CN109180794B - 一种新型斑节对虾ALFpm12抗菌肽、制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于甲壳类动物基因工程技术领域，公开了一种新型斑节对虾ALFpm12抗菌肽、制备方法及其应用,斑节对虾ALFpm12抗菌肽由123个氨基酸组成，分子量为13.54kDa，信号肽由25个氨基酸组成；ALFpm12与公开的斑节对虾ALF抗菌肽最高同源性仅有50％，在受副溶血弧菌入侵的斑节对虾各器官均显著上调，在4小时达到表达峰值；它的基因序列可由斑节对虾各组织提取的总RNA中通过RT‑PCR克隆获得。本发明抗菌肽对金黄色葡萄球菌、海岸微小杆菌等具有抑菌、杀菌作用，具有杀菌效率高、使用量少、时效长、生产简单的特点，并且能够抑杀海水细菌，显示其在水产养殖行业具有广阔的应用前景。

Description

一种新型斑节对虾ALFpm12抗菌肽、制备方法及其应用

技术领域

本发明属于甲壳类动物基因工程技术领域，尤其涉及一种新型斑节对虾ALFpm12抗菌肽、制备方法及其应用。

背景技术

目前，业内常用的现有技术是这样的：

海洋面积占地球表面积三分之二，在维持全球气候中发挥重要作用，并为渔业，水产业的可持续发展提供稳定的生态环境。海洋中生长着味道鲜美、蛋白丰富的鱼虾、贝类。随着海产养殖业的扩大发展，到2012年，水产业供给了6.66千万吨的海产品，包括175种海洋无脊椎动物，主要为甲壳类和软体动物。其中，养殖的甲壳类占海产品总体积的9.7％，但价值占到了22.4％。近年来，我国渔业经济发展迅速，水产养殖占到了全球养殖的70％。但是，随着我国水产养殖业精养、半精养等养殖模式的发展，集约化程度的日益提高，残饵、粪便、水生动植物尸体等富营养因子共存于一个水体，加之水源的污染和池塘自净与调节能力的降低，导致养殖水体中化学需氧量、生物耗氧量、氨氮、亚硝酸盐、硫化物等指标严重超标，病原微生物种类和数量上升，养殖环境恶化导致鱼虾病害频频发生。例如2015年，珠三角的南美白对虾养殖成功率不足2成。2016年，广东对虾产量产值均明显下降，收入下降了25.6％。目前，针对集约化养殖导致养殖动物病害频发的主要防治方法是使用抗生素和化学药物，尤其是抗生素的大量使用给食品安全及出口贸易带来了巨大安全隐患，同时导致耐药病原增多、环境污染加剧、生态风险升高等一系列问题。抗生素滥用问题在水产养殖业尤其严重，我国已成为世界上滥用抗生素最严重的国家之一，2015年我国抗生素总使用量估计约18.2万吨，其中约52％用于农业、养殖业。因此，为了保障人民群众的饮食健康，提高产品品质出口创汇，增加养殖户的经济效益，急需寻找一种解决病害频发的方法，开发出绿色、环保、无害、高效的抗生素替代品，实现科学养殖、生产绿色产品。

抗菌肽(Antimicrobial peptides，AMPs)是生物体合成的一类小分子防御多肽，在抗生素替代和绿色养殖中具有重要意义，它是动物免疫防御体系在诱导条件下产生的一类对抗外源性病原体致病作用的防御性肽类活性物质，能提高生物非特异免疫活性，杀死入侵的微生物，具有活性高、特异性强等特点。研究表明抗菌肽具有广谱抗菌作用，对革兰阳性菌、革兰阴性菌、真菌均有抑杀作用，还可以抗原虫、抗病毒以及杀伤动物体内的肿瘤细胞，在快速杀菌的同时，不会导致脓毒症，同时具有中和内毒素、调节增加机体免疫力等特性，使其最有可能替代抗生素成为新一代相对安全的抗菌药物。虽然，天然抗菌肽具有高活性、低毒性等特点，但也存在含量低、稳定性较差、生产成本高等问题，导致其不能在医药、食品及养殖领域获得广泛应用。

综上所述，现有技术存在的问题是：

(1)至今仍未获得能快速杀灭病毒、弧菌等高危病害菌的对虾抗菌肽。对虾属于非脊椎动物，关于它的基础研究比较薄弱，免疫机理尚不完全清楚，抗菌肽的种类及作用机理都在研究之中。目前，已公开的对虾抗菌肽种类和数量均远远少于其他物种，阻止了其开发与应用。

(2)对虾抗菌肽在对虾体内含量低、提取困难，成本高。通过化学合成方法获得抗菌肽的技术也面临成本高、活性不如天然抗菌肽等问题。以上方法均不适合抗菌肽的规模化生产及应用。

(3)采用基因工程生产抗菌肽具有成本低、工业化前景好等优点，但也得解决原核表达带来的易形成包涵体、活性低，真核表达产量低、过度修饰等问题。

综合以上原因，至今未获得具有高效杀菌活性且可应用于对虾病害防治的对虾抗菌肽。

解决上述技术问题的难度和意义：

难度在于：对虾养殖业也是近年发展非常快，高密度养殖和水质恶化引发了大规模的虾病爆发,使海产养殖业遭受严重损失，如何防治虾病仍然是对虾养殖业的难题。如何利用生物技术获得新颖、抗菌活性高的对虾抗菌肽并实现它在水产养殖行业的推广应用则是解决这个难题的关键。

解决现有技术的问题后，带来的意义为：1997年Destoumieux等从养殖的南美白对虾的血细胞和血浆中分离了几种抗菌活性因子，从中克隆得到一条虾抗菌肽。研究表明抗菌肽是对虾防御机制中的重要组成部分，是第一道天然防线。对虾抗菌肽新种类的发现和研究将有助于建立绿色、安全的对虾养殖技术。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种新型斑节对虾ALFpm12抗菌肽、制备方法及其应用。

本发明是这样实现的，一种斑节对虾抗菌肽ALFpm12，所述斑节对虾抗菌肽ALFpm12共123个氨基酸，分子量约为13.54kDa，氨基酸序列为：

SEQ ID NO：1。

本发明抗菌肽序列与现有斑节对虾的抗菌肽只有50％的同源性，属于斑节对虾ALF家族新型的抗菌肽。

进一步，所述斑节对虾ALFpm12基因的cDNA序列SEQ ID NO：4共有661个碱基，1-143及516-661为非编码区，起始密码子为ATG，终止密码子为TGA；信号肽序列为SEQ ID NO：2，共25个氨基酸。

进一步，斑节对虾抗菌肽ALFpm12的有效抑菌肽段氨基酸序列为：SEQ ID NO：3。

本发明的另一目的在于提供一种新型斑节对虾抗菌肽ALFpm12的原核表达方法，包括：

通过原核表达系统获得，将ALFpm12的基因序列连接到pSmartI、pCold IV质粒上，转化到大肠杆菌中，通过IPTG诱导获得SUMO-ALFpm12融合蛋白，经过镍离子的亲和层析纯化获得融合蛋白，再利用SUMO蛋白酶进行酶切获得ALFpm12抗菌肽。

进一步，ALFpm12的基因获得方法包括：

斑节对虾先用副溶血弧菌进行处理，收集处理4h的斑节对虾组织，采用试剂盒提取细胞的总RNA，通过反转录获得cDNA；

根据ALFpm12的cDNA序列设计引物，以斑节对虾血细胞和组织的总cDNA为模板，通过PCR克隆获得ALFpm12序列，上游引物为5'AACAAAAACAAATATTCACGAAAAC 3'，下游引物为5'TTAAACCAGCGAAAAAGATGAAG 3'，获得约661bp的特异性cDNA片段，经测序得到661bp的斑节对虾ALFpm12抗菌肽基因。

进一步，斑节对虾抗菌肽ALFpm12的制备方法，具体包括：

1)斑节对虾总RNA的提取：

斑节对虾组织的收集：斑节对虾用副溶血弧菌处理4小时，然后分离斑节对虾的胃、血、肝和肠等组织，放入液氮冷冻处理，存放于负八十摄氏度冰箱，即可用于后续的总RNA提取；

总RNA的提取：采取RNeasy Mini Kit提取斑节对虾的总RNA，称取不超过30mg的斑节对虾组织，在液氮条件下研磨成粉末，然后转移到干净的离心管中；加入Buffer RLT，充分振荡混匀；所有液体转移到收集管，15000rpm离心2min；加入一倍体积70％乙醇，充分混匀；吸取700μL混合物到Rneasy收集柱，15000rpm离心15秒，去除液体；加入700μL的BufferRPE，15000rpm离心2min；将吸附柱子放入新的2mL收集管，15000rpm离心1min；将吸附柱子转移到新的1.5mL收集管，加入30-50μL的Rnase-free water，盖上盖子，15000rpm离心2min，收集管获得斑节对虾的总RNA，存储于-80℃冰箱；

2)抗菌肽cDNA序列的克隆：

根据斑节对虾ALFpm12抗菌肽序列设计引物，从斑节对虾细胞中克隆获得抗菌肽序列ALFpm12，上游引物为5'AACAAAAACAAATATTCACGAAAAC 3'，下游引物为5'TTAAACCAGCGAAAAAGATGAAG 3'，采用RNeasy Mini Kit提取斑节对虾的总RNA，采用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒进行反转录获得cDNA，反转录程序为：42℃进行60min；70℃进行15min，获得斑节对虾的cDNA。以该cDNA为模板，采用上下游引物进行扩增，PCR程序为：94℃，3min；94℃，30sec，55℃，30sec，72℃，1min，共35个循环；72℃，10min；4℃终止反应，然后进行1％琼脂糖凝胶电泳，获得约661bp的特异性cDNA片段，用干净刀片切取661bp的目的片段，采用胶回收试剂盒回收目的片段，克隆到T-vector上，进行基因测序，得到661bp的斑节对虾ALFpm12抗菌肽基因。

进一步，抗菌肽cDNA序列的克隆后，还需将ALFpm12克隆到pSmartI和pCold IV质粒上，然后进行抗菌肽的诱导表达及纯化：

载体构建：抗菌肽序列通过限制性内切酶SacI和XhoI连接到pSmartI载体上，通过NdeI和XhoI连接到原核表达载体pCold IV上，经PCR筛选获得抗菌肽序列正确插入的重组质粒，

抗菌肽的诱导表达及纯化：然后转化到大肠杆菌BL21中；含有重组质粒的大肠杆菌BL21接种于含卡那霉素的LB液体培养基中，于200rpm，37℃恒温振荡培养至OD600＝0.3-0.6时，加入终浓度为1mmol/L的IPTG在200rpm诱导6-24h；将诱导完毕的菌液于5000rpm离心10min，弃上清，用含20mM Tris，pH8.0，200mM NaCl，25mM咪唑的Lysis buffe重新悬浮菌块并转移至50mL离心管中，按1g菌体加入10mL的Lysis buffer的比例；使用60W的功率超声破碎Lysis buffer悬浮的菌液，条件为：在冰浴中，总时间为20min，超声2sec，停顿4sec，超声破碎结束后15000rpm离心30min，获得的上清为总蛋白样品，含有抗菌肽；将总蛋白样品按照1mL/分钟的速度通过含有镍离子的亲和层析柱，采用含200mM NaCl,50mM Tris,pH调至8.0-8.1的Blance Buffer去除未结合的杂蛋白，然后用含200mM NaCl,60mM咪唑，50mMTris,pH调至8.0-8.1的Wanshing Buffer洗脱弱结合蛋白，最后用含200mM NaCl,500mM咪唑，50mM Tris,pH调至8.0-8.1的Elution Buffer洗脱并收集目的蛋白，在150mM NaCl,25mM Tris,1mM DTT,pH调至8.0-8.1的透析液中透析除盐，然后制成冻干粉，-80℃保存；透析蛋白的冻干粉在无菌去离子水中溶解成1mg/mL，然后加入SUMO蛋白酶进行酶切处理，SUMO蛋白和抗菌肽发生分离，经过SDS-PAGE电泳分离、考马斯亮蓝染色、脱色，用干净的刀片切下目的抗菌肽的胶条，经过干燥、酶解处理后进行MALDI-MS质谱分析，比对获得的蛋白肽。

进一步，抗菌肽基因的表达及纯化后，还需进行抗菌活性的分析：

培养待测菌株，进行抑菌实验；菌株包括金黄色葡萄球菌、海岸微小杆菌，在20mL培养基中培养；具体包括：

取200μL过夜培养物接至20mL无菌培养基中，37℃250rpm培养3h，使OD600在02-0.3；取培养液100μL至96孔板，以氨苄青霉素为阳性对照、PBS缓冲液为阴性对照，斑节对虾ALFpm12抗菌肽冻干粉用无菌的去离子水溶解成100μM的溶液，分别加入氨苄青霉素、PBS缓冲液和一定浓度的斑节对虾ALFpm12抗菌肽，将96孔板置于恒温培养箱孵育24h，用酶标仪测定OD600的吸光值，分析微生物生长情况。

其中，斑节对虾抗菌肽-ALFpm12，氨基酸序列如下：

MKVSFVVGVVALVAAVALFATPCQGQIWETLVPLITQQVVGLWKNGEREFFGHQCTYSVTPKIK SLELHFKGRMSCPSLSSVRGEALTRSRSGVEGKTVEDYVRKVLAQGVITEEEAKAWLTK，共123个氨基酸，分子量约为13.54kDa；信号肽序列SEQ ID NO：2为MKVSFVVGVVALVAAVALFATPCQG，共25个氨基酸。

斑节对虾抗菌肽全长cDNA序列：

CGTTTGCAGCATTCACCCACCTTCTTTCCCTCACCCGTTTGCAGCATTCACCCACCTTCTTTCCCTCACCCGTTTGCAGCATTCACCCACCTTCTTTCCCTCACCCGTTTGCAGCATTCACCCACCTTAAACCAGCGAAAAAGATGAAGGTCTCGTTCGTGGTCGGCGTAGTGGCACTGGTGGCAGCGGTGGCACTCTTCGCTACCCCGTGCCAGGGCCAGATATGGGAGACGCTGGTCCCTCTCATCACACAGCAGGTCGTGGGGTTGTGGAAAAACGGCGAAAGAGAATTTTTTGGTCACCAGTGCACATACTCAGTCACACCCAAAATTAAGAGTCTAGAACTGCACTTTAAGGGAAGGATGTCCTGCCCGTCCCTTAGTAGTGTGAGAGGAGAAGCTTTGACCCGCAGTCGCTCGGGCGTGGAGGGCAAGACGGTTGAGGATTACGTAAGGAAGGTCTTAGCACAGGGCGTGATAACGGAGGAGGAGGCAAAGGCGTGGCTTACCAAGTAAATGAAACGGAAGTCGATTTTTTTAAAGTCTTTTCTACGACGATGGTTCTTCTGCTTGATTTGCATAACGTCGGGCGGTTTAGTGAAGCTGTTTTCGTGAATATTTGTTTTTGTTATTCATTTTTATTTTTATCGTTGTTATTGGCA。

进一步，所述斑节对虾抗菌肽ALFpm12的制备方法进一步包括：

通过固相化学法合成。

综上所述，本发明的优点及积极效果为：

斑节对虾ALFpm12抗菌肽由123个氨基酸组成，分子量为13.54kDa，PI＝9.12，信号肽由25个氨基酸组成，为斑节对虾新颖的抗菌肽，与ALF家族最高同源性仅为50％；ALFpm12抗菌肽的cDNA全长661个碱基，可由斑节对虾组织的总RNA中通过RT-PCR克隆获得，大量存在于副溶血弧菌胁迫的斑节对虾各组织中，显示其在病害防御中的重要价值；ALFpm12抗菌肽可通过原核表达系统，与SUMO蛋白融合表达获得，也可以由固相化学合成的方法获得，本发明获得的SUMO-ALFpm12表达量大(>30mg/L)、活性高(抑菌率>65％)，已经具有较高的抗菌、杀菌效果，其生产成本低廉，显示出广阔的应用前景。本发明的ALFpm12抗菌肽对金黄色葡萄球菌、海岸微小杆菌等具有抑菌、杀菌作用，与氨苄青霉素相当。ALFpm12抗菌肽在16μM即可以对金黄色葡萄球菌(65.6％)、海岸微小杆菌(79％)具有较高的抑菌率，且抑菌时间可达到24小时。ALFpm12-LBD甚至在2μM就可以对海岸微小杆菌产生高达70％的抑菌率。海岸微小杆菌为海水细菌，与斑节对虾养殖环境相似，也预示该抗菌肽在水产养殖中具有重要的发展潜力，总的来说，ALFpm12具有杀菌效率高、使用量少、成本低、能够抑杀海水细菌等特点。

附图说明

图1是本发明实施例提供的pSmartI表达载体图。

图2是本发明实施例提供的pCold IV表达载体图。

图3是本发明实施例提供的ALFpm12同源性比对。

图4是本发明实施例提供的ALFpm12在各组织的表达情况。

图5是本发明实施例提供的ALFpm12响应副溶血弧菌胁迫的表达情况

图6是本发明实施例提供的ALFpm12的进化树分析。

图7是本发明实施例提供的斑节对虾ALFpm12抗菌肽的表达及纯化图。

图8是本发明实施例提供的SUMO-ALFpm12对金黄色葡萄球菌的抑菌实验图。

图9是本发明实施例提供的SUMO-ALFpm12对海岸微小杆菌的抑菌实验图。

图10是本发明实施例提供的ALFpm12对海岸微小杆菌的抑菌实验图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明实施例提供的源于对虾的抗菌肽具有以下优势：生物安全性好，源于对虾自身的抗菌肽不会对对虾养殖以及水体环境造成危害；

效率高，能针对性抑杀危害对虾养殖的病菌，减少对虾养殖对抗生素等药物的依赖度；

可抑杀源于海洋的病菌，许多海洋细菌均能耐受高盐等胁迫，导致其他来源的抗菌肽对其抑杀效果不佳。

本发明通过副溶血弧菌处理斑节对虾，刺激其细胞合成抗菌肽，通过反复筛选获得具有抗菌活性的抗菌肽cDNA，通过原核表达或化学合成技术获得抗菌肽ALFpm12，对金黄色葡萄球菌等致病菌起到抑杀作用，具有杀菌效率高、使用量少、时效长，并且能够抑杀海水细菌的特点。本发明利用SUMO蛋白与抗菌肽ALFpm12融合表达，获得可溶性的基因表达产物SUMO-ALFpm12,表现出较强的抗菌活性，其表达效率高、生产成本低，将来可应用于水产养殖病害的防治，具有重要的经济价值和发展潜力。

本发明实施例提供的从斑节对虾组织中克隆得到的抗菌肽ALFpm12，共含有123个氨基酸，分子量约为13.54KDa，其N-末端25个氨基酸序列为“信号肽”。

其中，抗菌肽ALFpm12，共含有123个氨基酸：

SEQ ID NO：1：

MKVSFVVGVVALVAAVALFATPCQGQIWETLVPLITQQVVGLWKNGEREFFGHQCTYSVTPKIKSLELHFKGRMSCPSLSSVRGEALTRSRSGVEGKTVEDYVRKVLAQGVITEEEAKAWLTK

信号肽SEQ ID NO：2：

MKVSFVVGVVALVAAVALFATPCQG。

本发明所说的斑节对虾抗菌肽ALFpm12基因的cDNA序列有661nt，1-143及516-661为非编码区，起始密码子为ATG，终止密码子为TGA，其序列如下：

SEQ ID NO：4

1

CGTTTGCAGCATTCACCCACCTTCTTTCCCTCACCCGTTTGCAGCATTCACCCACCTTCT

61

TTCCCTCACCCGTTTGCAGCATTCACCCACCTTCTTTCCCTCACCCGTTTGCAGCATTCA

121

CCCACCTTAAACCAGCGAAAAAGATGAAGGTCTCGTTCGTGGTCGGCGTAGTGGCACTGG

181

TGGCAGCGGTGGCACTCTTCGCTACCCCGTGCCAGGGCCAGATATGGGAGACGCTGGTCC

241

CTCTCATCACACAGCAGGTCGTGGGGTTGTGGAAAAACGGCGAAAGAGAATTTTTTGGTC

301

ACCAGTGCACATACTCAGTCACACCCAAAATTAAGAGTCTAGAACTGCACTTTAAGGGAA

361

GGATGTCCTGCCCGTCCCTTAGTAGTGTGAGAGGAGAAGCTTTGACCCGCAGTCGCTCGG

421

GCGTGGAGGGCAAGACGGTTGAGGATTACGTAAGGAAGGTCTTAGCACAGGGCGTGATAA

481

CGGAGGAGGAGGCAAAGGCGTGGCTTACCAAGTAAATGAAACGGAAGTCGATTTTTTTAA

541

AGTCTTTTCTACGACGATGGTTCTTCTGCTTGATTTGCATAACGTCGGGCGGTTTAGTGA

601

AGCTGTTTTCGTGAATATTTGTTTTTGTTATTCATTTTTATTTTTATCGTTGTTATTGGC

661

A

作为本发明的优选实施例,斑节对虾ALFpm12抗菌肽cDNA基因的获得如下：(1)斑节对虾先用副溶血弧菌进行处理，收集处理4h的斑节对虾各组织，放入液氮冷却，采用研钵充分研磨，然后采用试剂盒提取细胞的总RNA，通过反转录获得cDNA；

(2)以获得的总cDNA为模板，通过荧光定量PCR分析ALFpm12在各组织中的表达，并对斑节对虾响应副溶血弧菌胁迫的机制进行研究，采用的引物为上游引物SEQ ID NO：5为5'AACAAAAACAAATATTCACGAAAAC 3'，下游引物SEQ ID NO：6为5'TTAAACCAGCGAAAAAGATGAAG3'；

根据ALFpm12的cDNA序列设计引物，以斑节对虾组织的cDNA为模板，通过PCR克隆获得抗菌肽序列。

上游引物SEQ ID NO：5为5'AACAAAAACAAATATTCACGAAAAC 3'，下游引物SEQ IDNO：6为5'TTAAACCAGCGAAAAAGATGAAG 3'，获得约661bp的特异性cDNA片段，经测序得到661bp的斑节对虾ALFpm12抗菌肽基因，在NCBI网站上通过blast比对证实得到的基因片段为新的基因，利用软件对其进化分析。斑节对虾ALFpm12抗菌肽的氨基酸序列为：

SEQ ID NO：1

MKVSFVVGVVALVAAVALFATPCQGQIWETLVPLITQQVVGLWKNGEREFFGHQCTYSVTPKIK SLELHFKGRMSCPSLSSVRGEALTRSRSGVEGKTVEDYVRKVLAQGVITEEEAKAWLTK，共123个氨基酸，分子量为13.54kDa；

(3)ALFpm12表达活性分析，获得的斑节对虾总cDNA为模板，5'AACAAAAACAAATATTCACGAAAAC 3'和5'TTAAACCAGCGAAAAAGATGAAG 3'序列为引物，对斑节对虾各器官中ALFpm12的表达进行半定量RT-PCR分析和荧光定量PCR实验。

(4)序列的分析与抗菌肽序列的确定，同源性比对和相似性搜索用NCBI:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/,BLAST在线软件进行，抗菌肽进化分析用Mega软件。

(5)通过结构分析发现斑节对虾ALFpm12抗菌肽的活性结构区(ALFpm12-LBD)，采用化学合成的方法获得该肽段，通过抑菌实验证明该肽段具有抑菌活性，

该肽段SEQ ID NO：3为：QCTYSVTPKIKSLELHFKGRMSCP；

(6)斑节对虾ALFpm12抗菌肽基因连接到原核表达载体pSmartI、pCold IV质粒上，抗菌肽基因片段与SUMO蛋白融合表达，经IPTG诱导获得SUMO-ALFpm12融合蛋白；

(7)该融合蛋白含有组氨酸标签，利用镍柱通过亲和层析获得SUMO-ALFpm12融合蛋白；

(8)该融合蛋白经过SUMO蛋白酶的酶切，获得具有活性的ALFpm12抗菌肽，分子量为13.54kDa，经过质谱鉴定为完整的ALFpm12抗菌肽；

(9)ALFpm12抗菌肽对金黄色葡萄球菌、海岸微小杆菌具有抑菌、杀菌作用，与氨苄青霉素(50μg/mL)相当。

下面结合具体分析对本发明作进一步描述。

本发明所涉及的原核表达载体pSmartI、pCold IV，菌株E.coli BL21(DE3)均购自通用生物系统有限公司(安徽)。

本发明所涉及的菌种：金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(见遗传资源信息披露表附件)、海岸微小杆菌(Exiguobacterium aestuarii)(见遗传资源信息披露表附件)和副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)(见遗传资源信息披露表附件)购自中国普通微生物菌种保藏管理中心(http://www.cgmcc.net/index.html)，金黄色葡萄球菌CGMCCNO为1.363、海岸微小杆菌CGMCC NO为1.6140、副溶血弧菌CGMCC NO为1.1997。

下面结合具体实施例及分析对本发明作进一步描述。

本发明实施例提供的斑节对虾抗菌肽ALFpm12的制备方法，包括：

1.斑节对虾的副溶血弧菌胁迫及总RNA的提取：

斑节对虾培养于天然海水中，加入副溶血弧菌处理24小时，在处理0、2、4、8、12、24小时后分别取样，采集斑节对虾的胃、心、鳃、血、肝和肠等器官和组织，浸入液氮冷却，冻存于-80℃冰箱，即可用于后续的总RNA提取。

总RNA的提取：采取RNeasy Mini Kit(QIAGEN,Cat No./ID:74104)提取斑节对虾的总RNA，称量不超过30mg的组织，在液氮条件下研磨成粉末，然后转移到干净的离心管中；加入Buffer RLT，充分振荡混匀；所有液体转移到收集管，15000rpm离心2min(25℃)；加入一倍体积70％乙醇，充分混匀；吸取700μL混合物到Rneasy收集柱，15000rpm离心15秒，去除液体；加入700μL的Buffer RPE，15000rpm离心2min(25℃)；将吸附柱子放入新的2mL收集管，15000rpm离心1min(25℃)；将吸附柱子转移到新的1.5mL收集管，加入30-50μL的Rnase-free water，盖上盖子，15000rpm离心2min(25℃)，收集管获得斑节对虾的总RNA，存储于-80℃冰箱。

2.抗菌肽cDNA序列的克隆：

根据斑节对虾ALFpm12抗菌肽序列设计引物，从斑节对虾组织中克隆获得抗菌肽序列，上游引物为5'AACAAAAACAAATATTCACGAAAAC 3'，下游引物为5'TTAAACCAGCGAAAAAGATGAAG 3'，采用RNeasy Mini Kit(QIAGEN,Cat No./ID:74104)提取斑节对虾各组织的总RNA，采用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser(Takara,Japan)试剂盒进行反转录获得cDNA，反转录程序为：42℃进行60min；70℃进行15min，获得斑节对虾的cDNA。以该cDNA为模板，采用上下游引物进行扩增，PCR程序为：94℃，3min；94℃，30sec，55℃，30sec，72℃，1min，共35个循环；72℃，10min；4℃终止反应，然后进行1％琼脂糖凝胶电泳，获得约661bp的特异性cDNA片段，用干净刀片切取661bp的目的片段，采用胶回收试剂盒(Takara,Japan)回收目的片段，然后克隆到T-vector(Takara,Japan)上，送华大基因进行测序，得到661bp的斑节对虾ALFpm12抗菌肽基因，在NCBI网站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上通过blast比对证实得到的基因片段为新的基因，与斑节对虾ALF6抗菌肽的同源性为50％(图3)，表明本发明获得了斑节对虾ALF抗菌肽家族的一条新型抗菌肽。其序列为：

1

CGTTTGCAGCATTCACCCACCTTCTTTCCCTCACCCGTTTGCAGCATTCACCCACCTTCT

61

TTCCCTCACCCGTTTGCAGCATTCACCCACCTTCTTTCCCTCACCCGTTTGCAGCATTCA

121

CCCACCTTAAACCAGCGAAAAAGATGAAGGTCTCGTTCGTGGTCGGCGTAGTGGCACTGG

181

TGGCAGCGGTGGCACTCTTCGCTACCCCGTGCCAGGGCCAGATATGGGAGACGCTGGTCC

241

CTCTCATCACACAGCAGGTCGTGGGGTTGTGGAAAAACGGCGAAAGAGAATTTTTTGGTC

301

ACCAGTGCACATACTCAGTCACACCCAAAATTAAGAGTCTAGAACTGCACTTTAAGGGAA

361

GGATGTCCTGCCCGTCCCTTAGTAGTGTGAGAGGAGAAGCTTTGACCCGCAGTCGCTCGG

421

GCGTGGAGGGCAAGACGGTTGAGGATTACGTAAGGAAGGTCTTAGCACAGGGCGTGATAA

481

CGGAGGAGGAGGCAAAGGCGTGGCTTACCAAGTAAATGAAACGGAAGTCGATTTTTTTAA

541

AGTCTTTTCTACGACGATGGTTCTTCTGCTTGATTTGCATAACGTCGGGCGGTTTAGTGA

601

AGCTGTTTTCGTGAATATTTGTTTTTGTTATTCATTTTTATTTTTATCGTTGTTATTGGC

661

A

3.ALFpm12表达活性分析：

以1、2获得的斑节对虾总cDNA为模板，5'AACAAAAACAAATATTCACGAAAAC 3'和5'TTAAACCAGCGAAAAAGATGAAG 3'序列为引物，对斑节对虾各器官中ALFpm12的表达进行半定量RT-PCR分析，结果显示ALFpm12在斑节对虾的胃、心、鳃、血、肝和肠中均有表达，说明ALFpm12在多个器官参与副溶血弧菌胁迫的响应，起到抑杀副溶血弧菌、保护斑节对虾的作用，其中胃、心、血和肠的表达量明显高于其他器官，为本发明了解ALFpm12的作用机理提供了基础数据(图4)。然后，本发明采用荧光定量PCR试剂盒(Code No.:RR066A，Takara,Japan)进行荧光定量PCR实验，结果显示斑节对虾在副溶血弧菌胁迫4小时后，ALFpm12的表达量最高，然后逐步降低，没有加入副溶血弧菌胁迫的斑节对虾中ALFpm12表达量明显低于实验组(图5)，表明ALFpm12可以在各个主要器官中大量表达，对防御副溶血弧菌等病原微生物入侵起到积极作用，显示这一新型的抗菌肽在水产养殖、食品等领域具有重要的应用潜力。

4.序列的分析与抗菌肽序列的确定：

同源性比对和相似性搜索用NCBI:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/,BLAST在线软件进行，以BLASTZ软件辅助进行序列拼接，结果显示斑节对虾ALFpm12抗菌肽的cDNA序列共有661nt，1-28及427-661为非编码区，抗菌肽进化分析用Mega软件，斑节对虾抗菌肽全长cDNA序列：

信号肽预测用SIGNALP:http://www.cbs.dtu.dk/aervices/SignalP在线查找，经分析斑节对虾ALFpm12抗菌肽的氨基酸序列为：MKVSFVVGVVALVAAVALFATPCQGQIWETLVPLITQQVVGLWKNGEREFFGHQCTYSVTPKIKSLEL HFKGRMSCPSLSSVRGEALTRSRSGVEGKTVEDYVRKVLAQGVITEEEAKAWLTK，共123个氨基酸，分子量约为13.54kDa；信号肽序列SEQ ID NO：2为MKVSFVVGVVALVAAVALFATPCQG，共25个氨基酸。

通过NCBI采集已经公开发布的斑节对虾ALF抗菌肽序列(共6个)，然后进行进化分析及同源性比对，结果显示ALFpm12与其他ALF抗菌肽序列同源性都比较低，表明本发明获得了一个新型的ALF家族抗菌肽，具有较强的新颖性(见图6)。

5.抗菌肽基因原核表达载体的构建：

抗菌肽序列通过限制性内切酶SacI和XhoI连接到pSmartI(通用生物系统有限公司，安徽)载体上，通过NdeI和XhoI连接到原核表达载体pCold IV(通用生物系统有限公司，安徽)上，经PCR筛选获得抗菌肽序列正确插入的重组质粒(见图1，图2)，然后转化到大肠杆菌BL21(通用生物系统有限公司，安徽)中。

6.抗菌肽的诱导表达及纯化：

含有重组质粒的大肠杆菌BL21接种于含卡那霉素的LB液体培养基中，于200rpm，37℃恒温振荡培养至OD600＝0.3-0.6时，加入终浓度为1mmol/L的IPTG在200rpm诱导6-24h，pSmartI载体诱导最适诱导温度为37℃，pCold IV最适诱导温度为16℃。将诱导完毕的菌液于5000rpm离心10min，弃上清，用适量的Lysis buffer(20mM Tris，pH8.0，200mMNaCl，25mM咪唑)重新悬浮菌块，按1g菌块/10mL的比例加入Lysis buffer并转移至50mL离心管中。使用60W的功率超声破碎Lysis buffer悬浮的菌液，具体的条件为：在冰浴中，总时间为20min，超声2sec，停顿4sec，超声破碎结束后15000rpm离心30min，获得的上清即为总蛋白样品，含有抗菌肽(见图7A)。

将总蛋白样品按照1mL/分钟的速度通过含有镍离子的亲和层析柱，采用BlanceBuffer(200mM NaCl,50mM Tris,pH调至8.0-8.1)去除未结合的杂蛋白，然后用含60mM咪唑的Wanshing Buffer(200mMNaCl,60mM咪唑，50mM Tris,pH调至8.0-8.1)洗脱弱结合蛋白，最后用含500mM咪唑的Elution Buffer(200mMNaCl,500mM咪唑，50mM Tris,pH调至8.0-8.1)洗脱并收集目的蛋白(斑节对虾ALFpm12抗菌肽)，在透析液(150mM NaCl,25mM Tris,1mM DTT,pH调至8.0-8.1)中透析除盐，测量浓度，然后制成冻干粉，-80℃保存(见图7B)，1L微生物发酵液可获得超过30mg的SUMO-ALFpm12，其浓度为625微克/毫升，按照本方法可以快速、低成本生产SUMO-ALFpm12。

透析除盐后的蛋白冻干粉在无菌去离子水中溶解成1mg/mL，然后加入SUMO蛋白酶(通用生物系统有限公司，安徽)进行酶切处理，SUMO蛋白和抗菌肽发生分离，在4℃采用SUMO蛋白酶处理12h，可以观察到SUMO蛋白和ALFpm12抗菌肽发生分离，经过SDS-PAGE电泳分离、考马斯亮蓝染色、脱色，用干净的刀片切下目的抗菌肽的胶条，经过干燥、酶解等处理后可进行MALDI-MS质谱分析，比对获得的蛋白肽，证实为目的抗菌肽(100％比对上)，获得高纯度的ALFpm12抗菌肽。

7.抗菌活性的分析

培养待测菌株，分别进行抑菌实验。菌株包括金黄色葡萄球菌、海岸微小杆菌，在20mL培养基中培养。

取200μL过夜培养物接至20mL无菌培养基中，37℃250rpm培养3h，使OD600在02-0.3左右。取培养液100μL至96孔板，以氨苄青霉素为阳性对照、PBS缓冲液为阴性对照，斑节对虾SUMO-ALFpm12、ALFpm12抗菌肽冻干粉用无菌的去离子水溶解成100μM的溶液，分别加入氨苄青霉素、PBS缓冲液和一定浓度的斑节对虾ALFpm12抗菌肽，将96孔板置于恒温培养箱孵育24h，用酶标仪测定OD600的吸光值，分析微生物生长情况。结果显示，斑节对虾ALFpm12抗菌肽具有显著的抑菌效果，与氨苄青霉素(50μg/mL)的抑菌效果相当(见图8,9,10)。SUMO-ALFpm12在16μM时对金黄色葡萄球菌的抑制率为,65.6％，氨苄青霉素(50μg/mL)的抑制率为72％，表明SUMO-ALFpm12可以有效抑制金黄色葡萄球菌的生长，且持续时间超过24小时(见图8)。SUMO-ALFpm12在16μM时对海岸微小杆菌的抑制率为62％，而氨苄青霉素(50μg/mL)的抑制率为73％；24小时后，二者的抑菌率均超过70％，表明SUMO-ALFpm12可以有效抑制海岸微小杆菌的生长，且持续时间超过24小时，SUMO-ALFpm12具有效抑杀海水细菌的潜力，对水产养殖具有重要意义(见图9)。SUMO-ALFpm12为SUMO蛋白和ALFpm12的融合蛋白，融合表达后获得可溶性高、抑菌效果强的抗菌肽，这将为生产应用大大降低成本，直接把原核表达产物用于实际生产。

SUMO-ALFpm12融合蛋白经过SUMO蛋白酶处理、分离纯化可以获得ALFpm12肽段，该肽段的抑菌率大大提高，如对海岸微小杆菌的抑菌率达到79％，远高于SUMO-ALFpm12，为将来更高要求的应用提供解决方案。ALFpm12-LBD抗菌活性分析：ALFpm12-LBD为抗菌肽ALFpm12的杀菌活性结构，通过固相化学法合成该肽段，肽段序列为：QCTYSVTPKIKSLELHFKGRMSCP，该肽段在2μM即可有效抑杀海岸微小杆菌，抑菌率超过70％，该肽段仅仅24个氨基酸，合成成本低、抑菌率高，在水产养殖中具有重要的应用价值。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 深圳大学

<120> 一种新型斑节对虾ALFpm12抗菌肽、制备方法及其应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 123

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Lys Val Ser Phe Val Val Gly Val Val Ala Leu Val Ala Ala Val

1 5 10 15

Ala Leu Phe Ala Thr Pro Cys Gln Gly Gln Ile Trp Glu Thr Leu Val

20 25 30

Pro Leu Ile Thr Gln Gln Val Val Gly Leu Trp Lys Asn Gly Glu Arg

35 40 45

Glu Phe Phe Gly His Gln Cys Thr Tyr Ser Val Thr Pro Lys Ile Lys

50 55 60

Ser Leu Glu Leu His Phe Lys Gly Arg Met Ser Cys Pro Ser Leu Ser

65 70 75 80

Ser Val Arg Gly Glu Ala Leu Thr Arg Ser Arg Ser Gly Val Glu Gly

85 90 95

Lys Thr Val Glu Asp Tyr Val Arg Lys Val Leu Ala Gln Gly Val Ile

100 105 110

Thr Glu Glu Glu Ala Lys Ala Trp Leu Thr Lys

115 120

<210> 2

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Lys Val Ser Phe Val Val Gly Val Val Ala Leu Val Ala Ala Val

1 5 10 15

Ala Leu Phe Ala Thr Pro Cys Gln Gly

20 25

<210> 3

<211> 24

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Gln Cys Thr Tyr Ser Val Thr Pro Lys Ile Lys Ser Leu Glu Leu His

1 5 10 15

Phe Lys Gly Arg Met Ser Cys Pro

20

<210> 4

<211> 661

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cgtttgcagc attcacccac cttctttccc tcacccgttt gcagcattca cccaccttct 60

ttccctcacc cgtttgcagc attcacccac cttctttccc tcacccgttt gcagcattca 120

cccaccttaa accagcgaaa aagatgaagg tctcgttcgt ggtcggcgta gtggcactgg 180

tggcagcggt ggcactcttc gctaccccgt gccagggcca gatatgggag acgctggtcc 240

ctctcatcac acagcaggtc gtggggttgt ggaaaaacgg cgaaagagaa ttttttggtc 300

accagtgcac atactcagtc acacccaaaa ttaagagtct agaactgcac tttaagggaa 360

ggatgtcctg cccgtccctt agtagtgtga gaggagaagc tttgacccgc agtcgctcgg 420

gcgtggaggg caagacggtt gaggattacg taaggaaggt cttagcacag ggcgtgataa 480

cggaggagga ggcaaaggcg tggcttacca agtaaatgaa acggaagtcg atttttttaa 540

agtcttttct acgacgatgg ttcttctgct tgatttgcat aacgtcgggc ggtttagtga 600

agctgttttc gtgaatattt gtttttgtta ttcattttta tttttatcgt tgttattggc 660

a 661

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

aacaaaaaca aatattcacg aaaac 25

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ttaaaccagc gaaaaagatg aag 23

Claims (6)

1.一种斑节对虾抗菌肽ALFpm12，其特征在于，所述斑节对虾抗菌肽ALFpm12的氨基酸序列为：SEQ ID NO：1；

所述斑节对虾ALFpm12基因的cDNA序列SEQ ID NO：4；信号肽序列为SEQ ID NO：2。

2.如权利要求1所述的斑节对虾抗菌肽ALFpm12，其特征在于，斑节对虾抗菌肽ALFpm12的有效抑菌肽段氨基酸序列为：SEQ ID NO：3。

3.一种如权利要求1所述的斑节对虾抗菌肽ALFpm12的制备方法，其特征在于，所述斑节对虾抗菌肽抗ALFpm12的制备方法包括：

通过原核表达系统，将ALFpm12的基因序列连接到pSmartI、pCold IV质粒上，与SUMO蛋白基因序列相连，转化到大肠杆菌中，通过IPTG诱导获得SUMO- ALFpm12融合蛋白，经过镍离子的亲和层析纯化获得融合蛋白，再利用SUMO蛋白酶进行酶切获得ALFpm12抗菌肽。

4.如权利要求3所述的斑节对虾抗菌肽ALFpm12的制备方法，其特征在于，ALFpm12的基因获得方法包括：

斑节对虾先用副溶血弧菌进行处理，收集处理4h的斑节对虾各组织，采用试剂盒提取细胞的总RNA，通过反转录获得cDNA；

根据ALFpm12的cDNA序列设计引物，以斑节对虾的总cDNA为模板，通过PCR克隆获得抗菌肽序列，上游引物为5' AACAAAAACAAATATTCACGAAAAC 3'，下游引物为5'TTAAACCAGCGAAAAAGATGAAG 3'，获得约661bp的特异性cDNA片段，经测序得到661bp的斑节对虾ALFpm12抗菌肽基因。

5.一种如权利要求1所述斑节对虾抗菌肽ALFpm12的制备方法，其特征在于，斑节对虾抗菌肽ALFpm12的制备方法，具体包括：

1）斑节对虾组织的收集和总RNA的提取：

组织的收集：斑节对虾用副溶血弧菌处理4小时，然后分离斑节对虾的胃、血、肝和肠等组织，放入液氮冷冻处理，存放于负八十摄氏度冰箱，即可用于后续的总RNA提取；

总RNA的提取：采取RNeasy Mini Kit提取斑节对虾的总RNA，称取不超过30mg的斑节对虾组织，在液氮条件下研磨成粉末，然后转移到干净的离心管中；加入Buffer RLT，充分振荡混匀；所有液体转移到收集管，15000rpm离心2min；加入一倍体积70%乙醇，充分混匀；吸取700μL混合物到Rneasy收集柱，15000rpm离心15秒，去除液体；加入700μL的Buffer RPE，15000rpm离心2min；将吸附柱子放入新的2mL收集管，15000rpm离心1min；将吸附柱子转移到新的1.5mL收集管，加入30-50μL的Rnase-free water，盖上盖子，15000rpm离心2min，收集管获得斑节对虾的总RNA，存储于-80℃冰箱；

2）抗菌肽cDNA序列的克隆：

根据斑节对虾ALFpm12抗菌肽序列设计引物，从斑节对虾血细胞中克隆获得抗菌肽序列，上游引物为5' AACAAAAACAAATATTCACGAAAAC 3'，下游引物为5'TTAAACCAGCGAAAAAGATGAAG 3'，采用RNeasy Mini Kit提取斑节对虾的血细胞总RNA，采用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒进行反转录获得cDNA，反转录程序为：42℃进行60min；70℃进行15 min，获得斑节对虾的cDNA；以该cDNA为模板，采用上下游引物进行扩增，PCR程序为：94℃，3min；94℃，30sec，55℃，30sec，72℃，1min，共35个循环；72℃，10min；4℃终止反应，然后进行1%琼脂糖凝胶电泳，获得约661bp的特异性cDNA片段，用干净刀片切取661bp的目的片段，采用胶回收试剂盒回收目的片段，克隆到T-vector上，进行基因测序，得到661bp的斑节对虾ALFpm12抗菌肽基因。

6.如权利要求5所述的斑节对虾抗菌肽ALFpm12的制备方法，其特征在于，抗菌肽cDNA序列克隆后，还需进行抗菌肽基因的表达及蛋白纯化：

抗菌肽序列通过限制性内切酶SacI和XhoI连接到pSmartI载体上，通过NdeI和XhoI连接到原核表达载体pCold IV，经PCR筛选获得抗菌肽序列正确插入的重组质粒，然后转化到大肠杆菌BL21中；含有重组质粒的大肠杆菌BL21接种于含卡那霉素的LB液体培养基中，于200rpm，37℃恒温振荡培养至OD600=0.3-0.6时，加入终浓度为1mmol/L的IPTG在200rpm诱导6-24h；将诱导完毕的菌液于5000rpm离心10min，弃上清，用含20mM Tris，pH8.0，200mMNaCl，25mM咪唑的Lysis buffe重新悬浮菌块并转移至50mL离心管中，按1g菌体加入10mL的Lysis buffer的比例；使用 60W的功率超声破碎Lysis buffer悬浮的菌液，条件为：在冰浴中，总时间为20min，超声2sec，停顿4sec，超声破碎结束后15000 rpm离心30min，获得的上清为总蛋白样品，含有抗菌肽；

将总蛋白样品按照1mL/分钟的速度通过含有镍离子的亲和层析柱，采用含200 mMNaCl, 50 mM Tris, pH调至8.0-8.1的Blance Buffer去除未结合的杂蛋白，然后用含200mM NaCl, 60mM咪唑，50 mM Tris, pH调至8.0-8.1的Wanshing Buffer洗脱弱结合蛋白，最后用含200 mMNaCl, 500 mM咪唑，50 mM Tris, pH调至8.0-8.1的Elution Buffer洗脱并收集目的蛋白，在150 mM NaCl, 25 mM Tris,1 mM DTT, pH调至8.0-8.1的透析液中透析除盐，然后制成冻干粉，-80℃保存；

透析蛋白的冻干粉在无菌去离子水中溶解成1mg/mL，然后加入SUMO蛋白酶进行酶切处理，SUMO蛋白和抗菌肽发生分离，经过SDS-PAGE电泳分离、考马斯亮蓝染色、脱色，用干净的刀片切下目的抗菌肽的胶条，经过干燥、酶解处理后进行MALDI-MS质谱分析，比对获得的蛋白肽；

抗菌肽基因的表达及纯化后，还需进行抗菌活性的分析：

培养待测菌株，进行抑菌实验；菌株包括金黄色葡萄球菌、海岸微小杆菌，在20mL培养基中培养者至对数中期；具体包括：

取200μL过夜培养物接至20mL无菌培养基中，37℃ 250rpm培养3h，使OD600在0.2-0.3；取培养液100μL至96孔板，以氨苄青霉素为阳性对照、PBS缓冲液为阴性对照，斑节对虾ALFpm12抗菌肽冻干粉用无菌的去离子水溶解成100μM的溶液，分别加入氨苄青霉素、PBS缓冲液和一定浓度的斑节对虾ALFpm12抗菌肽，将96孔板置于恒温培养箱孵育24h，用酶标仪测定OD600的吸光值，分析微生物生长情况。

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