CN101974536B - 重组人干扰素β1a基因、其表达载体和重组人干扰素β1a的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种重组人干扰素β1a基因、其表达载体和重组人干扰素β1a的制备方法。重组人干扰素β1a基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，通过将重组人干扰素β1a基因与质粒pSV2-dhfr连接构建质粒表达载体，并将所述质粒载体转入CHO-DHFR-细胞，构建基于真核细胞的表达系统。本发明还公开了在CHO细胞表达体系中生产所述重组人干扰素β1a蛋白的方法，并对各步骤进行了优化，产生的重组人干扰素β1a蛋白比活达到1.62×10⁸IU/ml。

Description

重组人干扰素β1a基因、其表达载体和重组人干扰素β1a的制备方法

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，更具体地说涉及一种用DNA重组技术合成的人干扰素β1a、其表达载体、在CHO细胞中高效表达及其蛋白的制备方法。

背景技术

干扰素(interferon，IFN)是1957年英国科学家Isaacs和Lindenmann在研究病毒干扰现象时发现的一类分泌性蛋白，具有抗病毒活性、激活自然杀伤细胞、抑制肿瘤细胞增殖及免疫调节等作用，是临床上广泛应用的生物制剂。

天然IFN按动物来源分类可分为人干扰素(HuIFN)、牛干扰素(BovIFN)等，按IFN的分子结构、抗原特异性和细胞来源可分成不同的型别。根据人不同细胞产生的干扰素分子结构和抗原性的差别，将白细胞干扰素、成纤维细胞干扰素和免疫干扰素分别命名为IFN-α、IFN-β和IFN-γ。

人干扰素β分子含166个氨基酸，在80位氨基酸有一个N-糖基位点，天然干扰素β分子量为23kDa，含有3个半胱氨酸，分别在17、31和141位氨基酸。31与141位半胱氨酸之间形成的分子内二硫键对于IFN-β生物学活性非常很重，141Cys被Tyr替代后则完全丧失抗病毒作用，而Cys17被Ser替代后不仅不影响生物学活性，反而是使IFN-β分子稳定性更好。糖基对生物学活性无影响。IFN-β的生物学作用有较强的种属特异性。

由于天然干扰素需要从人体分离纯化获得，费时费力，为临床研究和应用带来很大的局限性，国内外均已利用基因工程技术在外源基因表达系统中表达、生产重组人IFN，并投入抗病毒和肿瘤治疗的临床研究。

重组IFN-β有大肠杆菌、酵母和中国仓鼠卵巢成纤维(CHO)细胞三种表达体系。哺乳动物真核细胞体系表达重组药物具有活性高、半衰期长、蛋白质可以正确折叠等优点，有极大的开发利用价值。目前FDA批准的重组干扰素蛋白药物有70％为真核细胞生产的，而同类国内产品均为大肠杆菌发酵生产。

申请日为1985年7月31日的美国专利US4966843公开了一种质粒表达载体以及通过该质粒表达载体在CHO细胞中生产人干扰素β的方法，但该方法生产的人干扰素β蛋白的活性较低。

因此开发一种稳定的能够高效表达干扰素β的真核细胞表达体系，并使表达量达到生产应用的先进水平，不但可以巩固国内市场，还可进一步开拓国际市场，对于提高产品质量、广泛地治疗人类的疾病具有重要意义。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种重组人干扰素β1a基因，建立可在CHO细胞中稳定、高效表达人干扰素β1a的方法，为工业化生产人干扰素β1a，提高产品质量和生产效率，改善人类健康奠定了技术基础。

通过因特网上的NCBI genebank检索得到β1a的cDNA全基因序列，为了提高表达后蛋白质的稳定性，本发明对其进行修饰，合成引物后经PCR扩增得到重组人干扰素β1a基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.1(图1)所示。

本发明另一个目的提供含有上述重组人干扰素β1a基因的质粒表达载体，使用了质粒pSV2-dhfr，其带有Bam H I、Eco RI酶切位点，将经Bam H I、EcoRI双酶切后的重组人干扰素β1a基因与所述质粒连接，形成本发明的质粒载体。本发明的质粒载体具有如图5所示结构。

本发明的再一个目的在于提供包含上述质粒表达载体的宿主细胞，将所述质粒载体转入CHO-DHFR^-细胞，构建了基于真核细胞的表达系统。

本发明还提供了在CHO细胞表达体系中生产所述重组人干扰素β1a蛋白的方法，包括以下步骤：

(1)根据人干扰素β1a的核苷酸序列合成重组人干扰素β1a基因；

(2)将重组人干扰素β1a基因连接到质粒载体pSV2-dhfr中，构建含有所述重组人干扰素β1a基因的质粒表达载体；

(3)将所述质粒表达载体转入CHO-DHFR^-细胞，构建基于真核细胞的表达系统；

(4)在所述基于真核细胞的表达系统中表达重组人干扰素β1a蛋白；

(5)分离并纯化所述重组人干扰素β1a蛋白。

其中，所述步骤(2)中质粒载体pSV2-dhfr先经磷酸化处理，通过BamHI和EcoR I双酶切将重组人干扰素β1a基因与质粒pSV2-dhfr连接。步骤(3)中，所述表达载体通过内切酶进行线性化处理，所述内切酶为Nde I和EcoR I，优选使用EcoR I。

步骤(4)是在氨甲基蝶呤(MTX)的存在下进行，并且优选的MTX浓度为1×10^-7至2×10^-7mol/l之间。

步骤(4)首先采用转瓶培养方式，培养周期为12-24天，每3天换液一次，优选的血清用量在上转瓶时和第一次换液时为10％，第二次、第三次换液为5％，以后均为3％；优选的pH为7.1-7.4，温度为37-38.5℃；接着可采用生物反应器培养方式，优选采用灌流培养，培养周期为20-60天，优选20-45天，接种浓度为0.5×10⁵～5×10⁵cells/ml，灌流速度为0.74L/天-5.55L/天，搅拌速度为140转/分钟。

步骤(5)中，进一步包括如下步骤：

a)将细胞培养液离心，超滤浓缩，得到超滤产品；

b)将超滤产品经蓝标亲和层析分离，得到层析样品，洗脱液为含2mol/LNaCl和60％乙二醇的Tris-HCl缓冲液；

c)将上述层析样品脱盐，得到脱盐产品，洗脱液为20mmol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液；

d)将脱盐产品经CM离子交换层析分离，洗脱液为含0～1mol/LNaCl的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，得到最终蛋白产品。

通过本发明上述方法分离纯化得到的最终蛋白产品，其纯度达到96％以上，蛋白比活为1.62×10⁸IU/mg。

本发明的有益效果是：

(1)合成经修饰的人干扰素β1a基因，并大量扩增，将该干扰素β1a基因连入合适的载体，完成工程载体的构建，使人干扰素β1a基因在CHO细胞中成功表达；

(2)将高表达水平的CHO细胞进行转瓶放大培养，优化了细胞培养条件，进一步在生物反应器上用微载体连续流培养，对各种培养条件进行了优化，使细胞表达干扰素的水平达到了工业生产的要求；

(3)设计和优化了从细胞培养液纯化干扰素的工艺，确定了简便的纯化工艺，获得高的回收率和较好的纯化效果。

附图说明

图1显示本发明重组的干扰素β1a基因序列；

图2显示重组人干扰素β1a的质粒表达载体的构建流程；

图3显示PSV2-dhfr质粒图；

图4显示PSV2-dhfr过Bam HI和Eco RI酶切后的质粒图；

图5显示PSV2-dhfr经Bam HI和Eco RI酶切后与IFN-β1a的连接图；

图6A和6B显示MTX浓度对重组人干扰素表达的影响；

图7显示转染后CHO细胞的重组人干扰素β1a表达水平的稳定性；

图8显示转瓶培养第3天、12天、18天、24天和30天细胞的生长状况和干扰素表达情况；

图9显示批次培养和灌流培养对CHO细胞生长的影响；

图10显示不同的细胞接种密度对CHO细胞生长的影响；

图11显示培养CHO细胞分泌干扰素β1a中罐流速度和葡萄糖浓度的比较；

图12显示培养期间取样进行细胞记数和蛋白活性分析的细胞动力学曲线；

图13显示灌流培养过程中搅拌速度和溶解氧的关系；

图14显示灌流培养过程中搅拌速度、灌流量与干扰素β1a表达的关系；

图15显示蓝标亲和层析中洗脱缓冲液对分离效果的影响；

图16显示蓝标色谱层析样品SDS电泳图，其中1为蛋白质标记，2为细胞培养液，3为超滤液，4为蓝标色谱层析样品；

图17显示CM离子交换层析色谱图；

图18显示CM亲和层析样品SDS电泳图，其中1为蛋白质标记，2为细胞培养液，3为超滤液，4为CM离子交换色谱样品；

图19显示Quantity One 1-D分析图，其中A为蓝标纯化样品，B为CM柱纯化样品。

具体实施方式

实施例1-4描述工程质粒psv2-dhfr-IFN-β1a的构建材料

菌株：大肠杆菌JM109，购于上海超研生物科技有限公司；载体pUC57，南京金斯瑞生物科技有限公司；psv2-dhfr购自ATCC。

主要试剂：

限制性内切酶EcoR I，Bam HI购自东洋纺生物技术有限公司。Taq DNA聚合酶，Pfu DNA聚合酶，超纯dNTPs，DNA Marker DL2000，λHind III购自北京鼎国生物技术有限公司。引物由上海生工生物工程有限公司合成。氨苄青霉素购自Sigma公司。感受态细胞，大量质粒提取试剂盒，DNA纯化、回收试剂盒、碱性磷酸酶购自Takara Biotech公司。

琼脂糖电泳缓冲液50xTAE：242g Tris，57.1ml冰乙酸，18.6g EDTA。EB溶液：100ml无菌水中溶入1g溴化乙锭。DNA载样液：0.25％溴酚蓝，0.25％二甲苯青，50％甘油。

LB液体培养基：胰蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 10g。LB固体培养基：在LB液体培养基中加入1.5％的琼脂粉，高压灭菌，铺平板后4℃保存。2YT液体培养基：1.6％胰蛋白胨，1％酵母抽提物，0.5％NaCl，用蒸馏水配置，pH＝7.0。TE缓冲液：10ml Tris-HCl(pH7.6)，1mM EDTA。

用于小量制备质粒DNA的碱裂解缓冲液：

溶液I：50mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris·HCl(pH8.0)，10mmol/L EDTA(pH8.0)，在6.895×10⁴Pa高压下蒸气灭菌15min后，保存于4℃；

溶液II：0.2mol/L NaOH，1％ SDS；

溶液III：5mol/L乙酸钾60ml，冰乙酸11.5ml，水28.5ml，所配溶液中钾浓度为3mol/L，乙酸浓度为5mol/L。

实施例1 干扰素β1a基因的PCR扩增

1、目的基因的获得：

通过因特网上的NCBI genebank检索得到干扰素β1a的cDNA全基因序列，为了提高表达后蛋白质的稳定性，本发明将干扰素β1a的17位半胱氨酸进行了修饰，得到重组人干扰素β1a基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

将重组干扰素β1a基因克隆到载体pUC57，受体菌为大肠杆菌DH5α菌株。培养含有IFN-β1a基因的大肠杆菌DH5α菌株，使用质粒提取试剂盒提取出pUC57-IFN-β1a。

2、质粒DNA的小量制备：

(1)将菌培养物倒入1.5ml微量离心管中，用微量离心机12,000rpm离心30s，倒尽培养液；

(2)用400μl TE溶液重悬、洗涤沉淀后，12000rpm离心30s，倒尽上清液；将细菌沉淀重悬于90μl用冰预冷的溶液I中，将菌体混匀，使菌体在溶液I中完全分散，然后加入10μl的50mg/ml溶菌酶溶液，混匀，在4℃放置1小时；

(3)加入200μl新配置的溶液II，盖紧管口，快速颠倒离心管数次，以混合内容物，确保离心管的整个内表面均与溶液II接触，将离心管放置于冰上5min；

(4)加150μl用冰预冷的溶液III，盖紧管口，将管倒置后温和振荡10s，将管置于冰上3-5min，12,000rpm离心5min，将上清液转移到另一离心管中；

(5)加入等量的酚∶氯仿∶异戊醇，振荡混匀，12000rpm离心几分钟，将上清液移到另一离心管中；

(6)用2倍体积的乙醇于室温沉淀双链DNA，然后12000rpm离心5min，倒去上清后，用70％乙醇洗涤DNA沉淀后，将离心管倒置于一张吸水滤纸上，吸尽残液，使核酸沉淀干燥，然后保存，或用TE缓冲液重新溶解后，贮存于-20℃冰箱。

3、引物设计：

根据公司保存的原核表达载体序列和保存资料中的基因序列，以及目标载体中的酶切位点设计了高选择性引物，设计软件采用Primer Premier 5。

上游引物：AgT CgA TAT ggA TCC ATg AgC TAC AAC TTg CTT g

下游引物：CCT ACA Cgg AAT TCT TCA gTT TCg gAg gTA ACC Tg

4、目的基因的PCR扩增：

PCR反应体系：

人工合成的人干扰素β基因   1μl

PCR缓冲液                  10μl

dNTP                       4μl

上游引物                   1μl

下游引物                   1μl

Tag DNA聚合酶              1μl

Pfu聚合酶                  1μl

重蒸水                     81μl

Total                      100μl

反应条件如下：1)94℃，3min；2)94℃，45s；3)45-50℃，45s；4)72℃，45s；5)72℃，10min。2)-4)步骤循环36次。反应完成后，采用1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。

实施例2 PCR产物的凝胶回收和双酶切

用TAE缓冲液制作琼脂糖凝胶，对目的基因进行琼脂糖凝胶电泳。在紫外灯下切出含有目的基因的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面的液体。为了加快之后进行的胶块融化，将碎胶块，称得胶块重量共0.63g，管A为0.32g，管B为0.31g，分别向管A和B加入胶块融化液DR-I Buffer 960μl和930μl，均匀混合后于75℃加热融化胶块。向上述胶块融化液中加入DR-I Buffer量的1/2体积量的DR-II Buffer，制得均匀混合的溶液。将试剂盒中的Spin Column安置于Collection Tube上，并将上述均匀混合的溶液转移至Spin Column，12000rpm离心10min，弃滤液。然后加入500μl RinseA，12000rpm离心30s，弃滤液，并重复操作一次。将Spin Column安置于新的1.5ml的离心管上，在SpinColumn膜的中央处加入25μl的灭菌蒸馏水，室温静置1min，12000rpm离心，1min洗脱DNA。

双酶切反应条件：

Buffer H        2μl

DNA             5μl

EcoR I          0.5μl

BamH I          0.5μl

超纯水          12μl

Total           20μl

酶切产物的回收和纯化：通过Gel Extraction Kit回收目的基因片段。将100μl PCR产物在1％的琼脂糖凝胶中电泳，切下含有目的基因的琼脂糖凝胶块，称重后加入3倍体积的Binding Buffer缓冲液(1g凝胶相当于1ml BindingBuffer)，在60℃水浴中溶解凝胶块，等完全溶解后将凝胶加入到DNA结合柱上，每个柱子加入800μl液体，10000rpm离心1min，将流出液再挂一次柱子以提高回收率，再10000rpm离心1min，弃废液。用700μl洗涤缓冲液洗柱子，10000rpm离心1min，再重复洗一次。将空DNA结合柱子离心1min，弃废液，换上新Eppendorf管，用30μl无菌重蒸水或TE Buffer在10000rpm下离心1min洗脱DNA，DNA溶液在-20℃冰箱保存并测序。

实施例3 psv2-dhfr质粒的扩增、双酶切以及磷酸化

1、大肠杆菌JM109感受态细胞的制备

2YT培养基的配制：胰酶蛋白胨16g，酵母提取物10g，氯化钠5g，溶于1L水中，高温灭菌备用。

铺平板和细菌扩增：将甘油保藏的菌种200μl接种于装有10ml LB培养液的50ml试管中于37℃振荡(250rpm)培养过夜；向两个内装200ml LB培养液的1L三角瓶中各加入4ml过夜培养细胞，于37℃下振荡培养至光密度(OD600)值介于0.5-0.6之间(约需1-2h)；将每份细胞培养物分别倒入一个预先冰浴的无菌250ml离心瓶并置于冰上保持20min，于4℃下8000rpm离心10min，弃上清；将每份沉淀轻缓地悬于100ml冰冷的0.1mol/L MgCl₂(pH 7.2)溶液中，按上述方法再次离心；去上清，并将每一沉淀轻缓地悬浮于20ml冰冷的含20％甘油的0.1mol/L CaCl₂(pH7.2)溶液中；每管1ml分装于40个1.5ml Ep管中，-80℃冷冻贮存备用。

2、psv2-dhfr质粒的转化

将200μl Ep管放在-20℃冰箱中预冷。从-80℃冰箱中取出感受态细胞，立即放入冰中。细胞融化后，取100μl放入预冷的Ep管中，在冰上放置10min；加入1μl酶切产物，在冰上冷却30min，将混合物在42℃热休克30s(勿摇晃)后立即放到冰浴中冷却2min，加入800μl SOC培养基37℃下振荡培养1h，涂平板。每个平板首先涂布20～40μl 500X氨苄青霉素，放在通风橱中风干。然后分别取10μl、100μl、250μl和640μl的培养液涂布于平板上。风干后倒置于培养箱中37℃过夜培养。

3、质粒的提取

大肠杆菌的培养：从平板培养基上挑选单菌落接种至1-4ml的含有抗生素的液体培养基中，37℃过夜培养。取1-4ml的过夜培养菌液，12000rpm离心2min，弃上清。用250μl的溶液I(含RnaseA)充分悬浮细菌沉淀，加入250μl的溶液II轻轻地上下翻转混合5-6次，使菌体充分裂解，形成透明溶液；加入400μl的4℃预冷的溶液III，轻轻上下翻转混合5-6次，直至形成紧实凝集块，然后室温静置2min；室温12000rpm离心10min，取上清液；将试剂盒的Spin Column安置于Collection Tube上；将上述上清液转移至Spin Column中，12000rpm离心30s，弃滤液。将500μl RinseA加入Spin Column中，12000rpm离心30s，弃滤液。将700μl RinseB加入Spin Column中，12000rpm离心30s，弃滤液，重复操作一次。将Spin Column安置于新的1.5ml的离心管上，在SpinColumn膜的中央处加入60μl灭菌蒸馏水或析出缓冲液(Elution Buffer)，室温静置1min，12000rpm离心1min洗脱。

4、质粒的酶切

将转化后的单克隆菌落放大培养后按照质粒提取的方法提取出psv2-dhfr，并通过琼脂糖凝胶电泳纯化回收。在与双酶切目的基因同样条件下用Eco RI和Bam H I酶切后再纯化回收。

质粒的单酶切反应体系：

Buffer K    2μl       Buffer H     2μl

DNA         5μl       DNA          5μl

Bam H I     0.5μl     EcoR I       0.5μl

超纯水      12.5μl    超纯水       12.5μl

Total       20μl      Total        20μl

质粒的双酶切反应体系：

Buffer H      2μl

DNA           5μl

EcoR I        0.5μl

Bam H I       0.5μl

超纯水        12μl

Total         20μl

37℃恒温反应1.5h后，用1％琼脂糖凝胶进行胶回收。

5、质粒的磷酸化

质粒的磷酸化可以去除载体DNA片段的5’-末端的磷酸基，为了避免质粒的自连接，必须进行磷酸化处理。

磷酸化反应体系：

DNA片段                    1-20pmol

10×碱性磷酸酶缓冲液       5μl

CIAP(10-30V/μl)           1-2μl

dH₂O                       定容至50μl

磷酸化步骤：在微量离心管中配制上述反应液，全量定容至50μl，37℃或50℃反应30min，用苯酚/氯仿/异戍醇(25∶24∶1)抽提2次，氯仿/异戍醇(24∶1)抽提1次，加入5μl 3M的NaoAC，加入125μl(2.5倍量)冷乙醇，在-20℃下保冷30-60min，离心分离回收沉淀，用200μl 70％冷乙醇洗净后，减压干燥，用20μl以下的TE Buffer溶解沉淀。

实施例4 人干扰素β1a基因与psv2-dhfr载体的连接、转化与鉴定

1、连接与转化

采用连接试剂盒连接双酶切后的目的基因IFN-β1a与载体psv2-dhfr质粒。将IFN-β1a溶解液7μl，psv2-dhfr质粒溶解液3μl，加入溶液I 10μl，总共20μl，16℃下连接1h。将连接产物转化感受态大肠杆菌，将200μl Ep管放在-20℃冰箱中预冷。从-80℃冰箱中取出致敏细胞，立即放入冰中。细胞融化后，取100μl放入预冷的Ep管中，轻轻混合，在冰上放置10min，每两分钟轻晃几下。涂平板，每个平板首先涂布20～40μl 500X氨苄青霉素，放在通风橱中风干。然后分别梯度培养液涂布于平板上。风干后倒置于培养箱中30℃过夜培养。

2、表达载体psv2-dhfr-IFN-β1a的鉴定

选取平板上的单克隆细胞菌落，挑取部分单菌落接种于5ml 2YT培养液中培养过夜。将0.5ml培养的菌液与0.5ml 50％的甘油混合于-40℃～-70℃保存。其余培养液离心，提取表达载体用限制性内切酶Bam HI和EcoR I酶切，然后进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果显示，与预期得到的基因大小相一致，表明表达载体psv2-dhfr-IFN-β1a构建成功。

实施例5-7 描述细胞转染和单克隆筛选

材料

CHO-dhfr购自ATCC，WISH公司保存。

主要试剂

IMDM培养基、DMEM培养基、新生牛血清均购自Gbico公司。二甲基亚砜、链霉素、卡那霉素、胰蛋白酶均购自Sigma公司。氨甲基喋呤购自CALBIOCHEM公司。胸苷购自上海华舜生物工程有限公司。次黄嘌呤购自BBI公司。

PBS取NaCl 8.0g、KCl 0.2g、Na₂HPO₄ 1.44g、KH₂PO₄ 0.24g，加水溶解并定容到1000ml，121℃下15min灭菌。

动物细胞基因组提取试剂盒。琼脂糖电泳缓冲液：50×TAE：242gTris，57.1ml冰乙酸，18.6g EDTA定容至1000ml，平时稀释到4×备用。EB溶液：100ml无菌水中溶入1g溴化乙锭，完全溶解后分装避光保存。DNA载样液：0.25％溴酚蓝，0.25％二甲苯青，50％甘油。TE缓冲液：10ml Tris-HCl(pH7.6)，1mM EDTA。

干扰素活性测定试剂 RPMI1640培养基：取1L规格RPMI1640培养基1袋，加800ml水溶解，加入青霉素和链霉素各10⁵IU，再加入碳酸氢钠2.1g，溶解后定容到1L，混匀，除菌过滤后4℃保存。完全培养基：取新生牛血清10ml，加入RPMI1640培养基90ml，4℃保存。测定培养基：取新生牛血清7ml，加入RPMI1640培养基93ml，4℃保存。攻毒培养基：取新生牛血清3ml，加入RPMI1640培养基97ml，4℃保存。消化液：取EDTA 0.2g、NaCl 8.0g、KCl0.2g、Na₂HPO₄ 1.152g、KH₂PO₄ 0.2g，加水溶解并定容到1000ml，121℃下15min灭菌。染色液：取结晶紫50mg，加入无水乙醇20ml溶解后加水稀释到100ml。脱色液：取无水乙醇50ml，乙酸0.1ml，加水稀释到100ml。

实施例5 CH0细胞的培养

1、CHO-dhfr细胞的复苏

从干冰或液氮中取出冷冻管，迅速投入37～38℃水浴中，约1min，使其融化。室温下于5min内用血清培养液稀释道原体积的4倍。500～800rpm离心10min。除去上清液，加入新鲜的培养液。一天后换液。刚复苏的细胞生长缓慢，传代后恢复正常。

2、细胞的传代、冻存

传代，弃去旧培养液，PBS洗一次，加入25％胰酶消化液，静置40-60s。细胞开始脱落时加入含血清培养液中止消化，用移液管反复轻微吹打，至成细胞悬液后按细胞密度稀释到所需比例转移到新细胞瓶中培养。

冻存，将单层细胞用胰蛋白酶消化后用细胞培养液制成细胞悬浮液，调节细胞数约106细胞/ml，800-1000rpm离心20s，去上清。加入含有10％二甲基亚砜和10％小牛血清的培养液。细胞悬浮液按每个2ml的冷冻管加入1ml的量分装，记上细胞株名和冷冻日期。先放到-20℃冰箱冻2h，再放到-70℃冰箱冻3h，最后放入液氮罐中保存。

实施例6 表达载体psv2-dhfr-IFN-β的转染

1、CHO-dhfr-细胞对氨甲基蝶呤(MTX)敏感剂量检测

在24孔板中，每孔接种1×10⁵细胞，加入不同浓度的MTX，2周后观察细胞生长状况。结果如下表1所示。

表1 CHO-dhfr-细胞对MTX的耐受程度

-：细胞正常生长；+：部分细胞变型；++：大量细胞死亡；+++：全部细胞死亡

由于CHO-dhfr^-细胞的生长需要添加胸苷和次黄嘌呤，因此完全培养基中需加入这两种营养。当将培养基换成普通培养基时细胞也能继续分裂数次，但在随后的持续培养过程中，活细胞并不死亡，只是在慢慢衰老，但当培养基中加入1×10^-7mol/L的MTX后该缺陷型细胞全部死亡，因此本发明在初筛过程中选择的MTX浓度为1×10^-7mol/L。

2、表达载体的线性化处理

研究发现，未经过单酶切处理的表达载体无法转染入CHO-dhfr^-细胞。为了保证DHFR基因(细胞从缺陷型恢复为野生型必须的基因片段，不能破坏)和Amp基因的完整，根据载体质粒基因图谱，选择Nde I或EcoR I内切酶对表达载体进行线性化处理，其中线性化内切酶中EcoR I的效果要好于Nde I。

酶切条件：

Nde I单酶切

H Buffer               2μl

psv2-dhfr-IFN-β       5μl

Nde I                  0.5μl

dd H₂O                 12.5μl

Total                  20μl

37℃恒温水浴保温1.5h。

EcoRI单酶切

H Buffer               2μl

psv2-dhfr-IFN-β       5μl

EcoRI                  0.5μl

dd H₂O                 12.5μl

Total                  20μl

37℃恒温水浴保温1.5h。

反应完成后将酶切产物进行0.7％琼脂糖凝胶电泳确定大小，然后通过DNA回收试剂盒进行回收纯化。

3、细胞转染

转染前一天，将8×10⁵细胞接种于6孔板，每池中加上3ml培养液，放入37℃ 5％二氧化碳培养箱中培养。转染时细胞饱和度在40％-80％。将2.5μg上述分别用Nde I或EcoRI酶切线性化处理的质粒溶于TE缓冲液，加入无血清、无抗生素、无蛋白培养基到总体积150μl，DNA浓度0.1μg/μl。加入15μl转染试剂到DNA溶液中，上下混合5次或旋转混合10秒，室温放置5-10min，形成复合物。将培养基从培养池中吸出，用4ml PBS，加入3ml新鲜含有血清和抗生素的培养基。取1ml培养基加入转染复合物中上下混合两次，立即将其加入含细胞的6cm池中，轻轻混合。将细胞放入37℃ 5％二氧化碳培养箱中培养，并使重组人干扰素β1a基因表达。

4、稳定的细胞株的获得和活力测定

转染细胞经过MTX的筛选压力淘汰后留下的细胞继续加压筛选，这时将MTX浓度提高到3×10^-7mol/l，绝大部分细胞死亡，将剩余的活细胞按单个克隆转入24孔板培养，每个孔的细胞来自一个克隆，经过一到两周培养后孔中密度达80％时取培养三天的上清液进行测活筛选，将活力高的细胞株转入方瓶培养，冻存。将MTX的筛选浓度提高后可以提高筛选效率，增加获得高表达细胞株的几率。经过筛选，采用psv2-dhfr载体转化的CHO细胞表达表达IFN-β的活性最高为194670IU/mL。

5、转染细胞的确定

将转染后经过筛选后的细胞使用方瓶培养后收集细胞，采用动物细胞基因组提取试剂盒提取细胞的基因组，通过扩增用的PCR引物进行扩增，如能扩增出目的基因则为阳性克隆，否则为假阳性。PCR扩增结果显示目的基因已经成功克隆进CHO-dhfr^-细胞。

6、重组人干扰素β1a基因的活性测定

按照药典的规定采用WISH细胞病变抑制法测定重组人干扰素β1a基因的活性。干扰素可以保护人羊膜细胞(WISH)免受水泡性口炎病毒(VSV)破坏的作用，用结晶紫对存活的WISH细胞染色，于波长570nm处测定其吸光度，可得到干扰素对WISH细胞的保护效应曲线，以此测定干扰素生物学活性。

本实施例分别制备标准品溶液和本发明供试品溶液进行活性测定和比较。

1)标准品溶液的制备

取人干扰素生物学活性测定的国家标准品，按说明书复溶后，用测定培养液稀释至每1ml含1000IU。在96孔细胞板中做4倍系列稀释，共稀释8个稀释度，每个稀释度做2个孔。在无菌条件下操作。

2)本发明供试品溶液的制备

将供试品按标示量溶解后，用测定培养液稀释成每1ml约含1000IU。在96孔细胞板中做4倍系列稀释，共稀释8个稀释度，每个稀释度做2个孔。在无菌条件下操作。

3)测定法

使WISH细胞在培养基中贴壁生长。按1∶2～1∶4传代，每周2～3次，于完全培养液中生长。取培养的细胞弃去培养液，用PBS洗2次后消化收集细胞，用完全培养基配制成每1ml含2.5×10⁵～3.5×10⁵个细胞的细胞悬液，接种于96孔细胞培养板中，每孔100μl。于37℃、5％二氧化碳条件下培养4～6小时。将配制完成的标准品溶液和供试品溶液移入接种WISH细胞的培养板中，每孔加入100μl。于37℃、5％二氧化碳条件下培养18～24h。弃去细胞培养板中的上清液。将保存的水泡性口炎病毒(-70℃保存)用攻毒培养液稀释至100 CCID 50，每孔100μl。于37℃、5％二氧化碳条件下培养24小时。然后弃去细胞培养板中的上清液，每孔加入染色液50μl，室温放置30min后，用流水小心冲去染色液，并吸干残留水分，每孔加入脱色液100μl，室温放置3～5min。混匀后，用酶标仪以630nm为参比波长，在波长570nm处测定吸光度，记录测定结果。在检测过程中我们以干扰素-α国家标准品作对照品的效价在自动酶标仪上计算样品的效价值。

结果显示，本发明的IFNβ1a基因在CHO细胞表达体系的滴度高于对照品。此外本发明的IFNβ1a基因在CHO细胞表达体系的滴度明显高于现有技术中公开的滴度值，说明本表达载体和表达水平优于现有的公开技术，如表2所示。

表2 IFNβ1a基因在CHO细胞表达体系的滴度结果

样品	IFNβ1a的滴度(U/ml)24hrs后
		供试品(本发明)	50,000
对照品(现有技术US4966843)	30,000

实施例7 人干扰素β1a基因的表达及优化

1、MTX浓度对人干扰素β1a基因表达的影响

将转化细胞培养到60％～80％密度后加入不同浓度的MTX进行初步优化。MTX的不同浓度分别为5×10^-8mol/L、1×10^-7mol/L、2×10^-7mol/L、4×10^-7mol/L、1×10^-6mol/L、2×10^-6mol/L，其与干扰素表达水平的函数关系如图6A所示。根据活性测定值以及显微镜检查细胞生长状况，初步确定MTX浓度为5×10^-8mol/l～4×10^-7mol/l。

在相同的条件下，再次选择不同浓度的MTX进一步优化，MTX的浓度分别为5×10^-8mol/l、1×10^-7mol/l、1.5×10^-7mol/l、2×10^-7mol/l、2.5×10^-7mol/l、3×10^-7mol/l，其与干扰素表达水平的函数关系如图6B所示。

实验结果表明，最佳MTX浓度在1×10^-7～2×10^-7mol/l之间。在一定的范围内，细胞表达的干扰素的量和加入的MTX浓度密切相关，在小于1.5×10^-7mol/l的浓度下，干扰素的表达量和MTX的浓度几乎成线性关系，这是由于DHFR基因和干扰素基因是串连关系，在抗生素的压力下，DHFR基因大量表达，由于基因的顺式表达，导致干扰素基因也大量表达，因此此时MTX的浓度对干扰素的表达的影响是正面的。但当MTX的浓度太高，超过细胞的承受极限时MTX就抑制了细胞的新陈代谢，阻止了细胞的分裂，甚至加速细胞的死亡。因此高浓度MTX下干扰素的表达水平就持续下降了。因此转瓶表达时使用1.5×10^-7mol/l浓度的MTX取得最好的表达效果。

2、转染后CHO细胞表达稳定性测试

连续传代的细胞在每次传代后第3天，即再次传代之前的培养液用于测定干扰素活力，统计结果如图7所示。

结果显示，筛选获得的转化细胞连续培养20代表达干扰素水平没有明显变化，因此可以肯定转染细胞的表达水平具有稳定性。

3、转瓶培养条件的优化

使用10％、5％和2％的血清浓度的培养基进行不传代连续培养，观察细胞数的变化和上清液的干扰素活性变化情况。

按照不同的换液时间，2天、3天、4天换液，确定最佳换液间隔时间。

结果发现，使用含10％血清的培养基培养细胞时细胞会快速生长，但在达到最大细胞密度后细胞也迅速老化脱落，虽然表达的干扰素水平比较高，但持续时间短。而选择5％或2％的血清浓度的培养基细胞生长速度下降，达到高密度所需时间变长，但细胞维持活性状态的时间延长，有利于延长表达干扰素的时间。

通过MTX增压干扰素的表达水平从1.9×10⁴IU/ml提高到1.3×10⁵IU/ml。经过转瓶培养优化后干扰素表达水平达到5×10⁵IU/ml。图8显示了3天、12天、18天、24天和30天转瓶细胞的生长状况和干扰素表达情况，细胞亮度变化可以看出3天、12天、18天的细胞亮度很好，说明视野中多为活细胞，24天时细胞亮度下降，说明不少细胞已经死亡，而30天的时候大部分细胞都已经死亡，细胞变形严重，干扰素表达量也大大下降。

因此，本发明优选的培养周期为12-24天，血清用量是上转瓶时和第一次换液时为10％，第二次、第三次换液为5％，以后均为3％。此外，细胞转瓶培养时，温度和pH直接影响细胞的生长状况，整个培养过程中pH控制在7.1-7.4之间，温度不能超过38.5℃，否则会引起转瓶中细胞的大量脱落，导致有效细胞数下降，从而使干扰素的表达量明显降低。温度过低也导致细胞的新陈代谢变慢，同样降低了干扰素的表达量。优选的温度范围是37-38℃。细胞换液间隔时间确定为3天，超过3天会导致细胞代谢物积累过多而使pH快速下降，使细胞产生酸中毒而使细胞衰亡。

4、生物反应器培养条件优化

1)细胞批式培养和灌流培养的比较

比较和验证两种培养方式对CHO细胞生长的不同影响，进行以下试验：两次的细胞接种浓度均为1.0×10⁵细胞/ml。批次培养5天不更换培养液；灌流培养是在接种后12小时开始灌流，灌流速度为0.2V/天(V为罐的有效体积3.7L，相当于0.74L/天)，48小时后改变灌流速度为0.5V/天，一直到5天。每天取载体进行消化计数细胞，算出细胞浓度，比较相同的培养时间不同的培养方式的CHO细胞生长状况，见图9。

结果显示，批次培养过程中的第4天，细胞密度缓慢地达到最大值15×10⁵/ml。而灌流培养过程中，由于培养液的营养成分不断地更新，细胞很快进入了对数生长期。在培养的第4天，细胞密度达到最大值50×10⁵/ml，是批次培养细胞密度最高值的4.3倍，说明罐流培养方式优于批次培养方式，此时灌流速度为1V/day。

2)接种浓度对细胞生长的影响

本实验利用灌流培养，分别采用接种浓度为0.5×10⁵细胞/ml、1.0×10⁵细胞/ml、3.50×10⁵细胞/ml，3次培养均在接种后12小时开始灌流培养，灌流速度为0.2V/天，48小时后改变灌流速度为0.5V/天，直到5天。每天取载体进行消化计数细胞，算出此时的细胞浓度，比较不同的细胞接种密度，在培养过程中的相同培养时间点上CHO细胞生长的状况，见图10。

从图10可以看出，细胞接种量越低，细胞生长的延迟期越长，细胞很长时间才能达到密度最高(如图中接种0.5×10⁵细胞/ml)；细胞接种越大，细胞就会在短时间内达到最高密度，但由于培养过程中培养液营养成分的限制，细胞达到最大密度后，细胞密度会很快降低(如图中接种3.50×10⁵细胞/ml)。以接种细胞密度为1.0×10⁵细胞/ml为最佳结果。

3)培养CHO细胞分泌干扰素β1a中罐流速度和葡萄糖浓度的比较

以培养CHO细胞分泌干扰素时间为横坐标，以罐流速度和葡萄糖浓度分别为纵坐标作图，如图11所示。

结果表明，随着细胞培养时间和罐流速度的增长，培养液中的葡萄糖浓度开始明显下降，通过该实验说明在培养20天左右可以维持细胞较好生长，不必应用高含量葡萄糖的培养基，可以避免由于过度生长产生乳酸或者没有充分利用造成浪费等问题。

4)培养CHO细胞分泌干扰素β1a中细胞密度和蛋白活性的变化

在5L生物反应器中采取连续培养方式培养CHO细胞，分泌干扰素β1a，培养周期为60天，培养期间取样进行细胞记数和蛋白活性分析，绘出细胞动力学曲线如图12所示。

结果表明，刚开始培养初期，细胞处于初始分裂，系统的表达水平明显较低，随着培养时间增加，细胞密度明显呈现对数生长期，从10⁵细胞/ml到10⁸细胞/ml，细胞分泌表达也开始明显提高，从1×10³IU/ml到1×10⁵IU/ml。干扰素β1a的生物活性最高的表达活性出现在培养后的第20天左右，为1×10⁶IU/ml，并在一段时间内(20～40天)基本维持在5～8×10⁷IU/ml范围，在40天到60天，细胞密度有逐渐下降的趋势，但不是非常显著。

5)灌流培养过程中搅拌速度和溶解氧的关系

为考察罐流培养中搅拌速度对细胞的影响，将培养周期中用的搅拌速度和对应的溶解氧进行对比，如图13所示。通过该实验，确定搅拌速度控制在140转以内，培养60天的周期，通过气体进行调节可以使溶解氧维持在30％左右，较好的维持了细胞生长所需要的氧气等。

6)灌流过程中搅拌速度、灌流量与干扰素β1a表达的关系

对罐流速度和蛋白表达活性进行了比较性研究，同时将上面实验中确定的搅拌速度再次进行确定性实验。从培养罐培养的第5天开始进行连续罐流培养，收液和进液速度基本保持一样，进液和收液速度从0.5V/天开始(V为罐的有效体积3.7L)逐渐增加到1V/天再到1.5V/天，最后到约2V/天。收液过程中每天从反应器中取样进行干扰素生物活性的测定，结果见图14。

结果显示，细胞在培养10后，数量明显有上升，第25天，细胞液的干扰素β1a的表达量逐渐提高，从1×10²IU/ml到1×10⁶IU/ml，从25天到45天，细胞分泌基本保持稳定，蛋白表达维持在1×10⁶IU/ml，45天之后，细胞开始明显衰亡，蛋白表达数量开始下降。第25天收获时，细胞液的干扰素β1a的表达量达到了高峰，其取样的生物活性测定值为6×10⁶IU/ml。之后基本维持在这个水平。培养后的第45天，干扰素β1a的表达量降低幅度的加大出现。在后来的重复实验中，将灌流速度从45天开始从2V/day逐渐减低到1V/天，之后干扰素β1a的表达量在1×10⁶细胞/ml左右又维持了10天。

实施例8 重组人干扰素β1a的分离和纯化

主要试剂

福林酚试剂，购自北京鼎国生物技术有限公司。牛血清白蛋白标准溶液：用水稀释到1mg/ml。丙烯酰胺单体溶液：14.55g丙稀酰胺和0.45g N’，N-二亚甲基双丙稀酰胺定容到50ml。浓缩胶缓冲液：1mol/l Tris-HCl，pH6.8。分离胶缓冲液：1.5mol/l Tris-HCl，pH8.8。10％ SDS；10％过硫酸铵；10％ TEMED。染色液：考马斯亮蓝R250lg，200ml甲醇，50ml冰乙酸定容到500ml。脱色液：400ml甲醇、100ml冰乙酸与水定容到1000ml。

实验步骤

1、超滤

细胞培养液经过8000rpm离心后去除其中悬浮的细胞或细胞碎片等有型杂物后，选用截留分子量为10K的膜进行超滤浓缩，处理完样品后膜用1％NaOH清洗，并保存在10％乙醇中防止细菌生长。实验过程中我们通过超滤浓缩将收集的细胞培养液浓缩5倍，而回收率为72％。比活性由5.46×10⁴IU/mg提高到9.52×10⁴IU/mg。

2、蓝标亲和层析

2.6×10 Blue Sepharose层析柱，首先用pH7.2含150mol/L NaCl的Tris-HCl缓冲液平衡，再超滤后样品经过8000rpm离心后上样到层析柱上。上样后经过pH7.2含150mol/L NaCl的20mmol/L Tris-HCl缓冲液平衡液洗脱至基线，然后用含2mol/L NaCl和60％乙二醇的20mmol/L pH7.2Tris-HCl缓冲液洗脱样品。

实验发现，使用含有2M NaCl和60％乙二醇的pH7.2的Tris-HCl洗脱缓冲液取得最好的分离效果。400ml样品上样后经过pH7.2含150mol/l NaCl的20mmol/l Tris-HCl缓冲液平衡液洗脱至基线后，用含2mol/l NaCl的20mmol/lpH7.2Tris-HCl缓冲液洗脱样品得32ml样品(图15)，回收率为86％，比活提高到1.03×10⁸IU/mg。经过蓝标层析纯化后样品仅剩一条杂蛋白带，约56K(图16)。

3、除盐

用5×20 G-25柱脱盐，平衡液和洗脱液为20mmol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液pH5.0，流速15ml/min。

4、CM离子交换层析

采用1ml柱体积的CM离子交换预装柱。缓冲液：20mmol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，pH 5.0。将除盐洗脱收集的样品上CM柱纯化。上样流速0.5ml/min。上样后以5个柱体积缓冲液平衡柱子。用含0～1mol/L NaCl，pH5.0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液线性梯度洗脱，收集目的峰。

色谱图(图17)中峰1为杂蛋白，峰2为干扰素。电泳结果为单带(图18)，回收率为77％，比活提高到1.62×10⁸IU/mg。

5、蛋白质电泳和浓度测定

参照《中华人民共和国药典》2005年第三部，采用lowery法测定样品中的蛋白质浓度。

SDS蛋白质电泳；5％浓缩胶配制：浓缩胶缓冲液0.6ml，水1.4ml，30％丙稀酰胺0.4ml，TEMED 2μl，10％过硫酸铵10μl。15％分离胶配制：分离胶缓冲液0.6ml，水1.0ml，30％丙稀酰胺2.0ml，TEMED 2μl，10％过硫酸铵20μl。样品处理：样品与上样缓冲液1∶1混合后沸水煮5min。各孔上样量为20μl。130V电压恒压电泳1小时后剥离凝胶后用去离子水漂洗，用染色液染色1h，在脱色摇床上脱色，凝胶于扫描仪上以300dpi分辨率扫描。

6、等电聚焦电泳

根据等定聚焦测定干扰素β的等电点为7.03，非糖基化的等电点约6。

7、干扰素分子量和纯度确定

采用Bio-Rad公司的Quantity One-1D软件进行分析，结果如图19所示。其中A图显示经过纯化后样品中除了一条主要杂蛋白带外，基线也不平，说明还有微量其他杂蛋白，只是由于含量低而未看到明显的带。而B图中除了干扰素的带外没有别的蛋白带，基线平滑说明很少有杂蛋白带，根据软件分析确定的A图的干扰素纯度为73％，B图中干扰素纯度达到96％。干扰素β分子量为23.5kDa，未糖基化的干扰素β的分子量为18kDa，说明通过CHO细胞表达的干扰素β1a已经充分糖基化。

表3 纯化过程中各步骤的实验参数和结果

	体积(ml)	蛋白质浓度(mg/ml)	比活力(IU/mg)	纯化倍数	回收率(％)
						培养液	4500	5.5	5.46×105	1	100
超滤	900	14	9.52×105	1.74	72
						蓝标色谱	5	0.51	1.03×108	188	62
CM色谱	10	0.063	1.62×108	296	48

经过以上各个纯化步骤后，本发明获得了比活为1.62×10⁸IU/mg，纯度为96％的重组人干扰素β1a蛋白，总回收率为48％。

10P103860_ST25SEQUENCE LISTING

<110>深圳职业技术学院

<120>重组人干扰素β1a基因、其表达载体和重组人干扰素β1a的制备方法

<130>10P103860

<160>1

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>501

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(501)

<223>重组的干扰素β1a基因序列

<400>1

atgagctaca acttgcttgg attcctacaa agaagcagca attttcaggc ccagaagctc    60

ctgtggcaat tgaatgggag gcttgaatat tgcctcaagg acaggatgaa ctttgacatc    120

cctgaggaga ttaagcagct gcagcagttc cagaaggagg acgccgcatt gaccatctat    180

gagatgctcc agaacatctt tgctattttc agacaagatt catctagcac tggctggaat    240

gagactattg ttgagaacct cctggctaat gtctatcatc agataaacca tctgaagaca    300

gtcctggaag aaaaactgga gaaagaagat ttcaccaggg gaaaactcat gagcagtctg    360

cacctgaaaa gatattatgg gaggattctg cattacctga aggccaagga gtacagtcac    420

tgtgcctgga ccatagtcag agtggaaatc ctaaggaact tttacttcat taacagactt    480

acaggttacc tccgaaactg a                                              501

Claims (7)

1.一种含有重组人干扰素β1a基因的质粒表达载体，其中所述重组人干扰素β1a基因为SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，所述质粒表达载体是通过将BamH I和EcoR I双酶切后的重组人干扰素β1a基因与质粒pSV2-dhfr连接而形成。

2.含有权利要求1所述的质粒表达载体的真核细胞表达系统，其是将所述质粒表达载体转入CHO-DHFR^-细胞中构建而成。

3.一种在CHO细胞表达体系中生产重组人干扰素β1a蛋白的方法，包括以下步骤：

(1)根据人干扰素β1a的核苷酸序列合成权利要求1所述的重组人干扰素β1a基因；

(2)将重组人干扰素β1a基因连接到质粒载体pSV2-dhfr中，构建含有所述重组人干扰素β1a基因的质粒表达载体；

(3)将所述质粒表达载体转入CHO-DHFR^-细胞，构建含有重组人干扰素β1a基因的CHO细胞表达系统；

(4)在所述CHO细胞表达系统中表达重组人干扰素β1a蛋白；

(5)分离并纯化所述重组人干扰素β1a蛋白；

其中，所述步骤(2)中质粒载体pSV2-dhfr先经磷酸化处理，通过BamHI和EcoR I双酶切将重组人干扰素β1a基因与质粒pSV2-dhfr连接。

4.根据权利要求3所述的方法，其中步骤(3)中，所述表达载体通过内切酶进行线性化处理，所述内切酶为Nde I或EcoR I。

5.根据权利要求3所述的方法，其中步骤(4)是在含有氨甲基蝶呤的培养体系下进行细胞培养，所述的氨甲喋呤浓度为1×10^-7至2×10^-7mol/l之间。

6.根据权利要求3所述的方法，其中步骤(4)首先采用转瓶培养方式，培养步骤(3)获得的含有重组人干扰素β1a基因的CHO细胞，培养周期为12-24天，细胞培养液每3天换一次，血清含量在上转瓶时和第一次换液时为10％，第二次、第三次换液为5％，以后均为3％；培养液的pH为7.1-7.4，温度为37-38.5℃；接着采用生物反应器培养方式灌流培养，培养周期为20-60天，接种浓度为0.5×10⁵～5×10⁵细胞/ml，灌流速度为0.74L/天-5.55L/天，搅拌速度为140转/分钟。

7.根据权利要求6所述的方法，其中步骤(5)所述的分离并纯化包括如下步骤：

a)将步骤(4)的细胞培养液离心，超滤浓缩，得到超滤产品；

b)将超滤产品经亲和层析分离，得到层析样品；

c)将上述层析样品脱盐，得到脱盐产品；

d)将脱盐产品经阳离子交换层析分离，得到纯化的蛋白产品。

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