PT1851312E - Promotores de aox1 mutantes - Google Patents

Description

ΡΕ1851312 1 DESCRIÇÃO "PROMOTORES DE AOXl MUTANTES" A presente invenção refere-se a promotores de AOXl de Pichia pastoris mutantes. A S. cerevisiae dominou (e ainda domina) a utilização cientifica e biotecnológica como organismo eucariótico modelo e sistema de produção. No último século outra levedura ganhou uma grande atracção: a levedura de fissão Schizosaccharomyces pombe. Pelo seu atributo de se reproduzir apenas por fissão, S. pombe atraiu grande atenção como organismo modelo e hoje em dia é a espécie de levedura mais intensamente estudada em termos de genética molecular e biologia celular, em conjunto com S. cerevisiae. Entre mais de 700 diferentes espécies de levedura conhecidas até à data, as duas leveduras mencionadas acima podem proporcionar apenas um conjunto limitado de atributos interessantes para aplicações tecnológicas e cientificas. Desde os anos de 1970 ou 80 mais e mais espécies de levedura com características espantosas foram investigadas para biotecnologia e investigação. Estas denominadas leveduras não convencionais (NCY) ou leveduras não Saccharomyces (neste caso o termo Saccharomyces inclui a levedura Schizosaccharomyces pombe) são desenvolvidos para várias razões: estas possuem importância médica como Candida albicans ou com relevância tecnológica relevância 2 ΡΕ1851312 tecnológica como Yarrowia lipolytica e Kluyveromyces lactis que têm a capacidade de crescer em substratos particulares (e.g. n-alcanos, lactose). E.g., o patogénico humano mais comum C. albicans é estudado extensivamente para revelar a natureza dos factores de virulência envolvidas em patogénese tornando-se, deste modo o organismo modelo para leveduras patogénicas. Outro grupo bem estabelecido de NCY são as leveduras metanotróficas Pichia pastoris e Hansenula polymorpha (Pichia angusta) que são superiores a S. cerevisiae em termos de produção de proteína recombinante e estudos de biogénese do peroxissoma. Estes são apenas os membros mais proeminentes das leveduras não convencionais que ainda possuem um atractivo tecnológico ou académico. Até à data, várias outras espécies são de particular interesse e este grupo crescerá rapidamente nos próximos anos.

Os açúcares, a classe mais abundante de moléculas na natureza, são utilizados por todas as leveduras conhecidas. Embora existam grandes diferenças na aceitação do substrato de espécie para espécie (ver Tabela 1) , a conversão de glucose 6-fosfato ou frutose 6-fosfato em piruvato é um tema comum no metabolismo. De qualquer forma, o equipamento enzimático para a via glicolítica varia significativamente entre diferentes leveduras. Enquanto em S. cerevisiae a maioria das enzimas são conhecidas e caracterizadas, pelo menos parcialmente, apenas algumas enzimas foram descritas nas NCYs. Algumas das funções necessárias para a glicólise são mediadas por vários genes/enzimas em algumas leveduras, especialmente os que ΡΕ1851312 desempenham um papel adicional no controlo ou regulação do metabolismo e/ou estão num cruzamento como a gluco-cinase/hexocinase, fosfofrutocinase e gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase. Normalmente, as isoenzimas são reguladas diferencialmente indicando diversas funções sob alteração de requisitos ambientais. Alguns dos genes que codificam as enzimas glicoliticas são constitutivos e intensamente expressos, e.g., a PGKl (fosfoglicerato cina-se) de S. cerevisiae ou o gene GAP de P. pastoris (gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase) enquanto outras enzimas são estritamente reguladas como o gene EN01 (enolase) de S. cerevisiae.

Tabela 1: Leveduras seleccionadas de interesse biotecnológico com substratos comerciais relevantes para além de glucose e frutose

Levedura Metabolismo energético Substratos seleccionados S. cerevisiae Crabtree positiva Sacarose, maltose, rafinose, etanol S. pombe Crabtree positiva sacarose, maltose, rafinose Zygosaccharomyces bailii Crabtree positiva Ácido acético, etanol, glicerol Yarrowia lipolytica Crabtree negativa n-alcanos, ácidos gordos, etanol Pichia stipitis Crabtree negativa Xilose Pichia pastoris Crabtree negativa metanol, glicerol Hansenula polymorpha Crabtree negativa metanol, glicerol Schwanninomyces Crabtree negativa amido, n-alcanos, xilose, sacarose, occidentalis rafinose, trealose, lactose, etanol Kluyveromyces lactis Crabtree negativa lactose, sacarose, maltose, rafinose, etanol, glicerol, xilitol, lactato 0 destino do piruvato no metabolismo varia de 4 ΡΕ1851312 forma significativa entre as espécies de levedura e condições de cultura. Em S. cerevisiae e outras leveduras positivas denominadas Crabtree positivas, a respiração é inibida por glucose e açúcares relacionados. Isto leva à transformação do piruvato através da piruvato descarbo-xilase a etanol e CO2, mesmo sob quantidades elevadas de oxigénio, que é também conhecida como fermentação. Nas leveduras Crabtree negativas, a que a maioria das NCY pertence, a transformação de piruvato a etanol ocorre apenas sob condições anaeróbicas. Sob condições aeróbicas o piruvato é oxidado a CO2 através da piruvato desidrogenase e do ciclo do ácido tricarboxilico (TCA). 0 ciclo TCA é de grande interesse para o metabolismo celular devido ao facto de que é a única maneira para a oxidação de açúcares a CO2. A oxidação a CO2 resulta na produção de NADH, que é utilizada para produção de energia. Além disso, os intermediários do ciclo de TCA são as principais fontes de metabolitos para propósitos biossintéticos. Devido à remoção de intermediários do ciclo do TCA este tem de ser realimentado para continuar a acontecer. As principais reacções anapleróticas em leveduras são a piruvato carboxilase e o ciclo do glioxilato. 0 primeiro é a via principal quando cultivadas em amónio como fonte única de azoto enquanto a última é necessária quando cultivadas em fontes de carbono com menos do que 3 átomos de carbono. Em contraste com este interesse eminente quase nada é conhecido acerca dos genes ou enzimas envolvidas no ciclo do TCA em NCYs. 0 NADH produzido por reacções catabólicas, ou no citosol ou na mitocôndria, tem de ser reoxidado a 5 ΡΕ1851312 NAD+ para manter as reacções a acontecer. Nas leveduras Crabtree negativas (e.g. Pichia pastoris) sob condições aeróbicas, o NADH é reoxidado principalmente através da cadeia respiratória. A situação é significativamente diferente nas leveduras Crabtree positivas como S. cerevisiae em que a respiração e fermentação coexistem. Quando cultivadas em glucose sob condições aeróbicas, a respiração é reprimida por glucose e ocorre a fermentação. Sob estas condições o NAD+ é regenerado pela formação de etanol (NADH produzido por glicólise) ou glicerol. A respiração em leveduras difere do paradigma animal desta via como descrito em todos os livros de bioquímica. Primeiro, algumas leveduras, como S. cerevisiae e Kluyve-romyces lactis, não apresentam o complexo I da cadeia respiratória. Nestas leveduras a regeneração de NAD+ é efectuada sem bombear protões através da membrana mitocondrial interna por desidrogenases de NADH externas e internas. A segunda maior diferença, encontrada nas leveduras Crabtree negativas, fungos e plantas, é uma via de respiração alternativa em paralelo com o complexo III e IV da cadeia do citocromo. Esta respiração alternativa é mediada pela denominada oxidase alternativa que transfere electrões directamente da mistura de ubiquinona para o oxigénio sem bombear protões través da membrana mitocondrial interna. 0 NADPH para propósitos biossintéticos é produzido na parte oxidativa da via da pentose fosfato (PPP). Outros metabolitos muito importantes proporcionados 6 ΡΕ1851312 por esta via são a ribose 5-fosfato e a eritrose 4-fosfato, necessárias para a sintese de ácidos nucleicos e nucleótido co-factores e para a síntese de aminoácidos aromáticos, respectivamente. Existem ainda muitas faltas na informação acerca dos genes e das suas enzimas correspondentes envolvidas na PPP em leveduras não convencionais. Algumas enzimas foram isoladas a partir de Candida utilis, S. pombe e K. lactis. A caracterização composicional e cinética revelou várias diferenças entre estas enzimas. Devido à ausência de informação a influência PPP nestas leveduras não pode ser estimada mas verificou-se que e.g. os mutantes da fosfoglucose isomerase de K. lactis, que são deficientes em glicólise, são capazes de crescer em meio com glucose, em contraste com S. cerevisiae. Esta observação indica que a capacidade da via da pentose fosfato em K. lactis é suficiente para crescer em glucose como fonte de carbono. Em leveduras metilotróficas, pode ser encontrada uma adicional transcetolase (di-hidroxiacetona sintase) . Esta enzima é localizada nos peroxissomas e confere a assimilação de formaldeído no metabolismo celular por condensação com xilulose 5-fosfato com formação de di-hidroxiacetona e gliceraldeído 3-fosfato.

As leveduras como organismos eucarióticos unicelulares proporcionam sistemas de expressão atractivos para produção de proteína recombinante. Estes combinam prós de bactérias, como técnicas de manipulação genética bem desenvolvidas, simples, seguras e deste modo, técnicas de cultura pouco dispendiosas (larga escala), com o benefício 7 ΡΕ1851312 principal dos sistemas de expressão eucarióticos, nomeadamente o processamento de proteínas eucarióticas. Devido às razões acima mencionadas, a S. cerevisiae domino este campo durante muitos anos resultando num grande número de proteínas (e.g. insulina, HBsAg, HSA) produzidas neste organismo. S. cerevisiae mostra algumas limitações devido a hiperglicosilação, retenção de proteínas segregadas no espaço periplásmico, instabilidade do plasmídeo e baixo rendimento de produção. Para ultrapassar as limitações deste organismo simples, foi desenvolvido um pequeno conjunto de leveduras não convencionais como hospedeiros para a expressão de genes heterólogos. Entre outros, K. lactis, Y. lipolytica e as leveduras metilotróficas Candida boidinii, H. polymorpha e P. pastoris foram utilizadas, mas apenas as 2 últimas espécies ganharam um interesse comercial importante. A Schizosaccharomyces pombe exibe algumas características com elevada proximidade com eucarióticos superiores que tornam esta levedura uma hospedeira muito atractiva para a produção de proteína heteróloga: (1) o mecanismo de iniciação de transcrição é mais semelhante à dos eucarióticos superiores, (2) alguns promotores de mamífero são funcionais em S. pombe, (3) a capacidade da excisão/união de RNA, sublinhando a semelhança de componentes do splicossoma com os de mamífero, (4) o sinal de retenção no retículo endoplasmático de mamífero KDEL pode ser reconhecido, (5) a existência de resíduos de galactose nas glicoproteínas e (6) algumas outras modificações pós-tradução como acetilação e isoprenilação de proteínas são efectuadas numa forma mais semelhante aos mamíferos do que ΡΕ1851312 às células de levedura. Várias das características acima mencionadas podem aumentar a importância de S. pombe na produção de proteína recombinante num futuro próximo no que respeita à produção de proteínas heterólogas autênticas e suas aplicações de elevado processamento, como a genómica estrutural e funcional.

Todos os microrganismos possuem mecanismos para adaptar o seu metabolismo para utilização óptima de nutrientes disponíveis no ambiente. A adaptação rápida e precisa destas restrições ambientais é o factor principal de controlo do crescimento e outros parâmetros fisiológicos de todos os organismos. Para as leveduras, assim como para a maioria dos microrganismos a glucose é a fonte preferida de carbono e energia. Deste modo, não é surpreendente que a glucose, o monossacárido mais abundante na natureza, é um mensageiro principal para células que afectam o crescimento e desenvolvimento destes organismos por regulação da expressão do gene, principalmente, mas não exclusivamente, no nível de controlo de transcrição. A análise de transcrição genómico revelou que uma quantidade considerável de genes é regulada pelo nível de glicose ambiental determinado. Os genes com função metabólica conhecida na utilização de glucose como os transportadores de glucose de afinidade baixa e enzimas glicolíticas assim como genes que codificam proteínas ribossomais são induzidas por glucose. Por outro lado, a glucose reprime um largo conjunto de genes, incluindo os genes envolvidos na utilização de fontes de carbono alternativas, gluconeogénese, o ciclo do 9 ΡΕ1851312 glioxilato, funções peroxissómicas e respiração. A repressão da respiração (efeito Crabtree) ocorre apenas em poucas espécies de leveduras (leveduras fermentativas, Crabtree positivas) como Saccharomyces cerevisiae enquanto na maioria das espécies de levedura a glucose não reprime a respiração (Crabtree negativa). Embora tenha sido conseguido um vasto conhecimento sobre a maquinaria de repressão pela glucose ao longo dos últimos 20 anos, principalmente com base na levedura Saccharomyces cerevisiae, o seu mecanismo actual, especialmente na parte a montante dos sensores e sinalização de glucose, não está completamente compreendida. No entanto, para obter uma melhor compreensão do presente trabalho, alguns dos participantes na repressão de catabolitos de carbono como descrito para S. cerevisiae são descritos resumidamente a seguir. O gene SNFl codifica para uma proteína cinase de Ser/Thr que pode ser encontrada em complexos de massa molecular elevada em células de leveduras. É regulada pelas alterações conformacionais no complexo causadas pela fosforilação na subunidade reguladora de Snflp. Até à data 3 cinases a montante (Paklp, Elmlp e Tos3p) são identificadas para fosforilar e, deste modo, activar Snflp. A sua actividade é absolutamente necessária para a desrepressão de uma vasta variedade de genes reprimidos pela glucose. Deste modo, não é surpreendente que Snflp ou homólogos estejam largamente conservados em eucarióticos. A proteína dedo de zinco Miglp é capaz de se 10 ΡΕ1851312 ligar a regiões do promotor de uma vasta variedade de genes reprimida pela glucose. Muito provavelmente actua por recrutamento do complexo geral repressor Ssn6(Cyc8)-Tuplp. A função de Miglp é controlada pela proteína cinase Snfl, embora não haja uma clara evidência de uma fosforilação directa. Miglp está localizada no núcleo na sua forma não fosforilada. A remoção de glucose causa a fosforilação de Miglp seguida por translocação para o citoplasma. Quando a glucose é adicionada às células, Miglp move-se rapidamente de volta para o núcleo e reprime a transcrição. A Adrlp também pertence à família de proteínas dedo de zinco e verificou-se ser um efector positivo das proteínas peroxissómicas e o gene ADH2, que codifica para a álcool desidrogenase II reprimida por glucose. A expressão de ADRl é regulada negativamente pela glucose através da proteína cinase dependente do AMP cíclico AMP (cAMP) em níveis elevados de cAMP. O principal efeito regulador aparece ao nível da tradução de mRNA, mas os efeitos reguladores na transcrição assim como na estabilidade de mRNA foram também observadas, dependendo na estirpe de S. cerevísíae analisada.

Para um grande número de genes, incluindo muitos dos genes envolvidos no metabolismo respiratório, a transcrição é activada em fontes de carbono não fermentáveis pelo complexo Hap2/3/4/5. Para alguns genes envolvidos na respiração como CYC1 (que codifica para o iso-l-citocromo c) e COX6 (subunidade VI da citocromo c oxidase) foi 11 ΡΕ1851312 estabelecido que Snfl é necessário para a desrepressão após crescimento em glucose. A transcrição de HAP4 é reprimida quando a glucose está presente, embora um envolvimento directo de Hap4p ou Snflp na desrepressão não possa ser demonstrado.

Gcrlp é uma proteína activadora de transcrição principal de genes glicolíticos (e.g. enolase, gliceral-deído 3-fosfato desidrogenase) . Gcrlp, em conjunto com o factor de transcrição geral Raplp é o principal item da expressão glicolítica do gene no que respeita a coordenação da transcrição e é absolutamente necessário para a expressão de nível elevado. 0 perfil de expressão genómica do tipo selvagem e do mutante de S. cerevisiae gcrl em crescimento em várias fontes de carbono revelou 53 grelhas de leitura aberta (ORFs), incluindo genes da glicólise, como dependentes de Gcrlp.

Esta descrição de alguns factores de transcrição e da via de Snflp e Miglp deve dar uma curta visão de alguns dos participantes na rede de repressão pela glucose. Deve ser notado que existem mais ciclos de regulação do que o da via de Snflp para a repressão pela glucose. Embora um amplo conhecimento sobre os sensores e sinalizadores para a glucose tenha sido conseguido nos últimos 20 anos, permanecem ainda por responder questões importantes: qual é a natureza do sinal de glucose como são as conhecidas vias de sinalização reguladas e integradas. 12 ΡΕ1851312

Um número limitado das espécies de levedura é capaz de crescimento em metanol como fonte única de carbono e energia. Estas pertencem a um dos quatros géneros Pichia, Hansenula, Candida e Torulopsis e partilham uma via de utilização por metanol que é expressa após desrepressão ou indução com metanol (ver 1.3.1). Uma vez que as reacções iniciais desta via são compartimentalizados nos peroxis-somas, estes organitos são também induzidos. Devido à forte indução dos peroxissomas, as leveduras Candida boidinii, Pichia metanolica, Pichia pastoris e Hansenula polymorpha foram frequentemente utilizadas em biologia celular para estudar a biogénese e função dos peroxissomas.

Como mencionado acima as leveduras metilotróficas partilham a via comum de utilização de metanol. 0 primeiro passo é a oxidação de metanol a formaldeido e peróxido de hidrogénio, catalisado por álcool oxidases (AOX, EC 1.1.3.13). A H2O2 tóxica é decomposta em oxigénio e água pela acção de catalase. Ambas as enzimas são sequestradas em peroxissomas. 0 formaldeido é oxidado por duas reacções de desidrogenase subsequentes ou assimiladas no metabolismo celular pela condensação com xilulose 5-fosfato (Xu5P). 0 formaldeido é oxidado a formato e depois a dióxido de carbono através de uma desidrogenase de formaldeido dependente de glutationa (GSH) e uma formato desidrogenase, ambas localizadas no citosol. 0 NADH, produzido em ambas as reacções, é utilizado para produzir energia para crescimento em metanol. A reacção de condensação ocorre nos peroxissomas e é catalisado pela acima mencionada sintase 13 ΡΕ1851312 de transcetolase de di-hidroxiacetona. Os compostos C3 di-hidroxiacetona (DHA) e gliceraldeído 3-fosfato (GAP) resultantes são depois metabolizados no citosol. Após uma fosforilação de DHA, a frutose 1, β-bisfosfato (FBP) é formada por uma reacção de aldolase de di-hidroxiacetona fosfato (DHAP) e GAP. A FBP é convertida em frutose 6-fosfato por uma fosfatase e a xilulose 5-fosfato (Xu5P) é regenerada na via da pentose fosfato. Um terço do GAP produzido entra na via da gluconeogénese para a síntese de constituintes da célula.

As enzimas chave da via da utilização de metanol, álcool oxidase e formato desidrogenase, são produzidas níveis muito elevados após a indução com metanol. A álcool oxidase pode contribuir com mais de 30% da proteína total solúvel, sintase de di-hidroxiacetona e formato desidrogenase até 20%. Os peroxissomas, que são também induzidos, podem contribuir com mais de cerca de 80% do volume de células. As sequências do promotor de vários genes de utilização de metanol foram desenvolvidas para a produção de proteína recombinante. Entre outros, estes promotores fortes e indutíveis são uma das razões para a vasta utilização de Pichia pastoris e Hansenula polymorpha como hospedeiras para a produção de proteína.

Em H. polymorpha e C. boidinii um gene codifica para uma álcool oxidase: MOX (metanol oxidase, H. polymorpha) e AODl (álcool oxidase, C. boidinii) . 2 genes foram encontrados em duas espécies de Pichia: P. pastoris 14 ΡΕ1851312 (AOXl e A0X2) e P. metanolica (AUGl e AUG2, gene de utilização de álcool, ou M0D1 e M0D2), com Aoxlp e Auglp sendo a principal a álcool oxidase. A comparação de regiões codificantes revelaram 73-85% de semelhança no nivel de aminoácidos entre as leveduras metilotróficas [1]. A homologia entre as ORFs (grelhas de leitura aberta) AOXl e A0X2 de P. pastoris é 92% e 97% aos niveis de sequência de nucleótidos e de aminoácidos, respectivamente [2, 3]. A álcool oxidase é uma flavoproteina octamérica contendo uma FAD ligada não covalentemente ou um análogo modificado (mFAD) por subunidade. A tradução de AOX ocorre em ribos-somas livres seguida por uma importação pós-tradução nos peroxissomas. A translocação em peroxissomas é dirigida através de uma sequência PTSl (sinal de direccionamento ao peroxissoma do tipo 1) na sua extremidade C-terminal. Os oligómeros de Aox são formados apenas após a importação para a matriz do peroxissoma.

Nas C. boidinii e P. pastoris não podem ser encontrados oligómeros Aox no citosol em contraste com a sintase de di-hidroxiacetona, que forma um dímero no citosol antes da sua translocação na matriz do peroxissoma. Não apenas a sequência do promotor da álcool oxidase 1 de Pichia pastoris, mas também a enzima é de interesse biotecnológico devido a uma vasta gama de substratos (álcoois primários insaturados e saturados com um comprimento de cadeia de curta a moderada) e uma elevada estabilidade sob várias condições de reacção. A regulação de todos os genes da álcool oxidase ocorre ao nivel da transcrição e mais 15 ΡΕ1851312 provavelmente no estádio de iniciação da transcrição. Embora AOXl e A0X2 sejam reguladas de forma semelhante (o mRNA não detectável em glicerol ou glucose, detectável em fase de jejum de carbono, elevadas quantidades de metanol), as suas regiões 5' de flanco não partilham homologia significativa [2, 4].

Cada locus AOX exibe um sitio putativo de ligação de RNA polimerase (TATAAA; Goldberg-Hogness ou TATA box) na posição -43 relativamente ao sitio primário de iniciação de transcrição. Ambas as sequências líder de mRNA de AOX de P. pastoris são extremamente ricas em resíduos A e anormalmente longas por leveduras (115 nucleótidos (nt) para A0X1 e 160 nt para AOX2) . As regiões de iniciação de tradução à volta do codão de iniciação ATG (sequência de Kozak; AOXl: CGAAACG ATG GCT, A0X2: GAGAAAA ATG GCC) são consistentes com sequências de consenso previamente descritas para S. cerevisiae e eucarióticos superiores. O papel fisiológico do segundo gene da álcool oxidase em P. pastoris e P. metanolica é ainda obscuro. A interrupção de AOXl ou AUG1 causa graves defeitos de crescimento nestas estirpes (o denominado fenótipo de utilização de metanol lenta (Muts)) enquanto as estirpes aox2 e aug2 apresentam taxas de crescimento comparáveis com a estirpe do tipo selvagem. Foram observadas 9 múltiplas formas da álcool oxidase em P. metanolica que representam uma oligomerização aleatória dos 2 produtos dos genes Auglp e Aug2p. AUG1 e AUG2 são reguladas diferencialmente: em jejum de carbono e baixa concentração de metanol apenas a Auglp pode ser 16 ΡΕ1851312 detectada, e com uma concentração crescente de metanol a proporção de Aug2p para Auglp aumenta. A alteração para octâmeros com conteúdo elevado de Aug2p é devida a um aumento na expressão de AUG2, regulada ao nível da transcrição. Os valores de Km para metanol dos dois homo-octâmeros de Auglp e Aug2p são cerca de 0,56 e 5,6 mM, respectivamente. Em conjunto com esta observação, a interrupção de AUGl causa um defeito de crescimento com baixas concentrações de metanol [5], estes resultados implicam que AUG2 é uma vantagem para P. metanolica quando cresce em concentrações elevadas de metanol. Em Pichia pastoris nem o papel do gene A0X2 foi analisado em mais detalhe nem existiam condições favoráveis para que possuísse um segundo gene de álcool oxidase. Uma vez que as condições de laboratório representam apenas uma fracção muito pequena de condições são confrontados com microrganismos de vida livre, devem existir situações na natureza em que o gene AOX2 tem importância selectiva para P. pastoris. A expressão de AODl de C. boidinii e MOX de H. polymorpha é estritamente reprimida durante o crescimento em glucose ou etanol como única fonte de carbono, desre-primida em glicerol e fortemente induzida em metanol. A expressão destas duas enzimas é também reprimida quando glucose e metanol estão presentes no meio. Se o glicerol está presente, o metanol é capaz de induzir a expressão do gene. A transcrição de AODl e MOX é também desreprimida em jejum de carbono e reprimida quando o etanol está presente 17 ΡΕ1851312 [6-9]. Dois mecanismos reguladores distintos são responsáveis para a repressão do metabolismo da utilização de metanol por etanol ou glucose [10, 11]. Em Pichia pastoris a situação é significativamente diferente: a AOXl é reprimida quando glucose, etanol ou glicerol está presente no meio (em concentrações não limitantes do crescimento). A desrepressão em jejum de carbono e indução por metanol são semelhantes à de AODl e MOX. As fontes de carbono com que a expressão de AOXl é desreprimida são e.g., sorbitol, manitol, trealose e alanina [12].

Após a alteração de metanol para uma fonte de carbono repressora como glucose ou etanol, os peroxissomas são degradados em horas durante a adaptação à nova fonte de carbono. A degradação proteolitica no vacúolo de levedura segue de novo dois mecanismos distintos quando adaptados a glucose ou etanol, denominados micro- e macroautofagia, respectivamente.

Como mencionado acima, as leveduras metilotró-ficas Pichia pastoris e Hansenula polymorpha são amplamente utilizadas para a produção de proteína recombinante. Até agora, mais do que 500 proteínas foram produzidas em P. pastoris. O seu desenvolvimento foi conduzido por algumas características, que lhes conferem vantagens entre os hospedeiros de expressão recombinante: 1) estas partilham as vantagens gerais das leveduras em termos de manipulação genética e tecnologia de cultivo (laboratorial e de larga-escala); 2) a capacidade para crescer a densidades celu- 18 ΡΕ1851312 lares extremamente elevadas; e 3) a produção de proteína recombinante a níveis elevados (segregados ou intracelulares) . Os promotores fortes indutíveis de genes que codificam para reacções da via de utilização de metanol foram desenvolvidos for produção de proteína recombinante. As mais amplamente utilizadas são as regiões do promotor dos genes da álcool oxidase A0X1 e MOX de P. pastoris e H. polymorpha, respectivamente. Mas também outras regiões do promotor dos genes da via de utilização de metanol foram utilizadas para conduzir a produção de proteína recombinante: promotores de FMD (formato desidrogenase) e DASl (sintase de di-hidroxiacetona) em H. polymorpha e C. boidinii e o promotor de FLDl (formaldeído desidrogenase) em P. pastoris. 0 último pode também ser induzido com metilamina como fonte única de azoto com glucose como uma fonte de carbono. Os promotores para a expressão constitutiva de genes estranhos estão também disponíveis: o elemento promotor de GAP (gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase) em P. pastoris e o promotor de PMAl (que codifica para a H+-ATPase da membrana plasmática) em H. polymorpha. Várias combinações de estirpe hospedeira auxotrófica/gene marcador foram desenvolvidas para P. pastoris (e.g. HIS4) e H. polymorpha (e.g. LEU2 e URA3). Os marcadores de selecção dominantes estão também disponíveis (e.g. resistência a Zeocin™, G418). A integração de genes em leveduras me-tilotróficas é efectuada principalmente (se não exclusivamente) por integração homóloga. Os vectores que comportam uma região ARS (sequência de replicação autónoma) estão também disponíveis mas estes são normalmente bastante 19 ΡΕ1851312 instáveis se a pressão selectiva é aliviada, o que resulta na sua limitada aplicação tecnológica. Em P. pastoris o gene estranho é integrado especificamente no sitio do locus AOXl ou no HIS4. Outros sítios de integração possíveis são e.g. o locus GAP (para a expressão de GAP) ou quaisquer outros loci marcadores de selecção (e.g. ADEl, URA3, ARG4 e LEU2). Nas cassetes de expressão de H. polymorpha são aleatoriamente integradas num arranjo cabeça-para-cauda levando a integrantes mitoticamente estáveis com um número de cópias elevado (até 100) . No entanto, um elevado número de cópias frequentemente não resulta num elevado nível de expressão. Os factores adicionais de grande influência são: estrutura da cassete de integração, natureza e estrutura da proteína a ser expressa e o sítio de integração. Especialmente, a estrutura da cassete de integração tem grande influência no efeito da dosagem do gene. Uma outra discussão de como optimizar a cassete de expressão e a dosagem do genes é dada em [13, 14] . As leveduras metilotróficas pertencem ao grupo de leveduras Crabtree negativas, deste modo a produção de etanol ocorre a um nível muito baixo quando cultivadas sob condições aeró-bicas. Devido a este facto estas leveduras podem ser cultivadas em densidades celulares muito elevadas em culturas em fermentador resultando em rendimentos elevados do produto. A produção de proteína conduzida por AOXl pode ainda ser aumentada 3-5 vezes quando a concentração de metanol no biorreactor está em esferas de limitação de crescimento. O facto de que P. pastoris segrega, sob condições convencionais, apenas pequenas quantidades de 20 ΡΕ1851312 proteínas endógenas torna cada proteína recombinante segregada a mais abundante no meio. A secreção pode servir como um substancial primeiro passo do processo de purificação a jusante. Para a secreção de proteína, a sequência pré-pró líder de S. cerevisiae MFal (factor de cruzamento a) e as sequências derivadas da fosfatase ácida (PHOl) são amplamente utilizadas em P. pastoris e H. polymorpha. Em alguns casos foi obtida secreção suficiente com proteínas de plantas, de fungos e de mamíferos que comportavam os seus sinais de secreção naturais. Como mencionado acima, as leveduras são capazes de efectuar modificações pós-tradução como a formação de ligações persulfureto, processamento de sequências sinal (e.g. sequência líder pré-pró de MFal), adição de lípido e glicosilação ligada a N- e 0-. Enquanto nas células de mamífero são produzidas estruturas altamente complexas compostas por oligossacáridos ligados a N- e O- de uma variedade de açúcares (e.g. N-acetilglucosamina, galactose, e ácido siálico), a maior parte das leveduras produz um tipo de estruturas com manose elevada sem algumas entidades de açúcar como galactose ou ácido siálico. Estas estruturas não mamíferas podem resultar em graves problemas para a aplicação terapêutica, principalmente devida ao seu elevado potencial de imunogenicidade. Em H. polymorpha e P. pastoris, em contraste com S. cerevisiae, a hiperma-nosilação é menos abundante e no terminal hiper-imunogénico as manoses ligadas em a-1,3 são incorporadas em oligossacáridos ligadas em N. Para ultrapassar os problemas de imunogenicidade (e alguns outros como baixa estabilidade no 21 ΡΕ1851312 fluxo de sangue) os esforços foram no sentido de humanizar as estruturas de oligossacárido derivadas de levedura, e, como revela a recente literatura, especialmente em P. pastoris. Até à data, a grande maioria dos temas de pesquisa e processos comerciais baseiam-se na levedura S. cerevisiae bem conhecida. Devido a um conhecimento crescente acerca das leveduras não convencionais, em conjunto com as aparentes vantagens em termos de fermentação em larga-escala e casos de glicosilação, H. polymorpha e P. pastoris tornaram-se rapidamente a levedura de eleição. Isto é salientado pelo facto de que vários processos de produção foram implementados na indústria.

Na WO 02/081650 é revelada a identificação de regiões AOXl do promotor, o que pode ser utilizado para a construção de promotores de AOXl mutantes. Uma vez que as regiões das sequências removidas do promotor de AOXl aqui reveladas são muito longas, o efeito acumulado e não os efeitos singulares das sequências reguladoras distintas do promotor podem observadas. No entanto, esta abordagem não permite o desenvolvimento de promotores fortemente intensi-ficadores. Especialmente quando se constroem novos promotores possuindo caracteristicas melhoradas por deleção ou por duplicação de partes do promotor original, é necessário o conhecimento da sequência reguladora exacta. É um objectivo da presente invenção proporcionar um promotor de AOXl melhorado com propriedades melhoradas de modo a facilitar o processamento a jusante na produção 22 ΡΕ1851312 de proteína, para aumentar os rendimentos de tempo e espaço e para ajudar a melhorar a qualidade do produto.

Outro objectivo é proporcionar um forte promotor de A0X1 num vector ou numa estirpe hospedeira que antecipa parcial ou totalmente a repressão por glucose. É vantajoso ter um promotor que conduz uma forte expressão na presença de elevadas concentrações de glucose.

Um outro objectivo da presente invenção é proporcionar um promotor de A0X1 que permite a produção de a proteína empregando uma quantidade reduzida de metanol ou sem metanol. Estes promotores terão um impacto significativo nos processos de produção industrial. Devido a questões de segurança, é necessário equipamento especial para as unidades de produção empregando metanol como um indutor. Isto contradiz as aplicações de Pichia pastoris em muitas unidades de produção menos especializadas. Adicionalmente, a estabilidade da proteína na presença de metanol pode dificultar indução com base em metanol da expressão de proteína. Isto é menos crítico para a produção de proteínas industriais robustas, mas torna-se uma questão principal para e.g. proteínas terapêuticas segregadas. A construção destes promotores requer o conhecimento de porções específicas (e.g. elementos reguladores, sítios de ligação do factor de transcrição) do promotor de A0X1 de Pichia pastoris do tipo selvagem que - quando mutado de alguma forma - apresenta um efeito no compor- 23 ΡΕ1851312 tamento da expressão. Deste modo, é um objectivo da presente invenção para identificar estas porções e para proporcionar deste modo os meios para criar os promotores de AOXl com caracteristicas melhoradas.

Deste modo a presente invenção refere-se a um promotor da álcool oxidase 1 (AOXl) de Pichia pastoris mutante do promotor de AOXl de Pichia pastoris do tipo selvagem (Seq ID N° 1) como definido nas reivindicações. 0 referido promotor mutante pode ainda compreender pelo menos uma mutação seleccionada a partir do grupo consistindo em: a) a sitio de ligação do factor de transcrição (TFBS), b) nucleótidos 170 a 191 (-784 a -763) , nucleótidos 192 a 213 (-762 a -741), nucleótidos 192 a 210 (-762 a -744), nucleótidos 207 a 209 (-747 a -745), nucleótidos 214 a 235 (-740 a -719), nucleótidos 304 a 350 (-650 a -604), nucleótidos 364 a 393 (-590 a -561), nucleótidos 434 a 508 (-520 a -446), nucleótidos 509 a 551 (-445 a -403), nucleótidos 552 a 560 (-402 a -394), nucleótidos 585 a 617 (-369 a -337), nucleótidos 621 a 660 (-333 a -294), nucleótidos 625 a 683 (-329 a -271), nucleótidos 736 a 741 (-218 a -213), nucleótidos 737 a 738 (-217 a -216), nucleótidos 726 a 755 (-228 a -199), nucleótidos 784 a 800 (-170 a -154) ou nucleótidos 823 a 861 (-131 a -93) de Seq ID N° 1, e suas combinações. Os números em parênteses (negativos) ao longo da descrição reflectem as posições correspondentes do promotor em relação ao codão de iniciação de tradução (e.g. ATG). Por 24 ΡΕ1851312 exemplo, "A" de "ATG" na sequência de ácido nucleico compreendendo NxGACTATGNy corresponde à posição +1, enquanto "T" antes do "A" de "ATG" corresponde à posição -1.

De acordo com a presente invenção, o promotor mutante de AOXl compreende pelo menos uma mutação num sitio de ligação do factor de transcrição e/ou uma da gama das sequências de ácido nucleico delineadas acima. Verificou-se que especialmente estas regiões do promotor de A0X1 são adequadas a modificar o referido promotor de modo a alterar as suas caracteristicas. Obviamente, também uma combinação das mutações apresentadas acima pode ser introduzida para estimular os aspectos caracteristicos de um promotor de AOXl (e.g. duas mutações de TFBS seleccionadas a partir de a) , uma mutação de TFBS seleccionada a partir de a) e uma mutação seleccionada a partir de b), uma mutação seleccionada a partir de a) e duas mutações seleccionadas a partir de b)). Por exemplo, uma mutação de um TFBS pode ser combinada com uma mutação nos nucleótidos 737 a 738 (-217 a -216) e/ou nucleótidos 207 a 209 (-747 a -745) da Seq ID N° 1. A expressão de uma proteína sob o controlo de um promotor de AOXl em Pichia pastoris é induzida geralmente pela adição de metanol e inibida pela presença de glucose no meio. De modo a intensificar ou a reduzir o efeito dos referidos aditivos do meio na expressão de proteína, o promotor é preferencialmente mutado nas regiões do promotor as apresentado acima. A eficácia dos promotores de AOXl mutados para produzir uma proteína de interesse varia dependendo da quantidade (í. e. cópias) do vector integrado 25 ΡΕ1851312 no cromossoma do hospedeiro. Especialmente as estirpes multicópia vieram mostrar efeitos intensificados do promotor. Uma vez que a resistência a antibiótico de estirpes de Pichia depende do número de cassetes de resistência a antibiótico (vectores introduzidos num hospedeiro compreendem preferencialmente uma cassete de resistência a antibiótico permitindo ao hospedeiro o crescimento num meio compreendendo um antibiótico como marcador selectivo) integrado no cromossoma do referido hospedeiro, as estirpes multicópia podem ser produzidas por aplicação de concentrações crescentes de antibiótico (no intervalo 10 yg/mL a 10 mg/mL, preferencialmente 50 yg/mL a 1000 mg/mL; dependendo do antibiótico utilizado; por exemplo, geneticina: 0,1 a 10 mg/mL, preferencialmente 0,2 a 5 mg/mL, particularmente 0,25 a 4 mg/mL, zeocina: 10 a 5000 yg/mL, preferencialmente 50 a 3000 yg/mL, particularmente 100 a 2000 yg/mL) em placas de agar selectivas para aumentar a pressão selectiva (e.g. [14]; Scorer, C.A. et al. (1994) Bio/Technology 12:181-184). No entanto, verificou-se que o crescimento das células que comportam uma multiplicidade de cassetes de resistência a antibiótico não é apenas dependente da concentração do antibiótico mas também dependente do tempo. Deste modo, as estirpes multicópia são capazes de crescimento até colónias detectáveis num meio contendo a mesma concentração de antibiótico num período de tempo mais curto do que as estirpes unicópia. Este comportamento permite a uma pessoa especialista na técnica detectar e isolar estirpes multicópia antes das estirpes unicópia começarem a crescer. Por exemplo, uma estirpe que comporta 26 ΡΕ1851312 uma cópia única de uma cassete de resistência a antibiótico cresce numa placa de agar até um tamanho de colónia detectável em 72 h, enquanto que a mesma estirpe que composta mais do que uma cópia da referida cassete cresce em 24 a 48 h até ao mesmo tamanho.

Especialmente as estirpes multicópia que comportam um promotor de AOXl com mutações nos nucleótidos 694 a 723 (-260 a -231) e nos nucleótidos 737 a 738 (-217 a -216) apresentaram surpreendentemente taxas de expressão intensificadas.

De modo a aumentar a eficiência de expressão de proteína de um hospedeiro na presença de metanol, os nucleótidos 170 a 235 (-784 a -719) do promotor de AOXl (Seq ID N° 1) são preferencialmente mutados. A mutação nesta região aumenta a expressão de proteína a 120 a 130 % em comparação com o promotor de AOXl do tipo selvagem, desde que o plasmídeo portador do promotor mutante de AOXl é integrado no cromossoma/genoma do hospedeiro apenas uma vez (mutante de cópia única). No entanto, as mutações em todas as outras regiões acima mencionadas reduzem ou não afectam a eficácia do metanol para induzir a expressão de proteína. Em contraste com isto, as mutações nas regiões do promotor do promotor de AOXl do tipo selvagem (como apresentado acima) leva - dependendo da mutação - à expressão de proteína aumentada e diminuída sob condições de desrepressão (e.g. ver Tabela 13, exemplo 1). 27 ΡΕ1851312

No entanto, as estirpes recombinantes portadoras de mais do que uma cópia dos promotores de A0X1 mutados resultam em estirpes possuindo uma actividade intensificada sob condições de desrepressão e indução por metanol (estirpes multicópia, e.g. ver Fig. 7, exemplo 2). Em detalhe, as estirpes multicópia portadoras de mutações nos nucleótidos 694 e 723 de Seq ID N° 1 (d6), nos nucleótidos 694 e 723 (-260 e -231) de Seq ID N° 1 (d6), nos nucleótidos 694 e 723 (-260 e -231) e nos nucleótidos 304 e 350 (-650 e -604) de Seq ID N° 1 (d2d6), em TFBS, especialmente em Rapl, Gcrl, QA- 1F, Hsf_l, Adrl, Hsf_2, MatlMC, abaA e Hap2345, apresentam uma expressão aumentada sob condições de desrepressão e e/ou sob indução por metanol em comparação com a expressão de proteínas sob o controlo do promotor de AOXl do tipo selvagem. Sob condições de desrepressão algumas destas estirpes multicópia apresentam uma expressão de proteínas que é cerca de 10 vezes aumentada em comparação com as expressões sob o controlo do promotor do tipo selvagem. Na presença de metanol como indutor, a eficiência de expressão é mais do que 5 vezes intensificada quando um promotor de acordo com a presente invenção é empregue. Deste modo, estas mutações, especialmente quando presentes no hospedeiro numa forma multicópia, são preferencialmente empregues para a expressão de proteínas. A combinação de duas ou mais das mutações acima mencionadas pode ainda intensificar a força do promotor (ver e.g. Fig. 7, exemplo 2). O sítio de ligação dos factores de transcrição 28 ΡΕ1851312 pode ser identificado experimentalmente (e.g. por alteração da mobilidade ou análise de footprint) ou por comparação de sequências com sítios de ligação do factor de transcrição conhecidos (e.g. por análise por computador, [15]). 0 conhecimento de regiões do promotor que influenciam a força e as características do referido promotor podem ser utilizados para conceber promotores com propriedades distintas (expressão elevada de proteína sob condições de desrepressão e/ou expressão elevada de proteína na presença de metanol) . Além disso, estas propriedades podem ser intensificadas ou alteradas se estes promotores mutantes são integrados uma ou mais vezes no genoma do hospedeiro (e.g. ver exemplos 1 a 3) .

No entanto, em alguns casos a actividade do promotor deve ser diminuída em vez de aumentada. Especialmente a co-expressão de proteínas reguladoras como cinases, fosforilases e proteínas auxiliares, tais como e.g. chaperones, isomerase de persulfureto de proteínas, cis-trans isomerases, foldases, isomerases de persulfureto de proteínas e proteases, tem de ser, em muitos casos, baixa em comparação com o produto principal, que pode ser produzido pela célula sob o promotor do tipo selvagem ou sob um promotor melhorado de acordo com a presente invenção. Especialmente, a expressão combinada de dois produtos diferentes (e.g. uma proteína auxiliar e o produto principal) sob o controlo de um promotor de A0X1 com actividade aumentada e um promotor de A0X1 com actividade 29 ΡΕ1851312 diminuída (em comparação com a actividade do tipo selvagem), respectivamente, tornou-se vantajoso porque a taxa de expressão do produto principal e a do secundário diferem ainda mais do que se forem utilizados os promotores de A0X1 do tipo selvagem. A expressão reduzida pode ser preferencialmente obtida por deleção dos sítios de ligação do activador como HSF ou HAP ou por inserção dos sítios de ligação do repressor no promotor de A0X1 do tipo selvagem. Deste modo, a utilização de promotor de A0X1 com actividade reduzida evita a sobrecarga da maquinaria de expressão de proteína da célula, que terá a consequência, de reduzir o rendimento do produto principal. Por exemplo, Bessette PH et al. (PNAS USA (1999) 96: 13703-13708) pode mostrar que a expressão de um polipéptido activo pode ser aumentada significativamente pela co-expressão de uma tiorredoxina.

De acordo com uma forma de realização preferida, o promotor compreende ainda uma mutação nos nucleótidos 694 a 723 (-260 a -231) e/ou nucleótidos 729 a 763 (-225 a -191) de Seq ID N° 1.

Uma mutação que afecta estes intervalos de nucleótido em combinação com uma mutação como apresentado acima resulta numa actividade de promotor ainda mais melhorada. Por exemplo, uma dupla mutação que afecta os nucleótidos 694 a 723 (-260 a -231) e os nucleótidos 737 a 738 (-217 a -216) de Seq ID N° 1 leva a um promotor apresentando níveis de expressão elevados sob desrepressão, assim como sob condições de indução em comparação com os 30 ΡΕ1851312 níveis de expressão sob as mesmas condições do promotor do tipo selvagem. O efeito desta dupla mutação pode ser intensificado quando o ácido nucleico compreendendo o promotor é introduzido na célula em mais do que uma cópia (resultando num clone multicópia). A mutação é preferencialmente uma deleção, uma substituição, uma inserção, uma inversão e/ou uma multiplicação .

De modo a modificar as características do promotor do tipo selvagem de AOX1 de Pichia pastoris são possíveis vários tipos de mutação. O promotor que se expande compreendendo as regiões acima mencionadas (sítio de ligação dos factores de transcrição (TFBS), nucleótidos 170 a 235 (-784 a -719), 170 a 191 (-784 a -763), 192 a 213 (-762 a -741), 192 a 210 (-762 a -744), 207 a 209 (-747 a -745), 214 a 235 (-740 a -719), 304 a 350 (-650 a -604), 364 a 393 (-590 a -561), 434 a 508 (- 520 a -446), 509 a 551 (-445 a -403), 552 a 560 (-402 a -394), 585 a 617 (-369 a -337), 621 a 660 (-333 a -294), 625 a 683 (-329 a -271), 694 a 723 (-260 a -231), 729 a 763 (-225 a -191), 736 a 741 (-218 a -213), 737 a 738 (- 217 a -216), 726 a 755 (-228 a -199), 784 a 800 (-170 a -154) ou 823 a 861 (-131 a -93) de Seq ID N° 1) pode ser parcialmente ou completamente removido, parcialmente ou completamente substituído com outros nucleótidos ou sequências de ácido nucleico, interrompidas pela inserção de nucleótidos únicos ou sequências de ácido nucleico, invertido parcialmente ou completamente ou multiplicado. Todas estas mutações levam a 31 ΡΕ1851312 uma alteração na actividade do promotor, porque as caracte-rísticas estruturais e/ou sítios de reconhecimento/ligação para e.g. factores de transcrição, são afectadas pelas mutações referidas. No entanto, estas alterações podem levar a uma actividade aumentada ou diminuída do promotor em comparação com a do promotor do tipo selvagem. É bem conhecido na técnica anterior que a multiplicação/duplicação da extensão do ácido nucleico específico pode aumentar uma actividade do promotor. A regulação da expressão do gene de muitos promotores euca-rióticos, especialmente promotores de levedura, envolve múltiplas interacções entre factores de transcrição ligados a um promotor. Os sítios múltiplos podem ser necessários para a funcionalidade mesmo dos elementos de actuação em cis mais pequenos. Nas células de levedura, as sequências activadoras a montante (UAS) são necessárias para a transcrição. Estes funcionam em qualquer orientação e a uma distância variável com respeito à TATA box e sítio de início de transcrição, mas em contraste com intensifi-cadores em eucarióticos superiores, estes devem ser a montante destes elementos basais. Os UAS são alvos de vários activadores de transcrição. A maior parte dos fenómenos de repressão em células de levedura resultam na inactivação ou ausência de factores de transcrição. No entanto, alguns sítios de regulação negativa (a montante das sequências de repressão (URS)) podem também ser identificados. 32 ΡΕ1851312

Com base na análise de deleção do promotor de A0X2 P. pastoris, foram encontradas três regiões reguladoras, duas regiões de actuação negativa (URS1 e URS2) e um dominio de actuação positiva (UAS) [3] . Para o promotor MOX de H. polymorpha duas sequências activadoras a montante (UAS1 e UAS2) e um sitio de ligação ao repressor (URS1) foram também descritos [8] . As sequências correspondentes podem também ser identificadas nos promotores de AOXl (nucleótidos 585 a 614 (-369 a -340) e 725 a 756 (-229 a -198), apresentando semelhanças com A0X2 UAS [3], assim como nucleótidos 622 a 656 (-332 a -298) [8]). A multi plicação (2, 3, 4, 5, 6 ou 7 vezes UAS) destas extensões de ácido nucleico pode resultar num promotor com uma força intensificada que leva a uma ainda mais potente expressão de proteína. Deste modo, a construção de promotores compreendendo múltiplas UAS, preferencialmente envolvendo as regiões das sequências acima mencionadas semelhantes a AOX2 e MOX UAS, ou outras extensões de sequência múltipla (e.g. a gama de sequências de ácido nucleico apresentada acima) cai também no âmbito da presente invenção e é considerada uma forma de realização preferida. Uma sequência de activação tem normalmente algumas centenas de pares de bases de um promotor. Por exemplo, a maior partes das sequências de activação têm cerca de 200 a 400 pares de bases do promotor que é melhorado. Mais a montante, o promotor contém normalmente outros intensificadores e sítios de ligação do factor de transcrição.

Pelo menos uma mutação do promotor de AOXl pode 33 ΡΕ1851312 ser introduzida por métodos convencionais conhecidos de uma pessoa especialista na técnica (e.g. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Third Edition), J. Sambrook e D. Russell, 2001, Cold Spring Harbor Laboratory Press).

De acordo com uma forma de realização preferida da presente invenção, o sitio de ligação do factor de transcrição (TFBS) é seleccionado a partir do grupo consistindo em Hapl, Hsf, Hap234, abaA, Stre, Rapl, Adrl, MatlMC, Gcrl e QA-1F. A mutação de pelo menos um destes TFBS resulta em promotores mutantes com caracteristicas que variam (ver exemplo 2).

Preferencialmente, o sitio de ligação do factor de transcrição (TFBS) Hapl compreende os nucleótidos 54 (-900) a 58 (-896) de Seq ID N° 1, nucleótidos de Hsf 142 (-812) a 149 (-805) e 517 (-437) a 524 (-430) de Seq ID N° 1, nucleótidos de Hap234 196 (-758) a 200 (-754), 206 (-748) a 210 (-744) e 668 (-286) a 672 (-282) de Seq ID N° 1, nucleótidos de abaA 219 (-735) a 224 (-730) de Seq ID N° 1, nucleótidos de Stre 281 (-673) a 285 (-669) de Seq ID N° 1, nucleótidos de Rapl 335 (-619) a 339 (-615) de Seq ID N° 1, nucleótidos de Adrl 371 (-583) a 377 (-577) de Seq ID N° 1, nucleótidos de MatlMC 683 (-271) a 687 (-267) de Seq ID N° 1, nucleótidos de Gcrl 702 (-252) a 706 (-248) de Seq ID N° 1 e nucleótidos de QA-1F 747 (-207) a 761 (-193) de Seq ID N° 1. 34 ΡΕ1851312

Estes TFBS podem ser identificados experimentalmente ou por comparação com TFBS conhecidos de outros promotores (e.g. promotores de eucarióticos) com o auxilio de programas de computador (e.g. ver exemplo 1).

Um resumo da influência dos promotores de AOX1 mutantes na expressão de proteínas, péptidos ou ácidos nucleicos funcionais é proporcionado na tabela 2 (em comparação com a actividade do tipo selvagem).

Tabela 2: Influência de mutantes do promotor do tipo selvagem de A0X1 na expressão de proteínas, péptidos ou ácidos nucleicos funcionais

Mutação Clone unicópia Clone multicópia Condição de desvepvessão1 Condição de indução por Metanol1 Condição de desrepressão1 Condição de indução por Metanol1 AHapl + AHsf 1 - + + + Δ1 + + /\Hap2345 1 + + AHap2345 2 - + + AabaA - + + AStre + + Δ2 - ARapl - + + Δ3 - - Aadrl - - + + Δ4 - - AHsf 2 Δ5 - - 35 ΡΕ1851312 (continuação)

Mutação Clone uniocpia Clone multicópia Condição de desrepressão1 Condição de indução por Metanol1 Condição de desrepressão1 Condição de indução por Metanol1 AHap2345 3 + + AMatlMC Δ6 + + + + Δ6* + - + + AGcrl - + + + Δ7 - - AQA-1F + + + AQA-IFZUS + - AHsf 2 dHap 2345 1 + + + AHsf 2 dHap 2345-lzus + AHsf 2 MatlMC - + + Δ8 - - Δ9 - - Δ2Δ6 - + + Δ736-41 - Δ737-38 AInD-d4m AD-d4 Δ1-1 Δ1-2 Δ1-3 ΔΙ-SacI 1Taxa de expressão em coitparação com o promotor de AOXl do tipo selvagem: - diminuiu, + aumentou_

Outro aspecto da presente invenção refere-se u uma molécula de ácido nucleico compreendendo um promotor de álcool oxidase 1 (AOXl) de Pichia pastoris mutante de acordo com a presente invenção e um ácido nucleico que 36 ΡΕ1851312 codifica uma proteína, péptido ou ácido nucleico funcional, em que o promotor e o referido ácido nucleico são operacionalmente ligados em conjunto. 0 promotor mutante de A0X1 pode ser ligado a uma gene que codifica para uma proteína (e.g. enzima), um péptido (e.g. hormona) ou ácido nucleico funcional (e.g. siRNA). 0 fragmento de ácido nucleico resultante pode ser utilizado para expressar e.g. uma proteína quando introduzido num organismo, preferencialmente uma levedura, especialmente uma estirpe de Pichia pastoris. A construção da referida molécula de ácido nucleico é bem conhecida da pessoa especialista na técnica e pode ser efectuada com métodos convencionais da biologia molecular (e.g. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Terceira Edição), J. Sambrook e D. Russell, 2001, Cold Spring Harbor Laboratory Press; manual "Pichia Expression Estojo ("kit")", Invitrogen Corp.). "Operacionalmente ligado" refere-se à(s) primeira (s) sequência(s) posicionadas suficientemente próximas de uma (s) segunda (s) sequência (s) de modo que a(s) primeira (s) sequência (s) podem exercer influência sobre a(s) segunda (s) sequência (s) ou uma região sob controlo dessa segunda sequência. Por exemplo, um promotor pode ser operacionalmente ligado a um gene de modo a que o gene seja expresso sob o controlo do promotor, que pode tipicamente ser a 5' do gene. Normalmente, um promotor nuclear pode estar a algumas centenas de pares de bases a partir do 37 ΡΕ1851312 sítio de iniciação de tradução. Cerca de 30 bp a jusante existe normalmente a jusante um elemento do promotor.

Outro aspecto da presente invenção refere-se a um vector compreendendo um promotor de álcool oxidase 1 (AOX1) de Píchía pastoris mutante, de acordo com a presente invenção ou uma ácido molécula de nucleico como apresentado acima.

De modo a introduzir o promotor mutante, opcionalmente operacionalmente ligado a um ácido nucleico que codifica para uma proteína, péptido ou ácido nucleico funcional, num hospedeiro, preferencialmente numa estirpe de levedura metilotrófica (e.g. uma estirpe de Pichia pastoris), o referido promotor tem de ser proporcionado num vector, que pode ser utilizado para a transformação do referido hospedeiro. Por exemplo, os referidos vectores podem ser plasmídeos epissomais de levedura (YEp), plasmídeos integrativos de levedura (YIp) ou cromossomas artificiais de levedura. Estes vectores compreendem normalmente uma origem de replicação (se for necessária a amplificação nos hospedeiros microbianos) e um marcador de selecção para a propagação dos vectores em E. coli, promotores e terminadores para a expressão de proteína recombinante em levedura e marcadores de selecção para levedura. Os vectores integrativos compreendem ainda uma sequência de replicação autónoma (ARS), que assegura a estabilidade do vector na célula (e.g. Myers, A. M., et al. (1986) Gene 45: 299-310). Os vectores integrativos, que não 38 ΡΕ1851312 são portadores de sequências AR, compreendem regiões de sequências que são homólogas a regiões do genoma. Alternativamente o DNA linear, e.g. proveniente de PCR pode ser utilizado para transformação.

Outro aspecto da presente invenção refere-se a uma célula compreendendo pelo menos um promotor de álcool oxidase 1 (AOXl) de Pichia pastoris mutante, pelo menos um fragmento de ácido nucleico ou pelo menos um vector como aqui revelado. A introdução de uma molécula de ácido nucleico portadora de um promotor mutante de AOXl (e.g. vector, em que o promotor é operacionalmente ligado a um ácido nucleico que codifica para uma proteína) num hospedeiro pode ser efectuada e.g. por electroporaçâo . A referida molécula de ácido nucleico é integrada no cromossoma após a sua introdução no referido hospedeiro numa cópia única ou em múltiplas cópias ou presente na célula como um plasmídeo de replicação autónoma de cópia única ou multicópia. Se vários promotores mutantes são utilizado, estes podem todos ser ligados com um único gene (que codifica para uma proteína ou ácido nucleico funcional (e.g. Ribozima, RNA anti-sentido etc.), uma proteína idêntica ou diferentes proteínas (e.g. 1 variante do promotor é ligada a um marcador de selecção e outro promotor mutante é ligado a outra proteína que deve ser expressa) . Deste modo no âmbito da presente invenção as estirpes unicópia compreendendo uma cópia do promotor de AOXl operacionalmente ligado a um ácido nucleico que codifica para uma proteína, um péptido ou um ácido nucleico 39 ΡΕ1851312 funcional, assim como as estirpes multicópia compreendendo mais do que uma, preferencialmente pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 ou 20 cópias do promotor de AOXl operacionalmente ligado a um ácido nucleico que codifica para uma proteina, um péptido ou um ácido nucleico funcional são preferencialmente produzidas.

De acordo com uma forma de realização preferida da presente invenção a referida célula é uma célula eucariótica, em particular um célula de levedura, preferencialmente uma célula de levedura metilotrófica.

Preferencialmente a célula de levedura metilotró-fica é seleccionada a partir do grupo consistindo em Candida, Hansenula, Pichia e Toruplosis, especialmente uma célula de Pichia pastoris.

Os promotores de AOXl assim como as suas variantes mutadas podem ser funcionalmente introduzidas num número muito grande de diferentes células de levedura, incluindo células metilotróficas (e.g. Pichia pastoris) e não metilotróficas (e.g. Saccharomyces cerevisiae) . A transferabilidade dos promotores para outros organismos, especialmente os promotores AOXl e MOX, é conhecida da pessoa especialista na técnica. Embora a especificidade do substrato e algumas caracteristicas reguladoras sejam diferentes em diferentes leveduras (e.g. Pichia pastoris, Hansenula polymorpha e Saccharomyces cerevisiae) foi demonstrado um reconhecimento de promotores estranhos (e.g. 40 ΡΕ1851312

Raschke, W.C., et al., Gene, 1996. 177:163-7; Pereira, G.G. e C.P. Hollenberg, Eur J Biochem, 1996. 238:181-91). Por exemplo, o promotor de MOX H. polymorpha é reconhecido em S. cerevisiae, reprimido na presença de glucose e desre-primida sob limitação de fonte de carbono. Do mesmo modo, o promotor de AOXl pode ser empregue em H. polymorpha e é regulado da mesma forma que o promotor de MOX. O promotor de ZZAl, que é proximamente relacionado com o promotor de AOXl pode também ser empregue com sucesso em S. cerevisiae.

Outro aspecto da presente invenção refere-se a um estojo ("kit") para a expressão de um proteína seleccionada ou transcrição para um RNA funcional, compreendendo i) um vector como definido acima, e ii) uma célula capaz de expressar a referida proteína ou RNA funcional sob o controlo de um promotor de acordo com a presente invenção. O vector de acordo com a presente invenção pode ser utilizado num estojo ("kit") para a expressão de uma proteína seleccionada ou transcrição de RNA funcional (e.g. ribozima, RNA anti-sentido, RNAi).

De acordo com uma forma de realização preferida da presente invenção a referida célula é uma célula de levedura, preferencialmente uma célula de levedura metilo-trófica. 41 ΡΕ1851312

Preferencialmente, a célula de levedura metilo-trófica é seleccionada a partir do grupo consistindo em Candida, Hansenula, Pichia e Toruplosis, especialmente um célula de Pichia pastoris.

Outro aspecto da presente invenção refere-se a um método para a expressão de uma proteína recombinante, péptido ou ácido nucleico funcional numa célula compreendendo os passos seguintes: - proporcionar um vector ou uma molécula de ácido nucleico compreendendo um promotor de A0X1 de acordo com a presente invenção e um ácido nucleico que codifica para uma proteína, péptido ou ácido nucleico funcional, sendo o referido promotor operacionalmente ligado ao referido ácido nucleico, - transformar a referida célula com o referido vector ou referida molécula de ácido nucleico, - cultura da célula transformada num meio de cultura adequado, - induzir opcionalmente a expressão da referida proteína, péptido ou ácido nucleico funcional e - isolar a referida proteína expressa, péptido ou ácido nucleico funcional.

De acordo com uma forma de realização preferida da presente invenção a referida célula é uma célula de levedura, preferencialmente uma célula de levedura metilo-trófica. 42 ΡΕ1851312

Preferencialmente a célula de levedura metilo-trófica é seleccionada a partir do grupo consistindo em Candida, Hansenula, Pichia e Toruplosis, especialmente uma célula de Pichia pastoris. Outro aspecto da presente invenção refere-se à utilização de uma molécula de ácido nucleico, um vector ou uma célula de acordo com a presente invenção para a expressão de uma proteína, péptido ou ácido nucleico funcional.

Quando uma molécula de ácido nucleico, um vector ou uma célula de acordo com a presente invenção é utilizada para a expressão de uma proteína, péptido ou ácido nucleico funcional, é vantajoso escolher um promotor apropriado de A0X1 que preenche os requisitos colocados para a expressão (e.g. expressão elevada ou constitutiva sob condições de desrepressão (= sem a adição de glucose ao meio) ou sob condições de indução por metanol). Os promotores adequados de A0X1 mutantes podem ser seleccionados com o auxílio da tabela 2.

Outro aspecto da presente invenção refere-se a um método para o isolamento de clones de super expressão compreendendo os passos: a) introduzir uma molécula de ácido nucleico compreendendo pelo menos um promotor de álcool oxidase 1 (A0X1) de Pichia pastoris mutante de acordo com a presente invenção e pelo menos um ácido nucleico que codifica uma 43 ΡΕ1851312 proteína (péptido) ou um ácido nucleico funcional e um gene de marcador de resistência, em que o referido promotor e o referido ácido nucleico são operacionalmente ligados em conjunto formando uma cassete de expressão ou a vector uni-ou multi-cópia compreendendo a referida molécula de ácido nucleico numa célula, b) transferir a célula do passo a) para um meio compreendendo um marcador selectivo apropriado, uma fonte de carbono não repressora e metanol para o crescimento selectivo dos clones de super expressão sob condições de indução, c) incubar a célula do passo b) no referido meio, d) isolar uma colónia da célula obtida no passo c) e e) detectar os clones com super expressão por determinação da taxa de expressão da referida célula. A construção de clones de super ou elevada expressão portadores de um vector ou um ácido nucleico compreendendo um promotor mutado indutível por metanol requer métodos que permitem à pessoa especialista na técnica um isolado destes clones. Este método é aqui proporcionado. 0 primeiro passo do referido método é a introdução do promotor compreendendo o ácido nucleico (e.g. vector) numa célula hospedeira, que é capaz de regular o referido promotor. 0 próprio promotor pode ser mutado por manipulação genética ou por mutagénese química (e.g. bissulfito, nitrito, ácido fumárico, hidrazina) ou física (e.g. radiação, especialmente a radiação UV) . A seguir. 0 44 ΡΕ1851312 primeiro passo do referido método é a introdução do promotor compreendendo ácido nucleico (e.g. vector) numa célula hospedeira, que é capaz de regular o referido promotor. 0 próprio promotor pode ser mutado por manipulação genética ou por mutagénese quimica (e.g. bissulfito, nitrito, ácido fumárico, hidrazina) ou física (e.g. radiação, especialmente a radiação UV). A seguir, a selecção de clones de super expressão directamente após a regeneração das células da transformação. A taxa de expressão é preferencialmente determinada por métodos como electroforese em gel (e.g. SDS-PAGE), ligação de anticorpo (e.g. ELISA), quantitativa (transcriptase reversa) PCR (e.g. RT-PCR em tempo real), actividade enzimática (e.g. se a proteína expressa é uma enzima) ou fluorometricamente (proteína com um espectro de emissão característica como proteína verde fluorescente).

Os promotores (transformantes) que apresentam a expressão aumentada na ausência, de fontes de C de outra forma repressoras (no caso do promotor de A0X1 glucose) são seleccionados por crescimento selectivo das células transformadas em/no meio contendo uma fonte de carbono não repressora. Os promotores (transformantes) que apresentam expressão aumentada na ausência de fontes de C, de outra forma, repressoras (no caso do promotor de A0X1 glucose) na presença de um indutor (e.g. metanol) são seleccionadas por crescimento selectivo das células transformadas em/no meio contendo uma fonte de carbono não repressora e o indutor 45 ΡΕ1851312 (e.g. metanol). O indutor pode também ser uma fonte de carbono não repressora. Os clones de super expressão são seleccionados por combinação de multicópia que leva a uma resistência superior contra antibióticos (e.g. Zeocina) ou produtividade elevada de um componente essencial do meio (e.g. Leu, His, Arg, Ura) com a selecção reguladora descrita acima. As composições do meio a ser utilizado num método de acordo com a presente invenção podem ser obtidas directamente de fabricantes ou distribuidores de estojos ("kits"), células e vectores relacionados com Pichia pastoris (e.g. Invitrogen) . A concentração de metanol no meio pode ser preferencialmente 0,05 a 15%, mais preferencialmente 0,1 a 10%, particularmente 0,3 a 5%. Na literatura cientifica são descritas diferentes concentrações de metanol para diferentes condições de cultura. Por exemplo, os frascos de agitação podem conter 1% de metanol ou menos (Guarna MM, et al. (1997) Biotech. Bioeng. 56:279-286), os processos de fermentação podem conter 0,5% de metanol (Damasceno LM, et al. (2004) Protein Expr Purif 37:18-26; Hellwig S., et al. (2001) Biotechnol Bioeng 74:344-352; Hellwig S., et al. (1999) Biotechnol Appl Biochem 30:267-275). A expressão intensificada de clones multicópia pode depender não apenas da presença de mais do que uma cópia do promotor mutado numa célula mas ser também devida ao facto de que existe uma ausência de vários factores de transcrição, porque estes factores podem ser ligados a um elevado número dos sítios de ligação do factor de 46 ΡΕ1851312 transcrição na referida célula. Isto pode ser apresentado pela comparação da taxa de expressão sob condições de indução de metanol com a taxa de expressão sob condições de desrepressão em que podem se pode verificar que a taxa de expressão intensificada não é apenas um efeito do número de cópias do promotor de A0X1 mutado na célula (sem efeito linear). Por exemplo, a estirpe d6*F10 apresenta estas caracteristicas. 0 meio utilizado para isolar clones de super expressão pode compreender ainda componentes de meio como leucina, uracilo, arginina, histidina e/ou adenina e sorbitol pode ser trocado por glucose de modo a identificar variantes do promotor que apresentam uma repressão reduzida na presença de glucose em comparação com as variantes do promotor do tipo selvagem.

Quando as estirpes auxotróficas são utilizadas, a célula pode ser transferida para um meio compreendendo sorbitol (ou outras fontes de carbono não repressoras) e contendo componentes individuais do meio (e.g. leucina, uracilo, arginina, histidina e adenina) para o crescimento selectivo de clones de super expressão clones sob condições de desrepressão empregando marcadores auxotróficos (passo b)) . 0 marcador de resistência P(TEF)-Zeo normalmente utilizado nos vectores que compreendem o promotor de AOXl leva à expressão constitutiva da proteína de resistência a 47 ΡΕ1851312 zeocina e deste modo permite o isolamento de clones multicópia por resistência contra elevadas concentrações do antibiótico. 0 novo método descrito permite combinar este efeito com caracteristicas reguladoras para detectar promotores e clones multi-cópia que levam a uma expressão mais elevada sob certas circunstâncias reguladoras controláveis (e.g. expressão desreprimida, expressão induzida etc.). Isto torna possível detectar novos promotores com propriedades reguladoras alteradas e também clones em que os clones multicópia levam a uma expressão intensificada sob estas condições reguladoras especiais. "Clones de super expressão" são clones de expressão que expressam mais de uma proteína ou de um ácido nucleico funcional sob o controlo do promotor mutado do que sob o controlo do promotor do tipo selvagem, ou mais de uma proteína ou ácido nucleico funcional do que pela aplicação de vectores com combinações de promotor-marcador de selecção normalmente utilizadas tais como P(TEF)-Zeo. A taxa de expressão dos "clones de super expressão" de acordo com a presente invenção pode ser, pelo menos 20%, preferencialmente, pelo menos 50%, mais preferencialmente pelo menos 100%, particularmente pelo menos 500% aumentada em comparação com a taxa de expressão da mesma proteína ou péptido ou ácido nucleico funcional sob o controlo do promotor do tipo selvagem (valor médio mais duas a três vezes o desvio padrão). Os "clones de super expressão" pode preferencialmente compreender mais do que uma cópia do promotor mutado ou molécula de ácido nucleico de acordo com a presente invenção. Alternativamente, "os clones de super 48 ΡΕ1851312 expressão" podem também ser denominados "clones de elevada expressão".

De acordo com a presente invenção "promotores indutiveis por metanol" são promotores cuja actividade é regulada pela presença de metanol no meio de cultura. Estes promotores são preferencialmente os promotores A0X1 (de Pichia pastoris) ou MOX (de Hansenula polymorpha) ou qualquer outro promotor indutivel por metanol e reprimido por glucose derivado de leveduras metilotróficas tais como e.g. FMD, FLD, DAS (e.g. ver tabela 6, exemplo 1).

De acordo com uma forma de realização preferida da presente invenção o marcador selectivo é um antibiótico, preferencialmente zeocina. 0 marcador selectivo a ser utilizado no meio depende do facto de se a caracteristica molecular da célula pode ser utilizada para distinguir uma célula portadora do ácido nucleico ou vector compreendendo um promotor mutado indutivel por metanol ou do tipo selvagem de uma célula que não é portadora do referido ácido nucleico ou vector. Os marcadores selectivos podem, deste modo, ser antibióticos (os genes para resistência a antibióticos podem ser encontrados no vector ou ácido nucleico introduzido na referida célula). Para compensar a auxotrofia de certas estirpes o marcador selectivo no meio pode ser uma substância como leucina, uracilo, arginina, histidina e adenina, dependendo do tipo de auxotrofia. 49 ΡΕ1851312

Preferencialmente, a molécula de ácido nucleico, o vector e a célula são um ácido nucleico, um vector e uma célula de acordo com a presente invenção.

De acordo com uma forma de realização preferida da presente invenção a molécula de ácido nucleico ou vector é introduzido na célula por transformação por métodos convencionais conhecidos da pessoa especialista na técnica, preferencialmente electroporação, transformação química, fusão de protoplastos ou por bombardeamento de partículas (ver e.g. Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Edited by: Fred M. Ausubel et al.} Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Terceira Edição), J. Sambrook e D. Russell, 2001, Cold Spring Harbor Laboratory Press). A presente invenção é ainda ilustrada pelas figuras que se seguem e exemplos sem estar a elas restrita.

Fig. 1 apresenta SDS-PAGE de GFP-Zeo que expressa estirpes de P. pastoris em microescala antes da indução com metanol (A) e 24 (B) e 72 (C) horas após indução. As amostras foram preparadas como descrito no exemplo 1 h). A pista 1 é X-33 (controlo negativo), Pista 2-4 são X-33 GFP-Zeo estirpes Muts A9, D2 e E2, Pista 5 é X-33 d6*F10. Uma banda forte aos 42 kDa está presente em todos os clones GFP-Zeo.

Fig. 2 apresenta um visão das deleções de sequências na região do promotor de AOXl e alguns sítios de 50 ΡΕ1851312 ligação do factor de transcrição. As regiões deltal-9 foram removidos por PCR de extensão de sobreposição.

Fig. 3 apresenta um gráfico de barras de intensidade de fluorescência das variantes do promotor de AOXl em microescala após desrepressão (jejum de carbono). As células foram cultivadas em 1% de glucose em microescala. Os dados representam a média de 6SD de 4 medições independentes. RFU: unidades de fluorescência relativa; WT: estirpe de P. pastoris GFP-Zeo D2 com GFP-Zeo sob o controlo do promotor de AOXl do tipo selvagem; D1-D9: estirpes de P. pastoris com construções de deleção ΑΟΧ1Δ 1-Δ9 em frente do gene GFPZeo; EX. comprimento de onda de excitação; EM: comprimento de onda de emissão.

Fig. 4 apresenta um gráfico de barras de intensidade de fluorescência das variantes do promotor de AOXl em microscala após indução por metanol. As células foram cultivadas em 1% de glucose em microescala. Os dados representam a média ± SD de 4 medições independentes. RFU: unidades de fluorescência relativa; WT: estirpe de P. pastoris FP-Zeo D2 com GFP-Zeo sob o controlo do promotor de AOXl do tipo selvagem; D1-D9: estirpes de P. pastoris com construções de deleção AOX1A 1-Δ9 em frente do gene GFPZeo; EX. comprimento de onda de excitação; EM: comprimento de onda de emissão.

Fig. 5 apresenta um gráfico de barras de intensidade de fluorescência de variantes seleccionadas do promotor de AOXl em microescala. Os níveis de expressão sob 51 ΡΕ1851312 desrepressão assim como as condições de indução de estirpes unicópia e estirpes multicópia com o tipo selvagem e variantes do promotor Δ6 são apresentadas. Os dados representam a média ± SD de 4 medições independentes. WT: estirpe unicópia GFP-Zeo com promotor de A0X1 do tipo selvagem (GFP-Zeo D2), D6: clone unicópia Α0Χ1Δ6*; WT_ E2: clone multicópia GFP-Zeo com promotor de AOXl do tipo selvagem; D6* FIO: clone multicópia ΑΟΧίΔβ* (X—33 d6F10).

Fig. 6 apresenta o resultado de um teste de gota de estirpes de P. pastoris em placas de agar MD e MDM com concentrações distintas de Zeocina™. As células foram cultivadas em meio BMD(1%) até uma OD595 de 1,5, diluído em passos de 10 para uma taxa de diluição final de 105 e transferidas para placas de agar utilizando um replicador de 48 pinos. Os números no topo da imagem denotam o factor de diluição que é o mesmo para todas as placas. O meio MD foi preparado como descrito acima. O metanol foi adicionado a placas MDM-Zeo para uma concentração final de cerca 0,5%. A Zeocina™ foi adicionada para concentrações finais de 100, 200 e 500 mg/mL, respectivamente. X-33: P. pastoris X-33, A9: P. pastoris GFP-Zeo Muts A9, D2: P. pastoris GFP-Zeo D2, E2: P. pastoris GFP-Zeo E2.

Fig. 7 apresenta o nível de expressão de várias estirpes multicópia em comparação com estirpes de referência; a) actividade sob condições de desrepressão; b) actividade após indução por metanol. 52 ΡΕ1851312

Fig. 8 apresenta o nível de expressão de estirpes multicópia Δ6* sob desrepressão e condições de indução em comparação com estirpes de referência. EXEMPLOS:

Exemplo 1:

Material e métodos: a) Estojos ("Kits") de Preparação/Purificação de DNA:

Foram utilizados vários estojos ("kits") de preparação e purificação de DNA comercialmente disponíveis utilizados de acordo com os manuais fornecidos (ver Tabela 3) .

Tabela 3: Estojos ("kits") de Preparação e Purificação de DNA

Estojo ("kit") Produtor Easy-DNA™Estojo ("kit") Invitrogen Corp., Carlsbad, CA, EUA QIAprep® Spin Miniprep Estojo ("kit") QIAGEN GmbH, Hilden, Alemanha Wizard® Plus SV Minipreps DNA Purification System Promega GmbH, Mannheim, Alemanha GenElute™ High Performance (HP) Plasmid Midiprep Estojo ("kit") Germany Sigma-Aldrich Handels GmbH, Vienna, Áustria QIAquick® Gel Extraction Estojo ("kit") QIAGEN GmbH, Hilden, Alemanha Quantum Prep™Freeze N Squeeze DNA Gel Extraction Spin Columns Bio-Rad Laboratories GmbH, Vienna, Áustria QIAquick® PCR Purification Estojo ("kit") QIAGEN GmbH, Hilden, Alemanha 53 ΡΕ1851312 b) Clonagem de TOPO®: A clonagem de TOPO® foi efectuada de acordo com os manuais fornecidos (para clonagem no pCR®4Blunt-T0P0® e para clonagem no pCR®-Blunt II-TOPO®). Foram sempre utilizados 4 pL de produto de PCR para clonagem. 2 e 4 pL de cada reacção de clonagem foram transformados em células E. coli TOP10F' quimicamente competentes One Shot® (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA, USA) de acordo com os protocolos acima mencionados. c) Transformação de E. coli: A transformação de reacções de ligação e plasmideos em E. coli foi efectuada de acordo com o Protocolo SEM (método simples e eficiente) [16] . As células E. coli TOP10F' quimicamente competentes foram utilizadas para transformação. d) Transformação de Pichia pastoris: A preparação de células competentes de Pichia pastoris: Uma única colónia da estirpe hospedeira desejada Pichia pastoris foi utilizada para inocular 50 mL de YPD (2% de glucose) num frasco Erlenmeyer de boca larga de 300 mL com reentrâncias. Após uma incubação durante a noite a 30°C, 60% de humidade e 130 rpm (Pilot Shake® RC-2 TE) um certo volume desta pré-cultura foi utilizado para inocular 200 mL de YPD (2% de glucose) num frasco Erlenmeyer de boca 54 ΡΕ1851312 larga de 2 L de boca larga para uma densidade óptica de cerca de 0,1 a 595 nm (OD595) . A cultura foi cultivada sob as mesmas condições da pré-cultura até uma densidade óptica de 1,0 a 1,5. As células foram centrifugadas a 4°C e 4000 rpm durante 10 minutos e ressuspensas em 200 mL de água estéril arrefecida em gelo. Este procedimento foi repetido 3 vezes com ressuspensão das células em 100 mL de água, 10 mL de 1 M de sorbitol e 0,5 mL de 1 M de sorbitol, respectivamente.

Foram linearizados 10 yg do plasmídeo desejado com BglII e NotI (50 u cada) durante a noite num volume final de 300 mL. Após restrição por digestão do DNA foi precipitado em EtOH e 0,3 M de acetato de sódio de acordo com um protocolo convencional [16]. O DNA foi dissolvido em 11 mL de ddH20 estéril e dessalinizado utilizando um MF-Millipore™ Membrane Filter (ver Tabela 12) para cerca de 1-2 h. Se 0 produto de PCR foi utilizado para transformação de cerca de 4-5 yg de DNA foi processado como descrito acima começando com precipitação com EtOH.

Para cada transformação 80 mL das células preparadas foram misturadas com 10 yg de DNA como descrito acima e incubadas durante 5 minutos em gelo. A mistura foi transferida para cuvetes de electro-transformação arrefecidas em gelo (Bio-Rad) e pulsada a 200 Ω, 25 mF e 2,5 kV. 1 mL de 1 M de sorbitol arrefecido em gelo foi adicionado imediatamente. A suspensão foi transferida para um tubo de 12 mL PP estéril (Greiner, Frickenhausen, 55 ΡΕ1851312

Alemanha, #184261) e incubada durante 2 horas a 30°C sem agitação. Após esta fase de regeneração de foram plaqueadas alíquotas em placas de selecção. Para a selecção de transformantes com expressão elevada sob condição de indução, as células foram plaqueadas em placas MSM-Zeo contendo meio mínimo com sorbitol (ou qualquer outra fonte de carbono não repressora) metanol e zeocina. Para a selecção de clones que apresentam expressão elevada sob condições de desrepressão, as células podem ser plaqueadas em placas mínimas de sorbitol zeo sem metanol. A inclusão de glucose em placas de selecção contendo metanol permite a detecção de clones de expressão não reprimida por glucose e seus promotores. e) PCR de colónias:

Uma única colónia da estirpe desejada de Pichia foi ressuspensa em 100 mL de ddH20 num microtubo de 100 mL e aquecidas 5 a 10 minutos a 95°C. Após centrifugação a 13 200 rpm durante 1 minuto, foram utilizados 10 mL de sobrenadante como molde para reacção de PCR. Foram utilizados 5 mL desta primeira ronda de PCR como molde para um segundo. Foram utilizados 5 pL da segunda ronda de PCR para um gel de controlo. As reacções de PCR continham 10 pmol de cada iniciador (AOXl_col e GFPrev), 200 mM de cada dNTP e 2,5 unidades de Hot Star Taq® DNA polymerase (QIAGEN) ou Taq DNA polymerase (Promega) sob condições de tampão de acordo com os manuais fornecidos num volume final de 50 pL. Para sequenciar, o segundo produto de PCR foi 56 ΡΕ1851312 purificado utilizando o QIAquick® PCR Purification Estojo ("kit").

Tabela 4: Programa de temperaturas para PCR de colónias

Temperatura Taq Hot Star Taq® Ciclos 95 ° C 5 min 15 min 1 95 ° C 30 seg 30 seg 57 ° C 30 seg 30 seg 12° C 1 min 30 seg 1 min 30 seg 30 12° C 10 min 10 min 1 f) isolamento de DNA genómico de Pichia: A estirpe desejada de P. pastoris foi cultivada durante a noite em 5 mL de YPD num tubo estéril de 12 mL PP numa barra de rotação a 30°C para uma OD5g5 final de 5-10. 1,5 mL da cultura foram utilizados para isolamento de DNA utilizando o Easy-DNA™ Estojo ("kit") de acordo com o protocolo fornecido. g) Ensaio de Proteína: A medição da concentração de proteína em solução tem sido desde há muito utilizada em bioquímica. Uma das suas aplicações principais é normalizar uma grande variedade de métodos bioquímicos na quantidade de proteína total como é efectuada no caso presente para as taxas de 57 ΡΕ1851312 consumo de oxigénio. As vias mais normalmente utilizadas para determinar as concentrações de proteína são os métodos de Bradford, Lowry e BCA™. Estes métodos têm limitações definitivas no que respeita a sensibilidade, intervalo dinâmico e compatibilidade de reagentes específicos. Entre estas 3 vias, Bradford e Lowry são mais fiáveis e reprodutíveis o que a BCA™. Por outro lado, Lowry e Bradford possui graves limitações quando detergentes e/ou agentes de redução estão presentes, o que resulta em valores elevados de branco. Deste modo, o ensaio de BCA™ é o método de selecção após uma lise química. As concentrações de proteína foram determinadas utilizando o ensaio de BCA™ após a lise química das células com Y-Per® e BSA como padrões de acordo com os manuais de instruções (Pierce Biotechnology Inc.), deste modo apenas os passos principais serão descritos resumidamente a seguir. 200 mL das culturas foram centrifugados a 4000 rpm e 4°C durante 5 minutos. Após rejeitar o sobrenadante, o sedimento foi ressuspensa em 100 mL de Y-Per® por pipetagem várias vezes. A suspensão foi incubada em 1,5 mL de microtubos num Thermomixer à temperatura ambiente e 600 rpm durante 20 minutos. Depois, os resíduos celulares foram centrifugados a 13 200 rpm e temperatura ambiente durante 10 minutos, o sobrenadante foi transferido num novo microtubo e armazenado a 4°C durante o ensaio de BCA™ ou SDS-PAGE. 25 mL de amostras foram misturados num poço de microplaca com 200 mL de reagente de trabalho de BCA™ (reagente A: reagente B = 50:1), agitado 58 ΡΕ1851312 completamente durante 30 segundos e fechado hermeticamente com selantes da placa (Promega). Após a incubação durante 30 minutos a 37°C e arrefecimento à temperatura ambiente a absorção foi determinada a 562 nm utilizando um leitor de placas Spectramax Plus 384. Se necessário, as amostras foram diluidas com ddH20 antes do ensaio com BCA. h) SDS-PAGE:

As amostras para SDS-PAGE foram preparadas por lise química das células utilizando Y-Per® como reagente como descrito na secção acima. 10 mL do lisado foram misturados com 10 mL de 2x SSB (tampão de amostra sigma) e incubados a 95°C durante 5-10 min e 15 mL desta mistura foram aplicados no gel de proteína. A electroforese foi efectuada com 180 V durante cerca de 1 h e as bandas de proteína foram detectadas utilizando coloração com azul de Coomassie™.

Tabela 5:Preparação de gel para SDS-PAGE

Gel de empaco- Gel de resolução tamento (4%) (12%) ddH20 3,05 mL 3,35 mL 30% de Acrilamida/bis 650 mL 4 mL 0,5 M de Tris-HCl pH 6,8 1,25 mL 1,5 M de Tris-HCl pH 8,8 2,5 mL ΡΕ1851312 (continuação)

Gel de empaco- Gel de resolução tamento (4%) (12%) 10% (p/v) de SDS 50 mL 100 mL TEME D 5 mL 10 mL 10% APS 25 mL 50 mL i) Ensaio de Glucose:

As concentrações de glucose foram determinadas utilizando o método Glucose-UV Hexocinase sem desprotei-nação (DIPRO med Handels GmbH, Weigelsdorf, Áustria, Prod. N° D590522) . 50 mL de culturas de Pichia foram transferidas numa microplaca de PCR e centrifugada a 4000 rpm durante 5 minutos. Foram adicionados 10 mL de sobrenadante a 190 mL de reagente de hexocinase numa microplaca UV-Star e incubada à temperatura ambiente durante 15 minutos. Após incubação, a absorção a 340 nm foi determinada utilizando um leitor de placas Spectramax Plus 384. j) Testes de gota:

As estirpes de P. pastoris foram cultivadas em BMD (1%) para uma OD595 final de 1,5 e diluída em passos de 10 para uma taxa de diluição final de 105. A transferência em placas de agar foi efectuada com um replicador de 48 pinos. As placas foram incubadas a 30°C até que as colónias apareçam (normalmente 2 dias em placas MD). 60 ΡΕ1851312 k) Alinhamentos de sequência:

Todos os alinhamentos de sequências foram efectuados utilizando MultAlin na página web do INRA (Institut National de la Recherche Agronomique, Paris, França) (prodes.toulouse.inra.fr/multalin/multalin.htmL) [17] ou com ClustalW no European Bioinformatics Institute (EBI, www.ebi.ac.ch/clustalw) [18]. Para comparação de sequências com MultAlin foi sempre utilizada a matriz de semelhança de DNA para comparação.

Os genes da via de utilização de metanol e a maioria dos genes peroxissómicos são regulados numa via semelhante no que respeita a repressão por glucose, a desrepressão em jejum de carbono e indução através de metanol. Uma regulação de transcrição semelhante, com um conjunto definido de factores de transcrição (repressores assim como indutores), deve ser responsável para este perfil de regulação. Os sítios de ligação do factor de transcrição nestas regiões do promotor devem mostrar algumas regiões conservadas. O alinhamento múltiplo de sequências entre as regiões do promotor de genes co-regulados deve revelar os sítios de ligação conservados dos factores de transcrição envolvidos na regulação dos genes concordantes. Vários genes das leveduras metilotróficas P. pastoris, H. polymorpha e C. boidinii foram reportados para ser co-regulados e as suas sequências de promotor foram isoladas (Tabela 6) . 61 ΡΕ1851312

Tabela 6: Genes co-regulados da via de utilização de metanol ou genes peroxissómicos das leveduras metilotróficas P. pastoris, H. polymorpha e C. boidinii.

Levedura Gene Enzima N° de Ac. Genbank Literatura P. pastoris AOX1 álcool oxidase www.invitrogen. com A0X2 álcool oxidase X79871 ZZAl álcool oxidase S62281 FLD1 formaldeído desidrogenase AF066054 H. polymorpha MOX metanol oxidase A11156 DAS di-hidroxiacetona sintase A11168 CAT catalase X56501 C. boidinii AOD1 álcool oxidase M81702 FLD1 formaldeído desidrogenase AB085186 FDH1 formato desidrogenase AB035095 DAS1 di-hidroxiacetona sintase AB035094 PMP20 proteína de membrana peroxissómica AB035096 PMP47 proteína de membrana peroxissómica AB035097 CTA1 catalase AB064338 1) Análise de factor de transcrição: A análise de factor de transcrição foi efectuada com Matlnspector Release professional 6.1 Jan. 2003 no ΡΕ1851312

GenomatixSuite 1.6.1 em Genomatix Software GmbH Servers [15] . A sequência Paoxi de pPICZ B foi utilizada uma pesquisa dos sitios de ligação do factor de transcrição utilizando a Matrix Family Library Version 3.1.1 Abril 2003 group ALL fungi.lib (www.genomatix.de). m) Iniciadores:

Tabela 7: Lista de iniciadores utilizados para os exemplos descritos (sintetizado por MWG Biotech AG, Ebersberg, Alemanha)

Seq ID N°. Nome Sequência Tm [°C] 2 P (A0X1) forw AAGGTACCAGATCTAACATCCAAAGACGAAAG 70 3 P(A0Xl)rev CTAGCCATGGTTGAATTCTTTCGAATAATTAGT- TGTTTTTTG 67 4 GFPZeo forw GAAAGAATTCAACCATGGCTAGCAAAGGAG 70 5 GFPZeo rev GATGATGGTCTAGAACGTGTCAGTCCTGCTCCTC 70 6 A0X1TT forw GACACGTTCTAGACCATCATCATCATCATCATTG 67 7 A0X1TT rev ATAGCGGCCGCACAAACGAAGGTCTC 72 8 AOXIAlforw CAAC ACCCACTTTAG G CT RCT RACACCAT-GACTTTATTAG 71 9 AOXIAlrev GTTAGTAGCCTAAAGTGGGTGTTGAGGAGAAGAG 70 10 A0XlA2forw GTTCATGTTTGTAGATGAGGGCTTTCTGAGTG 67 11 A0XlA2rev GCCCTCATCTACAAACATGAACCTCGCCAG 71 12 A0XlA3forw GAGGGCTTTCCCAAATGGCCCAAAACTG 70 13 A0XlA3rev CCATTTGGGAAAGCCCTCATCTGGAGTG 70 14 A0XlA4forw CGGCCAGTTGTTGGTATTGATTGACGAATGC 69 15 A0XlA4rev CAATACCAACAACTGGCCGTTAGCATTTC 71 16 AOXlAõforw GCTTCTGAACCTTGTCTCCACATTGTATGCTTC 68 17 A0XlA5rev GTGGAGACAAGGTTCAGAAGCGATAGAGAGAC 68 18 AOXlAôforw GTCTCCACACTGCTGATAGCCTAACGTTC 66 19 A0XlA6rev GGCTATCAGCAGTGTGGAGACAATGCATAATCATC 71 63 ΡΕ1851312 (continuação)

Seq ID N°. Nome Sequência Tm [°C] 20 AOXlA7forw GGAATACTGCTCTAACCCCTACTTGACAGC 65 21 AOXlA7rev GTAGGGGTTAGAGCAGTATTCCCACCAGAATC 67 22 AOXlA8forw CTTGACAGCAAGCTGCCCTGTCTTAAACC 66 23 AOXlA8rev GGGCAGCTTGCTGTCAAGTAGGGGTTAG 68 24 AOXlA9forw CTGTCTTAAACCTTACTGGTTCCAATTGACAAGC 68 25 AOXlA9rev GGAACCAGTAAGGTTTAAGACAGGGCAGC 69 26 423forw GATACACTAGCAGCAGACCGITGCAAACGCAG- GACCTCCACTCC 87* 27 1372forw GTGMGGTGATGCTACATACGGAAAGCTTACCCT- TAAATTTATTTGC 81* 28 2325forw CGtGGCCGAGGAGCAGGACTGACACGTTCíAGACCAT·· CATC 86* 29 AOXl col TCCAAAGACGAAAGGTTGAATG 72 30 GFPrev CCGTATGTAGCATCACCTTCACC 74 *Tm calculada utilizando a Equação 2 (QuikChange® multi site-directed mutagenesis estojo ("kit"))

Exemplo 1.1: Clonagem da construção repórter GFP-Zeo foi utilizado como um repórter para a expressão do gene conduzida pelas variantes do promotor de AOXl. As sequências circundantes do codão de iniciação ATG foram construídas de modo a preencher requisitos minimos das sequências de consenso de Kozak para genes com expressão elevada em levedura. Para alterar as regiões do promotor em frente do gene GFP-Zeo foi inserido um sitio de restrição EcoRI (Tabela 8) por PCR de extensão por sobreposição. 64 ΡΕ1851312

Tabela 8: Comparação do sítio de iniciação de tradução e sequências circundantes entre a sequência A0X1 utilizada neste exemplo (derivada de pPICZ) e a sequência de A0X1 da estirpe de P. pastoris NRRL Y-11430 (Genbank AN: U96967, [2]). 0 sítio de restrição EcoRI está sublinhado e os requisitos mínimos de Kozak nas posições -3 e +4 são marcadas com letras a negrito.

| ~3 +1 -M | P(ACXI} -GFP AAAACAACTA ATTATTgaAa gaattxMCc ATGGCTAgCa | IaOXI ('096967} AMACAACTA ATTATTcgA--------“AACg ÃTGSCTÃtCc | A produção de componentes de um sistema repórter com base em PCR P(AOXl) foi amplificada utilizando 10 ng do vector pPICZB ARS1 como molde. A reacção também continha 10 pmol de cada iniciador (P(AOXl)forw e P(AOXl)rev, respectivamente), 200 mM de cada dNTP e 2,5 U de Synergy™ polymerase em condições de tampão apropriadas num volume final de 50 mL. AOX1 TT foi amplificado de modo semelhante ao do promotor de AOXl. AOXITTforw e AOXITTrev foram utilizados como iniciador nesta reacção. Ambas as reacções de PCR foram efectuadas num termociclador para 30 ciclos (95°C, 1 min; 55°C, 30 s; 68°C, 2 min 30 s) com um passo de desnaturação inicial de 5 min a 95°C e um passo final de extensão de 10 min a 68°C. 2 yL da primeira ronda de PCR foram utilizados para amplificação numa segunda ronda sob 65 ΡΕ1851312 as mesmas condições acima. A única diferença foi um aumento na temperatura de extensão a 72°C. GFP-Zeo [19] foi amplificado utilizando 25 ng do vector pTracer™-CMV2 como molde. A reacçâo também continha 10 pmol de cada iniciador (GFP-Zeo forw e GFP-Zeo rev, respectivamente), 200 mM de cada dNTP e 2,5 U de Synergy™ polymerase em condições de tampão apropriado num volume final de 50 mL. O PCR foi efectuado num termociclador (ver Tabela 8) durante 30 ciclos (95°C, 1 min; 55°C, 30 s; 72°C, 2 min 30 s) com um passo inicial de desnaturação de 5 min a 95°C e um passo final de extensão de 10 min a 72°C.

Todos os produtos de PCR foram purificados por electroforese em gel de agarose antes do PCR de extensão por sobreposição. A reacção continha 10 ng de P(AOX1), 5 ng de AOX1 TT e 50 ng de GFP-Zeo preparados como descrito acima como moldes, 200 mM de cada dNTP e 2.5 U Synergy™ polymerase em condições de tampão apropriado num volume final de 50 mL. O PCR foi efectuado num termociclador (ver Tabela 8) durante 30 ciclos (95°C, 1 min; 53°C, 50 s; 68°C, 3 min 30 s) com um passo inicial de desnaturação de 5 min a 95°C e um passo final de extensão de 10 min a 68°C. Após 10 ciclos, foram adicionados 10 yL de uma mistura contendo 10 pmol de outros iniciadores P(AOXl)forw e AOXITTrev, de novo 200 mM de cada dNTP e 2,5 U de Synergy™ polymerase em condições de tampão apropriado. O PCR foi continuado como programado depois desta adição. O produto de PCR obtido com o tamanho desejado de cerca de 2,4 kb foi purificado num 66 ΡΕ1851312 gel de agarose. O produto purificado foi clonado num vector pCR®4Blunt-T0P0® e sequenciado. A sequenciação revelou 4 mutações e 1 deleção na construção repórter. 0 sitio de deleção dos pares de bases foi encontrado na posição -15 da sequência original do promotor. Uma vez que esta posição estava no sitio múltiplo de clonagem de todos os vectores pPlCZ (A, B e C; dentro do sitio de restrição SfuI) a deleção não deve influenciar a actividade do promotor e deste modo não foi corrigida. A primeira mutação (T—>C) foi encontrada na região do promotor na posição -828. As outras 3 mutações foram encontradas na sequência que codifica GFP-Zeo nas posições +122, +507 e +1075, respectivamente. A conversão G—>A na posição +122 altera o codão GGA de Gly para um codão GAA que resulta numa alteração de aminoácido G41A. A conversão T—>C a + 507 é uma mutação silenciosa que altera apenas um codão de R169. A última mutação (T—>C) na posição +1075 altera o codão stop TGA para o codão de Arginina CGA. As mutações -828, +122 e +1075 foram reparadas com o QuikChange® multi mutagénese dirigida ao sitio estojo ("kit") após construção do vector ρΑΟΧ. A mutação silenciosa na posição +507 e a mutação no poliligante não foram alteradas uma vez que não introduziram um codão raro. O pAOX foi construído por excisão do fragmento PAoxi-GFP-Zeo-AOXlTT a partir do vector pCR®4Blunt-TOPO® com 67 ΡΕ1851312 ΚρηI e NotI e inserindo-o no vector pBlueScript® SK- entre o sitio Kpnl e NotI.

As mutações encontradas no promotor de AOXl e a sequência GFP-Zeo foram corrigidas utilizando o QuikChange® multi mutagénese dirigida ao sitio estojo ("kit") (Stratagene, Amsterdão, Holanda). A reacção de PCR foi efectuada de acordo com o manual fornecido contendo 100 ng de pAOX, 100 ng de iniciadores mutagénicos (423forw, 1372forw e 2325forw, respectivamente) e 1 mL da mistura QuikChange® multi enzyme em condições de tampão apropriadas num volume final de 25 pL num termociclador durante 30 ciclos (95°C, 1 min; 55°C, 1 min; 65°C, 10 min 30 s) com um passo inicial de desnaturação de 1 min a 95°C. A digestão com Dpnl e a transformação química em células E. coli XL10-GOLD® (Invitrogen Corp.) foi efectuada de acordo com o manual fornecido. A correcção de toas as 3 mutações foi verificada por sequenciação.

Exemplo 1.2: Construção de deleções no promotor de AOXl

Os braços esquerdos do promotor de AOXl foram sintetizados utilizando P(AOXl)forw como iniciador directo e AOX n rev (n=l... 9) como iniciadores reversos. Os braços direitos foram sintetizados com 10 pmol de AOX n forw (n=1...9) como iniciadores directos e P (AOXl)rev como iniciador reverso. Todos os braços foram sintetizados utilizando 12 ng do vector pAOX como molde e 10 pg de cada 68 ΡΕ1851312

iniciador. A reacção também continha 10 pmol de cada iniciador, 200 mM de cada dNTP e 0,6 U de Pwo DNA polymerase em condições de tampão apropriadas num volume final de 50 mL. O PCR foi efectuado num termociclador durante 30 ciclos (95°C, 1 min; 55°C, 1 min; 68°C, 1 min 30 s) com um passo inicial de desnaturação de 5 min a 95°C e um passo final de extensão de 10 min a 68°C. todos os braços foram purificados a partir do gel de agarose antes da utilização para PCR de extensão por sobreposição.

Tabela 9: Pares de iniciadores de sobreposição e comprimento do braço para deleções do promotor

Construção Braço esquerdo Braço direito iniciador interno comprimento do braço [bp] iniciador interno comprimento do braço [bp] ΡαοχιΔΙ ΑΟΧΔ1 rev 184 ΑΟΧΔ1 forw 738 Paoxi^2 ΑΟΧΔ2 rev 315 ΑΟΧΔ2 forw 624 ΡαοχιΔ3 ΑΟΧΔ3 rev 374 ΑΟΧΔ3 forw 578 <1 J ΑΟΧΔ4 rev 519 ΑΟΧΔ4 forw 421 ΡαοχιΔ5 ΑΟΧΔ5 rev 636 ΑΟΧΔ5 forw 290 ΕαοχιΔ6 ΑΟΧΔ6 rev 708 ΑΟΧΔ6 forw 247 ΡαοχιΔ7 ΑΟΧΔ7 rev 742 ΑΟΧΔ7 forw 209 ΡαοχιΔ8 ΑΟΧΔ8 rev 794 ΑΟΧΔ8 forw 171 ΡαοχιΔ9 ΑΟΧΔ9 rev 833 ΑΟΧΔ9 forw 115 A reacção continha 10 ng de cada braço preparado como descrito acima como moldes, 200 mM de cada dNTP e 0,6 U de Pwo DNA polymerase em condições de tampão apropriadas num volume final de 50 mL. O PCR foi efectuado num termociclador durante 30 ciclos (95°C, 45 s; 60°C, 69 ΡΕ1851312 45 s; 68°C, 2 min) com um passo inicial de desnaturação de 5 min a 95°C e um passo final de extensão de 10 min a 68°C. Após 10 ciclos, foram adicionados 20 pL de uma mistura contendo 10 pmol de outros iniciadores P(AOXl) forw e P(AOXl)rev, de novo 200 mM de cada dNTP e 0,6 U de Pwo DNA polymerase em condições de tampão apropriadas. O PCR foi continuado como programado após adição da mistura.

Os produtos de PCR obtidos com o tamanho desejado de cerca de 898-947 bp foram purificados num gel de agarose e clonados num vector pCR®4Blunt-TOPO® (Δ2, Δ4, Δ5, Δ7 e Δ8) ou no pCR®-Blunt II-TOPO® (Δ1, Δ3, Δ6 e Δ9) e sequenciados.

Os vectores ρΑΟΧΔ foram construídos por excisão dos fragmentos ΡΑοχιΔ a partir dos vectores TOPO® com BglII e EcoRI e inseridos no vector pAOX entre o sítio BglII e £JcoRI em vez do promotor do tipo selvagem de AOXl. Os vectores resultantes foram verificados por sequenciação.

Exemplo 1.3: Transformação de Pichia pastoris e análise de transformantes A transformação de Pichia pastoris foi efectuada como descrito anteriormente. A selecção para a Integração de PAOxi (ou PaoxiA)-GFP-Zeo-AOXl TT foi efectuada por espalhamento das células de Pichia transformadas e regeneradas em alíquotas em placas de MSMZeo com agar. 70 ΡΕ1851312

As estirpes de Pichia pastoris foram cultivadas em placas de poços fundos contendo 300 pL de BMD(1%) por poço a 28°C, 320 rpm e 80% de humidade durante 60 horas à temperatura ambiente. Após este tempo, 50 pL foram retirados para determinação da fluorescência de GFP. A indução foi efectuada por adição de 250 pL de BMM2/poço seguido por outra incubação de 72 h. O metanol foi reabastecido por adição de 50 pL BMM10 após 10, 24 e 48 horas. Uma vez mais a fluorescência de GFP foi medida após 72 h de indução por metanol.

A análise de expressão de enzima repórter. A expressão de GFP-Zeo em Pichia pastoris foi analisada por detecção da fluorescência de GFP no leitor de placas Spectramax Gemini XS com excitação a 395 nm e emissão a 507 nm. 50 pL de culturas de P. pastoris cultivadas em poços de placas fundos como descrito acima foram diluídos 1+3 com ddH20 em placas de microtitulação FIA. Devida à limitada quantidade de amostra, foram efectuadas apenas medições únicas. Todas as médias ± desvio padrão dadas são calculadas a partir de, pelo menos, 3 culturas diferentes (poços).

Se a cassete de integração é integrada no locus AOX1 sem substituição do gene AOX1, a estirpe recombinante de Pichia é capaz de crescer em metanol com uma taxa do tipo selvagem, enquanto a substituição do gene AOXl por duplo crossover resulta numa taxa de crescimento muito mais 71 ΡΕ1851312 lenta em metanol. Estes dois fenótipos de crescimento são denominados utilização de metanol plus (Mut+) e utilização de metanol slow (Muts), respectivamente. Para análise do fenótipo de utilização de metanol, as culturas de microescala de Pichia pastoris foram transferidas para placas de agar MM e MD utilizando um replicador de 96 pinos e incubadas a 30°C durante 2 dias. Após 2 dias, as colónias aparecem em ambas as placas se a estirpe de Pichia possui fenótipo Mut+ enquanto as colónias de estirpes fenotipicas Muts aparecem apenas em placas MD.

Todas as estirpes Pichia que são derivadas de transformações com pAOX ou um dos plasmideos ρΑΟΧΔ foram analisadas por PCR de colónias e as construções de deleção também por sequenciação para assegurar que a sequência do promotor em frente ao gene repórter (GFP-Zeo).

Exemplo 1.4: Evolução directa do promotor de AOXl

Enquanto a mutagénese por PCR em regiões codificantes de genes está bem desenvolvida e estabelecida, nada é conhecido acerca da mutagénese em regiões do promotor. Devido à falta de conhecimento, várias condições de mutagénese foram efectuadas: Para minimizar desvios no espectro mutacional, foram utilizadas duas polimerases diferentes, uma Taq DNA polimerase e a Mutazyme® DNA poly-merase (Stratagene Inc.). Devido ao facto do conhecimento sobre a frequência de mutação para evolução de sequências 72 ΡΕ1851312 do promotor ser completamente nulo, várias frequências de mutação (teoricamente 1 a ~14/kb) foram testadas.

Mutagénese utilizando Hot Star Taq® DNA poly-merase: 0 PCR mutagénico foi efectuado na sequência do promotor num volume de reacção de 100 pL de acordo com [20] . A reacção continha 12 ng de pAOX, 40 pmol de cada iniciador, (P(AOXl) forw e P(AOXl)rev), dNTPs (200 mM dGTP, 200 mM dATP, 1 mM dTTP, 1 mM dCTP) e 5 U de Hot Star Taq® DNA polymerase em condições de tampão apropriadas. A concentração de MgCl2 foi aumentada para 7 mM (normalmente 3 mM) para alterar a taxa de erro da polimerase. O PCR foi efectuado num termociclador durante 30 ciclos (95°C, 45 s; 55°C, 45 s; 72°C, 1 min 30 s) com um passo inicial de desnaturação de 15 min a 95°C e passo final de extensão de 10 min a 72°C. O GeneMorph® random mutagenesis estojo ("kit") foi realizado na sequência do promotor num volume final de 50 pL de acordo com o manual fornecido. Diferentes quantidades do vector pAOX como molde foram utilizadas (ver Tabela 10). 12,5 pmol de cada iniciador, P(AOXl)forw e P(AOXl)rev foram utilizados. A reacção de PCR foi efectuada num termociclador durante 30 ciclos (95°C, 30 s; 55°C, 30 s; 68°C, 1 min 30 s) com um passo inicial de desnaturação de 1 min a 95°C e um passo final de extensão de 10 min a 68°C. 73 ΡΕ1851312

Tabela 10: Quantidade de molde utilizado na reacçâo de PCR

GeneMorph® N°. Frequência de mutação Quantidade de pAOX Mutações esperadas/kb 1 baixa-média 12 ng ~3 ou inferior 2 média 1,2 ng 3-7 3 Média-alta 120 pg ~7 ou superior

Foi efectuada uma primeira ronda de mutagénese com condições descritas acima (Taq, 3x GeneMorph®). Para obter uma frequência de mutação superior a reacção GeneMorph® #3 foi utilizada como molde para uma segunda ronda de PCR. Foram utilizadas as condições de Taq e GeneMorph® #2 e #3.

Antes da transformação de células de Pichia pastoris X-33 GFP-Zeo Muts A9, todas as reacções de PCR foram precipitadas e dessalinizadas como descrito anteriormente. Foi utilizado o procedimento convencional de transformação e regeneração. A selecção de promotores induzidos em meio de glucose foi efectuada por espalhamento de aliquotas de 150 pL de suspensão de células transformadas em placas MD com agar contendo 100-500 pg/mL de Zeocina™ e incubação a 30°C durante 2 dias.

Exemplo 1.5: Resultados e discussão I) Caracterização do sistema repórter

Até à data, uma grande variedade de variantes de 74 ΡΕ1851312 GFP são utilizadas em biologia molecular. Embora difiram apenas em algumas mutações pontuais, as suas caracterís-ticas diferem enormemente. Para lá das propriedades de reorganização melhoradas, o seu espectro de fluorescência assim como o seu rendimento em quantum e deste modo, as intensidades diferem bastante. As proteínas verde fluorescentes podem ser divididas em dois grupos principais, dependendo do seu máximo de excitação: as variantes de GFP do tipo selvagem com um máximo de excitação a 395 nm e um máximo menor a 470 nm, e as variantes de GFP deslocadas para o vermelho com uma excitação máxima a 4 80-4 90 nm. De acordo com a sua sequência de aminoácidos, o ciclo-3-GFP pertence ao grupo de variantes de GFP do tipo selvagem com um máximo de excitação de 395 nm.

Para controlar as propriedades espectrais quando expressa em Pichia pastoris, o espectro de fluorescência foi determinado. O máximo de excitação global do ciclo-3-GFP em GFP-Zeo é 395 nm, enquanto o segundo máximo a 478 nm é evanescente. O espectro de emissão revela uma emissão máxima de 510 nm. Dos dois comprimentos de onda de excitação sugeridos pelo manual, 395 nm é preferido e foi utilizado para todas as medições. A auto absorção é um fenómeno muito frequente em fluorescência espectroscópica. Em concentrações elevadas de fluoróforo, os fotões emitidos na região que se sobrepõe ao espectro de absorção (excitação) podem ser absorvidos (transferência de energia de radiação). Será observada uma 75 ΡΕ1851312 intensidade de fluorescência inferior se ocorrer auto-absorção (efeito da emissão do filtro interno). Isto leva a uma subestimação das actividades do promotor. Sem efeito de filtro interno a intensidade de fluorescência aumenta numa forma linear à medida que o fluoróforo aumenta. Deste modo, foram testados volumes crescentes de células de Pichia pastoris que expressam GFP-Zeo quanto à sua actividade de fluorescência.

Foram detectáveis até 3000 RFU sem efeito de emissão de filtro interno ao nivel da célula. A auto-absorção nas células, causada pela acumulação de GFP, não pode ser avaliada. Foi detectado um aumento linear na fluorescência ao longo de todas as 72 horas de fase de indução. Por essa razão, um efeito de filtro interno nas células parece não ser provável. Deste modo, a acumulação de GFP-Zeo no núcleo não é problema para a sua quantificação. Não ocorre efeito de filtro interno no intervalo de actividades de promotor de cópia única determinado neste estudo. Devido à ausência de subestimação de auto-absorção das actividades do promotor não é provável que ocorra. O efeito de filtro interno observado por outros é provavelmente causado pela utilização de uma diferente variante de GFP com um desvio de Stokes muito mais pequeno e, deste modo, sobreposição do espectro de excitação e de emissão. Tem de se ser cuidadoso quando se comparam os resultados das experiências de expressão de GFP. A utilização de várias variantes de GFP com propriedades espectrais distintas, mas também com utilizações de codões 76 ΡΕ1851312 optimizados, e, deste modo, niveis de expressão bastante diferentes em diferentes hospedeiros de expressão complica a comparação de resultados de diferentes laboratórios. II) actividade do promotor de A0X1 em microescala A cultura de células microbianas em pequena escala (e.g. levedura, bactéria) é normalmente efectuada em frascos de cultura em agitação. A inoculação e cultura de grandes bibliotecas microbianas em frascos de agitação são trabalhosos e demorados resultando em custos elevados. Nos últimos anos, a cultura em sistemas de microescala utilizando placas de microtitulação de poços fundos foi desenvolvida como uma alternativa. Devido à manipulação paralela de e.g. 96 ou 384 estirpes/culturas e menos material necessário, os sistemas de microtitulação são superiores aos frascos em agitação em termos de trabalho, tempo e, deste modo, intensidade de custos. Devido a várias razões, as maiores desvantagens dos sistemas de microtitulação, o pequeno volume de amostra e baixa eficiência de arejamento, são menos relevantes: (1) avanços técnicos nos sistemas analíticos levam a menores limites de detecção de um grande número de compostos resultando na necessidade de volumes de amostra muito baixos; (2) métodos e dispositivos para o crescimento em placas de microtitulação de poços fundos foram também melhorados. Foi demonstrado em alguns estudos que as taxas de arejamento e, deste modo, as condições de crescimento em placas de microtitulação são semelhantes às dos frascos de agitação. Foi também demonstrado que os 77 ΡΕ1851312 estudos de tempo real no promotor GALl em S. cerevisiae utilizando ciclo-3-GFP como proteína repórter são consistentes com estudos em frascos de agitação. A expressão de GFP-Zeo conduzida pelo promotor de A0X1 foi estudada em placas de microtitulação de poços fundos como descrito acima. Após crescimento celular em glucose, segue-se uma fase de indução com metanol como fonte de carbono e energia. A indução do promotor de A0X1 com metanol em células de Pichia pastoris possuindo a cassete de expressão PAoxi_GFP-Zeo-AOXl TT leva a um rápido aumento na fluorescência de GFP. Até às 72 h a fluorescência de GFP aumentou de uma forma linear. A expressão de GFPZeo pode continuar se o metanol é adicionado. Se não, o metanol desaparece por evaporação e consumo em 24 h e a expressão GFP-Zeo diminui para um nível de desrepressão. 0 aumento na fluorescência de GFP-Zeo também esteve de acordo com a proteína GFP-Zeo como foi demonstrado por SDSPAGE. Após a indução por metanol apareceu uma banda de proteína de cerca de 42 kDa que se tornou mais intensa conforme aumentou a fluorescência. A forte banda a 42 kDa foi encontrada em todos os clones GFP-Zeo enquanto no controlo negativo (tipo selvagem X-33) não apareceu banda. Também na amostra X-33 d6*FlO após 72 horas de indução por metanol foi encontrada uma banda forte (Fig. 1C, Pista 5) . Embora não normalizada, é atribuível uma clara correlação entre as intensidades das bandas de 42 kDa e os níveis de fluorescência apropriados. 78 ΡΕ1851312 III) Sítios de ligação de factor de transcrição

Como descrito anteriormente, as sequências de consenso para os sítios de ligação de vários factores de transcrição são conhecidos. A análise de sequências da sequência do promotor de A0X1 revelou vários sítios de ligação putativos dos factores de transcrição, com alguns máximos de especial interesse. De entre o motivo de factor de choque de temperatura e elemento de resposta ao stresse, foram encontrados poucos sítios de ligação de alguns factores de transcrição geralmente conhecidos por estarem envolvidos na regulação por glucose. Os sítios de ligação mais interessantes foram resumidos na Tabela 11 e Fig. 2.

Tabela 11: Sítios de ligação do factor de transcrição (TF) encontrados na sequência do promotor de A0X1. Os pares de bases em letra maiúscula denotam o núcleo da sequência (os 4 mais conservados, resíduos consecutivos da matriz), os pares de bases sublinhados mostram um elevado conteúdo de informação (Ci>60 de um máximo de 100) .

Matriz de TF Posição (5) * Variante de deleção Semelhança do núcleo Semelhança da Matriz Sequência Seq ID N°. HAP1.01 52-66 (-902 a -888) 1,000 0,802 r.t qt q -9 st etCSCftt 31 HSF.01 135 a 155 (-819 a -799) 1,000 0,784 Sâ«ar aaa- gtcstg 32 HAP234.01 193 a 205 (-761 a -749) Δ1 1,000 0,895 caage- CCA&tááÇ 33 79 ΡΕ1851312 203 a 215 ÍVtcaã ΗΆΡ234.01 (-751 a -739) Δ1 1,000 0,923 34 80 ΡΕ1851312 (continuação)

Matriz de TF Posição (5) * Variante de deleção Semelhança do núcleo Semelhança da Matriz Sequência Seq ID N° . ABM.01 213 a 227 (-741 a -727) Δ1 1,000 0,949 cfcegrct^. t 35 STFE.01 279 a 287 (-675 a -667) 1,000 1,000 g 36 RAP1.01 332 a 346 (-622 a -608) Δ2 1,000 0,845 fcscRC- CCifjSâ"* 37 ADR1.01 371 a 377 (-583 a -577) Δ3 1,000 1,000 tGGGGtc 38 HSF.03 516 a 536 (-438 a -418) Δ4 1,000 0,862 ÃftÃÃacU ccAaaaqt- 39 HAP234.01 665 a 677 (-289 a -277) Δ5 1,000 0,883 CàtCCAM aâS 40 MAT1MC.01 680 a 690 (-274 a -264) 1,000 0,901 tqeal- TGtcliC. 41 GCR1.02 699 a 713 (-255 a -241) Δ6 1,000 0,872 at- «cyrccaa gattc 42 QA-1F.01 743 a 763 (-211 a -191) Δ7 0,785 0,775 aca«c- taaattfcX GATcatga 43 *A posição determinada está marcada no que respeita ao ponto de início de tradução (ATG) do gene GFP-Zeo; as sequências nucleares dos sítios de ligação de factor de transcrição putativos são mostradas em letras maiusculas c denota homologia com a cadeia complementar IV) Sequências reguladoras em genes regulados por metanol Várias sequências são descritas na literatura como estando envolvidas na regulação de genes indutiveis por metanol. Com base na análise de deleção do promotor de A0X2 de P. pastoris foram descritas três regiões reguladoras, duas regiões de acção negativa (URS1 e URS2, 81 ΡΕ1851312 sequências de repressão a montante) e um domínio de acção positiva (UAS, sequência de activação a montante) [3]. Para o promotor MOX de H. polymorpha foram também descritas duas sequências de activação a montante (UAS1 e UAS2) e um sítio de ligação do repressor (URS1) [8]. V) Construções de deleção do promotor de A0X1

Com base na análise de factor de transcrição e do alinhamento múltiplo de sequências foram seleccionadas 9 regiões do promotor para deleção por PCR de extensão de sobreposição como descrito anteriormente. As construções de deleção do promotor de A0X1 foram clonadas no vector pAOX para substituir o promotor 5 "AOXl do tipo selvagem" pelo gene repórter GFP-Zeo. Os plasmídeos foram linearizados e integrados no genoma de Pichia pastoris.

Tabela 12: Sequências removidas nas construções do promotor de AOXl

Construção Posição* Sequência Seq ID N° Extremidade 5' Extremidade 3' Paoxi^I 170 -784 235 -719 tttçccâ&cgaâaâsccagcccagt" t a t tgçg cr, tg a 11. gga gcfccç ct~ cattccaafctccttcta 44 ΡαοχιΔ2 304 (-650) 350 (-604) ttatttccgaâtgeâ&eâagctccgc-a t. ta ca ec ega a ca fccacfc cc 45 ΡαοχιΔ3 364 (-590) 393 (-561) ctgagtgtggggtcsaatagttfccát- gttc 46 82 ΡΕ1851312 (continuação)

Construção Posição* Sequência Seq ID N° Extremidade 5' Extremidade 3' ΡαωχιΔ4 509 (-445) 551 (-403) gt ca aa aaqaaact tceaaaagicg-gcataccgtttgtcttgfc 47 Ραωη.Δ5 625 (-329) 683 (-271) ccggtgcacct91gc- ega aaegeaaatggggaaacac~ ccgetttttggaigattatgea 48 ΡαοχιΔ6 694 (-260) 723 (-231) a t tçt a t qct: t e caágá 11 ctggtfg -gaai 49 Ι?αοχιΔ7 729 (-225) 763 (-191) t g a ta «eeta aes 11 ca t gat-caaaaí ttaactqf 50 Ραω»Δ8 784 (-170) 800 (-154) aatatataaacagaagg 51 ΡαοχιΔ9 823 (-131) 861 (-93) tttttttâecâtcãttattagct-t. act 11 ca ta attgcc 52 *As posições dadas são marcadas em relação à Seq ID N° 1

Os integrantes foram analisados quanto a expressão de GFP-Zeo e quanto à integração da sequência correcta do promotor a seguir ao gene GFP-Zeo como descrito acima. Os integrantes de cópia única foram analisados em mais detalhe quanto aos niveis de expressão GFP-Zeo em diferentes fontes de carbono em microescala. Em todas as construções (deleção e tipo selvagem) não pôde ser detectada fluorescência de GFP quando glucose ou glicerol estavam presentes no meio (com e sem metanol) . Após jejum de carbono, representando as condições de desrepressão, foi detectado um ligeiro aumento na fluorescência de GFP. Em comparação com o tipo selvagem algumas variantes do promotor mostraram diferenças notáveis (Fig. 3). Uma actividade significativamente mais baixa do promotor foi verificada nas 6 construções (Δ3, Δ4, Δ5, Δ7, Δ8 e Δ9, ver Fig. 3) sob condições de desrepressão. Δ1 possuía actividade do tipo selvagem enquanto as construções Δ2 e Δ6* 83 ΡΕ1851312 resultaram numa expressão de GFP-Zeo significativamente elevada. 0 nivel de expressão do último foi notavelmente superior ao nivel do tipo selvagem.

Após indução por metanol todas as variantes apresentaram diminuição significativa da actividade do promotor com apenas uma excepção: Δ1 que resultou em cerca de 20% de actividade elevada em comparação com o tipo selvagem. A diminuição de actividade de todas as outras variantes é bastante significativa como pode ser observado na Fig. 4. A actividade do promotor de todas as variantes e construções do tipo selvagem normalizadas na actividade do tipo selvagem induzida por metanol é resumida na Tabela 13.

Tabela 13: Intensidade de fluorescência promotor de AOXl variantes em microescala. Os resultados representam a média SD de 4 medições independentes. A intensidade de fluorescência após 72 h de indução por metanol do promotor de WT (100%) é 987 ± 81. Não foi detectada fluorescência desde que estivesse presente glucose no meio.

Construção intensidade relativa de fluorescência [%] Desrepressão Metanol Paoxi 2,810,1 100 ΡαοχιΔΙ 3,010,5 120 1 12 ΡαοχιΔ2 4,410,8 40 1 3 ΡαοχιΔ3 0,710,2 68 1 8 ΕαοχιΔ4 1,910,1 72 1 4 84 ΡΕ1851312 (continuação)

Construção intensidade relativa de fluorescência [%] Desrepressão Metanol Paoxi^5 0,23+0,04 30 1 4 ΡαοχιΔ6* 9,110,6 42 1 2 ΡαοχιΔ7 2,210,4 31,3 1 0,5 ΡαοχιΔ8 0,310,2 17,1 1 0,7 ΡαοχιΔ9 1,310,1 61 1 3 A deleção da caixa TATA na construção Δ8 resultou numa destruição massiva do promotor com uma drástica diminuição de actividade em desrepressão e condições de indução de cerca de 90% e 80%, respectivamente. Por eliminação do experimentalmente determinado (Ellis, S.B., et al., Mol. Cell. Biol. (1985) 5:1111-1121) começo de iniciação de transcrição (Δ9) não foi observado este forte efeito no nível de expressão. É uma das melhores construções de deleção após indução por metanol. Como esperado, a caixa TATA tem um importante impacto ao nível de transcrição. Em contraste, o começo da iniciação transcrição parece não ser tão importante como a caixa TATA. Outra região na distância definida à caixa TATA pode actuar como um início de transcrição após deleção da original. Pode-se especular sobre o efeito desta deleção nos vários estádios do processo de expressão (e.g. iniciação da transcrição, estabilidade de mRNA, iniciação de tradução) uma vez que a extremidade 5' do mRNA foi alterada pela deleção.

Apenas duas construções, Δ2 e Δ6*, apresentam um nível de expressão superior significativo após desrepressão. Os sítios de ligação putativos dos factores de 85 ΡΕ1851312 transcrição de Raplp e Gcrlp são incluídos nas sequências removidas. Adicionalmente, o sítio de ligação putativo do factor de transcrição de QA-1F é muito próximo das sequências removidas de Δ6* . Vale a pena notar que, os sítios de ligação de Raplp e Gcrlp são conhecidos por actuarem de uma forma sinergística quando presentes em sequências do promotor [21] . 0 factor de transcrição geral

Raplp possui diversas funções celulares (e.g. estrutura de telómero, cruzamento, tradução, glicólise) dependente do contexto da sequência do seu sítio de ligação e dos factores de transcrição apropriados [22-24]. Como mencionado anteriormente, o Gcrlp é o principal item de regulação e coordenação de genes glicolíticos e é absolutamente necessário para um nível de expressão elevado em S. cerevisiae. Os sítios de ligação de Raplp e Gcrlp são encontrados em muito próximos da região nuclear da sequência de activação a montante (UAS) dos genes glicolíticos e a ligação de Gcrlp é aliviada por ligação do DNA por Raplp. Por outro lado, um sítio de ligação Raplp adjacente não é um requisito absoluto para a activação de genes dependente de Gcrlp. Parece que Gcrlp pode facilitar a ligação ao seu sítio de ligação quando estão presentes números elevados de caixas CT. Embora tenha sido descrita uma clara interacção de Raplp com Gcrlp, assim como de Gcrlp com Gcrlp, alguns outros factores são sugeridos como interagindo com Gcrlp e/ou Raplp modulando a actividade do complexo. Um vasto conhecimento do mecanismo de indução foi conseguido durante as últimas 3 décadas. A grande proximidade essencial descrita dos 86 ΡΕ1851312 sítios de ligação de Gcrlp e Raplp nas UAS funcionais, como descrito acima, pode não ser encontrada na sequência do promotor de A0X1. Em contraste, os dois sítios de ligação são 367 bp afastados. Entre os sítios de ligação putativos de Gcrlp, a sua sequência nuclear CTTCC está presente 2 vezes na sequência do promotor de AOXl, mas nenhum deles imediatamente adjacente e ao sítio de ligação Raplp ou a outro motivo CTTCC. Deste modo a acção sinergística destes dois sítios de ligação como encontrado em muitos genes glicolíticos parece não ser provável. Devido ao facto de que os papéis putativos de Raplp e Gcrlp são o de proteínas repressoras para AOXl sob condições de desrepressão, é possível um novo modo de inter (acção) das duas proteínas para esta nova função celular putativa.

Um envolvimento da deleção Δ6* (incluindo os sítios de ligação putativos de Gcrlp) na repressão após jejum de carbono é enfatizado pela observação de estirpes multicópia com expressão muito elevada de GFP-Zeo sem indução por metanol. A expressão GFP-Zeo do melhor clone de séries Δ1 - Δ9, denominada P. pastoris X-33 d6*F10, é apresentada na Fig. 5. A expressão GFP-Zeo é cerca de 10% superior após desrepressão (60h em microescala) nesta estirpe Δ6* multi-cópia do que no promotor de cópia única do tipo selvagem (X-33 GFP-Zeo D2) após indução por metanol. O nível de expressão de P. pastoris X-33 d6*F10 após indução por metanol é também muito superior à da estirpe multicópia com o promotor do tipo selvagem (X-33 GFP-Zeo E2). 87 ΡΕ1851312

As regiões do promotor de AOXl e DASl de P. pastoris e MOX de H. polymorpha promovem a expressão da enzima repórter beta-galactosidase (lacZ de E. coli) em S. cerevisiae [9] . 0 padrão de regulação destes genes em S. cerevisiae é semelhante ao dos seus hospedeiros naturais: a glucose reprime a expressão do gene. Em condições de jejum de carbono a expressão é ligeiramente desreprimida e glicerol como fonte de carbono induz a expressão. Os niveis de beta-galactosidase expressa sob o controlo das regiões reguladoras AOXl e DASl em S. cerevisiae são comparáveis aos obtidos com os promotores fortes de S. cerevisiae CYCl (constitutivo) e GAL2 (indutivel) [9] . Foi demonstrado que a expressão conduzida pelo promotor MOX é também induzida por etanol, metanol e ácido oleico em S. cerevisiae. Outra observação muito importante é o envolvimento de Adrlp na desrepressão/indução do promotor. Adrlp, um efector positivo de ADH2 (álcool desidrogenase 2) e algumas proteínas peroxissómicas em S. cerevisiae [25], é também um efector positivo do promotor MOX quando a glucose está ausente no meio.

Como mencionado antes, o padrão de regulação dos genes AOXl e MOX são significativamente diferentes nos seus hospedeiros naturais devido à desrepressão de MOX quando o glicerol está presente. A utilização da região do promotor de AOXl em H. polymorpha revelou que o promotor de AOXl não é reprimida por glicerol no hospedeiro heterólogos [26] . Deste modo, o promotor de AOXl heterólogo parece ser regulado como o promotor homólogo de MOX. Isto resulta na 88 ΡΕ1851312 sugestão de que as diferenças significativas no padrão de regulação entre P. pastoris e H. polymorpha são devidas à resposta geral de transcrição a diferentes fontes de carbono nestas duas leveduras. Ou seja, enquanto a maquinaria de repressão por glicerol e glucose é (parcialmente) idêntica em P. pastoris, em H. polymorpha (como em S. cerevisiae) a situação é diferente e o glicerol não utiliza a maquinaria de repressão por glucose.

Dois dos três sitios de ligação putativos HAP2/3/4/5 encontrados na sequência do promotor de AOXl estão na construção de deleção Δ1 e a terceira na Δ5. A sequência de deleção de Δ1 resulta num aumento da actividade do promotor após indução por metanol enquanto não foi observado efeito na desrepressão ao nível do promotor. Em contraste, a deleção de Δ5 resulta num severo decréscimo na actividade do promotor sob desrepressão assim como em condições de indução, deleção Na Δ1 foi encontrado um sítio de ligação putativo de abaA de Aspergillus nídulans. 0 produto do gene abaA é um activador de transcrição que está envolvido no desenvolvimento do conidióforo (aparelho reprodutivo assexuado) em A. nídulans [27]. Uma vez que todos os sítios de ligação putativos são possíveis sequências activadoras [27], a sua deleção deve ter um efeito negativo no nível de expressão como se verifica na construção Δ5. Devido ao facto de que ambas as deleções são muito longas, outro sítio de ligação pode ser responsável pelo efeito observado. 0 facto de que a deleção de Δ1 tem o efeito oposto no nível de expressão indica que um dos 89 ΡΕ1851312 sítios de ligação putativos é um motivo repressor, ou que está presente outro sítio de ligação que excede os efeitos da deleção dos sítios de ligação putativos de HAP e abaA, aumentando deste modo o nível de expressão.

No entanto, o complexo HAP é conhecido por ser responsável pela regulação positiva de genes envolvidos no metabolismo respiratório e de energia em S. cerevisiae. A regulação da respiração é controlada pelo nível de oxigénio assim como pela fonte de carbono presente no meio, ambos mediados pelo complexo Hap. Na levedura fermentativa S. cerevisiae, vários genes e, deste modo, funções da cadeia respiratória, assim como o ciclo do ácido cítrico são reprimidos pela glucose. A repressão da respiração pela glucose é parcialmente mediada pelo complexo Hap, nomeadamente pela ausência de Hap4p desde que a glucose esteja presente. Em contraste, a regulação dependente de oxigénio parece ser regulada por Haplp [28]. Os homólogos do complexo de genes Hap foram isolados na levedura respiratória K. lactis. Os genes envolvidos na respiração são constitutivamente expressos nas leveduras respiratórias, mesmo na presença de glucose. Até à data, quase todas as cadeias respiratórias do gene mostraram ser reguladas independentemente do complexo Hap [29]. 0 papel do complexo Hap parece estar na coordenação da assimilação de carbono e azoto, como foi também verificado em S. cerevisiae [30] e Aspergillus nidulans [29]. O primeiro passo na via de utilização de metanol, principalmente catalisado pelo produto do gene AOXl em p. 90 ΡΕ1851312 pastoris, é consome oxigénio. A maioria dos genes envolvidos no metabolismo energético e quase todos os genes que codificam enzimas que consomem oxigénio são regulados por oxigénio, principalmente por Haplp e/ou Hap2/3/4/5p [28] . Quando cultivadas em metanol como única fonte de energia e carbono, a via de utilização de metanol resulta em assimilação de carbono e produção de energia. Um envolvimento do motive de reconhecimento do complexo Hap TTCCAA na regulação do promotor de AOXl torna o sentido intuitivo. A construção Δ4, que inclui um segundo sitios de ligação putativo de HSF, resultou num decréscimo de 30% de actividade do promotor após desrepressão e indução. Deste modo, a HSF é um intensificador geral da expressão do gene AOXl sob condições de desrepressão assim como de indução. Em S. Cerevisiae, várias condições de stresse como choque por aquecimento, stresse oxidativo e jejum de glucose levaram à activação de HSF. Foi também demonstrado que a proteína cinase Snflp, um dos "interruptores metabólicos principais", está envolvido na fosforilação e deste modo na activação de HSF após jejum de carbono [31] . Deste modo, ocorre um envolvimento de HSF na activação total de AOXl após jejum de glucose (com ou sem indução).

Os estudos de expressão no promotor de AOXl utilizando versões truncadas assim como variantes com sequências removidas são revelados na técnica anterior [32, 91 ΡΕ1851312

Tabela 14: Resultados dos estudos do promotor por Inan et al. [32, 33]; A indução foi efectuada com 0,5% de metanol como fonte de carbono, repressão com 0,5% de metanol e 0,5% de etanol; As posições no inicio denotam a extremidade 5' da sequência no promotor de AOX1 no que respeita ao ponto de iniciação de tradução (ATG)

Fragmento do Deleção por referên- actividade relativa [%] Promotor cia a SEQ ID No.l induzida reprimida InanABCDEF - 100 3,1 ± 0,3 Inan BCDEF 7 a 152 (-947 a -802) 76 + 5 1,9 ± 0,2 Inan CDEF 1 a 292 (-947 a -661) 49 + 4 2,2 + 0,5 Inan DEF 1 a 432 (-947 a -521) 14 + 3 1,3 + 0 Inan EF 1 a 559 (-947 a -394) 24 ± 7 1,8 ± 0 Inan F 1 a 798 (-947 a -245) 7+2 1,8 + 0,2 InanA CDEF 153 a 292 (-801 a -661) 63 + 3 2,1 + 0,2 InanAB DEF 293 a 432 (-660 a -521) 109 ± 12 3,8 ± 0,4 InanABC EF 433 a 559 (-520 a -394) 128 ± 6 5,0 ± 0,6 InanABCD F 560 a 798 (-393 a -245) 16 ± 1 0,8 ± 0,2 A construção Inan_BCDEF, que tem inicio em 153 (-801) (Tabela 14) revelou um sitio de ligação de pelo menos uma proteína activadora a montante de 153 (-801). Os 92 ΡΕ1851312 candidatos para este sítio de ligação do activador são os sítios de ligação de Haplp (52 a 66, -902 a -888) e HSF (135 e 155, -819 a -799) na cadeia complementar encontrada com o Matlnspector. A truncagem no sítio de restrição Saci (210-215 (-744 a -739)) resultou num promotor que quase atinge a actividade do promotor do tipo selvagem (Geoff Lin Cereghino, Póster, Sixth Meeting on "Current Topics in Gene Expression e Proteomics", San Diego, Outubro 19-22, 2003) . Para atingir o nível do promotor do tipo selvagem com a construção de promotor truncada em Saci (pHWGO, Geoff Lin Cereghino, póster), um segundo sítio de ligação para uma proteína repressora pode estar presente a montante de 210 (-744) cuja deleção tem o mesmo impacto, mas na direcção oposta, na actividade do promotor. A localização da proteína repressora é entre 169 (-784) e 210 (-744) porque a construção Δ1 (Δ169 (-784) a 234 (-719)) contém um sítio de ligação ao repressor. A deleção de Δ1 resulta num aumento de 20% de actividade do promotor (Tabela 14) que está no intervalo do decréscimo por deleção do sítio de ligação da proteína activadora.

Por comparação com Δ4 (Δ 508 (-445) a 550 (-403)) a localização do sítio de ligação repressor pode ser ainda refinada a uma sequência entre 433 (-520) e 508 (-445) porque a deleção Δ4 inclui um factor de transcrição que actua positivamente, HSF a 516 a 536 (-438 a - 418) . Se a actuação positiva de HSF (se é HSF) está localizada na região proposta, pode ser sugerido um efeito mais forte do sítio de ligação do repressor entre 433 e 508 (-520 e -445) . Se o sítio de ligação para HSF está localizado na 93 ΡΕ1851312

região entre 508 e 536 (-445 e -418), outro sítio de ligação do activador está localizado entre 536 e 560 (-418 e -393) . Se não, é provável que sejam os mesmos sítios de ligação. Como a variante InanABCD_F (Δ 560 a 709 (-393 a -245)) com apenas 16% de actividade do tipo selvagem também a construção Δ5 (624 a 682 (-329 a -271)) resulta num decréscimo de cerca de 70% do nível do tipo selvagem. Como esperado, a deleção do fragmento Inan B do promotor de comprimento total (resulta em InanA_CDEF) assim como de Inan_BCDEF (resulta em Inan_CDEF) resulta num decréscimo de 63 e 64% do fragmento mais longo, respectivamente. Em contraste, enquanto a deleção do fragmento C do promotor de comprimento total resulta num aumento de cerca de 10% na actividade do promotor, a deleção do fragmento truncado Inan CDEF leva a um decréscimo de 49 a 14% (Tabela 14) . A explicação é uma ligação sinergística de factores de transcrição dependente no contexto dos seus sítios de ligação. É localizado entre 713 e 760 (-241 a -194) um último sítio de ligação de proteína activadora (Geoff Lin Cereghino, Póster San Diego). De novo, pela construção Δ7 (Δ 729 a 763, -225 a -191) a localização do activador pode ser refinada a jusante até 729 (-225).

Para concluir, foram encontradas várias regiões que tinham um forte impacto no nível de expressão do promotor de AOX1. Combinando todos sítios de regulação conhecidos do exemplo aqui proporcionado e de outros autores, excluindo as regiões contendo a caixa TATA e o sítio de iniciação de transcrição, existem, pelo menos, 10 sítios reguladores no promotor da AOXl sequência. ΡΕ1851312

Os dados proporcionados revelaram a regulação orquestrada do promotor de A0X1: vários factores são necessários para a ligação ao DNA para o nivel de expressão máximo. Sob condições de indução, vários factores de transcrição que actuam de forma positiva (activadores) se ligam ao DNA enquanto a maior parte das proteínas repressoras não se liga, resultando num nível de expressão elevado. Enquanto desreprimida, a actividade do promotor atingiu apenas uma pequena percentagem (~3%) do nível induzido. Isto é mais provavelmente devido a menos acti-vador e mais proteínas repressoras que se ligam à região do promotor. Sob condições de repressão pode assumir-se que não se ligam ao DNA activadores mas vários repressores com um consequente aumento da proporção repressor/activador sob condições de repressão.

Foi demonstrado para o promotor da ADH2 (álcool desidrogenase 2) de S. cerevisiae reprimido por glucose que a ligação de proteínas activadoras (e.g. Adrlp) imediatamente adjacentes a nucleossomas levaram à destabilização e deste modo ao rearranjo da cromatina após desrepressão. 0 rearranjo ocorre na região da caixa TATA e no sítio de iniciação de transcrição aumentando, deste modo, a sua acessibilidade. Devido à maior acessibilidade, ocorre a formação de um complexo estável de pré-iniciação, aumentando deste modo a actividade do promotor a um nível basal. De entre a ligação de vários factores de transcrição para intensificar a expressão conduzida pelo Paoxu pode assumir-se um mecanismo semelhante, pelo menos para a desrepressão. 95 ΡΕ1851312

Tendo em conta os dados e assunções em conjunto, a regulação do promotor de A0X1 é altamente complexa e os sítios de ligação putativos de vários factores de transcrição (que actuam positivamente e negativamente) revela uma maquinaria altamente coordenada que é capaz de integrar uma vasta variedade de sinais para a regulação do promotor de A0X1. VI) Mutagénese por PCR do promotor de A0X1

Foi aqui demonstrado que as mutações específicas nas sequências nucleares dos sítios de ligação dos factores de transcrição resultam em alterações significativas da sua força efectora. Assumidamente, algumas a proteínas activadoras e repressoras actuam no promotor de A0X1 para resultar na sua forte regulação (quase sem actividade sob glucose, actividade muito elevada em metanol). Deste modo mutagénese aleatória do promotor de A0X1 deve resultar em várias variantes do promotor com actividades de repressor do sítio de ligação destruídas ou reduzidas. Foi efectuado um conjunto de reacções de PCR com diferentes taxas de mutação. As variantes do promotor resultantes foram transformadas em P. pastoris estripe GFP-Zeo MutS A9 em que o gene A0X1 foi substituído pela estirpe GFP-Zeo. A substituição do promotor do tipo selvagem de A0X1 por variantes mutagenizadas do promotor deve ocorrer a uma taxa particular. 0 rastreio das variantes do promotor com taxa de expressão superior quando a glucose está presente no meio foi efectuado em placas de agar MD-Zeo. 0 espalhamento em placas de agar MD contendo 100 mg/mL de Zeocina™ 96 ΡΕ1851312 resultaram em placas cobertas de células de Pichia pastoris e não eram aparentes colónias únicas. Parece que a pressão selectiva não foi suficiente para reprimir o crescimento da estirpe do tipo selvagem. Embora não pudesse ser detectada fluorescência na estirpe de P. pastoris GFP-Zeo MutS A9 quando a glucose está presente, algumas proteínas GFP-Zeo podiam ser expressas nas células que conferiam resistência a Zeocina™. Para testar concentrações superiores de Zeocina™ para a inibição de crescimento da estirpe GFP-Zeo MutS A9 foram efectuados testes de gota como descrito anteriormente.

Como pode ser claramente observado na Fig. 6, o aumento para 200 pg/mL não diminuiu a viabilidade celular (em comparação com 100 pg/mL) das estirpes de P. pastoris portadoras de um gene GFP-Zeo sob o controlo do promotor de AOXl, mas o aumento de 500 pg/mL sim. Esperava-se que a mutagénese do promotor devia resultar em níveis de expressão apenas ligeiramente aumentados, deste modo, a pressão selectiva de 500 pg/mL de Zeocina™ parece ser demasiado elevada. Finalmente, foram seleccionados 350 pg/mL para todos os outros rastreios de variantes do promotor por mutagénese.

Devido à muito complexa regulação de transcrição com muitas regiões do promotor envolvidas é vantajosa uma abordagem de mutagénese aleatória utilizando uma taxa de mutagénese elevada. 97 ΡΕ1851312

Exemplo 2: Produção de deleções no promotor

Com base nos resultados de exemplo 1 foi produzida uma segunda geração de variantes de deleção. Em contraste com a primeira série, nestas novas construções de deleção, apenas foram removidas pequenas e especificas extensões de sequências do sitio de ligação putativo do factor de transcrição (5-15 bp) (Tabela 15).

Tabela 15: Efeitos de deleção de sítios de ligação de factor de transcrição específicos ao nível da expressão após desrepressão (jejum de glucose) e indução por metanol. As mutações Δ1-Δ9 assim como as combinações de mutações únicas foram também contabilizadas. Todos os números são activi-dades relativas do promotor em comparação com a actividade do promotor do tipo selvagem sob as mesmas condições.

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Materiais e métodos: a) Mutagénese:

As deleções foram introduzidas utilizando o protocolo de mutagénese dirigida ao sitio em dois passos de acordo com Wang et al. [34]. Num primeiro passo, foram avaliadas duas reacções separadas (uma para o iniciador directo e uma para o reverso) (100 ng de pAOX molde, 15 pmol de iniciador, 200 pM de cada dATP, dTTP, dCTP e dGTP, 2,5 U PfuUltra™ polymerase num volume total de 50 mL em condições de tampão apropriado). 25 pL destas 2 reacções de PCR foram combinados e um segundo passo de reacção de PCR foi efectuado.

Foi adicionado 1 pL da enzima de restrição Dpnl (10 u/pl) a 30 pL do segundo passo de reacção PCR e incubado durante 1 h a 37°C. 1-5 pL de reacção de PCR digeridos com Dpnl foram transformados em células E. coli electrocompetentes [16] e plaqueadas em placas de LB-Amp após 1 h de tempo de regeneração no meio SOC.

Tabela 16: Iniciadores para mutagénese dirigida ao sitio das deleções do sitio de ligação do factor de transcrição

Deleção Nome Sequenz (5'—>3') SEQ ID No. Hapl Haplfw GMTGAMCÇfTTTTQCCATA···· TCCJVCAGtTCCÃTfCTCAC 53 GMTGGACCTSTGGATATGSCMAMQ" Haplrv GTTTÇATTÇMCC 54 ΡΕ1851312 100 (continuação)

Deleção Nome Sequenz (5'—>3') SEQ ID No. Hsf 1 Hsf lfw CCGTTGCAÃACGCAG- GACCTCTTCTCCTCAACíiCCCAC 55 Hsf lrv G TGTTG&G GAGAAGAGGT CCT- GCGTTTGCMCGGTCTG 56 Hap2345 1 Hap2345 lfw CGAAAAACC&GCCCAGTTGCTTGATTG- GAGCTCGCTCATTCC 57 Hap2345 lrv gagcgagctccmtcaagcaactgg- GCIGGTTTTTCGATG 58 Hap2345 2 Hap2345 2fw CAGCCCAGTTATTGGGCT- TGAGCTCGCTCATTCCMTTCC 59 Hap2345 2rv G GAATTGGAATGAGCGAGCTCAAGC ~ CCAATAACTGGGCTG 60 ABM ABMfw GGCTTGATTG- GAGCTCGCTAATTCCTtCTATTAGGC- TAC 61 ABMrv GTAGCCTAATAGAAGGAÂTTAGC- GAGCTCCAATCAAGCC 62 Stre 1 Stre lfw GCCTGTCTATCCTGGCCGGCGAG~ G TTCATG TTTSTTTATTTC 63 Stre lrv CAMCATGAACCTCGCCÕGCCAG- gatagacasgctaatãaag 64 Rapl Raplfw GCAACA&GCTCCGCATTACAACAT- CACTCCAGATGAGG 65 Raplrv CCTC&TCTGGAGTGATGTTGTAATGCG- GAGCTTGTTGC 66 Adrl Adrlfw CCAGATGAGGGCTTTCTGAGT- gmatagtttcatgttccc 67 Adrlrv GGGMCATGMACTATTTCACT- CAGAAAGCCCTCATCTGG 68 Hsf 2 Hsf 2fw GCCAGTTGGTCAAAAACAAAAGTCG-GCATACCGTTTGTC 69 Hsf 2rv C GGTAT G C C G AC TTT TGT T TTTG AC “ CAACTGGCCGTTAGC 70 Hap2345 3 Hap2345 3fw CAAATGGGGAAACACCCGCTTATGAT- TATGCATTGTCTCCAC 71 Hap2345 3rv GAGACAATGCATAATCATAAGCGGGT- GTTTCCCCATTTGCG 72 MatlMC MatlMCfw GCTTTTTGGATGATTATGCCTCCACAT- TGTATGCTTCCMG 73 MatlMCrv CTT G G AAGC AT AC AA. T GT G GAG -GCATAATCATCCAAAAAGC 74 Gcrl Gcrlfw CMTGTCTCCACATTGTÂT- fiAAGATTCTGGTGGGAATACTGC 75 Gcrlrv GTATTCCCACCAGAATCTTCATACAAT- GTGfiAGACAATGC 76 101 ΡΕ1851312 (continuação)

Deleção Nome Sequenz (5'—>3') SEQ ID No. QA-1F QA-IFfw GCTGATAGCCTAACGTTCAT- GTXCTMCCCCTACTTGflCAGC 77 QA-lFrv GTCMGTAGGGGTTAGMCATGAACGT- TAGGCTATCAGCAG 78 736-741 d736-41fw GGMTÀCTGCTGATAGCTTCATGAT” ÇÂãAAT TTAACT GTTC 79 d736-41rv GTTAAATTTTGATCATGAAGCTAT- rAGCAGTATTCCCACC 80 737-738 d737-38fw GGAATACTGCTGATAGCCACGTTCAXG- ATCAAAATTTAACTG 81 d737-38rv GTTaaattttgatcatgsacgtg- GCTATCAGCAGTATTCC 82 b) Transformação de Pichia pastoris e caracterização de clones:

Os plasmideos construídos como descrito acima foram preparados e transformados em Pichia pastoris como descrito no exemplo 1.

Resultados e Discussão: É observado um forte efeito no nivel de expressão com as mutações curtas do exemplo 2 como anteriormente descrito para as deleções maiores do exemplo 1 em que todas as mutações possuíam um efeito significativo positivo ou negativo na actividade do promotor. As deleções curtas dos sítios de ligação do factor de transcrição específico têm fortes efeitos na actividade do promotor e produzem uma informação mais precisa acerca das propriedades reguladoras dos sítios reguladores individuais (e.g. o sítio de ligação dos factores de transcrição). Gcrl tem especial interesse uma vez que o seu sítio de ligação está incluído na deleção 102 ΡΕ1851312 Δ6. A sequenciação da região do promotor de um mutante de deleção ρΑΟΧΔ 6 e de uns produtos de PCR de colónia de DNA genómico de clones de Pichia pastoris revelou uma deleção adicional na região do promotor (Deleção dos nucleótidos 737 a 738 (-217 a -216) de Seq ID N° 1). Devido ao facto de que esta variante do promotor leva a um aumento de actividade do promotor resultando, consequentemente, numa taxa de expressão mais elevada sob condições de desrepressão, a mutação adicional pode ser introduzida num promotor de acordo com a presente invenção para aumentar a expressão de proteína sob estas condições. A actividade do promotor dos clones QA-1F com uma deleção adicional (Deleção de nucleótidos 736 a 741 (-218 a -213) de Seq ID N° 1) é significativamente diferente em comparação com o promotor AQA-1F sem esta deleção adicional: A actividade altera-se de -30% (desrepressão) e -100% (Indução) de actividade do tipo selvagem (A0X1AQA-1F, ver tabela 15) a -140% e -70%, respectivamente (ΑΟΧ1Δ0Α- lFzus, ver tabela 15) . A deleção adicional destes 6 nucleótidos parece ter uma influência dramática na actividade do promotor. Deste modo, foi introduzida uma nova variante do promotor portadora desta mutação (Δ736-741) pelo protocolo de mutagénese dirigida ao sítio como descrito acima. Ambas as mutações que aparecem duas vezes acidentalmente e independentemente nesta região resultaram num aumento da actividade do promotor sob condições de desrepressão. É notável que existe um aumento na actividade do promotor embora exista uma segunda mutação e mais 103 ΡΕ1851312 provavelmente influenciando negativamente em ambas as construções. A combinação de Δ2 e Δ6 (Δ2Δ6) foi produzida de modo semelhante a deleções únicas por PCR de extensão de sobreposição. É claramente apresentado na tabela 17 que a deleção de ambos os fragmentos resulta numa diminuição muito forte da actividade do promotor sob desrepressão assim como em condições de indução. Uma vez que não existe a deleção TA adicional nesta construção, em comparação com a construção Δβ* como acima mencionado, também este resultado apoia a especulação de que a mutação adicional que terá surgido acidentalmente (Δ737-38) é responsável pelo aumento na actividade do promotor após jejum de carbono. Várias deleções resultam numa diminuição dramática da actividade do promotor (e.g. Hsf, mas também Hapl e Hap2345_l). Estes sitios de ligação putativos são alvos brilhantes para a duplicação da sequência que pode resultar num aumento de actividade do promotor.

De modo interessante, em 2 de 4 clones da variante Δ736-741 produzidos por mutagénese dirigida ao sitio foi encontrada uma nova deleção de 9 nucleótidos (TTGGTATTG) na posição 552 a 560 (-402 a -394). O efeito de que as deleções foram encontradas numa região distinta foi também encontrado nas construções AHsf_2. Espera-se que este efeito seja devido a homologia de sequência local. Deste modo, estas regiões adicionalmente removidas (Δ552- 104 ΡΕ1851312 560, Δ737-38 e Δ736-41) e as sequências na sua proximidade (5 bp a montante e a jusante) são também sítios de ligação putativos do factor de transcrição e, deste modo, alvos extremamente interessantes para deleções e duplicações. A variante de deleção Δ736-41 resulta numa redução intensificada do nível de expressão sob condições de indução por metanol.

Estirpes Multicópia:

Na maioria dos casos, a produção de estirpes multicópia resulta em estirpes de superexpressão de GFP-Zeo. Em muitos casos, estas estirpes têm níveis de expressão superiores aos das estirpes d6*F10, principalmente sob condições de indução por metanol. A produção de estirpes multicópia foi conseguida com várias construções, especialmente com a construção Δ6*, a dupla deleção d2d6, construções incluindo as deleções Δΐ, Δ2 e Δ6* assim como e.g. Gcrl, Rapl, abaA, Hap2345_l, mas também e.g. QA-1F, Adrl, Hsf_2_MatlMC e Hsf_2_Hap2345_l (ver figura 7). Nestas estirpes, verifica-se uma taxa de expressão superior sob condições de indução em comparação com a estirpe d6*F10. Em contraste, a estirpe d6*F10 foi capaz de produzir mais GFP-Zeo do que qualquer outra estirpe produzida até agora sob condições de desrepressão. A transformação repetida da construção Δ6* de Pichia pastoris resulta num elevado número de estirpes multicópia com actividade comparável à da estirpe d6*F10, especialmente sob condições de desrepressão (figura 8). 105 ΡΕ1851312

Utilizando construções do promotor do tipo selvagem, foi observada uma muito menor frequência de estirpes multicópia (e.g. estirpe E2) do que utilizando variantes do promotor. Embora 2-4 vezes mais transformantes tenham sido analisados, o nível de expressão do melhor transformante de E2 é apenas duas vezes tão elevado como os transformantes unicópia. Em conclusão, a transformação de variantes do promotor resulta numa frequência mais elevada de estirpes multicópia e estas estirpes são multiplamente mais produtivas do que as estirpes mulitcópia do promotor do tipo selvagem.

Exeirçplo 3: Proteínas repórter alternativas

Para testar a praticabilidade de todos os resultados GFP-Zeo para outras proteínas basicamente bem expressas e industrialmente relevantes (e.g. enzimas) algumas variantes do promotor foram clonadas a seguir a estas enzimas repórter (e.g. PaHNL5a e HRP).

Clonagem:

As variantes do promotor foram clonadas nos vectores pPICZaB-HRP-WT [35] e pGAPZ A-PaHNL5a. Para a troca de promotor no pPICZaB-HRP-WT foi inserido um sítio de restrição NdeI na extremidade 5' do promotor por

mutagénese dirigida ao sítio (100 ng de vector como molde, iniciador NdelPlCZfor e NdelPICZrev - ver tabela 18) . O vector resultante foi denominado pPICZaB-Ndel-HRP-WT. 106 ΡΕ1851312

Tabela 18: Iniciador para mutagénese dirigida ao sitio para introdução de um sitio de restrição NdeI em pPICZaB-HRP-WT e para troca de promotor

Nome Sequência (5'—>3') Seq ID N° NdelPICZfor GAGATCAGATCTAACATATGCCAAAGACGAAAG- GTTG 83 NdelPICZrev CAACCTTTCGTCTTTGGÇATATGTTAGATCTG- ATCTC 84 AOX1NDE1 AAACATATGAGATCTAACATCCAAAGACGAAAGG 85 AOXlrev TGGTTGAATTCTTTCAATAATTAGTTG 86

Para o clone de expressão pGAPZ A-PaHNL5a o gene PaHNLSa foi primeiro clonado a partir do vector pHIL-D2 (Glieder, A., et al. Angew. Chemie Int. Ed. 2003) num vector pGAPZ A, resultando num plasmideo pGAPZA-PaHNL5a. A clonagem das variantes do promotor em pGAPZ A-PaHNL5a pode ser efectuada directamente após digestão com EcoRI/BglII dos plasmideos pGAPZ A-PaHNL5a e ρΑΟΧΔ. Para uma troca no pPICZaB-Ndel-HRP-WT as variantes do promotor foram amplificadas por PCR utilizando os iniciadores AOX1NDE1 e AOXlrev (ver tabela 18, 10 ng ρΑΟΧΔ, 10 pmol de iniciador AOX1NDE1 e AOXlrev, 200 mM de cada dNTP, 0,6 U de Phusion™ Polymerase em condições de tampão apropriado e num volume total de 50 mL). Os produtos de PCR e o plasmideo pPICZaB-Ndel-HRP-WT foram clonados empregando os sitios de restrição Ndel/HindIII.

Transformação, crescimento e ensaios enzímáticos:

Para a transformação de Pichia pastoris todos os vectores HRP foram linearizados por NdeI e todos os 107 ΡΕ1851312 plasmídeos PaHNL5a por BglII. A transformação foi efectuada como descrito no exemplo 1. O crescimento de estirpes de P. pastoris foi também efectuado como descrito no exemplo 1 com apenas algumas excepções. A quantidade de BMD(1%) inicial foi aumentada para 350 pL e após 60 horas, 100 pL de cultura foram retirados para centrifugação (4000 rpm, 4°C, 10 min). A indução por metanol foi efectuada exactamente como descrito no exemplo 1.

Foram retirados 50 pL (desrepressão ou 10 pL (indução) de sobrenadante da centrifugação para o ensaio de HNL e 15 pL em ambas as condições para o ensaio de HRP.

Ensaio de HRP (de acordo com [35]):

Foram adicionados 15 pL de sobrenadante a 150 pL de lmM de ABTS/2,9 mM de H2O2 em tampão 50 mM de NaOAc pH 4,5 em placas de microtitulação PS. A absorção foi seguida durante 5 minutos a 405 nm num leitor de placas Spectramax Plus384 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA).

Ensaio de HNL (de acordo com [36]):

Foram adicionados 50 pL ou 10 pL de sobrenadante a 100 ou 140 pL de tampão 0,05 M de fosfato-citrato pH 5,0 numa placa de microtitulação UVStar. A reacção foi iniciada por adição de 50 pL de solução de 0,06 M de mandelonitrilo (em tampão 0,003 M de fosfatocitrato pH 3,5) e seguido durante 5 minutos a 280 nm num leitor de placas Spectramax Plus384 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA). ΡΕ1851312 108

Resultados e discussão:

Os resultados utilizando as proteínas repórter alternativas PaHNL5aandHRP mostraram claramente a transfe-rabilidade de actividade do promotor detectado utilizando GFP-Zeo (Tabela 17) .

Devido à baixa sensibilidade do ensaio de HRP o nível de expressão em condições de desrepressão foi abaixo do limite de detecção. Deste modo, a expressão de HRP não pode ser determinada sob condições de desrepressão.

Tabela 17: Actividade do Promotor de várias variantes do promotor de AOX1 com enzimas repórter alternativas (em parênteses rectos a actividade relativa em comparação com o promotor do tipo selvagem sob as mesmas condições é contabilizada (desrepressão e indução, respectivamente)) GFP- -Zeo PaHNL5a HRP Promotor Desrepr. Metanol Desrepr. [mU/min] Metanol [mU/min] Desrepr. [mU/min] Metanol [mU/min] P(A0X1) 27,3 987 2,58 69,5 n.d. 20,3 (100%) (100%) (100%) (100%) (100%) P(AOX1)Δ1 29,5 1188 2,37 100 n.d. 26,9 (108%) (120%) (92%) (144%) (132%) P(A0X1)Δ2 43,0 399 n,d, 91,7 n.d. 9,6 (157%) (40%) (132%) (47%) P (AOX1) Δ6* 89,9 422 8,65 51,7 n.d. 17,5 (329%) (42%) (335%) (74%) (86%) P(AOX1)Δ 9,9 336 1,29 37,5 n.d. 9,9 2Δ6 (36%) (34%) (50%) (54%) (49%) n.d. não detectável 109 ΡΕ1851312

Para transferir a selecção de multicópia para os sistemas repórter alternativos, as variantes do promotor de AOXl foram clonadas nos plasmideos HRP e PaHNLSa apropriados a seguir ao gene de resistência a Zeocina substituindo, deste modo, o promotor TEF1.

Exemplo 4: Proteína repórter alternativa a GFP

Para testar as variantes do promotor com GFP, as variantes do promotor descritas nos exemplos 1 e 2 foram clonadas a seguir ao gene ciclo-3 GFP.

Clonagem:

Os sítios de restrição internos BamRI e XhoI no ciclo-3 GFP no vector pAOX foram removidos por mutagénese dirigida ao sítio empregando os iniciadores Bam-del-f e Xho-del-f (Tabela 19) e 100 ng de vector como molde. O fragmento GFP foi amplificado por PCR a partir do plasmídeo resultante (10 ng) empregando os iniciadores GFP-Zeo forw (Seq. ID N° 4, Tabela 7, 10 pmol) e wtGFP-Xhol-r (Tabela 19, 10 pmol) e Phusion™ polymerase sob condições apropriadas. O produto de PCR resultante pode ser clonado no vector pPICZ B empregando restrição com EcoRI/Xhol e ligação utilizando T4 DNA Ligase. O plasmídeo resultante foi nomeado pPICZ-GFP. 110 ΡΕ1851312 A clonagem de todas as variantes do promotor no pPICZ-GFP pode ser efectuada directamente após digestão com BglII/EcoRI dos plasmídeos pPICZ GFP e pAOXD.

Tabela 19: Iniciador para mutagénese dirigida ao sitio do ci-clo-3-GFP no vector pAOX e amplificação do seu fragmento GFP.

Nome Sequência (5' —»3') Seq. ID N° cgccacaacattgaagatggttccgttcaactagcagac- Bam-del-f caítatc ggaaacattcteggacacaaact- 87 Xho-del-f tgagtacaactataactcacacaatg atctcgagttacttgtacaattcatccatgccatgt- 88 wtGFP- Xhol-r gtaatccc 89

Transformação, crescimento e detecção de GFP:

Para a transformação de Pichia pastoris todos os plasmídeos foram linearizados por BglII. A transformação foi efectuada como descrito no exemplo 1. Após transformação e uma fase de regeneração de 2 h as células foram plaqueadas em placas de agar YPD-Zeo contendo 100 yg/mL Zeocina. O crescimento de Pichia pastoris, indução por metanol e medição da fluorescência de GFP foram efectuados exactamente como descrito no exemplo 1.

Resultados e discussão:

De novo, os resultados utilizando GFP como 111 ΡΕ1851312 sistema repórter mostram a transferabilidade da actividade do promotor detectada utilizando GFP-Zeo (Tabela 20).

Estirpes Multicópia:

Como descrito no exemplo 1 e 2, a ocorrência de estirpes multicópia utilizando Zeocina como marcador de selecção é muito comum. A frequência de estirpes multicópia pode ser enormemente aumentada através do aumento da concentração de Zeocina nas placas de selecção a 500 e 1000 pg/mL, respectivamente.

Tabela 20: Actividade relativa do promotor de várias variantes do promotor de AOXl com GFP e GFP-Zeo como gene repórter em comparação com o promotor do tipo selvagem sob as mesmas condições (desrepressão e indução, respectivamente) GFP GFP-Zeo

Variante do Promotor Estirpe n° Metanol RFU Estirpe n° Metanol RFU WT EI 100 % D2 100 % AHapl C9 89 % A2 84 % Δ1 4E6 79 % A9 134 % Δ1-3 8-F12 75 % D5 67 % Δ2 G12 37 % F2 40% ARapl D6 27 % B9 34 % Δ3 H3 26 % H2 70 % AAdrl A9 50 % A2 56 % Δ4 C7 66 % H9 71 % Δ5 38E6 28 % D4 31 % AMatlMC 6C2 31 % F6 32 % Δ6 37F5 79 % H3 91 % Δ6* Eli 23 % A5 40 % 112 ΡΕ1851312 (continuação) GFP GFP-Zeo Variante do Promotor Estirpe n° Metanol RFU Estirpe n° Metanol RFU AGcrl A9 60 % A2 55 % Δ7 D12 38 % A7 25 % AQA-1F 7A3 61 % E2 61 % AQA-lFzus 7A6 15 % H7 25 % Δ8 EI 11 % Hl 17 % Δ9 3E5 23 % A12 61 % Δ2Δ6 4B10 22 % F3 21 % Δ736-41 5A7 8.8 % C6 6 % Δ737-38 1G11 5.0 % A3 8 % Estirpes Multicópia Δ1-3 8B10 400 % Δ6 37A3 650 %

Exemplo 5: Séries suficientes utilizando GFP

Para testar pequenas partes do promotor de AOXl num sistema isento de quase todos os sitio de liqação dos factores de transcrição, o promotor de AOXl foi cortado alguns pares de base a seguir à caixa TATA nas posições -176 e -194 que resulta nos elementos basais do promotor de AOX176 e AOX194 (Tabela 21) . Para permitir a clonagem subsequente dos elementos do promotor a seguir aos fragmentos basais do promotor assim como a clonagem do promotor basal foram inseridos os sítios de restrição BspTI e EcoRl na extremidade 5' e 3', respectivamente. 113 ΡΕ1851312

Tabela 21: Sequência dos elementos basais do promotor de AOXl AOX176 e AOX194 e fragmentos do promotor 737 e 201-214 que podem ser adicionados a seguir às variantes basais do promotor. Sítios de restrição BspTI e £coRI estão sublinhados.

Nome Sequência (5'->3 ') Seq. ID N° AOXl76 CTTAAGGACAGCAAÍPftTftTAAACAGaAGGAAGCTGCCCT· GTCTIAÃACCTTTTTTTTTATCATCATTATTAGCT-TA C T TTC&TkhfTGCGA CTGGTTCCAAT-TGACAAGCTTTTGATTTTAACGACTTTTAACGACAACT~ T GAG AAGATC&AAAAACAAC TARTTATTGAAAGAATTC cttaagtgttctaacccctacttgacagcaatata- TAAACAGAAGGAAGCTGCCCTGTCT- TAAACCTTTTTTTTTATCATCATTATTAGCT- 90 AOXl94 TACTTTCATMTTGCGACTGGTTCCAAT- TGACAAGCTTTTGATTTTAACGACTTTTMCGACAACT·* TGAGAAGATCAAAAAACAACTAATTATTGAAAGAATTC 91 737 TAGCCTAACGTT 92 201-214 CATGATCAAAATTT 93

Clonagem:

Os elementos basais de AOXl foram amplificados a partir de pAOX (10 ng) utilizando os iniciadores AOXlbasalrv (Tabela 21, 10 pmol) e AOXbasalfwn (10 pmol, AOX194) e AOX176fw (10 pmol, AOX176), respectivamente. O PCR foi efectuado utilizando Phusion™ polymerase (0,6 U) em condições apropriadas num volume total de 50 pL. A variante do promotor AOX176-737 foi amplificada por PCR utilizando os iniciadores AOXlbasalrv e 737-38AOX176 como descrito acima. A variante do promotor AOX176-201-214 foi amplificada por PCR utilizando os iniciadores AOXlbasalrv e 201-214AOX176 como descrito acima. 114 ΡΕ1851312

Os produtos de PCR resultantes podem ser clonados no vector pPICZ-GFP empregando o corte por restrição com BglII/EcoRI e ligação utilizando T4 DNA Ligase, substituindo, deste modo, o promotor do tipo selvagem de AOXl.

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Os 4 oligonucleótidos Leu2basallf, Leu2basal2f, Leu2basallr e Leu2basal2r (25 pmol cada) foram misturados num volume total de 20 mL, aquecidos a 95°C for 2 minutos e arrefecidos até a temperatura ambiente lentamente. Foram ligados 3 yL da mistura com 159 ng de um fragmento pPICZ-GFP BglII/EcoRI durante 6 h a 16°C. Após transformação em E. coli o vector resultante foi denominado pLeu2basal-GFP. A variante do promotor Leu2-737 foi amplificada por PCR utilizando iniciadores LEU2basalrv e 737-38Leu2 e pLeu2basal-GFP como molde como descrito acima. O produto de PCR resultante pode ser clonado no vector pPICZ-GFP empregando restrição por corte de BglII/EcoRI e ligação utilizando T4 DNA Ligase, substituindo, deste modo, o promotor do tipo selvagem de AOXl. O plasmideo resultante foi denominado pLeu2-GFP-737. 115 ΡΕ1851312

Tabela 22: Iniciador para produção dos elementos basais do promotor e construções suficientes.

Nome Sequência (5'->3') Seq ID N° AOXlbasalrv TTTGAATTCTTTCAATAATTAGTTGTTTTTTG TTAGATCTCGACTTMGGACAGCAATATATAAACAGAAG- 94 AOX176fw GAAG 95 AOXlbasalfwn TTAGATCTCGACTTAAGTGTTCTAACCCCTACTTGACAG AAASATCTTAGCCTAACGTTCITftAGGACAGCAATATA- 96 737-38AOX176 taaacagaaggaag AAAGATCTCATG&TCAAAATXTCTTAAGGACAGCAATA- 97 201-214AOX176 TATAAACAGAAGGAAG GATCTCGACTTAAGCAATCGTCT- 98 LEU2basallf TACTtTCT AAC TTTTC TTACCT Τ Τ T AC AT TTCAG 99 LEU2basal2f CAATATATATATATATTTCAAGGATATACCG 100 AATTCGGTATA7CCTTGAAATATATATATATATTGCT- LEU2basallr GAAATGTAAAAG 101 LEU2basal2r G TAAGAAAAGT TAGAAAGTAAGACGAT T GC T TAAGTCGA 102 LEU2basalrv GGTTGAATTCGGTATATCCTTG 103 AAAGATCTTAGCCTAACGTTCTTAAGCAATCGTCT- 737-38Leu2 TACTTTCTAAC 104

Transformação, crescimento e detecção de GFP:

Para a transformação de Pichia pastoris todos os plasmideos foram linearizados com BamRI. A transformação foi efectuada como descrito no exemplo 1. Após transformação e uma fase de regeneração de 2 h, as células foram plaqueadas em placas de agar YPD-Zeo contendo 100 yg/mL de Zeocina. O crescimento de Pichia pastoris, indução por metanol e medição da fluorescência de GFP foram efectuados exactamente como descrito no exemplo 1. ΡΕ1851312 116

Resultados e discussão:

Esta experiência mostra que a adição de pequenos elementos identificados nos exemplos 1 e 2 podem ser utilizados para aumentar a força no promotor dos elementos basais do promotor derivados do promotor A0X1 ou a partir do promotor de LEU2 de Saccharomyces cerevisiae.

Estirpes Multicópia: A ocorrência e frequência das estirpes multicópia encontradas após transformação é exactamente a mesma como descrito no Exemplo 4. 0 diferente sitio de linearização no plasmideo não teve qualquer influência na produção de estirpes multicópia.

Tabela 23: Actividade no promotor dos elementos basais do promotor sem e após adição de pequenos fragmentos do promotor de AOXl que supostamente actuam como reguladores dos sitios de ligação. A GFP tem sido utilizada como proteína repórter. São apresentadas as estirpes unicópia assim como as estirpes multicópia.

Unicópia Multicópia Desrepr. RFU Metanol RFU Desrepr. RFU Metanol RFU pAOX176-GFP n.d. 22,1 ±0,2 - - PAOX194-GFP n.d. 16,9 ±2,9 - - pAOX176-GFP- n.d. 21,2 ±1,1 59 ±6 265 ±38 737 PAOX176-GFP- 69,6 ± 44,9 ±4,8 - - 201-214 6,0 pLeu2basal-GFP n,d, 11,3 ±3,6 - - pLeu2-GFP-737 n,d, 19,2 ±1,9 55 ±5 138 ±11 117 ΡΕ1851312

Referências: [I] Nakagawa, T., et al. (1999) Yeast 15(12), 1223-30. [2]

Koutz, P., et al. (1989) Yeast 5(3), 167-77.

[3] Ohi, H., et al. (1994) Mol. Gen. Genet. 243(5), 489-99.

[4] Cregg, J. M., et al.(1989) Mol. Cell. Biol. 9(3), 1316-23.

[5] Nakagawa, T., et al. (2002) Yeast 19(12), 1067-73.

[6] Sakai, Y., et al. (1998) J. Bacteriol. 180(22), 5885- 5890.

[7] Genu, V., et al. (2003) Eur. J. Biochem. 270(11), 2467- 2475.

[8] Goedecke, S., et al. (1994) Gene 139(1), 35-42.

[9] Tschopp, J. F., et al. (1987) Nucleic Acids Res. 15(9), 3859-76.

[10] Parpinello, G., et al. (1998) J. Bacteriol. 180(11), 2958-67.

[II] Alamae, T. et al. (1994) Yeast 10(11), 1459-66.

[12] Inan, M. et al. (2001) J. Biosci. Bioeng. 92(6), 585-589.

[13] Sreekrishna, K., et al. (1997) Gene 190(1), 55-62.

[14] Romanos, M., et al. (1998) Methods Mol. Biol. 103(55-72.

[15] Quandt, K., et al. (1995) Nucleic Acids Res. 23(23), 4878-84.

[16] Ausubel, F. M., et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley e Sons, New York, 2003.

[17] Corpet, F. (1988) Nucleic Acids Res. 16(22), 10881-90. 118 ΡΕ1851312 [18] Chenna, R., et al. (2003) Nucleic Acíds Res. 31(13), 3497-500.

[19] Bennett, R. P., et al. (1998) BioTechniques 24(3), 478-82.

[20] Farinas, E. T., et al. (2001) Adv. Synth. Catai. 343(6), 601-606.

[21] Huie, Μ. A. et al. (1996) Yeast 12(4), 307-17.

[22] Lopez, M. C., et al. (1998) pnas U. S. A. 95(24), 14112-7.

[23] Zeng, X., et al. (1997) Genetics 147(2), 493-505.

[24] Del Vescovo, V., et al. (2004) J. Mol. Biol. 338(5), 877-93.

[25] Simon, M., et al. (1992) Yeast 8(4), 303-9.

[26] Raschke, W. C., et al. (1996) Gene 177(1-2), 163-7.

[27] Andrianopoulos, A. et al. (1994) Mol. Cell. Biol. 14(4), 2503-15.

[28] Kwast, K. E., et al. (1998) J. Exp. Biol. 201 (Pt 8)(1177-95.

[29] Bourgarel, D., et al. (1999) Mol. Microbiol. 31(4), 1205-15.

[30] Dang, V. D., et al. (1996) J. Bacteriol. 178(7), 1842-9.

[31] Hahn, J. S. et al. (2004) J. Biol. Chem. 279(7), 5169- 76.

[32] WO 02/081650 [33] US 6 699 691 [34] Wang, W. et al. (1999) Biotechniques 26(4), 680-2.

[35] Morawski, B., et al. (2000) Protein Eng 13(5), 377-84.

[36] Weis, R., et al. (2004) FEMS Yeast Res. 5 , 179-189. 119 ΡΕ1851312

Listagem de sequências:

Seq ID N° 1: promotor de AOX1 de Pichia pastoris ggtaccâgátctããçatccaaagscgaaaggttgaatgaaacctttttgccátccgscatc- cacãggfcccãttctcãcacataagtgccaaacgcããcaggaggggatacactagcagcagac" cgttgcaeacgc&ggacctccactcctcttctcctcâacacccacttttgccatcgaaaaac* cageccagttattgggcttgattggagetcgct.esttccaattcctt.ctattaggctactae- cacçatgactttattagcctgtctatcctggcccccctggcgaggttcatgtttgtttatttc- cgaatgcsscsagctccgcattac&cceçaa€&tcact:<:ca<gat<ia$$gctttct~- gagtg£ggggtcaa⣣gttt.catgttccccaaatggcccaaaactgacagtttaaa“ cgctgtGt£ggaacctaatatgãcaaaagcçCgatctcat.Cicaagatgaactaagtttggt.t“ cgtfcgaaâtgctaacggcçagt£ggtcaaaaagaaacttccaaaagfccggcatac- çgtttgtettgtttggtãttgsttgacgaatgctcasasataatçtcãttaatgettagcg-

Gagtctctctatcgcttctgaaccccggtgcacctgtgccgaaacgcaaatggggaaacacc- cgctttttggatgattatgcattgtetccacattgtatgcttccaagattctggtgggaa·' taccgctgacagccteacgttcatgatcaaaatttaactgttctaacccctaettgacagcaa- tatataaacagaaggaagctgccGtgtcttaaaccttttttt.t.tatcatcatc.âttagct“ tactfctcataattQGgactggttccaattgaoaagctfct:tgattttaacgactt£taaçga“

caacttgagaagatcaaaâaacaáCrtáattatfcgaaagããttcaáCG

Lisboa, 30 de Dezembro de 2010

Claims (8)

ΡΕ1851312 1 REIVINDICAÇÕES 1. Promotor da álcool oxidase 1 (A0X1) de Pichia pastoris mutante do promotor de A0X1 de Pichia pastoris do tipo selvagem (Seq ID N° 1) compreendendo pelo menos uma mutação nos nucleótidos 170 a 235 (-784 a -719) de Seq ID N° 1 para expressão elevada sob condições induzidas por metanol.

1 2 3 4 5 C

'iq 1 •ii. ΡΕ1851312 2/8 ί ·3 β .1 i

ΡΕ1851312 3/8 3 te

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ΡΕ1851312 6/8

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2. Promotor de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o promotor compreender uma outra mutação dos nucleótidos 694 a 723 (-260 a -231) e/ou nucleótidos 729 a 763 (-225 a -191) de Seq ID N° 1 e/ou de um sitio de ligação de factor de transcrição (TFBS) e/ou de pelo menos uma mutação seleccionada a partir do grupo consistindo nos nucleótidos 170 a 191 (- 784 a -763), nucleótidos 192 a 213 (-762 a -741), nucleótidos 192 a 210 (-762 a -744) , nucleótidos 207 a 209 (-747 a -745), nucleótidos 214 a 235 (-740 a -719), nucleótidos 304 a 350 (-650 a -604), nucleótidos 364 a 393 (-590 a -561), nucleótidos 434 a 508 (-520 a -446), nucleótidos 509 a 551 (-445 a -403), nucleótidos 552 a 560 (-402 a -394), nucleótidos 585 a 617 (-369 a -337), nucleótidos 621 a 660 (-333 a -294), nucleótidos 625 a 683 (-329 a -271), nucleótidos 736 a 741 (-218 a -213), nucleótidos 737 a 738 (-217 a -216), nucleótidos 726 a 755 (-228 a -199), nucleótidos 784 a 800 (-170 a -154) ou nucleótidos 823 a 861 (-131 a -93). 2 ΡΕ1851312

3. Promotor de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado por a mutação ser uma deleção, uma substituição, uma inserção, ou uma inversão.

4. Promotor de acordo com a reivindicação 2 ou 3, caracterizado por o sitio de ligação do factor de transcrição (TFBS) ser seleccionado a partir do grupo consistindo em Hapl, Hsf, Hap234, abaA, Stre, Rapl, Adrl, MatlMC, Gcrl e QA-1F, em que o sitio de ligação do factor de transcrição (TFBS) Hapl compreende preferencialmente os nucleótidos 54 a 58 de Seq ID N° 1, Hsf nucleótidos 142 a 149 e 517 a 524 de Seq ID N° 1, Hap234 nucleótidos 196 a 200, 206 a 210 e 668 a 672 de Seq ID N° 1, abaA nucleótidos 219 a 224 de Seq ID N° 1, Stre nucleótidos 281 a 285 de Seq ID N° 1, Rapl nucleótidos 335 a 339 de Seq ID N° 1, Adrl nucleótidos 371 a 377 de Seq ID N° 1, MatlMC nucleótidos 683 a 687 de Seq ID N° 1, Gcrl nucleótidos 702 a 706 de Seq ID N° 1 e QA-1F nucleótidos 747 a 761 de Seq ID N° 1.

5. Molécula de ácido nucleico compreendendo pelo menos um promotor de álcool oxidase 1 (AOX1) de Pichia pastoris mutante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4 e pelo menos um ácido nucleico que codifica uma proteína (péptido) ou um ácido nucleico funcional, caracterizado por o referido promotor e referido ácido nucleico estar operacionalmente ligado em conjunto formando uma cassete de expressão única ou em multicópia.

6. Vector compreendendo um promotor de álcool 3 ΡΕ1851312 oxidase 1 (A0X1) de Pichia pastoris mutante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4 ou uma molécula de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 5.

7 Fia PE1851312 8/8 rfu {mzfminm}

7. Célula compreendendo pelo menos um promotor de álcool oxidase 1 (A0X1) de Pichia pastoris mutante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, pelo menos um fragmento de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 5 ou pelo menos um vector de acordo com a reivindicação 6.

8. Célula de acordo com a reivindicação 7, caracterizada por a referida célula ser uma célula eucariótica, em particular uma célula de levedura, preferencialmente uma célula de levedura metilotrófica, preferencialmente seleccionada a partir do grupo consistindo em Candida, Hansenula, Pichia e Toruplosis, em particular uma célula de Pichia pastoris.

9. Estojo ("Kit") para a expressão de uma proteína seleccionada compreendendo i) um vector de acordo com a reivindicação 6, e ii) uma célula capaz de expressar a proteína referida sob o controlo de um promotor de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4.

10. Estojo ("kit") de acordo com a reivindicação 9, caracterizada por a referida célula ser uma célula de 4 ΡΕ1851312 levedura, preferencialmente uma célula de levedura metilotrófica, preferencialmente seleccionada a partir do grupo consistindo em Candida, Hansenula, Pichia e Toru-plosis, em particular uma célula de Pichia pastoris.

11. Método para a expressão de uma proteína recombinante, péptido ou ácido nucleico funcional numa célula compreendendo os passos seguintes: proporcionar uma molécula de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 5 ou um vector de acordo com a reivindicação 6 compreendendo um promotor de A0X1 de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4 e um ácido nucleico que codifica para uma proteína, péptido ou ácido nucleico funcional, estando o referido promotor operacionalmente ligado ao referido ácido nucleico, - transformar a referida célula com o referido vector ou referida molécula de ácido nucleico, - cultivar a célula transformada num meio de cultura adequado, - indução opcional da expressão da referida proteína, péptido ou ácido nucleico funcional e - isolamento da referida proteína expressa, péptido ou ácido nucleico funcional. 5 ΡΕ1851312

12. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizada por a referida célula ser uma célula de levedura, preferencialmente uma célula de levedura metilotrófica, preferencialmente seleccionada a partir do grupo consistindo em Candida, Hansenula, Pichia e Toruplosis, em particular uma célula de Pichia pastoris.

13. Utilização de uma molécula de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 5, um vector de acordo com a reivindicação 6 ou uma célula de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 ou 8 para a expressão de uma proteína, péptido ou ácido nucleico funcional.

14. Método para o isolamento de clones de super expressão compreendendo os passos: a) introduzir uma molécula de ácido nucleico compreendendo pelo menos um promotor de álcool oxidase 1 (A0X1) de Pichia pastoris mutante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4 e pelo menos um ácido nucleico que codifica uma proteína (péptido) ou um ácido nucleico funcional e um gene marcador de resistência, em que o referido promotor e o referido ácido nucleico são operacionalmente ligados em conjunto formando uma cassete de expressão uni- ou multi-cópia ou um vector compreendendo a referida molécula de ácido nucleico numa célula, 6 ΡΕ1851312 b) transferir a célula do passo a) para um meio compreendendo um marcador selectivo apropriado, uma fonte de carbono não repressora e metanol para o crescimento selectivo de clones de super expressão sob condições de indução, c) incubar uma célula do passo b) no referido meio, d) isolar uma colónia da célula obtida do passo c) e e) detectar os clones de super expressão por determinar a taxa de expressão da referida célula.

15. Método de acordo com a reivindicação 14, caracterizada por o marcador selectivo ser um antibiótico, preferencialmente Zeocina ou geneticina.

16. Método de acordo com a reivindicação 14 ou 15, caracterizada por o marcador selectivo ser Zeocina e o gene marcador de resistência é o gene sh ble.

17. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 16, caracterizadas por a célula ser uma célula de levedura, preferencialmente uma célula de levedura metilotrófica, preferencialmente seleccionada a partir do grupo consistindo em Candida, Hansenula, Pichia e Toruplosis, em particular uma célula de Pichia pastoris.

18. Método de acordo com qualquer uma das 7 ΡΕ1851312 reivindicações 11 a 17, caracterizado por a fonte de carbono não repressora ser seleccionada a partir do grupo consistindo em alanina, manitol, sorbitol, trealose, lactose e suas combinações.

19. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 18, caracterizado por a molécula de ácido nucleico ou vector ser introduzido na célula por transformação, preferencialmente electroporação ou transformação química, ou por fusão de protoplasto, ou por bombardeamento de partículas. Lisboa, 30 de Dezembro de 2010 ΡΕ1851312 1/8 kDâ 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 A s - B-

8 1 ΡΕ1851312 REFERÊNCIAS CITADAS NA DESCRIÇÃO Esta lista de referências citadas pelo requerente é apenas para conveniência do leitor. A mesma não faz parte do documento da patente Europeia. Ainda que tenha sido tomado o devido cuidado ao compilar as referências, podem não estar excluídos erros ou omissões e o IEP declina quaisquer responsabilidades a esse respeito. Documentos de patentes citadas na Descrição • VVO i32S81§50 A * US 6S8SSSÍ B Literatura que não é de patentes citada na Descrição * Sesrer,.CA m. 5S1--64 * Eessetía PH st λ Μ Μ i», v«, * J, Sambso#; á fôísssíi, MoSsctóss OarSisg: A LsSofssssv Msísiís!. Cosi Sp?inq Kaster Lsbetsfexy·· P?ess. 2901 * Pysrs, ÍL 81. et aí, Ge?®. 1956. vot 45, 239-310 «f A 19SS, sei. 177. í£3 7 * Pmmk "®<ik Ϊ CE Hotiesfeefg, £í.ir J Smhm, «·· Gtunu MM «í: EffiSJg., 1997, -»ο£, S8<. 273-266 :37,18-26. *: Nettwfg S, si ai. Svmhmi Ste®. 2081,-- «ei; 74, 544-362 Hetiwig S. et isL 8l'VJ>!f3si Ac;.'.' 3,¾^¾ ...... *: CiiEíit PK&ÍÍS& fe píiílogj'. ,¾½ Wíísy 8 Soas Eifts, S.& «í A àMi-.m* Stei, 1S$S., M 5, 1117-1421 *: ©esff Ltti; Séfffighítw, Sh»#í8 Ttpfcs. te íSsíw s*- ífíBSS£í.nf.S3' Pf&tSKSTJlíCS. 13 CSÍDiMÍ 2063 * Hsfcsgaws, T, et si Vessí, tS&S.: vA 15 {12), 122:3¾ " * SÍ&ate.P.et^, Vgsjf '?69,vçí. Sí3), 7S7-77 4: M *» ftfcf Ge#., 1604,:^,.243:(5^ 463-59 * Cragg. 1 M. et AM& CM .Stete tm «$. 913¾. 316-23 * Ha&sgaws, T. eí a!, Ysa®, :200¾¾ 16 (12:1, 7.067¾ * S-sk&i Y, et aí, X S^Mribi. m.·: ISO {22¾ 5605-5899 ·*. ©esa^etaí. Em 1 assÁKB.^S, ssOTS {1:1:¾ ; .2467-2475:. « Gaedecte,.», at:sí. 73§4,γοΙ i Isstsa^piJ:. Fijet 33iJ&sí®fc.4s5íiiífi&s,, 1937, «®L -15(27,:3659-75:-2SSS-67 * ^msa.m.eUL YfeasÇ 1994, vol. 10(11). :459-65 * ínan, M. eí aí. J, Bteseí. SOmkí,, 2>30í. voi. 32 (3). 533-569 * SreeteSsísfi* SL; et ai ÚWs, Wt vei 192 W, 55-62 - ffeman&s, M, « ^ « « ^ 103, 55 72 < Qiiafidt, K. et aí, MíSfes Sss., 1995, vui,£3 >23), 4S7&-34 SfcSsg?. Mhí WíSs? sfiá Saf5a;,:23S3 * Conasí, 6. Nudêic Ãcm Rss,. 1966 veí. 16 ;22>, 13861-90 *.. e&êftRa, R, st A' OíiiSíste AsSs Í7es. f 200-3, vcsí, M 235,2497-500 * ieítnea, R, P. et &mtèmk}m,«, ν·δί. 24 {3),47:662 * Fsdfias. E- T. et aí, A<i~·. Syp& Caís; 2507, «y 343 «3). €-01-506 ·:. Ηώκ Μ, A, ei aí, Ysasi, 1986( 12 f4{, 3S7-77 ; Lspes., M.C,et A m4S UÊ A,-19¾¾ voi. 95 >21), :Í4l:12-7-' ' ' ‘ Zw^4 X. ètat, Sbs&ics 1397, 147:(2),433-505- :. OS! ¥easow, V- ei st, J. MOtBM, 2034:, Μ M (5), 377^3 * Ssrfiaft Sí «tal '>»wí w: *(e S 4' 30ϊ-9 « Rasem W. C. et ai S«M, 19S6,'M 177 {t-2), 163-7 * Andeí3»^«ulaS', Av-ataL^-Ósi. 1#%^:·'· 14 í4 26-26-'S * Xwasí, -K, E «t ai, 4 SE: IfeE 1 pS®· Έ- :291 <. i 577-9S * Bouf8«f«j" S, sá-A Ml msmlMv 189¾ vai, $1 {4j, 1205-15 * Qane, V, D, et si i: ’%ίφ*ώϊν Ί S6.: (csi :17S- (7), 1342-9 * .Rahn, J S «t aí, 0. ::2084, 273)7:, 5563-7« 2 ΡΕ1851312 * Wafig. W. et aí, iWvdt £§ {*% · Wãa. R, st aí, F£MS: Vteasí *&*,' 2CQ4, S, 6¾½ íía-faa: * Mo^waàí, B, atai, Prateiaôkt, 2SÍÍS,1® (Sj,. 377-.S4