CN111304177B

CN111304177B - 一种重组蛋白swHO1的制备方法及应用

Info

Publication number: CN111304177B
Application number: CN202010107683.6A
Authority: CN
Inventors: 李伟; 孙文秀; 臧彧伟
Original assignee: Yangtze University
Current assignee: Yangtze University
Priority date: 2020-02-21
Filing date: 2020-02-21
Publication date: 2022-05-24
Anticipated expiration: 2040-02-21
Also published as: CN111304177A

Abstract

本发明公开了一种重组蛋白swHO1的制备方法，提取黄鳝肝脏组织总RNA，通过反转录和PCR扩增，将黄鳝血红素氧化酶1的编码基因克隆到表达载体上，获得重组表达载体pET‑HO1；将所述重组表达载体pET‑HO1转化到大肠杆菌BL21(DE3)细胞中进行表达，纯化，得到重组蛋白swHO1。一种重组蛋白swHO1在病原细菌诱导的黄鳝氧化应激调控中的应用、及黄鳝免疫相关基因表达调控中的应用。本发明构建了黄鳝血红素氧化酶1基因的原核表达载体，诱导表达，亲和层析获得纯化的重组蛋白swHO1。本发明制备的黄鳝血红素氧化酶1具有提高病原细菌处理的血清组织中抗氧化能力和提高肝脏免疫相关基因表达的作用。

Description

一种重组蛋白swHO1的制备方法及应用

技术领域

本发明属于重组基因蛋白技术领域，具体涉及一种重组蛋白swHO1的制备方法及应用。

背景技术

血红素氧化酶是生物体内血红素降解过程中的重要限速酶，它可以将血红素降解为一氧化碳(CO)、胆绿素和Fe²⁺。这三种产物在机体内具有抗氧化、抗炎症和促进细胞自噬及调控细胞凋亡与增殖的作用。目前已知，哺乳动物血红素氧化酶有1、2和3三种主要的同工酶。黄鳝(Monopterus albus)的HO1基因是否在病原细菌诱导的氧化应激中能够起到的调控作用和对免疫相关基因表达有什么的影响，未见相关报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种重组蛋白swHO1的制备方法，并且所制备的重组蛋白swHO1能够降低病原细菌感染诱导的氧化应激水平、提高抗氧化能力并能显著提高免疫相关基因的表达。其技术方案如下：

一种重组蛋白swHO1的制备方法，提取黄鳝肝脏组织总RNA，通过反转录和PCR扩增，将黄鳝血红素氧化酶1的编码基因克隆到表达载体上，获得重组表达载体pET-HO1；将所述重组表达载体pET-HO1转化到宿主细胞中进行表达，纯化，得到重组蛋白swHO1。

一种所述方法制备得到的重组蛋白swHO1。

一种重组蛋白swHO1在病原细菌诱导的黄鳝氧化应激调控中的应用。

一种重组蛋白swHO1在病原细菌诱导的黄鳝免疫相关基因表达调控中的应用。

本发明提供的技术方案至少包括以下有益效果：

1、本发明采用基因工程的方法，构建了黄鳝血红素氧化酶1基因的原核表达载体，诱导表达，亲和层析获得纯化的重组蛋白swHO1。

2、本发明制备的重组蛋白swHO1，一定程度上抑制了血清中ROS的水平，并提高血清总抗氧化能力。

3、本发明制备的重组蛋白swHO1具有调控肝脏免疫相关基因表达的作用。重组蛋白swHO1能够一定程度上激活内源性HO1基因的表达，能够抑制Nrf2-keap1-ARE信号途径，从而起到平衡ROS产生的氧化应激，起到保护机体细胞的作用。另外，重组蛋白swHO1可以显著提高急性应激期肝脏中Hepcidin基因的表达。

本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。

附图说明

图1为本发明实施例提供的黄鳝HO1基因表达和纯化后的SDS-PAGE图，其中，最左侧泳道为Marker；泳道1为阴性对照(含pET-28a(+)质粒菌株诱导后)；泳道2为阳性对照(含pET-HO1质粒菌株未诱导)；泳道3为含pET-HO1质粒菌株诱导后；泳道4为纯化的重组蛋白swHO1；

图2为本发明实施例提供的黄鳝重组蛋白swHO1对病原菌处理的血清ROS水平的影响图；

图3为本发明实施例提供的黄鳝重组蛋白swHO1对病原菌处理的血清T-AOC水平的影响图；

图4为本发明实施例提供的黄鳝重组蛋白swHO1对病原菌处理的肝脏HO1基因表达的影响图；

图5为本发明实施例提供的黄鳝重组蛋白swHO1对病原菌处理的肝脏Nrf2基因表达的影响图；

图6为本发明实施例提供的黄鳝重组蛋白swHO1对病原菌处理的肝脏抗菌肽基因Hepcidin表达的影响图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明作进一步地详细描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，均属于本发明保护的范围。

实施例1黄鳝HO1基因的克隆

(1)按照Trizol试剂说明书提取黄鳝肝脏总RNA，利用M-MLV反转录酶合成cDNA，合成cDNA于-80℃低温保存备用；

(2)根据已知鱼类的HO1基因序列，设计了一对简并引物de-HO1-F(如SEQ ID NO:1所示，5’-CACRGARCTBATGCTGAGCT-3’)和de-HO1-R(如SEQ ID NO:2所示，5’-CTGSTGGCCCACGCKTACACC-3’)，用来扩增上述反转录合成得到的黄鳝HO1基因的cDNA片段；

(3)所述扩增产物进行纯化后与pEASY-T1载体连接，转化至DH5a感受态细胞中，鉴定得到阳性克隆片段；

(4)根据所得cDNA片段设计基因特异性引物HO5GSP(如SEQ ID NO:3所示，5’-ATCTACCAGGCCCTGGAGGAAGAGATGGACAGGAAC-3’)和HO3GSP(如SEQ ID NO:4所示，5’-GGAGGTCAGGTCTTGGGTCGAATCGCTC-3’)，分别用于上述步骤(1)中合成cDNA片段的5’和3’末端的RACE扩增，并得到cDNA末端序列；

(5)将上述阳性克隆片段与上述cDNA末端序列进行拼接后即得到黄鳝HO1基因全长cDNA序列(如SEQ ID NO:5所示)。

实施例2原核表达载体的构建

按照Trizol试剂盒说明书提取黄鳝肝脏组织总RNA利用MMLV反转录酶进行合成cDNA第一条链。

以实施例1制备的黄鳝HO1基因全长cDNA序列为模板，re-ex-F和re-ex-R为引物，进行PCR扩增。将PCR产物和pET-28a(+)表达载体进行双酶切，回收纯化，连接转化大肠杆菌DH5α，获得重组表达载体pET-HO1。

具体的，特异性引物re-ex-F(如SEQ ID NO:6所示，5’-CAAGGATCCATGGAAGCAGAGAAGAAAAC-3’)和re-ex-R(如SEQ ID NO:7所示，5’-CAACTCGAGTAAAACGTAGATTCCCATA-3’)，在正向引物re-ex-F、反向引物re-ex-R分别添加了Bam HⅠ和XhoⅠ酶切位点。

采用引物re-ex-F和re-ex-R扩增黄鳝HO1基因的成熟肽片段。PCR反应体系：ddH₂O(16.2μL)，10×buffer(2.5μL)，dNTP(2μL)，re-ex-F(1μL)，re-ex-R(1μL)，cDNA(2μL)，TaqE(0.3μL)，总体积25μL。PCR反应程序：94℃4min；94℃1min，60℃30s，72℃1min 30s，共35个循环；最后72℃延伸10min。

再将PCR产物与原核表达载体pET-28a(+)同时进行Bam HⅠ和XhoⅠ双酶切，分别用DNA凝胶回收试剂盒纯化酶切产物，经T4 DNA连接酶连接后转化E.coli DH5a，在含有卡那霉素(50μg/mL)的平板上进行抗性筛选。挑取阳性克隆接种到LB液体培养基中进行培养，37℃、220r/m，培养8h后用质粒提取试剂盒提取质粒，送公司进行测序验证粒。构建成功的重组表达载体，命名为pET-HO1。

实施例3重组蛋白pET-HO1的诱导表达和纯化

将1ng上述实施例1测序验证后的重组表达载体pET-HO1转化E.coli BL21(DE3)细菌，在含有50mg/L卡那霉素的LB培养液中培养至OD值约为0.6时，加入IPTG(125μg·mL^-1)进行诱导，培养3h。离心收集菌体，超声破碎，然后加入5×上样缓冲液进行12％SDS-PAGE电泳检测目标蛋白的表达情况。

以1％的接种量(质量体积比)将能表达重组蛋白的BL21(DE3)细菌菌株接种到含有50μg/mL卡那霉素的新鲜LB培养基中，200r/min 37℃培养12-15h，诱导表达。将诱导好的菌液离心，于4℃、10000r·min-1离心10min收集菌体，沉淀用PBS缓冲液(50mmol/L，pH＝8.0)重悬，冰上超声裂解细菌，超声5s，间隔10s，总时间20min，4℃，10000r·min-1离心10min，收集沉淀，沉淀用裂解缓冲液(6mol/L盐酸胍，10mmol/L咪唑，50mmol/L PBS，pH＝8.0)洗涤三次后，加入适量裂解缓冲液溶解，用0.45μm滤膜过滤后将上清加到Ni-NTA HisBind Resin纯化柱中，用含有咪唑(100mmol/L)的PBS洗脱，获得重组蛋白swHO1(如SEQ IDNO:8所示)。

纯化的重组蛋白swHO1经含6，3，1.5，0.5，0.1mol/L的盐酸胍缓冲液梯度透析复性后，使用透析袋浓缩，用BCA法测定蛋白浓度。SDS-PAGE电泳检测经过洗脱、透析后的重组蛋白swHO1。结果如图1所示，纯化后的样品，可见大小为35kDa的单一条带，表明通过上述实施例的方法得到了高纯度的重组蛋白swHO1。

实施例4重组蛋白swHO1对病原菌处理的肝脏组织活性氧(ROS)和总抗氧化能力 (T-AOC)的影响

取96尾健康黄鳝驯化3天后，随机分成4组，分别为对照组，病原细菌处理组，病原细菌+灭活蛋白处理组，病原细菌+活性蛋白处理组，每组24尾。对照组每条鱼注射0.9％生理盐水1mL；病原菌组注射1mL嗜水气单胞菌(1×10⁶cfu/mL)，病原菌+灭活蛋白组注射1mL嗜水气单胞菌(1×10⁶cfu/mL)+灭活蛋白(5μg/mL)混合液，病原菌+活性蛋白组注射1mL嗜水气单胞菌(1×10⁶cfu/mL)+活性蛋白(5μg/mL)混合液。其中活性蛋白为重组蛋白swHO1，灭活蛋白为无活性的重组蛋白swHO1。

注射后，分别在0,3,6,9,12,24h随机挑取4尾黄鳝，取其肝组织(约为150mg)按RIPA试剂盒(碧云天生物技术有限公司)说明书加入RIPA裂解液，冰上研磨至匀浆后，冰上放置30min，12000r/min离心30min后，取上清保存。

将不同处理组的肝脏样品依次加入酶标包被板中，根据ROS(上海酶联生物科技有限公司)和T-AOC(上海酶联生物科技有限公司)酶联免疫分析试剂盒说明书的步骤，测各个样品在450nm波长下的吸光度，根据标准曲线计算各个样品中的ROS和T-AOC的浓度。用SPSS20.0进行统计学分析，采用方差分析进行组间比较，当P＜0.01时为差异极显著，当P＜0.05时为差异显著。

如图2，在注射后9h和12h，病原菌+活性蛋白处理组ROS水平显著低于病原菌处理组(P＜0.05)，并且其他时间点血清中的ROS水平并未因注射重组蛋白swHO1而显著提高，说明注射重组蛋白swHO1一定程度上抑制了血清中ROS的水平。

如图3，在分别处理后3h，9h，12h时，病原菌+活性蛋白组相对于对照组的血清总抗氧化能力T-AOC无显著差异；但处理后6h和24h时，结果显示，病原菌+活性蛋白组相对于对照组，其血清中的总抗氧化能力显著提高(P＜0.05)。

实施例5重组蛋白swHO1对病原细菌嗜水气单胞菌处理后肝脏HO1和Nrf2基因表达的影响

取96尾健康黄鳝在驯化3天后，随机分成4组。分别为对照组，病原细菌处理组，病原细菌+灭活蛋白处理组，病原细菌+活性蛋白处理组，每组24尾。对照组每条鱼注射0.9％生理盐水1mL；病原菌组注射1mL嗜水气单胞菌(1×10⁶cfu/mL)，病原菌+灭活蛋白组注射1mL嗜水气单胞菌(1×10⁶cfu/mL)+灭活蛋白(5μg/mL)混合液，病原菌+活性蛋白组注射1mL嗜水气单胞菌(1×10⁶cfu/mL)+活性蛋白(5μg/mL)混合液。其中活性蛋白为重组蛋白swHO1，灭活蛋白为无活性的重组蛋白swHO1。

注射后，分别在0,3,6,9,12,24h随机取4尾，取其肝组织(约为150mg)，根据RNA提取试剂盒说明书提取黄鳝肝组织总RNA，以提取的总RNA为模板，按逆转录试剂盒操作说明合成cDNA第一链，以黄鳝cDNA为模板，检测HO1和Nrf2基因的表达。

设计实时荧光定量PCR引物对HO1-rt-F(如SEQ ID NO:9所示，5’-GCAGCCGGATGAACAGTGTGG-3’)/HO1-rt-R(如SEQ ID NO:10所示，5’-CGTAGATTCCCATAGTGACAG-3’)，和引物对Nrf2-rt-F(如SEQ ID NO:11所示，5’-CGAGCTGGATTCACTGAAGGA-3’)/Nrf2-rt-R(如SEQ ID NO:12所示，5’-TAATGCGAGGAACAAGGAAGATGGT-3’)分别对上述4种处理后的黄鳝肝脏中HO1基因和Nrf2基因的表达水平进行分析。

实时荧光定量PCR反应体系以及反应条件：20μl反应体系，10μl SYBR Taq、0.4μlHep-rt-F、0.4μl Hep-rt-F、0.4μl Rox RD II、1μl cDNA(600ng/μl)、7.8μl H₂O。反应条件如下：95℃10s；95℃5s，54℃34s，40个循环。

设计了一对分析beta-actin的引物对act-rt-F(如SEQ ID NO:13所示，

5’-GCTGTGCTGTCCCTGTA-3’)和act-rt-R(如SEQ ID NO:14所示，

5’-GAGTAGCCACGCTCTGTC-3’)，用来作为内部参照。

荧光定量PCR相对表达水平通过公式2^-ΔΔct计算。所有数据通过SPSS20进行单因素方差分析。当P＜0.05时差异显著，当P＜0.01时差异极显著。

如图4所示，在注射后9h、12h，病原细菌+活性蛋白处理组HO1基因表达水平均显著高于相对于对照组和病原菌处理组(P＜0.05)。这个结果表明外源性重组蛋白swHO1能够一定程度上激活内源性HO1基因的表达。

如图5所示，相对于病原菌处理组，在处理后3～24h各时间点，病原细菌+活性蛋白组均显著降低了转录因子Nrf2基因的表达水平(P＜0.05)。这个结果表明外源性swHO1蛋白能够抑制Nrf2-keap1-ARE信号途径，从而起到平衡ROS产生的氧化应激，起到保护机体细胞的作用。

实施例6重组蛋白swHO1对病原菌处理的肝脏组织Hepcidin基因表达的影响

按照上述步骤3所述的方法处理96尾鱼。分别于处理后0,3,6,9,12,24h随机取样4尾，取其取其肝组织(约为150mg)根据RNA提取试剂盒说明书提取黄鳝肝组织总RNA，以提取的总RNA为模板，按逆转录试剂盒操作说明合成cDNA第一链，以黄鳝cDNA为模板，检测Hepcidin基因的表达。

设计实时荧光定量PCR引物Hep-rt-F(如SEQ ID NO:15所示，5’-CTCGCCTTTATCTGCATTCTGG-3’)和引物Hep-rt-R(如SEQ ID NO:16所示，5’-CGCAGCCCTTGTAGTTCT-3’)，对上述4种处理后的黄鳝肝脏中Hepcidin基因的表达水平进行分析。

实时荧光定量PCR反应体系以及反应条件：20μl反应体系，10μl SYBR Taq、0.4μlHep-rt-F、0.4μl Hep-rt-F、0.4μl Rox RD II、1μl cDNA(600ng/μl)、7.8μl H20。反应条件如下：95℃10s；95℃5s,54℃34s，40个循环。荧光定量PCR相对表达水平通过公式2^-ΔΔct计算。所有数据通过SPSS20进行单因素方差分析。当P＜0.05时差异显著，当P＜0.01时差异极显著。

结果如图6所示，在注射后9h和12h时，病原细菌+灭活蛋白处理组、病原细菌+活性蛋白组的Hepcidin基因表达水平均显著高于对照组和病原细菌处理组(P<0.05)，说明重组蛋白swHO1可以显著提高急性应激期肝脏中Hepcidin基因的表达，不论其是否失活；Hepcidin作为机体细胞中重要的铁离子代谢蛋白和天然免疫分子，参与了机体的抵抗外界病原物入侵的过程；外源性swHO1蛋白能够显著提高急性应激期Hepcidin基因的表达从而起到保护机体降低病原菌危害的作用。

综上所述：

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 长江大学

<120> 一种重组蛋白swHO1的制备方法及应用

<160> 16

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cacrgarctb atgctgagct 20

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ctgstggccc acgcktacac c 21

<210> 3

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atctaccagg ccctggagga agagatggac aggaac 36

<210> 4

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ggaggtcagg tcttgggtcg aatcgctc 28

<210> 5

<211> 1510

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gttgccacat catgtttagc tgaggttttg tgacattgct tcctgttttc attcagctgc 60

tggagggagg agacagagga gggctgtata aaagaaggag aagacggcag caatagcaca 120

gaactgtact ggacatctaa agggtaaacg gtggacacag accaaagtat cagaactgaa 180

gaacttcatc ataactggtg agtaaaagac aatatttctg tttacatgtg aattttagaa 240

ccttatgtta atgccttttt actatatagt gttgatatcc atgctataat attgattttg 300

ttctgtaaaa gcatatttct agcatttaat gtttatgttt ttctagggcc acaatggaag 360

cagagaagaa aactcagaca acagcagcac agatgactga cagagatctg tccgaacaaa 420

tcaaaaaggt gactaaggat agtcacgtca gagcagagaa cacagaactg atgctgagct 480

tccagagggg acaagtcaca ctcgcacaat ataagctcct cctctgctca ctgcatgaaa 540

tctaccaggc cctggaggaa gagatggaca ggaacttcac ccaccctgct gttgcaccca 600

tttacttccc tactgaactg gccagactgg agtccattga gaaagacctg gaatacttct 660

atggccagga ctggagagag aagattgttg tccctgcagc cactaaaaga tacgcccaca 720

gactcagaca gattggtaaa gaaaacccag aatttctgct tgcccatgct tacacccggt 780

acctaggtga cctgtctgga ggtcaggtct tgggtcgaat cgctcagaag tccatggggc 840

tgaagagcag cgagggtctg ctgttcttta ccttccctgg tgtgtccagc cccaacctgt 900

tcaaacagct ctaccgcagc cggatgaaca gtgtggagct gacagaggag gagaggaacg 960

ccgtgctgga ggaggccgtc agagccttcg agtttaacat tcaggtcttt gaggacttac 1020

agaagatgct gagtgtctct gaaaaccagc tgcaaagtag ttcaacacac tccaaatcag 1080

caaaggtact ccagttcaca ggaaccacta tcaaggcttc cccactgctc agggtgatcc 1140

tggggctctt tgtggctctg gctactgtca ctatgggaat ctacgtttta tagacaccac 1200

gcacacaaga ggaaatacta tgtgttggtc ctttactttt atactgtaaa ggtattaaaa 1260

cccctacttg attgtaaacc tgcaagattt taactgtcta taaataaact gtaatatttt 1320

tataatttaa caaagaacta cattttatgt acattgtaat gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt 1380

gtgagttcta cattttctca aacttttatg cagtgtgcat taacatgtgc aatatgtttt 1440

taatactgta aatgttacat ttgaaataaa aaacatttgt tgaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1500

aaaaaaaaaa 1510

<210> 6

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

caaggatcca tggaagcaga gaagaaaac 29

<210> 7

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

caactcgagt aaaacgtaga ttcccata 28

<210> 8

<211> 503

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Val Ala Thr Ser Cys Leu Ala Glu Val Leu Arg His Cys Phe Leu Phe

1 5 10 15

Ser Phe Ser Cys Trp Arg Glu Glu Thr Glu Glu Gly Cys Ile Lys Glu

20 25 30

Gly Glu Asp Gly Ser Asn Ser Thr Glu Leu Tyr Trp Thr Ser Lys Gly

35 40 45

Ala Thr Val Asp Thr Asp Gln Ser Ile Arg Thr Glu Glu Leu His His

50 55 60

Asn Trp Lys Val Lys Asp Asn Ile Ser Val Tyr Met His Ile Leu Glu

65 70 75 80

Pro Tyr Val Asn Ala Phe Leu Leu Tyr Ser Val Asp Ile His Ala Ile

85 90 95

Ile Leu Ile Leu Phe Cys Lys Ser Ile Phe Leu Ala Phe Asn Val Tyr

100 105 110

Val Phe Leu Gly Pro Gln Trp Lys Gln Arg Arg Lys Leu Arg Gln Gln

115 120 125

Gln His Arg Leu Leu Thr Glu Ile Cys Pro Asn Lys Ser Lys Arg Lys

130 135 140

Leu Arg Ile Val Thr Ser Glu Gln Arg Thr Gln Asn Ala Cys Asn Ala

145 150 155 160

Ser Arg Gly Asp Lys Ser His Ser His Asn Ile Ser Ser Ser Ser Ala

165 170 175

His Cys Met Lys Ser Thr Arg Pro Trp Arg Lys Arg Trp Thr Gly Thr

180 185 190

Ser Pro Thr Leu Leu Leu His Pro Phe Thr Ser Leu Leu Asn Trp Pro

195 200 205

Asp Trp Ser Pro Leu Arg Lys Thr Trp Asn Thr Ser Met Ala Arg Thr

210 215 220

Gly Glu Arg Arg Leu Leu Ser Leu Gln Pro Leu Lys Asp Thr Pro Thr

225 230 235 240

Asp Ser Asp Arg Leu Val Lys Lys Thr Gln Asn Phe Cys Leu Pro Met

245 250 255

Leu Thr Pro Gly Thr Asp Val Thr Cys Leu Glu Val Arg Ser Trp Val

260 265 270

Glu Ser Leu Arg Ser Pro Trp Gly Arg Arg Ala Ala Arg Val Cys Cys

275 280 285

Ser Leu Pro Ser Leu Val Cys Pro Ala Pro Thr Cys Ser Asn Ser Ser

290 295 300

Thr Ala Ala Gly His Thr Val Trp Ser Ser Gln Arg Arg Arg Gly Thr

305 310 315 320

Pro Cys Trp Arg Arg Pro Ser Glu Pro Ser Ser Leu Thr Phe Arg Ser

325 330 335

Leu Arg Thr Tyr Arg Arg Cys Cys Val Ser Leu Lys Thr Ser Cys Lys

340 345 350

Val Val Gln His Thr Pro Asn Gln Gln Arg Tyr Ser Ser Ser Gln Glu

355 360 365

Pro Leu Ser Arg Leu Pro His Cys Ser Gly Gly Ser Trp Gly Ser Leu

370 375 380

Trp Leu Trp Leu Leu Ser Leu Trp Glu Ser Thr Phe Tyr Arg His His

385 390 395 400

Ala His Lys Arg Lys Tyr Tyr Val Leu Val Leu Tyr Phe Tyr Thr Val

405 410 415

Lys Val Leu Lys Pro Leu Leu Asp Cys Lys Pro Ala Arg Phe Leu Leu

420 425 430

Ser Ile Asn Lys Leu Val Tyr Phe Tyr Asn Leu Thr Lys Asn Tyr Ile

435 440 445

Leu Cys Thr Leu His Cys Val Cys Val Cys Val Cys Val Ser Ser Thr

450 455 460

Phe Ser Gln Thr Phe Met Gln Cys Ala Leu Thr Cys Ala Ile Cys Phe

465 470 475 480

Tyr Tyr Cys Lys Cys Tyr Ile Lys Asn Lys Lys His Leu Leu Lys Lys

485 490 495

Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys

500

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gcagccggat gaacagtgtg g 21

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

cgtagattcc catagtgaca g 21

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

cgagctggat tcactgaagg a 21

<210> 12

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

taatgcgagg aacaaggaag atggt 25

<210> 13

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

gctgtgctgt ccctgta 17

<210> 14

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

gagtagccac gctctgtc 18

<210> 15

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

ctcgccttta tctgcattct gg 22

<210> 16

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

cgcagccctt gtagttct 18

Claims

1.一种重组蛋白swHO1在制备病原细菌诱导的黄鳝氧化应激调控药物中的应用，所述重组蛋白swHO1如SEQ ID NO:8所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述重组蛋白swHO1按如下方法制备：

提取黄鳝肝脏组织总RNA，通过反转录和PCR扩增，将黄鳝血红素氧化酶1的编码基因克隆到表达载体上，获得重组表达载体pET-HO1；将所述重组表达载体pET-HO1转化到大肠杆菌BL21(DE3)细胞中进行表达，纯化，得到重组蛋白swHO1。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述黄鳝血红素氧化酶1的编码基因的PCR扩增步骤如下：

（1）根据已知鱼类的HO1基因序列，设计了一对简并引物用来扩增反转录得到的黄鳝HO1基因的cDNA片段；所述扩增产物进行纯化后与pEASY-T1载体连接，转化至DH5a感受态细胞中，鉴定得到阳性克隆片段；

（2）根据所得cDNA片段设计基因特异性引物分别用于cDNA片段的5’和3’末端进行RACE扩增，得到cDNA末端序列；

（3）将所述阳性克隆片段与所述cDNA末端序列进行拼接后即得到黄鳝HO1基因全长cDNA序列。

4.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述重组表达载体pET-HO1的构建步骤如下：

（1）以所述黄鳝HO1基因全长cDNA序列为模板，设计正向引物和反向引物，进行PCR扩增，得到PCR产物；其中所述正向引物和反向引物中分别添加了Bam HⅠ和XhoⅠ酶切位点；

（2）将PCR产物和pET-28a(+)表达载体进行双酶切，回收纯化，连接后转化至大肠杆菌DH5α，筛选，提取质粒进行测序验证，获得重组表达载体pET-HO1。

5.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述表达步骤为：

将所述重组表达载体pET-HO1转化至所述宿主细胞E.coli BL21（DE3）细菌中，得到表达菌株；

将所述表达菌株接种至含有50 mg/L卡那霉素的LB培养液中培养至OD值约为0.6时，加入IPTG进行诱导，培养3h。

6.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述纯化步骤为：离心收集诱导后的所述表达菌株菌液，超声破碎，离心，悬浮，过滤，上清上样至Ni-NTA His Bind Resin纯化柱，用含有咪唑的PBS溶液洗脱，后即得所述重组蛋白swHO1的溶液。