CN116514950A - 一种重组猪α-干扰素的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种重组猪α‑干扰素的制备方法，重组猪α‑干扰素的制备方法包括猪α‑干扰素真核表达载体的构建、重组酵母菌的诱导表达、发酵工艺和后续提取工艺。本发明具有培养成本低、产量高以及便于产物分离纯化等优点，通过酵母表达的α‑干扰素直接以有活性的干扰素的形式分泌在发酵液的上清液中，无需复杂的变复性等后续处理工艺，并且发酵液上清中杂蛋白含量低，易进行大规模的生产。

Description

一种重组猪α-干扰素的制备方法

技术领域

本发明涉及干扰素技术领域，尤其是一种重组猪α-干扰素的制备方法。

背景技术

干扰素(IFN)是一种广谱抗病毒剂，并不直接杀伤或抑制病毒，而主要是通过细胞表面受体作用使细胞产生抗病毒蛋白，从而抑制乙肝病毒的复制，其类型分为三类，α-(白细胞)型、β-(成纤维细胞)型，γ-(淋巴细胞)型；同时还可增强自然杀伤细胞(NK细胞)、巨噬细胞和T淋巴细胞的活力，从而起到免疫调节作用，并增强抗病毒能力。

干扰素是一组具有多种功能的活性蛋白质(主要是糖蛋白)，是一种由单核细胞和淋巴细胞产生的细胞因子。它们在同种细胞上具有广谱的抗病毒、影响细胞生长，以及分化、调节免疫功能等多种生物活性。α-干扰素具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节作用，α-干扰素的免疫调节作用很强，还有增强免疫对病毒感染细胞的免疫杀伤活性，α-干扰素还能增强巨噬细胞的吞噬功能和细胞毒活性。

猪α-干扰素(poIFN-α)是一类具有抗病毒和免疫调节活性的细胞因子，是猪体抵御病原入侵的重要早期防御系统之一。应用基因工程的方法表达重组猪干扰素具有与天然干扰素高度相似的抗病毒等生物学活性，因此重组猪干扰素可以作为一类高效的抗病毒和免疫调节生物制剂。其作用机制表现为：病毒感染细胞导致IFN的产生，并随被感染细胞死亡、崩解而释出，IFN分子向附近扩散，随血液循环至全身。IFN是由宿主细胞编码的蛋白质，因其是通过作用于靶细胞、激活靶细胞内的基因而发挥作用的，故其具有广谱抗病毒作用。当IFN进入细胞后干扰素与细胞表面的干扰素受体结合后，可诱导细胞产生具有酶活性的抗病毒蛋白。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供一种重组猪α-干扰素的制备方法，本发明通过将重组猪α-干扰素通过表达载体导入毕赤酵母菌株中，再通过重组毕赤酵母的诱导表达获得高产量重组蛋白。

本发明的技术方案为：一种重组猪α-干扰素的制备方法，所述的方法通过将猪α-干扰素基因通过表达载体导入毕赤酵母菌株，再通过毕赤酵母菌株的诱导表达、发酵和后提取制得。

作为优选的，所述的制备方法包括猪α-干扰素真核表达载体的构建、重组酵母菌的诱导表达，包括以下步骤：

S1)、利用毕赤酵母密码子的偏爱性优化猪α-干扰素poIFN-α基因序列，并将合成的基因构建入pGAPZαA载体中，人工合成含有目的基因的重组质粒pGAPZαA-poIFN-α；

S2)、通过毕赤酵母感受态的制备，电转重组质粒，将合成的质粒pGAPZαA-poIFN-α导入毕赤酵母中进行种子液的制备，以及摇瓶发酵诱导重组蛋白的表达。

作为优选的，所述的重组质粒pGAPZαA-poIFN-α的构建方法的步骤：

将目的基因poIFN-α和载体pGAPZαA分别进行双酶切，酶切位点是NotⅠ、XhoⅠ，然后将酶切回收产物poIFN-α和pGAPZαA进行连接，并将连接产物导入大肠杆菌Top10F’感受态细胞中，然后利用试剂盒提取获得重组质粒pGAPZαA-poIFN-α。对重组质粒进行线性化并纯化后电击转化至毕赤酵母X33感受态细胞中。

作为优选的，将通过电转导入毕赤酵母感受态的重组毕赤酵母菌液涂布在YPDS+Zeocin的低抗性平板上，并进行多次的高抗性筛选。

作为优选的，所述重组毕赤酵母菌株的诱导表达采用如下步骤：将筛选的重组酵母菌划线接种到YPDS+Zeocin的抗性平板上，30℃培养，挑取单菌落接种至YPD液体培养基中，30℃摇床培养16h，得到种子液；然后将种子液按比例接种至YPD液体培养基中，30℃开始诱导表达，每隔24小时，取发酵液保存，并补充等量的培养基，保存的发酵液中含有重组毕赤酵母菌株分泌表达的重组猪α-干扰素，取发酵液检测重组蛋白的表达情况。

作为优选的，上述中，每隔24小时，取1mL发酵液保存，并补充1mL的培养基，连续培养发酵96小时。

本发明的有益效果为：

1、本发明将猪α-干扰素poIFN-α基因克隆到毕赤酵母分泌性表达载体pGAPZαA使之整合到毕赤酵母染色体中，实现了poIFN-α重组蛋白在毕赤酵母中的分泌表达，并通过控制培养条件，使poIFN-α重组蛋白在毕赤酵母中大量分泌具有抗病毒活性的重组猪α-干扰素；

2、本发明毕赤酵母是一种能高效表达重组蛋白的酵母品种，具有完整的蛋白表达、加工和修饰功能，与杆状病毒、哺乳动物细胞相比，具有生长速度快、培养成本低、产量高及便于产物分离纯化等优点，通过酵母表达直接以有活性的干扰素形式分泌到发酵上清液中，较原核生物相比，真核系统操作简单，无复杂变性、复性等后续工艺，且发酵上清液中杂蛋白含量较低，非常适合进行大规模的工业化生产。

附图说明

图1为本发明猪α-干扰素PCR扩增的结果，图1中泳道M为DNA Maker DL2000，泳道poIFN-α为猪α-干扰素PCR扩增的条带；

图2为本发明pGAPZαA质粒和pGAPZαA-poIFN-α分别用NotⅠ、XhoⅠ单双酶切的结果，其中，图2中，将菌液PCR鉴定为阳性的菌株扩培提取的质粒(编号为1号质粒和2号质粒)，用NotⅠ、XhoⅠ单双酶切，泳道M为DNA Maker DL2000，泳道1-4为分别为1号质粒、NotⅠ单酶切、XhoⅠ单酶切、NotⅠ和XhoⅠ双酶切的条带；泳道5-8为2号质粒、NotⅠ单酶切、XhoⅠ单酶切、NotⅠ和XhoⅠ双酶切的条带；

图3为本发明毕赤酵母系统重组猪α-干扰素X33-51菌株的SDS-PAGE电泳检测结果；图3中泳道M为蛋白低分子Maker 40kD，泳道1-4是pGAPZαA-PoIFN-α的X33-51菌株24h/48h/72h/96h酵母表达产物；

图4为本发明毕赤酵母系统重组猪α-干扰素X33-29菌株的SDS-PAGE电泳检测结果；其中，图4中泳道M为蛋白低分子Maker 40kD，泳道5-8是pGAPZαA-PoIFN-α的X33-29菌株24h/48h/72h/96h酵母表达产物。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步说明：

实施例1

本实施例提供重组猪α干扰素的构建

1、基于毕赤酵母密码子偏好性优化猪的α干扰素表达基因编码序列，根据毕赤酵母(Pichia pastoris)密码子偏好性和GC含量使用生物软件DNA Works进行优化猪α干扰素基因序列，优化后的基因序列委托江苏金斯瑞生物科技公司合成。

优化后的poIFN-α序列如SEQ ID NO.1所示：

TGTGATCTACCTCAGACTCATAGTCTTGCTCACACTAGAGCCCTGAGATTGCTTGCTCAAATGAGAAGAATCTCACCATTCTCATGTTTGGATCATCGTCGTGACTTTGGAAGTCCACATGAAGCTTTGGGTGGTAACCAGGTTCAAAAGGCACAGGCCATGGCATTGGTTCACGAAATGTTGCAACAGACTTTTCAACTATTCTCTACTGAGGGATCAGCAGCCGCCTGGGACGAGTCATTGTTGCATCAATTCTGCACCGGATTGGATCAACAATTACGAGATTTGGAAGCTTGTGTCATGCAAGAAGTCGGCTTGGAAGGTACTCCACTTTTGGAAGAGGACAGTATTCTAGCCGTTAGAAAGTATTTCCATAGGCTACCCTTGTACCTACAAGAAAAATCCTATAGTCCATGTGCTTGGGAAATTGTGCGTGCTGAAGTTATGAGGGTGTTTTCTTCAAGTACTAACTTGCAGGATAGATTGAGAAAAAAAGAA

2、PoIFN-α基因和pGAPZαA质粒的双酶切体系反应和连接反应

用NotⅠ、XhoⅠ分别对poIFN-α基因和pGAPZαA质粒双酶切，酶切反应体系分别为：

用T4 DNA连接酶对poIFN-α基因和pGAPZαA质粒的双酶切产物进行连接，16℃连接过夜。连接体系入下：

pGAPZαA双酶切产物	5μL
		poIFN-α双酶切产物	10μL
T4 DNA连接酶	1μL
		10×Ligation buffer	2μL
DDW	2μL
		总体系	20μL

3、连接产物转化Top10F’感受态

取100μL大肠杆菌Top10F’感受态细胞于新1.5mL离心管(预冷)，将连接产物全部加入于冰水混合物作用30min；冰浴结束后，将离心管移入42℃的水浴锅中，热击90s；热冲击后迅速转移到冰水混合物中，冰浴2min后加入900μL LB培养基；轻轻混匀于37℃/180rpm振荡培养1h；振荡培养结束后将菌液低速离心3min，无菌条件下弃多余上清，留约100μL上清重悬菌体沉淀；将转化产物100μL涂布于含有25μg/mL Zeocin的低盐LB固体培养基，37℃培养18h-24h。

4、重组质粒的鉴定

从转化后培养的低盐LB平板上挑取疑似阳性的白色单个菌落接种于含25μg/mLZeocin的低盐LB液体培养基中,37℃振荡培养过夜直接以菌液为模板进行鉴定反应。体系与程序为：94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸30s，共运行35个循环，最后72℃延伸10min。同时以去离子水代替模板做空白对照。PCR结束后各取5μL产物在0.8％琼脂糖凝泳电泳检测。对PCR鉴定为阳性的转化菌参照质粒抽提试剂盒说明提取重组质粒pGAPZαA-poIFN-α。

如图1和2所示，在图1中泳道M为DNA Maker DL 2000，泳道poIFN-α为猪α-干扰素PCR扩增的条带；在图2中泳道M为DNA Maker DL 2000，将菌液PCR鉴定为阳性的菌株扩培提取的质粒(编号为1号质粒和2号质粒)，1-4为分别为1号质粒、NotⅠ单酶切、XhoⅠ单酶切、NotⅠ和XhoⅠ双酶切的条带；泳道5-8为2号质粒、NotⅠ单酶切、XhoⅠ单酶切、NotⅠ和XhoⅠ双酶切的条带。

实施例2

重组质粒转入毕赤酵母菌表达宿主中

1、用BspHⅠ对重组质粒pGAPZαA-poIFN-α进行单酶切，酶切反应体系为：

2、X33感受态的制备

用无菌牙签挑取单菌落X33接种于10mL的YPD培养液中30℃振荡培养过夜；取部分过夜培养物按1：1000的比例接种于的新鲜YPD培养液中30℃振荡培养至菌液OD＝1.3～1.5。4℃，1500g离心5分钟用30mL的无菌水重悬菌体；同样离心收集菌体用30mL的无菌水重悬菌体；同样离心收集菌体用20mL预冷的1M山梨醇重悬菌体；4℃，1500g离心5分钟用500μL预冷的1M山梨醇重悬菌体即得感受态细胞用于当天电转(置于冰上)，不要冻存细胞。

3、线性化重组质粒电转感受态细胞

取80μL新制备的感受态酵母细胞与25μL线性化的重组质粒轻轻混匀。转入预冷电转杯中冰浴5分钟。设定电转化参数1500v，25μF，电阻186Ω，电击结束，立即加入1mL预冷的1M山梨醇，轻轻混匀后转入5mL的离心管中。30℃温箱中静置培养2小时。用100μL重悬菌体并铺于新鲜制备的YPDS平板(含100μg/mL的Zeocin)上将平板倒置于30℃温箱中培养3天。

4、重组转化子的高抗性筛选

将在100μg/mL抗生素抗性的YPDS平板中生长良好的菌落挑选接种到250μg/mL抗生素抗性的YPDS平板中，250μg/mL抗生素抗性的YPDS平板中生长良好的菌落继续挑选接种到500μg/mL抗生素抗性的YPDS平板中，500μg/mL抗生素抗性的YPDS平板中生长良好的菌落继续挑选接种到1000μg/mL抗生素抗性的YPDS平板中。挑选在1000μg/mL抗生素抗性的YPDS平板中生长较好的转化子在250μg/mL抗生素抗性的YPDS平板中划线纯化单克隆，以备下一步操作。

实施例3

重组毕赤酵母菌的诱导表达

将筛选的多个酵母克隆接种于5mL YPD培养液中，30℃振荡培养16h(OD约为4.0～6.0)，然后按比例1：1000接种于30mLYPD培养液中，30℃振荡培养。每隔24小时取样，并补充等体积的YPD培养液，连续培养96小时，共取样四次，以14000rpm的转速离心8min，取上清，并保留沉淀，保存在-20℃。

实施例4

表达产物的SDS-PAGE凝胶电泳分析

1、相关试剂的配制

10％SDS：1g SDS溶于10mL水中，65℃水浴溶解，室温保存(电泳室抽屉)。

5×SDS-PAGE电泳缓冲液：Tris 15.1g，甘氨酸94g，加入SDS 5g，定容至1000mL。

10％过硫酸铵：称取过硫酸铵1g溶于10mL水中，分装于1.5mL离心管中，4℃保存(使用不超过一周，冰箱保存)。

1.5M Tris-HCL：18.17g Tris，PH＝8.8，定容至100mL

1M Tris-HCL：12.12g Tris，PH＝6.8，定容至100mL(冰箱4℃保存)

染色液：考马斯亮蓝R-250 1.5g，甲醇270mL，冰乙酸60mL，定容至600mL

30％Arc-Bis：丙烯酰胺29g，甲叉双丙烯酰胺1g，定容100mL，4℃避光保存

脱色液：冰乙酸300mL，无水乙醇100mL，双蒸水600mL。

2、SDS-PAGE凝胶的配制

3、重组毕赤酵母菌pGAPZαA-poIFN-αSDS-PAGE验证

将保存的上清加入5×Protein Loding Buffer，混匀，100℃沸水浴10min，以蛋白质标准分子量为参考，在分离胶为12％的SDS-PAGE蛋白胶上电泳，按以下步骤操作：

(1)先将样品梳移去，用双蒸水淋洗每个样品孔，然后在样品孔中加入电泳缓冲液，同时在电泳槽中也加满电泳缓冲液。处理完毕后，根据实验的需要加样电泳。

(2)通常使用稳压的方式进行电泳，电压一般为80V，30min，后调为120V，1h。待溴酚蓝带移至凝胶底部即可结束电泳(约需1-2小时)。

(3)电泳完毕后，倒去电泳缓冲液，取出夹心槽。小心地取出凝胶，放入染色液中置于水平摇床上中染色1-2小时。染色完毕后，倒去染色液，用少量水淋洗凝胶，然后置于脱色液中脱色，并轻轻晃动，脱色至蓝色背景消失为止(约需1.5-2小时，换脱色液2-3次)。此凝胶即可用于观察、分析、拍片。

如图3和4所示，图3为毕赤酵母系统重组猪α-干扰素X33-51菌株的SDS-PAGE电泳检测结果。在图3中泳道M为蛋白低分子Maker 40kD，泳道1-4是pGAPZαA-poIFN-α的X33-51菌株24h/48h/72h/96h酵母表达产物。

图4为毕赤酵母系统重组猪α-干扰素X33-29菌株的SDS-PAGE电泳检测结果。在图4中泳道M为蛋白低分子Maker 40kD，泳道5-8是pGAPZαA-poIFN-α的X33-29菌株24h/48h/72h/96h酵母表达产物。

实施例5

重组猪α干扰素生物学活性测定

PRV的半数细胞感染量(TCID₅₀)的测定

按Reed-Muench法进行：将生长良好的BHK-21细胞用胰酶将其消化下来再用含2％灭活新生小牛血清的DMEM培养液配成悬液于96孔细胞培养板上每孔加入细胞悬液100μL，置37℃、5％CO₂培养箱中培养至均匀的单层细胞。弃去培养板中的营养液，于96孔细胞培养板上再加入180μL含2％灭活新生小牛血清的DMEM培养液分别将20μL PRV病毒加入该细胞培养板装有180μL培养液的第一排孔中将混合液吹打均匀后吸取20μL混合液加入到装有180μL培养液的第二孔中更换枪头如上吹打混匀后再吸取20μL混合液加入到装有180μL培养液的第三孔中连续如此操作即可作一系列10倍稀释。每个稀释度作8个重复病毒液做6个10倍梯度稀释。细胞对照孔加入180μL含2％灭活新生小牛血清的DMEM培养液置37℃、5％CO₂培养箱培养逐日观察(1～4d)，直到终点。即能看到引起细胞病变的病毒最高稀释度按Reed-Muench法计算PRV的TCID₅₀。根据下表按Reed-Muench法计算TCID₅₀：

2、重组猪α干扰素抗病毒活性测定

具体步骤如下：

(1)铺板：弃去BHK-21细胞培养瓶中的培养液用胰酶消化收集细胞,加入含2％灭活新生小牛血清的DMEM培养液吹打均匀配成细胞悬液。然后接种于96孔细胞培养板每孔100微升37℃、5％CO₂培养箱中培养过夜使细胞贴壁为单层。

(2)制备干扰素溶液：取表达上清经0.22μm的滤器过滤，接种于无任何抗生素的LB培养液中作无菌检验。检验合格后用细胞维持液作连续4倍梯度稀释。

(3)加样：取预先培养成细胞单层的96孔细胞培养板弃去营养液将不同稀释度的干扰素样品移入96孔细胞培养板每孔100微升。每个浓度作7个重复，37℃、5％CO₂培养箱中培养过夜。同时设置不加病毒的空白对照和不加干扰素的阴性对照。

(4)制备病毒液：攻毒剂量100TCID₅₀取保存的PRV用细胞维持液稀释至工作浓度。

(5)攻毒：弃去96孔细胞培养板中培养液甩干加入工作浓度的病毒液每孔100微升，37℃、5％CO₂条件下培养约24小时至36小时。

(6)细胞病变判定：待病毒对照孔出现完全细胞病变时判断结果并根据细胞的病变程度按5分级制进行打分记录不同浓度时的保护性。

细胞病变的保护程度划为5等级

4：无明显的细胞病变

3：细胞病变在25％左右

2：有约50％的细胞病变

1：细胞病变在75％左右

0：有100％病变

(7)结果计算：根据Reed-Muench法计算。50％细胞病变保护的稀释度中所含的干扰素量即为1个干扰素单位。

根据下表按Reed-Muench法计算poIFN-α的效价：

上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理和最佳实施例，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。

Claims (9)

1.一种重组猪α-干扰素的制备方法，其特征在于：所述的方法通过将猪α-干扰素基因通过表达载体导入毕赤酵母菌，再通过毕赤酵母菌的诱导表达、发酵和后提取制得。

2.根据权利要求1所述的一种重组猪α-干扰素的制备方法，其特征在于：所述的制备方法包括猪α-干扰素真核表达载体的构建、重组酵母菌的诱导表达，包括以下步骤：

S1)、利用毕赤酵母密码子的偏爱性优化猪α-干扰素poIFN-α基因序列，优化后的poIFN-α序列如SEQ ID NO.1所示；

并将合成的基因构建入pGAPZαA载体中，人工合成含有目的基因的重组质粒pGAPZαA-poIFN-α；

S2)、通过毕赤酵母感受态的制备，电转重组质粒，将合成的重组质粒pGAPZαA-poIFN-α导入毕赤酵母中进行种子液的制备，以及摇瓶发酵诱导重组蛋白的表达。

3.根据权利要求2所述的一种重组猪α-干扰素的制备方法，其特征在于：所述的重组质粒pGAPZαA-poIFN-α的构建方法的步骤：

将目的基因PoIFN-α和载体pGAPZαA分别进行双酶切，酶切位点是NotⅠ、XhoⅠ，然后将酶切回收产物poIFN-α和pGAPZαA进行连接，并将连接产物导入大肠杆菌Top10F’感受态细胞中，然后利用试剂盒提取获得重组质粒pGAPZαA-PoIFN-α。

4.根据权利要求3所述的一种重组猪α-干扰素的制备方法，其特征在于：对重组质粒pGAPZαA-poIFN-α进行线性化并纯化后电击转化至毕赤酵母X33感受态细胞中。

5.根据权利要求4所述的一种重组猪α-干扰素的制备方法，其特征在于：将通过电击转化导入毕赤酵母感受态细胞的重组毕赤酵母菌液涂布在YPDS+Zeocin的低抗性平板上，并进行多次的高抗性筛选。

6.根据权利要求5所述的一种重组猪α-干扰素的制备方法，其特征在于，所述重组毕赤酵母菌的诱导表达采用如下步骤：

将筛选的重组酵母菌划线接种到YPDS+Zeocin的抗性平板上，30℃培养，挑取单菌落接种至YPD液体培养基中，30℃摇床培养16h，得到种子液；

然后将种子液按比例接种至YPD液体培养基中，30℃开始诱导表达，每隔24小时，取发酵液保存，并补充等量的培养基，保存的酵母菌即为通过表达载体导入毕赤酵母的重组猪α-干扰素，取发酵液检测重组蛋白的表达情况。

7.根据权利要求6所述的一种重组猪α-干扰素的制备方法，其特征在于：每隔24小时，取1mL发酵液保存，并补充1mL的培养基，连续培养发酵96小时。

8.根据权利要求3所述的一种重组猪α-干扰素的制备方法，其特征在于：将连接产物转化大肠杆菌Top10F’感受态细胞：

具体为：将连接产物加入大肠杆菌Top10F’感受态细胞中，轻弹两下后，再将离心管放置于冰水混合物中冰浴30min；冰浴结束后，将离心管移入42℃的水浴锅中，热击90s；热冲击后迅速转移到冰水混合物中，冰浴2min后加入900μL LB培养基；轻轻混匀于37℃/180rpm振荡培养1h；振荡培养结束后将菌液低速离心3min，无菌条件下弃多余上清，留约100μL上清重悬菌体沉淀；将转化产物100μL涂布于含有25μg/mL Zeocin的低盐LB固体培养基，37℃培养18h-24h。

9.根据权利要求4所述的一种重组猪α-干扰素的制备方法，其特征在于：线性化重组质粒电转感受态细胞具体为：

取80μL新制备的感受态酵母细胞与25μL线性化的重组质粒轻轻混匀。转入预冷电转杯中冰浴5分钟。设定电转化参数1500v，25μF，电阻186Ω，电击结束，立即加入1mL预冷的1M山梨醇，轻轻混匀后转入5mL的离心管中。30℃温箱中静置培养2小时。用100μL重悬菌体并铺于新鲜制备的YPDS平板上，将平板倒置于30℃温箱中培养3天。