CN107201372B - 斑节对虾过氧化物还原酶1编码基因序列及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了斑节对虾过氧化物还原酶1编码基因序列及其用途。具体而言，本发明提供了：(1)一种斑节对虾Prx1的cDNA；(2)一种由上述斑节对虾Prx1的cDNA编码的氨基酸序列；(3)一种含有上述斑节对虾Prx1的cDNA的表达载体；(4)一种制备斑节对虾Prx1重组蛋白的方法和(5)一种检测由上述方法制备而成的斑节对虾Prx1重组蛋白的活性的方法。

Description

斑节对虾过氧化物还原酶1编码基因序列及其用途
技术领域
本发明涉及一种对虾过氧化物还原酶的基因序列，更具体涉及斑节对虾过氧化物还原酶1编码基因序列及其用途。
背景技术
对虾只能依靠先天免疫作为第一道防线来防止入侵病原微生物和环境毒性应激；过氧化物还原酶可用于对虾的先天免疫反应。过氧化物还原酶是普遍存在的、分子量为20-30kDa的、丰富的、多功能的和进化上保守的抗氧化酶家族。过氧化物还原酶主要通过清除过氧化物以保护细胞免受活性氧引起的氧化损伤。此外，过氧化物还原酶在免疫反应，分子伴侣，细胞内氧化还原信号转导，细胞增殖，分化和凋亡，DNA突变，肿瘤，癌症，NK细胞活性增强等方面也起重要作用。
过氧化物还原酶1(Prx1)属于过氧化物还原酶家族中重要的一员，在各个门类中都发挥重要作用。斑节对虾Prx1的cDNA是从斑节对虾中分离出序列。斑节对虾Prx1 cDNA编码198个氨基酸多肽,具有951个碱基对(bp)。斑节对虾Prx1蛋白有保守的过氧化物还原酶结构域和过氧化物酶催化中心。从系统发育分析和序列图中可以看出，斑节对虾Prx1在对虾过氧化物还原酶家族中属于典型的2-Cys过氧化物还原酶成员，和过氧化物具有较强的亲和性质。对于转录水平，斑节对虾Prx1的mRNA在各组织中被普遍检测到，表明其在对虾生理过程中起关键作用。科学研究还表明，斑节对虾Prx1在消除由病毒或细菌感染介导的免疫反应和炎症过程中起着关键作用(Wang et al.,2015)。
本研究提供了斑节对虾Prx1基因在对虾中具有应对各种毒物因子的有用信息，有助于进一步探索斑节对虾Prx1的功能机制，可作为应用于生态毒理学的新型分子生物标志物，或作为虾类抗病或增强虾类免疫力药物使用，有助于了解多种生理活动。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种斑节对虾Prx1的cDNA。
本发明的第二个目的是提供一种由上述斑节对虾Prx1的cDNA编码的氨基酸序列。
本发明的第三个目的是提供一种含有上述斑节对虾Prx1的cDNA的表达载体。
本发明的第四个目的是提供一种制备斑节对虾Prx1重组蛋白的方法。
本发明的第五个目的是提供一种检测由上述方法制备而成的斑节对虾Prx1重组蛋白的活性的方法。
本发明的第六个目的是提供一种检测由上述方法制备而成的斑节对虾Prx1重组蛋白对提高对虾免疫力和成活率的效果的方法。
本发明的第一个目的是通过如下技术方案来实现的：
一种斑节对虾Prx1的cDNA，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明上述斑节对虾Prx1的cDNA，其具体通过如下方法获得：根据已构建的cDNA文库筛选斑节对虾Prx1的EST序列，在对目的基因的EST序列进行验证后，设计PCR引物。利用cDNA末端快速扩增(Rapid Amplification of cDNA ends,RACE)技术对目的基因的3ˊ和5ˊ末端进行PCR扩增获得斑节对虾Prx1基因的全长序列。来自斑节对虾的Prx1的全长cDNA序列为951bp，含有43bp的5'-非翻译区(UTR)，314bp的3'-UTR，具有poly(A)尾巴。开放阅读框(ORF)为594bp，编码198个氨基酸，分子量22kDa，PI为5.3。在所有实验组织中，斑节对虾Prx1 mRNA中被普遍检测到，表明在生理过程中起持续起作用。我们选择鳃和肝胰腺作为目标组织，用细菌刺激(哈维氏弧菌和无乳链球菌)及环境毒性应激(重金属，渗透压和酸碱度应激)处理后，结果显示该基因在免疫器官中表达量明显升高，并被外源刺激诱导表达，预示在斑节对虾抗菌及抗应激等生理过程中起重要作用。
本发明的第二个目的是通过如下技术方案来实现的：
一种由上述斑节对虾Prx1的cDNA编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明的第三个目的是通过如下技术方案来实现的：
一种含有上述斑节对虾Prx1的cDNA的表达载体，其特征在于：所述的表达载体包含上述斑节对虾Prx1的ORF序列。
本发明的第四个目的是通过如下技术方案来实现的：
一种制备斑节对虾Prx1重组蛋白的方法，其特征在于包括：使用上述斑节对虾Prx1的cDNA的表达载体转化寄主细胞、培养转化体、纯化获得重组的斑节对虾Prx1蛋白，所述的寄主细胞为原核或真核细胞。
优选地，所述的寄主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)。
本发明的第五个目的是通过如下技术方案来实现的：
一种检测由上述方法制备而成的斑节对虾Prx1重组蛋白的活性的方法，其特征在于：在体外对由上述方法制备而成的斑节对虾Prx1重组蛋白的抗氧化酶活性进行测定，并利用琼脂糖扩散法检测重组的对虾Prx1结合蛋白的抑菌效果。
本发明的第六个目的是通过如下技术方案来实现的：
一种检测由上述方法制备而成的斑节对虾Prx1重组蛋白对提高对虾免疫力和成活率的效果的方法，其特征在于包括以下步骤：
步骤1：将斑节对虾分为实验组和对照组，向所述的实验组中的斑节对虾注射由上述方法制备而成的斑节对虾Prx1重组蛋白；所述的对照组不作任何处理；
步骤2：对实验组和对照组的斑节对虾进行细菌刺激和环境毒性应激处理后，进行死亡率统计；所述的细菌刺激中的细菌包括哈维氏弧菌和无乳链球菌；所述的环境毒性应激包括重金属，渗透压和酸碱度应激。
通过比较实验组和对照组的死亡率，可以确定由上述方法制备而成的斑节对虾Prx1重组蛋白在抗逆过程中的实际效果。
有益效果：
本发明从对虾样品中得到一个新的斑节对虾Prx1的cDNA序列，通过基因工程技术对其功能研究，发现该序列在真核或原核细胞中可以高效表达；本发明还将上述斑节对虾Prx1的cDNA序列克隆到原核或真核表达载体上，转化大肠杆菌感受态细胞，通过阳性克隆子的诱导表达得到其重组蛋白，研究其性质发现，斑节对虾Prx1基因在免疫组织中特异性高表达，并受外源毒性刺激后通过上调或者下调，其重组纯化蛋白对细菌具有抑制生长作用，在斑节对虾活体注射实验中亦发现其可以降低有害刺激所引发的死亡率升高现象，揭示其可以作为虾类抗菌或增强虾类免疫力药物使用。
附图说明
图1显示斑节对虾Prx1的blastP结果，含有thioredoxin(TRX)-like superfamily家族中Typical 2-Cys PRX subfamily结构域；
图2斑节对虾Prx1的核苷酸和推导的氨基酸序列；每行的数字表示核苷酸或氨基酸的位置；起始密码子(ATG)和终止子密码子(TAA)被框着；硫氧还蛋白超家族信号区标注为灰色；氧化还原活性位点标为成绿色；两个活性半胱氨酸标为红色(被三角形圈起)，聚腺苷酸化信号序列(AATAAA)是粗体，poly(A)信号序列是斜体；
图3是通过实时定量PCR检测不同组织中斑节对虾Prx1的相对表达水平，EF-1α被选为内参基因；
图4A经细菌刺激(哈维氏弧菌和无乳链球菌)后，斑节对虾Prx1在鳃中表达分布特征，EF-1α被选为内参基因，*代表P<0.05,**代表P<0.01；
图4B经细菌刺激(哈维氏弧菌和无乳链球菌)后，斑节对虾Prx1在肝胰腺中表达分布特征，EF-1α被选为内参基因，*代表P<0.05,**代表P<0.01；
图5A经铜、锌、铬刺激后，斑节对虾Prx1在鳃中表达分布特征，EF-1α被选为内参基因，*代表P<0.05,**代表P<0.01；
图5B经铜、锌、铬刺激后，斑节对虾Prx1在肝胰腺中表达分布特征，EF-1α被选为内参基因，*代表P<0.05,**代表P<0.01；
图6A经高、低盐刺激后，斑节对虾Prx1在鳃中表达分布特征，EF-1α被选为内参基因，*代表P<0.05,**代表P<0.01；
图6B经高、低盐刺激后，斑节对虾Prx1在肝胰腺中表达分布特征，EF-1α被选为内参基因，*代表P<0.05,**代表P<0.01；
图7A经不同PH(PH＝7，PH＝9)刺激后，斑节对虾Prx1在鳃中表达分布特征，EF-1α被选为内参基因，*代表P<0.05,**代表P<0.01；
图7B经不同PH(PH＝7，PH＝9)刺激后，斑节对虾Prx1在肝胰腺中表达分布特征，EF-1α被选为内参基因，*代表P<0.05,**代表P<0.01；
图8斑节对虾Prx1基因在大肠杆菌中的融合表达蛋白，其中：M：蛋白marker；1.pRSET空载体的E.coli BL21菌株，IPTG诱导表达；2-4.pRSET-PmPrx1的E.coli BL21重组菌株，IPTG诱导表达，诱导时间分别为：0小时，2小时，6小时，8小时；图A是其SDS-PAGE结果，图B为其Western blot结果；
图9Ni-NTA树脂亲和纯化的斑节对虾Prx1原核表达蛋白，其中M：蛋白marker；1-2.Ni-NTA树脂亲和纯化的pRSET-PmPrx1，分别为第一收集管，第二收集管；
图10重组斑节对虾Prx1的抗氧化活性检测实验，通过催化过氧化氢反应的方法测定；
图11斑节对虾Prx1重组蛋白的体外对细菌的抗菌效果检测；
图12示出了斑节对虾Prx1重组蛋白注射组死亡率明显低于PBS注射组。
具体实施方式
下面通过以下具体实施方式对本发明作进一步阐述，但是本发明的内容完全不局限于此。
1.总RNA的提取和全长cDNA文库构建
1.1总RNA的提取
鲜活健康斑节对虾(体重约30g)在我们南海水产研究所的深圳实验基地内暂养7d后(水温约25±1℃，气泵充气，盐度：3.3％)，解剖虾体取出各组织约100mg，放入1mLRNALater(Ambion,CA,USA)中，根据试剂说明，使用TRIzol试剂(Invitrogen，Shanghai，China)从解剖组织(约50mg)中纯化总RNA。通过260/280nm处的UV吸光度比(NanoDrop-2000，Thermo Fisher，USA)检测RNA的质量，并得到其浓度，同时通过1.2％琼脂糖凝胶电泳测量质量。
1.2总RNA的提取，全长cDNA模板的制备
根据PrimeScript TM Reverse Transcriptase试剂盒(TaKaRa，Dalian，China)的说明书，用1μg总RNA合成第一条cDNA，在42℃,反应2分钟。取以上反应液进行扩增反应，37℃，40分钟，85℃，5秒，取出将母液于-80℃保存备用，普通PCR工作液浓度70ng/μL备用，定量PCR工作液浓度30ng/μL备用，放-20℃进行使用。
2.斑节对虾Prx1基因cDNA全序列的克隆
2.1 EST序列验证
从之前构建的cDNA文库中筛选斑节对虾Prx1的EST序列。使用PmPrx1-F5'-ATGAGCAACACTGTTCCAGC-3’和PmPrx1-R 5'-CAATAGCTGGAACAGTGTTGC-3’引物验证EST序列。
以上述合成的cDNA作为模板，用进行PCR扩增，反应体系为：超纯水17μL，cDNA模版1μL，10mmol/L dNTP 2μL，10nmol/L引物F和R各1μL，Extaq酶0.5μL，10x Extaq buffer 2.5μL,共25μL。反应条件为：94℃变性3min；33个循环：94℃高温变性30s,56℃低温退火30s,72℃延伸1:30min；72℃延伸10min；4℃保温。所扩增的PCR产物用1.2％的琼脂糖凝胶电泳进行检测，从凝胶中纯化回收目的产物。然后将纯化的PCR产物克隆到pUC-19T载体中，转化大肠杆菌DH-5α感受态细胞，挑取阳性克隆单菌株，220rpm,摇6h，提质粒，并用M13通用引物进行测序。
2.2斑节对虾Prx1全长cDNA的获得
根据已验证的EST序列片段设计特异性引物。利用cDNA末端快速扩增(RapidAmplification of cDNA ends,RACE)技术对目的基因的3’末端进行PCR扩增。
依据序列合成3’-RACE引物：一扩引物5’-GCAGAATCTCCGTCAGGTAACAAT-3’和2扩引物5’-AGTATGCCCTGCTGGCTGGAAACC-3’，采用上述合成的全长cDNA为模板，采用touchdownPCR和nest PCR的方法，按照
Figure GDA0002716050720000062
RACE 5'/3'试剂盒(TaKaRa,Japan)进行3’RACE PCR扩增。第一次反应体积为25μL，反应条件为个94℃变性3min；9个循环：94℃变性30s,72℃【-1℃】退火30s,72℃延伸1:30min,每循环一次降1℃；24个循环：94℃变性30s,62℃退火30s,72℃延伸1：30min；72℃延伸10min；4℃保温。2扩体系保持不变，反应条件为94℃变性3min；33个循环：94℃变性30s,68-62℃(梯度反应)退火30s,72℃延伸1：30min；72℃延伸10min；4℃保温。PCR产物经1.2％琼脂糖凝胶电泳分离，亚克隆PUC-19T载体，T7、SP6进行测序反应获得3’RACE片段314bp的核酸序列，拼接后获得全长cDNA为951bp(图2)。
2.3斑节对虾Prx1的生物信息学分析
Figure GDA0002716050720000061
Figure GDA0002716050720000071
表1-斑节对虾Prx1的blast分析结果
用Blast(http://www.ncbi.nim.nih.gov/)进行同源性分析，结果上表1所示，该基因与印度明对虾、日本囊对虾、凡纳滨对虾等的prx1蛋白有高度同源性，揭示该基因是prx1基因。利用DNAstar等工具进行生物信息学分析，揭示起始密码ATG位于44-46核苷酸，终止密码子位于637-639核苷酸，开放读码框为594个核苷酸，推测编码一个198个氨基酸的蛋白(图2)。5’UTR为43bp，3’UTR为314bp，3’UTR存在典型的加尾信号AATAAA(图2)。预测分子质量22kDa和理论PI值为5.3。利用ExPASy软件和SignalIP软件分析该蛋白显示，斑节对虾Prx1蛋白序列属于硫氧还蛋白超家族，具有从第六个氨基酸到第164个的TRX折叠结构域。它含有两个高度保守的半胱氨酸残基，一个氧化还原活性位点(TFVCPT)，两个Prx特征基序(FYPLDFTFVCPTEI和GEVCPA)和两个活性半胱氨酸(Cys 51和Cys 172)(图1)，但斑节对虾Prx1缺乏信号肽。
3.PCR检测斑节对虾Prx1在斑节对虾不同组织的分布
提取了雌雄斑节对虾的不同组织(包括卵巢，心脏，肝胰脏，肠，脑，胸神经，肌肉，鳃，胃，淋巴)的RNA。总RNA的提取方法见前所述。
PCR反应使用定量引物qPmPrx1-F(5’-TACCCTTTGGATTTCACCTTTGTC-3’)和qPmPrx1-R(5’-ATTGATTGTTACCTGACGGAGATT-3’)扩增斑节对虾Prx1基因，看家基因EF-1α(GenBank:DQ021452.1)(EF-F5’-ATGGTTGTCAACTTTGCCCC-3’，EF-R 5’-TTGACCTCCTTGATCACACC-3’)作为内参，以上述合成的cDNA作为模板。反应总体系为12.5μL，含有6.25μL的2×SYBR Pre-Mix ExTaq(TaKaRa，Dalian，China)，1μL cDNA模板，0.5μL30mmol/L的每个正向和反向引物，以及4.25μL去离子水。PCR反应条件设定为94℃，30s，然后40个循环：94℃，5s，60℃，30s，72℃，30s。溶解曲线分析为65-95℃，以确保每个单一产物的扩增。通过2-ΔΔCt方法分析斑节对虾Prx1的相对表达水平。
4.PCR检测斑节对虾Prx1的mRNA在不同免疫刺激条件下的表达
现在,病原体和环境毒性刺激都严重威胁着全球对虾养殖业的发展，造成了巨大的经济损失。这其中，包括哈维氏弧菌，无乳链球菌病害，以及重金属，高低pH,高盐低盐胁迫。细菌免疫或环境胁迫通常会引起吞噬作用，诱导活性氧(ROS)的产生。只能依赖先天免疫的甲壳动物已发展出保护性抗氧化系统，其中的过氧化物酶(Prx)是最后发现的，具有免疫功能的基因，Prx诱导表达的基因往往被认为参加了宿主抗菌的天然免疫过程。为确认斑节对虾Prx1是否参与这一过程，进行了相应菌和环境毒性物质刺激表达实验。
健康斑节对虾按照100μL 1×108CFU/mL密度的哈维氏弧菌，无乳链球菌，对照组注射100μL PBS缓冲液(NaCl 137mM，KCl 2.7mM，Na2HPO4 10mM，KH2PO4 2mM，pH 7.4)血液注射。注射后0,6,12,24,48,72和96h取鳃和肝胰腺，剪碎后置于RNAlater中保存。此外，我们分别配置0.18mg/L铜，0.506mg/L锌和7.73mg/L镉，pH 7.0±0.1,pH 9.0±0.1，盐度为2.3％，4.3％的海水，然后将健康的斑节对虾放入其中进行浸泡，并以正常海水中的对虾为对照组，重金属和酸碱度实验分别于0,6,12,24,48,和96h取鳃和肝胰腺，高盐低盐实验于0,4,8,16,和32h取鳃和肝胰腺，剪碎后置于RNAlater中保存，并带回实验室分析。
总RNA抽提方法和cDNA逆转录方法见前所述。根据斑节对虾Prx1基因的全cDNA设计荧光定量PCR引物见前所述,同时选用EF-1α作为内参基因。定量体系以及反应程序都如前所述。结果见附图4A-图5B，斑节对虾Prx1在注射后有显著的上调或者下调，表达量显著异于对照组，说明斑节对虾Prx1受免疫刺激后参与此免疫过程，是免疫应答表达蛋白。
5.斑节对虾Prx1融合蛋白的制备
通过PCR(rPmPrx1-F5’-CGACGATGACGATAAGGATCCATGAGCAACACTGTTCCAGC-3’，rPmPrx1-R5’-GTTAGCAGCCGGATCAAGCTTCAATAGCTGGAACAGTGTTGC-3’；)扩增整个斑节对虾Prx1编码区，并克隆到pRSET质粒中。将重组质粒pRSET-PmPrx1转化到大肠杆菌BL21(DE3)菌株中。只有pRSET的转化体也转化到用作对照组的大肠杆菌BL21(DE3)菌株中。将两种大肠杆菌BL21细胞在含有100μg/mL氨苄青霉素的Luria-Bertani(LB)培养基中培养，直至大肠杆菌BL21细胞溶液的OD600达到0.4～0.6。当将1mM异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)以终浓度为1mol/L加入LB培养基中时，在37℃，220rpm下诱导细胞8h。根据His-bindingPurification Kit说明书(Novagen)，通过Ni-NTA亲和层析纯化重组斑节对虾Prx1蛋白。通过SDS-PAGE和Western blot对纯化蛋白进行验证，于29kDa左右处有明显条带，去除由载体添加的6×His标签融合蛋白，和我们所预测的斑节对虾Prx1蛋白为22kDa结果一致。所得斑节对虾Prx1蛋白的浓度使用改良的BCA蛋白测定试剂盒(Sangon Biotech,Shanghai,China)。我们将纯化的重组斑节对虾Prx1蛋白储存在-80℃下为进一步使用。
6.斑节对虾Prx1基因编码蛋白的抗氧化酶活性检测和抗菌活性测定
我们利用过氧化物酶催化过氧化氢反应的原理，通过测定420nm处吸光度的变化得出酶活性的大小。根据过氧化物测试盒说明书(南京建城生物工程研究所，南京，中国)，按要求加入指定试剂和蛋白，37℃下准确反应半小时后，加入显色试剂，3500rpm，10min，将样品冷却至测量温度，测试OD420nm处的吸光度，根据说明书，计算PmPrx1蛋白的酶活性大小。其一，我们选择对虾的生长低温20℃和生长高温37℃作为不同反应条件，进行了斑节对虾Prx1重组蛋白酶活测定试验，显示斑节对虾Prx1重组蛋白是温度依赖型蛋白，随温度升高，酶活性升高。其二，我们进行了不同斑节对虾Prx1重组蛋白剂量的测定，即每个体系中分别加入10μg，20μg PmPrx1蛋白，在37℃温度下进行测定，结果显示，该蛋白为剂量依赖性蛋白(图10)。
通过琼脂扩散试验检测重组pRSET-PmPrx1蛋白体外抑菌活性。具体步骤为：取哈维氏弧菌和无乳链球菌菌种，涂布在营养琼脂培养基平板上，37℃培养
Figure GDA0002716050720000105
Figure GDA0002716050720000106
活化；然后分别挑取单菌落，将单菌落于LB液体培养基中，37℃培养
Figure GDA0002716050720000104
Figure GDA0002716050720000103
活化扩大培养；取0.1ml置于LB琼脂平板上，用灭菌的L形曲玻璃棒均匀涂布，略干后，分别将用相同浓度pRSET-PmPrx1蛋白，pRSET蛋白，PBS浸泡的无菌滤纸片放哈维氏弧菌和无乳链球菌涂布平板上，每个无菌纸片的距离大于等于24mm,每种菌株各做三个平行，铺好后，将平板正置温箱内37℃培养
Figure GDA0002716050720000101
Figure GDA0002716050720000102
检测重组蛋白对各种菌的抑菌效果。结果显示重组斑节对虾Prx1蛋白对哈维氏弧菌具有强溶解活性和对无乳链球菌只有轻微溶解活性。纯化的pRSET蛋白和PBS没有抗菌性能(图11)。重要结果表明，纯化的斑节对虾Prx1重组蛋白的抗菌性能表现出对病原菌的抑制具有选择性作用，该蛋白对哈维氏弧菌更敏感。
7.斑节对虾Prx1重组蛋白在斑节对虾活体中的抗菌功能研究
为了进一步确定斑节对虾Prx1重组蛋白在斑节对虾活体中对于哈维氏弧菌及无乳链球菌的抗菌效果，进行如下实验。实验用斑节对虾分成四组每组25尾.第一组及第二组作为对照组在注射50uL灭菌的磷酸盐缓冲盐水(PBS，pH7.4)12小时后分别注射50uL哈氏弧菌悬液(0.5*109CFU/mL)或50uL无乳链球菌悬液(0.5*109CFU/mL)；第三组、第四组作为实验组在注射20uL的斑节对虾Prx1重组蛋白(5μg/g)12小时后，分别注射50uL哈氏弧菌悬液(0.5*109CFU/mL)或50uL无乳链球菌悬液(0.5*109CFU/mL)。分别于12h，24h，48h，72h和96h后记录死亡情况。结果显示，斑节对虾Prx1重组蛋白注射组死亡率明显低于PBS注射组(图12)。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国水产科学研究院南海水产研究所
<120> 斑节对虾过氧化物还原酶1编码基因序列及其用途
<130> 002
<160> 2
<170> BiSSAP 1.3.6
<210> 1
<211> 951
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 斑节对虾Prx1的cDNA的核苷酸序列
<400> 1
ggcacgaggg tcgttgagac aagagaatac caagaccacc accatgagca acactgttcc 60
agctattggc aaacctgccc ctgtcttcaa gggcactgct gttgttgatg ggcagttcaa 120
ggagatctcc ctggaagatt acaagggcaa atatgtcatt ttcttcttct accctttgga 180
tttcaccttt gtctgcccca ctgaaattat cgccttctct gaccgtgttg aagaattcag 240
gaaaattgga tgcgaagtgg ttgcttgctc tacagactcc cacttctccc accttgcttg 300
gatcaacact ccccgcaagg aaggtggtct tggtacgatg aagatccctc ttctggctga 360
caagtcaatg gaagttgcaa aggcttacgg agtccttaag gaggatgaag gcattgcttt 420
cagaggcctc tttgttattg atggcaagca gaatctccgt caggtaacaa tcaatgacct 480
gccagttggg cgtgatgtag atgaaacgct gcgattagta caagccttcc agttcacaga 540
tgagcatggt gaagtatgcc ctgctggctg gaaacccgga gccaagacaa tgaaggccga 600
tcctactggc agcaaagaat acttccagaa tgaaaattaa tataacatca tcatttcttg 660
gatatttttt ttctcctttt ataaaatatt taggatctgt cttgttcaaa agagttggca 720
ttcaggatat ggcattaggt tcattctggt aatgatcttt ccttttgttt aaaaccggtt 780
tgaaagctca agtaattaca gtacacaaca tagtttgaat caaaataagt tcaggttatt 840
ttgaagaaaa gctgcgttat atcacagtat cagtattcta tgtttagaag gtgtatattt 900
aatcaataaa cttgccagtc aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa a 951
<210> 2
<211> 198
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 一种由上述斑节对虾Prx1的cDNA编码的氨基酸序列
<400> 2
Met Ser Asn Thr Val Pro Ala Ile Gly Lys Pro Ala Pro Val Phe Lys
1 5 10 15
Gly Thr Ala Val Val Asp Gly Gln Phe Lys Glu Ile Ser Leu Glu Asp
20 25 30
Tyr Lys Gly Lys Tyr Val Ile Phe Phe Phe Tyr Pro Leu Asp Phe Thr
35 40 45
Phe Val Cys Pro Thr Glu Ile Ile Ala Phe Ser Asp Arg Val Glu Glu
50 55 60
Phe Arg Lys Ile Gly Cys Glu Val Val Ala Cys Ser Thr Asp Ser His
65 70 75 80
Phe Ser His Leu Ala Trp Ile Asn Thr Pro Arg Lys Glu Gly Gly Leu
85 90 95
Gly Thr Met Lys Ile Pro Leu Leu Ala Asp Lys Ser Met Glu Val Ala
100 105 110
Lys Ala Tyr Gly Val Leu Lys Glu Asp Glu Gly Ile Ala Phe Arg Gly
115 120 125
Leu Phe Val Ile Asp Gly Lys Gln Asn Leu Arg Gln Val Thr Ile Asn
130 135 140
Asp Leu Pro Val Gly Arg Asp Val Asp Glu Thr Leu Arg Leu Val Gln
145 150 155 160
Ala Phe Gln Phe Thr Asp Glu His Gly Glu Val Cys Pro Ala Gly Trp
165 170 175
Lys Pro Gly Ala Lys Thr Met Lys Ala Asp Pro Thr Gly Ser Lys Glu
180 185 190
Tyr Phe Gln Asn Glu Asn *
195

Claims (1)

1.斑节对虾Prx1重组蛋白在制备同时对于哈维氏弧菌及无乳链球菌具有抗菌效果的药物中的应用，所述斑节对虾Prx1重组蛋白通过以下方法制备获得：包括使用斑节对虾Prx1的cDNA的表达载体转化寄主细胞、培养转化体、纯化获得重组的斑节对虾Prx1蛋白，所述的寄主细胞为原核或真核细胞，所述斑节对虾Prx1的cDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
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黄河鲤鱼2-Cys型过氧化物还原酶基因的分子克隆、原核表达与活性分析;杨玉珠;《中国优秀硕士学位论文全文数据库农业科技辑》;20170315(第3期);第116页第5.2.9节 *

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