CN109320601A - 重组igf-1蛋白和高效表达及其在促细胞增殖方面的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种重组IGF‑1蛋白和高效表达及其在促细胞增殖方面的用途。所述重组IGF‑1的氨基酸序列为SEQ ID NO.1，核酸序列为SEQ ID NO.2。本发明的重组IGF‑1蛋白可有效的促进表达重组蛋白基因工程CHO细胞株的细胞增殖，以及在CAR‑T细胞治疗时对体外T‑细胞具有促增殖作用。另外，本发明使用毕赤酵母来表达IGF‑1重组蛋白，无细菌内毒素产生，极大地提高了IGF‑1的产量，显著降低生产成本，提供巨大的经济效益。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，更具体地是一种重组IGF-1蛋白和高效表达及其在促CHO细胞和T细胞增殖方面的用途。
背景技术
胰岛素样生长因子系统 Clnsulin-like growth factor system，IGFs)是一个复杂的分子网络，包括两种配体（IGF-1和IGF-2），两种受体 （IGF-IR, IGF-2R），6种高亲和力结合蛋白（IGFBPl-6），广泛分布于体内各组织器官，IGFBP蛋白水解酶由于可以间接调控IGFs的作用也被认为是IGF家族的一部分。1957 年 Salmon与 Daughudy在研究生长激素（growth hormone,GH）作用时首次发现一类活性物质“硫酸因子” (即目前的胰岛素样生长因子），于1978年确定了其氨基酸序列，并发现其序列与胰岛素家族有近50%氨基酸序列相似，因此将该类活性物质分类命名为胰岛素样生长因子1和胰岛素样生长因子 2。目前这一类与胰岛素类似结果和功能的物质统一命名为胰岛素样生长因子系统 （Insulin-likegrowth factor system, IGFs），其中IGF-1、IGF-2 和 IGFBP3在血液循环中浓度较高，可以实验检测其血清水平。
胰岛素样生长因子1（insulin-like growth factor-1, IGF-1）由肝脏合成、分泌，基因位于染色体12q22上，全长153个氨基酸，活性单位为70个氨基酸，结构与胰岛素相似，具有促进细胞有丝分裂的生物学功能； IGF-2基因位于11p上，是细胞分裂和代谢的调节因子，尤其对于胚胎的生长发育有重要作用。这两个多肽来自同一个分化前体，在氨基酸序列上有70%相同。
IGF受体共有两类，即IGF-1型受体（GF-1R）和 IGF-2 型受体（GF-2R）。IGF-1和IGF-2主要通过与其受体结合而发挥作用。IGFBP有6种 ( IGFBP1- IGFBP6)，一方面可通过与 IGF 特异性结合调控IGF 活性及消除率发挥生物学作用，另一方面也可对调控细胞产生直接作用。
CHO细胞即中国仓鼠卵巢细胞（Chinese Hamster Ovary Cell），是最具代表性的动物细胞表达系统，被广泛应用于生物制药领域。它建株于1957年，由美国科罗拉多大学Theodore T. Puck从一成年雌性中国仓鼠卵巢中分离得到，是一种连续细胞系，能传百代以上，具有永生性。后来陆续又有很多科学家用药物加压、极端条件筛选和诱导突变等方法筛选得到了一系列不同表型的CHO细胞株，如DUKX-B11、DG-44和CHO-K1等 。
CHO细胞能用于表达各种复杂的重组蛋白。据统计，70%以上的动物细胞表达药物产品都是以CHO细胞为表达宿主。2011年6月批准的 27种单克隆抗体中，其中13种就是通过CHO细胞表达的，占了约50% 的比例。
CHO细胞之所以成为最受欢迎的宿主细胞，主要在于其易于培养以及基因操作 ，而且相比其他表达系统，它还具有许多优点：①具有准确的转录后修饰功能，表达的糖基化药物蛋白在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然蛋白分子；②具有产物胞外分泌功能，便于下游产物分离纯化；③具有外源重组基因的高效扩增和表达能力；④既可贴壁生长也可以进行悬浮培养，且有较高的耐受剪切力和渗透压能力，外源蛋白表达水平较高；⑤CHO细胞属于成纤维细胞，很少分泌自身的内源蛋白，利于外源蛋白的分离纯化。
发明内容
本发明就是为了解决上述技术问题，所提出的一种重组IGF-1蛋白和高效表达及其在促细胞增殖方面的用途。
本发明是按照以下技术方案实现的。
一种重组IGF-1蛋白，所述重组IGF-1蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.1。
进一步的，所述重组IGF-1蛋白的核酸序列为SEQ ID NO.2。
一种上述重组IGF-1蛋白的高效表达方法，包括以下步骤：
a. IGF-1基因克隆及载体质粒的构建
采用DNA全序列合成法来人工合成IGF-1核苷酸序列，核酸序列为SEQ ID NO.2，对应的氨基酸序列为SEQ ID NO.1；将IGF-1核苷酸序列加入酶切位点与pPICZα酵母表达载体连接，连接产物转化DH5α感受态细胞，测序验证；
b.毕赤酵母表达工程菌的转化和制备
将步骤a中构建的pPICZα-IGF-1经限制性内切酶处理后电转化到毕氏酵母菌菌株X33感受态细胞内培养，经抗性选择而获得阳性转化子；
c. 重组酵母工程菌的筛选
将数个含有待表达基因的酵母菌落分别在含有Zeocin抗生素，具有缓冲能力及甘油的基本培养液中培养；培养一段时候后离心收集菌体，菌体再重悬于不含甘油的同种基本培养液内，含0.5%甲醇；每24小时加入100%甲醇至最终浓度为0.5%，在不同的时间点分别收集培养上清液，筛选表达特异蛋白的重组酵母工程菌株；
d.大规模高密度表达、生产和制备重组IGF-1蛋白
使用500L和1000L生物发酵罐系统，取一支工程菌种子库，小规模摇床培养开始，然后扩增到一级种子罐、二级种子罐，进入生产发酵罐；经培养至罐内甘油消耗尽，溶氧随之回至底限再回升时，启动甘油流加；待流加结束，溶氧再回升时，启动甲醇流加，进入诱导和重组蛋白生产阶段，维持72小时甲醇流加。
一种上述重组IGF-1蛋白在促细胞增殖方面的应用。
进一步的，所述细胞为CHO细胞和T细胞。
本发明获得了如下有益效果。
本发明用毕赤酵母表达IGF-1重组蛋白，无细菌内毒素产生。本发明采用毕赤酵母表达系统，大大降低IGF-1蛋白的生产成本，在500L和1000L发酵罐的表达验证结果表明，重组IGF-1的产量可高达10g/L以上，获得了意想不到结果，也获得了极大的潜在的巨大经济效益。
附图说明
图1是本发明pPICZα-IGF-1重组质粒酶切验证图；
图2是本发明IGF-1基因测序结果图；
图3是本发明pPICZα-IGF-1重组毕赤酵母表达工程菌电转后平板生长情况图；
图4是本发明大规模高密度表达重组IGF-1蛋白SDS-PAGE蛋白电泳图；
图5是本发明分泌的重组IGF-1蛋白的纯化图；
图6是本发明HPLC检测纯化后的IGF-1纯度图；
图7是本发明重组IGF-1对重组蛋白表达基因工程CHO细胞具有刺激增生作用图。
具体实施方式
下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述。
实施例1:IGF-1基因克隆及载体质粒的构建
IGF-1核苷酸序列（ID: GenBank: X56773.1）
GGTCCAGAAACTTTGTGTGGTGCTGAATTGGTTGACGCCTTGCAGTTCGTTTGTGGTGACAGAGGTTTCTACTTCAACAAGCCAACCGGTTACGGTTCCTCATCTCGTAGGGCTCCACAAACTGGTATCGTTGACGAGTGTTGTTTCAGATCCTGCGACCTGAGAAGATTGGAGATGTACTGTGCTCCATTGAAGCCAGCTAAGTCTGCT-TGATAA
IGF-1氨基酸序列（ID: UniProtKB - P05019）
GPETLCGAELVDALQFVCGDRGFYFNKPTGYGSSSRRAPQTGIVDECCFRSCDLRRLEMYCAPLKPAKSA
采用DNA全序列合成法来人工合成IGF-1核苷酸序列（由北京擎科新业生物技术有限公司合成）。分别在其N端加上XhoⅠ酶切位点，在其C端加上XbaⅠ酶切位点，用这两个酶分别酶切合成的目的基因和pPICZα酵母表达载体；目的基因与pPICZα酵母表达载体的连接：具体步骤：将酶切后的目的基因与pPICZα酵母表达载体按一定比例混合，并加入连接buffer和连接酶，22℃连接1小时；连接产物转化DH5α感受态细胞，具体步骤：将连接产物加入DH5α感受态细胞，冰浴30分钟，42℃热激90秒，再冰浴2分钟，加入培养基置于摇床中，150rpm，45分钟，12000rpm离心1分钟，涂板。测序验证，具体步骤：挑取单克隆，扩大培养，小量提取质粒，酶切鉴定，如图1所示（泳道L：DNA标准分子量；泳道1：pPICZα-IGF-1重组质粒酶切鉴定结果），pPICZα-IGF-1重组质粒XhoⅠ&XbaⅠ双酶切鉴定，目的条带大小约230bp，与预期目的条带大小一致，挑选出酶切得到与目的片段大小一致的质粒，并进行测序确认，测序引物为P1和P2，测序结果如图2所示（测序由北京擎科新业生物技术有限公司进行）。
P1：CTGGTTCCAATTGACAAGC
P2：CAAATGGCATTCTGACATCC
实施例2:毕赤酵母表达工程菌的转化和制备
将毕氏酵母菌菌株X33菌落接种于含5ml YPD培养液的50ml离心管中，以250转/分的速度于30℃下培养过夜。次日取0.2ml过夜培养物再转接入500ml YPD的培养液中，置于2升的三角培养瓶中。在30℃下旋转培养2-3小时，使细胞密度达到OD600=1.3-1.5。酵母菌经离心方法收集，再重悬于500ml冰预冷的无菌水中洗涤两次。然后酵母菌悬于20ml冰预冷的1MSortbitol溶液洗涤一次。
将实施例1构建的pPICZα- IGF-1质粒DNA经Pme I限制性内切酶处理后，形成线性质粒分子。取5μg线性化后质粒DNA与80μl处理后的酵母菌相混合并置于0.2厘米厚的电极杯内，置于电转仪上。电脉冲条件为电压7500V/CM，电极间隔时间为5-10（ms）。电击处理后，立即加入1ml冰预冷的1M Sorbitol溶液于酵母菌中，然后转入15ml试管中。转化的酵母菌置于30℃培养箱中放置2小时，然后接种涂布在含Zeocin抗生素的YPD平板培养基上（如图3所示）。经抗性选择而生长出的克隆，再用分子生物学方法鉴定其基因的插入。蛋白质的表达与分泌则以SDS-PAGE或用特异抗体做蛋白质免疫印迹检测。
实施例3: 重组酵母工程菌的筛选
将数个含有待表达基因的酵母菌落分别在含有Zeocin抗生素，具有缓冲能力及甘油的基本培养液中培养。以300转/分的速度培养至菌体密度达到OD600=2-6。培养物经1500转/分，15分钟条件下离心收集菌体，菌体再重悬于同种基本培养液但不含甘油，改含0.5%甲醇，细胞密度达到OD600=1.0，继续培养。酵母菌在甲醇的诱导下，外源蛋白在启动子的作用下开始表达。其后，每24小时加入100%甲醇至最终浓度为0.5%。在不同的时间点分别收集培养上清液。使用SDS-PAGE变性聚丙烯酰胺凝胶电泳初步测定IGF-1重组蛋白的表达，筛选表达特异蛋白的重组酵母工程菌株。
实施例4: 大规模高密度表达重组IGF-1蛋白
使用500L和1000L（吨级）生物发酵罐系统开展IGF-1重组蛋白的吨级规模化生产和发酵工艺以及公斤级重组IGF-1蛋白的制备工艺和技术建立。重组酵母工程菌按上述方法研发的工艺程序制备工程菌种子库。取一支工程菌种子库接种到三角瓶中，从小规模摇床培养开始，然后扩增到一级种子罐、二级种子罐，进入生产发酵罐（1吨体积）。经培养至罐内甘油消耗尽，溶氧随之回至底限再回升时，启动甘油流加。待流加结束，溶氧再回升时，启动甲醇流加，进入诱导和重组蛋白生产阶段，维持72小时甲醇流加。可在不同培养时间点取样测试重组蛋白的表达。对于分泌型蛋白在细胞内及培养液中的含量均用SDS-PAGE方法进行分析，表达水平和纯度在每一步中均进行监测。结果显示发酵液中的重组IGF-1蛋白的表达水平在10g/L以上。图4是本发明大规模高密度表达重组IGF-1蛋白SDS-PAGE蛋白电泳图，泳道M：蛋白质标准分子量（由上至下：97.4kD，66.2kD，43.0kD，31.0kD，20.1kD，14.4kD）；泳道1：1吨发酵罐表达的重组IGF-1，分子量～7.7kD；泳道2：500L发酵罐表达的重组IGF-1，分子量～7.7kD；泳道3：IGF-1重组蛋白对照（购自赛默飞公司）。
实施例5: 分泌的重组IGF-1蛋白的纯化与特性
重组IGF-1蛋白经酵母工程菌发酵培养直接分泌到上清液。经连续流离心将含有分泌出的重组IGF-1蛋白上清液与菌体分离后，直接上美国GE公司的MMC分离填料介质，用柱层析法将目标蛋白质收集，纯化方法：25mM NaAc-HAc pH5.0平衡液平衡纯化柱并上样，50mMPB pH 7.0将杂蛋白洗脱，50mM PB pH 7.0，0.6M NH4Cl，将目的蛋白洗脱。进入下一步疏水型层析柱的精纯，纯化方法：50mM PB pH 7.0，1.2M NH4Cl的平衡液平衡纯化柱并上样，20mM PB pH 7.0将目的蛋白洗脱。再进入下一步离子交换层析柱的精纯，纯化方法：50mMTris-HCl pH7.3的平衡液平衡纯化柱并上样，50mM Tris-HCl+300mM NaCl pH7.3，将目的蛋白洗脱，得到纯度达98%以上的重组IGF-1。另，纯化过程中所用试剂均是去除内毒素的，具体方法：用0.5摩尔的氢氧化钠冲洗出液口和排压口直至流出碱后继续冲洗3个柱体积，之后用纯水冲洗5个柱体积，即可过滤纯化试剂。利用常规方法来决定蛋白质的浓度，如Lowyr法蛋白质浓度测定方法。精纯后，重组IGF-1蛋白的纯度可达98%以上。图5是本发明分泌的重组IGF-1蛋白的纯化图，图A：GE MMC分离填料介质纯化结果；图B：PHP疏水柱纯化结果；图C：QFF离子交换柱纯化结果。
实施例6:纯化后的IGF-1内毒素测定
测定方法依据中华人民共和国药典2015年版三部通则1143，细菌内毒素检查，测得纯化后重组IGF-1蛋白内毒素含量≤0.5 EU/mg。
实施例7:纯化后的IGF-1纯度测定（HPLC）
岛津LC-10Avp Plus高效液相色谱仪，色谱柱：TOSOH公司TSK-GEL G2000SWXL 7.8×300mm柱。以50mM PB-0.1M NaCl缓冲液，pH7.0为流动相，流速：0.8ml/min，检测波长：280nm。图6是本发明纯化后的IGF-1纯度HPLC检测图。
实施例8: rhIGF-1促细胞增殖实验
（1）CHO细胞株
接种细胞：取对数生长期表达重组蛋白基因工程CHO细胞株（购自赛默飞公司），调整细胞浓度为 5×l04/ml，以每孔100μl体积（100-1000个细胞）接种于无菌96孔培养板中，置于37℃，5% CO2恒温孵箱中培养。
培养细胞：24h后，每孔加100μl含相应浓度IGF-l的培养液。按实验设计分为4组，分别为① 对照组，等量的细胞培养液；② IGF-l：50ng/ml组，③ IGF-l：100ng/ml组，④IGF-l：150ng/ml组，分别检测不同剂量的 IGF-l对CHO细胞培养不同时段的细胞增殖情况的影响。
在显微镜下以计数板计数法测定不同剂量的重组IGF-1产生的单位细胞增殖数量。
结果表明加入不同量的重组IGF-1，表达重组蛋白质的基因工程CHO细胞均有显著快速增殖的效果（图7），其中使用100ng/ml剂量添加的重组IGF-1的细胞增殖效果为上限，高于这个剂量的使用也没有获得更高的细胞增殖和速率增加。
CHO细胞在重组IGF-1作用下的增殖曲线图见图7。
（2）T细胞
健康人外周血T细胞的分离和培养：新鲜抗凝外周血梯度离心后吸取单个核细胞，再经尼龙毛柱获得T淋巴细胞。
接种细胞：取上述细胞，调整细胞浓度为 1×l05/ml，以每孔100μl体积接种于无菌96孔培养板中，在含 PHA（10mg/L）的RPMI 1640（含10% 胎牛血清）培养液中，置于37℃，5% CO2恒温孵箱中培养。
培养细胞：24h后，每孔加100μl含相应浓度IGF-l的培养液。按实验设计分为4组，分别为① 对照组，等量的细胞培养液；② IGF-l：50ng/ml组，③ IGF-l：100ng/ml组，④IGF-l：150ng/ml组。
MTT呈色：培养72h，每孔加入 MTT 溶液（5 mg/ml 用 PBS 配）20μl。继续孵育4小时，终止培养，离心后再吸弃孔内培养上清液。每孔加入 150μl DMSO，振荡10分钟，使结晶物充分融解。
比色：选择490nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果，可见加入IGF-1可以促进T细胞的增殖，见下表。
序列表
<110> 天津林达生物科技有限公司
天津溥瀛生物技术有限公司
<120> 重组IGF-1蛋白和高效表达及其在促细胞增殖方面的用途
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 70
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 1
Gly Pro Glu Thr Leu Cys Gly Ala Glu Leu Val Asp Ala Leu Gln Phe
1 5 10 15
Val Cys Gly Asp Arg Gly Phe Tyr Phe Asn Lys Pro Thr Gly Tyr Gly
20 25 30
Ser Ser Ser Arg Arg Ala Pro Gln Thr Gly Ile Val Asp Glu Cys Cys
35 40 45
Phe Arg Ser Cys Asp Leu Arg Arg Leu Glu Met Tyr Cys Ala Pro Leu
50 55 60
Lys Pro Ala Lys Ser Ala
65 70
<210> 2
<211> 216
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 2
ggtccagaaa ctttgtgtgg tgctgaattg gttgacgcct tgcagttcgt ttgtggtgac 60
agaggtttct acttcaacaa gccaaccggt tacggttcct catctcgtag ggctccacaa 120
actggtatcg ttgacgagtg ttgtttcaga tcctgcgacc tgagaagatt ggagatgtac 180
tgtgctccat tgaagccagc taagtctgct tgataa 216
Claims (5)
1.一种重组IGF-1蛋白，其特征在于：所述重组IGF-1蛋白的氨基酸序列为SEQ IDNO.1。
2.据权利要求1所述的一种重组IGF-1蛋白，其特征在于：所述重组IGF-1蛋白的核酸序列为SEQ ID NO.2。
3.一种权利要求1、2所述重组IGF-1蛋白的高效表达方法，其特征在于，包括以下步骤：
a. IGF-1基因克隆及载体质粒的构建
采用DNA全序列合成法来人工合成IGF-1核苷酸序列，核酸序列为SEQ ID NO.2，对应的氨基酸序列为SEQ ID NO.1；将IGF-1核苷酸序列加入酶切位点与pPICZα酵母表达载体连接，连接产物转化DH5α感受态细胞，测序验证；
b.毕赤酵母表达工程菌的转化和制备
将步骤a中构建的pPICZα-IGF-1经限制性内切酶处理后电转化到毕氏酵母菌菌株X33感受态细胞内培养，经抗性选择而获得阳性转化子；
c. 重组酵母工程菌的筛选
将数个含有待表达基因的酵母菌落分别在含有Zeocin抗生素，具有缓冲能力及甘油的基本培养液中培养；培养一段时候后离心收集菌体，菌体再重悬于不含甘油的同种基本培养液内，含0.5%甲醇；每24小时加入100%甲醇至最终浓度为0.5%，在不同的时间点分别收集培养上清液，筛选表达特异蛋白的重组酵母工程菌株；
d.大规模高密度表达、生产和制备重组IGF-1蛋白
使用500L和1000L生物发酵罐系统，取一支工程菌种子库，小规模摇床培养开始，然后扩增到一级种子罐、二级种子罐，进入生产发酵罐；经培养至罐内甘油消耗尽，溶氧随之回至底限再回升时，启动甘油流加；待流加结束，溶氧再回升时，启动甲醇流加，进入诱导和重组蛋白生产阶段，维持72小时甲醇流加。
4.一种权利要求1、2所述重组IGF-1蛋白在促细胞增殖方面的应用。
5.根据权利要求4所述的一种重组IGF-1蛋白在促细胞增殖方面的应用，其特征在于：所述细胞为CHO细胞和T细胞。
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-
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- 2018-10-18 CN CN201811217207.9A patent/CN109320601A/zh active Pending
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