CN110029122B - 一种甘露聚糖酶高产菌株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种甘露聚糖酶高产菌株及其应用。所述突变菌株的保藏编号为CCTCC NO:M2019123。所述突变菌株摇瓶发酵上清液中甘露聚糖酶酶活高达43560U/ml，比出发菌提高了91.4%，取得了意料不到的技术效果。所述突变菌株可广泛应用于甘露聚糖酶的生产，有利于显著降低该酶的生产成本，进而促进该酶在饲料等领域中的广泛应用。

Description

一种甘露聚糖酶高产菌株及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种甘露聚糖酶生产菌株及其应用。

背景技术

植物细胞壁主要由半纤维素、纤维素及木质素等物质构成。甘露聚糖是植物半纤维素的重要组分，是由β-1，4-D-甘露糖连接而成的线状多聚体，在多糖的侧链上主要有乙酰基和半乳糖基等取代基团。甘露聚糖具有高度的亲水性，因而在单胃动物的消化道内大量吸水，使消化道内容物的粘度增加，从而对胃肠的蠕动产生抵抗作用，直接影响了动物对营养物质的消化和吸收。近年来，随着豆类产品(如豆粕等)在饲料中的广泛应用，甘露聚糖的抗营养问题也越来越受到重视，在饲料中添加酶制剂是解决这一问题的主要途径。甘露聚糖的完全酶解需要β-甘露聚糖酶、β-甘露糖苷酶、β-葡糖苷酶、α-半乳糖苷酶和脱乙酰酶的协同作用，其中β-甘露聚糖酶在饲料中的应用比较广泛。

β-甘露聚糖酶，又称为β-D-甘露聚糖酶或β-1,4-D-甘露聚糖酶，是一类能够水解含有β-1,4-D-甘露糖苷键的甘露寡糖、甘露多糖(包括甘露聚糖、半乳甘露聚糖、葡甘露聚糖等)的内切水解酶。它属于半纤维素酶类，具有纤维素酶活性的广谱诱导型多功能酶，广泛存在于动植物和微生物中。

β-甘露聚糖酶广泛存在于自然界中，在动物、植物、微生物中都有发现。从微生物中提取的β-甘露聚糖酶活性高、成本低、提取方便，比从动植物中提取的β-甘露聚糖酶有更广的作用pH、温度范围，底物专一性更好，已在工业生产和理论研究中得到了广泛的应用。。分解甘露聚糖的酶的最初报道是在20世纪初，直到50年代，陆续发现报道了许多产甘露聚糖酶的生物，已报道的有芽孢杆菌、气单孢菌、黄单孢菌、梭孢菌、青霉、木霉和链霉等。不同微生物所产的甘露聚糖酶在分子量、最适催化温度、最适pH、底物特异性等方面都存在很大差异。真菌产甘露聚糖酶作用偏酸性，而细菌和放线菌产甘露聚糖酶作用的pH近中性或偏碱性，但稳定性较好。β-甘露聚糖酶早期的研究工作主要是产酶微生物菌株的选育，发酵条件优化、酶的纯化和理化性质、酶水解作用机理等方面。随着基因和蛋白质工程技术的广泛应用，β-甘露聚糖酶的研究开始转向基因的克隆表达和活性位点等方面的研究，以满足满足饲料工业发展的需求。

本发明即提供一株可高效表达β-甘露聚糖酶的菌株，实现大幅度提高甘露聚糖酶产量、降低生产成本的目的。

发明内容

本发明为解决现有技术问题，提供了一种毕赤酵母突变菌株。申请人首先使用新的启动子ATX构建得到重组表达甘露聚糖酶的毕赤酵母工程菌，然后进一步通过紫外诱变获得一株能大幅度提高甘露聚糖酶的表达量的突变菌，有利于降低甘露聚糖酶的生产成本，应用前景广阔。

本发明一方面提供了一种重组质粒，所述重组质粒携带有启动子ATX和甘露聚糖酶基因。

所述启动子ATX的核苷酸序列为SEQ ID NO:1。

所述甘露聚糖酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:2，其编码核苷酸序列为SEQ ID NO:3。

本发明一方面提供了一种毕赤酵母工程菌株，所述菌株携带有上述重组质粒。

本发明还提供了一种突变菌株毕赤酵母ATX-001（Pichia pastoris ATX-001），是以上述的毕赤酵母工程菌为出发菌株通过紫外诱变获得的。

所述突变菌株已于2019年3月6日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2019123。

本发明还提供了所述毕赤酵母突变菌株在生产甘露聚糖酶中的应用。

申请人首先利用新型的启动子ATX构建得到重组表达甘露聚糖酶的毕赤酵母工程菌ATX-ME-2，其摇瓶发酵上清液中甘露聚糖酶酶活达到22754U/ml，比使用启动子AOX1的对照组菌株提高了220%，取得了意料不到的技术效果。

为了提高甘露聚糖酶的产量，申请人以毕赤酵母ATX-ME-2为出发菌株，进一步通过紫外诱变的方法筛选获得一株突变菌株ATX-2。所述突变菌株摇瓶发酵上清液中甘露聚糖酶酶活高达43560U/ml，比出发菌提高了91.4%，取得了意料不到的技术效果。所述突变菌株可广泛应用于甘露聚糖酶的生产，有利于显著降低该酶的生产成本，进而促进该酶在饲料等领域中的广泛应用。

具体实施方式

下面结合实例对本发明的方法做进一步说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常可按常规条件，如J.萨姆布鲁克（Sambrook）等编写的《分子克隆实验指南》中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件运行。本领域相关的技术人员可以借助实施例更好地理解和掌握本发明。但是，实现本发明的方法不应限于本发明实施例所记载的具体方法步骤。

菌株与载体：大肠杆菌DH5α、毕赤酵母GS115、载体pPIC9k、pPICZA、Amp、G418、Zeocin购自Invitrogen公司。

酶与试剂盒：DNA聚合酶购买自Takara公司，T4连接酶、限制性内切酶购自Fermentas公司，质粒提取试剂盒及胶纯化回收试剂盒购自Omega公司，GeneMorph II随机诱变试剂盒购自北京博迈斯生物科技有限公司。

培养基配方：

大肠杆菌培养基（LB培养基）：0.5%酵母提取物，1%蛋白胨，1%NaCl，pH7.0；

LB+Amp培养基：LB培养基加100μg/mL氨苄青霉素；

酵母培养基（YPD培养基）：1%酵母提取物，2%蛋白胨，2%葡萄糖；

YPD+Zeocin培养基：YPD培养基加100μg/ml Zeocin；

酵母筛选培养基（MD培养基）：1.34% YNB，4×10^-5生物素，1%甘油、2%琼脂糖；

BMGY培养基：2%蛋白胨，1%酵母提取物，100 mM磷酸钾缓冲液(pH6.0)，1.34% YNB，4×10^-5生物素，1%甘油；

BMMY培养基：2%蛋白胨，1%酵母提取物，100 mM磷酸钾缓冲液(pH6.0)，1.34% YNB，4×10^-5生物素，0.5%甲醇。

实施例1、新启动子ATX的设计、克隆与表达质粒的构建

1、新启动子ATX的设计与克隆

申请人以毕赤酵母的醇氧化酶启动子AOX1的基因序列为基础，去除基因序列中的TATA box序列，改造后的新启动子序列为SEQ ID NO:1，命名为ATX。新启动子ATX由华大基因公司全基因合成。

用PCR反应克隆新启动子ATX，引物和反应条件如下：

引物1(F)：ATCAGATCTAACATCCAAAGACGAAAGGTTGAA

引物1(R)：CGTTTGGATCCTTCGAATAATTAGTTGTTTTTTG

PCR条件为：94℃变性5min；然后94℃变性30s，56℃复性30s，72℃延伸1min，35个循环后，72℃保温10min。新启动子ATX基因全长941bp。

、新表达载体pATX9K构建

将克隆得到的新启动子ATX基因用限制性内切酶BglⅡ和BamHⅠ进行双酶切，50 μl酶切体系如下：新启动子ATX基因的 PCR产物43 μl、10×FastDigest Buffer 5 μl、BglⅡ1μl和BamHⅠ1 μl。37℃酶切2h后，琼脂糖凝胶电泳回收。

表达载体pPIC9K的50 μl酶切体系如下：表达载体pPIC9K 43μl、10×FastDigestBuffer 5 μl、BglⅡ1μl和BamHⅠ1 μl。37℃酶切2h后，琼脂糖凝胶电泳回收。

将经BglⅡ和BamHⅠ双酶切的新启动子ATX基因片段与表达载体pPIC9K连接，构建得到新的表达质粒pATX9K。连接体系如下：表达载体pPIC9K双酶切产物5 μl、新启动子ATX基因双酶切产物3 μl、10×T₄ ligase buffer 1 μl、T₄ ligase 1 μl。22 ℃连接过夜，转化到大肠杆菌DH5α，挑取转化子测序验证。测序验证正确的转化子转接到LB+Amp液体培养基中，37℃过夜培养，提质粒，即为新的表达质粒pATX9K。

实施例2、甘露聚糖酶基因ME的克隆和密码子优化

申请人以甘露聚糖酶基因ME（GenBank号为EU919724.1）的氨基酸序列SEQ ID NO:2为基础，根据毕赤酵母的密码子偏好性，对其进行密码子优化。优化后的新基因序列为SEQID NO:3，命名为ME-2，由华大基因公司合成该序列。

采用PCR反应克隆中性甘露聚糖酶基因ME-2片段，引物和反应条件如下：

引物2(F)：GCGCGAATTCTTGCCAAACTCTTTGCAAGGTTTGC；

引物2(R)：TAAAGCGGCCGCTTACATACCCCAGAATCTCTTTTTT；

PCR条件为：94℃变性5min；然后94℃变性30s，56℃复性30s，72℃延伸1min40s，35个循环后，72℃保温10min。ME-2基因长度与ME基因相同，全长1515bp。

实施例3、毕赤酵母工程菌的构建

1、重组质粒的构建

将克隆得到的甘露聚糖酶基因ME-2用限制性内切酶EcoR I和Not I进行双酶切，100 μl酶切体系如下：甘露聚糖酶基因ME-2的 PCR产物40 μl、10×H buffer 10 μl、10×BSA 10 μl、EcoR I 5 μl、Not I 5 μl、ddH₂O 30 μl。37℃酶切4 h后，琼脂糖凝胶电泳回收。

将实施例1构建得到的表达载体pATX9K先用限制性内切酶EcoR I进行单酶切，100μl酶切体系如下：表达载体pATX9K 20 μl、10×H buffer 10 μl、EcoR I 5 μl、ddH₂O 65 μl。37℃酶切4 h后，琼脂糖凝胶电泳回收。将回收片段再用限制性内切酶Not I进行单酶切，100 μl酶切体系如下：pATX9K回收片段 20 μl、10×H buffer 10 μl、10×BSA 10 μl、10×Triton 10 μl、Not I 5 μl、ddH₂O 45 μl。37℃酶切4 h后，琼脂糖凝胶电泳回收。

将经EcoR I和Not I双酶切的ME-2片段与表达载体pATX9K连接，构建表达载体pATX9K-ME-2。连接体系如下：表达载体pATX9K双酶切产物5 μl、ME-2基因双酶切产物3 μl、10×T₄ ligase buffer 1 μl、T₄ ligase 1 μl。22 ℃连接过夜，转化到大肠杆菌DH5α，挑取转化子测序验证。测序验证正确的转化子转接到LB+Amp液体培养基中，37℃过夜培养，提质粒，即为重组酵母表达质粒pATX9K-ME-2。

、转化与筛选

将重组酵母表达质粒pATX9K-ME-2用Sal I进行线性化，线性化产物用柱纯化试剂盒纯化后，通过电穿孔法转化毕赤酵母GS115，涂布MD平板。在MD平板上生长出的菌落即为毕赤酵母工程菌株，然后涂布含不同浓度遗传霉素G418的YPD平板上筛选多拷贝的转化子。

、摇瓶发酵验证

挑取单个多拷贝转化子分别接入BMGY培养基中，30℃、220rpm振荡培养24小时后，再转入BMMY培养基中，30℃、220rpm振荡培养，每24小时添加0.5%的甲醇。诱导表达4d后，离心去除菌体，将上清液进行甘露聚糖酶活力测定。

结果显示，使用新启动子ATX构建得到的转化子摇瓶发酵培养液中甘露聚糖酶酶活最高达到22754U/ml，将该转化子命名为毕赤酵母ATX-ME-2（Pichia pastoris ATX-ME-2）。

作为对照组，申请人参照实施例1-3同样的操作，将启动子AOX1基因片段与表达载体pPIC9K连接，构建得到表达质粒pAOX9K；然后将甘露聚糖酶ME-2基因与表达质粒pAOX9K进行连接，构建得到重组酵母表达质粒pAOX9K-ME-2，然后经转化获得导入质粒pAOX9K-ME-2的转化子，摇瓶发酵酶活最高达到7110U/ml，将该转化子命名为毕赤酵母AOX-ME-2（Pichia pastoris AOX-ME-2）。

上述结果表明，本发明提供的新启动子ATX能显著提高毕赤酵母对甘露聚糖酶ME-2的表达量，与使用启动子AOX1的对照组相比，甘露聚糖酶ME-2的表达量提高了220%，取得了意料不到的技术效果。

（1）甘露聚糖酶酶活单位的定义

在37℃、pH5.5的条件下，每分钟水解底物产生1μmol甘露糖所需酶液的量为一个甘露聚糖活性单位。

（2）甘露聚糖酶酶活测定方法

以0.6%槐豆胶甘露聚糖（Sigma公司，Batch#125K0091）为底物，以0.1M 醋酸-醋酸钠（pH5.5）为缓冲液，将甘露聚糖底物37℃平衡20min，将待测酶液37℃平衡10min。取4支试管，分别加入酶液2ml，其中3支作为测定管，分别加入2ml 底物溶液，另一支作为空白管，加入5ml DNS溶液，在37℃±0.5℃水浴30分钟。然后三支测定管分别加入5ml DNS溶液，空白管加入2ml 底物溶液，在沸水浴中反应5分钟，冷却后定容至25ml。以空白管调零，在分光光度计540nn 处测吸光度。

实施例4、紫外诱变与筛选

紫外诱变导致的突变随机性很强，突变产生的效果也是随机的，难以预测。因此，为了获得有效的正突变，技术人员通常需要进行多轮紫外诱变，筛选的工作量较大，而且存在无法获得有效正突变的可能性。但因为紫外诱变所需设备简单、费用少，并且可在短时间内获得大量突变体，因此，它现在仍是一种常用的诱变选育方法。

申请人以毕赤酵母ATX-ME-2为出发菌株，通过紫外诱变方法对其进行遗传学改造，进一步提高其甘露聚糖酶的产量。

将毕赤酵母ATX-ME-2接种于YPD平板，30℃培养2-3d，使用无菌水洗菌体，制成悬浮液，稀释至1×10⁶个/mL，紫外灯（40W）照射2-10min，距离约22cm，致死率达到90%以上，涂布平板。30℃培养48h。

第一轮紫外诱变共获得了约355个突变菌单菌落，将各个单菌落分别接种于装有200ul BMGY液体培养基的96孔板，30℃ 250rpm振荡培养1 d后，离心去掉上层培养基，再加入200ul BMM培养基，30℃、250rpm振荡培养2 d，每天添加0.5%的甲醇。诱导表达2 d后，离心去除菌体，得到含甘露聚糖酶的上清液，测定甘露聚糖酶的活力，以出发菌ATX-ME-2为对照，筛选出发酵酶活力得到显著提高的突变菌株。

结果显示，第一轮紫外诱变筛选获得的突变菌中，没有一株突变菌发酵上清液中甘露聚糖酶的酶活高于出发菌。申请人又按照上述方法继续进行了19轮诱变筛选，最终获得2株甘露聚糖酶产量显著高于出发菌的突变菌株，分别命名毕赤酵母ATX-001，ATX-002。

将上述筛选获得的2株突变菌ATX-001，ATX-002分别转接于BMGY培养基中，30℃，250rpm振荡培养1 d后，再转入BMM培养基中，30℃，250rpm振荡培养，每天添加0.5%的甲醇；诱导表达4 d后，离心去除菌体，得到发酵上清液；将发酵上清液进行甘露聚糖酶酶活检测。结果显示，上述突变菌株中毕赤酵母ATX-001发酵上清液酶活最高，达到43560U/ml，比出发菌毕赤酵母ATX-ME-2提高了91.4%，取得了意料不到的技术效果。

申请人已于2019年3月6日将突变菌株毕赤酵母ATX-001（Pichia pastoris ATX-001）保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2019123。

序列表

<110> 青岛蔚蓝生物集团有限公司

<120> 一种甘露聚糖酶高产菌株及其应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 941

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

agatctaaca tccaaagacg aaaggttgaa tgaaaccttt ttgccatccg acatccacag 60

gtccattctc acacataagt gccaaacgca acaggagggg atacactagc agcagaccgt 120

tgcaaacgca ggacctccac tcctcttctc ctcaacaccc acttttgcca tcgaaaaacc 180

agcccagtta ttgggcttga ttggagctcg ctcattccaa ttccttctat taggctacta 240

acaccatgac tttattagcc tgtctatcct ggcccccctg gcgaggttca tgtttgttta 300

tttccgaatg caacaagctc cgcattacac ccgaacatca ctccagatga gggctttctg 360

agtgtggggt caaatagttt catgttcccc aaatggccca aaactgacag tttaaacgct 420

gtcttggaac ctaatatgac aaaagcgtga tctcatccaa gatgaactaa gtttggttcg 480

ttgaaatgct aacggccagt tggtcaaaaa gaaacttcca aaagtcgcca taccgtttgt 540

cttgtttggt attgattgac gaatgctcaa aaataatctc attaatgctt agcgcagtct 600

ctctatcgct tctgaacccc ggtgcacctg tgccgaaacg caaatgggga aacacccgct 660

ttttggatga ttatgcattg tctccacatt gtatgcttcc aagattctgg tgggaatact 720

gctgatagcc taacgttcat gatcaaaatt taactgttct aacccctact tgacagcaaa 780

cagaaggaag ctgccctgtc ttaaaccttt ttttttatca tcattattag cttactttca 840

taattgcgac tggttccaat tgacaagctt ttgattttaa cgacttttaa cgacaacttg 900

agaagatcaa aaaacaacta attattcgaa ggatccaaac g 941

<210> 2

<211> 428

<212> PRT

<213> 双孢菌属(Bispora sp.)

<400> 2

Ala Pro Gly Trp Gly Trp Arg Thr Val Thr Val Thr Glu Thr Val Thr

1 5 10 15

Pro Ser Ser Thr Ala Ala Gly Thr Cys Ser Ala Ser Ser Pro Ser Thr

20 25 30

Ser Gly Ile Ile Ser Ser Ser Thr Ser Ser Ser Thr Ala Thr Ile Ser

35 40 45

Ser Ala Ser Ala Thr Ser Tyr Pro Ser Thr Thr Tyr Pro Thr Thr Pro

50 55 60

Ala Tyr Pro Ile Cys Thr Ser Arg Ala Pro Phe Ala Ser Ile Asp Asp

65 70 75 80

Val His Pro Arg Leu Phe Asn Tyr Asn Gly Thr Gly Ala Lys Tyr Phe

85 90 95

Ala Gly Thr Asn Ala Trp Trp Thr Ser Tyr Leu Met Ile Asp Ser Asp

100 105 110

Val Asn Leu Val Phe Ser Glu Ile Lys Asn Thr Gln Leu Gln Val Val

115 120 125

Arg Ile Trp Gly Phe Gly Ser Val Asn Thr Asp Pro Gly Pro Gly Thr

130 135 140

Val Phe Phe Gln Leu Leu Asn Ser Thr Gly Ser Tyr Ile Asn Tyr Ala

145 150 155 160

Ala Asn Gly Ile Pro Arg Leu Asp Ala Val Val Ser Tyr Ala Glu Arg

165 170 175

Asn Gly Val Lys Ile Val Leu Asn Phe Val Asn Asn Trp Ser Ala Leu

180 185 190

Gly Gly Ile Ala Ser Tyr Asn Ala Ala Phe Gly Gly Asn Ala Thr Ser

195 200 205

Trp Tyr Thr Asp Ala Glu Ser Gln Lys Val Tyr Lys Asp Tyr Ile Lys

210 215 220

Leu Leu Val Asn Arg Tyr Lys Cys Ser Pro Ala Ile Phe Ala Trp Glu

225 230 235 240

Leu Ala Asn Glu Pro Arg Cys Gln Gly Cys Asp Thr Ser Val Ile Tyr

245 250 255

Asn Trp Ala Thr Glu Val Ser Gln Tyr Ile Lys Ser Leu Asp Pro Arg

260 265 270

His Met Val Ala Leu Gly Asp Glu Gly Trp Phe Ala Pro Ala Asp Gly

275 280 285

Ile Gly Asp Gly Ser Tyr Ala Tyr Ser Gly Asp Gln Gly Val Asp Phe

290 295 300

Val Lys Asn Leu Gly Ile Lys Thr Leu Asp Tyr Gly Thr Phe His Leu

305 310 315 320

Tyr Pro Ser Ser Trp Gly Tyr Asn Glu Ser Trp Gly Ser Thr Trp Ile

325 330 335

Leu Gln His Asn Glu Val Gly Ala Ala His Asn Lys Ala Val Val Leu

340 345 350

Glu Glu Tyr Gly Gly Pro Pro Thr Pro Asn Asn His Thr Ala Val Glu

355 360 365

Glu Pro Trp Gln Ala Thr Val Leu Lys Asp Thr Lys Leu Ala Met Asp

370 375 380

Gln Phe Trp Gln Phe Gly Thr Val Leu Ser Thr Gly Leu Ser Asp Tyr

385 390 395 400

Asp Asn Phe Thr Ile Trp Tyr Asn Ser Gln Glu Tyr Val Pro Leu Ala

405 410 415

Arg Asp His Ala Ala Ala Met Leu Glu Lys Pro Val

420 425

<210> 3

<211> 1287

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gctccaggat ggggttggag aaccgttact gtcaccgaaa ccgtcactcc ttcttctact 60

gctgctggaa cttgctccgc ttcctcccca tccacctctg gtatcatttc ctcctccact 120

tcctcctcca ctgctaccat ttcttccgct tctgccactt cctacccatc caccacctac 180

cctaccaccc cagcttaccc tatctgtacc tccagagctc ctttcgcttc cattgacgac 240

gttcacccaa gattgttcaa ctacaatggt actggtgcca agtacttcgc cggtactaac 300

gcttggtgga cctcctactt gatgatcgac tccgatgtta acttggtttt ttctgaaatt 360

aaaaacactc aattgcaagt tgttagaatt tggggatttg gttctgtcaa cactgaccca 420

ggaccaggta ccgttttctt tcaattgttg aactctactg gttcctacat taactacgcc 480

gccaacggaa tcccaagact tgatgctgtc gtttcctacg ctgagcgtaa cggtgtcaag 540

attgtcttga actttgtcaa caactggtcc gctttgggag gaattgcctc ctacaacgct 600

gctttcggtg gtaacgctac ttcttggtac accgacgccg aatcccaaaa ggtctacaag 660

gactacatta aattgcttgt taacagatac aagtgttccc cagctatctt tgcctgggag 720

ttggccaacg aaccaagatg tcaaggatgc gacacctccg tcatttacaa ctgggccacc 780

gaagtttccc aatacatcaa gtctttggac ccaagacaca tggtcgcttt gggtgatgag 840

ggttggtttg ccccagctga cggaattgga gacggttcct acgcctactc cggtgatcag 900

ggtgttgatt tcgttaaaaa ccttggtatc aagactcttg attacggaac cttccacttg 960

tacccatcct cttggggtta caacgagtcc tggggttcca cttggatttt gcagcacaac 1020

gaggttggag ctgcccacaa caaagccgtc gttttggagg aatacggtgg accaccaact 1080

ccaaacaacc ataccgccgt cgaagaacct tggcaagcta ccgtcttgaa ggacaccaag 1140

cttgccatgg accagttctg gcagttcggt accgttttgt ccaccggtct ttccgactat 1200

gacaacttca ctatttggta caactctcag gaatacgtcc cattggccag agatcatgcc 1260

gctgctatgt tggaaaagcc agtttaa 1287

Claims (4)

1.一种重组质粒，其特征在于，所述的重组质粒携带有启动子ATX和甘露聚糖酶基因，所述的启动子ATX的核苷酸序列为SEQ ID NO:1。

2.如权利要求1所述的重组质粒，其特征在于，所述的甘露聚糖酶的氨基酸序列为SEQID NO:2，其编码核苷酸序列为SEQ ID NO:3。

3.一种毕赤酵母工程菌，其特征在于，所述的毕赤酵母工程菌携带有权利要求1或2所述的重组质粒。

4.权利要求3所述的毕赤酵母工程菌在生产甘露聚糖酶中的应用。