CN110724720A

CN110724720A - 一种猪α-干扰素的发酵工艺

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Publication number: CN110724720A
Application number: CN201911058796.5A
Authority: CN
Inventors: 郭海岩; 刘刚; 王兴业; 韩国英; 苗玉和; 韩法杰; 王红军; 孙秀丽
Original assignee: Shandong Xianpu Airui Technology Co ltd
Current assignee: Shandong Xianpu Airui Technology Co ltd
Priority date: 2019-11-01
Filing date: 2019-11-01
Publication date: 2020-01-24

Abstract

本发明涉及猪干扰素的发酵生产，具体涉及一种猪α‑干扰素的发酵工艺。该工艺包括菌株活化及筛选、一级种子培养、二级种子培养和发酵培养；所述菌株为含有重组猪α‑干扰素表达载体的甲醇酵母；所述发酵培养包括菌体快速生长阶段、菌体边富集边诱导阶段和菌体诱导阶段；在菌株活化及筛选中，通过递增培养基中的抗生素浓度对所述菌株进行至少三次抗性筛选，得到稳定的多拷贝菌株；在菌体边富集边诱导阶段，向诱导培养基中流加甲醇和甘露醇溶液；在菌体诱导阶段，向诱导培养基中流加甲醇；所述诱导培养基中添加有亮氨酸和油酸。采用本发明的发酵工艺生产猪α‑干扰素，产量高达21.6g/L，发酵历时仅54～60h。

Description

一种猪α-干扰素的发酵工艺

技术领域

本发明涉及猪干扰素的发酵生产，具体涉及一种猪α-干扰素的发酵工艺。

背景技术

我国是世界养猪大国，2018年出栏超69382万头，每年因病毒性疾病的爆发，给生猪养殖业造成上百亿元损失。急需寻求一种高效、安全以及无毒副作用的猪病毒性疾病防治新产品。目前市场上使用最多的是猪白细胞干扰素，由四川世红生物技术有限公司通过诱生方法生产，于1997年获得农业部新兽药证书[(97)新兽药证字第01号]。目前利用大肠杆菌和毕赤酵母成功地表达出重组干扰素，但是至今在我国未有重组的猪重组干扰素获得新兽药证书，也未有进口的重组猪干扰素获得进口注册证书。其中很大的障碍就是生产工艺复杂，产量低。

毕赤酵母的醇氧化酶(AOXI)基因的启动子具有强诱导性和强启动性，是一种常用的能高效表达外源蛋白的表达系统，但不同外源蛋白在毕赤酵母中的表达情况差异较大，发酵工艺是引起这种差异的重要因素之一。

传统毕赤酵母发酵工艺包括两种：先生长后诱导模式和边生长边诱导模式。先生长后诱导模式即利用甘油为碳源，历经约34-48h生长期，使酵母菌达到较高的密度，再加甲醇诱导，大约进行72-120h，最后的工程菌密度一般可达450g/L左右，整个发酵过程历时108-168h。此工艺存在明显的弊端，耗时耗力。边生长边诱导模式是在蛋白表达与菌体生产之间寻找一个平衡点，并不要求菌体一定要达到很高密度后再进行蛋白诱导表达，同时省略补料生长期，因此整个生产周期较短。但此工艺与上述先生长后诱导模式相比，降低了菌密度和外源蛋白的产量。

发明内容

为弥补上述领域存在的不足，本发明探索出了一种适于猪α-干扰素在毕赤酵母中表达的发酵工艺，具有发酵时间短，产量高等优势。

本发明提供一种猪α-干扰素的发酵工艺，其特征在于：包括菌株活化及筛选、一级种子培养、二级种子培养和发酵培养；所述菌株为含有猪α-干扰素表达载体的甲醇酵母；所述发酵培养包括菌体快速生长阶段、菌体边富集边诱导阶段和菌体诱导阶段；

在所述菌株活化及筛选中，通过递增培养基中的抗生素浓度对所述菌株进行至少三次抗性筛选，得到稳定的多拷贝菌株；

在所述菌体边富集边诱导阶段，向诱导培养基中流加甲醇和甘露醇溶液；在所述菌体诱导阶段，向诱导培养基中流加甲醇；

所述诱导培养基中添加有亮氨酸和油酸。

在一些实施例中，所述表达载体含有博来霉素抗性基因；在所述菌株活化及筛选中，将所述菌株依次接种到含有300μg/ml、600μg/ml和900μg/ml博来霉素的培养基中，进行三次抗性筛选。

在优选实施例中，所述诱导培养基含有终浓度为1mg/ml的亮氨酸和体积百分比浓度为0.02％的油酸。

在优选实施例中，在所述菌体边富集边诱导阶段，以6～9mL/h/L的速率向诱导培养基中流加0.1g/ml的甘露醇溶液，以2～3mL/h/L的速率向诱导培养基中流加甲醇；在所述菌体诱导阶段，以9～12mL/h/L的速率向诱导培养基中流加甲醇。

在优选实施例中，所述菌株采用保藏编号为CCTCC M 2019749的菌株。

在一些实施例中，从发酵开始至发酵液中初始碳源消耗殆尽时为菌体快速生长阶段；从菌体快速生长阶段结束时至菌体湿重达400g/L时为菌体边富集边诱导阶段；从菌体边富集边诱导阶段结束时至菌体湿重达到500g/L以上时为菌体诱导阶段。

在一些实施例中，所述发酵培养包括如下步骤：

菌体快速生长阶段：将二级种子液加入诱导培养基中，控制温度30℃，pH5.0，发酵期间通过调整转速和通气量使溶氧保持在30％以上，定时取样测定碳源剩余，当初始碳源消耗殆尽时进入菌体边富集边诱导阶段；

菌体边富集边诱导阶段：以6～9mL/h/L的速率补加0.1g/ml的甘露醇溶液，以2～3mL/h/L的速率补加甲醇，控制转速200rpm，温度28℃，pH5.0，溶氧为20～30％，定时取样测定细胞湿重，当菌体湿重达400g/L以上时，停止补加甘露醇溶液，转入菌体诱导阶段；

菌体诱导阶段：以9～12mL/h/L的速率补加甲醇，控制转速200rpm，温度28℃，pH6.0，溶氧为20～30％，当菌体湿重达到500g/L以上时，结束发酵。

在一些实施例中，所述菌株活化及筛选包括如下步骤：

第一次筛选：取菌株冻干粉0.8～1.2g，溶于1mL无菌YPD液体培养基中，取菌液在含有300μg/ml博来霉素的YPD固体培养基上划线，然后置于30℃恒温培养箱中培养48h；

第二次筛选：从第一次筛选的平板上挑取单菌落，再在含有600μg/ml博来霉素的YPD固体培养基上划线培养，然后置于30℃恒温培养箱中培养48h；

第三次筛选：从第二次筛选的平板上挑取单菌落，再在含有900μg/ml博来霉素的YPD固体培养基上划线培养，然后置于30℃恒温培养箱中培养48h。

在优选实施例中，每100ml所述诱导培养基含有1g酵母粉、2g胰蛋白胨、2ml甘油、0.34g YNB、1.0941gKH₂PO₄、0.4473g K₂HPO₄·3H₂O、0.1g亮氨酸、0.02ml油酸和0.1ml0.4mg/ml的生物素溶液。

本发明还提供任一上述发酵工艺在生产猪α-干扰素中的应用。

本发明提供的猪α-干扰素的发酵工艺，包括菌株活化及筛选、一级种子培养、二级种子培养、发酵培养(菌体快速生长阶段，菌体边富集边诱导阶段，菌体诱导阶段)步骤。采用本发明的发酵工艺生产猪α-干扰素，产量高达21.6g/L，发酵过程历时54～60h。

相比传统的猪α-干扰素的发酵工艺，本发明的主要改进之处在于：

(1)本发明在发酵前将菌种依次接种到含300μg/ml、600μg/ml、900μg/ml博来霉素的YPD培养基上，筛选出稳定多拷贝的高产菌种用于发酵，从而提高猪α-干扰素的产量。

(2)本发明在诱导培养基中加入了亮氨酸和油酸，从而提高猪α-干扰素的产量。亮氨酸是猪α-干扰素序列中占比较高的氨基酸，占氨基酸总量的14.20％，可以补充猪α-干扰素大量表达所造成的亮氨酸匮乏；油酸对AOX1启动子具有很强的促启动作用，可以加快甲醇代谢，提高甲醇的利用率。

(3)本发明在富集菌体的基础上进行两次甲醇流加。第一次流加是在菌体边富集边诱导阶段，采用甲醇和甘露醇混合补料，边富集菌体边诱导猪α-干扰素表达；第二次流加是在菌体诱导阶段，仅用甲醇补料。与先生长后诱导的传统发酵工艺相比，发酵时间缩短了30％以上，与边生长边诱导的传统发酵工艺相比，提高了起始诱导菌体量，增加了3～5倍猪α-干扰素产量。

本发明优选采用保藏编号为CCTCC M 2019749的菌株，该菌株是我们自己构建的。我们在NCBI网站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上找到山猪α-干扰素蛋白序列，删除了山猪α-干扰素原有的信号肽，并且对其具有简并密码子的氨基酸进行统计分析，选择使用频率高的密码子，得到新的重组猪α-干扰素基因序列。通过基因合成，获得了新的重组猪α-干扰素基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。将新基因插入到分泌型多拷贝pPICZaA表达载体上并转染到毕赤酵母中，再采用含有高浓度的博来霉素平板进行筛选，获得了重组猪α-干扰素分泌能力显著提高的毕赤酵母菌并进行了菌种保藏。采用本发明的保藏菌株和发酵工艺生产猪α-干扰素，产量高达21.6g/L，发酵历时仅54～60h，具有极高的应用价值。

本发明提供的生产猪α-干扰素的工程菌，保藏信息如下：

保藏名称：毕赤酵母X33/PoIFN-α

分类命名：Pichia sp.X33/PoIFN-α

保藏日期：2019年9月25日

保藏编号：CCTCC M 2019749

保藏单位：中国典型培养物保藏中心

保藏单位地址：湖北省武汉市洪山区八一路武汉大学中国典型培养物保藏中心，邮编：430072，E-mail:cctcc@whu.edu.cn。

附图说明

图1.本发明构建的pPICZαA-猪α干扰素质粒图谱；

图2.筛选含有本发明重组猪α-干扰素基因的毕赤酵母的电泳图。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明进行详细阐述，需要理解的是，下述实施例仅作为对本发明的解释和说明，不以任何形式限制本发明的范围。

实验试剂：

DNA纯化回收试剂盒、2×PCR Master Mix、限制性内切酶EcoR I和Not I、10×buffer、T4-DNA连接酶、D-山梨醇、酵母膏、酵母提取物、酵母粉、胰蛋白胨、蛋白胨、YNB、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、生物素、博来霉素、甘油、氯化钠、硫酸铵、葡萄糖均购自生工生物工程(上海)股份有限公司；

pPICZαA质粒：购自上海信裕生物技术有限公司，货号XY0216；

DH5α感受态细胞：购自Invitrogen公司，货号18265017；

X-33酵母感受态细胞：购自Invitrogen公司，货号C18000；

亮氨酸：购自峨眉山龙腾生物科技有限公司；

油酸：购自淮南泉润环保科技有限公司；

甘露醇：购自广东光华科技股份有限公司；

甲醇：购自青岛锦鹏化工有限公司；

溶细胞酶：购自美国sigma公司；

质粒提取纯化试剂盒：购自Qiagen公司；

猪α干扰素定量检测试剂盒：购自江苏科晶生物科技有限公司；

0.4mg/ml的生物素溶液：称取生物素0.04g，溶解于100mL单蒸水中，用孔径为0.22微米纤维素滤膜无菌过滤。

培养基：

LB培养基

每100mlLB培养基含有：1g胰蛋白胨、0.5g酵母提取物、1g氯化钠，pH 7.4。

配制方法：在950ml ddH₂O中溶解10g胰蛋白胨，5g酵母提取物，10g氯化钠，然后用NaOH调节pH为7.4，用ddH₂O定容至1L。若配制固体培养基，则每升加入15g琼脂。121℃高压蒸汽灭菌20min。

YPD培养基

配方：酵母膏：蛋白胨：葡萄糖＝1:2:2(质量比)。

配制方法：溶解10g酵母膏，20g蛋白胨于900ml ddH₂O中，如制平板需加入20g琼脂；121℃高压蒸汽灭菌20min；冷却后加入100ml单独灭菌(115℃高压蒸汽灭菌15min)的葡萄糖溶液(含20g葡萄糖)。

BMGY培养基

每100mlBMGY培养基含有：1g酵母粉、2g胰蛋白胨、1ml甘油、0.34gYNB(不含硫酸铵及氨基酸)、1g硫酸铵、1.0941g KH₂PO₄、0.4473g K₂HPO₄·3H₂O、0.1ml 0.4mg/ml的生物素溶液。

100LBMGY培养基的配制方法：在ddH₂O中加入1000g酵母粉，2000g胰蛋白胨，1L甘油，340gYNB(不含硫酸铵及氨基酸)，1000g硫酸铵，KH₂PO₄ 1094.1g，K₂HPO₄·3H₂O 447.3g，加热搅拌溶解，定容至99900ml，然后121℃高压蒸汽灭菌20min；冷却至室温后流加100ml单独灭菌的生物素溶液，混匀后分装到合适的无菌容器中。

BMMY培养基

每100mlBMMY培养基含有：1g酵母粉、2g胰蛋白胨、0.5ml甲醇、0.34g YNB(不含硫酸铵及氨基酸)、1g硫酸铵、1.0941g KH₂PO₄、0.4473g K₂HPO₄·3H₂O、0.1ml 0.4mg/ml的生物素溶液。

1000LBMMY培养基的配制方法：在ddH₂O中加入10000g酵母粉，20000g胰蛋白胨，5L甲醇，3400gYNB(不含硫酸铵及氨基酸)，10000g硫酸铵，KH₂PO₄ 10941g，K₂HPO₄·3H₂O4473g，加热搅拌溶解，定容至999900ml，然后121℃高压蒸汽灭菌20min；冷却至室温后流加1L单独灭菌的生物素溶液，混匀后分装到合适的无菌容器中。

诱导培养基

每100ml诱导培养基含有：1g酵母粉、2g胰蛋白胨、0.5ml甲醇、0.34g YNB(不含硫酸铵及氨基酸)、1g硫酸铵、1.0941g KH₂PO₄、0.4473g K₂HPO₄·3H₂O、0.1g亮氨酸、0.02ml油酸、0.1ml 0.4mg/ml的生物素溶液。

1000L诱导培养基的配制方法：在ddH₂O中加入10000g酵母粉，20000g胰蛋白胨，5L甲醇，3400gYNB(不含硫酸铵及氨基酸)，10000g硫酸铵，KH₂PO₄ 10941g，K₂HPO₄·3H₂O4473g，1000g亮氨酸、200ml油酸，加热搅拌溶解，定容至999900ml，然后121℃高压蒸汽灭菌20min；冷却至室温后流加1L单独灭菌的生物素溶液，混匀后分装到合适的无菌容器中。

本发明未特别说明的实验试剂均为本领域常规试剂，可按照本领域常规方法配制而得或商购获得；未特别说明的实验方法，均为本领域常规方法，可参考相关实验手册，例如分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW，Molecular cloning:a laboratorymanual，2001)，或制造厂商说明书。

实施例1.本发明生产重组猪α-干扰素的工程菌的构建

步骤1、目的基因的获得

我们在NCBI网站上找到山猪α-干扰素原始基因序列(SEQ ID NO.3)，删除了山猪α-干扰素原有的信号肽，并对其具有简并密码子的氨基酸进行统计分析，选择使用频率高的密码子，获得了新的重组猪α-干扰素基因序列(SEQ ID NO.1)，委托生工生物工程(上海)有限公司进行全基因合成，获得了目的基因。

设计引物，然后通过PCR反应使目的基因的5’端加上EcoR I酶切位点，3’端加上Not I酶切位点。PCR产物经1.5％的琼脂糖凝胶电泳后，用DNA纯化回收试剂盒回收525bp的片段，该片段的DNA序列如SEQ ID NO.2所示。

上述引物的核苷酸序列如下：

正向引物F1(5’-3’)：

GGAATTCCATGTGTGACTTGCCACAAACT；

反向引物R1(5’-3’)：

ATTTGCGGCCGCTTTATTCCTTCTTTCTCAATCTGTCTT。

PCR反应体系(25μl)：2×PCR Master Mix 10μl、正向引物200nM、反向引物200nM、目的基因模板1μl、剩余体积用ddH₂O补足。

PCR反应程序：预变性95℃5min，1个循环；变性95℃10s、退火58℃10s、延伸72℃30s，40个循环；最终延伸72℃5min，1个循环。

用EcoR I和Not I双酶切处理PCR产物，37℃，酶切20min。

100μl酶切体系为：10×buffer：10μl；DNA 6μg；EcoR I酶：3μl；NotI酶：3μl；去离子水补足体积。

酶切产物经1.5％的琼脂糖凝胶电泳后，用DNA纯化回收试剂盒回收片段，得到线性化的目的基因片段。

步骤2、表达载体的构建

用EcoR I和Not I双酶切处理表达载体pPICZαA质粒，酶切体系和条件同步骤1。酶切产物经1.5％的琼脂糖凝胶电泳后，用DNA纯化回收试剂盒回收3.6kp的片段，得到线性化的质粒片段。

将步骤1得到的目的基因片段与线性化的质粒片段按1pmol:10pmol的比例混合均匀，加入5μLT4-DNA连接酶，在25℃条件下连接15min，连接产物即重组子(pPICZαA-猪α干扰素)。

用连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。转化步骤如下：将连接产物和感受态细胞混匀后在冰上孵育半小时，42℃热激90秒，冰上放置2min，然后加入液体LB培养基缓摇1个小时，3000rpm离心5min，将100μl菌液涂布在含有100μg/ml博来霉素的LB固体平板上，37℃倒置培养过夜。次日分别挑取12个单菌落，接种在含有100μg/ml博来霉素的LB液体培养基中，37℃过夜培养，采用质粒提取纯化试剂盒提取pPICZαA-猪α干扰素质粒。

委托生工生物工程(上海)有限公司对获得的12份pPICZαA-猪α干扰素质粒进行测序，将测序正确的质粒备用。

步骤3、重组酵母菌的获得

(1)电转化

用步骤2筛选的pPICZαA-猪α干扰素质粒电击转化X-33酵母感受态细胞，具体操作步骤如下：

将pPICZαA-猪α干扰素质粒10μL转入80μL X-33酵母感受态细胞中，轻轻充分混匀，加入置于冰上预冷5min的0.2cm的石英电转化杯中。电转化杯使用前预先用70％乙醇清洗浸泡，并置于紫外灯下消毒半小时。将石英电转化杯擦干外壁的水分，放入BioRadGenePulse电转化仪的杯槽中以1.5kV、25μF、200Ω、0℃的条件下电击，转化后立即加入1mL4℃预冷30min的D-山梨醇，混匀。将电转化杯放于30℃恒温箱中温育1-2h，得到电转化产物。取150μL电转化产物均匀涂布于含100μg/ml博来霉素的YPD选择平板培养基上，观察转化子的生长，30℃培养3-5天，得到生产猪α干扰素的工程菌。

(2)阳性菌株的筛选

筛选阳性菌株，具体步骤如下：常温下随机挑选YPD平板内的长势较好的单一菌落，用灭菌的牙签或枪头挑取单一菌落，在含100μg/ml博来霉素的YPD平板上轻点，做一拷贝；然后将沾有菌体的牙签或枪头置于相应的10μl无菌去离子水EP管中，加5μl(5u/μl)的溶细胞酶，37℃水浴半小时，-80℃静置15分钟，沸水中煮沸5分钟，12000rpm离心5分钟，取上清1μl作为模板，加到25μl PCR反应体系中。

PCR引物的核苷酸序列如下：

正向引物F1(5’-3’)：

GGAATTCCATGTGTGACTTGCCACAAACT；

反向引物R1(5’-3’)：

ATTTGCGGCCGCTTTATTCCTTCTTTCTCAATCTGTCTT。

PCR反应体系(25μl)：2×PCR Master Mix 10μl、正向引物200nM、反向引物200nM、模板1μl、剩余体积用ddH₂O补足。

PCR反应结束后取10μL扩增产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，凝胶成相系统中观察并拍照记录，在525bp处有明显条带，证明构建的毕赤酵母含有目的基因，为阳性克隆(图2)。

(3)多拷贝菌株的筛选

将阳性克隆单菌落依次划线接种到含300μg/ml、600μg/ml、900μg/ml博来霉素YPD固体培养基上，筛选出稳定多拷贝的高产菌种。具体步骤如下：

将含100μg/ml博来霉素的YPD平板上的阳性克隆单菌落采用“三步划线法”接种到含300μg/ml博来霉素的YPD选择平板培养基上，30℃培养3-5天后观察菌落。

将含300μg/ml博来霉素的YPD平板上长势较好的单一菌落采用“三步划线法”接种到含600μg/ml博来霉素的YPD选择平板培养基上，30℃培养3-5天后观察菌落。

将含600μg/ml博来霉素的YPD平板上长势较好的单一菌落采用“三步划线法”接种到含900μg/ml博来霉素的YPD选择平板培养基上，30℃培养3-5天后观察菌落。此平板上所有单菌落均为多拷贝菌株。

实施例2.采用山猪α-干扰素原始序列构建工程菌

山猪α-干扰素原始基因的获得：

委托生工生物工程(上海)有限公司公司对山猪α-干扰素原始基因序列(SEQ IDNO.3)进行全基因合成，获得山猪α-干扰素原始基因。采用如下引物对该基因进行扩增，通过PCR反应使目的基因的5’端加上EcoR I酶切位点，3’端加上Not I酶切位点，并添加酶切位点保护碱基。PCR产物经1.5％的琼脂糖凝胶电泳后，用DNA纯化回收试剂盒回收594bp的DNA片段。

PCR引物的核苷酸序列如下：

正向引物F2(5’-3’)：GGAATTCCATGGCCCCAACCTCAGCCT；

反向引物R2(5’-3’)：ATTTGCGGCCGCTTTATCACTCCTTCTTCCTGAGT。

PCR体系：2×PCR Master Mix 10μl、正向引物200nM、反向引物200nM、模板1μl、剩余体积用ddH₂O补足。

PCR程序：预变性95℃5min，1个循环；变性95℃10s、退火60℃10s、延伸72℃30s，40个循环；最终延伸72℃5min，1个循环。

表达载体的构建：方法同实施例1步骤2。

重组酵母菌的获得：方法同实施例1步骤3。

实施例3.本发明的工程菌与现有工程菌生产猪α-干扰素的性能比较

分别对实施例1获得的工程菌(本发明的工程菌)和实施例2获得的工程菌(现有的工程菌)进行高密度发酵，方法如下：

(1)挑取多拷贝菌株的单菌落，接入装有250mL YPD液体培养基的1L三角瓶中，置于摇床中，在30℃、200rpm的条件下培养至OD600＝0.6～0.8，镜检无染菌后，作为一级种子备用。

(2)将4瓶一级种子液共1L接入已灭菌的100L BMGY发酵培养基中，使用发酵种子罐培养，控制通气量在5L/min，温度30℃，转速200rpm，待OD600＝0.6～0.8，且镜检无误后可作为二级种子液备用。此阶段需要24h。

(3)用泵将备好的100L二级种子液泵入1吨BMMY液体培养基中。发酵温度为30.5℃，发酵转速为200rpm，发酵风量为35NL/min，每24h补加0.5％(v/v)的甲醇，发酵时间为72h，得到酵母重组猪α-干扰素发酵液。

用猪α干扰素定量检测试剂盒测定发酵液中猪α-干扰素的浓度，按使用说明书操作(夹心ELISA)。

每个菌株的发酵实验重复3次，得到的3批发酵液中猪α-干扰素的浓度如表1所示，本发明的工程菌生产猪α-干扰素的平均浓度为(11.23±0.05)g/L，现有的工程菌生产猪α-干扰素的平均浓度为(0.32±0.02)g/L。可见，本发明改造的重组猪α-干扰素序列使微生物发酵法生产猪α-干扰素的能力在原有基础上提高了35.09倍。

表1.连续3批发酵液中猪α-干扰素的浓度ELISA检测结果

将上述本发明的工程菌(菌株1)送中国典型培养物保藏中心进行菌种保藏，保藏编号为CCTCC M 2019749。

实施例4.本发明优化的猪α-干扰素的发酵工艺

1、菌株活化及筛选

本实施例使用保藏编号为CCTCC M 2019749的重组毕赤酵母菌发酵生产重组猪α-干扰素。在超净台上将冻干菌粉用YPD液体培养基溶解，按照下列步骤对菌株进行三次博来霉素抗性筛选。

第一次筛选：取重组毕赤酵母菌冻干粉0.8～1.2g，溶于1mL无菌YPD液体培养基中，取菌液在含300μg/ml博来霉素的YPD平板培养基上划线，全程无菌操作；划线后的培养基置于30℃恒温培养箱中培养48h；

第二次筛选：从第一次筛选的平板上挑取单菌落，再在含600μg/ml博来霉素的YPD平板培养基上划线培养，全程无菌操作；划线后的培养基置于30℃恒温培养箱中培养48h；

第三次筛选：从第二次筛选的平板上挑取单菌落，再在含900μg/ml博来霉素的YPD平板培养基上划线培养，全程无菌操作；划线后的培养基置于30℃恒温培养箱中培养48h。

2、一级种子培养

从第三次筛选的YPD固体培养基上挑取单菌落，接入装有250mL YPD液体培养基的1L三角瓶中，置于摇床中，在30℃、200rpm的条件下培养至OD600＝0.6～0.8；镜检无染菌后，作为一级种子液备用。

3、二级种子培养

将4瓶一级种子液共1L接种到已灭菌的100LBMGY发酵培养基中，使用发酵种子罐培养，控制通气量在5L/min，温度30℃，转速200rpm，待OD600＝0.6～0.8，且镜检无误后作为二级种子液备用。此阶段需要12～16h。

4、发酵培养

(1)菌体快速生长阶段

用泵将备好的100L二级种子液泵入1吨诱导培养基中。发酵条件控制在转速200rpm，温度30℃，pH5.0，通气量10L/min。每4h取样一次测定其碳源剩余、菌体浓度，初期使用分光光度计测量其600nm吸光值(OD600)，后期测量湿重作为参考。发酵期间通过调整转速和通气量使溶氧保持在30％以上。以溶氧电极数值上升到100％为标志表示初始碳源已消耗殆尽，即可进入菌体边富集边诱导阶段。此阶段需要12～16h。

(2)菌体边富集边诱导阶段

以6～9mL/h/L的恒定速率补加浓度为0.1g/ml的甘露醇溶液，以2～3mL/h/L的恒定速率补加甲醇，发酵条件控制在转速200rpm，温度28℃，pH5.0，溶氧(DO)在20～30％之间。每6h取样1次，测OD600、细胞湿重及细胞干重，分析酵母菌生长状态。菌体湿重达400g/L以上时，停止补加甘露醇。转入甲醇诱导表达阶段。此阶段需要6～8h。

(3)菌体诱导阶段

以9～12mL/h/L的速率补加甲醇，发酵条件控制在转速200rpm，温度28℃，pH6.0，DO在20～30％之间。维持发酵到42～44h，湿重达到500g/L以上，结束发酵，得发酵液。

发酵液中猪α-干扰素的浓度测定

用猪α-干扰素定量检测试剂盒(江苏科晶生物科技有限公司)测定发酵液中猪α-干扰素的浓度，按使用说明书操作(夹心ELISA)。连续3批发酵液中猪α-干扰素的浓度如表2所示：

表2.连续3批发酵液中猪α-干扰素浓度的ELISA检测结果

发酵液中猪α-干扰素的活性测定

用细胞病变抑制法测定干扰素的活性，采用MDBK/VSV系统检测干扰素的生物活性，由标准品计算出样品的效价。测定方法参照《中华人民共和国药典》2005年版。测定结果见表3，本发明生产的发酵液中猪α-干扰素的活性达到1.91×10¹⁰以上。

表3.连续3批发酵液中猪α-干扰素的活性

实施例5.影响发酵液中猪α-干扰素浓度的因素

以下实验均使用保藏编号为CCTCC M 2019749的重组毕赤酵母菌。

1、菌种筛选对发酵液中猪α-干扰素浓度的影响

按照实施例3的方法进行发酵，设置三个实验组：第一组使用经过一次博来霉素抗性筛选(只经过300μg/ml博来霉素抗性筛选)所得到的菌株，第二组使用经过两次博来霉素抗性筛选(依次经过300μg/ml、600μg/ml博来霉素抗性筛选)所得到的菌株，第三组使用经过三次博来霉素抗性筛选(依次经过300μg/ml、600μg/ml、900μg/ml博来霉素抗性筛选)所得到的菌株。博来霉素抗性筛选的方法参照实施例4。

用猪α-干扰素定量检测试剂盒测定发酵液中猪α-干扰素的浓度，按使用说明书操作。三个实验组分别进行了3个批次的发酵，计算3批发酵液中猪α-干扰素浓度的均值，结果如表4所示，随着博来霉素抗性筛选次数的增加，发酵液中猪α-干扰素的浓度依次提高。

表4.菌种筛选对发酵液中猪α-干扰素浓度的影响

2、亮氨酸浓度对发酵液中猪α-干扰素浓度的影响

按照实施例3的方法进行发酵，设置四个实验组：第一组的BMMY培养基中加入亮氨酸至终浓度为0.5mg/ml，第二组的BMMY培养基中加入亮氨酸至终浓度为1mg/ml，第三组的BMMY培养基中加入亮氨酸至终浓度为5mg/ml，第四组的BMMY培养基中加入亮氨酸至终浓度为10mg/ml。

用猪α-干扰素定量检测试剂盒测定发酵液中猪α-干扰素的浓度，按使用说明书操作。四个实验组分别进行3个批次的发酵，计算3批发酵液中猪α-干扰素浓度的均值，结果如表5所示，在甲醇诱导阶段，当BMMY培养基中含有终浓度为1mg/ml的亮氨酸时，发酵液中猪α-干扰素的浓度最高。

表5.不同浓度亮氨酸对发酵液猪α-干扰素的浓度的影响

3、油酸浓度对发酵液中猪α-干扰素浓度的影响

按照实施例4的方法进行发酵，设置四个实验组：第一组的诱导培养基中含有0.01％(v/v)油酸，第二组的诱导培养基中含有0.02％(v/v)油酸，第三组的诱导培养基中含有0.04％(v/v)油酸，第四组的诱导培养基中含有0.08％(v/v)油酸。

用猪α-干扰素定量检测试剂盒测定发酵液中猪α-干扰素的浓度，按使用说明书操作。四个实验组分别进行3个批次的发酵，计算3批发酵液中猪α-干扰素浓度的均值，结果如表6所示，当诱导培养基中含有0.02％(v/v)油酸时，发酵液中猪α-干扰素的浓度最高。

表6.不同浓度的油酸对发酵液中猪α-干扰素浓度的影响

4、甘露醇流加速率对发酵液中猪α-干扰素浓度的影响

按照实施例4的方法发酵生产猪α-干扰素，设置五个实验组：在菌体边富集边诱导阶段，第一组：甘露醇溶液流加速率为0mL/h/L，第二组的甘露醇溶液流加速率为1～3mL/h/L，第三组的甘露醇溶液流加速率为3～6mL/h/L，第四组的甘露醇溶液流加速率为6～9mL/h/L，第五组的甘露醇溶液流加速率为9～12mL/h/L。其中，甘露醇溶液采用ddH₂O配制，浓度为0.1g/ml。

用猪α-干扰素定量检测试剂盒测定发酵液中猪α-干扰素的浓度，按使用说明书操作。五个实验组分别进行3个批次的发酵，计算3批发酵液中猪α-干扰素浓度的均值，结果如表7所示，在菌体边富集边诱导阶段流加甘露醇可以提高发酵液中猪α-干扰素的浓度，当甘露醇溶液的流加速率为6～9mL/h/L时，发酵液中猪α-干扰素的浓度最高。

表7.不同速率流加甘露醇对发酵液中猪α-干扰素浓度的影响

实施例6.本发明的发酵工艺与现有发酵工艺生产猪α-干扰素的性能比较

使用保藏编号为CCTCC M 2019749的重组毕赤酵母菌，分别按照如下三种工艺发酵生产猪α-干扰素。

1、本发明的发酵工艺，参照实施例4。

2、先生长后诱导的传统发酵工艺，参照实施例3。

3、边生长边诱导的传统发酵工艺，如下：

(1)一级种子培养

(2)二级种子培养

将4瓶一级种子液共1L接种到已灭菌的100L BMGY发酵培养基中，使用发酵种子罐培养，控制通气量在5L/min，温度30℃，转速200rpm，待OD600＝0.6～0.8，且镜检无误后作为二级种子液备用。此阶段需要12～16h。

(3)发酵培养

按10％的体积比将二级种子液全部接入装有BMMY培养基的发酵罐中，设定溶氧30％，溶氧、搅拌通气关联。培养2-4h后，待发酵培养基中的溶氧上升时，开始补加甲醇，补加策略为：第1个小时，补加量为0.5ml/L/hr；第2个小时，补加量为0.75ml/L/hr；第3-4个小时，补加量为1-1.5ml/L/hr；第5-6个小时，补加量为1.5-1.8ml/L/hr；第7个小时，补加量为2-2.5ml/L/hr；然后以2ml/L/hr的速度保持流加至最后。此阶段需要40～50h。

表8.不同发酵工艺对发酵液中猪α-干扰素浓度的影响

序列表

<110> 山东仙普爱瑞科技股份有限公司

<120> 一种猪α-干扰素的发酵工艺

<130> P190648-XPA

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 501

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgtgtgact tgccacaaac tcactctttg gctcacacta gagctttgag attgttggct 60

caaatgagaa gaatctctcc attctcttgt ttggactaca gaagagactt cggtttccca 120

caagaagctt tgggtggtaa ccaagttcaa aaggctcaag ctatggcttt ggttcacgaa 180

atgttgcaac aaactttcca attgttctct actgaaggtt ctgctgctgc ttgggacgaa 240

tctttgttgc accaattctg tactggtttg gaccaacaat tgagagactt ggaagcttgt 300

gttatgcaag aagctggttt ggaaggtact ccattgttgg aagaagactc tatcttggct 360

gttagaaagt acttccacag attgactttg tacttgcaag aaaagtctta ctctccatgt 420

gcttgggaaa tcgttagagc tgaagttatg agagctttct cttcttctac taacttgcaa 480

gacagattga gaaagaagga a 501

<210> 2

<211> 525

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ggaattccat gtgtgacttg ccacaaactc actctttggc tcacactaga gctttgagat 60

tgttggctca aatgagaaga atctctccat tctcttgttt ggactacaga agagacttcg 120

gtttcccaca agaagctttg ggtggtaacc aagttcaaaa ggctcaagct atggctttgg 180

ttcacgaaat gttgcaacaa actttccaat tgttctctac tgaaggttct gctgctgctt 240

gggacgaatc tttgttgcac caattctgta ctggtttgga ccaacaattg agagacttgg 300

aagcttgtgt tatgcaagaa gctggtttgg aaggtactcc attgttggaa gaagactcta 360

tcttggctgt tagaaagtac ttccacagat tgactttgta cttgcaagaa aagtcttact 420

ctccatgtgc ttgggaaatc gttagagctg aagttatgag agctttctct tcttctacta 480

acttgcaaga cagattgaga aagaaggaat aaagcggccg caaat 525

<210> 3

<211> 570

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atggccccaa cctcagcctt cctcacggcc ctggtgctac tcagctgcaa tgccatctgc 60

tctctgggct gtgacctgcc tcagacccac agcctggctc acaccagggc cctgaggctc 120

ctggcacaaa tgaggagaat ctctcccttc tcctgcctgg accacagaag ggactttgga 180

tcccctcatg aggcttttgg gggcaaccag gtccagaagg ctcaagccat ggctctggtg 240

catgagatgc tccagcagac cttccagctc ttcagcacag agggctcggc tgctgcctgg 300

aatgagagcc tcctgcacca gttctgcact ggactggatc agcagctcag ggacctggaa 360

gcctgtgtca tgcaggaggc ggggctggaa gggacccccc tgctggagga ggactccatc 420

ctggctgtga ggaaatactt ccacagactc accctctatc tgcaagagaa gagctacagc 480

ccctgtgcct gggagatcgt cagggcagaa gtcatgagat ccttctcttc ctccagaaac 540

ctgcaagaca gactcaggaa gaaggagtga 570

<210> 4

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ggaattccat gtgtgacttg ccacaaact 29

<210> 5

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atttgcggcc gctttattcc ttctttctca atctgtctt 39

<210> 6

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ggaattccat ggccccaacc tcagcct 27

<210> 7

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

atttgcggcc gctttatcac tccttcttcc tgagt 35

Claims

1.一种猪α-干扰素的发酵工艺，其特征在于：包括菌株活化及筛选、一级种子培养、二级种子培养和发酵培养；所述菌株为含有猪α-干扰素表达载体的甲醇酵母；所述发酵培养包括菌体快速生长阶段、菌体边富集边诱导阶段和菌体诱导阶段；

所述诱导培养基中添加有亮氨酸和油酸。

2.根据权利要求1所述的发酵工艺，其特征在于：所述表达载体含有博来霉素抗性基因；在所述菌株活化及筛选中，将所述菌株依次接种到含有300μg/ml、600μg/ml和900μg/ml博来霉素的培养基中，进行三次抗性筛选。

3.根据权利要求1所述的发酵工艺，其特征在于：所述诱导培养基含有终浓度为1mg/ml的亮氨酸和体积百分比浓度为0.02％的油酸。

4.根据权利要求1所述的发酵工艺，其特征在于：在所述菌体边富集边诱导阶段，以6～9mL/h/L的速率向诱导培养基中流加0.1g/ml的甘露醇溶液，以2～3mL/h/L的速率向诱导培养基中流加甲醇；在所述菌体诱导阶段，以9～12mL/h/L的速率向诱导培养基中流加甲醇。

5.根据权利要求1所述的发酵工艺，其特征在于：所述菌株采用保藏编号为CCTCCM2019749的菌株。

6.根据权利要求1所述的发酵工艺，其特征在于：从发酵开始至发酵液中初始碳源消耗殆尽时为菌体快速生长阶段；从菌体快速生长阶段结束时至菌体湿重达400g/L时为菌体边富集边诱导阶段；从菌体边富集边诱导阶段结束时至菌体湿重达到500g/L以上时为菌体诱导阶段。

7.根据权利要求1所述的发酵工艺，其特征在于：所述发酵培养包括如下步骤：

8.根据权利要求2所述的发酵工艺，其特征在于：所述菌株活化及筛选包括如下步骤：

9.根据权利要求1-8任一所述的发酵工艺，其特征在于：每100ml所述诱导培养基含有1g酵母粉、2g胰蛋白胨、2ml甘油、0.34g YNB、1.0941gKH₂PO₄、0.4473g K₂HPO₄·3H₂O、0.1g亮氨酸、0.02ml油酸和0.1ml 0.4mg/ml的生物素溶液。

10.权利要求1-9任一所述的发酵工艺在生产猪α-干扰素中的应用。