levaduras no Saccharomyces (en este caso el término
Saccharomyces incluye la levadura Schizosaccharomyces
pombe) se desarrollan por varias razones: poseen importancia
médica como Candida albicans o relevancia tecnológica como
Yarrowia lipolytica y Kluyveromyces lactis que tienen
la capacidad de crecer sobre sustratos concretos (p. ej.
n-alcanos, lactosa). Por ejemplo el patógeno fúngico
humano más común C. albicans se estudia extensamente para
revelar la naturaleza de los factores de virulencia implicados en la
patogénesis, convirtiéndose por lo tanto en el organismo modelo para
las levaduras patogénicas. Otro grupo bien establecido de NCY son
las levaduras metilotróficas Pichia pastoris y Hansenula
polymorpha (Pichia angusta) que son superiores a S.
cerevisiae en términos de producción de proteína recombinante y
estudios de biogénesis de peroxisomas. Estos son solamente los
miembros más prominentes de las levaduras no convencionales que
tienen todavía atractivo tecnológico académico. Hasta la fecha otras
numerosas especies también tienen un interés particular y este grupo
aumentará rápidamente en los próximos años.
Los azúcares, la clase de moléculas más
abundante en la naturaleza, son utilizados por todas las levaduras
conocidas. Aunque hay grandes diferencias en la aceptación del
sustrato entre especie y especie (véase la Tabla 1), la conversión
de glucosa 6-fosfato o fructosa
6-fosfato en piruvato es un tema común en su
metabolismo. De cualquier manera, el equipamiento enzimático para la
ruta glicolítica varía significativamente entre las diferentes
levaduras. Si bien en S. cerevisiae la mayoría de las enzimas
son conocidas y están caracterizadas, al menos parcialmente, en las
NCY solamente se describieron unas pocas enzimas. Algunas de las
funciones necesarias para la glicólisis están mediadas por numerosos
genes/enzimas en algunas levaduras, especialmente aquellas que
juegan un papel adicional en el control o la regulación del
metabolismo y/o que están en un punto de ramificación como
glucoquinasa/hexoquinasa, fosfofructoquinasa y gliceraldehído
3-fosfato deshidrogenasa. Normalmente, las
isoenzimas se regulan diferencialmente indicando diversas funciones
bajo pre-requisitos medioambientales cambiantes.
Algunos de los genes que codifican enzimas glicolíticas son
constitutivos y altamente expresados, p. ej. el gen PGK1
(fosfoglicerato quinasa) de S. cerevisiae o GAP
(gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa) de P.
pastoris mientras otras enzimas son estrictamente reguladas como
el gen de la ENO1 (enolasa) de S. cerevisiae.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
El destino del piruvato en el metabolismo varía
significativamente entre las especies de levadura y las condiciones
de cultivo. En S. cerevisiae y otras levaduras denominadas
Crabtree positivas, la respiración es inhibida por la glucosa y
azúcares afines. Esto conduce a la transformación de piruvato vía
piruvato descarboxilasa en etanol y CO_{2}, incluso con grandes
cantidades de oxígeno, lo que también es conocido como fermentación.
En las levaduras Crabtree negativas, a la que pertenecen la mayoría
de las NCY, la transformación de piruvato en etanol se produce
solamente en condiciones anaerobias. En condiciones aerobias el
piruvato se oxida a CO_{2} vía piruvato deshidrogenasa y ciclo de
los ácidos tricarboxílicos (TCA). El ciclo de los TCA tiene un
interés excepcional para el metabolismo celular debido al hecho de
que esta es la única vía de oxidación de los azúcares a CO_{2}. La
oxidación a CO_{2} da como resultado la producción de NADH, que se
utiliza para la producción de energía. Además, los intermedios del
ciclo de los TCA son las principales fuentes de metabolitos con
fines biosintéticos. Debido a la eliminación de intermedios el ciclo
de los TCA debe ser recargado para mantenerse en funcionamiento. Las
principales reacciones anapleróticas en levaduras son la piruvato
carboxilasa y el ciclo del glioxilato. La primera es la ruta
principal cuando se desarrolla sobre amonio como única fuente de
nitrógeno mientras el último es necesario cuando se desarrolla sobre
fuentes de carbono con menos de 3 átomos de carbono. En contraste
con este eminente interés no se conoce apenas nada acerca de los
genes o enzimas implicados en el ciclo de los TCA en las NCY. El
NADH generado por las reacciones catabólicas, ya sea en el citosol o
en las mitocondrias, tiene que ser re-oxidado a
NAD^{+} para mantener las reacciones en funcionamiento. En las
levaduras Crabtree negativas (p. ej. Pichia pastoris) en
condiciones aerobias el NADH es re-oxidado
principalmente a través de la cadena respiratoria. La situación es
significativamente diferente en las levaduras Crabtree positivas
como S. cerevisiae donde coexisten respiración y
fermentación. Cuando se desarrolla sobre glucosa en condiciones
aerobias, la respiración es reprimida por la glucosa y se produce la
fermentación. En estas condiciones el NAD^{+} es regenerado por la
formación de etanol (NADH producido por glicólisis) o glicerol. La
respiración en levaduras difiere del paradigma animal de esta ruta
descrito en cualquier libro de texto de bioquímica. Primero, algunas
levaduras, como S. cerevisiae y Kluyveromyces lactis,
carecen del complejo I de la cadena respiratoria. En estas
levaduras la regeneración de NAD^{+} se realiza sin bombear
protones a través de la membrana mitocondrial interna por las NADH
deshidrogenasas externa e interna. La segunda diferencia principal,
encontrada en las levaduras Crabtree negativas, hongos y plantas, es
una ruta de respiración alternativa paralela al complejo III y IV de
la cadena del citocromo. Esta respiración alternativa está mediada
por la denominada oxidasa alternativa que transfiere electrones
directamente desde la reserva de ubiquinona a oxígeno sin bombear
protones a través de la membrana mitocondrial interna.
El NADPH para fines biosintéticos se produce en
la porción oxidativa de la ruta de las pentosas fosfato (PPP). Otros
metabolitos muy importantes proporcionados por esta ruta son la
ribosa 5-fosfato y la eritrosa
4-fosfato, necesarias para la síntesis de ácidos
nucleicos y cofactores de nucleótidos y para la síntesis de
aminoácidos aromáticos, respectivamente. Todavía existen muchos
vacíos en la información sobre los genes y sus correspondientes
enzimas implicados en la PPP en las levaduras no convencionales. Se
aislaron unas pocas enzimas de Candida utilis, S. pombe y
K. lactis. La caracterización composicional y cinética reveló
varias diferencias entre estas enzimas. Debido a la carencia de
información, no se puede estimar la influencia de la PPP en estas
levaduras pero se ha demostrado que p. ej. los mutantes para la
fosfoglucosa isomerasa de K. lactis, que carecen de
glicólisis, son capaces de crecer en medio con glucosa, en contraste
con S. cerevisiae. Esta observación indica que la capacidad
de la ruta de las pentosas fosfato en K. lactis es suficiente
para el crecimiento sobre glucosa como fuente de carbono. En
levaduras metilotróficas, se pudo encontrar una transcetolasa
adicional (dihidroxiacetona sintasa). Esta enzima está localizada en
los peroxisomas y confiere la asimilación de formaldehído en el
metabolismo celular por condensación con xilulosa
5-fosfato con formación de dihidroxiacetona y
gliceraldehído 3-fosfato.
Las levaduras como organismos eucarióticos
unicelulares proporcionan sistemas de expresión atractivos para la
producción de proteínas recombinantes. Combinan los pros de las
bacterias, como técnicas de manipulación genética bien
desarrolladas, técnicas de cultivo simples, seguras y por lo tanto
baratas (a gran escala), con la ventaja principal de los sistemas de
expresión eucarióticos, esto es el procesamiento de proteínas
eucariótico. Debido a las razones mencionadas anteriormente S.
cerevisiae ha dominado este campo durante muchos años dando como
resultado un gran número de proteínas (p. ej. insulina, HBsAg, HSA)
producidas en este organismo. S. cerevisiae muestra ciertas
limitaciones debido a la hiperglicosilación, retención de las
proteínas secretadas en el espacio periplásmico, inestabilidad
plasmídica y bajos rendimientos de producto. Para superar las
limitaciones de este organismo sencillo se ha desarrollado un
pequeño grupo de levaduras no convencionales como anfitriones para
la expresión de genes heterólogos. Entre otros se utilizaron K.
lactis, Y. lipolytica y las levaduras metilotróficas Candida
boidinii, H. polymorpha y P. pastoris, pero solamente las
2 últimas especies adquirieron interés comercial excepcional.
Schizosaccharomyces pombe muestras ciertas características
con íntima proximidad a eucariotas superiores lo que hace de esta
levadura un anfitrión muy atractivo para la producción de proteína
heteróloga: (1) el mecanismo de inicio de la transcripción es más
similar al de los eucariotas superiores, (2) algunos promotores de
mamífero son funcionales en S. pombe, (3) la capacidad de
empalme de ARN, destacando en una similitud de componentes del
espliceosoma con el de los mamíferos, (4) la señal de retención del
retículo endoplásmico de mamíferos KDEL puede ser reconocida, (5)
existencia de residuos de galactosa en las glicoproteínas y (6)
algunas otras modificaciones post-traduccionales
como la acetilación y la isoprenilación de proteínas se realizan de
una manera más similar a la de los mamíferos que a la de las células
de levadura. Varios de los rasgos mencionados antes podrían aumentar
la importancia de S. pombe en la producción de proteína
recombinante en el futuro próximo con respecto a la producción de
proteínas heterólogas auténticas y sus aplicaciones de alto
rendimiento, como la genómica estructural y funcional.
Todos los microorganismos poseen mecanismos para
adaptar su metabolismo a la utilización óptima de los nutrientes
disponibles en el entorno. La adaptación rápida y exacta a estas
restricciones medioambientales es el principal factor que controla
el crecimiento y otros parámetros fisiológicos de todos los
organismos. Para la levadura, como para la mayor parte de los
microorganismos, la glucosa es la fuente de carbono y energía
preferida. Por lo tanto no es sorprendente que la glucosa, el
monosacárido más abundante en la naturaleza, sea el mensajero
principal para las células afectando al crecimiento y desarrollo de
estos organismos por medio de la regulación de la expresión génica,
principalmente, pero no exclusivamente, a nivel de control de la
transcripción. El análisis de la transcripción genómica reveló que
una cantidad considerable de genes está regulada por el nivel de
glucosa determinado medioambientalmente. Los genes con una función
metabólica conocida en la utilización de la glucosa como los
transportadores de glucosa de baja afinidad y las enzimas
glicolíticas así como los genes que codifican proteínas ribosomales
están inducidos por glucosa. Por otra parte, la glucosa reprime un
gran grupo de genes, incluyendo los genes implicados en la
utilización de fuentes de carbono alternativas, la gluconeogénesis,
el ciclo del glioxilato, las funciones peroxisómicas y la
respiración. La represión de la respiración (efecto Crabtree) se
produce solamente en unas pocas especies de levadura (levaduras
fermentativas, Crabtree positivas) como Saccharomyces
cerevisiae mientras en la mayoría de las especies de levadura la
glucosa no reprime la respiración (Crabtree negativas). Aunque se ha
logrado un amplio conocimiento de la maquinaria de represión de la
glucosa a lo largo de los últimos 20 años, basado principalmente en
la levadura Saccharomyces cerevisiae, su mecanismo real,
especialmente las porciones aguas arriba de la detección y la
señalización de la glucosa, no es completamente comprendido. Sin
embargo, para obtener una mejor comprensión del presente trabajo, se
describen brevemente a continuación unos pocos actores de la
represión de los catabolitos carbonados para S.
cerevisiae.
El gen SNF1 codifica una proteína/quinasa
Ser/Thr que puede ser encontrada en complejos de elevada masa
molecular en células de levadura. Está regulado por cambios
conformacionales en el complejo causados por la fosforilación en la
subunidad reguladora de Snf1p. Hasta la fecha se han identificado 3
quinasas aguas arriba (Pak1p, Elmlp y Tos3p) para fosforilar y por
lo tanto activar Snf1p. Su actividad es absolutamente necesaria para
la des-represión de una amplia variedad de genes
reprimidos por glucosa. Por consiguiente no es sorprendente que
Snflp o sus homólogos estén ampliamente conservados en
eucariotas.
La proteína en dedo de cinc Mig1p es capaz de
unirse a regiones promotoras de una amplia variedad de genes
reprimidos por glucosa. Está actuando muy probablemente mediante el
reclutamiento del complejo represor general
Ssn6(Cyc8)-Tuplp. La función de Miglp está
controlada por la proteína quinasa Snf1, aunque todavía no hay una
evidencia clara de una fosforilación directa. Miglp está localizada
en el núcleo en su forma no fosforilada. El agotamiento de la
glucosa ocasiona la fosforilación de Miglp seguido de translocación
al citoplasma. Cuando se añade glucosa a las células Miglp vuelve
rápidamente al núcleo y reprime la transcripción.
Adr1p también pertenece a la familia de las
proteínas en dedo de cinc y se encontró que era un efector positivo
de proteínas peroxisómicas y el gen ADH2, que codifica la
alcohol deshidrogenasa II reprimida por glucosa. La expresión de
ADR1 está regulada a la baja por la glucosa por medio de la
proteína quinasa dependiente de AMP cíclico (AMPc) a niveles de AMPc
elevados. El principal efecto regulador aparece a nivel de la
traducción del ARNm, pero también se observaron efectos reguladores
sobre la transcripción así como sobre la estabilidad del ARNm,
dependiendo de la cepa de S. cerevisiae analizada.
Para un número grande de genes incluyendo muchos
de los genes implicados en el metabolismo respiratorio la
transcripción es activada sobre fuentes de carbono no fermentables
por el complejo Hap2/3/4/5. Para unos pocos genes implicados en la
respiración como CYC1 (que codifica el
iso-1-citocromo c) y COX6
(subunidad VI de la citocromo c oxidasa) se ha establecido que Snf1
es necesaria para la des-represión después del
crecimiento sobre glucosa. La transcripción de HAP4 es
reprimida cuando está presente glucosa, sin embargo no se pudo
demostrar una implicación directa de Hap4p o Snflp en la
des-represión.
Gcr1p es una proteína activadora de la
transcripción principal de los genes glicolíticos (p. ej. enolasa,
gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa). Gcr1p,
junto con el factor de transcripción general Rap1p es el principal
punto de la expresión de genes glicolíticos con respecto a la
coordinación de la transcripción y es absolutamente necesaria para
un elevado nivel de expresión. El patrón de expresión genómica de
S. cerevisiae gcr1 de tipo salvaje y mutante que crece sobre
diferentes fuentes de carbono reveló 53 marcos de lectura abiertos
(ORF), incluyendo los genes de la glicólisis, como dependientes de
Gcr1p.
Esta descripción de algunos factores de
transcripción y de la ruta Snflp y Miglp debe proporcionar una breve
perspectiva general de algunos participantes en la trama de
represión de la glucosa. Se debe observar que hay más ciclos
reguladores que la ruta de Snflp para la regulación de la glucosa.
Aunque se ha logrado una amplio conocimiento de la detección y
señalización de la glucosa los últimos 20 años, las principales
cuestiones todavía están sin responder: cuál es la naturaleza de la
señal de glucosa y cómo son reguladas e integradas las rutas de
señalización conocidas.
Un número limitado de especies de levadura es
capaz de crecer sobre metanol como única fuente de carbono y
energía. Pertenecen a uno de los cuatro géneros Pichia,
Hansenula, Candida y Torulopsis y comparten una ruta de
utilización de metanol general que es expresada después de la
des-represión o inducción con metanol (véase 1.3.1).
Puesto que las reacciones iniciales de esta ruta están
compartimentadas dentro de peroxisomas, estos orgánulos también son
inducidos. Debido a la fuerte inducción de los peroxisomas, las
levaduras Candida boidinii, Pichia metanolica, Pichia
pastoris y Hansenula polymorpha se utilizan
frecuentemente en la biología celular para estudiar la biogénesis y
la función de los peroxisomas.
Como se ha mencionado antes las levaduras
metilotróficas comparten una ruta de utilización de metanol común.
La primera etapa es la oxidación de metanol a formaldehído y
peróxido de hidrógeno, catalizada por alcohol oxidasas (AOX, EC
1.1.3.13). El H_{2}O_{2} tóxico se disocia en oxígeno y agua por
la acción de la catalasa. Ambas enzimas son secuestradas en los
peroxisomas. El formaldehído es oxidado por dos reacciones con
deshidrogenasa posteriores o asimilado en el metabolismo celular
mediante condensación con xilulosa 5-fosfato (Xu5P).
El formaldehído se oxida a formiato y adicionalmente a dióxido de
carbono mediante formaldehído deshidrogenasa dependiente de
glutation (GSH) y formiato deshidrogenasa, localizadas ambas en el
citosol. El NADH, generado en ambas reacciones, se utiliza para
producir energía para el crecimiento sobre metanol. La reacción de
condensación tiene lugar dentro de los peroxisomas y está catalizada
por la transcetolasa dihidroxiacetona sintasa mencionada antes. Los
compuestos C3 resultantes, la dihidroxiacetona (DHA) y el
gliceraldehído 3-fosfato (GAP) se metabolizan
adicionalmente en el citosol. Después de la fosforilación de DHA, se
forma fructosa 1,6-bisfosfato (FBP) mediante una
reacción aldolasa de dihidroxiacetona fosfato (DHAP) y GAP. La FBP
se convierte en fructosa 6-fosfato mediante una
fosfatasa y la xilulosa 5-fosfato (Xu5P) se regenera
en la ruta de las pentosas fosfato. Un tercio del GAP generado entra
en la ruta de la gluconeogénesis para la síntesis de constituyentes
celulares.
Las enzimas clave de la ruta de utilización del
metanol, alcohol oxidasa y formiato deshidrogenasa, son producidas a
niveles muy elevados después de la inducción con metanol. La alcohol
oxidasa puede representar más del 30% del total de la proteína
soluble, la dihidroxiacetona sintasa y la formiato deshidrogenasa
hasta el 20%. Los peroxisomas, que también son inducidos, pueden
representar aproximadamente un 80% del volumen celular. Las
secuencias promotoras de varios genes de utilización del metanol
fueron desarrolladas para la producción de proteínas recombinantes.
Entre otros, estos promotores fuertes e inducibles son una causa
principal del amplio uso de Pichia pastoris y Hansenula
polymorpha como anfitriones para la producción de proteínas.
En H. polymorpha y C. boidinii un
gen codifica una alcohol oxidasa: MOX (metanol oxidasa, H.
polymorpha) y AOD1 (alcohol oxidasa, C. boidinii).
Se encontraron 2 genes en las dos especies de Pichia P.
pastoris (AOX1 y AOX2) y P. metanolica
(AUG1 y AUG2, gen que utiliza alcohol, o MOD1 y
MOD2), siendo Aoxlp y Aug1p la principal alcohol oxidasa. La
comparación de las regiones codificantes reveló una similitud del
73-85% a nivel de aminoácidos entre las levaduras
metilotróficas [1]. La homología entre los ORF (marcos de lectura
abiertos) de AOX1 y AOX2 de P. pastoris es del
92% y 97% a nivel de secuencia de nucleótidos y aminoácidos,
respectivamente [2, 3]. La alcohol oxidasa es una flavoproteína
octamérica que contiene un FAD unido no covalentemente o un análogo
modificado (mFAD) por subunidad. La traducción de AOX se produce
sobre los ribosomas libres seguido de una importación
post-traduccional en los peroxisomas. La
traslocación en los peroxisomas está dirigida por una secuencia PTS1
(señal de direccionamiento de peroxisoma de tipo 1) en su extremo C
terminal. Los oligómeros de Aox se forman solamente después de la
importación en la matriz del peroxisoma.
En C. boidinii y P. pastoris no se
pudieron encontrar oligómeros Aox en el citosol en contraste con la
dihidroxiacetona sintasa, que forma un dímero en el citosol antes de
su translocación a la matriz peroxisómica. No solamente la secuencia
promotora de la alcohol oxidasa I de Pichia pastoris, si no
también la enzima tienen un interés biotecnológico debido a una
amplia gama de sustrato (alcoholes primarios insaturados y saturados
con una longitud de cadena de corta a moderada) y una elevada
estabilidad en diferentes condiciones de reacción. La regulación de
todos los genes de alcohol oxidasa se produce a nivel de la
transcripción y muy probablemente en la fase de inicio de la
transcripción. Aunque AOX1 y AOX2 son regulados de un
modo similar (ARNm no detectable sobre glicerol o glucosa,
detectable en la fase de agotamiento de carbono, elevadas cantidades
en metanol), sus 5 regiones limítrofes no comparten una homología
significativa [2, 4].
Cada locus AOX muestra un supuesto sitio de
unión a ARN polimerasa (TATAAA; caja
Goldberg-Hogness o TATA) en la posición -43 con
respecto al sitio de inicio de la transcripción primario. Ambas
secuencias líder del ARNm de AOX de P. pastoris son
extremadamente ricas en residuos A e inusualmente largas para las
levaduras (115 nucleótidos (nt) para AOX1 y 160 nt para AOX2). Las
regiones de inicio de la traducción en torno al codón de iniciación
ATG (secuencia Kozak; AOX1: CGAAACG ATG GCT, AOX2:
GAGAAAA ATG GCC) coinciden con las secuencias consenso descritas
previamente para S. cerevisiae y eucariotas superiores. El
papel fisiológico del segundo gen de alcohol oxidasa en P.
pastoris y P. metanolica todavía no está claro. La
desorganización de AOX1 o AUG1 ocasiona graves
defectos en el crecimiento en estas cepas (el denominado fenotipo
lento de utilización de metanol (Mut^{S})) mientras las cepas
aox2 y aug2 muestran tasas de crecimiento comparables con las
de la cepa de tipo salvaje. Se observaron 9 formas múltiples de
alcohol oxidasa en P. metanolica que representan una
oligomerización al azar de los 2 productos génicos Aug1p y Aug2p.
AUG1 y AUG2 están regulados diferencialmente: en el
agotamiento del carbono y la baja concentración de metanol solamente
se pudo detectar Aug1p, y con una concentración creciente de metanol
aumenta la razón de Aug2p a Aug1p. El desplazamiento a octámeros con
un elevado contenido de Aug2p se debe a un incremento en la
expresión de AUG2, regulado a nivel de la transcripción. Los
valores de Km para el metanol de los dos homooctámeros de Aug1p y
Aug2p son de aproximadamente 0,56 y 5,6 mM, respectivamente. Junto
con el descubrimiento, esa interrupción de AUG1 ocasiona un defecto
en el crecimiento a bajas concentraciones de metanol [5], estos
resultados implican que AUG2 es una ventaja para P.
metanolica cuando crece a concentraciones superiores de metanol.
En Pichia pastoris ni el papel del gen AOX2 fue
analizado con mayor detalle ni fueron favorables las condiciones
para poseer un segundo gen de alcohol oxidasa encontrado. Puesto que
las condiciones de laboratorio representan solamente una fracción
muy pequeña de las condiciones a las que se enfrentan los
microorganismos de vida libre, debe haber situaciones en la
naturaleza en las que el gen AOX2 tenga una importancia
selectiva para P. pastoris.
La expresión de AOD1 de C.
boidinii y MOX de H. polymorpha es estrictamente
reprimida durante el crecimiento sobre glucosa o etanol como única
fuente de carbono, des-reprimida sobre glicerol y
fuertemente inducida sobre metanol. La expresión de estas dos
enzimas también es reprimida cuando están presentes glucosa y
metanol en el medio. Si está presente glicerol el metanol es capaz
de inducir la expresión génica. La transcripción de AOD1 y
MOX también es des-reprimida en el
agotamiento de carbono y reprimida cuando se encuentra presente
etanol [6-9]. Dos mecanismos reguladores distintos
son responsables de la represión del metabolismo de utilización de
metanol por etanol o glucosa [10, 11]. En Pichia pastoris la
situación es significativamente diferente: AOX1 es reprimido
cuando están presentes en el medio glucosa, etanol o glicerol (a
concentraciones no limitantes del crecimiento). La
des-represión en el agotamiento del carbono y la
inducción por metanol son similares para AOD1 y MOX.
Las fuentes de carbono con las cuales la expresión de AOX1 es
des-reprimida son p. ej. sorbitol, manitol,
trehalosa y alanina [12].
Tras el cambio de metanol a una fuente de
carbono represora como glucosa o etanol, los peroxisomas son
degradados en horas durante la adaptación a la nueva fuente de
carbono. La degradación proteolítica en las vacuolas de la levadura
sigue de nuevo dos mecanismos distintos cuando se adapta a glucosa o
etanol, denominados micro- y macroautofagia, respectivamente.
Como se ha mencionado antes, las levaduras
metilotróficas Pichia pastoris y Hansenula polymorpha
son ampliamente utilizadas para la producción de proteína
recombinante. Hasta ahora, se han producido más de 500 proteínas en
P. pastoris. Su desarrollo fue dirigido por unas pocas
características, que les proporcionan ventajas entre los anfitriones
recombinantes: 1) comparten las ventajas generales de las levaduras
en términos de manipulación genética y tecnología de cultivo (A
escala de laboratorio y a gran escala); 2) la capacidad para crecer
a densidades celulares extremadamente elevadas; y 3) el elevado
nivel de producción de proteína recombinante (secretada o
intracelular). Los promotores inducibles fuertes de los genes que
codifican reacciones de la ruta de utilización del metanol fueron
desarrollados para la producción de proteína recombinante. Los más
ampliamente utilizados son las regiones promotoras de los genes de
la alcohol oxidasa AOX1 y MOX de P. pastoris y
H. polymorpha, respectivamente. Pero también se utilizaron
otras regiones promotoras de los genes de la ruta de utilización de
metanol para dirigir la producción de proteína recombinante: los
promotores FMD (formiato deshidrogenasa) y DAS1
(dihidroxiacetona sintasa) de H. polymorpha y C.
boidinii y el promotor FLD1 (formaldehído deshidrogenasa)
de P. pastoris. El último también puede ser inducido con
metilamina como única fuente de nitrógeno con glucosa como fuente de
carbono. Los promotores para la expresión constitutiva de genes
foráneos también se encuentran disponibles: el elemento promotor GAP
(gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa) de P.
pastoris y el promotor PMA1 (que codifica H+ -ATPasa de
la membrana plasmática) de H. polymorpha. Se desarrollaron
varias combinaciones de cepa anfitriona auxotrófica/gen marcador
para P. pastoris (p. ej. HIS4) y H. polymorpha
(p. ej. LEU2 y URA3). Los marcadores de selección
dominante también se encuentran disponibles p. ej. Zeocina®,
resistencia a G418). La integración del gen en levaduras
metilotróficas se realiza principalmente (si no exclusivamente)
mediante integración homóloga. Los vectores que portan una región
ARS (secuencia autónomamente replicante) también se encuentran
disponibles pero normalmente son bastante inestables si la presión
de selección se libera, lo que da como resultado su aplicación
tecnológica limitada. En P. pastoris el gen foráneo es
integrado de manera específica del sitio en el locus AOX1 o
HIS4. Otros posibles sitios de integración son p. ej. el
locus GAP (para la expresión de GAP) o cualquier otro locus para
marcadores de selección (p. ej. ADE1, URA3, ARG4 y
LEU2). En H. polymorpha se integran al azar casetes de
expresión en una disposición
cabeza-a-cola que conduce a
integrantes mitóticamente estables con un elevado número de copias
(hasta 100). Sin embargo, un elevado número de copias a menudo no
dan como resultado un elevado nivel de expresión. Otros factores de
gran influencia son: la estructura de la casete de integración, la
naturaleza y estructura de la proteína que va a ser expresada y el
sitio de integración. Especialmente la estructura de la casete de
integración tiene una gran influencia sobre el efecto de la
dosificación del gen. Un estudio adicional de cómo optimizar la
casete de expresión y la dosificación del gen se proporciona en [13,
14]. Las levaduras metilotróficas pertenecen al grupo de levaduras
Crabtree negativas teniendo lugar de ese modo la producción de
etanol a un nivel muy bajo cuando crecen en condiciones aerobias.
Debido este hecho, estas levaduras se pueden hacer crecer a
densidades celulares muy elevadas en cultivos en fermentadores dando
como resultado rendimientos de producto muy elevados. La producción
de proteína conducida por AOX1 se puede incrementar
adicionalmente 3-5 veces cuando la concentración de
metanol en el biorreactor se encuentra en esferas limitantes del
crecimiento. El hecho de que P. pastoris secrete en
condiciones convencionales solamente bajas cantidades de proteínas
endógenas hace de cada proteína recombinante secretada la más
abundante del medio. La secreción puede servir como una primera
etapa sustancial en el procedimiento de purificación aguas abajo.
Para la secreción de proteína, la secuencia líder prepro MF\alpha1
(factor de apareamiento \alpha) de S. cerevisiae y las
secuencias derivadas de la fosfatasa ácida (PHO1) son
ampliamente utilizadas en P. pastoris y H. polymorpha.
En algunos casos se obtuvo secreción suficiente con proteínas de
plantas, hongos y mamíferos que portaban sus señales de secreción
naturales. Como se ha mencionado antes, las levaduras son capaces de
realizar modificaciones postraduccionales como la formación de
enlaces disulfuro, el procesamiento de secuencias señal (p. ej.
secuencia líder prepro de MF\alpha1), adición de lípidos y
glicosilación unida a N y O. Si bien en células de mamífero se
producen estructuras de oligosacáridos unidos a N y O muy complejas
compuestas por una variedad de azúcares (p. ej.
N-acetilglucosamina, galactosa, y ácido siálico), la
mayor parte de las levaduras generan estructuras de tipo alto
contenido de manosa carentes de algunas entidades de azúcar como
galactosa o ácido siálico. Estas estructuras no de mamífero pueden
producir graves problemas para la aplicación terapéutica debido
principalmente a su elevada inmunogenicidad potencial. En H.
polymorpha y P. pastoris, en contraste con S.
cerevisiae, la hipermanosilación es menos abundante y no se
incorporan manosas conectadas a \alpha-1,3
terminales hiper-inmunogénicas a los oligosacáridos
unidos a N. Para superar estos problemas de inmunogenicidad (y
algunos otros como la baja estabilidad en el flujo sanguíneo), los
esfuerzos están encaminados a humanizar estructuras de
oligosacáridos derivadas de levadura, y, como revela la literatura
reciente, especialmente en P. pastoris. Hasta la fecha, la
inmensa mayoría de los artículos de investigación y los
procedimientos comerciales tienen que ver con la levadura bien
conocida S. cerevisiae. Debido a un conocimiento creciente de
las levaduras no convencionales, junto con las ventajas aparentes en
términos de fermentación a gran escala y los problemas de
glicosilación, H. polymorpha y P. pastoris se están
convirtiendo rápidamente en la levadura de elección. Esto se
enfatiza por el hecho de que numerosos procedimientos de producción
fueron implementados en
la industria.
la industria.
En el documento WO 02/081650 se describe la
identificación de regiones del promotor AOX1, que puede ser
utilizado para la construcción de promotores de AOX1
mutantes. Puesto que las regiones de la secuencia suprimida del
promotor de AOX1 descritas allí son muy largas, se puede
observar un efecto acumulado y no los efectos individuales de las
distintas secuencias reguladoras del promotor. No obstante,
semejante enfoque no permitirá el desarrollo de promotores
fuertemente intensificados. Especialmente cuando se construyen
nuevos promotores que tienen rasgos mejorados suprimiendo o
duplicando porciones del promotor original se requiere el
conocimiento de la secuencia reguladora exacta.
Un objeto de la presente invención es
proporcionar un promotor de AOX1 mejorado con propiedades
intensificadas para facilitar el procesamiento aguas abajo en la
producción de proteínas, para incrementar los rendimientos
tiempo-espacio y para ayudar a elevar el nivel de
calidad del producto.
Otro objeto es proporcionar un promotor de
AOX1 fuerte en un vector o una cepa anfitriona que anticipe
parcial o totalmente la represión por glucosa. Resulta ventajoso
tener un promotor que conduzca la expresión fuerte en presencia de
elevadas concentraciones de glucosa.
Un objeto adicional de la presente invención es
proporcionar un promotor de AOX1 que permita la producción de
una proteína empleando una cantidad reducida de metanol o sin
metanol. Tales promotores tendrían un impacto significativo sobre
los procedimientos de producción industrial. Debido a problemas de
seguridad se necesita un equipamiento especial para las plantas de
producción que emplean metanol como inductor. Esto contradice las
aplicaciones de Pichia pastoris en plantas de producción
mucho menos especializadas. Además la estabilidad de las proteínas
en presencia de metanol puede dificultar la inducción basada en
metanol de la expresión de proteínas. Esto es menos crítico para la
producción de proteínas industriales robustas, pero se convierte en
un problema principal p. ej. para las proteínas terapéuticas
secretadas.
La construcción de tales promotores requiere el
conocimiento de las porciones específicas (p. ej. elementos
reguladores, sitios de unión del factor de transcripción) del
promotor de AOX1 de Pichia pastoris de tipo salvaje
que -cuando muta de algún modo- muestra un efecto sobre el
comportamiento de la expresión. Por lo tanto un objeto de la
presente invención es identificar estas porciones y proporcionar por
lo tanto los medios para crear promotores de AOX1 con
características mejoradas.
Por lo tanto la presente invención se refiere a
un promotor de alcohol oxidasa 1 (AOX1) de Pichia
pastoris mutante del promotor de AOX1 de Pichia
pastoris de tipo salvaje (SEQ ID No. 1) como se define en las
reivindicaciones. Dicho promotor mutante puede comprender
adicionalmente una mutación seleccionada del grupo que consiste
en:
- a)
- un sitio de unión del factor de transcripción (TFBS),
- b)
- los nucleótidos 170 a 235 (-784 a -719), los nucleótidos 170ao 191 (-784 a -763), los nucleótidos 192 a 213 (-762 a -741), los nucleótidos 192 a 210 (-762 a -744), los nucleótidos 207 a 209 (-747 a -745), los nucleótidos 214 a 235 (-740 a -719), los nucleótidos 304 a 350 (-650 a -604), los nucleótidos 364 a 393 (-590 a -561), los nucleótidos 434 a 508 (-520 a -446), los nucleótidos 509 a 551 (-445 a -403), los nucleótidos 552 a 560 (-402 a -394), los nucleótidos 585 a 617 (-369 a -337), los nucleótidos 621 a 660 (-333 a -294), los nucleótidos 625 a 683 (-329 a -271), los nucleótidos 736 a 741 (-218 a -213), los nucleótidos 737 a 738 (-217 a -216), los nucleótidos 726 a 755 (-228 a -199), los nucleótidos 784 a 800 (-170 a -154) o los nucleótidos 823 a 861 (-131 a -93) del SEQ ID No. 1, y sus combinaciones. Los números (negativos) entre paréntesis a lo largo de toda la memoria reflejan las correspondientes posiciones del promotor con respecto al codón de inicio de la traducción (p. ej. ATG). Por ejemplo, "A" de "ATG" en una secuencia de ácido nucleico que comprende N_{x}GACTATGN_{y} corresponde a la posición +1, mientras la "T" antes de "A" de "ATG" corresponde a la posición -1.
\vskip1.000000\baselineskip
De acuerdo con la presente invención el promotor
de AOX1 mutante comprende al menos una mutación en un sitio
de unión al factor de transcripción y/o uno de los intervalos de
secuencia del ácido nucleico esbozados antes. Resultó que
especialmente estas regiones del promotor de AOX1 son
adecuadas para modificar dicho promotor con el fin de alterar sus
características. Por su puesto también se puede introducir una
combinación de las mutaciones esbozadas antes para mejorar los
rasgos característicos de un promotor de AOX1 (p. ej. dos
mutaciones TFBS seleccionadas de a), una mutación TFBS seleccionada
de a) y una mutación seleccionada de b), una mutación seleccionada
de a) y dos mutaciones seleccionadas de b)). Por ejemplo, una
mutación de un TFBS se puede combinar con una mutación en los
nucleótidos 737 a 738 (-217 a -216) y/o los nucleótidos 207 a 209
(-747 a -745) del SEQ ID No. 1. La expresión de una proteína bajo el
control de un promotor de AOX1 en Pichia pastoris es
inducida generalmente por la adición de metanol e inhibida por la
presencia de glucosa en el medio. Con el fin de aumentar o reducir
el efecto de dichos aditivos del medio sobre la expresión de las
proteínas, el promotor es mutado preferiblemente en las regiones
promotoras como se ha esbozado antes. La eficacia de los promotores
de AOX1 mutados para producir una proteína de interés varía
dependiendo de la cantidad (esto es las copias) del vector integrado
en el cromosoma del anfitrión. Especialmente resultó que las cepas
con múltiples copias muestran efectos promotores mejorados. Puesto
que la resistencia a antibióticos de las cepas de Pichia
depende del número de casetes de resistencia a antibióticos (los
vectores introducidos en un anfitrión comprenden preferiblemente una
casete de resistencia a antibiótico que permite al anfitrión crecer
sobre/en un medio que comprende un antibiótico como marcador
selectivo) integradas en el cromosoma de dicho anfitrión, se pueden
producir cepas con múltiples copias aplicando concentraciones
crecientes de antibiótico (en el intervalo de 10 \mug/ml a 10
mg/ml, preferiblemente 50 \mug/ml a 1000 \mug/ml; dependiendo
del antibiótico utilizado; por ejemplo, geneticina: 0,1 a 10 mg/ml,
preferiblemente 0,2 a 5 mg/ml, concretamente 0,25 a 4 mg/ml,
zeocina: 10 a 5000 \mug/ml, preferiblemente 50 a 3000 \mug/ml,
concretamente 100 a 2000 \mug/ml) sobre placas de agar selectivo
para incrementar la presión de selección (p. ej. [14]; Scorer, C.A.
et al. (1994) Bio/Technology 12:181-184). Sin
embargo, se encontró que el crecimiento de las células que albergan
una multiplicidad de casetes de resistencia a antibiótico no depende
solamente de la concentración de antibiótico si no que también
depende del tiempo. Por lo tanto, las cepas con múltiples copias son
capaces de crecer hasta una colonia detectable sobre un medio que
contiene la misma concentración de antibiótico en un período de
tiempo más corto que las cepas con una única copia. Este
compartimento permite al experto en la técnica detectar y aislar
cepas de múltiples copias antes de que las cepas de una sola copia
comiencen a crecer. Por ejemplo, una cepa que alberga una única
copia de un casete de resistencia a antibiótico crece sobre una
placa de agar hasta un tamaño de colonia detectable en 72 h,
mientras la misma cepa que alberga más de una copia de dicha casete
crece en 24 a 48 h hasta el mismo tamaño.
Especialmente las cepas con múltiples copias que
albergan un promotor de AOX1 con mutaciones en los
nucleótidos 694 a 723 (-260 a -231) y en los nucleótidos 737 a 738
(-217 a -216) mostraron un aumento sorprendente de las tasas de
expresión.
Con el fin de incrementar la eficacia de
expresión de proteínas de un anfitrión en presencia de metanol, se
mutan preferiblemente los nucleótidos 170 a 235 (-784 a -719) del
promotor de AOX1 (SEQ ID No. 1). Una mutación en esta región
aumenta la expresión de proteína de 120 a 130% en comparación con el
promotor de AOX1 de tipo salvaje, siempre que el plásmido que
porta el promotor de AOX1 mutante esté integrado solamente
una vez en el cromosoma/genoma del anfitrión (mutante de una sola
copia). No obstante, las mutaciones dentro de todas las regiones
mencionadas antes reducen o no afectan a la eficacia del metanol
para inducir la expresión de proteína. En contraste con esto, las
mutaciones en las regiones promotoras del promotor de AOX1 de
tipo salvaje (como se ha esbozado antes) conducen -dependiendo de la
mutación- a un incremento o disminución de la expresión de proteína
en condiciones de des-represión (p. ej. véase la
Tabla 13, ejemplo 1).
No obstante, las cepas recombinantes que
albergan más de una copia de los promotores de AOX1 mutados
dan como resultado cepas que tienen una actividad incrementada en
condiciones de des-represión e inducida por metanol
(cepas de múltiples copias, p. ej. véase la Fig. 7, ejemplo 2). En
detalle, las cepas con múltiples copias que albergan mutaciones en
los nucleótidos 694 a 723 del SEQ ID No. 1 (d6), en los nucleótidos
694 y 723 (-260 y -231) del SEQ ID No. 1 (d6), en los nucleótidos
694 y 723 (-260 y -231) y en los nucleótidos 304 y 350 (-650 y -604)
del SEQ ID No. 1 (d2d6), en TFBS, especialmente en Rap1, Gcr1,
QA-1F, Hsf_1, Adr1, Hsf_2, Mat1MC, abaA y Hap2345,
muestran un incremento de la expresión en condiciones de
des-represión y/o de inducción con metanol en
comparación con la expresión de proteínas bajo el control del
promotor de AOX1 de tipo salvaje. En condiciones de
des-represión algunas de estas cepas con múltiples
copias muestran expresiones de proteínas que han aumentado
aproximadamente 10 veces en comparación con las expresiones bajo el
control del promotor de tipo salvaje. En presencia de metanol como
inductor la eficacia de expresión es intensificada más de 5 veces
cuando se emplea un promotor de acuerdo con la presente invención.
Por lo tanto, estas mutaciones, especialmente cuando están presentes
en el anfitrión en forma de múltiples copias, se emplean
preferiblemente para la expresión de proteínas. La combinación de
dos o más de las mutaciones mencionadas antes puede aumentar
adicionalmente la fuerza del promotor (véase p. ej. la Fig.
7,
ejemplo 2).
ejemplo 2).
Los sitios de unión del factor de transcripción
se pueden identificar experimentalmente (p. ej. mediante cambio de
la movilidad o análisis de la huella genética) o mediante
comparación de la secuencia con sitios de unión del factor de
transcripción conocidos (p. ej. mediante análisis computarizado,
[15]).
El conocimiento de las regiones promotoras que
influyen en la fuerza y las características de dicho promotor puede
ser utilizado para diseñar promotores con distintas propiedades
(elevada expresión de proteína en condiciones de
des-represión y/o elevada expresión de proteína en
presencia de metanol). Además estas propiedades pueden ser mejoradas
o alteradas si estos promotores mutantes se integran una o más veces
en el genoma del anfitrión (p. ej. véanse los ejemplos 1 a 3).
Sin embargo, en algunos casos la actividad del
promotor debe ser disminuida en lugar de aumentada. Especialmente se
requiere en muchos casos que la co-expresión de
proteínas reguladoras como las quinasas, fosforilasas y proteínas
coadyuvantes, tales como p. ej. chaperonas, proteínas disulfuro
isomerasa, isomerasas cis-trans, foldasas, proteínas
disulfuro isomerasas y proteasas, sea baja en comparación con el
producto principal, que puede ser producido por la célula con el
promotor de tipo salvaje o con el promotor mejorado de acuerdo con
la presente invención. Especialmente la expresión combinada de dos
productos diferentes (p. ej. una proteína coadyuvante y el producto
principal) bajo el control de un promotor de AOX1 con una actividad
incrementada y un promotor de AOX1 con una actividad disminuida (en
comparación con la actividad de tipo salvaje), respectivamente,
resultó ser ventajosa, debido a que la tasa de expresión del
producto principal y secundario difiere aún más con respecto al uso
de promotores de AOX1 de tipo salvaje. Se puede obtener una
reducción de la expresión preferiblemente suprimiendo los sitios de
unión al activador como HSF o HAP o insertando sitios de unión al
represor en el promotor de AOX1 de tipo salvaje. Por consiguiente,
el uso del promotor de AOX1 con una actividad reducida evita la
sobrecarga de la maquinaria de expresión de proteínas de la célula,
que tendría la consecuencia de que se podría reducir el rendimiento
del producto principal. Por ejemplo, Bessette PH et al. (PNAS
USA (1999) 96:13703-13708) pudieron demostrar que la
expresión de un polipéptido activo se podría incrementar
significativamente mediante la co-expresión de una
tiorredoxina.
De acuerdo con una realización preferida el
promotor comprende adicionalmente una mutación en los nucleótidos
694 a 723 (-260 a -231) y/o los nucleótidos 729 a 763 (-225 a -191)
del SEQ ID No. 1.
Una mutación que afecta a estos intervalos de
nucleótidos combinada con una mutación como se ha esbozado antes da
como resultado una actividad del promotor incluso más intensificada.
Por ejemplo, una doble mutación que afecta a los nucleótidos 694 a
723 (-260 a -231) y a los nucleótidos 737 a 738 (-217 a -216) del
SEQ ID No. 1 conduce a un promotor que muestra niveles de expresión
superiores en condiciones de des-represión así como
en condiciones inducidas en comparación con los niveles de expresión
en las mismas condiciones del promotor de tipo salvaje. El efecto de
esta doble mutación puede ser intensificado cuando el ácido nucleico
que comprende el promotor es introducido en la célula en más de una
copia (dando como resultado un clon con múltiples copias).
La mutación es preferiblemente una deleción, una
sustitución, una inserción y/o una inversión.
Con el fin de modificar las características del
promotor de AOX1 de tipo salvaje de Pichia pastoris
son posibles varios tipos de mutación. Los tramos del promotor que
comprenden las regiones mencionadas antes (sitios de unión al factor
de transcripción (TFBS), los nucleótidos 170 a 235 (-784 a -719),
170 a 191 (-784 a -763), 192 a 213 (-762 a -741), 192 a 210 (-762 a
-744), 207 a 209 (-747 a -745), 214 a 235 (-740 a -719), 304 a 350
(-650 a -604), 364 a 393 (-590 a -561), 434 a 508 (-520 a -446), 509
a 551 (-445 a -403), 552 a 560 (-402 a -394), 585 a 617 (-369 a
-337), 621 a 660 (-333 a -294), 625 a 683 (-329 a -271), 694 a 723
(-260 a -231), 729 a 763 (-225 a -191), 736 a 741 (-218 a -213), 737
a 738 (-217 a -216), 726 a 755 (-228 a -199), 784 a 800 (-170 a
-154) o 823 a 861 (-131 a -93) del SEQ ID No. 1) pueden ser parcial
o completamente suprimidos, parcial o completamente sustituidos por
otros nucleótidos o secuencias de ácido nucleicos, interrumpidos
mediante la inserción de nucleótidos individuales o secuencias de
ácido nucleicos, invertidos parcial o completamente o multiplicados.
Todas estas mutaciones conducen a un cambio en la actividad del
promotor, debido a que las características estructurales y/o los
sitios de reconocimiento/unión p. ej. para los factores de
transcripción resultan afectados por dichas mutaciones. No obstante,
estos cambios pueden conducir a un incremento o disminución de la
actividad del promotor en comparación en el promotor de tipo
salvaje.
Es bien sabido en la técnica anterior que la
multiplicación/duplicación de tramos de ácido nucleico específicos
puede incrementar la actividad del promotor. La regulación de la
expresión génica de muchos promotores eucarióticos, especialmente
promotores de levadura, implica múltiples interacciones entre los
factores de transcripción unidos en un promotor. Se pueden requerir
múltiples sitios para el funcionamiento incluso de los elementos que
actúan en cis más pequeños. En células de levadura, las secuencias
activadoras aguas arriba (UAS) son necesarias para la transcripción.
Funcionan en cualquier orientación y a una distancia variable con
respecto a la caja TATA y el sitio de inicio de la transcripción,
pero en contraste con los intensificadores en eucariotas superiores,
deben estar aguas arriba a partir de estos elementos basales. Las
UAS son dianas de numerosos activadores transcripcionales.
La mayor parte de los fenómenos de represión en
células de levadura resultan de la inactivación o ausencia de
factores de transcripción. Sin embargo, también se pudieron
identificar algunos sitios reguladores negativos (secuencias de
represión aguas arriba (URS)).
Basándose en el análisis de deleción del
promotor de AOX2 de P. pastoris se encontraron tres
regiones reguladoras, dos regiones de acción negativa (URS1 y URS2)
y un dominio de acción positiva (UAS) [3]. Para el promotor de
MOX de H. polymorpha también se describieron dos
secuencia activadoras aguas arriba (UAS1 y UAS2) y un sitio de unión
al represor (URS1) [8]. También se pudieron encontrar las
correspondientes secuencias sobre los promotores de AOX1
(nucleótidos 585 a 614 (-369 a -340) y 725 a 756 (-229 a -198), que
mostraban similitudes con las UAS de AOX2 [3], así como los
nucleótidos 622 a 656 (-332 a -298)[8]). La multiplicación (2, 3, 4,
5, 6 o 7 veces UAS) de estos tramos de ácido nucleico puede dar como
resultado un promotor con una fuerza mayor que conduce a una
expresión de proteínas incluso más potente. Por lo tanto, la
construcción de promotores que comprenden UAS múltiples,
preferiblemente que implican a las regiones de secuencia mencionadas
antes similares a las UAS de AOX2 y MOX, u otros
tramos de secuencia múltiple (p. ej. los intervalos de secuencia de
ácido nucleico esbozados antes) también están dentro del alcance de
la presente invención y se considera que son una realización
preferida. Una secuencia activadora está normalmente a unos pocos
cientos de pares de bases de un promotor. Por ejemplo, la mayor
parte de las secuencias activadoras está a aproximadamente 200 a 400
pares de bases del promotor que está intensificado. Adicionalmente
aguas arriba el promotor contiene normalmente intensificadores y
sitios de unión al factor de transcripción
adicionales.
adicionales.
Al menos una mutación del promotor AOX1 puede
ser introducida mediante métodos convencionales conocidos por el
experto en la técnica (p. ej. Molecular Cloning: A Laboratory Manual
(Tercera Edición), J. Sambrook y D. Russell, 2001, Cold Spring
Harbor Laboratory Press).
De acuerdo con una realización preferida de la
presente invención el sitio de unión del factor de transcripción
(TFBS) se selecciona del grupo que consiste en Hap1, Hsf, Hap234,
abaA, Stre, Rap1, Adr1, Mat1MC, Gcr1 y QA-1F.
La mutación de al menos uno de estos TFBS da
como resultado promotores mutantes con características variables
(véase el ejemplo 2).
Preferiblemente, el sitio de unión al factor de
transcripción (TFBS) Hap1 comprende los nucleótidos 54 (-900) a 58
(-896) del SEQ ID No. 1, Hsf los nucleótidos 142 (-812) a 149 (-805)
y 517 (-437) a 524 (-430) del SEQ No. 1, Hap234 los nucleótidos 196
(-758) a 200 (-754), 206 (-748) a 210 (-744) y 668 (-286) a 672
(-282) del SEQ ID No. 1, abaA los nucleótidos 219 (-735) a 224
(-730) del SEQ ID No. 1, Stre los nucleótidos 281 (-673) a 285
(-669) del SEQ ID No. 1, Rap1 los nucleótidos 335 (-619) a 339
(-615) del SEQ ID No. 1, Adr1 los nucleótidos 371 (-583) a 377
(-577) del SEQ ID No. 1, Mat1MC los nucleótidos 683 (-271) a 687
(-267) del SEQ ID No. 1, Gcr1 los nucleótidos 702 (-252) a 706
(-248) del SEQ ID No. 1 y QA-1F los nucleótidos 747
(-207) a 761 (-193) del SEQ ID No. 1.
Estos TFBS pueden ser identificados
experimentalmente o por comparación con TFBS conocidos de otros
promotores (p. ej. promotores de eucariotas) con la ayuda de
programas de ordenador (p. ej. véase el ejemplo 1).
Un resumen de la influencia de los promotores de
AOX1 mutantes sobre la expresión de proteínas, péptidos o ácido
nucleicos funcionales se proporciona en la tabla 2 (en comparación
con la actividad del tipo salvaje).
\vskip1.000000\baselineskip
Otro aspecto de la presente invención hace
referencia a una molécula de ácido nucleico que comprende un
promotor de alcohol oxidasa 1 (AOX1) de Pichia
pastoris mutante de acuerdo con la presente invención y un ácido
nucleico que codifica una proteína, péptido o ácido nucleico
funcional, donde el promotor y dicho ácido nucleico están conectados
operablemente entre sí.
El promotor de AOX1 mutante puede ser
conectado a un gen que codifica una proteína (p. ej. enzima), un
péptido (p. ej. hormona) o un ácido nucleico funcional (p. ej.
ARNsi). El fragmento de ácido nucleico resultante puede ser
utilizado ara expresar p. ej. una proteína cuando es introducida en
un organismo, preferiblemente una levadura, especialmente una cepa
de Pichia pastoris. La construcción de dicha molécula de
ácido nucleico es bien conocida por el experto en la técnica y puede
ser realizada con métodos de biología molecular convencionales (p.
ej. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Tercera Edición), J.
Sambrook y D. Russell, 2001, Cold Spring Harbor Laboratory Press;
manual "Pichia Expression Kit", Invitrogen Corp.).
"Conectado operablemente" hace referencia a
una primera secuencia o secuencias que están situadas
suficientemente próximas a una segunda secuencia o secuencias de
manera que las primeras secuencias pueden ejercer influencia sobre
las segundas secuencias o una región bajo el control de esa segunda
secuencia. Por ejemplo, un promotor puede estar conectado
operablemente a un gen de manera que el gen sea expresado bajo el
control del promotor, que estará típicamente 5' con respecto al gen.
Normalmente, un promotor núcleo estará a unos pocos cientos de pares
de bases del sitio de inicio de la traducción. Aproximadamente 30 pb
aguas abajo hay normalmente un elemento promotor aguas abajo.
Otro aspecto de la presente invención hace
referencia a un vector que comprende un promotor de alcohol oxidasa
1 (AOX1) de Pichia pastoris mutante de acuerdo con la
presente invención o una molécula de ácido nucleico como se ha
esbozado antes.
Con el fin de introducir el promotor mutante,
opcionalmente conectado operablemente a un ácido nucleico que
codifica una proteína, péptido o ácido nucleico funcional, en un
anfitrión, preferiblemente en una cepa de levadura metilotrófica (p.
ej. una cepa de Pichia pastoris), dicho promotor tiene que
ser proporcionado en un vector, que puede ser utilizado para la
transformación de dicho anfitrión. Por ejemplo, dichos vectores
pueden ser plásmidos episómicos de levadura (YEp), plásmidos de
integración de levadura (YIp) o cromosomas artificiales de levadura.
Tales vectores comprenden normalmente un origen de replicación (si
fuera necesaria la amplificación en anfitriones microbianos) y un
marcador de selección para la propagación de los vectores en E.
coli, promotores y terminadores para la expresión de proteínas
recombinantes en levadura y marcadores de selección para levadura.
Los vectores que no son de integración comprenden adicionalmente una
secuencia replicante autónoma (ARS), que asegura la estabilidad del
vector en la célula (p. ej. Myers, A. M., et al. (1986) Gene
45: 299-310). Los vectores de integración, que no
albergan secuencias AR, comprenden regiones de secuencia que son
homólogas a las regiones del genoma. Alternativamente se puede
utilizar para la transformación ADN lineal, p. ej. originado a
partir de PCR.
Otro aspecto de la presente invención hace
referencia a una célula que comprende al menos un promotor de
alcohol oxidasa 1 (AOX1) de Pichia pastoris mutante,
al menos un fragmento de ácido nucleico o al menos un vector como se
ha descrito en la presente memoria. La introducción de una molécula
de ácido nucleico que alberga un promotor de AOX1 mutante (p.
ej. vector, donde el promotor está conectado operablemente a un
ácido nucleico que codifica una proteína) en un anfitrión se puede
realizar p. ej. mediante electroporación. Dicha molécula de ácido
nucleico es integrada en el cromosoma después de su introducción en
dicho anfitrión en una sola copia o en múltiples copias o presente
en la célula como plásmido replicante autónomo de una sola copia o
de múltiples copias. Si se utilizan varios promotores mutantes,
pueden estar todos conectados con un único gen (que codifica una
proteína o ácido nucleico funcional (p. ej. Ribozima, ARN
antisentido etc.), una proteína idéntica o proteínas diferentes (p.
ej. la variante del promotor 1 está conectada a un marcador de
selección y otro promotor mutante está conectado con otra proteína
que debe ser expresada). Por lo tanto en el alcance de la presente
invención se producen preferiblemente cepas de una sola copia que
comprenden una copia del promotor de AOX1 conectado operablemente a
un ácido nucleico que codifica una proteína, un péptido o un ácido
nucleico funcional así como cepas con múltiples copias que
comprenden más de una, preferiblemente al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8,
9, 10, 15 o 20 copias del promotor de AOX1 conectado operablemente a
un ácido nucleico que codifica una proteína, un péptido o un ácido
nucleico funcional.
De acuerdo con una realización preferida de la
presente invención dicha célula es una célula eucariótica, en
particular una célula de levadura, preferiblemente una célula de
levadura metilotrófica.
Preferiblemente la célula de levadura
metilotrófica se selecciona del grupo que consiste en Candida,
Hansenula, Pichia y Torulopsis, especialmente una célula
de Pichia pastoris.
Los promotores de AOX1 así como sus
variantes mutadas pueden ser introducidos funcionalmente en un
número muy grande de diferentes células de levadura, incluyendo
células metilotróficas (p. ej. Pichia pastoris) y no
metilotróficas (p. ej. Saccharomyces cerevisiae). La
transferibilidad de los promotores a otros organismos, especialmente
promotores de AOX1 y MOX, es conocida por un experto en la
técnica. Aunque la especificidad de sustrato y algunos rasgos
reguladores son diferentes en las diferentes levaduras (p. ej.
Pichia pastoris, Hansenula polymorpha y
Saccharomyces cerevisiae) se demostró un reconocimiento de
los promotores foráneos (p. ej. Raschke, W.C., et al., Gene,
1996. 177:163-7; Pereira, G.G. y C.P. Hollenberg,
Eur J Biochem, 1996. 238:181-91). Por ejemplo, el
promotor de MOX de H. polymorpha es reconocido en
S. cerevisiae, reprimido en presencia de glucosa y
des-reprimido bajo limitación de la fuente de
carbono. De un modo similar el promotor de AOX1 puede ser
empleado en H. polymorpha y está regulado de la misma manera
que el promotor de MOX. El promotor de ZZA1, que está
íntimamente relacionado con el promotor de AOX1 pudo ser empleado
con éxito en S. cerevisiae.
Otro aspecto de la presente invención hace
referencia a un kit para la expresión de una proteína seleccionada o
la transcripción de un ARN funcional, que comprende
- i)
- un vector como se ha definido antes, y
- ii)
- una célula capaz de expresar dicha proteína o ARN funcional bajo el control de un promotor de acuerdo con la presente invención.
\vskip1.000000\baselineskip
El vector de acuerdo con la presente invención
se puede utilizar en un kit para la expresión de una proteína
seleccionada o la transcripción de un ARN funcional (p. ej.
ribozima, ARN antisentido, ARNi).
De acuerdo con una relación preferida de la
presente invención dicha célula es una célula de levadura,
preferiblemente una célula de levadura metilotrófica.
Preferiblemente la célula de levadura
metilotrófica se selecciona del grupo que consiste en Candida,
Hansenula, Pichia y Torulopsis, especialmente una célula
de Pichia pastoris.
Otro aspecto de la presente invención hace
referencia a un método para la expresión de una proteína, péptido o
ácido nucleico funcional recombinantes en una célula que comprende
las siguientes etapas:
- \bullet
- proporcionar un vector o una molécula de ácido nucleico que comprende un promotor de AOX1 de acuerdo con la presente invención y un ácido nucleico que codifica una proteína, péptido o ácido nucleico funcional, estando conectado operablemente dicho promotor a dicho ácido nucleico,
- \bullet
- transformar dicha célula con dicho vector o dicha molécula de ácido nucleico,
- \bullet
- cultivar la célula transformada en un medio de cultivo adecuado,
- \bullet
- opcionalmente inducir la expresión de dicha proteína, péptido o ácido nucleico funcional y
- \bullet
- aislar dicha proteína, péptido o ácido nucleico funcional expresados.
\vskip1.000000\baselineskip
De acuerdo con una realización preferida de la
presente invención dicha célula es una célula de levadura,
preferiblemente una célula de levadura metilotrófica.
Preferiblemente la cepa de levadura
metilotrófica se selecciona del grupo que consiste en Candida,
Hansenula, Pichia y Torulopsis, especialmente una célula
de Pichia pastoris. Otro aspecto de la presente invención
hace referencia al uso de una molécula de ácido nucleico, un vector
o una célula de acuerdo con la presente invención para la expresión
de una proteína, péptido o ácido nucleico funcional.
Cuando se utiliza una molécula de ácido
nucleico, un vector o una célula de acuerdo con la presente
invención para la expresión de una proteína, péptido o ácido
nucleico funcional resulta ventajoso seleccionar un promotor de AOX1
apropiado que satisfaga los requerimientos planteados para la
expresión (p. ej. expresión elevada o constitutiva en condiciones de
des-represión (= sin adición de glucosa al medio) o
en condiciones inducidas por metanol). Los promotores de AOX1
mutantes adecuados pueden ser seleccionados con la ayuda de la tabla
2.
Otro aspecto de la presente invención hace
referencia a un método para el aislamiento de clones de
superexpresión que comprende las etapas de:
- a)
- introducir una molécula de ácido nucleico que comprende al menos un promotor de alcohol oxidasa 1 (AOX1) de Pichia pastoris mutante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 y al menos un ácido nucleico que codifica una proteína (péptido) o un ácido nucleico funcional y un gen de resistencia marcador, donde dicho promotor y dicho ácido nucleico están conectados operablemente entre sí formando una casete de expresión de una sola copia o de múltiples copias que comprende dicha molécula de ácido nucleico en una célula,
- b)
- transferir la célula de la etapa a) a un medio que comprende un marcador selectivo apropiado y una fuente de carbono no represora sin metanol para el crecimiento selectivo de clones de superexpresión en condiciones de des-represión,
- c)
- incubar la célula de la etapa b) en dicho medio,
- d)
- aislar una colonia de la célula obtenida de la etapa c) y
- e)
- detectar clones de superexpresión determinando la tasa de expresión de dicha célula.
\vskip1.000000\baselineskip
La construcción de clones de superexpresión o
expresión elevada que albergan un vector o un ácido nucleico que
comprende un promotor inducible por metanol mutado requiere métodos
que permitan al experto en la técnica aislar estos clones. Semejante
método se proporciona en la presente memoria. La primera etapa de
dicho método es la introducción del promotor que comprende ácido
nucleico (p. ej. vector) en una célula adecuada, que es capaz de
regular dicho promotor. El propio promotor puede ser mutado mediante
ingeniería genética o mediante mutagénesis química (p. ej.
bisulfito, nitrito, ácido fumárico, hidrazina) o física (p. ej.
radiación, especialmente radiación UV). En una etapa adicional las
células que albergan dicho promotor mutado son transferidas a un
medio, preferiblemente un medio sólido directamente o vía un medio
líquido, que comprende un antibiótico (p. ej. Zeocina) y sorbitol (u
otra fuente de carbono no represora como se describe, p. ej. en
[12], en particular alanina, manitol o trehalosa) para el
crecimiento de clones de elevada expresión en condiciones de
des-represión y que comprende metanol adicional, si
se deben descubrir clones de expresión elevada en condiciones
inducidas. Incluyendo glucosa en el medio junto con metanol, los
transformantes inducidos por glucosa no reprimida y metanol pudieron
ser aislados (para evitar la volatilización de metanol el medio
puede ser almacenado durante la incubación en una atmósfera saturada
con metanol o que comprenda metanol). Después del cultivo de las
células en o sobre un medio adecuado, dichas células se aíslan de
dicho medio y se pueden utilizar para un análisis adicional (p. ej.
determinación de la tasa de expresión exacta, aislamiento del
promotor con el fin de analizar los cambios en la secuencia de ácido
nucleico del promotor en comparación con el promotor de tipo
salvaje). Las fuentes de carbono no represoras utilizadas en el
método de acuerdo con la presente invención y descritas, p. ej. en
[12], se emplean preferiblemente en una cantidad de 0,1 a 10%,
preferiblemente en una cantidad de 0,2 a 5%, más preferiblemente en
una cantidad de 0,3 a 3%, en particular en una cantidad de 0,5 a 1%.
Se selecciona una fuente de carbono no represora preferida del grupo
que consiste en alanina, manitol, sorbitol, trehalosa, lactosa y sus
combinaciones.
La selección del gen de resistencia a un
marcador adecuado depende del marcador utilizado para seleccionar
los transformantes. Por ejemplo, si se utiliza Zeocina como marcador
el gen de resistencia al marcador que se va a introducir en el
vector bajo el control del promotor de AOX1 mutante es el gen Sh
ble. Si el ácido nucleico codifica una proteína o un péptido, la
proteína resultante/expresada puede ser una proteína de fusión.
Resulta especialmente ventajoso proporcionar el gen de resistencia
marcador bajo el control del promotor de AOX1 mutante, porque en
semejante caso la tasa de expresión del gen de resistencia marcador
depende también de la fuerza del promotor y del comportamiento del
promotor mutado. Por ejemplo, un promotor fuerte responsable de la
elevada expresión del producto de ácido nucleico también aumentará
la tasa de expresión del producto del gen de resistencia al
marcador. Tales clones tienen una ventaja selectiva sobre los clones
con un promotor que muestra una fuerza del promotor reducida. Esto
permite la selección de clones de superexpresión directamente
después de la regeneración a partir de la transformación de las
células.
La tasa de expresión se determina
preferiblemente mediante métodos como la electroforesis en gel (p.
ej. SDS-PAGE), unión a anticuerpos (p. ej. ELISA),
PCR cuantitativa (transcriptasa inversa) (p. ej.
RT-PCR en tiempo real), actividad enzimática (p. ej.
si la proteína expresada es una enzima) o fluorométricamente
(proteína con un espectro de emisión característico como la proteína
fluorescente verde).
Los promotores (transformantes) que muestran un
incremento de la expresión en ausencia de fuentes de C por lo demás
represoras (en el caso de la glucosa promotora del AOX1) se
seleccionan mediante crecimiento selectivo de células transformadas
en/sobre medio que contiene una fuente de carbono no represora. Los
promotores (transformantes) que muestran un incremento de la
expresión en ausencia de fuentes de C por lo demás represoras (en el
caso de la glucosa promotora de AOX1) en presencia de un inductor
(p. ej. metanol) se seleccionan mediante crecimiento selectivo de
células transformadas en/sobre medio que contiene una fuente de
carbono no represora y el inductor (p. ej. metanol). El inductor
también puede ser una fuente de carbono no represora. Los clones de
superexpresión se seleccionan combinando una copia múltiple que
conduce a una resistencia superior frente a antibióticos (p. ej.
Zeocina) o una productividad superior de un componente del medio
esencial (p. ej. Leu, His, Arg, Ura) con la selección reguladora
descrita más arriba.
Las composiciones de medio que se van a utilizar
en un método de acuerdo con la presente invención se pueden obtener
directamente de fabricantes o distribuidores de kits, células y
vectores relacionados con Pichia Pastoris (p. ej.
Invitrogen). La concentración de metanol en el medio puede ser
preferiblemente de 0,05 a 15%, más preferiblemente de 0,1 a 10%,
concretamente de 0,3 a 5%. En las publicaciones científicas se
describen diferentes concentraciones de metanol para diferentes
condiciones de cultivo. Por ejemplo, los matraces con sacudimiento
pueden contener 1% de metanol o menos (Guarna MM, et al.
(1997) Biotech. Bioeng. 56:279-286), los
procedimientos de fermentación pueden contener 0,5% de metanol
(Damasceno LM, et al. (2004) Protein Expr Purif
37:18-26; Hellwig S., et al. (2001)
Biotechnol Bioeng 74:344-352; Hellwig S., et
al. (1999) Biotechnol Appl Biochem
30:267-275).
La expresión intensificada de clones de
múltiples copias puede depender no solamente de la presencia de más
de una copia del promotor mutado en una célula si no también debido
al hecho de que hay una carencia de varios factores de
transcripción, debido a que estos factores pueden estar unidos al
elevado número de sitios de unión al factor de transcripción en
dicha célula. Esto pudo ser demostrado mediante la comparación de la
tasa de expresión en condiciones de inducción con metanol con la
tasa de expresión en condiciones de des-represión
donde se pudo encontrar que la tasa de expresión intensificada no es
sólo un efecto del número de copias del promotor de AOX1 mutado en
la célula (efecto no lineal). Por ejemplo, la cepa d6*F10 muestra
tales características.
El medio utilizado para aislar clones de
superexpresión puede comprender componentes del medio adicionales
como leucina, uracilo, arginina, histidina y/o adenina y el sorbitol
puede ser cambiado por glucosa con el fin de identificar variantes
del promotor que muestren una represión reducida en presencia de
glucosa en comparación con las variantes de promotor de tipo
salvaje.
Cuando se utilizan cepas auxotróficas, la célula
puede ser transferida a un medio que comprende sorbitol (u otras
fuentes de carbono no represoras) y que contiene componentes del
medio individuales (p. ej. leucina, uracilo, arginina, histidina y
adenina) para el crecimiento selectivo de clones de superexpresión
en condiciones de des-represión empleando marcadores
de auxotrofia (etapa b)).
El marcador de resistencia
P(TEF)-Zeo utilizado comúnmente en los
vectores que comprenden el promotor de AOX1 conduce a la expresión
constitutiva de la proteína de resistencia a zeocina y por lo tato
permite el aislamiento de clones de múltiples copias mediante la
resistencia a concentraciones más altas del antibiótico. El nuevo
método descrito permite combinar este efecto con las características
reguladoras para detectar promotores y clones de múltiples copias
que conducen a una expresión superior en ciertas circunstancias
reguladoras controlables (p. ej. expresión
des-reprimida, expresión inducida etc.). Esto hace
posible detectar nuevos promotores con propiedades reguladoras
alteradas y también clones donde los clones con múltiples copias
conducen a un aumento de la expresión en tales condiciones
reguladoras especiales.
Los "clones de superexpresión" son clones
de expresión que expresan más de una proteína o de un ácido nucleico
funcional bajo el control del promotor mutado que bajo el control
del promotor de tipo salvaje o más de una proteína o ácido nucleico
funcional que aplicando vectores que utilizan normalmente
combinaciones de promotor-marcador de selección
tales como P(TEF)-Zeo. La tasa de expresión
de los "clones de superexpresión" de acuerdo con la presente
invención puede ser incrementada al menos un 20%, preferiblemente al
menos 50%, más preferiblemente al menos 100%, concretamente al menos
500% en comparación con la tasa de expresión de la misma proteína o
péptido o ácido nucleico funcional bajo el control del promotor de
tipo salvaje (valor medio más dos a tres veces la desviación
típica). Los "clones de súper-expresión" pueden
comprender preferiblemente más de una copia del promotor mutado o
molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención.
Alternativamente, los "clones de superexpresión" también pueden
ser denominados "clones de expresión elevada".
De acuerdo con la presente invención los
"promotores inducibles por metanol" son promotores cuya
actividad está regulada por la presencia de metanol en el medio de
cultivo. Tales promotores son preferiblemente los promotores de
AOX1 (de Pichia pastoris) o de MOX (de
Hansenula polymorpha) o cualquier otro promotor inducible por
metanol y reprimido por glucosa derivado de levaduras metilotróficas
tales como p. ej. FMD, FLD, DAS (p. ej. véase la tabla 6, ejemplo
1).
De acuerdo con una realización preferida de la
presente invención el marcador selectivo es un antibiótico,
preferiblemente zeocina.
El marcador selectivo que se va a utilizar en el
medio depende de qué característica molecular de la célula se va a
utilizar para distinguir una célula que alberga el ácido nucleico o
vector que comprende un promotor de tipo salvaje o inducible por
metanol de una célula que no alberga dicho ácido nucleico o vector.
Los marcadores selectivos pueden ser por lo tanto antibióticos (los
genes para la resistencia a antibióticos se pueden encontrar en el
vector o ácido nucleico introducido en dicha célula). Para compensar
la auxotrofia de ciertas cepas el marcador selectivo del medio puede
ser una sustancia como leucina, uracilo, arginina, histidina y
adenina, dependiendo del tipo de auxotrofia.
Preferiblemente, la molécula de ácido nucleico,
el vector y la célula son un ácido nucleico, un vector y una célula
de acuerdo con la presente invención.
De acuerdo con una realización preferida de la
presente invención la molécula de ácido nucleico o el vector son
introducidos en la célula mediante transformación mediante métodos
convencionales conocidos por un experto en la técnica,
preferiblemente electroporación, transformación química, fusión de
protoplastos o mediante bombardeo con partículas (véase p. ej.
Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons,
Editado por: Fred M. Ausubel et al.; Molecular Cloning: A
Laboratory Manual (Tercera Edición), J. Sambrook y D. Russell, 2001,
Cold Spring Harbor Laboratory Press).
La presente invención se ilustra adicionalmente
mediante las siguientes figuras y ejemplos sin estar restringida a
estas. La Fig. 1 muestra la SDS-PAGE de cepas de
P. pastoris que expresan GFP-Zeo a
microescala antes de la inducción con metanol (A) y 24 (B) y 72 (C)
horas después de la inducción. Las muestras se prepararon como se
describe en el ejemplo 1 h). La Calle 1 es X-33
(control negativo), las Calles 2-4 son
X-33 GFP-Zeo cepas Mut^{S} A9, D2
y E2, la Calle 5 es X-33 d6*F10. Se encuentra
presente una fuerte banda a 42 kDa en todos los clones
GFP-Zeo.
La Fig. 2 muestra una perspectiva general de las
deleciones de secuencia en la región del promotor de AOX1 y
algunos sitios de unión al factor de transcripción. Las regiones
delta 1-9 fueron suprimidas mediante PCR de
extensión solapante.
La Fig. 3 muestra un diagrama de barras de la
intensidad de fluorescencia de las variantes del promotor de
AOX1 a microescala después de la
des-represión (agotamiento del carbono). Las células
se hicieron crecer sobre glucosa al 1% a microescala. Los datos
representan la media \pm DT de 4 medidas independientes. RFU:
unidades de fluorescencia relativa; WT: P. pastoris cepa
GFP-Zeo D2 con GFP-Zeo bajo el
control del promotor de AOX1 de tipo salvaje;
D1-D9: cepas de P. pastoris con constructos
de deleción AOX1\Delta 1-\Delta9 delante
del gen GFP-Zeo; EX. longitud de onda de excitación;
EM: longitud de onda de emisión.
La Fig. 4 muestra un diagrama de barras de la
intensidad de fluorescencia de variantes del promotor de AOX1
a microescala después de la inducción con metanol. Las células se
hicieron crecer sobre glucosa 1% a microescala. Los datos
representan la media \pm DT de 4 medidas independientes. RFU:
unidades de fluorescencia relativa; WT: P. pastoris cepa
GFP-Zeo D2 con GFP-Zeo bajo el
control del promotor de AOX1 de tipo salvaje;
D1-D9: cepas de P. pastoris con constructos
de deleción AOX1\Delta 1-\Delta9 delante
del gen GFP-Zeo; EX. longitud de onda de excitación;
EM: longitud de onda de emisión.
La Fig. 5 muestra un diagrama de barras de la
intensidad de fluorescencia de variantes de promotor de AOX1
seleccionadas a microescala. Se muestran los niveles de expresión en
condiciones de des-represión así como de inducción
de cepas con una sola copia y cepas con múltiples copias variantes
de promotor de tipo salvaje y \Delta6. Los datos representan la
media \pm DT de 4 medidas independientes. WT: cepa
GFP-Zeo con una sola copia con el promotor de
AOX1 de tipo salvaje (GFP-Zeo D2), D6: clon
AOX1\Delta6* con una sola copia; WT_E2: clon
GFP-Zeo con múltiples copias con el promotor de
AOX1 de tipo salvaje; D6* F10: clon AOX1\Delta6* con
múltiples copias (X-33 d6F10).
La Fig. 6 muestra el resultado de un ensayo de
gota gruesa de cepas de P. pastoris sobre placas de agar MD y
MDM con distintas concentraciones de Zeocina®. Las células se
hicieron crecer sobre medio BMD (1%) a una DO_{595} de 1,5, se
diluyeron en etapas de 10 a una tasa de dilución final de 10^{5} y
se transfirieron a las placas de agar utilizando un replicador de 48
agujas. Los números de la parte superior del cuadro indican el
factor de dilución que es el mismo para todas las placas. Se preparó
medio MD como se ha descrito antes. Se añadió metanol a las placas
de MDM-Zeo a una concentración final de
aproximadamente 0,5%. Se añadió Zeocina® a concentraciones finales
de 100, 200 y
500 \mug/ml, respectivamente. X-33: P. pastoris X-33, A9: P. pastoris GFP-Zeo Mut^{S} A9, D2: P. pastoris GFP-Zeo D2, E2: P. pastoris GFP-Zeo E2.
500 \mug/ml, respectivamente. X-33: P. pastoris X-33, A9: P. pastoris GFP-Zeo Mut^{S} A9, D2: P. pastoris GFP-Zeo D2, E2: P. pastoris GFP-Zeo E2.
La Fig. 7 muestra el nivel de expresión de
varias cepas con múltiples copias en comparación con cepas de
referencia; a) actividad en condiciones de
des-represión; b) actividad después de la inducción
con metanol.
La Fig. 8 muestra el nivel de expresión de cepas
de múltiples copias \Delta6* en condiciones de
des-represión e inducidas en comparación con las
cepas de referencia.
\vskip1.000000\baselineskip
Se han utilizado varios kits de preparación y
purificación de ADN disponibles en el mercado de acuerdo con los
manuales suministrados (véase Tabla 3).
\vskip1.000000\baselineskip
Se realizó la clonación TOPO® de acuerdo con los
manuales suministrados (para clonar en
pCR®4Blunt-TOPO® y para clonar en pCR®-Blunt
II-TOPO®). Siempre se utilizaron 4 \mul de
producto de PCR para la clonación. Se transformaron 2 y 4 \mul de
cada reacción de clonación en células de E. coli TOP10F'
químicamente competentes (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA, USA) de
acuerdo con los protocolos mencionados antes.
\vskip1.000000\baselineskip
La transformación de las reacciones de ligación
y los plásmidos en E. coli se realizó de acuerdo con el
Protocolo SEM (método simple y eficaz) [16]. Se utilizaron células
E. coli TOP10F' químicamente competentes para la
transformación.
\vskip1.000000\baselineskip
Preparación de células de Pichia pastoris
competentes: Se utilizó una única colonia de la cepa anfitriona de
Pichia pastoris deseada para inocular 50 ml de YPD (glucosa
al 2%) en un matraz Erlenmeyer de cuello ancho con pantalla de 300
ml. Después de incubar durante la noche a 30ºC, con una humedad del
60% y a 130 rpm (Pilot Shake® RC-2 TE), se utilizó
un cierto volumen de este pre-cultivo para inocular
200 ml de YPD (glucosa al 2%) en un matraz Erlenmeyer con cuello
ancho con pantalla de 2 l a una densidad óptica de aproximadamente
0,1 a 595 nm (DO 595). El cultivo se hizo crecer en las mismas
condiciones que el pre-cultivo a una densidad óptica
de 1,0 a 1,5. Las células se sedimentaron a 4ºC y 4000 rpm durante
10 minutos y se resuspendieron en 200 ml de agua estéril enfriada
con hielo. Este procedimiento se repitió 3 veces con
re-suspensión de las células en 100 ml de agua, 10
ml de sorbitol 1 M y 0,5 ml de sorbitol 1 M, respectivamente.
Se linealizaron 10 \mug del plásmido deseado
con BglII y NotI (50 u cada una) durante la noche en un
volumen final de 300 \mul. Después de la digestión con las enzimas
de restricción el ADN se hizo precipitar en EtOH y acetato de sodio
0,3 M de acuerdo con un protocolo convencional [16]. El ADN se
disolvió en 11 \mul de ddH_{2}O estéril y se eliminaron las
sales utilizando un Filtro de Membrana MF-Millipore®
(véase Tabla 12) durante aproximadamente 1-2 h. Si
se utilizaba el producto de la PCR para la transformación se
procesaban aproximadamente 4-5 \mug de ADN como se
ha descrito antes empezando en la precipitación con EtOH.
Para cada transformación se mezclaron 80 \mul
de las células preparadas con 10 \mug de ADN como se ha descrito
antes y se incubaron durante 5 minutos sobre hielo. La mezcla se
transfirió a cubetas de electro-transformación
enfriadas con hielo (Bio-Rad) y se pulsaron a 200
\Omega, 25 \muF y 2,5 kV. Se añadió inmediatamente 1 ml de
sorbitol 1 M enfriado con hielo. La suspensión se transfirió a un
tubo PP de 12 ml estéril (Greiner, Frickenhausen, Alemania, núm.
184261) y se incubó durante 2 horas a 30ºC sin sacudimiento. Después
de esta fase de regeneración se cultivaron en placa alícuotas sobre
placas de selección. Para la selección de transformantes con una
expresión elevada en condiciones de inducción, las células se
cultivaron en placa sobre placas de MSM-Zeo que
contenían medio mínimo con sorbitol (o cualquier otra fuente de
carbono no represora), metanol y zeocina. Para la selección de
clones que mostraban una expresión elevada en condiciones de
des-represión, las células pueden ser cultivadas en
placa sobre placas con sorbitol-zeo mínimo carentes
de metanol. La inclusión de glucosa en placas de selección que
contienen metanol permite la detección de clones de expresión no
reprimidos por glucosa y sus promotores.
\vskip1.000000\baselineskip
Se resuspendió una única colonia de la cepa de
Pichia deseada en 100 \mul de ddH_{2}O en un microtubo de
100 \mul y se calentó durante 5 a 10 minutos a 95ºC. Después de la
centrifugación a 13.200 rpm durante 1 minuto se utilizaron 10 \mul
de sobrenadante como molde para la reacción de PCR. Se utilizaron 5
\mul de esta primera ronda de PCR como molde para una segunda. Se
utilizaron 5 \mul de la segunda ronda de PCR para un gel de
control. Las reacciones de PCR contenían 10 pmoles de cada cebador
(AOX1_col y GFPrev), 200 \muM de cada dNTP y 2,5 unidades de ADN
Polimerasa Hot Star Taq® (QIAGEN) o ADN polimerasa de Taq (Promega)
en condiciones de tampón de acuerdo con los manuales suministrados
en un volumen final de 50 \mul. Para la secuenciación se purificó
el producto de la segunda PCR utilizando un Kit de Purificación por
PCR QIAquick®.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La cepa de P. pastoris deseada se hizo
crecer durante la noche en 5 ml de YPD en un tubo PP de 12 ml
estéril sobre un barril de rotación a 30ºC a una DO a 595 final de
5-10. Se utilizaron 1,5 ml del cultivo para el
aislamiento de ADN utilizando el Easy-DNA® Kit de
acuerdo con el protocolo suministrado.
\vskip1.000000\baselineskip
La medida de la concentración de proteína en
solución se ha utilizado durante mucho tiempo en bioquímica. Una de
sus principales aplicaciones consiste en la normalización de una
amplia variedad de métodos bioquímicos para la cantidad total de
proteína como se realiza en el presente caso para las tasas de
consumo de oxígeno. Las vías más comúnmente utilizadas para
determinar las concentraciones de proteína son los métodos de
Bradford, Lowry y BCA®. Estos métodos tienen limitaciones definidas
con respecto a la sensibilidad, el intervalo dinámico y la
compatibilidad con reactivos específicos. Entre estos 3 análisis,
los del Bradford y Lowry son más fiables y reproducibles que el de
BCA®. Por otra parte los de Lowry y Bradford poseen graves
limitaciones cuando se encuentran presentes detergentes y/o agentes
reductores lo que da como resultado valores del blanco elevados. De
este modo el análisis BCA® es el método de elección después de la
lisis química. Se determinaron las concentraciones de proteína
utilizando el análisis BCA® después de la lisis celular química con
Y-Per® y BSA como patrón de acuerdo con el manual de
instrucciones (Pierce Biotechnology Inc.) por lo tanto solamente las
etapas principales se describirán brevemente más abajo. Se
centrifugaron 200 \mul de los cultivos a 4.000 rpm y 4ºC durante 5
minutos. Después de descartar el sobrenadante, el sedimento se
resuspendió en 100 \mul Y-Per® pipeteando arriba y
abajo. La suspensión se incubó en microtubos de 1,5 ml en un
Termomezclador a la temperatura ambiente y a 600 rpm durante 20
minutos. Después de que los desechos celulares fueran sedimentados a
13.200 rpm y a la temperatura ambiente durante 10 minutos, el
sobrenadante fue transferido a un nuevo microtubo y almacenado a 4ºC
para el análisis BCA® o SDS-PAGE. Se mezclaron 25
\mul de muestra en un pocillo de microplaca con 200 \mul de
reactivo de trabajo de BCA® (reactivo A:reactivo B = 50:1), se agitó
cuidadosamente durante 30 segundos y se cubrió herméticamente con
selladores de placa (Promega). Después de incubar durante 30 minutos
a 37ºC y enfriar a la temperatura ambiente se determinó la absorción
a 562 nm utilizando un lector
de placa Spectramax Plus 384. Cuando fue necesario, se diluyeron las muestras con ddH_{2}O antes del análisis BCA.
de placa Spectramax Plus 384. Cuando fue necesario, se diluyeron las muestras con ddH_{2}O antes del análisis BCA.
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Se prepararon muestras para
SDS-PAGE mediante lisis celular química utilizando
Y-Per® como reactivo como se describe en la sección
anterior. Se mezclaron 10 \mul de producto lisado con 10 \mul de
2x SSB (tampón para muestra Sigma) y se incubaron a 95ºC durante
5-10 min y se cargaron 15 \mul de esta mezcla
sobre gel de proteína. Se realizó la electroforesis con 180 V
durante aproximadamente 1 h y se detectaron bandas de proteína
utilizando tinción con azul de Coomassie®.
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\vskip1.000000\baselineskip
Se determinaron las concentraciones de glucosa
utilizando el método de UV Hexoquinasa con Glucosa sin
desproteinización (DIPRO med Handels GmbH, Weigelsdorf, Austria,
Prod. núm. D590522). Se transfirieron 50 \mul de cultivos de
Pichia a una microplaca de PCR y se centrifugaron a 4.000 rpm
durante 5 minutos. Se añadieron 10 \mul de sobrenadante a 190
\mul de reactivo de hexoquinasa en una microplaca
UV-Star y se incubaron a la temperatura ambiente
durante 15 minutos. Después de la incubación se midió la absorción a
340 nm utilizando un lector de placa Spectramax Plus 384.
\vskip1.000000\baselineskip
Se hicieron crecer cepas de P. pastoris
en BMD (1%) a una DO595 final de 1,5 y se diluyeron en etapas de 10
a una tasa de dilución final de 10^{5}. La transferencia sobre
placas de agar se realizó con un replicador de 48 agujas. Las placas
se incubaron a 30ºC hasta que aparecieron colonias (normalmente 2
días sobre placas MD).
\vskip1.000000\baselineskip
Todos los alineamientos de secuencia se
realizaron utilizando MultAlin en la página de inicio de INRA
(Institut National de la Recherche Agronomique, Paris, Francia)
(prodes.toulouse.inra.fr/multalin/multalin.html) [17] o con ClustalW
en el European Bioinformatics Institute (EBI,
www.ebi.ac.ch/clustalw) [18]. Para la comparación de secuencias con
MultAlin siempre se utilizó la matriz de similitud de secuencias de
ADN para la comparación.
Los genes de la ruta de utilización del metanol
y la mayoría de los genes peroxisómicos están regulados de una
manera similar con respecto a la represión por glucosa, la
des-represión en el agotamiento de carbono y la
inducción por medio de metanol. Una regulación transcripcional
similar con un grupo definido de factores de transcripción
(represores así como inductores) debe ser responsable de este patrón
de regulación. Los sitios de unión al factor de transcripción en
estas regiones promotoras deben mostrar algunas regiones
conservadas. El alineamiento de secuencias múltiples entre las
regiones promotoras de genes co-regulados debe
revelar los sitios de unión conservados de los factores de
transcripción implicados en la regulación de los genes convenientes.
Se informó de que varios genes de las levaduras metilotróficas P.
pastoris, H. polymorpha y C. boidinii estaban
co-regulados y sus secuencias promotoras fueron
aisladas (Tabla 6).
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\vskip1.000000\baselineskip
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(Tabla pasa a página
siguiente)
\newpage
Se realizó el análisis del factor de
transcripción con MatInspector Release professional 6.1 Enero 2003
en el GenomatixSuite 1.6.1 de Genomatix Software GmbH Servers [15].
Se utilizó la secuencia PAOX1 de pPICZ B para investigar los sitios
de unión al factor de transcripción empleando Matrix Family Library
Version 3.1.1 Abril 2003 grupo ALL fungi.lib (www.genomatix.de).
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
Ejemplo
1.1
Se utilizó GFP-Zeo como
informador para la expresión del gen dirigida por variantes del
promotor de AOX1. Se construyeron las secuencias circundantes del
codón de inicio ATG para satisfacer los requerimientos mínimos de
las secuencias consenso de Kozak para los genes altamente expresado
en levadura. Para cambiar las regiones promotoras delante del gen
GFP-Zeo se insertó un sitio de restricción EcoRI
(Tabla 8) mediante PCR de extensión solapante.
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La producción basada en la PCR de los
componentes del sistema informador P(AOX1) fue amplificada
utilizando 10 ng del vector pPICZ-B ARS1 como molde.
La reacción también contenía 10 pmoles de cada cebador
(P(AOX1)forw y P(AOX1)rev, respectivamente), 200
\muM de cada dNTP y 2,5 U de polimerasa Synergy® en condiciones de
tampón apropiadas en un volumen final de 50 \mul.
Se amplificó AOX1 TT de un modo similar al
promotor de AOX1. Se utilizaron AOX1TTforw y AOX1TTrev como
cebadores en esta reacción. Ambas reacciones de PCR se llevaron a
cabo en un termociclador durante 30 ciclos (95ºC, 1 min; 55ºC, 30 s;
68ºC, 2 min 30 s) con una etapa de desnaturalización inicial de 5
min a 95ºC y una etapa de extensión final de 10 min a 68ºC. Se
utilizaron 2 \mul de la primera PCR para la amplificación en una
segunda ronda en las mismas condiciones que antes. La única
diferencia fue un incremento en la temperatura de extensión hasta
72ºC.
Se amplificó GFP-Zeo [19]
utilizando 25 ng del vector pTracer®-CMV2 como molde. La reacción
también contenía 10 pmoles de cada cebador (GFP-Zeo
forw y GFP-Zeo rev, respectivamente), 200 \muM de
cada dNTP y 2,5 U de polimerasa Synergy® en un tampón apropiado en
un volumen final de 50 \mul. La PCR se realizó en un termociclador
(véase Tabla 8) durante 30 ciclos (95ºC, 1 min; 55ºC, 30 s; 72ºC, 2
min 30 s) con una etapa de desnaturalización inicial de 5 min a 95ºC
y una etapa de extensión final de 10 min a 72ºC.
Todos los productos de la PCR se purificaron
mediante electroforesis en gel de agarosa antes de la PCR de
extensión solapante. La reacción contenía 10 ng de P(AOX1), 5
ng de AOX1 TT y 50 ng de GFP-Zeo preparados como se
ha descrito antes como moldes, 200 \muM de cada dNTP y 2,5 U de
polimerasa Synergy® en condiciones de tampón apropiadas en un
volumen final de 50 \mul. La PCR se realizó en un termociclador
(véase Tabla 8) durante 30 ciclos (95ºC, 1 min; 53ºC, 50 s; 68ºC, 3
min 30 s) con una etapa de desnaturalización inicial de 5 min a 95ºC
y una etapa de extensión final de 10 min a 68ºC. Después de 10
ciclos se añadieron 10 \mul de una mezcla que contenía 10 pmoles
de los cebadores externos P(AOX1)forw y AOX1TTrev, de
nuevo 200 \muM de cada dNTP y 2,5 U de polimerasa Synergy® en
condiciones de tampón apropiadas. La PCR se continuó como se había
programado después de esta adición. El producto de la PCR obtenido
con el tamaño deseado de aproximadamente 2,4 kb se purificó sobre un
gel de agarosa. El producto purificado se clonó en un vector
pCR®4Blunt-TOPO® y se secuenció. La secuenciación
reveló 4 mutaciones y una deleción en el constructo informador.
El sitio de deleción del par de bases se
encontró en la posición -15 de la secuencia promotora original.
Puesto que esta posición estaba en el sitio de clonación múltiple de
todos los vectores pPICZ (A, B y C; dentro del sitio de restricción
SfuI) la deleción no debe influir en la actividad del promotor y por
lo tanto no fue corregida. La primera mutación (T- ->C) se
encontró en la región promotora en la posición -828. Las otras 3
mutaciones se encontraron dentro de la secuencia codificante
GFP-Zeo en las posiciones +122, +507 y +1075,
respectivamente.
La conversión G- ->A en la posición
+122 cambia el codón GGA de Gly a un codón GAA que da como resultado
un cambio de aminoácido G41A. La conversión T- ->C en +507
es una mutación silenciosa que cambia solamente un codón de R169. La
última mutación (T- ->C) de la posición +1075 cambia el
codón de terminación TGA al codón de Arginina CGA. Las mutaciones
-828, +122 y +1075 fueron reparadas con el kit de mutagénesis
dirigida a múltiples sitios QuikChange® tras la construcción del
vector pAOX. La mutación silenciosa en la posición +507 y la
mutación en el poliligador no fueron cambiadas puesto que no
introducían ningún codón raro.
Se construyó pAOX separando por corte el
fragmento
P_{AOX1}-GFP-Zeo-AOX1TT
del vector pCR®4Blunt-TOPO® con KpnI y
NotI e insertándolo en el vector pBlueScript® SK entre los
sitios KpnI y NotI.
Las mutaciones encontradas en el promotor
AOX1 y la secuencia de GFP-Zeo fueron
corregidas utilizando el kit de mutagénesis dirigida a múltiples
sitios QuikChange® (Stratagene, Amsterdam, Países Bajos). La
reacción de PCR se realizó de acuerdo con el manual suministrado que
contenía 100 ng de pAOX, 100 ng de cebadores mutagénicos (423dir,
1372forw y 2325dir, respectivamente) y 1 \mul de combinación de
múltiples enzimas QuikChange® en condiciones de tampón apropiadas en
un volumen final de 25 \mul en un termociclador durante 30 ciclos
(95ºC, 1 min; 55ºC, 1 min; 65ºC, 10 min 30 s) con una etapa de
desnaturalización inicial de 1 min a 95ºC. La digestión con DpnI y
la transformación química en células E. coli
XL10-GOLD® (Invitrogen Corp.) se realizaron de
acuerdo con el manual suministrado. La corrección de las 3
mutaciones se verificó mediante secuenciación.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1.2
Se sintetizaron los brazos izquierdos del
promotor de AOX1 utilizando P(AOX1)forw como
cebador directo y AOX n rev (n=1...9) como cebadores inversos. Los
brazos derechos se sintetizaron con 10 pmoles de AOX n forw
(n=1...9) como cebadores directos y P(AOX1)rev como
cebador inverso. Todos los brazos se sintetizaron utilizando 12 ng
del vector pAOX como molde y 10 pg de cada cebador. La reacción
también contenía 10 pmoles de cada cebador, 200 \muM de cada dNTP
y 0,6 U de ADN polimerasa Pwo en condiciones de tampón
apropiadas en un volumen final de 50 \mul. La PCR se realizó en un
termociclador durante 30 ciclos (95ºC, 1 min; 55ºC, 1 min; 68ºC, 1
min 30 s) con una etapa de desnaturalización inicial de 5 min a 95ºC
y una etapa de extensión final de 10 min a 68ºC. Todos los brazos
fueron purificados en gel de agarosa antes de su uso como molde para
la PCR de extensión solapante.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
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La reacción contenía 10 ng de cada brazo
preparado como se ha descrito antes como moldes, 200 \muM de cada
dNTP y 0,6 U de ADN polimerasa Pwo en condiciones de tampón
apropiadas en un volumen final de 50 \mul. La PCR se realizó en un
termociclador durante 30 ciclos (95ºC, 45 s; 60ºC, 45 s; 68ºC, 2
min) con una etapa de desnaturalización inicial de 5 min a 95ºC y
una etapa de extensión final de 10 min a 68ºC. Después de 10 ciclos
se añadieron 20 \mul de una mezcla que contenía 10 pmoles de los
cebadores externos P(AOX1)forw y
P(AOX1)inv, de nuevo 200 \muM de cada dNTP y 0,6 U
de ADN polimerasa Pwo en condiciones de tampón apropiadas. La
PCR se hizo continuar como se había programado después de la adición
de la mezcla.
Los productos de la PCR obtenidos con el tamaño
deseado de aproximadamente 898-947 pb se purificaron
sobre un gel de agarosa y se clonaron en el vector
pCR®4Blunt-TOPO® (\Delta2, \Delta4, \Delta5,
\Delta7 y \Delta8) o pCR®-Blunt II-TOPO®
(\Delta1, \Delta3, \Delta6 y \Delta9) y se secuenciaron.
Se construyeron los vectores pAOX\Delta
separando por corte los fragmentos P_{AOX1}\Delta de los
vectores TOPO® con BglII y EcoRI e insertándolos en el
vector pAOX entre los sitios BglII y EcoRI en lugar
del promotor de AOX1 de tipo salvaje. Los vectores
resultantes se verificaron mediante secuenciación.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1.3
La transformación en Pichia pastoris se
llevó a cabo como se ha descrito antes. La selección para la
Integración de P_{AOX1} (o
P_{AOX1}\Delta)-GFP-Zeo-AOX1
TT se realizó diseminando las células de Pichia transformadas
y regeneradas en alícuotas sobre placas de agar
MSM-Zeo.
Las cepas de Pichia pastoris se hicieron
crecer en placas de pocillos profundos que contenían 300 \mul de
BMD (1%) por pocillo a 28ºC, 320 rpm y 80% de humedad durante 60
horas a la temperatura ambiente. Después de este momento, se tomaron
50 \mul para la determinación de la fluorescencia GFP. Se realizó
la inducción añadiendo 250 \mul de BMM2/pocillo seguido de una
incubación adicional de 72 h. Se rellenó con metanol añadiendo 50
\mul de BMM10 después de 10, 24 y 48 horas. Una vez más se midió
la fluorescencia GFP a las 72 horas de la inducción con metanol.
Análisis de la expresión de la enzima
informadora. Se analizó la expresión de GFP-Zeo en
Pichia pastoris mediante detección de la fluorescencia de GFP
en el lector de placa Spectramax Gemini XS con excitación a 395 nm y
emisión a 507 nm. Se diluyeron 50 \mul de cultivos de P.
pastoris cultivados en placas con pocillos profundos como se ha
descrito antes 1+3 con ddH_{2}O en placas de microtitulación FIA.
Debido a la cantidad limitada de muestra solamente se realizaron
medidas individuales. Todas las medias \pm desviaciones típicas
dadas se calculan a partir de al menos 2 cultivos diferentes
(pocillos).
Si la casete de integración está integrada en el
locus AOX1 sin remplazar el gen AOX1, la cepa de
Pichia recombinante es capaz de crecer sobre metanol con la
velocidad del tipo salvaje, mientras la sustitución del gen
AOX1 con un doble cruzamiento da como resultado una tasa de
crecimiento mucho más lenta sobre metanol. Estos dos fenotipos de
crecimiento se denominan utilización de metanol más (Mut^{+}) y
utilización de metanol lenta (Mut^{S}), respectivamente. Para el
análisis del fenotipo de utilización del metanol, se transfirieron
cultivos a microescala de Pichia pastoris a placas de agar MM
y MD utilizando un replicador de 96 agujas y se incubaron a 30ºC
durante 2 días. Después de 2 días aparecieron colonias en ambas
placas si la cepa de Pichia posee fenotipo Mut^{+} mientras las
cepas fenotípicas Mut^{S} solamente aparecieron sobre las colonias
de las placas MD.
Se analizaron todas las cepas de Pichia
que derivan de transformaciones de pAOX o uno de los plásmidos
pAOX\Delta mediante PCR de colonias y también se secuenciaron los
constructos de deleción para asegurar la secuencia del promotor
delante del gen informador (GFP-Zeo).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1.4
Si bien la mutagénesis por PCR sobre las
regiones codificantes de los genes está bien desarrollada y
establecida no se sabe nada de la mutagénesis en las regiones
promotoras. Debido a la carencia de conocimiento se realizaron
varias condiciones de mutagénesis: Para minimizar la predisposición
en el espectro mutacional, se utilizaron dos polimerasas diferentes,
una ADN polimerasa de Taq y la ADN polimerasa Mutazyme® (Stratagene
Inc.). Debido al hecho de que se carece completamente del
conocimiento de la frecuencia de mutación para la evolución de las
secuencias promotoras, se sometieron a ensayo varias frecuencias de
mutación (teóricamente de 1 a \sim14/kb).
Mutagénesis utilizando ADN polimerasa Hot Star
Taq®: Se realizó una PCR mutagénica sobre la secuencia promotora en
un volumen de reacción de 100 \mul de acuerdo con [20]. La
reacción contenía 12 ng de pAOX, 40 pmoles de cada cebador,
(P(AOX1)forw y P(AOX1)inv), dNTP (dGTP
200 \muM, dATP 200 \muM, dTTP 1 mM, dCTP 1 mM) y 5 U de ADN
polimerasa Hot Star Taq® en condiciones de tampón apropiadas. La
concentración de MgCl_{2} se incrementó a 7 mM (normalmente 3 mM)
para alterar la tasa de error de la polimerasa. La PCR se realizó en
un termociclador durante 30 ciclos (95ºC, 45 s; 55ºC, 45 s; 72ºC, 1
min 30 s) con una etapa de desnaturalización inicial de 15 min a
95ºC y una etapa de extensión final de 10 min a 72ºC.
Se realizó el kit de mutagénesis al azar
GeneMorph® sobre la secuencia del promotor en un volumen final de 50
\mul de acuerdo con el manual suministrado. Se utilizaron
diferentes cantidades del vector pAOX como molde (véase la Tabla
10). Se utilizaron 12,5 pmoles de cada cebador,
P(AOX1)forw y P(AOX1)rev. La reacción de
PCR se llevó a cabo en un termociclador durante 30 ciclos (95ºC, 30
s; 55ºC, 30 s; 68ºC, 1 min 30 s) con una etapa de desnaturalización
inicial de 1 min a 95ºC y una etapa de extensión final de 10 min a
68ºC.
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Se realizó una primera ronda de mutagénesis con
las condiciones descritas antes (Taq, 3x GeneMorph®). Para obtener
una frecuencia de mutaciones mayor se utilizó la reacción GeneMorph®
núm. 3 como molde para una segunda ronda de PCR. Se utilizaron Taq y
GeneMorph® condiciones núm. 2 y núm. 3.
Antes de la transformación en células de
Pichia pastoris X-33 GFP-Zeo
Mut^{S} A9, todas las reacciones de PCR se precipitaron y se
sometieron a eliminación de las sales como se ha descrito antes. Se
utilizó el procedimiento de transformación y regeneración
convencional. La selección de promotores inducidos en medio con
glucosa se realizó diseminando alícuotas de 150 \mul de suspensión
de células transformadas en placas de agar MD que contenían
100-500 \mug/ml de Zeocina® e incubación a 30ºC
durante 2 días.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1.5
Hasta la fecha, se encuentra en uso una gran
variedad de variantes de GFP en la biología molecular. Aunque
difieren solamente en unas pocas mutaciones puntuales, sus
características difieren enormemente. Aparte de unas propiedades de
plegamiento mejoradas, sus espectros de fluorescencia así como sus
rendimientos cuánticos y por lo tanto intensidades difieren mucho.
Las proteínas fluorescentes verdes pueden ser divididas en dos
grupos principales, dependiendo de su máximo de excitación:
variantes de GFP de tipo salvaje con un máximo de excitación a 395
nm y un máximo menor a 470 nm, y variantes de GFP desplazadas al
rojo con un máximo de excitación a 480-490 nm. De
acuerdo con su secuencia de aminoácidos, la
ciclo-3-GFP pertenece al grupo de la
variante de GFP de tipo salvaje con un máximo de excitación a 395
nm.
Para controlar las propiedades espectrales
cuando se expresan en Pichia pastoris se determinaron los
espectros de fluorescencia. El máximo de excitación global del
ciclo-3-GFP en
GFP-Zeo es de 395 nm, mientras el segundo máximo a
478 nm es evanescente. El espectro de emisión revela un máximo de
emisión de 510 nm. De las dos longitudes de onda de excitación
sugeridas por el manual se prefiere 395 nm y se utilizó para todas
las medidas adicionales.
La auto-absorción es un fenómeno
muy frecuente en la espectroscopía de fluorescencia. A elevadas
concentraciones de fluoróforo, los fotones emitidos en una región
solapante del espectro de absorción (excitación) pueden ser
absorbidos (transferencia de energía radiactiva). Se observará una
intensidad de fluorescencia menor si se produjera
auto-absorción (efecto de filtro interno de
emisión). Esto conduce a una infra-estimación de las
actividades del promotor. Sin efecto de filtro interno la intensidad
de fluorescencia aumenta de una manera lineal a medida que aumenta
el fluoróforo. Por consiguiente se sometieron a ensayo los volúmenes
crecientes de células de Pichia pastoris que expresan
GFP-Zeo en busca de su actividad de
fluorescencia.
Hasta 3.000 RFU no fue detectable efecto de
filtro interno de emisión a nivel de la célula. La
auto-absorción en las células, ocasionada por la
acumulación de GFP, no pudo ser evaluada. Se detectó un incremento
lineal en la fluorescencia a lo largo de las 72 horas completas de
la fase de inducción. Por esa razón parece que no es probable un
efecto de filtro interno dentro de las células. De este modo la
acumulación de GFP-Zeo dentro del núcleo no es
problema para su cuantificación. No se produce efecto de filtro
interno en el intervalo de actividades del promotor de una sola
copia determinadas en este estudio. Debido a la carencia de
auto-absorción no es probable que se produzca
infra-estimación de las actividades del promotor. El
efecto de filtro interno observado por otros está causado muy
probablemente por el uso de una variante de GFP diferente con un
desplazamiento de Stokes y por lo tanto una excitación solapante y
un espectro de emisión mucho más pequeños. Se debe ser cuidadoso
cuando se comparan los resultados de los experimentos de expresión
de GFP. El uso de varias variantes de GFP con distintas propiedades
espectrales, pero también con usos codónicos optimizados y por lo
tanto niveles de expresión bastante diferentes en los diferentes
anfitriones, complica la comparabilidad de los resultados de
diferentes laboratorios.
\vskip1.000000\baselineskip
Se realiza normalmente un cultivo a pequeña
escala de células microbianas (p. ej. levadura, bacteria) en
cultivos en matraz con sacudimiento. La inoculación y cultivo de
grandes genotecas microbianas en matraces con sacudimiento son
laboriosos y consumen mucho tiempo, dando como resultado unos costes
elevados. En los últimos años se han desarrollado sistemas de
cultivo a micro-escala utilizando placas de
microtitulación con pocillos profundos como alternativa. Debido a la
manipulación paralela p. ej. de 96 o 384 cepas/cultivos y al menor
material necesario, los sistemas de microtitulación son superiores a
los matraces con sacudimiento en términos de trabajo, tiempo y por
lo tanto intensidad de los costes. Debido a varias razones, las
principales desventajas de los sistemas de microtitulación, el
pequeño volumen de las muestras y la baja eficacia de aireación, son
menos relevantes: (1) los avances técnicos en los sistemas
analíticos conducen a límites de detección inferiores de un gran
número de compuestos que dan como resultado la necesidad de
volúmenes de muestra muy pequeños; (2) los métodos y dispositivos
para el crecimiento en placas de microtitulación de pocillos
profundos también se mejoraron. Se ha demostrado en algunos estudios
que las tasas de aireación y por lo tanto las condiciones de
crecimiento en las placas de microtitulación son similares a las de
los matraces con sacudimiento. También se ha demostrado que en
estudios en tiempo real con el promotor de GAL1 en S.
cerevisiae utilizando
ciclo-3-GFP como proteína
informadora coinciden con los estudios en matraces con
sacudimiento.
La expresión de GFP-Zeo
conducida por el promotor de AOX1 se estudió en placas de
microtitulación de pocillos profundos como se ha descrito antes.
Después del crecimiento celular sobre glucosa sigue una fase de
inducción con metanol como fuente de carbono y energía. La inducción
del promotor de AOX1 con metanol en células de Pichia
pastoris que poseen la casete de expresión
PAOX1-GFP-Zeo-AOX1
TT condujo a un rápido incremento en la fluorescencia con GFP. Hasta
las 72 horas la fluorescencia por GFP aumentó de un modo lineal. La
expresión de GFP-Zeo continuaría si se añadiera
metanol. Si no, el metanol se agota por evaporación y el consumo en
24 horas y la expresión de GFP-Zeo disminuye hasta
un nivel des-reprimido.
El incremento en la fluorescencia por
GFP-Zeo también está de acuerdo con la proteína
GFP-Zeo como se demostró mediante
SDS-PAGE. Tras la inducción con metanol apareció una
banda de proteína de aproximadamente 42 kDa que se volvió más
intensa a medida que aumentó la fluorescencia. La fuerte banda a 42
kDa se encontró en todos los clones de GFP-Zeo
mientras en el control negativo (X-33 tipo salvaje)
no apareció banda. También en la muestra de X-33
d6*F10 después de 72 horas de inducción con metanol se encontró una
fuerte banda (Fig. 1C, Calle 5). Aunque no normalizada, es evaluable
una clara correlación entre las intensidades de las bandas de 42 kDa
y los niveles de fluorescencia apropiados.
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Como se ha descrito antes, las secuencias
consenso para los sitios de unión de varios factores de
transcripción son conocidas. El análisis de secuencia de la
secuencia del promotor de AOX1 reveló varios supuestos sitios de
unión al factor de transcripción, con unas pocas dianas de especial
interés. Entre el factor de choque térmico y el motivo del elemento
de respuesta al estrés, se encontraron sitios de unión de unos pocos
factores de transcripción conocidos generalmente por estar
implicados en la regulación de la glucosa. Los sitios de unión más
interesantes se resumieron en la Tabla 11 y en la Fig. 2.
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Se describen en la literatura varias secuencias
que están implicadas en la regulación de genes inducibles por
metanol. Basándose en el análisis de deleción del promotor de
AOX2 de P. pastoris se describieron tres regiones
reguladoras, dos regiones de acción negativa (URS1 y URS2,
secuencias de represión aguas arriba) y un dominio de acción
positiva (UAS, secuencia de activación aguas arriba) [3]. Para el
promotor de MOX de H. polymorpha también se
describieron dos secuencias de activación aguas arriba (UAS1 y UAS2)
y un sitio de unión al represor (URS1) [8].
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Basándose en el análisis del factor de
transcripción y el alineamiento de secuencias múltiples se
seleccionaron 9 regiones promotoras para la deleción mediante PCR de
extensión solapante como se ha descrito antes. Los constructos de
deleción del promotor de AOX1 se clonaron en el vector pAOX
para remplazar el promotor 5 de "AOX1 de tipo salvaje"
por el gen informador GFP-Zeo. Los plásmidos se
linealizaron y se integraron en el genoma de Pichia
pastoris.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
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Se analizaron los integrantes en busca de la
expresión de GFP-Zeo y en busca de la integración de
la secuencia promotora correcta delante del gen
GFP-Zeo como se ha descrito antes. Se analizaron los
integrantes de una sola copia con mayor detalle en busca de sus
niveles de expresión de GFP-Zeo en diferentes
fuentes de carbono a micro-escala. En ninguno de los
constructos (deleción y de tipo salvaje) se pudo detectar
fluorescencia por GFP mientras estuvieron presentes glucosa o
glicerol en el medio (con o sin metanol). Tras el agotamiento del
carbono, que representaba las condiciones de
des-represión, se detectó un ligero incremento en la
fluorescencia por GFP. En comparación con el tipo salvaje, algunas
variantes del promotor mostraron diferencias notables (Fig. 3). Se
encontró una actividad promotora significativamente inferior en 6
constructos (\Delta3, \Delta4, \Delta5, \Delta7, \Delta8 y
\Delta9, véase la Fig. 3) en condiciones de
des-represión. \Delta1 poseía actividad de tipo
salvaje mientras los constructos \Delta2 y \Delta6* produjeron
una expresión de GFP-Zeo signi-
ficativamente superior. El nivel de expresión del último fue notablemente superior que el del nivel de tipo salvaje.
ficativamente superior. El nivel de expresión del último fue notablemente superior que el del nivel de tipo salvaje.
Tras la inducción con metanol todas las
variantes mostraron una actividad promotora significativamente
disminuida con una única excepción: \Delta1 que produjo una
actividad en torno a 20% mayor en comparación con el tipo salvaje.
La disminución en la actividad de todas las demás variantes es
bastante significativa como se puede observar en la Fig. 4.
La actividad promotora de todas las variantes y
los constructos de tipo salvaje normalizados en la actividad de tipo
salvaje inducida por metanol se resume en la Tabla 13.
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La deleción de la caja TATA en el constructo
\Delta8 dio como resultado una destrucción masiva del promotor con
un fuerte descenso de la actividad en condiciones de
des-represión e inducción de aproximadamente 90% y
80%, respectivamente. Mediante la eliminación del comienzo del
inicio de la transcripción determinado experimentalmente (Ellis,
S.B., et al., Mol. Cell. Biol. (1985)
5:1111-1121) (\Delta9) no se observó semejante
efecto fuerte sobre el nivel de expresión. Es uno de los mejores
constructos de deleción después de la inducción con metanol. Como se
esperaba, la caja TATA tiene un fuerte impacto sobre el nivel de
transcripción. En contraste el comienzo del inicio de la
transcripción parece no ser tan importante como la caja TATA. Otra
región en la distancia definida a la caja TATA puede actuar como
inicio de la transcripción después de la deleción de la original. Se
puede especular sobre el efecto de esta deleción sobre las
diferentes fases del proceso de expresión (p. ej. inicio de la
transcripción, estabilidad del ARNm, inicio de la traducción) puesto
que el extremo 5' del ARNm fue cambiado mediante deleción.
Solamente dos constructos, \Delta2 y
\Delta6*, muestran un nivel de expresión significativamente
superior después de la des-represión. Los supuestos
sitios de unión al factor de transcripción de Rap1p y Gcr1p están
incluidos en las secuencias suprimidas. Además, el supuesto sitio de
unión al factor de transcripción de QA-1F está muy
próximo a las secuencias suprimidas de \Delta6*. Notablemente, se
sabe que los sitios de unión de Rap1p y Gcr1p actúan de una manera
sinérgica cuando están presentes en secuencias promotoras [21]. El
factor de transcripción general Rap1p tiene diversas funciones
celulares (p. ej. estructura del telómero, apareamiento, traducción,
glicólisis) dependientes del contexto de la secuencia de su sitio de
unión y de los factores de transcripción apropiados
[22-24]. Como se ha mencionado antes, Gcr1p es el
principal punto de regulación y coordinación de los genes
glicolíticos y es absolutamente necesario para un elevado nivel de
expresión en S. cerevisiae. Los sitios de unión de Rap1p y Gcr1p se
encuentran en íntima proximidad en la región núcleo de la secuencia
activadora aguas arriba (UAS) de los genes glicolíticos y la unión
de Gcr1p es aliviada flexionando en ADN mediante Rap1p. Por otra
parte un sitio de unión a Rap1p adyacente no es un requerimiento
absoluto para la activación de genes dependiente de Gcr1p. Parece
que Gcr1p puede facilitar la unión a su sitio de unión cuando está
presente un número elevado de cajas CT. Aunque se describió una
clara interacción de Rap1p con Gcr1p así como de Gcr1p con Gcr1p, se
sugiere que algunos otros factores interaccionan con Gcr1p y/o Rap1p
modulando la actividad del complejo. Se ha logrado un amplio
conocimiento del mecanismo de inducción durante las 3 últimas
décadas.
La íntima proximidad esencial descrita de los
sitios de unión a Gcr1p y Rap1p en las UAS funcionales descritas
antes no pudo ser encontrada en la secuencia del promotor de
AOX1. Por el contrario, los dos sitios de unión están a 367
pb. Entre el supuesto sitio de unión a Gcr1p, su secuencia núcleo
CTTCC está presente 2 veces en la secuencia del promotor de
AOX1, pero ninguna de ellas inmediatamente adyacente al sitio
de unión a Rap1p u otro motivo CTTCC. Por lo tanto parece que no es
probable una acción sinérgica de estos dos sitios de unión
encontrados en muchos genes glicolíticos. Debido al hecho de que los
supuestos papeles de Rap1p y Gcr1p son proteínas represoras de
AOX1 en condiciones de des-represión, es
posible un nuevo modo de (inter-) acción de las dos proteínas para
esta supuesta función celular novedosa.
Una implicación de la deleción \Delta6*
(incluyendo el sitio de unión a Gcr1p) en la represión tras el
agotamiento del carbono es enfatizada por la observación de cepas
con múltiples copias con una expresión de GFP-Zeo
muy elevada sin inducción por metanol. La expresión de
GFP-Zeo del mejor clon de la serie
\Delta1-\Delta9, denominado P. pastoris
X-33 d6*F10, se muestra en la Fig. 5. La expresión
de GFP-Zeo es aproximadamente 10% superior después
de la des-represión (60h a
micro-escala) en esta cepa con múltiples copias
\Delta6* que en una cepa de promotor de tipo salvaje de una sola
copia (X-33 GFP-Zeo D2) después de
la inducción con metanol. El nivel de expresión de P.
pastoris X-33 d6*F10 después de la inducción con
metanol también es mucho mayor que el de una cepa con múltiples
copias con el promotor de tipo salvaje (X-33
GFP-Zeo E2).
Las regiones promotoras AOX1 y
DAS1 de P. pastoris y MOX de H.
polymorpha promueven la expresión de la enzima informadora
beta-galactosidasa (lacZ de E. coli) en S.
cerevisiae [9]. El patrón de regulación de estos genes en S.
cerevisiae es similar al de sus anfitriones naturales: la
glucosa reprime la expresión del gen. En condiciones de agotamiento
de carbono la expresión es ligeramente des-reprimida
y el glicerol como fuente de carbono induce la expresión. Los
niveles de beta-galactosidasa expresados bajo el
control de las regiones reguladoras AOX1 y DAS1 en
S. cerevisiae son comparables con los obtenidos con los
promotores fuertes CYC1 de S. cerevisiae
(constitutivo) y GAL2 (inducible) [9]. Se demostró que la
expresión conducida por el promotor de MOX también es
inducida por etanol, metanol y ácido oleico en S. cerevisiae. Otro
descubrimiento muy importante es la implicación de Adr1p en la
des-represión/inducción del promotor. Adr1p, un
efector positivo de ADH2 (alcohol deshidrogenasa 2) y algunas
proteínas peroxisómicas en S. cerevisiae [25], también es un
efector positivo del promotor de MOX cuando el medio carece
de glucosa.
Como se ha mencionado antes el patrón de
regulación de los genes AOX1 y MOX es
significativamente diferente en sus anfitriones naturales debido a
la des-represión de MOX cuando está presente
glicerol. La utilización de la región del promotor de AOX1 en
H. polymorpha reveló que el promotor de AOX1 no está
reprimido por glicerol en el anfitrión heterólogo [26]. De este
modo, el promotor de AOX1 heterólogo parece estar regulado
como el promotor de MOX homólogo. Esto da como resultado la
sugerencia de que las diferencias significativas en el patrón de
regulación entre P. pastoris y H. polymorpha se deben
a la respuesta transcripcional global a diferentes fuentes de
carbono en estas dos levaduras. Lo que significa, que mientras la
maquinaria de represión del glicerol y la glucosa son (parcialmente)
idénticas en P. pastoris, en H. polymorpha (como en
S. cerevisiae) la situación es diferente y el glicerol no
utiliza la maquinaria de represión de la glucosa.
Dos de los tres supuestos sitios de unión
HAP2/3/4/5 encontrados en la secuencia del promotor de AOX1
están en el constructo de deleción \Delta1 y el tercero en
\Delta5. La deleción de la secuencia de \Delta1 da como
resultado un incremento en la actividad del promotor tras la
inducción con metanol si bien no se observó efecto sobre el nivel de
promotor en des-represión. Por el contrario, la
deleción de \Delta5 da como resultado un fuerte descenso en la
actividad del promotor en condiciones de
des-represión así como de inducción. En la deleción
\Delta1 se encontró un supuesto sitio de unión a abaA de
Aspergillus nidulans. El producto del gen abaA es un
activador transcripcional que está implicado en el desarrollo de los
conidióforos (aparato de reproducción asexual) en A. nidulans
[27]. Puesto que todos los supuestos sitios de unión son posibles
secuencias activadoras [27], su deleción debe tener un efecto
negativo sobre el nivel de expresión encontrado en el constructo
\Delta5. Debido al hecho de que ambas deleciones son muy largas
otro sitio de unión podría ser responsable del efecto observado. El
hecho de que la deleción de \Delta1 tenga un efecto opuesto sobre
el nivel de expresión indica que uno de los supuestos sitios de
unión es un motivo represor, o se encuentra presente otro sitio de
unión que excede los efectos de la deleción de los supuestos sitios
de unión de HAP y abaA incrementando de ese modo el nivel de
expresión.
Sin embargo, se sabe que el complejo HAP es
responsable de la regulación al alza de los genes implicados en el
metabolismo respiratorio y energético en S. cerevisiae. La
regulación de la respiración está controlada por el nivel de oxígeno
así como por la fuente de carbono presente en el medio, ambos
mediados por el complejo Hap. En la levadura fermentativa S.
cerevisiae, varios genes y por lo tanto funciones de la cadena
respiratoria así como el ciclo del ácido cítrico son reprimidos por
glucosa. La represión por glucosa de la respiración está
parcialmente mediada por el complejo Hap, es decir por la ausencia
de Hap4p mientras esté presente glucosa. Por el contrario, la
regulación dependiente de oxígeno parece estar regulada por Hap1p
[28]. Los homólogos de los genes del complejo Hap fueron aislados en
la levadura respiratoria K. lactis. Los genes implicados en
la respiración son expresados constitutivamente en levaduras
respiratorias, incluso en presencia de glucosa. Hasta la fecha, se
ha demostrado que casi cada gen de la cadena respiratoria está
regulado independientemente del complejo Hap [29]. El papel del
complejo Hap parece estar en la coordinación de la asimilación del
carbono y el nitrógeno, que también se ha encontrado en S.
cerevisiae [30] y Aspergillus nidulans [29].
La primera etapa en la ruta de utilización del
metanol, catalizada principalmente por el producto del gen de
AOX1 en P. pastoris, es el consumo de oxígeno. La
mayoría de los genes implicados en el metabolismo de la energía y
casi todos los genes que codifican las enzimas que consumen oxígeno
están regulados por oxígeno, principalmente por Hap1p y/o
Hap2/3/4/5p [28]. Cuando se desarrolla sobre metanol como única
fuente de energía y carbono, la ruta de utilización de metanol da
como resultado la asimilación de carbono y la producción de energía.
Una implicación del motivo de reconocimiento TTCCAA del complejo Hap
en la regulación del promotor de AOX1 tiene un sentido
intuitivo.
El constructo \Delta4, que incluye un segundo
supuesto sitio de unión a HSF, dio como resultado una disminución
del 30% de la actividad del promotor después de la
des-represión y la inducción. Por lo tanto HSF es un
intensificador general de la expresión del gen de AOX1 en
condiciones de des-represión así como de inducción.
En S. cerevisiae varias condiciones de estrés como el choque
térmico, el estrés oxidativo y el agotamiento de glucosa condujeron
a la activación de HSF. También se ha demostrado que la proteína
quinasa Snflp, uno de los "interruptores maestros metabólicos",
está implicada en la fosforilación y por lo tanto la activación de
HSF tras el agotamiento del carbono [31]. De este modo existe una
implicación de HSF en la activación total de AOX1 tras el
agotamiento de la glucosa (con o sin inducción).
Los estudios de expresión del promotor de
AOX1 utilizando versiones truncadas así como variantes con
secuencias suprimidas se describen en la técnica anterior [32,
33].
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El constructo Inan_BCDEF, que empieza en 153
(-801) (Tabla 14) reveló un sitio de unión de al menos una proteína
activadora aguas arriba de 153 (-801). Los candidatos de este sitio
de unión al activador son los sitios de unión de Hap1p (52 a 66,
-902 a -888) y HSF (135 y 155, -819 a -799) en la hebra
complementaria encontrada con MatInspector. El truncamiento en el
sitio de restricción SacI (210-215 (-744 a -739))
dio como resultado un promotor que casi alcanzó la actividad del
promotor de tipo salvaje (Geoff Lin Cereghino, Poster, Sixth Meeting
on "Current Topics in Gene expression and Proteomics", San
Diego, Octubre 19-22, 2003). Para alcanzar el nivel
del promotor de tipo salvaje con el constructo del promotor truncado
de SacI (pHWGO, Geoff Lin Cereghino, Poster), puede estar presente
un segundo sitio de unión para una proteína represora aguas arriba
de 210 (-744) cuya deleción tiene el mismo impacto, pero en la
dirección opuesta, sobre la actividad del promotor. La localización
de la proteína represora está entre 169 (-784) y 210 (-744) debido a
que el constructo \Delta1 (\Delta 169 (-784) a 234 (-719))
contiene un sitio de unión al represor. La deleción de \Delta1 da
como resultado un incremento del 20% de la actividad promotora
(Tabla 14) que está en el intervalo de la disminución por deleción
del sitio de unión a la proteína activadora.
Por comparación con \Delta4 (\Delta 508
(-445) a 550 (-403)) la localización del sitio de unión al represor
puede ser perfeccionada adicionalmente a una secuencia entre 433
(-520) y 508 (-445) debido a que la deleción \Delta4 incluye un
factor de transcripción que actúa positivamente, HSF en 516 a 536
(-438 a -418). Si el HSF que actúa positivamente (si es HSF) está
localizado en la región propuesta, se puede sugerir un efecto más
fuerte del sitio de unión al represor entre 433 y 508 (-520 y -445).
Si el sitio de unión para HSF está localizado en la región entre 508
y 536 (-445 y -418) otro sitio de unión al activador está localizado
entre 536 y 560 (-418 y -393). Si no, es probable que sea el mismo
sitio de unión. Como la variante InanABCO_F (\Delta 560 a 709
(-393 a -245)) con sólo 16% de la actividad del tipo salvaje,
también el constructo \Delta5 (624 a 682 (-329 a -271)) da como
resultado un descenso de aproximadamente 70% del nivel de tipo
salvaje. Como se esperaba, la deleción del fragmento Inan B a partir
del promotor completo (produce InanA_CDEF) así como a partir de
Inan_BCDEF (produce Inan_CDEF) da como resultado una disminución
hasta 63 y 64% del fragmento más largo, respectivamente. Por el
contrario, si bien la deleción del fragmento C a partir del promotor
completo da como resultado un incremento de aproximadamente 10% en
la actividad del promotor, la deleción a partir del fragmento
Inan_COEF truncado conduce a una disminución de 49 al 14% (Tabla
14). La explicación es una unión sinérgica de los factores de
transcripción dependiente del contexto de sus sitios de unión. Entre
713 y 760 (-241 a -194) se encuentra localizado un último sitio de
unión a la proteína activadora (Geoff Lin Cereghino, Poster San
Diego). De nuevo, por medio del constructo \Delta7 (\Delta 729 a
763, -225 a -191) la localización del activador podría ser
perfeccionada aguas abajo hasta 729 (-225).
Para concluir, se encontraron varias regiones
que tenían un fuerte impacto sobre el nivel de expresión del
promotor de AOX1. Combinando todos los sitios reguladores
conocidos del ejemplo proporcionado en la presente memoria y de
otros autores, excluyendo las regiones que contienen la caja TATA y
el sitio de inicio de la transcripción, existen al menos 10 sitios
reguladores sobre la secuencia del promotor P_{AOX1}.
Los datos proporcionados revelaron la regulación
orquestada del promotor de AOX1: son necesarios varios
factores para la unión al ADN para un nivel de expresión máximo. En
condiciones inductoras varios factores de transcripción que actúan
en positivo (activadores) se unían al ADN mientras la mayor parte de
las proteínas represoras no se unían dando como resultado un nivel
de expresión elevado. Mientras estaba des-reprimido,
la actividad del promotor alcanzó solamente un pequeño porcentaje
(\sim3%) del nivel inducido. Esto se debe muy probablemente a
proteínas menos activadoras y más represoras que se unen a la región
promotora. En condiciones de represión se puede suponer que ningún
activador y varios represores se unen al ADN con un incremento
adicional de la proporción de represor/activador en condiciones de
represión.
Se ha demostrado para el promotor de ADH2
(alcohol deshidrogenasa 2) reprimido por glucosa de S.
cerevisiae que la unión de proteínas activadoras (p. ej. Adr1p)
inmediatamente adyacentes a los nucleosomas conduce a la
desestabilización y por lo tanto a la transposición de la cromatina
después de la des-represión. La transposición tiene
lugar en la región de la caja TATA y el sitio de inicio de la
transcripción, incrementando por lo tanto su accesibilidad. Debido a
la mayor accesibilidad tiene lugar la formación de un complejo de
pre-iniciación estable aumentando de ese modo la
actividad del promotor a un nivel basal. Entre la unión de varios
factores de transcripción para intensificar la expresión conducida
por P_{AOX1}, es asumible un mecanismo similar, al menos para la
des-represión. Tomados todos los datos y
suposiciones juntos, la regulación del promotor de AOX1 es
muy compleja y los supuestos sitios de unión de varios factores de
transcripción (que actúan positivamente y negativamente) revela una
maquinaria altamente coordinada que es capaz de integrar una amplia
variedad de señales para la regulación del promotor de
AOX1.
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Se ha demostrado aquí que las mutaciones
específicas en las secuencias núcleo de los sitios de unión al
factor de transcripción dan como resultado alteraciones
significativas de su fuerza efectora. Supuestamente unas pocas
proteínas activadoras y represoras actúan sobre el promotor de
AOX1 para dar como resultado su regulación muy fuerte (casi
sin actividad en glucosa, actividad muy elevada en metanol). Por lo
tanto la mutagénesis al azar del promotor de AOX1 debe dar
como resultado numerosas variantes del promotor con actividades del
sitio de unión al represor destruidas o reducidas. Se realizaron un
grupo de reacciones de PCR con diferentes tasas de mutación. Las
variantes del promotor resultantes se transformaron en P.
pastoris cepa GFP-Zeo Mut^{S} A9 donde el gen
de AOX1 estaba remplazado por la cepa
GFP-Zeo. La reposición del promotor de AOX1 de tipo
salvaje por variantes del promotor mutagenizado se debe producir a
una tasa concreta. El escrutinio en busca de variantes del promotor
con una tasa de expresión superior cuando está presente glucosa en
el medio se realizó sobre placas de agar MD-Zeo.
La diseminación sobre placas de agar MD que
contenían 100 \mug/ml de Zeocina® dio como resultado placas con
manchas con células de Pichia pastoris y no son evidentes
colonias individuales. Parece que la presión de selección no fue
suficiente para reprimir el crecimiento de la cepa de tipo salvaje.
Aunque no se pudo detectar fluorescencia en P. pastoris cepa
GFP-Zeo Mut^{S} A9 cuando estaba presente glucosa,
unas pocas proteínas GFP-Zeo podrían ser expresadas
en la célula confiriendo resistencia a Zeocina®. Para someter a
ensayo concentraciones de Zeocina® más altas en busca de inhibición
del crecimiento de la cepa GFP-Zeo Mut^{S} A9 se
realizaron ensayos de gota gruesa como se ha descrito antes.
Como se puede observar claramente en la Fig. 6
el incremento hasta 200 \mug/ml no disminuyó la viabilidad celular
(en comparación con 100 \mug/ml) de las cepas de P.
pastoris que portaban el gen GFP-Zeo bajo el
control del promotor de AOX1, pero el incremento de hasta 500
\mug/ml si lo hizo. Se esperaba que la mutagénesis del promotor
diera como resultado niveles de expresión solo ligeramente
incrementados, por lo tanto una presión de selección de 500
\mug/ml de Zeocina® parece ser demasiado elevada. Finalmente se
seleccionaron 350 \mug/ml para todos los demás escrutinios de las
variantes del promotor por mutagénesis.
Debido a la muy compleja regulación
transcripcional con las muchas regiones promotoras implicadas,
resulta ventajoso un enfoque de mutagénesis al azar utilizando una
tasa de mutación elevada.
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Basándose en los resultados del ejemplo 1 se
generó una segunda generación de variantes por deleción. En
contraste con la primera serie en estos nuevos constructos por
deleción solamente fueron suprimidos tramos de secuencia pequeños y
específicos de los supuestos sitios de unión al factor de
transcripción (5-15 pb) (Tabla 15).
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(Tabla pasa a página
siguiente)
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Todas las deleciones se introdujeron utilizando
el protocolo de mutagénesis dirigida al sitio de dos fases de
acuerdo con Wang et al. [34]. En una primera etapa se
evaluaron dos reacciones separadas (una para el cebador directo y
una para el inverso) (100 ng de molde pAOX, 15 pmoles de cebador,
200 \muM de cada uno de dATP, dTTP, dCTP y dGTP, 2,5 U de
polimerasa PfuU1-tra® en un volumen total de
50 \mul en condiciones de tampón apropiadas). Se combinaron 25
\mul de estas dos reacciones de PCR y se realizó una segunda etapa
de reacción de PCR.
Se añadió 1 \mul de enzima de restricción
DpnI (10 u/\mul) a 30 \mul de la segunda etapa de
reacción de PCR y se incubó durante 1 hora a 37ºC. Se transformaron
1-5 \mul de reacción de PCR digerida con
DpnI en células de E. coli electrocompetentes [16] y
se cultivaron en placa sobre placas LB-Amp después
de un tiempo de regeneración de 1 h en medio SOC.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
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Se prepararon los plásmidos construidos como se
ha descrito antes y se transformaron en Pichia pastoris como
se describe en el ejemplo 1.
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Se observa un fuerte efecto sobre el nivel de
expresión con las mutaciones cortas del ejemplo 2 ya descrito para
las deleciones más grandes del ejemplo 1 donde todas las mutaciones
tienen un efecto positivo o negativo significativo sobre la
actividad del promotor. Las deleciones cortas de los sitios de unión
al factor de transcripción específico tienen fuertes efectos sobre
la actividad del promotor y proporcionan una información más precisa
sobre las propiedades reguladoras de sitios reguladores individuales
(p. ej. sitios de unión al factor de transcripción). Gcr1 tiene un
interés especial puesto que su sitio de unión está incluido en la
deleción A6. La secuenciación de la región promotora de un mutante
por deleción pAOX\Delta6 y los productos de la PCR de colonias de
ADN genómico de clones de Pichia pastoris revelaron una
deleción adicional en la región promotora (Deleción de los
nucleótidos 737 a 738 (-217 a -216) del SEQ ID No. 1). Debido al
hecho de que esta variante del promotor conduce a un aumento de
actividad del promotor dando como resultado por consiguiente una
tasa de expresión superior en condiciones de
des-represión, la mutación adicional puede ser
introducida en un promotor de acuerdo con la presente invención para
incrementar la expresión de proteínas en estas condiciones.
La actividad promotora de los clones
QA-1F con una deleción (Deleción de los nucleótidos
736 a 741 (-218 a -213) del SEQ ID No. 1) es significativamente
diferente en comparación con el promotor
\DeltaQA-1F sin esta deleción adicional: La
actividad cambia de \sim30% (des-represión) y
\sim100% (Inducción) de la actividad de tipo salvaje
(AOX1\DeltaQA-1F, véase la tabla 15) a \sim140%
y \sim70%, respectivamente (AOX1\DeltaQA-1Fzus,
véase la tabla 15). La deleción adicional de estos 6 nucleótidos
parece tener una influencia espectacular sobre la actividad
promotora. De este modo se introdujo una nueva variante de promotor
que portaba esta mutación (\Delta736-741) por
medio del protocolo de mutagénesis dirigida al sitio como se ha
descrito antes. Ambas mutaciones que surgieron dos veces
accidentalmente e independientemente en esta región dieron como
resultado un incremento de la actividad promotora en condiciones de
des-represión. Resulta notable que hay un incremento
en la actividad del promotor aunque en ambos constructos haya e
influya muy probablemente negativamente una segunda mutación.
Se generó una combinación de \Delta2 y
\Delta6 (\Delta2\Delta6) similar a las deleciones individuales
por PCR de extensión solapante. Se demuestra claramente en la tabla
17 que una deleción de ambos fragmentos da como resultado un
descenso muy fuerte de la actividad del promotor con condiciones de
des-represión así como de inducción. Puesto que no
hay una deleción adicional TA en este constructo en comparación con
el constructo \Delta6* como se ha mencionado antes, también este
resultado apoya la especulación de que la mutación adicional surgida
accidentalmente (\Delta737-38) es responsable del
aumento de actividad del promotor después del agotamiento del
carbono.
Varias deleciones dan como resultado un descenso
espectacular de la actividad del promotor (p. ej. Hsf, pero también
Hap1 y Hap2345_1). Estos supuestos sitios de unión son dianas
estupendas para una duplicación de la secuencia que daría como
resultado un incremento en la actividad del promotor.
De manera interesante, en 2 de 4 clones de la
variante \Delta736-741 generada mediante
mutagénesis dirigida al sitio, se encontró una nueva deleción de 9
nucleótidos (TTGGTATTG) en la posición 552 a 560 (-402 a -394). El
efecto de esas deleciones se encontró en una región distinta,
también se encontró en los constructos \DeltaHsf_2. Dicho efecto
es esperado debido a la homología de la secuencia local. De este
modo las regiones adicionalmente suprimidas
(\Delta552-560, \Delta737-38 y
\Delta736-41) y las secuencias en íntima
proximidad (5 pb aguas arriba y abajo) también son supuestos sitios
de unión al factor de transcripción y por lo tanto dianas altamente
interesantes para deleciones y duplicaciones. La variante por
deleción \Delta736-41 da como resultado un aumento
de la reducción del nivel de expresión en condiciones de inducción
con metanol.
\vskip1.000000\baselineskip
En la mayor parte de los casos la generación de
cepas con múltiples copias da como resultado cepas de superexpresión
de GFP-Zeo. En muchos casos estas cepas tienen
niveles de expresión superiores que las cepas d6*F10, principalmente
en condiciones de inducción con metanol. La generación de cepas con
múltiples copias fue alcanzable con varios constructos,
especialmente con el constructo \Delta6*, los constructos de doble
deleción d2d6, incluyendo las deleciones \Delta1, \Delta2 y
\Delta6* así como p. ej. Gcr1, Rap1, abaA, Hap2345_1, pero también
p. ej. QA-1F, Adr1, Hsf_2_Mat1MC y Hsf_2_Hap2345_1
(véase la figura 7). En estas cepas se encuentra una tasa de
expresión superior en condiciones de inducción en comparación con la
cepa d6*F10. Por el contrario, la cepa d6*F10 fue capaz de producir
más GFP-Zeo que cualquier otra cepa generada hasta
ahora en condiciones de des-represión. La
transformación repetida del constructo \Delta6* en Pichia
pastoris da como resultado un elevado número de cepas con
múltiples copias con actividad comparable a la de la cepa d6*F10,
especialmente en condiciones de des-represión
(figura 8).
Utilizando constructos promotores de tipo
salvaje, se observó una frecuencia mucho menor de cepas con
múltiples copias (p. ej. cepa E2) que utilizando variantes del
promotor. Aunque se analizaron 2-4 veces más
transformantes, el nivel de expresión del mejor transformante E2 es
sólo dos veces más alto que los transformantes con una sola copia.
En conclusión, la transformación de las variantes del promotor da
como resultado una frecuencia superior de cepas de múltiples copias
y estas cepas son mucho más productivas que las cepas de promotor de
tipo salvaje con múltiples copias.
\vskip1.000000\baselineskip
Para someter a ensayo la viabilidad de todos los
resultados de GFP-Zeo para otras proteínas
básicamente bien expresadas e industrialmente relevantes (p. ej.
enzimas) se clonaron algunas variantes del promotor delante de tales
enzimas informadoras (p. ej. PaHNL5\alpha y HRP).
\vskip1.000000\baselineskip
Se clonaron variantes del promotor en los
vectores pPICZ\alphaB-HRP-WT [35]
y pGAPZ A-PaHNL5\alpha. Para el cambio de promotor en
pPICZ\alphaB-HRP-WT se insertó un
sitio de restricción NdeI en el extremo 5' del promotor mediante
mutagénesis dirigida al sitio (100 ng de vector como molde, cebador
Nde1PICZdirr y Nde1PICZrev - véase la tabla 18). El vector
resultante se denominó
pPICZaB-NdeI-HRP-WT.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Para el clon de expresión pGAPZ
A-PaHNL5\alpha se clonó primero el gen
PaHNL5\alpha a partir de un vector pHIL-D2
(Glieder, A., et al. Angew. Chemie Int. Ed. 2003) en un
vector pGAPZ A, dando como resultado un plásmido
pGAPZA-PaHNL5\alpha. La clonación de las variantes
del promotor en pGAPZ A-PaHNL5\alpha se pudo
realizar directamente después de la digestión con
EcoRI/BglII de los plásmidos pGAPZ
A-PaHNL5\alpha pAOXA. Para un cambio en
pPICZ\alphaB-NdeI-HRP-WT
se amplificaron las variantes del promotor mediante PCR utilizando
los cebadores AOX1NDE1 y AOX1rev (véase la tabla 18, 10 ng de
pAOX\Delta, 10 pmoles de cebador AOX1NDE1 y AOX1rev, 200 \muM de
cada dNTP, 0,6 u de Polimerasa Phusion® en condiciones de tampón
apropiadas y un volumen total de 50 \mul). Los productos de la PCR
y el plásmido
pPICZ\alphaB-NdeI-HRP-WT se
clonaron empleando los sitios de restricción
NdeI/HindIII.
\vskip1.000000\baselineskip
Para la transformación de Pichia pastoris
todos los vectores HRP fueron linealizados por medio de NdeI
y todos los plásmidos PaHNL5\alpha por medio de
BglII. La transformación se realizó como se ha descrito en el
ejemplo 1. El crecimiento de las cepas de P. pastoris también
se realizó como se ha descrito en el ejemplo 1 sólo con algunas
excepciones. La cantidad de BMD inicial (1%) se incrementó a 350
\mul y después de 60 horas se tomaron 100 \mul de cultivo para
su centrifugación (4000 rpm, 4ºC, 10 min). La inducción con metanol
se realizó exactamente como se ha descrito en el ejemplo 1.
Se tomaron 50 \mul
(des-represión) o 10 \mul (inducción) de
sobrenadante de la centrifugación para el análisis HNL y 15 \mul
en ambas condiciones para el análisis HRP.
\vskip1.000000\baselineskip
Se añadieron 15 \mul de sobrenadante a 150
\mul de ABTS 1 mM/ H_{2}O_{2} 2,9 mM en tampón NaOAc 50 mM pH
4,5 en placas de microtitulación PS. La absorción estuvo seguida de
5 minutos a 405 nm en un lector de placa Spectramax Plus384
(Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA).
\vskip1.000000\baselineskip
Se añadieron 50 \mul o 10 \mul de
sobrenadante a 100 o 140 \mul de tampón
fosfato-citrato 0,05 M pH 5,0 en una placa de
microtitulación UV-Star. La reacción se inició
añadiendo 50 \mul de solución de mandelonitrilo 0,06 M (en tampón
fosfato-citrato 0,003 M pH 3,5), seguido de 5
minutos a 280 nm en un lector de placa Spectramax Plus384 (Molecular
Devices, Sunnyvale, CA, USA).
\vskip1.000000\baselineskip
Los resultados utilizando las proteínas
informadoras alternativas PaHNL5\alpha y HRP muestran
claramente la transferibilidad de la actividad del promotor
detectada utilizando GFP-Zeo (Tabla 17).
Debido a la menor sensibilidad del análisis HRP,
el nivel de expresión en las condiciones de
des-represión estuvo por debajo del límite de
detección. De este modo la expresión de HRP no pudo ser determinada
en condiciones de des-represión.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Para transferir la selección de múltiples copias
a los sistemas informadores alternativos, se clonaron las variantes
del promotor de AOX1 en los plásmidos HRP y
PaHNL5\alpha apropiados delante del gen de resistencia a
Zeocina remplazando de ese modo el promotor TEF1.
\vskip1.000000\baselineskip
Para someter a ensayo las variantes del promotor
con GFP, se clonaron las variantes del promotor descritas en los
ejemplos 1 y 2 delante de un gen de ciclo-3 GFP.
\vskip1.000000\baselineskip
Se suprimieron los sitos de restricción
BamHI y XhoI internos de la ciclo-3
GFP en el vector pAOX mediante mutagénesis dirigida al sitio
empleando los cebadores Bam-del-f y
Xho-del-f (Tabla 19) y 100 ng de
vector como molde. El Fragmento de GFP se amplificó mediante PCR a
partir del plásmido resultante (10 ng) empleando los cebadores
GFP-Zeo forw (Seq. ID No. 4, Tabla 7, 10 pmoles) y
wtGFP-XhoI-r (Tabla 19, 10 pmoles) y
polimerasa Phusion® en condiciones apropiadas. El producto de la PCR
resultante se pudo clonar en el vector pPICZ B empleando el corte de
restricción EcoRI/XhoI y la ligación utilizando ADN
ligasa de T4. El plásmido resultante se denominó
pPICZ-GFP.
La clonación de todas las variantes del promotor
en pPICZ-GFP se pudo realizar directamente después
de la digestión con BglII/EcoRI de los plásmidos
pPICZ-GFP y pAOX\Delta.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Para la transformación de Pichia pastoris
se linealizó la transformación de todos los plásmidos mediante
BglII. La transformación se realizó como se ha descrito en el
ejemplo 1. Después de la transformación y de una fase de
regeneración de 2 h las células se cultivaron en placa sobre placas
de agar YPD-Zeo que contenían 100 \mug/ml de
Zeocina.
El crecimiento de Pichia pastoris, la
inducción con metanol y la medida de la fluorescencia GFP se
realizaron exactamente como se ha descrito en el ejemplo 1.
\vskip1.000000\baselineskip
De nuevo, los resultados utilizando GFP como
sistema informador muestran la transferibilidad de la actividad del
promotor detectada utilizando GFP-Zeo (Tabla
20).
\vskip1.000000\baselineskip
Como se ha descrito en los ejemplos 1 y 2, la
existencia de cepas con múltiples copias utilizando Zeocina como
marcador de selección es muy común. La frecuencia de cepas de
múltiples copias se pudo incrementar enormemente aumentando la
concentración de Zeocina en las placas de selección hasta 500 y 1000
\mug/ml, respectivamente.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Para someter a ensayo pequeñas porciones del
promotor de AOX1 en un sistema libre de casi todos los sitios de
unión al factor de transcripción, se cortó el promotor de AOX1 unas
pocas bases por delante de la caja TATA en las posiciones -176 y
-194 lo que da como resultado los elementos promotores basales
AOX176 y AOX194 (Tabla 21). Para permitir la posterior clonación de
los elementos promotores delante de los fragmentos del promotor
basal así como la clonación del promotor basal, se insertaron los
sitios de restricción BspTI y EcoRI en el extremo 5' y
en el extremo 3', respectivamente.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se amplificaron elementos de AOX1 basal a partir
de pAOX (10 ng) utilizando los cebadores AOX1basalrev (Tabla 21, 10
pmoles) y AOXbasalforw (10 pmoles, AOX194) y AOX176fw (10 pmoles,
AOX176), respectivamente. La PCR se realizó utilizando la polimerasa
Phusion® (0,6 u) en condiciones apropiadas en un volumen total de 50
\mul.
Se amplificó la variante del promotor
AOX176-737 mediante PCR utilizando los cebadores
AOX1basalrv y 737-38AOX176 como se ha descrito
antes. La variante del promotor
AOX176-201-214 se amplificó mediante
PCR utilizando los cebadores AOX1basalin y
201-214AOX176 como se ha descrito antes.
Los productos de la PCR resultantes pudieron ser
clonados en el vector pPICZ-GFP empleando el corte
de restricción BglII/EcoRI y la ligación utilizando
ADN ligasa de T4 remplazando de ese modo el promotor de AOX1
de tipo salvaje.
Los 4 oligonucleótidos Leu2basal1f, Leu2basal2f,
Leu2basal1r y Leu2basal2r (25 pmoles de cada uno) se mezclaron en un
volumen total de 20 \mul, se calentaron a 95ºC durante 2 minutos y
se enfriaron hasta la temperatura ambiente lentamente. Se ligaron 3
\mul de la mezcla con 159 ng de un fragmento
BglII/EcoRI de pPICZ-GFP durante 6
horas a 16ºC. Después de la transformación en E. coli el
vector resultante se denominó pLeu2basal-GFP.
La variante del promotor
Leu2-737 se amplificó mediante PCR utilizando los
cebadores LEU2basalrv y 737-38Leu2 y
pLeu2basal-GFP como molde como se ha descrito antes.
El producto de la PCR resultante se pudo clonar en el vector
pPICZ-GFP empleando el corte de restricción
BglII/EcoRI y la ligación utilizando ADN ligasa de T4
remplazando de ese modo el promotor de AOX1 de tipo salvaje.
El plásmido resultante se denominó
pLeu2-GFP-737.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Para la transformación de Pichia pastoris
todos los plásmidos se linealizaron mediante BamHI. La
transformación se realizó como se ha descrito en el ejemplo 1.
Después de la transformación y de una fase de regeneración de 2 h,
las células se cultivaron en placa sobre placas de agar
YPD-Zeo que contenían 100 \mug/ml de Zeocina.
El crecimiento de Pichia pastoris, la
inducción con metanol y la medida de la fluorescencia de GFP se
realizaron exactamente como se ha descrito en el ejemplo 1.
\vskip1.000000\baselineskip
Este experimento demuestra que la adición de
pequeños elementos identificados en los ejemplos 1 y 2 podría ser
utilizada para incrementar la fuerza promotora de los elementos del
promotor basal derivados del promotor de AOX1 o del promotor
LEU2 de Saccharomyces cerevisiae.
\vskip1.000000\baselineskip
La aparición y frecuencia de cepas con múltiples
copias encontradas después de la transformación es exactamente la
misma que se ha descrito en el Ejemplo 4. El diferente sitio de
linealización en el plásmido no tuvo ninguna influencia sobre la
generación de cepas con múltiples copias.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Pichia pastoris
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaaggtaccag atctaacatc caaagacgaa ag
\hfill32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctagccatgg ttgaattctt tcgaataatt agttgttttt tg
\hfill42
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
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<211> 30
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<212> ADN
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<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgaaagaattc aaccatggct agcaaaggag
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgatgatggtc tagaacgtgt cagtcctgct cctc
\hfill34
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
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<211> 34
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgacacgttct agaccatcat catcatcatc attg
\hfill34
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
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<211> 26
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatagcggccg cacaaacgaa ggtctc
\hfill26
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
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<211> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
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\hfill54
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<212> ADN
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\hfill22
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\hskip1cm
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<212> ADN
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<212> ADN
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<213> Artificial
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<223>
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<400> 137
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\hskip-.1em\dddseqskipttctgaaccc cggtgcacct gtgccgaaac gcaaatgggg aaacacccgc
\hfill50
Claims (19)
1. Un promotor de alcohol oxidasa 1 (AOX1) de
Pichia pastoris mutante del promotor de AOX1 de Pichia
pastoris de tipo salvaje (SEQ ID No. 1) que comprende al menos
una mutación en los nucleótidos 694 a 723 (-260 a -231) del Seq ID
No. 1 para su expresión elevada en condiciones de
des-represión en relación con el promotor de AOX1 de
tipo salvaje.
2. El promotor de acuerdo con la reivindicación
1, caracterizado porque el promotor comprende adicionalmente
una mutación de los nucleótidos 170 a 239 (-784 a -719) y/o los
nucleótidos 729 a 763 (-225 a -191) del Seq ID No. 1 y/o de un sitio
de unión al factor de transcripción (TFBS) y/o de al menos una
mutación seleccionada del grupo que consiste en los nucleótidos 170
a 191 (-784 a -763), los nucleótidos 192 a 213 (-762 a -741),
nucleótidos 192 a 210
(-762 a -744), los nucleótidos 207 a 209 (-747 a -745), los nucleótidos 214 a 235 (-740 a -719), los nucleótidos 304 a 350 (-650 a -604), los nucleótidos 364 a 393 (-590 a -561), los nucleótidos 434 a 508 (-520 a -446), los nucleótidos 509 a 551 (-445 a -403), los nucleótidos 552 a 560 (-402 a -394), los nucleótidos 585 a 617 (-369 a -337), los nucleótidos 621 a 660 (-333 a -294), los nucleótidos 625 a 683 (-329 a -271), los nucleótidos 736 a 741 (-218 a -213), los nucleótidos 737 a 738 (-217 a -216), los nucleótidos 726 a 755 (-228 a -199), los nucleótidos 784 a 800 (-170 a -154) o los nucleótidos 823 a 861 (-131 a -93).
(-762 a -744), los nucleótidos 207 a 209 (-747 a -745), los nucleótidos 214 a 235 (-740 a -719), los nucleótidos 304 a 350 (-650 a -604), los nucleótidos 364 a 393 (-590 a -561), los nucleótidos 434 a 508 (-520 a -446), los nucleótidos 509 a 551 (-445 a -403), los nucleótidos 552 a 560 (-402 a -394), los nucleótidos 585 a 617 (-369 a -337), los nucleótidos 621 a 660 (-333 a -294), los nucleótidos 625 a 683 (-329 a -271), los nucleótidos 736 a 741 (-218 a -213), los nucleótidos 737 a 738 (-217 a -216), los nucleótidos 726 a 755 (-228 a -199), los nucleótidos 784 a 800 (-170 a -154) o los nucleótidos 823 a 861 (-131 a -93).
3. El promotor de acuerdo con la reivindicación
1 o 2, caracterizado porque la mutación es una deleción, una
sustitución, una inserción y/o una inversión.
4. El promotor de acuerdo con la reivindicación
2 o 3, caracterizado porque el sitio de unión al factor de
transcripción (TFBS) se selecciona del grupo que consiste en Hap1,
Hsf, Hap234, abaA, Stre, Rap1, Adr1, Mat1MC, Gcr1 y
QA-1F, donde el sitio de unión al factor de
transcripción (TFBS) Hap1 comprende preferiblemente los nucleótidos
54 a 58 del Seq ID No. 1, Hsf los nucleótidos 142 a 149 y 517 a 524
del Seq ID No. 1, Hap234 los nucleótidos 196 a 200, 206 a 210 y 668
a 672 del Seq ID No. 1, abaA los nucleótidos 219 a 224 del Seq ID
No. 1, Stre los nucleótidos 281 a 285 del Seq ID No. 1, Rap1 los
nucleótidos 335 a 339 del Seq ID No. 1, Adr1 los nucleótidos 371 a
377 del Seq ID No.1, Mat1MC los nucleótidos 683 a 687 del Seq ID No.
1, Gcr1 los nucleótidos 702 a 706 del Seq ID No. 1 y
QA-1F los nucleótidos 747 a 761 del Seq ID No.
1.
5. Una molécula de ácido nucleico que comprende
al menos un promotor de alcohol oxidasa 1 (AOX1) de Pichia
pastoris mutante de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4 y al menos un ácido nucleico que codifica una
proteína (péptido) o un ácido nucleico funcional,
caracterizado porque dicho promotor y dicho ácido nucleico
están conectados operablemente entre sí formando una casete de
expresión con una única copia o múltiples copias.
6. Un vector que comprende un promotor de
alcohol oxidasa 1 (AOX1) de Pichia pastoris mutante de
acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o una
molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 5.
7. Una célula que comprende al menos un promotor
de la alcohol oxidasa 1 (AOX1) de Pichia pastoris mutante de
acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, al menos
un fragmento de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 5 o
al menos un vector de acuerdo con la reivindicación 6.
8. Una célula de acuerdo con reivindicación 7,
caracterizada porque dicha célula es una célula eucariótica,
en particular una célula de levadura, preferiblemente una célula de
levadura metilotrófica, seleccionada preferiblemente del grupo que
consiste en Candida, Hansenula, Pichia y Torulopsis,
en particular una célula de Pichia pastoris.
9. Un kit para la expresión de una proteína
seleccionada que comprende
- i)
- un vector de acuerdo con la reivindicación 6, y
- ii)
- una célula capaz de expresar dicha proteína bajo el control de un promotor de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
\vskip1.000000\baselineskip
10. Un kit de acuerdo con la reivindicación 9,
caracterizado porque dicha célula es una célula de levadura,
preferiblemente una célula de levadura metilotrófica, seleccionada
preferiblemente del grupo que consiste en Candida, Hansenula,
Pichia y Torulopsis, en particular una célula de
Pichia pastoris.
11. Un método para la expresión de una proteína,
un péptido o un ácido nucleico funcional recombinantes en una célula
que comprende las siguientes etapas:
- -
- proporcionar una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 5 o un vector de acuerdo con la reivindicación 6 que comprende un promotor de AOX1 de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 y un ácido nucleico que codifica una proteína, péptido o ácido nucleico funcional, estando dicho promotor conectado operablemente a dicho ácido nucleico,
- -
- transformar dicha célula con dicho vector o dicha molécula de ácido nucleico,
- -
- cultivar la célula transformada en un medio de cultivo adecuado,
- -
- opcionalmente inducir la expresión de dicha proteína, péptido o ácido nucleico funcional y
- -
- aislar dicha proteína, péptido o ácido nucleico funcional expresados.
\vskip1.000000\baselineskip
12. El método de acuerdo con la reivindicación
11, caracterizado porque dicha célula es una célula de
levadura, preferiblemente una célula de levadura metilotrófica,
seleccionada preferiblemente del grupo que consiste en Candida,
Hansenula, Pichia y Torulopsis, en particular una célula
de Pichia pastoris.
13. El uso de una molécula de ácido nucleico de
acuerdo con la reivindicación 5, un vector de acuerdo con la
reivindicación 6 o una célula de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 7 u 8 para la expresión de una proteína, péptido o
ácido nucleico funcional.
14. Un método para el aislamiento de clones de
superexpresión que comprende las etapas de:
- a)
- introducir una molécula de ácido nucleico que comprende al menos un promotor de alcohol oxidasa 1 (AOX1) de Pichia pastoris mutante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 y al menos un ácido nucleico que codifica una proteína (péptido) o un ácido nucleico funcional y un gen de resistencia marcador, donde dicho promotor y dicho ácido nucleico están conectados operablemente entre sí formando una casete de expresión de una única copia o de múltiples copias o un vector que comprende dicha molécula de ácido nucleico en una célula,
- b)
- transferir la célula de la etapa a) a un medio que comprende un marcador selectivo apropiado y una fuente de carbono no represora sin metanol para el crecimiento selectivo de clones de superexpresión en condiciones de des-represión,
- c)
- incubar la célula de la etapa b) en dicho medio,
- d)
- aislar una colonia de la célula obtenida de la etapa c) y
- e)
- detectar los clones de superexpresión determinando la tasa de expresión de dicha célula.
\vskip1.000000\baselineskip
15. Un método de acuerdo con la reivindicación
14, caracterizado porque el marcador selectivo es un
antibiótico, preferiblemente Zeocina o geneticina.
16. Un método de acuerdo con la reivindicación
14 o 15, caracterizado porque el marcador selectivo es
Zeocina y el de resistencia marcador es el gen sh ble.
17. Un método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 14 a 16, caracterizado porque la célula
es una célula de levadura, preferiblemente una célula de levadura
metilotrófica, preferiblemente seleccionada del grupo que consiste
en Candida, Hansenula, Pichia y Torulopsis, en
particular una célula de Pichia pastoris.
18. Un método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 11 a 17, caracterizado porque la fuente
de carbono no represora se selecciona del grupo que consiste en
alanina, manitol, sorbitol, trehalosa, lactosa y sus
combinaciones.
19. Un método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 11 a 18, caracterizado porque la
molécula de ácido nucleico o el vector son introducidos en la célula
mediante transformación, preferiblemente electroporación o
transformación química, o mediante fusión de protoplastos, o
mediante bombardeo de partículas.
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