CN115747075A - 一种能胞外分泌抗菌肽的三角褐指藻构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明专利属于硅藻基因工程领域，主要发明一种能胞外分泌抗菌肽的三角褐指藻构建方法及其抑菌活性研究。本发明将三角褐指藻内源性强启动子HASP(highly abundant secreted protein)加上信号肽序列与经过密码子优化的拟穴青蟹中抗菌肽Scy基因融合构建外分泌表达载体，获得的Scy转基因藻株可以胞外分泌抗菌肽，而且分泌的抗菌肽可以有效抑制细菌的生长。

Description

一种能胞外分泌抗菌肽的三角褐指藻构建方法

技术领域

本发明属于硅藻基因工程领域，特别涉及一种能胞外分泌抗菌肽的三角褐指藻构建方法及其抑菌活性研究。

背景技术

抗菌肽是一类广泛存在于各种生物中的一类小分子多肽，一般由10～50个氨基酸组成。研究发现，抗菌肽可以有效地杀死病原微生物、病毒、致病原生动物等。抗菌肽的作用机制主要通过破坏细菌细胞膜的结构完整性，使细胞内外屏障丧失，从而杀死细菌。抗菌肽优点是分子量小、抗菌谱广泛、活性强、稳定性好，进入生物体内无有害残留，对细菌不会产生耐药性，逐渐成为新的可以代替传统抗生素替代品。然而，天然的抗菌肽在生物体内含量较少，提取困难，且制备的费用较高，因此利用基因工程技术是实现抗菌肽规模化生产的主要手段之一。

抗菌肽Scy首次从拟穴青蟹射精管中分离获得的一种阴离子抗菌肽。研究发现Scy具有广谱抗菌活性,且能抑制WSSV感染。利用大肠杆菌原核表达系统和毕赤酵母真核表达系统获得了Scy基因的表达产物，证明其对革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌，具有良好的抗菌特性。

目前，人们依靠以下三种方法获得抗菌肽：(1)直接从生物体内分离得到抗菌肽(2)通过化学合成方法获得抗菌肽(3)通过基因工程方法获得抗菌肽。从生物体内分离抗菌肽工艺复杂，步骤繁琐，而且提取抗菌肽的产量少，难以实现工业化生产。通过化学合成方法得到的抗菌肽价格昂贵，适用于科研研究，而通过基因工程方法获得抗菌肽，有利于工业化生产具有广泛应用前景。现在，利用基因工程表达外源蛋白系统主要有大肠杆菌表达系统和酵母表达系统。

大肠杆菌表达系统是最早建立并应用于表达外源蛋白的表达系统，是目前应用于最广泛外源表达系统。具有操作简单、成本低、目的蛋白表达量高等优点，抗菌肽的分子量小，将抗菌肽的基因构建在表达载体上并转化到大肠杆菌中，添加IPTG就可诱导大肠杆菌表达外源抗菌肽蛋白，大肠杆菌生长周期短且易操作，所以被广泛应用于表达外源蛋白。但是，大肠杆菌中有能引起免疫反应的内毒素，而内毒素会对抗菌肽的分离纯化造成困难；并且大肠杆菌是原核表达系统，缺乏对真核蛋白的折叠、修饰以及加工的生物过程，也容易形成包涵体，因此，原核表达系统获得的重组抗菌肽往往活性较低、具有细胞毒性。而在真核表达系统中应用最广泛是酵母，酵母是真核生物所以能够对蛋白进行加工和修饰，但酵母表达系统存在一个比较突出的问题，那就是对蛋白过度糖基化，会对抗菌肽的活性形成影响；同时，酵母表达量低，且后续分离纯化成本高，不利于工业应用。

三角褐指藻作为一种单细胞真核硅藻,它拥有进行细胞核并表达外源蛋白的真核表达系统。它的基因组在2008年就完成测序，遗传背景清晰，转化手段成熟。三角褐指藻可对蛋白进行加工和修饰，可正确表达外源蛋白，所以利用基因工程的方法将抗菌肽转入三角褐指藻体内是能够成功表达。三角褐指藻优点是生长速度快，能够进行光合作用，光周期短，培养成本低且环保；还能直接用作鱼、虾等水生生物的饵料；三角褐指藻已作为细胞工厂成功表达异源活性物质，如单克隆抗体，生物塑料的前体等。综上所述，三角褐指藻可解决大肠杆菌和酵母表达的存在弊端问题。

发明内容

针对目前外源基因表达系统存在的问题，本发明提供了一种能胞外分泌抗菌肽的三角褐指藻的构建方法及抑菌活性的研究。本发明采用能够分泌到胞外的表达系统，将抗菌肽分泌到胞外，离心收集上清，藻液重复利用，继续培养，避免转基因生物带来的安全问题；采用增强型启动子HASP，提高抗菌肽的表达量；收集上清，将上清透析再经冷冻干燥获得干粉做抑菌验证。

本发明是这样完成的，一种能胞外分泌抗菌肽的三角褐指藻的构建方法，有以下四个步骤：

(1)合成经密码子优化后拟穴青蟹中抗菌肽Scy基因CDNA序列，从文献中筛找适合三角褐指藻信号肽序列

(2)构建HASP启动子-信号肽-抗菌肽-FCPA终止子三角褐指藻的外分泌表达载体模式，得到表达的载体，命名为pH-S-Scy。

(3)将表达的载体通过基因枪转化法转化到受体三角褐指藻，筛选阳性藻株

(4)对阳性藻株的基因组DNA进行验证，还会从RNA水平和蛋白水平验证抗菌肽的表达，获得能稳定表达转基因藻株。

将HASP启动子加信号肽编码的序列和抗菌肽Scy基因连接并克隆到质粒中，构建一种外分泌表达抗菌肽载体，将构建表达的载体通过基因枪转化法转化到受体三角褐指藻，获得能稳定表达Scy转基因藻株。用到的质粒就是硅藻中常用的过表达T1质粒。

所述抗菌肽Scy是一种阴离子抗菌肽。

所述抗菌肽Scy基因序列是经过密码子优化后的，具有SEQ ID NO.1序列和氨基酸序列具有SEQ ID NO.2序列。

所述HASP启动子序列具有SEQ ID NO.3序列，在三角褐指藻中信号肽对应氨基酸序列具有SEQ ID NO.4序列和在三角褐指藻对应信号肽表达基因序列具有SEQ ID NO.5序列。

所述构建表达载体命名为pH-S-Scy。

所述一种能胞外分泌抗菌肽三角褐指藻的构建方法中所述抗菌肽Scy转基因三角褐指藻在抑制考克氏菌和Trelief5αChemically Competent Cell感受态细菌生长方面有明显抑菌效果。本发明可以将转基因三角褐指藻中的抗菌肽分泌到胞外，在启动子后面添加了一段54bp信号肽序列，其氨基酸序列为MNLRCILPFLLASFSAGA，见SEQ ID NO.4，在三角褐指藻中表达的基因序列为ATGAATCTTCGTTGTATCCTTCCGTTTCTCCTCGCAAGCTTCTCGGCTGGGGCT，见SEQ ID NO.5.

本发明采用三角褐指藻作为细胞工厂生产抗菌肽具有以下几个优点：(1)基因工程方法已经成熟，在三角褐指藻体内成功表达异源活性物质，如单克隆抗体，生物塑料的前体等(2)可以将表达的抗菌肽分泌到胞外，避免转基因生物带来的安全问题(3)三角褐指藻生长周期短，能进行光合作用，还能直接用作鱼和虾的饵料。

Scy基因序列表SEDIQ No.1中的碱基序列序列表

SEQ ID No.1的信息

(a)序列特征

长度：255核苷酸

类型：核苷酸

链型：单链

(b)分子类型：DNA

序列描述：SEQ ID NO.1

ATGAAGGAAGACTCCAACATTTTGGACAAGACCGCCAAGATGACCAAGCAGAACAAGGCCCTCCTCTTCACCGCCGGAGGCGCCGCCGCCTTTATGGCCGGATACTACTACTACCACTGCAACTACCGTAACCCGGCCCCCAAGAAGTCCGGATCCACCACCTCCCAAGACAAGACCGACGCCCAGGCCGTCCAGTCCATTCCCTCCCCCTCCGGAAACAAGGGCAAGGAATCCAAGGACCCCAAGGTCAAGTAA

Scy基因序列表SEDIQ No.2中的氨基酸序列序列表

SEQ ID No.2的信息

(a)序列特征

长度：84个氨基酸

类型：氨基酸

链型：单链

(b)分子类型：氨基酸

序列描述：SEQ ID NO.2

MKEDSNILDKTAKMTKQNKALLFTAGGAAAFMAGYYYYHCNYRNPAPKKSGSTTSQDKTDAQAVQSIPSPSGNKGKESKDPKVK

HASP启动子序列表SEDIQ No.3中的碱基序列序列表

SEQ ID No.3的信息

(a)序列特征

长度：499核苷酸

类型：核苷酸

链型：单链

(b)分子类型：DNA

序列描述：SEQ ID NO.3

CATACAGTGAATGTAACTTTCGAATTGACAGTATTAGTAGTCGTATTGACAGTGAGGCACGCCCCTCAATGTGCGAGGTGGAAAATATACCAGCATGACAATGAATCTTGGAGATTCTTTTGCTGTCATCAAGATTCACCGCCAAATCTTCAGGAACCTATCACGTCCACAGGCGATGTTAATTCTTGAGTCGTCAAAACAAAGTCCTGTCCTACCTGTAGAAGTTGACAGCGAGCAATTGTATGCAAACTTCTGACTTTGTTATAATAACATTAAAGGTAATTAAGTATCTTCAATTAGGCATTTTGTCACTGTCAGTCCGTTCCGACAATATAGGTAGATTTGGAATGAATCTTTTCTATGCTGCTGCGAATCTTGTACACCTTTGAGGCCGTAGATTCTGTCCGACGAAGCGATAATTATTGCAAAATACATGGACTCATTATTTTGATTCGATTTCTTTTTGGTATCCGACTCGAAAAGATCCATCACGGCGAGC

信号肽序列表SEDIQ No.4中的氨基酸序列序列表

SEQ ID No.4的信息

(a)序列特征

长度：18个氨基酸

类型：氨基酸

链型：单链

(b)分子类型：氨基酸

序列描述：SEQ ID NO.4

MNLRCILPFLLASFSAGA

信号肽序列表SEDIQ No.5中的碱基序列序列表

SEQ ID No.5的信息

(a)序列特征

长度：54核苷酸

类型：核苷酸

链型：单链

(b)分子类型：DNA

序列描述：SEQ ID NO.5

ATGAATCTTCGTTGTATCCTTCCGTTTCTCCTCGCAAGCTTCTCGGCTGGGGCT

比较案例

之前有研究报道将含有抗菌肽鲎素(tachyplesin)基因(tac)的重组质粒利用基因枪转化方法转入三角褐指藻体内，筛选阳性藻株，做抑菌实验验证，结果发现目的蛋白表达量低，没有形成明显抑菌圈。而且它是体内表达抗菌肽，不是分泌性，存在转基因生物安全问题无法应用到实践中去。所以本发明采用分泌型启动子，可以将抗菌肽分泌到上清中，避免了转基因生物带来的安全问题。

附图说明：

图1为本发明中构建分泌型表达质粒过程

图2为本发明中筛选分泌性抗菌肽Scy阳性藻株DNA水平和转录水平验证

图3为本发明中分泌性抗菌肽Scy藻株对考克氏菌和Trelief5 ChemicallyCompetent Cell感受态细菌抑菌效果

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本发明所限定的范围。

除非特别指明，以下实施例中所用的试剂均可从正规渠道商购获得。

实施例1三角褐指藻的培养

三角褐指藻作为转基因的受体藻株。按照Guillard and Ryther(1962)(文献：Guillard RRL,Ryther JH.Studies of marine planktonic diatoms:I.Cyclotella nanaHustedt,and Detonula confervacea(Cleve)Gran[J].Canadian Journal ofMicrobiology,1962,8(2):229-239.)的研究报道配置含f/2的人工海水培养基进行培养，置于恒温光照培养箱(GXZ-380C，江南仪器厂，宁波中国)中静置培养，每天手动摇瓶3次。培养的光照强度为80μmolphotonsm^-2s^-1，光暗周期为12h：12h，温度为20±1℃。

实施例2抗菌肽序列的合成

本实验选择拟穴青蟹中抗菌肽Scy基因(文献：K.J.Wang,W.S.Huang,M.Yang,H.Y.Chen,J.Bo,S.J.Li,G.Z.Wang,A male-specific expression gene,encodes a novelanionic antimicrobial peptide,scygonadin,in Scylla serrata,Molecularimmunology,44(2007)1961-1968)，从NCBI数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)下载Scy基因序列(NCBI Genbank Accession No.MH488960.1)，对应拟穴青蟹抗菌肽Scy的氨基酸序列MKEDSNILDKTAKMTKQNKALLFTAGGAAAFMAGYYYYHCNYRNPAP KKSGSTTSQDKTDAQAVQSIPSPSGNKGKESKDPKVK，见SEQ ID NO.1拟穴青蟹抗菌肽Scy基因根据三角褐指藻密码子偏好性，通过擎科公司开发Index软件进行密码子优化后在三角褐指藻中表达的基因序列为：ATGAAGGAAGACTCCAACATTTTGGACAAGACCGCCAAGATGACCAAGCAGAACAAGGCCCTCCTCTTCACCGCCGGAGGCGCCGCCGCCTTTATGGCCGGATACTACTACTACCACTGCAACTACCGTAACCCGGCCCCCAAGAAGTCCGGATCCACCACCTCCCAAGACAAGACCGACGCCCAGGCCGTCCAGTCCATTCCCTCCCCCTCCGGAAACAAGGGCAAGGAATCCAAGGACCCCAAGGTCAAGTAA，见SEQ ID NO.2。首先，委托南京擎科生物科技有限公司，合成抗菌肽Scy基因，按照Infusion试剂盒(Code#CU201-02，全式金生物技术有限公司，北京)说明书，将合成抗菌肽Scy基因序列插入到常用的硅藻过表达pPha-T1质粒(文献：Zaslavskaia LA等.Transformation of the diatom Phaeodactylum tricornutum(Bacillariophyceae)with a variety of selectable marker and reporter genes[J].Journal of Phycology,2001,36(2):379-386.)的多克隆位点中的EcoRI和HindIII之间，获得了Scy-pPha-T1表达载体(如图1C所示)。使用TaqDNA聚合酶(Cat.CW0690H，CWBIO，北京)说明书PCR扩增Scy基因，使用引物960-F和960-R序列分别为：

gtctgccgtttcgagaattcATGAAGGAAGACTCCAACAT和atagcacgcttctgaagcttTTACTTGACCTTGGGGTCCT，采用胶回收试剂盒(D2500-02，omega，日本)，将扩增的Scy目的片段和利用EcoRI和HindIII双酶切的质粒进行胶回收，按照Infusion试剂盒(Code#CU201-02，全式金生物技术有限公司，北京)说明书进行目的片段和双酶切质粒连接，Infusion反应体系为：2×Basic Assemble Mix为5μl,双酶切质粒为1μl,目的片段为4μl。10μl反应体系，轻轻混合，50℃反应15min，反应结束后将离心管置于冰上冷却数秒。然后进行转化，取50μl DH5α感受态细胞(TaKaRa，日本)加入1.5ml离心管中再加入2.5μl连接后产物，轻轻混匀在冰上放置30min，然后在42℃水浴中热激60S，之后转移冰上冷却两分钟，加入450μl LB培养基(LB培养基购买于生工生物工程股份有限公司，NO.A507002)放到37℃摇床中220rpm培养1h，取100μl均匀涂到含Amp(Cat#A8180，Solarbio，100mg/ml)的LB平板上(15g琼脂/L，250gLB培养基/L)之后在37℃培养箱中过夜培养，第二天挑取单菌落(委托生工生物工程股份有限公司进行测序)，将测序正确的Scy-pPha-T1质粒用于下一步的实验。

实施例3获得HASP启动子-信号肽序列

在前期实验中，将上一步构建好的Scy-pPha-T1质粒，进行基因枪转化，后来受到文献中的启发启动子后加个信号肽(文献：Erdene-Ochir E,Shin B K,Kwon B,etal.Identification and characterisation of the novel endogenous promoter HASP1and its signal peptide from Phaeodactylum tricornutum[J].Scientific Reports,2019,9(1))，可以将目的基因分泌到胞外，还有pPha-T1质粒中FCPA启动子是光启动子，有一定缺点需要高度依赖光才能驱动基因表达(文献：Seo S,Jeon H,Hwang S,Jin E,ChangKS(2015)Development of a new constitutive expression system for thetransformation of the diatom Phaeodactylum tricornutum.Algal Res 11:50–54)根据文献中介绍与FCPA启动子相比，HASP启动子在所有阶段都强烈驱动基因表达(文献：Erdene-Ochir E,Shin B K,Kwon B,et al.Identification and characterisation ofthe novel endogenous promoter HASP1 and its signal peptide from Phaeodactylumtricornutum[J].Scientific Reports,2019,9(1))，后来将pPha-T1质粒改造，将pPha-T1质粒上原有FCPA光启动子替换成HASP启动子，利用同源重组方法按照Infusion试剂盒(Code#CU201-02，全式金生物技术有限公司，北京)说明书。从NCBI数据库查找HASP基因序列(Genbank Accession No.XM_002181840.1)，该基因位于14号染色体，利用生物信息工具在EnsemblProtists中预测HSAP基因启动子序列(499bp)，使用SignalP软件，在N末端发现了负责HASP分泌的18个氨基酸信号肽(SP)(如图1A)。(文献：Erdene-Ochir E,Shin B K,Kwon B,et al.Identification and characterisation of the novel endogenouspromoter HASP1and its signal peptide from Phaeodactylumtricornutum[J].Scientific Reports,2019,9(1))。

下载预测HASP基因启动子的序列(270874-271372)

CATACAGTGAATGTAACTTTCGAATTGACAGTATTAGTAGTCGTATTGACAGTGAGGCACGCCCCTCAATGTGCGAGGTGGAAAATATACCAGCATGACAATGAATCTTGGAGATTCTTTTGCTGTCATCAAGATTCACCGCCAAATCTTCAGGAACCTATCACGTCCACAGGCGATGTTAATTCTTGAGTCGTCAAAACAAAGTCCTGTCCTACCTGTAGAAGTTGACAGCGAGCAATTGTATGCAAACTTCTGACTTTGTTATAATAACATTAAAGGTAATTAAGTATCTTCAATTAGGCATTTTGTCACTGTCAGTCCGTTCCGACAATATAGGTAGATTTGGAATGAATCTTTTCTATGCTGCTGCGAATCTTGTACACCTTTGAGGCCGTAGATTCTGTCCGACGAAGCGATAATTATTGCAAAATACATGGACTCATTATTTTGATTCGATTTCTTTTTGGTATCCGACTCGAAAAGATCCATCACGGCGAGC，见SEQ ID NO.3。信号肽氨基酸序列为MNLRCILPFLLASFSAGA，见SEQ ID NO.4，在三角褐指藻中表达的基因序列ATGAATCTTCGTTGTATCCTTCCGTTTCTCCTCGCAAGCTTCTCGGCTGGGGCT，见SEQ ID NO.5。PCR扩增对应启动子和信号肽序列，加入TE裂解液(购买自上海生工有限公司，由1MTris pH 8.0和0.5MEDTA组成)裂解WT型三角褐指藻，95℃，10min，按照KOD酶(Code#KMM-201，TOYOBO，日本)说明书将获得的基因组DNA作为模板扩增HASP启动子和信号肽，所使用的引物为HASP-F和HASP-R，序列分别为:ACCAGATCCCCCGGGCATACAGTGAATGTAACTTTCGAATT和TGTTGGAGTCTTCCTTAGCCCCAGCCGAGAAGCTTGCGAGGA，胶图见图1B，切胶进行胶回收，委托上海生工有限公司测序，将测序结果与NCBI数据库下载启动子序列进行比对，大体一致。将上一步构建好Scy-pPha-T1质粒的线性化，按照KOD酶(Code#KMM-201，TOYOBO，日本)说明进行PCR扩增(退火温度：56℃；延伸时间：30秒)所使用的引物为GTH-F和GTH-R，引物序列为:AAGGAAG ACTCCAACATTTTGG和CCCGGGGGATCTGG TTCTATAGTGTCA，将线性化质粒进行胶回收，将扩增HASP启动子和信号肽序列与线性化质粒进行连接转化，具体方法在实施例2中所述，送上海生工有限公司测序。将含HASP启动子-信号肽-Scy抗菌肽基因测序正确菌样命名为pH-S-Scy，如图1C。

实施例4将构建好的pH-S-Scy质粒通过基因枪转化方法转移至三角褐指藻。

1.提取质粒

将命名为pH-S-Scy菌样扩大培养到含30ml LB液体培养基加30μlAmp(100mg/ml)50ml离心管中，放到37℃摇床中，180rpm，培养12～16小时。将培养好的菌液，5000g离心10min，弃上清(将离心管倒扣用卫生纸吸干)，采用Easy Pure Plasmid Miniprep Kit试剂盒(Code#EM101-02，全式金，北京)按照说明书提取质粒：加入500μl的RB，悬涡振荡细胞沉淀，加入500μl蓝色溶液LB，温和上下翻转4-6次，使菌体充分裂解，裂解时间不超过5min，加入750μl黄色溶液，轻轻混合5-6次，室温放置2min，12000g离心5min小心吸取上清加入离心柱中，12000g离心1min，弃液，取多次重复，加入650μl WB，12000g离心1min,弃流出液，空离12000g离心2min，将离心柱转移进一新的离心管，在柱中加入35μl EB室温静置2min后10000g离心1min，得到pH-S-Scy质粒，

2.通过基因枪方法获得阳性藻株

参考文献中报道的方法进行基因枪的转化(文献：Zaslavskaia,L.A.,Lippmeier,J.C.,Kroth,P.G.,Grossman,A.R.and Apt,K.E.(2000)Transformation of the diatomPhaeodactylum tricornutum(Bacil lariophyceae)with a variety of selectablemarker and reporter genes.J.Phycol.36,379–386)

(1)制备微弹

称取30mg金粉(Cat.#1652262，BioRad，美国，直径0.6μm)加入到1.5ml离心管中，向离心管中加入1ml70％乙醇，涡旋振荡3min，静置15min,10000g离心5s，弃上清，加入1mlDEPC水，涡旋1min，静置1min,10000g离心1min，弃上清，重复此操作三次。加入500μl灭菌的50％甘油，快速振荡混匀，使金粉浓缩至60mg/ml，置于冰上待用。转移30μl金粉到1.5ml离心管中，然后迅速依次加入5ug质粒DNA，20μl亚精胺和50μl氯化钙，边涡旋振荡边加入，涡旋2min，静置2min,3000g离心2s弃上清，向上述体系中加入140μl 70％乙醇，3000g离心2s弃上清，再加入140μl无水乙醇3000g离心2s弃上清，最后加入48μl无水乙醇，微弹制备完成，尽快轰击。

(2)基因枪转化藻细胞的准备

取WT型生长至指数生长期的藻细胞，2000g离心4min，将藻细胞浓缩至1×10^8/ml，取200μl均匀涂布于f/2固体平板中央，在恒温光照培养箱中培养两天后待用。

(3)按照基因枪使用说明书进行基因枪(BioRad，美国)的轰击

(4)轰击后藻细胞的培养

轰击后的藻细胞置于光照培养箱恢复培养24h后，用含zeocin(100μg/mL)f/2液体培养基将藻细胞刮下，涂布于含有zeocin(100μg/mL)抗性含f/2培养基海水固体培养基(含15g琼脂/L)上培养，培养20-30天后在平板上可以看见单藻落。

3.筛选阳性藻株

(1)挑取10株在zeocin(100μg/mL)抗性平板上长出单藻落于10ml的培养管中培养里面加入2ml含zeocin(100μg/mL)的f/2液体培养基中培养4-5天。

(2)从培养管中取出500μl的藻液到1.5ml离心管中，8000g离心1min，弃上清，加入20μl TE裂解液将藻细胞悬浮起来，转移进PCR管。

(3)将PCR管放入PCR仪(TaKaRa，日本)，95℃，10min进行裂解。

4.DNA水平验证验证

使用PCR仪(TaKaRa，日本)进行PCR扩增，25μl PCR反应体系为：12.5μlTaqDNA聚合酶(Cat.CW0690H，CWBIO，北京)，1μl正向引物YZH960-F序列为GAGGCCGTAGATTCTGTCCG,1μl反向引物YZH960-R序列为AGTATCCGGCCATAAAGGCG，2μl裂解后单藻落，8.5μl DEPC水。反应过程为：94℃，4min，94℃，30s，56℃,30s，72℃,30s，循环30次，72℃，10min，4℃终止反应。取2.5μl PCR反应后产物在1％琼脂糖凝胶电泳跑15min后，通过凝胶成像仪发现有一株Scy转基因藻株有一条269bp条带，WT型和其他几株单藻落没有这个条带，切下条带委托上海生工有限公司测序，将测序结果与Scy基因序列进行比对，比对正确，说明在三角褐指藻中成功转入Scy基因，获得Scy转基因的藻株(如图2A)。

5.RNA水平的验证

(1)收集转基因藻株和WT型藻株

扩大培养Scy转基因的藻株和WT型三角褐指藻，各取80ml的藻液2000g离心4min，将上清收集起来用来做后续抑菌试验，将离心后的藻液悬浮起来转移到1.5ml离心管中，8000g离心1min，弃上清，放入液氮中，用来提取RNA。

(2)提取Scy转基因藻株和WT型藻株的RNA

按照多糖多酚植物总RNA提取试剂盒(Cat.#DP441，天根生化科技有限公司，北京)的说明书提取三角褐指藻的RNA：将收集的藻液放在液氮中迅速研磨成粉末，研磨完后转移进离心管后，加入500μl裂解液(475μl SL+25μlβ-巯基乙醇)，立即振荡混匀2min,12000rpm离心2min，将上清液转移进过滤柱CS上，1200rpm离心2min，小心吸取收集管中的上清至新的RNase-Free离心管中，吸头尽量避免接触收集管中的细胞碎片沉淀，加入0.4倍上清体积无水乙醇混匀，将得到的溶液和沉淀一起转移进吸附柱CR3中，12000rpm离心15s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中，向CR3柱中350μl去蛋白液RW1，12000rpm离心15s，倒掉收集管中的废液，工作液配制：取10μlDNaseI加入70μl RDD缓冲液，轻柔混合，向吸附柱CR3中央加入80μl工作液，室温放置15min。向吸附柱CR3中加入350μl去蛋白液RW1，12000rpm离心15s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中，向吸附柱CR3中加入500μl漂洗液RW，12000rpm离心15s，倒掉收集管中的废液，重复此操作一次，空离12000rpm离心2min，将吸附柱CR3放入一个新的RNase-Free离心管中，向吸附柱中间部位悬空加入35μlRNase-Free ddh₂o，室温放置2min，12000rpm离心1min，得到RNA溶液。

(3)RT-PCR

按照反转试剂盒(Code.#RR047A，Takara，日本)说明书反转成cDNA，进行总RNA中去除基因组DNA，反应体系如下：

反应条件：42℃，2min，4℃终止。

用去除了基因组DNA的RNA作为模板，采用TakaRa的PrimerScrip^TM RT reagentKit with gDNA Eraser进行反转反应

具体反应体系为：

反应条件为：37℃，15min，85℃，5s，4℃终止反应。

将上述RT反应中得到的转基因藻株和WT型中的CDNA作为模板，进行PCR扩增，验证转基因藻株的转录活性。

使用验证引物YR960F：CATTTTGGACAAGACCGCCA，YR960R：TGGTGGATCCGGACTTCTTG，使用PCR仪进行PCR反应体系为：94℃，4min，94℃，30S，56℃,30s，72℃,30s循环30次，72℃，10min，4℃终止反应。发现Scy转基因藻株出现一条143bp条带，WT型没有，(如图2B)委托上海生工有限公司进行测序，测序结果与转入Scy基因比对一致。说明抗菌肽基因Scy基因在转基因藻株中有转录活性。

6.转基因三角褐指藻上清中总蛋白抑菌活性研究

(1)收集三角褐指藻上清中的总蛋白

分别收集培养到指数生长期的Scy转基因阳性藻株和WT型三角褐指藻，5000g离心4min，收集上清，将上清转移进透过3500D分子量透析袋(YA1077-5m，Solarbio，北京)中，然后放在4度冰箱中进行透析，每隔两小时换一次超纯水，主要将一些海水中盐离子透析掉，透析24h后转移进50ml离心管中，放入-20℃冰箱中放置12h，将冻好上清放置冷冻干燥机中冷冻干燥两天，获得蛋白干粉，加入DEPC水进行溶解

(2)分别使用抑菌圈和吸光光度法来验证分泌性抗菌肽三角褐指藻总蛋白抑菌活性分析，具体方法如下：

参考文献中报道方法检测总蛋白抑菌实验(Sheng-qi Rao,Ru-yi Zhang,RuiChen,Ya-jun Gao,Lu Gao,Zhen-quan Yang,Nanoarchite-ctonics for enhancedantibacterial activity with Lactobacillus buchneri S-layer proteins-coatedsilver nanoparticles,Journal of Hazardous Mater ials,Volume426,2022,128029,ISSN 0304-3894,)分别接菌种Trelief5αChemically Competent Cell感受态细胞，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，考克式菌(Kocuria sp)于1mlLB液体培养基中37℃，180rpm摇床中培养大约8h，将菌液活化。分别各取这三种菌液1μl到1.5ml离心管，将菌液稀释2000倍，将稀释好的菌液取100μl用涂布棒均匀涂在含1.5％琼脂LB培养基中(LB固体培养基中厚度尽量厚一些)，置于室温待平板表面菌液被吸收。然后在超净台中用白枪头在平板对称两边上分别打个孔，实验组向孔中加入100μlScy转基因三角褐指藻总蛋白的浓缩液，对照组加入100μl WT型三角褐指藻总蛋白浓缩液。上样后放入37℃培养箱过夜培养，第二天观察抑菌圈是否产生。实验结果表明，Scy转基因三角褐指藻对考克式菌和Trelief5αChemically Competent Cell感受态细胞有明显的抑菌效果，而作为对照组WT型三角褐指藻没有表现出抑菌的效果，如图3A和3B。参考文献中使用吸光度法(文献：Hemlata,SumbulAfreen,Tasneem Fatma,Extraction,purification and characterization ofphycoerythrin from Michrochaete and its biologicalactivities,Biocatalysis andAgricultural Biotechnology,Volume 13,2018,Pages 84-89)测定菌生长情况，按上面方法将三种菌活化，将活化后的菌稀释2000倍数，取100μl菌液加到96孔板中，再加100μl分泌性抗菌肽藻株蛋白浓缩液，做三组平行作为实验组1，同样的加100μl WT型藻株蛋白浓缩液，做三组平行作为实验组2，阳性对照中加100μlLB和100μl稀释好的菌液，阴性对照中加100μlLB和100μl蛋白浓缩液，放到37度培养箱培养16h，计算抑菌率(阳性对照-实验组/阳性对照-阴性对照)，如图3C和3D。

Claims (6)

1.一种能胞外分泌抗菌肽的三角褐指藻的构建方法，其特征在于：将HASP启动子加信号肽编码的序列和抗菌肽Scy基因连接并克隆到质粒中，构建一种外分泌表达抗菌肽载体，将构建表达的载体通过基因枪转化法转化到受体三角褐指藻，获得能稳定表达Scy转基因藻株。

2.根据权利要求1所述能胞外分泌抗菌肽三角褐指藻的构建方法，其特征在于：所述抗菌肽Scy是一种阴离子抗菌肽。

3.根据权利要求2所述能胞外分泌抗菌肽三角褐指藻的构建方法，其特征在于：所述抗菌肽Scy基因序列是经过密码子优化后的，具有SEQ ID NO.1序列和氨基酸序列具有SEQ IDNO.2序列。

4.根据权利要求1所述能胞外分泌抗菌肽三角褐指藻的构建方法，其特征在于：所述HASP启动子序列具有SEQ ID NO.3序列，在三角褐指藻中信号肽对应氨基酸序列具有SEQID NO.4序列和在三角褐指藻对应信号肽表达基因序列具有SEQ ID NO.5序列。

5.根据权利要求1所述能胞外分泌抗菌肽三角褐指藻的构建方法，其特征在于：所述构建表达载体命名为pH-S-Scy。

6.一种根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于：所述抗菌肽Scy转基因三角褐指藻在抑制考克氏菌和Trelief5αChemically Competent Cell感受态细菌生长方面有明显抑菌效果。

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